WO2022220216A1 - アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤 - Google Patents

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WO2022220216A1
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aptamer
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雄大 田淵
ジェイ ヤン
真清 瀧
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雄大 田淵
ジェイ ヤン
真清 瀧
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    • C12N2310/351—Conjugate

Definitions

  • the present disclosure relates to target-specific binding compounds and compositions useful as pharmaceuticals or biochemical tools.
  • the SARS-CoV-2 coronavirus is a pathogenic virus causing a pandemic as of 2020-2021. Research to develop drugs for treating diseases associated with this virus is being carried out all over the world, but the development of specific therapeutic drugs against this virus has not yet been fully achieved.
  • Non-Patent Document 1 describes nucleic acid aptamers that bind to the spike protein of SARS-CoV-2.
  • the spike protein is a protein that protrudes from the outer surface of SARS-CoV-2 and constitutes a protrusion structure (spike) that covers the virus particle, and is a receptor expressed on cells such as the human respiratory system (for example, A viral protein that binds to the ACE2 receptor or neuropilin 1 receptor) and mediates infection in humans.
  • the nucleic acid aptamer of Non-Patent Document 1 was identified based on the indicators that it binds to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein and competes with ACE2 for binding to the RBD. .
  • RBD receptor binding domain
  • Non-Patent Documents 2 and 3 which are completely separate studies unrelated to SARS-CoV-2, describe nucleic acid aptamers with covalent binding ability.
  • Non-Patent Document 2 introduces a sulfonyl fluoride (SF) group to the 5' end of a nucleic acid library for SELEX, an in vitro selection method, and binds to epidermal growth factor receptor by screening from the library.
  • SF sulfonyl fluoride
  • Non-Patent Document 3 in order to address the problem that covalent drugs have the risk of irreversible adverse effects, introduced one SF group to existing thrombin-binding aptamers to make them covalent and Thrombin inhibitors are described whose drug action is reversible by complementary strand antidotes.
  • the embodiments of the present disclosure provide nucleic acid aptamers with new properties that may be more useful in terms of their function as therapeutic agents.
  • Embodiments of the present disclosure also provide covalent agents, such as anti-SARS-CoV-2 agents, with such novel properties.
  • Head Nucleic Acid Aptamer [2] The first nucleic acid residue to which a sulfonyl fluoride group is linked via a linker and the second nucleic acid residue to which a sulfonyl fluoride group is linked via a linker are separated by at least 3 residues, [ 1].
  • the plurality of sulfonyl fluoride groups are linked to the nucleic acid aptamer by an azide-alkyne click chemistry reaction, and the linker is a linker comprising a linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction, [ 1] or the multi-warhead nucleic acid aptamer according to [2].
  • the linker is a linker comprising a linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction, [ 1] or the multi-warhead nucleic acid aptamer according to [2].
  • Multiple nucleic acid residues in the nucleic acid sequence of the SARS-CoV-2 spike protein-binding nucleic acid aptamer are each linked to a sulfonyl fluoride group via a linker and covalently bind to the SARS-CoV-2 spike protein.
  • the multi-warhead nucleic acid aptamer according to any one of [1] to [3].
  • 5′-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3′ has a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) of A sulfonyl fluoride group is linked to each of a plurality of nucleic acid residues in the nucleic acid sequence via a linker, The multi-warhead nucleic acid aptamer according to [4].
  • a pharmaceutical composition comprising the multi-warhead nucleic acid aptamer according to any one of [1] to [6].
  • a pharmaceutical composition comprising the multi-warhead nucleic acid aptamer of [4] or [5], for inhibiting binding of SARS-CoV-2 to receptors on cells of a subject.
  • a method for producing a nucleic acid aptamer with enhanced binding efficiency to a target protein comprising: a) a target protein-specific nucleic acid aptamer modified such that a first reactive group is ligated or bound to each of a plurality of nucleic acid residues in the nucleic acid sequence of the aptamer; b) reacting a warhead compound having a structure in which a second reactive group corresponding to the first reactive group and a sulfonyl fluoride group are linked or bonded to each other to react the first reactive group and the first reactive group; Obtaining a multi-warhead structure in which each of the plurality of nucleic acid residues of the nucleic acid aptamer and a sulfonyl fluoride group are linked via a linker containing a linking portion formed by a reaction between two reactive groups.
  • a method including [10] The method of [9], wherein the first and second nucleic acid residues of the plurality of nucleic acid residues are separated by at least 3 residues.
  • the first reactive group is (a1) a group having a carbon-carbon triple bond or (a2) an azide group; the second reactive group corresponding to the first reactive group is (b1) an azide group or (b2) a group having a carbon-carbon triple bond; said reaction is an azide-alkyne click chemistry reaction, The method according to [9] or [10].
  • the sulfonyl fluoride group is present in the form of -aryl-SO 2 F.
  • FIG. 1 shows a mobility shift assay (a) showing that a SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamer linked to a single warhead can form a covalent bond with a target viral protein (RBD), and residual unreacted RBD.
  • RBD target viral protein
  • FIG. 2 is an experiment showing that a SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamer linked to two warheads does not lose its specific binding ability to a target protein and has enhanced covalent bond formation efficiency.
  • FIG. 3 shows the results of examining the concentration dependence of covalent interactions between double warhead aptamers and target proteins.
  • FIG. 4 is an experiment showing that a triple warhead aptamer with three warheads linked still retains its specific binding ability to the target protein and still has enhanced covalent bond formation efficiency.
  • FIG. 5 shows the results of examining the time course of covalent interactions between triple warhead aptamers and target proteins.
  • FIG. 6 shows the results of examining the concentration dependence of covalent interactions between triple warhead aptamers and target proteins.
  • FIG. 7 shows the results of experiments in which the target protein and triple warhead aptamers were mixed in the presence of human serum.
  • FIG. 8 shows ELISA results showing that aptamer-type multi-warhead covalent agents strongly inhibit protein-protein interactions between SARS-CoV-2 viral proteins and their human receptors.
  • Figure 9 shows that multi-warhead-modified VEGF-binding aptamers (T4/T17, T4/T22) have enhanced covalent binding efficiency to VEGF proteins compared to single-warhead-modified aptamers (T4, T17, T22). show.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 described above introduce one covalent warhead (sulfonyl fluoride group) at one location of the nucleic acid aptamer (at a unique location at the 5' end in the case of Non-Patent Document 2).
  • these prior art disclosures did not make the embodiments of the present invention obvious.
  • these prior arts aim to form an irreversible bond between an aptamer drug and a target molecule by a covalent warhead. They describe an increase in the 'local concentration' of aptamers in These objectives, namely the formation of an irreversible drug-target bond and the increase in the local concentration of the aptamer drug at the target molecular site, are in principle completed with one covalent bond, and there are additional covalent bonds. I don't see any obvious reason for adding the number.
  • nucleic acid aptamers are drugs that rely on specific molecular arrangements of flexible linear structures called single-stranded nucleic acids. Constraining such flexible linear structures at one point versus multiple separate points fundamentally changes the tensions that can occur within the linear structure and the physical degrees of freedom that can be enjoyed. I thought it might come. It is not obvious from the prior art that the simultaneous linking of multiple covalent warheads to a nucleic acid aptamer results in the formation and maintenance of a functional aptamer in the first place.
  • the sulfonyl fluoride group has been known as a covalent warhead, attaching it to multiple sites on a drug simultaneously is unprecedented, much less what would happen in an aptamer. I didn't.
  • the data disclosed in this application demonstrate that there is a significant time lag between docking of the aptamer and the ability of the sulfonyl fluoride group to form a covalent bond, allowing re-release of the aptamer and the presence of additional sulfonyl fluoride groups. can significantly reduce the time difference.
  • the knowledge was obtained for the first time in the present disclosure.
  • the present disclosure also provides the first finding that an aptamer attached with multiple sulfonyl fluoride groups does not become a promiscuous binder that forms an unintended covalent bond and can maintain high target selectivity.
  • the covalent agents of the embodiments of the present disclosure can efficiently covalently bind to single-molecule targets and, in some circumstances, to multiple-molecular targets. can. None before has a covalent drug had the potential to alter drug dynamics in response to the environment in this way. This is a unique function that is not an extension of the prior art.
  • the present embodiments are the first to bring to the technical field agents with such new properties, and are progressive.
  • the present disclosure is a multi-warhead nucleic acid aptamer having multiple sulfonyl fluoride groups, wherein the multiple sulfonyl fluoride groups are linked via linkers to multiple nucleic acid residues in the nucleic acid sequence of the nucleic acid aptamer.
  • Multi-warhead nucleic acid aptamers can form covalent bonds with target proteins in addition to specific interactions (docking) unique to aptamers. This compound can be understood to be an aptamer-based covalent drug.
  • a single molecule of a multi-warhead nucleic acid aptamer can form multiple covalent bonds to a single target molecule, or, depending on the circumstances, to multiple target molecules.
  • drug refers to a substance that can specifically bind to a target substance, especially a target protein.
  • drugs that can bind to the active site of a target enzyme and inhibit enzyme activity are also contemplated, as well as drugs that are simply used as binding labels or targeting moieties.
  • the term “drug” should therefore be understood broadly as a "binding agent” that can be used in vivo or in vitro.
  • the present disclosure provides that a plurality of nucleic acid residues in the nucleic acid sequence of a SARS-CoV-2 spike protein-binding nucleic acid aptamer, i.e., at least two nucleic acid residues, each have a sulfonyl fluoride group via a linker.
  • a multi-warhead nucleic acid aptamer is provided that is linked and thereby capable of covalently binding to the SARS-CoV-2 spike protein.
  • a spike protein binding nucleic acid aptamer is preferably a nucleic acid aptamer that binds to the receptor binding domain of the spike protein.
  • it has a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) of 5′-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3′, and a sulfonyl fluoride group is linked to each of a plurality of nucleic acid residues in the nucleic acid sequence via a linker.
  • SARS-CoV-2 spike protein-binding nucleic acid aptamers are provided. By having such a structure, the compound specifically recognizes and binds (docked) to the SARS-CoV-2 target protein via the nucleic acid aptamer moiety represented by SEQ ID NO: 1, and multiple hooks.
  • nucleic acid aptamer means a nucleic acid molecule capable of specific binding to a target molecule, as understood by those skilled in the art.
  • the technology of nucleic acid aptamers per se is well known to those skilled in the art.
  • Natural nucleic acid aptamers that exist as part of a riboswitch are also known, but more typical nucleic acid aptamers in technical applications are artificial nucleic acid aptamers, more specifically targeted from libraries of random sequences.
  • Nucleic acid molecules selected by screening for their ability to bind to substances referred to as SELEX: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment), or the sequences of nucleic acid molecules so selected are partially modified (e.g.
  • aptamers are obtained or produced as those that bind to desired target substances, the specific targets of each aptamer are inevitably known. Therefore, a person skilled in the art can not only clearly recognize the nucleic acid aptamer, but also its corresponding target.
  • Non-Patent Document 1 The nucleic acid aptamer itself having the sequence of SEQ ID NO: 1 is described in Non-Patent Document 1, as described above, and binds to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of SARS-CoV-2; and by the authors of Non-Patent Document 1 based on the indication that it competes with ACE2 for binding to RBD.
  • RBD receptor binding domain
  • SARS-CoV-2 spike protein binding aptamers are also described in Non-Patent Document 1.
  • Several other publications also describe nucleic acid aptamers that bind to the SARS-CoV-2 spike protein and differ in primary structure. 2021; 6: 227, Sun et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 10266-10272, Valero et al., PNAS 2021 Vol. 118 No. 50 e2112942118, and Schmitz et al., Angew. Chem. Int. Ed. DNA aptamers are described.
  • aptamers are essentially similar in that they function by binding to this protein, which decorates the viral particle surface at high density and mediates infection of host cells, described for the aptamer of SEQ ID NO:1. and exemplification can also be observed with other SARS-CoV-2 spike protein binding aptamers. It was found that conventional SARS-CoV-2 spike protein-binding aptamers may have limited infection inhibition effects regardless of the high binding affinity represented by the K d value. The embodiment can achieve effectiveness of infection inhibition effect by a new means of aptamer-type multi-warhead covalent drug, and the significance of its contribution is great.
  • nucleic acid aptamers for different targets, and for combinations of different warhead linkage positions for a given nucleic acid aptamer, giving generality to their applicability to a wide variety of nucleic acid aptamers.
  • specific examples of aptamers that can be covalently drugged into multi-warheads according to the present disclosure include thrombin-binding aptamers, coagulation factor IXa-binding aptamers, factor Xa-binding aptamers, and von Willebrand factor-binding aptamers.
  • tissue factor pathway inhibitor binding aptamer tissue factor pathway inhibitor binding aptamer, platelet-derived growth factor binding aptamer, complement protein C5 binding aptamer, nucleolin binding aptamer, CXCL12 binding aptamer, CCL2 binding aptamer, hepcidin binding aptamer, Toll-like receptor 9 binding aptamer, VEGF binding aptamer, etc. include but are not limited to.
  • the Examples section illustrates data for multi-warhead VEGF binding aptamers.
  • nucleic acid aptamer sequence eg, SEQ ID NO: 1
  • Nucleic acid members of a nucleic acid library to be screened in the SELEX method for identifying nucleic acid aptamers usually have primer sequences (primer (including sequences that are the same as and sequences that are complementary to the primers).
  • primer sequences primer (including sequences that are the same as and sequences that are complementary to the primers).
  • the nucleic acid aptamer of Non-Patent Document 1 was originally isolated and identified as a spike protein-binding molecule from a long-sequence nucleic acid population with primer sequences added to both ends.
  • the "core sequence" of a nucleic acid aptamer is, for example, SEQ ID NO: 1, where more than half of the SELEX primer sequence (for example, for each primer sequence, more than half from the end of the nucleic acid molecule) is removed.
  • SELEX primer sequence for example, for each primer sequence, more than half from the end of the nucleic acid molecule.
  • Non-Patent Document 2 describes that a sulfonyl fluoride (SF) group was introduced at the 5' end of the SELEX library in order to select nucleic acid aptamers against epidermal growth factor receptor. This is understood to be the introduction of an SF group at the 5' end of the PCR amplification primer sequence. The inventors have found that the introduction of an SF group via a linker to one internal nucleic acid residue that is distant from the primer sequence and in the middle of the core sequence does not abolish the specific binding function of the nucleic acid aptamer and is efficient. (Non-Patent Document 3, Fig. 1 of the present application).
  • SF sulfonyl fluoride
  • a nucleic acid aptamer can specifically bind to a target substance with a high binding affinity represented by a dissociation constant value K d of less than micromolar (preferably less than 100 nanomolar, more preferably less than 10 nanomolar), and this embodiment , a nucleic acid aptamer with multiple sulfonyl fluoride groups linked thereto can also maintain such specific binding ability and affinity for a target substance.
  • aptamer-target binding is the sum of numerous non-covalent interactions.
  • nucleic acid aptamers can be DNA, RNA, or combinations thereof, such as single-stranded DNA, single-stranded RNA, or combinations thereof.
  • the term nucleic acid aptamer also includes those containing one or more nucleic acid modifications or non-natural nucleic acid moieties (such as non-natural backbone moieties and non-natural sugar moieties) known to those skilled in the art.
  • nucleic acid modifications and non-natural nucleic acid moieties that can be used in aptamers, for example for nuclease resistance and other purposes, are known (Zhou et al., Nat Rev Drug Discov, 2017, 16(3): 181-202 ).
  • Nucleic acid aptamers generally have a length of 10 residues (bases) or longer, more typically 15 residues or longer. Nucleic acid aptamers are typically 100 residues or less in length, more typically 60 residues or less in length, although they may be longer.
  • a nucleic acid residue (or sometimes simply abbreviated as “residue”) means a monomer unit that constitutes a nucleic acid polymer. Thus, for example, each deoxyribonucleotide moiety in a DNA aptamer can be recognized as a residue.
  • aptamer-type drugs have the characteristic that the drug effect can be canceled or "detoxified” by administering a complementary strand.
  • Non-Patent Document 3 mentioned above also showed that the drug effect of the thrombin covalent aptamer can be released by a complementary strand, but the release efficiency was slightly lower than that of the non-covalent aptamer.
  • the inventors recognized that a SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamer that binds to the virus rather than to the human receptor would be of relatively little significance in reversing its drug effect. This does not exclude the possibility of canceling the drug effect of multi-warhead nucleic acid aptamers by complementary strands.
  • a multi-warhead nucleic acid aptamer or an aptamer-type multi-warhead covalent agent is characterized by having sulfonyl fluoride groups linked to at least two nucleic acid residues.
  • the number of residues to which the sulfonyl fluoride group is linked can be 2, 3, or 4, or it can be 5, 6, or more.
  • the number of residues to which sulfonyl fluoride groups are linked can be, for example, less than 20% or less than 10% of the total number of residues contained in the nucleic acid aptamer.
  • the residue to which the sulfonyl fluoride group is attached corresponds to the residue to which the linker is attached.
  • At least one or all of the residues to which the sulfonyl fluoride group is linked may be internal residues instead of terminal residues of the nucleic acid aptamer.
  • at least one or all of the residues to which the sulfonyl fluoride group is linked may be residues located within 5 residues or more, or 10 residues or more from the 5′ end or 3′ end of the nucleic acid aptamer.
  • At least one or all of the residues to which the sulfonyl fluoride group is linked may be residues in the core sequence of the nucleic acid aptamer.
  • At least one or all of the residues to which the sulfonyl fluoride group is linked are located within 5 residues or more, or 10 residues or more from the 5′ end or 3′ end of the core sequence of the nucleic acid aptamer.
  • the linkers are attached to nucleobases in the nucleic acid residue.
  • the linker can be attached to the 5' end of the nucleic acid aptamer or the 5' terminal phosphate (i.e., the phosphate group attached to the 5' end).
  • the linker can be attached to the 3' end of the nucleic acid aptamer or the 3' terminal phosphate (i.e., the phosphate group attached to the 3' end).
  • a linker can be attached to the 2' position of the ribose ring of any of the residues that make up the nucleic acid aptamer.
  • Nucleic acid aptamers have a finite number of residues, and each residue has a finite number of sites to which linkers can be attached. Therefore, based on the present disclosure and available knowledge, those skilled in the art can appropriately determine the combination of linker binding positions in the nucleic acid aptamer without undue trial and error, and easily confirm that the target binding ability is not lost. be able to.
  • Nucleic acid residues with linked or bound alkyne structures or azide groups available for azide-alkyne click chemistry reactions at these positions, and modified oligonucleotides of any sequence incorporating such nucleic acid residues are commercially available or can be synthesized by one skilled in the art. It is within the ordinary skill of one of ordinary skill in the art to synthesize nucleic acids incorporating multiple such residues. There are also commercially available services for synthesizing modified oligonucleotides of any sequence incorporating residues linked or bound by alkyne structures or azide groups at each of the above positions.
  • Examples of companies providing reagents or custom synthesis services for such alkyne- or azide-modified oligonucleotides include Integrated DNA Technologies, Japan Gene Research Institute, and Sigma-Aldrich, It is not limited to these. These structures have conventionally been used, for example, for fluorescent labeling of nucleic acids.
  • the bases are adenine (A), guanine (G), inosine (I) (hypoxanthine), cytosine (C), thymine (T), and uracil. (U) etc., but A, C, T or U are preferred, with T or U being particularly preferred.
  • a linker can be attached to the 5-position of the pyrimidine rings that make up those bases.
  • a linker can be attached such that the methyl group at the 5-position of the pyrimidine ring that constitutes the thymine base is replaced with a linker, resulting in the same structure as U with a linker attached as described above.
  • such a state can also be referred to as having a linker attached to the 5-position of the pyrimidine ring that constitutes the T (thymine) base.
  • a linker can be attached to the 7-position of the purine rings that make up those bases. In that case, the nitrogen atom at the 7-position of the purine ring can be replaced with a carbon atom.
  • the first nucleic acid residue having a sulfonyl fluoride group linked via a linker and the second nucleic acid residue having a sulfonyl fluoride group linked via a linker are at least three residues is seperated.
  • the first and second nucleic acid residues may be separated by at least 5 residues, or may be separated by at least 10 residues.
  • that the first nucleic acid residue and the second nucleic acid residue are separated by one residue means that both residues are adjacent, and that they are separated by n residues is It means that n ⁇ 1 residues are sandwiched between both residues.
  • the terms “first,” “second,” etc. in this disclosure are for convenience to refer to distinct elements (eg, distinct residues). Thus, for example, the terms "first nucleic acid residue” and “second nucleic acid residue” in this paragraph do not refer to specific positions on a nucleic acid sequence.
  • SARS-CoV-2-binding nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO: 1, wherein at least one of the multiple sites where the sulfonyl fluoride group is linked corresponds to any of i) to iii) below. Aptamers are provided.
  • sulfonyl fluoride groups are linked via a linker in i) and ii), i) and iii), ii) and iii), or i) and ii) and iii) below in SEQ ID NO: 1
  • SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamers are provided that are: i) the nucleobase of any of A 9 to T 15 ; ii) the nucleobase of any of T 26 to T 32 ; iii) the nucleobase of any of G 39 -A 45 ;
  • the alphabet represents the type of base, and the subscript number represents the base position in SEQ ID NO:1.
  • a SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamer is provided that has a sulfonyl group attached to it: i) T12 ; ii) T29 ; iii) T42 .
  • the aptamer when multiple covalent bonds are formed with one target by introducing sulfonyl fluoride groups into multiple residues that are spaced apart from each other on the nucleic acid sequence, the aptamer is specific.
  • the effect of covalently anchoring the docked state to the may be more robust, while also increasing the probability of covalent binding to multiple molecules of the target.
  • Non-Patent Document 1 Since the aptamer of Non-Patent Document 1 is a DNA aptamer, it originally has a T base. When a linker is attached such that the methyl group at the 5-position of the pyrimidine ring of the T base is replaced with a linker, such a linker-modified T base has the same structure as the corresponding linker-modified U base, but here the original Since the aptamer has a sequence of T bases, T 12 , T 29 and the like are indicated above. When the same kind of linker is bound to the U base of the RNA aptamer, it can be called "a linker is bound to the U base" even if the result is the same structure.
  • Sulfonyl fluoride groups have the formula —SO 2 F and are known to be capable of reacting with at least serine, threonine, lysine, tyrosine, cysteine, or histidine residues of proteins under physiological conditions to form covalent bonds. It is a reactive electrophilic chemical group (Narayanan et al., Chemical Science 2015, 6(5), 2650-2659). A reactive group that forms a covalent bond with a target in this way is sometimes called a warhead.
  • a nucleic acid aptamer to which a sulfonyl fluoride group is linked is sometimes referred to as a warhead-modified aptamer.
  • multi-warhead refers to multiple sulfonyl fluoride groups linked together.
  • a wide variety of compounds bearing sulfonyl fluoride groups have been synthesized, as exemplified in part by Narayanan et al., and a wide variety of synthetic routes for introducing sulfonyl fluoride groups are available to those skilled in the art. It is possible.
  • Linker Those skilled in the art will appreciate that a wide variety of chemical linkers can be used in this embodiment, so long as they can covalently link the nucleic acid aptamer and the sulfonyl fluoride group (or warhead structure described above). Chemical linkers typically have a hydrocarbon backbone. Hydrocarbon-based backbones also include those that also contain other atoms attached to and/or inserted into the hydrocarbon backbone. As used in this disclosure, the term “linked” means the state in which two moieties are indirectly bonded with another atom(s) in between, which means that two moieties have another atom(s) in between. are directly covalently bonded to each other without intervening.
  • nucleic acid aptamer when a nucleic acid aptamer is covalently bonded to one end of a linker and a sulfonyl fluoride group is covalently bonded to the other end, and the backbone of the linker itself also consists of covalent bonds between atoms, the nucleic acid aptamer and the sulfonyl fluoride group are covalently bonded. connected to
  • Linkers include, for example, alkylene having 1 to 10 carbon atoms, alkenylene having 2 to 10 carbon atoms, alkynylene having 2 to 10 carbon atoms, heteroalkylene, cycloalkylene, heterocycloalkylene, arylene, heteroarylene and other divalent heterocyclic groups, It can be, but is not limited to, a divalent group comprising or consisting of -CONH- (or -NHCO-), -CO-, -NH-, -O-, or combinations thereof.
  • Heteroalkylene represents an alkylene backbone in which carbon atoms are replaced at each position by a heteroatom such as an oxygen, nitrogen or sulfur atom; ether moieties and polyether moieties such as polyethyleneoxy and polypropyleneoxy is also included.
  • Cycloalkylene and heterocycloalkylene represent cyclic alkylene and heteroalkylene, respectively.
  • Heterocycloalkylene includes crown ethers.
  • Groups that make up the linker in this disclosure include substituted and unsubstituted groups. For example, alkylene, arylene, heteroarylene, heterocycle, and/or -NH- hydrogen atoms can be substituted. Examples of typical substituents include, but are not limited to, C1-C10 alkyl and alkyloxy, aryl, hydroxyl, amino, halogen, and combinations thereof.
  • linkers in this embodiment comprise a linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction.
  • Azide-alkyne clicks although linking moieties formed by other reactive groups and mechanisms (eg, amide linking moieties formed between amino groups and N-hydroxysuccinimide (NHS) ester groups) are also possible.
  • chemistry reactions makes it possible to ligate nucleic acid aptamers with multiple sulfonyl fluoride groups and produce multi-warhead covalent agents so efficiently that post-reaction product separation can be omitted.
  • linking moieties formed by azide-alkyne click chemistry reactions can dramatically improve the covalent binding capacity of aptamer-type covalent binding agents.
  • Use of these preferred linking moieties can impart excellent covalent binding ability to aptamers regardless of the type of warhead structure.
  • the reason for such differences in covalent bonding ability depending on the ligation method is that the reaction conditions for azide-alkyne click chemistry, which can be performed in a mild solution environment in a short time, can suppress the instability or decomposition of warhead compounds.
  • the linking structure containing the nitrogen-rich rings may provide some favorable physical and chemical effects on nucleic acids, target proteins and/or —SO 2 F groups.
  • the azide-alkyne click chemistry reaction itself is known, and those skilled in the art can clearly recognize the structure of the linking moiety formed by the azide-alkyne click chemistry reaction.
  • a preferred example of the linking moiety formed by the azide-alkyne click chemistry reaction is a divalent group represented by the following chemical formula (I).
  • This is a linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction called copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC).
  • CuAAC copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition
  • the left side (left arm) of the structural formula shown above is linked or bonded to the nucleic acid aptamer and the right side (right arm) is linked or bonded to the sulfonyl fluoride group, but the reverse is also possible.
  • linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction is a divalent group represented by general formula (II) below.
  • the 8-membered ring may be a heterocyclic ring in which one or more carbon atoms not involved in fusion with another ring are replaced with non-carbon atoms such as nitrogen, Typically, the carbon of the linking portion of the linker (the left-hand binding arm in general formula (II) below) can be replaced with nitrogen.
  • linking moiety represented by general formula (II) is shown in chemical formula (IIa) below.
  • linking moiety represented by general formula (II) is shown in chemical formula (IIb) below.
  • SPAAC strain-promoted azide-alkyne cycloaddition
  • the left side (left arm) of the structural formula shown above may be linked or bonded to the nucleic acid aptamer and the right side (right arm) may be linked or bonded to the sulfonyl fluoride group, or vice versa.
  • the orientation of the linking moiety is reversed depending on whether the azide group is provided from the nucleic acid aptamer side or from the sulfonyl fluoride group side.
  • the linker can be a combination of the groups described above.
  • the nucleic acid aptamer side and/or the sulfonyl fluoride group side with respect to the linking portion formed by the azide-alkyne click chemistry reaction is alkylene having 1 to 10 carbon atoms, alkenylene having 2 to 10 carbon atoms, alkynylene having 2 to 10 carbon atoms, heteroalkylene, cycloalkylene, heterocycloalkylene, arylene, heteroarylene, -CONH- (or -NHCO-), -CO-, -NH-, -O-, or combinations thereof It may be a divalent group comprising or consisting of.
  • the linker can be represented by the formula -L 1 -YL 2 -, where Y is a linking moiety, such as a linking moiety formed by an azide-alkyne click chemistry reaction, L1 is a linker portion that binds to the nucleic acid aptamer (corresponding to a first linker described below), and L2 is a linker portion that binds to a sulfonyl fluoride group (corresponding to a second linker described later).
  • the entirety of -L 1 -YL 2 - corresponds to the third linker described later.
  • the third linker consists of the structure -C ⁇ C-(CH 2 ) 4 -(I)-CH 2 -CO-C 6 H 4 -, where (I) is represents (I).
  • the length and specific composition of the linker can vary depending on the practitioner's design, but as a guide only, the linker (especially the third linker) typically has 2-100 carbon atoms. range, more typically in the range of 5-50. Also, as a guide only, the length of the linker, i.e., the distance between the nucleic acid aptamer and the sulfonyl fluoride group when the linker is maximally extended, may typically be within 100 ⁇ , more typically within 50 ⁇ , Alternatively, it is within 30 ⁇ . The length of the linker can typically be 5 ⁇ or longer, more typically 10 ⁇ or longer.
  • Covalent bonds are usually formed within the target molecule(s), but covalent bonds may also be formed to other types of molecules (e.g., another viral protein) in the vicinity of the target molecule upon aptamer binding. be.
  • the present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising the multiwarhead nucleic acid aptamers described above.
  • the present disclosure provides the above multiwarhead nucleic acid aptamers for use as a medicament.
  • the aptamers in this case are multi-warhead modified spike protein binding aptamers.
  • a method of inhibiting binding of SARS-CoV-2 to a receptor on a cell of a subject comprising administering to the subject an effective amount of the aptamer or composition comprising the same.
  • a "subject" in the present disclosure is typically a mammalian animal or its tissues or cells. In certain embodiments, a "subject” is a human or tissue or cell thereof. A subject can be a human patient.
  • the receptor for SARS-CoV-2 can be the ACE2 receptor or the neuropilin 1 receptor.
  • Inhibiting binding may include preventing binding and/or dissolving binding.
  • a virus whose receptor-binding portion of the spike protein has been blocked by a covalently-anchored nucleic acid aptamer then indefinitely has a reduced or lost ability to bind to cells within the host organism, and It is understood that the ability to infect other individuals is also reduced or lost.
  • the SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamers of the present disclosure and pharmaceutical compositions comprising the same are used to prevent SARS-CoV-2 infection, prevent the spread of infection within or between individuals, or to treat infection. can be
  • a pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient is water.
  • a pharmaceutical composition may, for example, contain a concentration of salt suitable for injection into the human body.
  • routes of administration include, but are not limited to, oral, intravenous, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, transdermal, intraperitoneal, intrathecal, rectal, vaginal, ocular, and inhalation.
  • aptamer-type multi-warhead covalent drug [Method for producing aptamer-type multi-warhead covalent drug]
  • the multi-warheading approach and effects exemplarily demonstrated with SARS-CoV-2 binding nucleic acid aptamers are applicable to other nucleic acid aptamers. Accordingly, the present disclosure more generally provides methods of making aptamer-type multi-warhead covalent agents, and aptamer-type multi-warhead covalent agents produced by the methods.
  • this production method can produce aptamer-type multi-warhead covalent agents exemplified by the SARS-CoV-2-binding nucleic acid aptamers described above.
  • the structural and functional descriptions provided in the preceding sections relating to the nucleic acid aptamer aspects herein are also applicable to the present method of manufacture aspects, and vice versa.
  • the combination of the target protein and its specific nucleic acid aptamer can be selected from those known to those skilled in the art, not limited to SARS-CoV-2.
  • the method of this embodiment can also be described as a method of imparting new covalent binding functionality to nucleic acid aptamers, or a method of enhancing the binding efficiency of covalent binding nucleic acid aptamers.
  • the present disclosure provides: A method for producing a nucleic acid aptamer with enhanced binding efficiency to a target protein, comprising: a) a target protein-specific nucleic acid aptamer modified such that a first reactive group is ligated or bound to each of a plurality of nucleic acid residues in the nucleic acid sequence of the aptamer; b) reacting a warhead compound having a structure in which a second reactive group corresponding to the first reactive group and a sulfonyl fluoride group are linked or bonded to each other to cause the first reactive group and the second reaction; obtaining a multi-warhead structure in which each of the plurality of nucleic acid residues of the nucleic acid aptamer and the sulfonyl fluoride group are linked via a linker comprising a linking portion formed by reaction between the groups.
  • a target protein-specific nucleic acid aptamer modified such that a first reactive group is ligated or bound to each of a pluralit
  • the enhancement of the binding efficiency to the target protein means that a covalent bond-forming ability is imparted compared to a nucleic acid aptamer of the same sequence that does not have a covalent bond, or that of the same sequence that has only one warhead. Compared to the nucleic acid aptamer under the same conditions, it means including one or more of the following: an increase in the rate of covalent bond formation; a lower concentration of covalent bond formation to the target; more (that is, the ability to form covalent bonds to multiple) target molecules; or the ability to more strongly inhibit the binding of competing molecules to the target protein.
  • the number of residues having the first reactive group in the nucleic acid sequence of the aptamer can be 2, 3, or 4, or can be 5, 6, or more. can be The number of residues having the first reactive group can be, for example, less than 20% or less than 10% of the total number of residues contained in the nucleic acid aptamer.
  • the residue with the first reactive group corresponds to the residue to which the linker connecting the sulfonyl fluoride groups is attached.
  • first nucleic acid residue and the second nucleic acid residue among the plurality of nucleic acid residues having the first reactive group are separated by at least three residues.
  • the first and second nucleic acid residues may be separated by at least 5 residues, or by at least 10 residues.
  • At least one or all of the nucleic acid residues having the first reactive group may be internal residues instead of terminal residues of the nucleic acid aptamer.
  • at least one or all of the nucleic acid residues having the first reactive group may be residues located within 5 residues or more, or 10 residues or more from the 5′ end or 3′ end of the nucleic acid aptamer.
  • At least one or all of the nucleic acid residues having the first reactive group may be residues in the core sequence of the nucleic acid aptamer.
  • nucleic acid residues having the first reactive group are residues located within 5 residues or more, or 10 residues or more from the 5′ end or 3′ end of the core sequence of the nucleic acid aptamer.
  • the first reactive group can be linked or attached to the 5' end of the nucleic acid aptamer or the 5' terminal phosphate (i.e., the phosphate group attached to the 5' end).
  • the first reactive group can be linked or attached to the 3' end of the nucleic acid aptamer or the 3' terminal phosphate (i.e., the phosphate group attached to the 3' end).
  • the first reactive group can be attached to the 2' position of the ribose ring of any of the residues that make up the nucleic acid aptamer.
  • Nucleic acid aptamers have a finite number of residues, and each residue has a finite number of sites to which linkers can be attached. Therefore, based on the present disclosure and available knowledge, a person skilled in the art can easily determine the combination of linker binding positions appropriately without excessive trial and error and confirm that the target binding ability is not lost.
  • the second reactive group of (b) “corresponds” to the first reactive group of (a) above means that the combination of the first reactive group and the second reactive group corresponds to the first reactive group of (a). It means that they are in a relationship to perform a ligation reaction known to those skilled in the art.
  • the first reactive group in (a) is (a1) a group having a carbon-carbon triple bond (-C ⁇ C-) or (a2) an azide group
  • corresponding to the first reactive group (b ) is (b1) an azide group, or (b2) a group having a carbon-carbon triple bond (-C ⁇ C-)
  • the reaction is an azide-alkyne click chemistry reaction. preferable.
  • the group (a) is the alkyne structure group (a1)
  • the group (b) is the azide group (b1)
  • the group (a) is the azide group (a2).
  • the group (b) becomes the alkyne structure group (b2).
  • Linking moieties can also be formed by other reactive groups and reaction mechanisms known to those skilled in the art.
  • the first reactive group in (a) is (a3) an NHS ester group or (a4) an amino group
  • the second reactive group in (b) is (b3) an amino group or ( b4) NHS ester groups.
  • the ligation reaction in the method of the present embodiment is a reaction that produces a multi-warhead aptamer, it is understood that a plurality of first reactive groups and a corresponding plurality of second reactive groups are involved. be.
  • first reactive group is for convenience to refer to the reactive group on the side of the nucleic acid aptamer rather than on the side of the warhead compound, wherein the plurality of first reactive groups have completely identical structures to each other. is not always required.
  • alkyne structure a group having a carbon-carbon triple bond that can be used in an azide-alkyne click chemistry reaction, including alkynyl groups, cycloalkynyl groups, and heterocycloalkynyl groups, is also referred to as an "alkyne structure".
  • Cycloalkynyl and heterocycloalkynyl groups can be used in the SPAACs described above and thus can undergo click chemistry reactions in the absence of copper(I) ions.
  • An azido group is a group of the formula -N3 .
  • alkyne structures known to those skilled in the art that can be used in SPAAC include OCT (cyclooctyne), MOFO (monofluorocyclooctyne), DIFO (difluorocyclooctyne), DIMAC (dimethoxyazacyclooctyne), DIFBO (difluoro benzocyclooctyne), DIBO (dibenzocyclooctyne), DIBAC (dibenzazacyclooctyne), BARAC (biarylazacyclooctyne), and BCN (bicyclo[6.1.0]nonyne), respectively. be done.
  • heterocycloalkynyl group is shown in the following chemical formula III, and a specific example of the cycloalkynyl group is shown in the following chemical formula IV.
  • the first reactive group may be directly bound to the nucleic acid aptamer, or may be linked to the nucleic acid aptamer via a linker.
  • Cycloalkynyl groups, heterocycloalkynyl groups, and azide groups are typically linked to nucleic acid aptamers via linkers.
  • the linker that connects the nucleic acid aptamer and the first reactive group is sometimes referred to as the first linker.
  • first linker examples include alkylene having 1 to 10 carbon atoms, alkenylene having 2 to 10 carbon atoms, alkynylene having 2 to 10 carbon atoms, heteroalkylene, cycloalkylene, heterocycloalkylene, arylene, heteroarylene, -CONH- ( or -NHCO-), -CO-, -NH-, -O-, or a divalent group comprising or consisting of, but not limited to, combinations thereof.
  • the above groups constituting the linker include substituted and unsubstituted ones.
  • alkylene, arylene, heteroarylene, and/or -NH- hydrogen atoms can be replaced.
  • typical substituents include, but are not limited to, C1-C10 alkyl and alkyloxy, aryl, hydroxyl, amino, halogen, and combinations thereof.
  • first linkers that connect the nucleic acid aptamer (left) to the alkynyl group (right) are described below: -(CH 2 ) n - (where n is an integer from 1 to 10); -O —CH 2 —; —(CH 2 ) n —NHCO—(CH 2 ) 2 —O—CH 2 — (n is an integer of 1 to 10); —C ⁇ C—(CH 2 ) n — (n is 1 and -C ⁇ C-(CH 2 CH 2 O) n -(CH 2 ) 2 - (where n is an integer from 1 to 10).
  • a first linker is -C ⁇ C-(CH 2 ) 4 -.
  • Non-limiting examples of first linkers that connect the nucleic acid aptamer (left) to the cycloalkynyl or heterocycloalkynyl group (right) are described below: -(CH 2 CH 2 O) n -(CH 2 ) 2 -NHCO-(CH 2 ) 4 -(CO)- (n is an integer of 1 to 10); -(CH 2 ) n -NHCO-(CH 2 ) 4 -(CO)- (n is 1 to 10 -(CH 2 ) n - (n is an integer of 1 to 10); -(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -NHCOO-CH 2 -; -(CH 2 ) n -NHCOO -CH 2 - (n is an integer of 1 to 10); -(CH 2 ) 6 -NHCO-(CH 2 ) 3 -CONH-(CH 2 CH 2 O) 2 -(CH 2 ) 2 -NHCOO-CH
  • warhead compound means one of the two compounds involved in the ligation reaction of this embodiment, which has a sulfonyl fluoride group that provides covalent bond-forming ability in the covalent drug.
  • the second reactive group in the warhead compound may be directly attached to the sulfonyl fluoride group, or may be linked to the sulfonyl fluoride group via a linker.
  • the linker that connects the sulfonyl fluoride group and the second reactive group is sometimes referred to as a second linker.
  • the second linker is, for example, alkylene having 1 to 10 carbon atoms, alkenylene having 2 to 10 carbon atoms, alkynylene having 2 to 10 carbon atoms, heteroalkylene, cycloalkylene, heterocycloalkylene, arylene, heteroarylene, -CONH- ( or -NHCO-), -CO-, -NH-, -O-, or a divalent group comprising or consisting of, but not limited to, combinations thereof.
  • the terminal portion of the second linker that binds to the sulfonyl fluoride group is preferably arylene (eg p-phenylene) or heterocycloalkylene (eg 1,4-piperazinylene), carbonyl-arylene or carbonyl-hetero Cycloalkylene is more preferred.
  • the above groups constituting the linker include substituted and unsubstituted ones.
  • alkylene, arylene, heteroarylene, and/or -NH- hydrogen atoms can be replaced.
  • Examples of typical substituents include, but are not limited to, C1-C10 alkyl and alkyloxy, aryl, hydroxyl, amino, halogen, and combinations thereof.
  • One specific example of a second linker is -CH2 -CO - C6H4- .
  • warhead compounds are shown in chemical formulas (V) to (X) below.
  • the portion connecting the azide group and the sulfonyl fluoride group is the second linker.
  • warhead compounds having other second reactive groups eg, groups having a carbon-carbon triple bond
  • monovalent groups containing carbonyl groups to sulfonyl fluoride groups represent preferred examples of warhead structures.
  • azide-alkyne click chemistry reaction Specific reaction conditions for the azide-alkyne click chemistry reaction are well known to those skilled in the art. For example, an alkyne structure-containing compound and an azide in the presence of a copper(I) stabilizing ligand such as tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine and a reducing agent such as ascorbic acid, and copper(II) sulfate.
  • Azide-alkyne click chemistry reactions can be performed by mixing the group-containing compounds in aqueous solution. SPAAC does not require a copper catalyst system. Azide-alkyne click chemistry reactions can be performed at room temperature.
  • a ligation reaction known to those skilled in the art forms the aforementioned ligation moiety derived from the first reactive group and the second reactive group.
  • a multi-warhead structure is generated in which multiple residues of the nucleic acid aptamer and multiple sulfonyl fluoride groups are linked via a linker containing this linking portion (referred to as a "third linker" in the present disclosure).
  • This structure provides an embodiment of a multi-warhead modified nucleic acid aptamer and can also provide an active ingredient of a covalent drug composition.
  • the third linker may be a divalent group having the structure -(first linker)-(the linking portion)-(second linker)-.
  • Scheme 1 shows a specific example of the synthesis of a warhead compound and the ligation reaction between a nucleic acid aptamer modified with a first reactive group (alkynyl group) via a linker at the nucleobase and the warhead compound.
  • 1 is the precursor of the warhead compound
  • 2 is the warhead compound
  • 3 is the internal residue of the alkynyl linker-modified nucleic acid aptamer
  • 4 is the internal residue of the warhead-modified nucleic acid aptamer.
  • the method may further comprise chemically synthesizing the nucleic acid aptamer of a) before performing the ligation reaction.
  • the nucleic acid aptamer component a) in this embodiment is essentially a modified oligonucleotide, and can be synthesized by applying a known oligonucleotide chemical synthesis method.
  • An example of a suitable chemical synthesis method is the phosphoramidite method, but is not necessarily limited thereto.
  • a modified oligo using at least one nucleoside having a nucleobase to which a first reactive group is linked or attached (e.g., in the form of a phosphoramidite derivative) as a substrate at desired residues of a desired sequence, a modified oligo
  • a nucleoside having a nucleobase to which a first reactive group is linked or attached e.g., in the form of a phosphoramidite derivative
  • Nucleic acid aptamers have advantages such as the ability to provide high target specificity, the ability to detoxify, and the fact that they themselves hardly provoke immune reactions. ing.
  • the low in vivo stability more specifically the short half-life in the circulation due to elimination in the kidney, is considered to be a weak point of aptamer-type drugs. This is one of the reasons for the delay in application.
  • the aptamer-type covalent agent provided in the embodiments of the present disclosure can bind to the target protein, and once the warhead moiety forms a covalent bond to the target protein, the retained and can continue to have an effect on the target protein.
  • aptamer-type covalent drugs can, for example, obtain sustained efficacy in pharmacokinetics different from conventional aptamer-type drugs that are passive and have a short half-life.
  • the aptamer-type multi-warhead covalent drug according to the present disclosure can not only significantly improve these advantages, but also, as shown in the examples below, conventional aptamer-type drugs and conventional covalent drugs Unseen heterogeneous effects can also be provided.
  • alkyne linker-modified Ts consist of -C[identical to]C-( CH2 ) 4 -C[identical to]CH attached to the 5-position of the pyrimidine ring of the thymine (T) base in place of the usual methyl group.
  • -C[identical to]C-( CH2 ) 4- can be recognized as a first linker and -C[identical to]CH as an alkynyl group.
  • the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein (# SPD-C52H3) was purchased from ACROBiosystems, USA. Hereafter, the receptor-binding domain of this SARS-CoV-2 spike protein is abbreviated as RBD.
  • Human serum (#H4522) was purchased from Aldrich, USA.
  • aptamers Small-scale quantitative analysis of aptamers was performed using a reverse-phase semi-micro HPLC system (PU-2085 with C18 column, JASCO Corporation) connected to a fluorescence detector followed by a PDA. Aptamers were separated by using an acetonitrile 0-60% gradient containing 20 mM triethylamine acetate in water (pH 7.4) over 26 min at a flow rate of 200 ⁇ L/min.
  • Warhead compound 1 was synthesized on a preparative scale by the following procedure. 4-(2-bromoacetyl)-benzene-1-sulfonyl fluoride (71.1 ⁇ mol, Aldrich, USA, #00364) and sodium azide (64.6 ⁇ mol, Wako Pure Chemical Industries, #195-11092) were added to 323 ⁇ L of dimethylsulfoxide. (DMSO). The reaction mixture was vortexed at room temperature for 10 minutes, then mixed with cold water (0.5 mL) and extracted with ethyl acetate (1 mL).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the SARS-CoV-2 spike protein-binding aptamer is abbreviated as SC2BA
  • the warhead-modified aptamers are abbreviated as T12, T12/T29, etc.
  • numbers such as 12, 29, etc. represent the position of the warhead-modified residue in SEQ ID NO: 1, and multiple When the residues are separated by a slash "/", it indicates that the multiple residues are warhead-modified.
  • the bands of unreacted RBDs were quantified using Image Lab (trademark) software.
  • the intensity of the unreacted RBD band in samples without modified SC2BA was normalized as 100% to determine the relative intensity of that band in each of the other samples.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a RayBio COVID-19 Spike-ACE2 binding assay kit II was used. This assay uses a plate with immobilized human ACE2 receptor protein on its surface, to which Fc-tagged RBD protein is added to induce ACE2-RBD interaction, and after washing, HRP-labeled anti-Fc antibody and measuring the color development of the substrate (TMB: 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) by the HRP enzyme to quantify the binding of ACE2-RBD.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • Figure 1(a) shows that unmodified SC2BA or warhead-modified SC2BA were incubated with RBD under physiologically active conditions at 37°C for 12 h, after which the reaction mixture was separated by SDS-PAGE and proteins visualized by CBB. Show the results.
  • the first lane of the gel shown is molecular weight markers.
  • RBD alone has an apparent molecular weight of approximately 32 kDa (lane 2). Even if unmodified SC2BA is bound to this, there is no change in the mobility of RBD when it is run on an SDS-PAGE gel under denaturing/reducing conditions (lane 3).
  • Warhead-modified SC2BAs (T12, T29, T42, respectively) with a sulfonyl fluoride group linked via a linker at positions 12, 29, or 42 of the nucleic acid sequence were attached.
  • the aptamer formed a covalent bond to the RBD, thus confirming a shift in the mobility of the RBD on SDS-PAGE, ie an increase in molecular weight (lanes 4-6, dashed box).
  • the non-mobility-shifted bands, ie, uncovalently bound RBDs are reduced in abundance.
  • FIG. 3 shows the results of examining the concentration dependence of covalent interactions between double warhead aptamers and target proteins.
  • 3a and 3b are the results for T12/T29, and c and d are the results for T12/T42.
  • the EC50 was determined to be approximately 2-3 ⁇ M each.
  • the target protein-aptamer bimolecular covalent complex (RBD-SC2BA)
  • the target protein-aptamer-target protein trimolecular covalent complex (RBD-SC2BA-RBD) also occurs in a concentration ratio dependent manner. was found. This will be discussed later.
  • T 1/2 was approximately 30 minutes each, suggesting that most covalent reactions occur rapidly within an hour. seen (not shown).
  • Figure 5 shows the results of examining the time course of covalent interaction between the triple warhead aptamer (24 ⁇ M) and the target protein (6 ⁇ M). Over 50% of the target protein is covalently bound within 15 minutes of mixing the aptamer and target protein, and the reaction is mostly complete within 60 minutes. This is generally a fairly fast reaction rate for covalent drugs.
  • FIG. 6(a) shows the results of examining the concentration dependence of the covalent interaction between the triple warhead aptamer and the target protein. It was found that a single aptamer molecule can form a covalent bond with two target proteins (RBD-SC2BA-RBD) when the concentration of the aptamer to the target protein (RBD) is relatively low. This was also observed in experiments using aptamers with two warheads (Fig. 3). Non-Patent Document 3 also suggested that after one covalent bond is formed, the docking between the aptamer portion and the target molecule is once dissociated, and the two become tethered with a linker. .
  • Figure 7 shows the results of an experiment in which the target protein RBD and the triple warhead aptamer were mixed under the presence of human serum.
  • the extent of covalent bond formation to the target protein was not substantially reduced even in the presence of high concentrations of serum proteins (see intensity of "RBD" band).
  • Human ACE2 is the major receptor for SARS-CoV-2 and the starting point for SARS-CoV-2 to infect humans.
  • Figure 8 shows an ELISA experiment assaying the protein-protein interaction between the RBD of SARS-CoV-2 and ACE2 in humans, showing that the administered aptamer drug inhibited the interaction of the virus with the human receptor. The goal is to find out how much it can be blocked. Blocking the RBD-ACE2 interaction prevents SARS-CoV-2 virus from infecting cells, as has been demonstrated in antibody studies.
  • Non-Patent Document 1 The K d (dissociation constant) of ACE2 for RBD is reported to be 34.6 nM, and the K d of unmodified SC2BA for RBD is reported to be approximately 5.8 nM (Non-Patent Document 1).
  • the results in Figure 8 indicate that unmodified SC2BA does have the ability to inhibit the interaction of the RBD of SARS-CoV-2 with human ACE2, but the effect may be limited.
  • aptamers that introduced a single warhead to make them covalent had significantly improved potency in blocking the interaction of viral proteins with human receptors (example of T12 is shown).
  • aptamers incorporating multiple covalent warheads showed surprisingly high levels of enhanced inhibitory potency, and even triple warhead aptamers reduced the interaction of viral proteins with human receptors by at least 90%. Inhibition was achieved as described above (Fig. 8).
  • FIG. 9 shows data for vascular endothelial growth factor (VEGF) binding aptamer as an example.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the VEGF-binding nucleic acid aptamer itself (5'-CAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGT-3'; SEQ ID NO: 2) is described in Kaur and Yung, PLoS ONE, 2021, 7:e31196.
  • VEGF is a potent angiogenic mitogen that is widely overexpressed in cancer cells.
  • This nucleic acid aptamer was created by Kaur et al. by truncating a longer existing VEGF binding aptamer and has a very high target binding affinity with a K d value of 0.5 ⁇ 0.32 nM.
  • Multiwarhead-modified VEGF-binding aptamers were generated essentially as described above, reacted with a fixed amount of recombinant VEGF165 protein (VES-H6248, ACROBiosystems), and unreacted (i.e. The intensity of the VEGF band (not forming covalent bonds) was quantified. In the experiments shown in FIG. 9, the concentration of aptamer in each sample is 100 ⁇ M.
  • VEGF is glycosylated so the exact molecular weight and molarity cannot be determined, but this is a condition of aptamer excess over VEGF anyway.
  • "none” represents a sample of VEGF protein alone with no added aptamer and was used as the reference point for relative quantification of unreacted bands.
  • Multi-warhead-modified VEGF-binding aptamers (T4/T17 and T4/T22; numbers indicate residue numbers in SEQ ID NO: 2) significantly increased VEGF protein binding compared to single warhead-modified aptamers (T4, T17, and T22). shows a clear enhancement of covalent binding efficiency to
  • results exemplified in this example demonstrate that the ligation of multiple covalent warheads to a nucleic acid aptamer generally maintains the structural integrity and target-specific binding capacity of the aptamer, and indeed, the rapid formation of covalent bonds to the target. It has been demonstrated that covalent bonds can sometimes be formed to multiple target molecules to remarkably enhance the pharmacological effect based on specific binding. In particular, this example demonstrated aptamer-type multi-warhead covalent agents as specific and effective agents against SARS-CoV-2.
  • aptamer-type multi-warhead covalent drugs may also have a new aspect of environment-responsive (ER) covalent drugs. That is, when the drug concentration is relatively low, each drug molecule can struggle alone to form covalent bonds to two target molecules per drug molecule, whereas when the drug concentration is relatively high, single-point concentration can occur. , a single drug molecule can form multiple covalent bonds to a single target molecule. To the best of the inventor's knowledge, no covalent drug has been reported that changes covalent bonding properties in this way depending on the environment.
  • ER environment-responsive

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Abstract

治療薬等としての機能において有用となる新しい特性を核酸アプタマー型薬剤に付与する。そのような新しい特性を有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬剤等の共有結合性薬剤を提供する。具体的には、複数の共有結合性ウォーヘッドを有するアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤を提供する。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とするアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤を提供する。マルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物、およびマルチウォーヘッド核酸アプタマーの製造方法も提供される。

Description

アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤
　本開示は、医薬あるいは生化学的ツールとして有用な、標的に特異的に結合する化合物および組成物に関する。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、２０２０～２０２１年の時点でパンデミックを引き起こしている病原性ウイルスである。このウイルスに関連する疾患を治療するための薬剤を開発する研究が世界中で行われているが、このウイルスに対して特異的な治療薬の開発はまだ十分達成されていない。
　非特許文献１を含めいくつかの文献は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合する核酸アプタマーを記載している。スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の外表面から突出してそのウイルス粒子を覆う突起構造（スパイク）を構成するタンパク質であって、ヒトの呼吸器系等の細胞上に発現される受容体（例えばＡＣＥ２受容体またはニューロピリン１受容体）に結合してヒトへの感染を媒介するウイルスタンパク質である。非特許文献１の核酸アプタマーは、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（receptor binding domain：ＲＢＤ）に結合すること、およびＲＢＤへの結合についてＡＣＥ２と競合することという指標に基づいて同定されたものである。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には関係しない全くの別研究である非特許文献２および３は、共有結合能を有する核酸アプタマーを記載している。非特許文献２は、in vitro selection法であるSELEXのための核酸ライブラリーの５’末端にスルホニルフルオリド（ＳＦ）基を導入し、そのライブラリーからのスクリーニングにより、上皮成長因子受容体に結合する核酸アプタマーを得たことを記載している。非特許文献３は、共有結合性薬剤は非可逆的な有害作用のリスクを有するという問題に対処するべく、既存のトロンビン結合アプタマーに１つのＳＦ基を導入して、共有結合性を有しかつ相補鎖解毒剤によって薬剤作用が可逆的となるトロンビン阻害薬を記載している。
Song et al., Anal. Chem., 2020, 92, 9895-9900 宍戸裕子、北海道大学博士学位論文、２０１８年９月２５日 Tabuchi et al., Chem. Commun., 2021, 57, 2483-2486
　本開示の実施形態は、治療薬等としての機能においてより有用となり得る新しい特性を核酸アプタマーに付与するものである。本開示の実施形態はまた、そのような新しい特性を有する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬剤等の共有結合性薬剤を提供するものである。
　本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
　複数のフッ化スルホニル基を有するマルチウォーヘッド核酸アプタマーであって、前記複数のフッ化スルホニル基は、核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にリンカーを介して連結されている、マルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［２］
　リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第１の核酸残基と、リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れている、［１］に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［３］
　前記複数のフッ化スルホニル基は、前記核酸アプタマーにアジド－アルキン間クリックケミストリー反応により連結されており、前記リンカーは、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分を含むリンカーである、［１］または［２］に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［４］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して共有結合することができる、［１］～［３］のいずれか一項に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［５］
　５’－ＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＧＧＡＣＡ－３’
の核酸配列（配列番号１）を有し、
　前記核酸配列中の複数の核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されている、
　［４］に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［６］
　前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、［１］～［５］のいずれか一項に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
［７］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物。
［８］
　［４］または［５］に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物であって、対象の細胞上の受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害するための、医薬組成物。
［９］
　標的タンパク質に対する結合効率が増強された核酸アプタマーの製造方法であって、
　ａ）アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にそれぞれ第１の反応基が連結または結合されるように修飾された、標的タンパク質に特異的な核酸アプタマーと、
　ｂ）前記第１の反応基に対応する第２の反応基とフッ化スルホニル基とが連結または結合された構造を有する、ウォーヘッド化合物と
を反応させて、前記第１の反応基と前記第２の反応基の間の反応により形成された連結部分を含むリンカーを介して前記核酸アプタマーの前記複数の核酸残基のそれぞれとフッ化スルホニル基とが連結されたマルチウォーヘッド構造を取得することを含む、方法。
［１０］
　前記複数の核酸残基のうちの第１の核酸残基と第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れている、［９］に記載の方法。
［１１］
　前記第１の反応基が、（ａ１）炭素間三重結合を有する基、または（ａ２）アジド基であり、
　前記第１の反応基に対応する前記第２の反応基が、（ｂ１）アジド基、または（ｂ２）炭素間三重結合を有する基であり、
　前記反応はアジド－アルキン間クリックケミストリー反応である、
　［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］
　前記マルチウォーヘッド構造において、前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、［９］または［１０］に記載の方法。
［１３］
　前記マルチウォーヘッド構造において、前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、［１１］に記載の方法。
図１は、１箇所にウォーヘッドが連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーが標的のウイルスタンパク質（ＲＢＤ）と共有結合を形成できることを示すモビリティシフトアッセイ（ａ）、および未反応ＲＢＤの残量を測定した結果（ｂ）を示す。 図２は、２箇所にウォーヘッドが連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーが、標的タンパク質に対する特異的結合能を失わず、かつ増強された共有結合形成効率を有することを示す実験である。 図３は、ダブルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用の濃度依存性を調べた結果を示す。 図４は、３箇所にウォーヘッドが連結されたトリプルウォーヘッドアプタマーが、依然として標的タンパク質に対する特異的結合能を失わず、かつさらに増強された共有結合形成効率を有することを示す実験である。 図５は、トリプルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用のタイムコースを調べた結果を示す。 図６は、トリプルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用の濃度依存性を調べた結果を示す。 図７は、ヒト血清が存在する条件下で標的タンパク質とトリプルウォーヘッドアプタマーとを混合した実験の結果を示す。 図８は、アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質とそのヒト受容体との間のタンパク質－タンパク質相互作用を強く阻害することを示すＥＬＩＳＡの結果である。 図９は、マルチウォーヘッド修飾ＶＥＧＦ結合アプタマー（Ｔ４／Ｔ１７、Ｔ４／Ｔ２２）が単一ウォーヘッド修飾アプタマー（Ｔ４、Ｔ１７、Ｔ２２）と比べてＶＥＧＦタンパク質への共有結合効率の増強を有することを示す。
　核酸アプタマーの複数箇所に同時に共有結合性ウォーヘッドを導入するという着想はこれまで公開された例がなく、そのような複数ウォーヘッド導入が機能的薬剤としてそもそも可能かということについての知見は存在しておらず、そのような構成がどのような技術的効果を生じるかも知られていなかった。本発明者らは、新しい着想のもと研究を行ったところ、核酸アプタマーの複数箇所に共有結合性ウォーヘッドを連結して機能的薬剤を得ることが可能であることを実証しただけでなく、従来の薬剤にはなかった新しい特性を提供できることを発見した。本開示は、このような発見に基づいてアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤の実施形態を提供するものである。
　上述した非特許文献２および３は、核酸アプタマーの一箇所に（非特許文献２の場合は５’末端という特異な一箇所に）１つの共有結合性ウォーヘッド（フッ化スルホニル基）を導入することを開示していたが、これら先行技術の開示は本願の発明の実施形態を自明にするものではなかった。第一に、これら先行技術は、共有結合性ウォーヘッドによりアプタマー薬剤と標的分子との間に不可逆的な結合を形成させることを目的とするものであり、非特許文献３はそのことにより標的分子におけるアプタマーの「局所的濃度（local concentration）」が増加すると説明している。これらの目的、すなわち薬剤－標的間の不可逆的な結合の形成および標的分子位置におけるアプタマー薬剤の局所的濃度の増加は、原理上１つの共有結合で完結することであり、そこにさらに共有結合の数を追加する明らかな理由は見られない。
　第二に、核酸アプタマーは一本鎖核酸というフレキシブルな線状構造の特定の分子配置に依存する薬剤である。そのようなフレキシブルな線状構造を、一点において拘束することと、離れた複数点で拘束することとでは、線状構造内で生じ得る張力、および享受され得る物理的自由度が根本的に変わってくる可能性が考えられた。核酸アプタマーに複数の共有結合性ウォーヘッドを同時に連結させた場合にそもそも機能的アプタマーが形成され維持されるということは先行技術から自明なことではなく、本願で初めて明らかになったことである。第三に、フッ化スルホニル基は共有結合性ウォーヘッドとして公知であったが、それを薬剤の複数の箇所に同時に取り付けるということは先例が無く、ましてやアプタマーにおいてそれを行うとどうなるかは予測できなかった。本願で開示されているデータは、アプタマーがドッキングしてからフッ化スルホニル基が共有結合を形成できるまでにはアプタマーの再放出を許すほどの有意な時間差があり、追加のフッ化スルホニル基の存在がその時間差を有意に縮め得ることを示唆している。しかしその知見は本開示で初めて得られたものである。複数のフッ化スルホニル基を付けたアプタマーがむやみに目的外共有結合を形成する無差別結合体にはならず高い標的選択性を維持できるという知見も、本開示で初めて得られたものである。
　第四に、実施例の欄に示されるように、本開示の実施形態の共有結合性薬剤は、一分子の標的に効率的に共有結合でき、かつ環境によっては複数分子の標的にも共有結合し得る。環境に応じてこのように薬物ダイナミクスを変えるポテンシャルを有する共有結合性薬剤はかつてなかった。これは先行技術の延長線上にはない異質な機能である。本実施形態はそのような新しい性質を有する薬剤を本技術分野に初めてもたらすものであり、進歩的である。
　本開示は、複数のフッ化スルホニル基を有するマルチウォーヘッド核酸アプタマーであって、その複数のフッ化スルホニル基が核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にリンカーを介して連結されている、マルチウォーヘッド核酸アプタマーを提供する。マルチウォーヘッド核酸アプタマーは、標的タンパク質に対して、アプタマー固有の特異的相互作用（ドッキング）をすることに加えて、共有結合を形成することができる。この化合物は、アプタマーに基づくコバレントドラッグ（共有結合性薬剤）であると理解することができる。マルチウォーヘッド核酸アプタマーの１つの分子は、１つの標的分子に対して複数の共有結合を形成し、または、環境によっては、複数の標的分子に対して共有結合を形成することができる。本開示において「ドラッグ」とは、標的物質、特に標的タンパク質に特異的に結合できる物質を表す。例えば標的酵素の活性部位に結合して酵素活性を阻害できるドラッグのほか、単純に結合標識または標的化部分として使用されるドラッグも企図される。従って、「ドラッグ」という用語は広くインビボまたはインビトロで使用され得る「結合剤」として解されるべきである。
　より具体的に、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基に、すなわち少なくとも２つの核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されており、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して共有結合することができる、マルチウォーヘッド核酸アプタマーを提供する。スパイクタンパク質結合核酸アプタマーは、好ましくはスパイクタンパク質の受容体結合ドメインに結合する核酸アプタマーである。一実施形態において、５’－ＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＧＧＡＣＡ－３’の核酸配列（配列番号１）を有し、該核酸配列中の複数の核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合核酸アプタマーが提供される。このような構造を有することにより、該化合物は、配列番号１で表される核酸アプタマー部分を介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的タンパク質を特異的に認識して結合（ドッキング）し、そして複数のフッ化スルホニル基を介して、その標的に対して効率的に共有結合を形成することができる。以下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合核酸アプタマーの例を特に参照しながら本開示の実施形態を説明するが、その説明は他の核酸アプタマーにも適用できることが理解されるべきである。
［核酸アプタマー］
　核酸アプタマーという用語は、当業者に理解されるように、標的分子に特異的結合をすることができる核酸分子を意味する。核酸アプタマーの技術自体は当業者によく知られている。リボスイッチの一部分として存在する天然の核酸アプタマーも知られているが、技術的応用においてより典型的な核酸アプタマーは人工的な核酸アプタマーであり、より具体的には、ランダム配列のライブラリーから標的物質に対する結合能についてスクリーニングすること（ＳＥＬＥＸ：Systematic evolution of ligands by exponential enrichmentと呼ばれる）によって選抜された核酸分子、またはそのように選抜された核酸分子の配列を一部修正（例えば切り詰めおよび／または化学修飾）して得られた核酸分子である。これらは通常、天然には存在しない配列を含む（もしくはそのような配列からなる）天然には存在しない遊離核酸断片、あるいは少なくとも天然条件下ではその標的分子に遭遇することがない配列を含む（もしくはそのような配列からなる）天然には存在しない遊離核酸断片である。アプタマーは、所望の標的物質に対して結合するものとして取得または作製されるものであるから、必然的に、それぞれのアプタマーには特異的な標的が知られている。従って、当業者は核酸アプタマーを明確に認識することができるだけでなく、それに対応する標的も認識することができる。
　多数のアプタマーがパブリッシュされており、当業者に知られている。多数のアプタマーの例ならびにアプタマーに関連する既存技術および試薬の記述は、例えば、aptagen.com、bioanalysis-zone.com、genemedsyn.com、linaris.de、cambio.co.uk、basepairbio.com等に見出すことができる。配列番号１の配列を有する核酸アプタマー自体は、上述したように、非特許文献１に記述されたものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合すること、およびＲＢＤへの結合についてＡＣＥ２と競合することという指標に基づいて非特許文献１の著者らによって同定されたものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合アプタマーの他の例も非特許文献１に記載されている。また、他のいくつかの文献も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合し一次構造が異なる核酸アプタマーを記述している。例えばYang et al., Signal Transduct Target Ther. 2021; 6: 227、Sun et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 10266-10272、Valero et al., PNAS 2021 Vol. 118 No. 50 e2112942118、およびSchmitz et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 10279-10285は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤまたはＲＢＤ以外の部分に結合して感染を阻害できるＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーを記載している。これらのアプタマーは、ウイルス粒子表面を高密度でデコレートし宿主細胞への感染を媒介するこのタンパク質に結合することにより機能するという点で、本質的に類似しており、配列番号１のアプタマーについて説明および例示されることは他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合アプタマーでも観察することができる。従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合アプタマーはＫｄ値で表される結合親和性の高さに関わらず感染阻害の効果が限定的となり得ることが見出されたのに対し、本開示の実施形態は、アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤という新しい手段により感染阻害効果の実効性を達成でき、その貢献の意義は大きい。
　また、本開示の発明の原理は、異なる核酸アプタマーについて、異なる標的について、および所与の核酸アプタマーの異なるウォーヘッド連結位置の組合せについて、実証されており、多様な核酸アプタマーに適用できる一般性を有する。スパイクタンパク質結合アプタマー以外に、本開示に従ってマルチウォーヘッド共有結合薬剤化し得るアプタマーの具体例としては、トロンビン結合アプタマー、凝固系第ＩＸａ因子結合アプタマー、第Ｘａ因子結合アプタマー、ヴォン・ヴィレブランド因子結合アプタマー、組織因子経路インヒビター結合アプタマー、血小板由来成長因子結合アプタマー、補体蛋白質Ｃ５結合アプタマー、ヌクレオリン結合アプタマー、ＣＸＣＬ１２結合アプタマー、ＣＣＬ２結合アプタマー、ヘプシジン結合アプタマー、Ｔｏｌｌ様受容体９結合アプタマー、ＶＥＧＦ結合アプタマー等が挙げられるがこれらに限定されない。実施例の欄ではマルチウォーヘッドＶＥＧＦ結合アプタマーのデータを例示している。
　核酸アプタマーの配列（例えば配列番号１）の５’側および／または３’側にさらなる核酸配列が追加されてもよい。核酸アプタマーを同定するためのＳＥＬＥＸ法においてスクリーニング対象となる核酸ライブラリーの核酸構成員は、通常、ＰＣＲ等の核酸増幅技術によるライブラリー増幅のために５’末端と３’末端にプライマー配列（プライマーと同じ配列およびプライマーに対して相補的な配列を含む）を有している。実際、非特許文献１の核酸アプタマーも、元々は両端にプライマー配列が追加された長い配列の核酸集団の中からスパイクタンパク質結合分子として単離・同定され、その後、標的への特異的結合に必須ではない５’末端配列と３’末端配列とを切り落として配列番号１の５１マー配列にまで短縮されたものである。このように、標的結合能を担うコア配列の５’側および／または３’側に他の配列を追加し得ることは他の核酸アプタマーにおいても典型的に見られる。
　本開示において、核酸アプタマーの「コア配列」とは、例えば配列番号１のように、ＳＥＬＥＸのプライマー配列の半分以上（例えば、各プライマー配列について、核酸分子末端側からの半分以上）が除かれておりかつ単離状態で標的結合能を維持できる核酸配列を意味する。
　非特許文献２は、上皮成長因子受容体に対する核酸アプタマーを選抜するために、ＳＥＬＥＸライブラリーの５’末端にスルホニルフルオリド（ＳＦ）基を導入したことを記載している。これはすなわちＰＣＲ増幅用プライマー配列の５’末端にＳＦ基を導入したものと理解される。本発明者らは、プライマー配列から離れておりコア配列の真っ只中にある１つの内部核酸残基にリンカーを介してＳＦ基を導入しても、核酸アプタマーの特異的結合機能は失われず効率的な共有結合形成ができることを見出した（非特許文献３、本願図１）。プライマー配列はＳＥＬＥＸライブラリーの全ての構成員が有するものであり圧倒的多数の構成員は標的特異的結合能を有さないから、コア配列こそが特異的結合能を生じさせると言える。そのコア配列にリンカーとＳＦ基を導入しても核酸アプタマーとしての機能を維持できることは予測できなかった発見であった。本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも部分的にこの発見に基づいている。
　核酸アプタマーはマイクロモーラー未満（好ましくは１００ナノモーラー未満、より好ましくは１０ナノモーラー未満）の解離定数値Ｋｄで表される高い結合親和性で標的物質に特異的に結合することができ、本実施形態の、複数のフッ化スルホニル基が連結された核酸アプタマーも標的物質に対するそのような特異的結合能力および親和性を維持することができる。通常、アプタマーと標的との結合は、多数の非共有結合性相互作用の総和として得られる。
　一般に核酸アプタマーはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せであり得、例えば一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、またはそれらの組合せであり得る。核酸アプタマーという用語には、当業者に知られる１種類以上の核酸修飾または非天然核酸部分（非天然骨格部分および非天然糖部分等）を含むものも包含される。例えばヌクレアーゼ耐性その他の目的でアプタマー中に使用することができる様々な核酸修飾および非天然核酸部分が知られている（Zhou et al., Nat Rev Drug Discov, 2017, 16(3): 181-202）。その例としては２’－フルオロ化、２’－アミノ化、２’－Ｏ－メチル化、逆方向（inverted）チミジンによる３’修飾、ホスホロチオエート、ＬＮＡ、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾が挙げられるがこれらに限定されない。一般的に核酸アプタマーの長さは１０残基（塩基）以上であり、より典型的には１５残基以上である。核酸アプタマーの長さは典型的に１００残基以下、より典型的には６０残基以下であるが、これらより長い場合もあり得る。本開示において、核酸残基（あるいは単に「残基」と略すこともある）とは、核酸ポリマーを構成するモノマー単位を意味する。従って、例えばＤＮＡアプタマーにおける各デオキシリボヌクレオチド部分が残基と認識され得る。
　一般にアプタマー型薬剤は、相補鎖を投与することによって薬剤効果を解除あるいは「解毒」できるという特徴を有する。上述した非特許文献３でも、トロンビン共有結合性アプタマーの薬剤効果を相補鎖によって解除できることが示されたが、解除の効率が非共有結合性アプタマーと比べて少し低下することが示されていた。ヒト受容体ではなくウイルスの方に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーは、その薬剤効果を解除する意義が比較的低いことを本発明者らは認識した。これはマルチウォーヘッド核酸アプタマーの薬剤効果を相補鎖によって解除する可能性を排除するものではない。
　マルチウォーヘッド核酸アプタマー、あるいはアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤は、少なくとも２つの核酸残基においてフッ化スルホニル基が連結されていることを特徴とする。フッ化スルホニル基が連結される残基の数は、２個、３個、もしくは４個であり得、または５個、６個、もしくはそれ以上の数とすることも可能であり得る。フッ化スルホニル基が連結される残基の数は、例えば核酸アプタマーに含まれる残基の総数の２０％未満あるいは１０％未満であり得る。本開示において、フッ化スルホニル基が連結される残基は、リンカーが結合される残基に対応する。
　核酸アプタマーのうちフッ化スルホニル基が連結される複数の核酸残基の位置は、比較的自由に変更できることが見出された。非特許文献３に記述された研究および本願図１に示される研究等で、本発明者らは、異なる標的を有する多様なアプタマーを用いて実験を行い、アプタマーのコア配列中で標的結合面に近い残基および遠い残基を含め様々な位置において単一ウォーヘッド導入を試みたが、いずれの場合においても特異的標的に対する共有結合形成が得られた。本願ではそこからさらに発展して、これらの核酸残基の複数に同時にウォーヘッドを連結しても機能的な共有結合性アプタマーが得られることを見出したものである。複数のウォーヘッドを有することにより、従来のコバレントドラッグと比べて共有結合を形成する分子レベルでの確率を向上させ、反応速度および反応効率を向上させることができることが見出された。また、環境に応じて一分子の薬剤が標的の複数分子に共有結合を形成することも可能になる。
　フッ化スルホニル基が連結される残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーの末端の残基ではなく内部残基であってもよい。例えば、フッ化スルホニル基が連結される残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーの５’末端または３’末端から５残基以上、または１０残基以上内部に位置する残基であり得る。フッ化スルホニル基が連結される残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーのコア配列中の残基であってもよい。例えば、フッ化スルホニル基が連結される残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーのコア配列の５’末端または３’末端から５残基以上、または１０残基以上内部に位置する残基であり得る。
　好ましい一実施形態では、リンカーの少なくとも１つまたは全部が、核酸残基中の核酸塩基に結合している。別の実施形態では、リンカーは、核酸アプタマーの５’末端または５’末端リン酸（すなわち、５’末端に結合したリン酸基）に結合され得る。別の実施形態では、リンカーは、核酸アプタマーの３’末端もしくは３’末端リン酸（すなわち、３’末端に結合したリン酸基）に結合され得る。さらに別の実施形態では、リンカーは、核酸アプタマーを構成するいずれかの残基のリボース環の２’位に結合され得る。核酸アプタマーの残基の数は有限であり、各残基中でリンカーを結合できる部位の数も有限である。従って、当業者は本開示および利用可能な知見に基づいて、過度な試行錯誤なく、核酸アプタマー中でリンカー結合位置の組合せを適宜決定して、標的結合能力が失われないことを容易に確認することができる。
　これらの位置に、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応のために使用可能なアルキン構造またはアジド基が連結または結合された核酸残基、およびそのような核酸残基を組み込む任意の配列の修飾オリゴヌクレオチドは、市販されているか、または当業者が合成することができる。複数のそのような残基を組み込んで核酸を合成することも当業者の通常の技量の範囲内で可能である。また、上記の各位置にアルキン構造またはアジド基が連結または結合された残基を組み込む任意の配列の修飾オリゴヌクレオチドの合成サービスが市販もされている。そのようなアルキン修飾またはアジド修飾オリゴヌクレオチドのための試薬または受託合成サービスを提供している会社の例としてはIntegrated DNA Technologies社、株式会社日本遺伝子研究所、および Sigma-Aldrich社が挙げられるが、これらに限定されない。これらの構造は、従来、例えば核酸の蛍光標識などに利用されてきた。
　リンカーが、核酸アプタマー中の核酸塩基に結合している場合、その塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イノシン（Ｉ）（ヒポキサンチン）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）等のうちのいずれでもあり得るが、Ａ、Ｃ、ＴまたはＵが好ましく、ＴまたはＵが特に好ましい。例えばＣおよびＵについては、それらの塩基を構成するピリミジン環の５位にリンカーが結合し得る。Ｔについては、チミン塩基を構成するピリミジン環の５位のメチル基がリンカーで置き換えられるかたちでリンカーが結合し得、その結果として、上記のようにリンカーが結合したＵと同じ構造になる。本明細書では、このような状態も、Ｔ（チミン）塩基を構成するピリミジン環の５位にリンカーが結合していると呼び得る。Ａ、Ｇ、およびＩについては、それらの塩基を構成するプリン環の７位にリンカーが結合し得る。その場合、プリン環７位の窒素原子は炭素原子に置き換えられ得る。
　一実施形態では、リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第１の核酸残基と、リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れている。第１の核酸残基と第２の核酸残基とが少なくとも５残基離れていてもよく、少なくとも１０残基離れていてもよい。本開示において、第１の核酸残基と第２の核酸残基とが１残基離れているということは両残基が隣接していることを意味し、ｎ残基離れているということは両残基間にｎ－１個の残基が挟まっていることを意味する。また、本開示において「第１の」「第２の」等という用語は、別個の要素（例えば別個の残基）を指すための便宜上のものである。従って、例えば本段落で「第１の核酸残基」「第２の核酸残基」というのは核酸配列上の特定の位置を指しているのではない。
　ある特定の実施形態では、フッ化スルホニル基が連結される複数箇所のうちの少なくとも１つが下記ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかに該当する、配列番号１の配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーが提供される。別の実施形態では、配列番号１中の下記ｉ）とｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、またはｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）においてリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーが提供される：
　ｉ）Ａ９～Ｔ１５のいずれかの核酸塩基；
　ｉｉ）Ｔ２６～Ｔ３２のいずれかの核酸塩基；
　ｉｉｉ）Ｇ３９～Ａ４５のいずれかの核酸塩基。
　ここで、アルファベットは塩基の種類を表し、下付きの数字は配列番号１中の塩基位置を表す。
　さらに具体的な一実施形態では、配列番号１中の下記ｉ）とｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、またはｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）の塩基においてリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーが提供される： 
　ｉ）Ｔ１２；
　ｉｉ）Ｔ２９；
　ｉｉｉ）Ｔ４２。
　上記説明のように核酸配列上で互いに距離を置いた複数の残基にフッ化スルホニル基を導入することにより、一標的に対して複数の共有結合が形成された場合には、アプタマーが特異的にドッキングした状態を共有結合により固定する効果がより堅固になり、その一方で、標的の複数分子に対して共有結合が起こる確率も高まり得る。
　なお、非特許文献１のアプタマーはＤＮＡアプタマーであるから、元来Ｔ塩基を有している。Ｔ塩基のピリミジン環の５位メチル基がリンカーで置き換わるかたちで、リンカーが結合している場合、そのようなリンカー修飾Ｔ塩基は、対応するリンカー修飾Ｕ塩基と同じ構造になるが、ここでは元のアプタマーがＴ塩基の配列を有するものであるから、上記ではＴ１２、Ｔ２９等の表記をしている。ＲＮＡアプタマーのＵ塩基に同種類のリンカーが結合している場合には、結果として同じ構造になっていても「Ｕ塩基にリンカーが結合している」と呼ばれ得る。
［ウォーヘッド］
　フッ化スルホニル基は、－ＳＯ２Ｆという式で表され、生理的条件下でタンパク質の少なくともセリン、スレオニン、リジン、チロシン、システイン、またはヒスチジン残基と反応して共有結合を形成できることが知られる反応性の求電子化学基である（Narayanan et al., Chemical Science 2015, 6(5), 2650-2659）。このように標的と共有結合を形成する反応性の基をウォーヘッド（warhead、弾頭）と呼ぶこともある。本開示において、フッ化スルホニル基が連結された核酸アプタマーをウォーヘッド修飾アプタマーと呼ぶこともある。本開示において、複数のフッ化スルホニル基が連結されていることを「マルチウォーヘッド」という用語で表す。Narayanan et al.の論文に一部が例示されているように、フッ化スルホニル基を有する多様な化合物が合成されており、フッ化スルホニル基を導入するための多様な合成経路が当業者にとって利用可能である。
　どのような構造の化学基としてウォーヘッドを提供するのがより望ましいかを決定することはまだ成熟してない分野であり、特にアプタマー型共有結合性薬剤の文脈における異なるウォーヘッド構造の挙動については比較知見がほとんど蓄積されておらず予測ができなかった。例えばアルキルリンカーに直接－ＳＯ２Ｆを結合させるなど他の態様も考え得るが、本開示の実施形態では－アリール－ＳＯ２Ｆまたは－ヘテロシクリル－ＳＯ２Ｆという形態で存在するウォーヘッド構造がアプタマー型共有結合性薬剤において特に効率的に機能し得るため好ましい。より具体的には、－カルボニル－アリール－ＳＯ２Ｆまたは－カルボニル－ヘテロシクリル－ＳＯ２Ｆが好ましく、－カルボニル－フェニル－ＳＯ２Ｆのような－カルボニル－アリール－ＳＯ２Ｆが特に好ましい。ヘテロシクリルは例えば１，４－ピペラジニレン基であり得る。これらの好ましいウォーヘッド構造は、連結の手法を問わず優れた共有結合能をアプタマーに付与することができることが見出された。
［リンカー］
　上記核酸アプタマーとフッ化スルホニル基（または前述したウォーヘッド構造）とを共有結合的に連結できる限り、多種多様な化学的リンカーを本実施形態において使用できることが当業者に理解される。化学的リンカーは典型的には炭化水素系骨格を有する。炭化水素系骨格には、炭化水素骨格に結合した、および／または炭化水素骨格に挿入された他の原子も含むものも包含される。本開示において、「連結」という用語は、２つの部分が間に他の原子（複数可）を挟んで間接的に結合している状態を意味し、これは２つの部分が間に他の原子を挟まずに直接互いに共有結合している状態と対比される。すなわち、１つの部分（核酸アプタマー）がリンカー構造の一端に結合し、もう１つの部分（フッ化スルホニル基）がそのリンカー構造の別の一端に結合している場合、２つの部分は「連結」されている。「共有結合的に連結」とは、一連の共有結合によって２つの部分が繋がっていることを意味する。例えば、リンカーの一端に核酸アプタマーが、他端にフッ化スルホニル基が共有結合しており、リンカー自体の主骨格も原子間の共有結合からなる場合、核酸アプタマーとフッ化スルホニル基は共有結合的に連結されている。
　当業者は、デザインするリンカーの長さ、親水性、柔軟性、および立体障害性のようなパラメータ、ならびに合成の便宜に応じて、通常の知識に基づいて適切なリンカーを選択し使用することができる。リンカーは例えば、炭素数１～１０のアルキレン、炭素数２～１０のアルケニレン、炭素数２～１０のアルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレンその他の二価複素環基、－ＣＯＮＨ－（もしくは－ＮＨＣＯ－）、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、またはこれらの組合せを含む、またはそれからなる、二価の基であり得るが、これらに限定されない。ヘテロアルキレンは、アルキレン骨格の炭素原子が各箇所につき１つの酸素、窒素、または硫黄原子のようなヘテロ原子で置き換えられたものを表し、エーテル部分、ならびにポリエチレンオキシおよびポリプロピレンオキシのようなポリエーテル部分も含まれる。シクロアルキレンおよびヘテロシクロアルキレンはそれぞれ環状のアルキレンおよびヘテロアルキレンを表す。ヘテロシクロアルキレンには、クラウンエーテルが含まれる。本開示においてリンカーを構成する基には置換および非置換のものが包含される。例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、複素環、および／または－ＮＨ－の水素原子が置換され得る。典型的な置換基の例としては、炭素数１～１０のアルキルおよびアルキルオキシ、アリール、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
　本実施形態におけるリンカーの少なくとも１つまたは全部は、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分を含むものであることが特に好ましい。他の反応基および反応機序により形成される連結部分（例えばアミノ基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基との間で形成されるアミド連結部分）も可能であるが、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応を用いれば、反応後の生成物分離を省略できるほど、きわめて効率的に核酸アプタマーと複数のフッ化スルホニル基との連結およびマルチウォーヘッド共有結合性薬剤の製造を行うことができる。特に、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分の使用により、アプタマー型共有結合性薬剤の共有結合能が格段に向上し得ることが見出された。これらの好ましい連結部分の使用は、ウォーヘッド構造の種類を問わず優れた共有結合能をアプタマーに付与することができる。連結方法によってこのような共有結合能の違いが生じる理由としては、穏和な溶液環境で短時間で行えるアジド－アルキン間クリックケミストリーの反応条件がウォーヘッド化合物の不安定性ないし分解を抑制できる可能性が考えられ、窒素リッチな環を含む連結構造が核酸、標的タンパク質、および／または－ＳＯ２Ｆ基に対して何らかの好ましい物理的化学的作用を提供する可能性等も考えられる。
　アジド－アルキン間クリックケミストリー反応自体は公知であり、当業者は、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分の構造を明確に認識することができる。アジド－アルキン間クリックケミストリー反応は、アジド基（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）と炭素間三重結合（－Ｃ≡Ｃ－）部分との間で起こる［３＋２］環化付加反応として記述することもできる。
　アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分の好ましい一例は下記化学式（Ｉ）で表される２価の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　これは銅(I)触媒アジド－アルキン環化付加（CuAAC）と呼ばれるアジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分である。上記で示す構造式の左側（左腕）が核酸アプタマーに連結または結合され右側（右腕）がフッ化スルホニル基に連結または結合される態様が好ましいが、その逆であってもよい。
　アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分の別の例は、下記一般式（ＩＩ）で表される２価の基である。下記一般式（ＩＩ）中、８員環は置換基（例えばメチル、メトキシ、Ｏ＝、フッ素原子、または芳香族環もしくは脂肪族環の融合）によって置換されていてもよく、例えばビシクロ［６．１．０］構造の一部であってもよい。また、下記一般式（ＩＩ）中、８員環は、他の環との融合に関与していない１つ以上の炭素が窒素等の非炭素原子で置き換えられたヘテロ環であってもよく、典型的には、リンカー（下記一般式（ＩＩ）中の左側の結合腕）の結合部分の炭素が窒素で置き換えられ得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記一般式（ＩＩ）で表される連結部分の具体的な一例を下記化学式（ＩＩａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記一般式（ＩＩ）で表される連結部分のさらに別の具体例を下記化学式（ＩＩｂ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記式（ＩＩ）、（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）で表される構造は、歪み促進型アジドーアルキン環化付加（SPAAC）と呼ばれるアジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分の例である。SPAACは銅触媒を用いる必要がないため、銅フリークリックケミストリー反応とも呼ばれる。
　上記で示した構造式の左側（左腕）が核酸アプタマーに連結または結合され右側（右腕）がフッ化スルホニル基に連結または結合されてもよいし、その逆であってもよい。後述するように、アジド基が核酸アプタマー側から提供されるかあるいはフッ化スルホニル基側から提供されるかによって、連結部分の向きが逆になる。
　リンカーの他の部分は上述した基の組合せであり得る。例えば、リンカーのうち、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分に対して核酸アプタマー側および／またはフッ化スルホニル基側が、炭素数１～１０のアルキレン、炭素数２～１０のアルケニレン、炭素数２～１０のアルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、－ＣＯＮＨ－（もしくは－ＮＨＣＯ－）、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、またはこれらの組合せを含むか、またはそれからなる二価の基であり得る。
　特定の実施形態においてリンカーは、－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－という式で表すことができ、ここで、Ｙは連結部分、例えばアジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分であり、Ｌ１は核酸アプタマーに結合するリンカー部分（後述する第１のリンカーに相当する）であり、Ｌ２はフッ化スルホニル基に結合するリンカー部分（後述する第２のリンカーに相当する）である。－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－全体が後述する第３のリンカーに相当する。具体的な一例において、第３のリンカーは、－Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ２）４－（Ｉ）－ＣＨ２－ＣＯ－Ｃ６Ｈ４－という構造からなり、ここで（Ｉ）は上記化学式（Ｉ）を表す。
　上述したように、リンカーの長さおよび具体的組成は実施者のデザインに応じて変動させ得るが、あくまで目安として、リンカー（特に第３のリンカー）の炭素数は典型的には２～１００の範囲内であり得、より典型的には５～５０の範囲内である。また、あくまで目安として、リンカーの長さ、すなわちリンカーが最大伸張したときの核酸アプタマーとフッ化スルホニル基との間の距離は典型的には１００Å以内であり得、より典型的には５０Å以内、あるいは３０Å以内である。リンカーの長さは典型的に５Å以上であり得、より典型的には１０Å以上である。リンカーの長さを長くすると、フッ化スルホニル基は、よりアプタマー結合部位から離れた部位、あるいは、アプタマー上のリンカー結合点からより離れた部位への共有結合形成が可能になる。通常は標的分子（複数可）内に共有結合が形成されるが、アプタマー結合時に標的分子近傍に存在する別の種類の分子（例えば別のウイルスタンパク質）に対して共有結合が形成できる可能性もある。
［医薬組成物］
　一側面において本開示は、上述したマルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物を提供する。換言すると、本開示は、医薬として使用するための上記マルチウォーヘッド核酸アプタマーを提供する。インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、対象の細胞上の受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害するための上記医薬組成物またはアプタマーも提供される。この場合のアプタマーはマルチウォーヘッド修飾スパイクタンパク質結合アプタマーである。対象の細胞上の受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害する方法であって、対象に有効量の上記アプタマーまたはそれを含む組成物を投与することを含む方法の実施形態も企図される。本開示における「対象」とは、典型的には哺乳類動物またはその組織もしくは細胞である。特定の実施形態において「対象」はヒトまたはその組織もしくは細胞である。対象はヒト患者であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための受容体は、ＡＣＥ２受容体またはニューロピリン１受容体であり得る。
　結合を阻害するとは、結合を防止すること、および／または結合を解消させることを含み得る。スパイクタンパク質の受容体結合部分が、共有結合的に固定された核酸アプタマーによってブロックされたウイルスは、その後無期限に、宿主個体内の細胞に結合する能力が減少または喪失した状態になり、また、他の個体に感染する能力も減少または喪失した状態になることが理解される。本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーおよびそれを含む医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の防止、個体内もしくは個体間の感染拡大の防止、または感染の治療の方法のために利用され得る。
　医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得る。そのような担体または賦形剤の典型的な一例は水である。医薬組成物は例えば人体への注射に適した濃度の塩を含み得る。当業者は、標的タンパク質が存在する部位または領域に有効量の医薬組成物を送達するための適切な投与経路を適宜選択することができる。投与経路の例としては、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、腹腔内、髄腔内、経直腸、経膣、眼球、および吸入が挙げられるがこれらに限定されない。
［アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤の製造方法］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーで例示的に実証されたマルチウォーヘッド化の手法および効果は、他の核酸アプタマーにも適用できる。従って本開示は、より一般的に、アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤の製造方法、およびその方法によって製造されるアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤を提供する。
　この製造方法によって、上述したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合核酸アプタマーに例示されるアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤を製造できることが理解されるべきである。従って、本明細書の核酸アプタマーの態様に関する先行セクションで提供された構造的および機能的な記述は、本製造方法の態様にも適用することができ、その逆も然りである。この製造方法の態様において、標的タンパク質およびそれに対する特異的核酸アプタマーの組合せは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に限らず当業者が既知のもののなかから選択することができる。本態様の方法は、核酸アプタマーに新しい共有結合機能性を付与する方法、あるいは共有結合性核酸アプタマーの結合効率を増強させる方法として記述することもできる。
　本開示は、一態様において、
　標的タンパク質に対する結合効率が増強された核酸アプタマーの製造方法であって、
　ａ）アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にそれぞれ第１の反応基が連結または結合されるように修飾された、標的タンパク質に特異的な核酸アプタマーと、
　ｂ）第１の反応基に対応する第２の反応基とフッ化スルホニル基とが連結または結合された構造を有する、ウォーヘッド化合物と
を反応させて、第１の反応基と第２の反応基の間の反応により形成された連結部分を含むリンカーを介して核酸アプタマーの上記複数の核酸残基のそれぞれとフッ化スルホニル基とが連結されたマルチウォーヘッド構造を取得することを含む、方法を提供する。
　標的タンパク質に対する結合効率の増強とは、共有結合性を有さない同配列の核酸アプタマーと比べて共有結合形成能が付与されていること、または、ウォーヘッドを１つしか有さない同配列の核酸アプタマーと同条件下で比べて、以下のうちの１つ以上を含むことを意味する：共有結合形成速度が増加すること；より少ない濃度で標的に対して共有結合形成できること；より多くの（つまり複数の）標的分子に対して共有結合形成できること；もしくは、標的タンパク質に対する競合他分子の結合をより強く阻害できること。
　アプタマーの核酸配列中で、第１の反応基を有する残基の数は、２個、３個、もしくは４個であり得、または５個、６個、もしくはそれ以上の数とすることも可能であり得る。第１の反応基を有する残基の数は、例えば核酸アプタマーに含まれる残基の総数の２０％未満あるいは１０％未満とし得る。本開示において、第１の反応基を有する残基は、フッ化スルホニル基を連結するリンカーが結合する残基に対応する。
　第１の反応基を有する複数の核酸残基のうちの第１の核酸残基と第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れていることが好ましい。第１の核酸残基と第２の核酸残基とは、少なくとも５残基、または少なくとも１０残基離れていてもよい。
　第１の反応基を有する核酸残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーの末端の残基ではなく内部残基であってもよい。例えば、第１の反応基を有する核酸残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーの５’末端または３’末端から５残基以上、または１０残基以上内部に位置する残基であり得る。第１の反応基を有する核酸残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーのコア配列中の残基であってもよい。例えば、第１の反応基を有する核酸残基の少なくとも１つまたは全部が、核酸アプタマーのコア配列の５’末端または３’末端から５残基以上、または１０残基以上内部に位置する残基であり得る。
　好ましい一実施形態では、複数ある第１の反応基の少なくとも１つまたは全部が、核酸残基中の核酸塩基に連結または結合している。別の実施形態では、第１の反応基は、核酸アプタマーの５’末端または５’末端リン酸（すなわち、５’末端に結合したリン酸基）に連結または結合され得る。別の実施形態では、第１の反応基は、核酸アプタマーの３’末端もしくは３’末端リン酸（すなわち、３’末端に結合したリン酸基）に連結または結合され得る。さらに別の実施形態では、第１の反応基は、核酸アプタマーを構成するいずれかの残基のリボース環の２’位に結合され得る。核酸アプタマーの残基の数は有限であり、各残基中でリンカーを結合できる部位の数も有限である。従って、当業者は本開示および利用可能な知見に基づいて、過度な試行錯誤なく、リンカー結合位置の組合せを適宜決定して、標的結合能力が失われないことを容易に確認することができる。
　上記（ａ）の第１の反応基に対して、（ｂ）の第２の反応基が「対応する」とは、第１の反応基と第２の反応基の組合せによって両基間で当業者に知られる連結反応を行える関係にあることを意味する。例えば、（ａ）の第１の反応基が、（ａ１）炭素間三重結合（－Ｃ≡Ｃ－）を有する基、または（ａ２）アジド基であり、第１の反応基に対応する（ｂ）の第２の反応基が、（ｂ１）アジド基、または（ｂ２）炭素間三重結合（－Ｃ≡Ｃ－）を有する基であり、反応はアジド－アルキン間クリックケミストリー反応であることが特に好ましい。つまり、例えば（ａ）の基がアルキン構造の基（ａ１）である場合には（ｂ）の基はアジド基（ｂ１）であり、逆に、（ａ）の基がアジド基（ａ２）である場合には（ｂ）の基はアルキン構造の基（ｂ２）となる。当業者に知られる他の反応基および反応機序により連結部分を形成することも可能である。例えば別の一例では、（ａ）の第１の反応基が、（ａ３）ＮＨＳエステル基または（ａ４）アミノ基であり、（ｂ）の第２の反応基が、（ｂ３）アミノ基または（ｂ４）ＮＨＳエステル基である。
　本実施形態の方法における連結反応は、マルチウォーヘッド型アプタマーを生成する反応であるから、複数個の第１の反応基と、対応する複数個の第２の反応基が関与することが理解される。「第１の反応基」という用語は、ウォーヘッド化合物側ではなく核酸アプタマー側にある反応基を指すための便宜上のものであり、複数個の第１の反応基が互いに完全同一の構造を有することは必ずしも求められない。
　本開示では、アルキニル基、シクロアルキニル基、およびヘテロシクロアルキニル基を含め、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応に使用可能な炭素間三重結合を有する基を「アルキン構造」とも呼ぶ。
　アルキニル基は、末端アルキンに基づくものでも、内部アルキンに基づくものでもよい。アジド－アルキン間クリックケミストリー反応に用いられ得るシクロアルキニル基およびヘテロシクロアルキニル基は当業者に知られており、通常は７員または８員のものであり、置換基（例えばメチル、メトキシ、Ｏ＝、フッ素原子、または芳香族環もしくは脂肪族環の融合）によって置換されていてもよい。ヘテロシクロアルキニル基は、シクロアルキニル基の環の１つ以上の炭素が窒素等の非炭素原子で置き換えられたものである。典型的には、環のうちリンカーに結合する部分の炭素が窒素で置き換えられ得る。シクロアルキニル基およびヘテロシクロアルキニル基は上述したSPAACに用いることができ、従って銅(I)イオンの不在下でクリックケミストリー反応を起こすことができる。アジド基は－Ｎ３という式で表される基である。
　SPAACに用いられ得るものとして当業者に知られるアルキン構造の例として、OCT（シクロオクチン）、MOFO（モノフルオロシクロオクチン）、DIFO（ジフルオロシクロオクチン）、DIMAC（ジメトキシアザシクロオクチン）、DIFBO（ジフルオロベンゾシクロオクチン）、DIBO（ジベンゾシクロオクチン）、DIBAC（ジベンゾアザシクロオクチン）、BARAC（ビアリールアザシクロオクチンオン）、およびBCN（ビシクロ[6.1.0]ノニン）にそれぞれ由来する１価の基が挙げられる。
　ヘテロシクロアルキニル基の一具体例を下記化学式ＩＩＩに、シクロアルキニル基の一具体例を下記化学式ＩＶに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　第１の反応基は、核酸アプタマーに直接結合していてもよく、あるいはリンカーを介して核酸アプタマーに連結されていてもよい。特にシクロアルキニル基、ヘテロシクロアルキニル基、およびアジド基は、典型的にリンカーを介して核酸アプタマーに連結される。本開示において、核酸アプタマーと第１の反応基とを連結するリンカーを第１のリンカーと呼ぶこともある。
　当業者は、デザインするリンカーの長さ、親水性、柔軟性、および立体障害性のようなパラメータ、ならびに合成の便宜に応じて、適切な第１のリンカーを選択し使用することができる。第１のリンカーは例えば、炭素数１～１０のアルキレン、炭素数２～１０のアルケニレン、炭素数２～１０のアルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、－ＣＯＮＨ－（もしくは－ＮＨＣＯ－）、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、またはこれらの組合せを含む、またはそれからなる、二価の基であり得るが、これらに限定されない。リンカーを構成する上記の基には置換および非置換のものが包含される。例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、および／または－ＮＨ－の水素原子が置換され得る。典型的な置換基の例としては、炭素数１～１０のアルキルおよびアルキルオキシ、アリール、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
　核酸アプタマー（左）をアルキニル基（右）に連結する第１のリンカーの非限定的な具体例を以下に記載する：－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～１０の整数）；－Ｏ－ＣＨ２－；－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－（ｎは１～１０の整数）；－Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～１０の整数）；および－Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）２－（ｎは１～１０の整数）。第１のリンカーの特定の一具体例は、－Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ２）４－である。
　核酸アプタマー（左）をシクロアルキニル基またはヘテロシクロアルキニル基（右）に連結する第１のリンカーの非限定的な具体例を以下に記載する： －（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）４－（ＣＯ）－（ｎは１～１０の整数）；－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）４－（ＣＯ）－（ｎは１～１０の整数）；－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～１０の整数）；－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－；－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－（ｎは１～１０の整数）；－（ＣＨ２）６－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）３－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－。
　ウォーヘッド化合物という用語は、本実施形態の連結反応に関与する２つの化合物のうち１つであって、コバレントドラッグにおける共有結合形成能を提供するフッ化スルホニル基を有する化合物を意味する。ウォーヘッド化合物における上記第２の反応基は、フッ化スルホニル基に直接結合していてもよく、あるいはリンカーを介してフッ化スルホニル基に連結されていてもよい。本開示において、フッ化スルホニル基と上記第２の反応基とを連結するリンカーを第２のリンカーと呼ぶこともある。
　当業者は、デザインするリンカーの長さ、親水性、柔軟性、および立体障害性のようなパラメータ、ならびに合成の便宜に応じて、適切な第２のリンカーを選択し使用することができる。第２のリンカーは例えば、炭素数１～１０のアルキレン、炭素数２～１０のアルケニレン、炭素数２～１０のアルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、－ＣＯＮＨ－（もしくは－ＮＨＣＯ－）、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、またはこれらの組合せを含む、またはそれからなる、二価の基であり得るが、これらに限定されない。特に、第２のリンカーのうちフッ化スルホニル基に結合する末端部分がアリーレン（例えばｐ－フェニレン）またはヘテロシクロアルキレン（例えば１，４－ピペラジニレン）であることが好ましく、カルボニル－アリーレンまたはカルボニル－ヘテロシクロアルキレンであることがより好ましい。リンカーを構成する上記の基には置換および非置換のものが包含される。例えば、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、および／または－ＮＨ－の水素原子が置換され得る。典型的な置換基の例としては、炭素数１～１０のアルキルおよびアルキルオキシ、アリール、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。第２のリンカーの特定の一具体例は－ＣＨ２－ＣＯ－Ｃ６Ｈ４－である。
　ウォーヘッド化合物の非限定的な具体例を下記化学式（Ｖ）～（Ｘ）に示す。下記各式において、アジド基とフッ化スルホニル基とを連結している部分が第２のリンカーである。下記化合物はいずれもアジド基を有するものであるが、アジド基のかわり上述した他の第２の反応基（例えば炭素間三重結合を有する基）を有するウォーヘッド化合物も企図される。下記各化学式において、カルボニル基からフッ化スルホニル基までを含む一価の基が、好ましいウォーヘッド構造の例を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　アジド－アルキン間クリックケミストリー反応の具体的な反応条件は当業者によく知られている。例えば、トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミンのような銅(I)安定化リガンドおよびアスコルビン酸のような還元剤、ならびに硫酸銅(II)の存在下で、アルキン構造含有化合物とアジド基含有化合物とを水溶液中で混合することによって、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応を行うことができる。SPAACの場合は銅触媒系は不要である。アジド－アルキン間クリックケミストリー反応は室温で行うことができる。
　当業者に知られる連結反応（特にアジド－アルキン間クリックケミストリー反応）により、第１の反応基と第２の反応基に由来して上述した連結部分が形成される。結果として、この連結部分を含むリンカー（本開示において「第３のリンカー」と呼ぶ）を介して核酸アプタマーの複数の残基と複数のフッ化スルホニル基とが連結されたマルチウォーヘッド構造が生じる。この構造が、マルチウォーヘッド修飾核酸アプタマーの実施形態を提供し、また、コバレントドラッグ組成物の有効成分を提供することができる。第３のリンカーは、－（第１のリンカー）－（上記連結部分）－（第２のリンカー）－という構造を有する２価の基であり得る。
　下記スキーム１に、ウォーヘッド化合物の合成、および、核酸塩基においてリンカーを介して第１の反応基（アルキニル基）で修飾された核酸アプタマーとウォーヘッド化合物との連結反応の、具体的な一例を示す。１はウォーヘッド化合物の前駆体、２はウォーヘッド化合物、３はアルキニルリンカー修飾された核酸アプタマーの内部残基、４はウォーヘッド修飾核酸アプタマーの内部残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本方法は、上記連結反応を行う前に、ａ）の核酸アプタマーを化学合成することをさらに含み得る。本実施形態におけるａ）の核酸アプタマー成分は、本質的に修飾オリゴヌクレオチドであり、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法を適用して合成することができる。好適な化学合成法の一例はホスホロアミダイト法であるが、必ずしもこれに限定されない。
　例えば、第１の反応基が連結または結合された核酸塩基を有する少なくとも１つのヌクレオシドを（例えばホスホロアミダイト誘導体の形態で）、所望の配列の所望の複数残基における基質として用いて、修飾オリゴヌクレオチドを化学合成することによって、複数残基において第１の反応基が連結または結合された核酸アプタマーを化学合成することができる。
　核酸アプタマーは、高い標的特異性を提供できること、解毒可能であること、それ自体が免疫反応をほとんど引き起こさないことといった利点を有することから、高い薬効および安全性を有し得、医薬品として有望視されている。一方、生体内での安定性が低いこと、より具体的には腎臓での除去に起因して循環中の半減期が短いことが、アプタマー型医薬の弱点であると考えられており、その医療応用が遅れている一因となっている。本開示の実施形態で提供されるアプタマー型共有結合性薬剤は、標的タンパク質に対して結合した後、ひとたびウォーヘッド部分が標的タンパク質に対し共有結合を形成すれば、標的タンパク質上または標的タンパク質近傍に保持され、標的タンパク質への影響を維持し続けることができる。従ってアプタマー型共有結合性薬剤は例えば、受動的で短い半減期を有する従来のアプタマー型医薬とは異なる薬物動態において薬効の持続を得ることが可能である。本開示に係るアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤は、これらの利点を顕著に向上させ得るだけでなく、下記実施例に示すように、従来のアプタマー型薬剤や従来の共有結合性薬剤には見られなかった異質な効果も提供することができる。
　以下、実施例を示して本開示の実施形態をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は例示であって、本発明はこれらの具体的実施形態に限定されない。
［材料と方法］
１．全般的事項
　非特許文献１に記載された、配列5’-CAGCACCGACCT12TGTGCTTTGGGAGTGCT29GGTCCAAGGGCGT42TAATGGACA-3’ （配列番号１）からなる無修飾のSARS-CoV-2スパイクタンパク質結合アプタマー、ならびに、上記配列の第12位T（T12）、第29位T（T29）、および第42位T（T42）のうちの1箇所、2箇所、または3箇所がそれぞれアルキンリンカー修飾Tで置き換えられた配列からなるアルキンリンカー修飾アプタマーを、Integrated DNA Technologies社においてカスタム合成した。これらのアルキンリンカー修飾Tは、チミン（T）塩基のピリミジン環の5位に、通常のメチル基の代わりに、-C≡C-(CH2)4-C≡CHが結合したものである。ここで、-C≡C-(CH2)4-を第１のリンカー、-C≡CHをアルキニル基として認識することができる。
　SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（# SPD-C52H3）は米国ACROBiosystems社から購入した。以下、このSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインをRBDと略記する。ヒト血清（#H4522）は米国Aldrich社から購入した。
　NMR実験は、500MHz核磁気共鳴装置（JNM-ECA500、日本電子株式会社）を使用して25℃で行った。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析は、光ダイオードアレイ（PDA）および／またはLCQ-Fleetイオントラップ質量分析計に接続されC18逆相カラム（Hypersil GOLD、2.1×100 mm、米国Thermo Fisher Scientific社）が備え付けられたAgilent 1100 HPLCシステム（米国Agilent Technologies社）上で、0.1%ギ酸を含むアセトニトリル0-100%勾配を流速300μL／分で用いて行った。アプタマーの小規模定量分析を、蛍光検出器およびそれに続くPDAに接続された逆相セミミクロHPLCシステム（C18カラムを伴うPU-2085、日本分光株式会社）を用いて行った。20 mMトリエチルアミンアセテート水溶液（pH 7.4）を含むアセトニトリル0-60%勾配を流速200μL／分で26分間に渡り使用することによってアプタマーを分離した。
　染色したゲルおよびゲル内蛍光の画像は全てChemDoc XRS+（米国Bio-Rad Laboratories社）により撮影し、Image Lab（商標）ソフトウェア（米国Bio-Rad Laboratories社）を使用してバンド強度を定量化した。
２．共有結合性アプタマーの合成
２．１．ウォーヘッド化合物1の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　以下の手順により、ウォーヘッド化合物1を調製規模で合成した。
　4-(2-ブロモアセチル)-ベンゼン-1-スルホニルフルオリド（71.1μmol、米国Aldrich社、#00364）とアジ化ナトリウム（64.6μmol、和光純薬、#195-11092）を、323μLのジメチルスルホキシド（DMSO）中で混合した。反応混合物を室温で10分間ボルテックスし、続いて冷水（0.5 mL）と混合して、酢酸エチル（1 mL）で抽出した。回収した有機相を飽和NaHCO3（0.5 mL×2）および鹹水（0.5 mL×2）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させて、黄色固形物として純粋な産物を得た（11.8 mg、収率49%）。1Hおよび13C NMRによって、上図右側に示すウォーヘッド化合物1が同定された。該化合物において、アセチル-ベンゼン部分を第２のリンカーとして認識することができる。
２．２．ウォーヘッドが連結されたアプタマーの合成
　トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル（水中に0.5μmol、米国Aldrich社、#762342）と硫酸銅(II) （水中に0.25μmol、米国Aldrich社、#451657）を混合した。次に、各アルキンリンカー修飾アプタマー（水中に10 nmol）と50 mMウォーヘッド化合物1（DMSO中に0.5μmol）を加え、さらにアスコルビン酸（水中に0.4μmol、米国Aldrich社、# A92902）を添加した後１時間にわたり室温で混合物を反応させた。反応産物を、エタノール沈殿により精製した。具体的には、粗製反応産物に3M酢酸ナトリウム（水中に9μmol）および-20℃に冷却したエタノールを加え、-20℃で１時間インキュベートした。その後遠心分離を行い（15000 rpm、20分、4℃）、上清を除去し、沈殿物を70%エタノール溶液で洗浄した後にヌクレアーゼフリー水に溶解した。HPLC分析により、それぞれウォーヘッドが連結された純粋なアプタマーが同定された。
　以下、SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合アプタマーをSC2BAと略記し、特にウォーヘッド修飾アプタマーはT12、T12/T29等と略記する。この略記中、Tはウォーヘッド修飾された塩基の種類を表し（T＝チミン）、12、29等の数字は、ウォーヘッド修飾されたその残基の、配列番号１中の位置を表し、複数の残基がスラッシュ「/」で隔てられて記載されている場合はその複数の残基がウォーヘッド修飾されていることを表す。
３．共有結合モビリティシフトアッセイ
　無修飾SC2BA、および1つまたは複数のウォーヘッドが連結されたSC2BA（各60μM）を、それぞれリン酸緩衝食塩水（D-PBS、pH 7.4）中でRBD（6μM）と混合し、37℃で12時間インキュベートした。その後混合物を、βメルカプトエタノールを含む1Xサンプルバッファーと混ぜ、沸騰水中で変性させて、12%ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分離した。ゲル上の全タンパク質をクーマシーブリリアントブルー（CBB）染色により可視化した。SC2BAがRBDに共有結合すると、ゲル上でRBDのモビリティシフトとして検出することができた。
　未反応のRBD（すなわち、アプタマーと共有結合反応を起こしていないRBD）のバンドを、Image Lab（商標）ソフトウェアにより定量化した。修飾SC2BAを加えなかった試料における未反応のRBDのバンドの強度を100%として標準化し、他の各試料におけるそのバンドの相対的強度を決定した。
　上記は基本的な実験条件を記載している。図面に示されているように各実験の目的に応じて、試薬の濃度や反応時間を適宜調節した。
４．ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）
　RayBio社のCOVID-19 Spike-ACE2 binding assay kit IIを利用した。このアッセイは、表面にヒトACE2受容体タンパク質が固定化されたプレートを使用し、Fcタグ標識されたRBDタンパク質をそこに加えてACE2-RBD相互作用を起こさせ、洗浄後、HRP標識抗Fc抗体を反応させて、HRP酵素による基質（TMB：3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）の発色を測定することにより、ACE2-RBDの結合を定量化するものである。アプタマー投与の影響を調べる実験では、はじめに、Fc標識RBDタンパク質と、無修飾SC2BA、または1つもしくは複数のウォーヘッドが連結されたSC2BA（100μM）とを反応させた。次に、ACE2固定化プレートにこの反応溶液を加えてタンパク質・タンパク質相互作用を起こさせ、その後洗浄を行った。最後に、HRP標識抗Fc抗体を反応させて、HRP酵素基質の発色を測定することにより、アプタマーの存在がACE2-RBD結合を阻害する能力を定量化した。上記手法に関して、ヒトACE2受容体タンパク質とFc標識RBDタンパク質とを先に相互作用させた後に各SC2BAを加えても同様の阻害活性を示すことが確認されている。
［結果と考察］
　核酸アプタマーにフッ化スルホニル基（ウォーヘッド）を連結させる反応の概略は、上記スキーム１で示した通りである。この例では、アプタマーの配列末端ではなく配列内部の塩基にフッ化スルホニル基が連結されている。また、この例ではチミン塩基にフッ化スルホニル基が連結されているが、同様の手法で他の箇所にフッ化スルホニル基の連結を行うこともでき、チミンに限定する必然性はない。図示していないが、反応後の反応混合物を未精製のままHPLCで分析した結果、リンカーの位置および数に関わらず、ウォーヘッド導入が完了した分子が少なくとも90%以上の高い純度で得られていた。
　図１（ａ）は、無修飾SC2BAまたはウォーヘッド修飾SC2BAを、37℃の生理的活性条件下でRBDと12時間インキュベートした後に、反応混合物をSDS-PAGEで分離し、CBBでタンパク質を可視化した結果を示す。示されたゲルの第１レーンは分子量マーカーである。RBD単独は約32 kDaの見かけ上の分子量を有する（第２レーン）。これに無修飾SC2BAを結合させても、変性・還元性条件であるSDS-PAGEのゲル中に流すとRBDのモビリティに変化は起こらない（第３レーン）。対照的に、核酸配列の第12位、第29位、または第42位にリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されたウォーヘッド修飾SC2BA（それぞれ、T12、T29、T42）を結合させた場合には、アプタマーがRBDに対して共有結合を形成し、そのためSDS-PAGE上でRBDのモビリティのシフト、すなわち分子量の増加が確認された（第４～６レーン、破線枠）。対応して、モビリティシフトしていないバンド、すなわち未共有結合RBDは量が減少している。この未共有結合RBDバンドの強度を定量的に測定したところ、系中の約60～65%程度のRBDに対して共有結合が形成されていたことがわかった（ｂ）。非特許文献１によるシミュレーションによるとSC2BAの第29位および第42位はRBDに対する結合面にほぼ位置するのに対し、第12位はRBD結合面から離れていると推測された。
　RBDに匹敵する量のBSA（ウシ血清アルブミン）を共存させた条件で上記と同じ実験を行ったが、RBDに対する共有結合の形成率は上記の実験と実質的に変わらず、BSAのモビリティシフトも検出されなかった（図示していない）。このことは共有結合性アプタマーの標的特異性を実証している。また、共有結合性アプタマーの濃度を２倍に増やして上記と同じ実験を行ったところ、RBDに対する共有結合の形成率が数パーセント値増加したが、共有結合形成率が70%を超えることはなかった（図示していない）。
　次に、T12/T29、またはT12/T42という、それぞれ一分子当たり２残基にフッ化スルホニル基を連結させたダブルウォーヘッドアプタマーを作製し、上記と同じモビリティシフトアッセイを行った。驚くべきことに、核酸アプタマー本体の２箇所にリンカーを導入して２つのウォーヘッドを連結させても、これらアプタマーの標的特異的結合能は失われず、しかも、共有結合形成率が70%を超える顕著な結合効率向上が達成された（図２）。
　図３は、ダブルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用の濃度依存性を調べた結果を示す。図３のａ、ｂはT12/T29についての結果、ｃ、ｄはT12/T42についての結果である。EC50はそれぞれ約2～3μMと決定された。濃度比依存的に、標的タンパク質-アプタマーの二分子共有結合複合体（RBD-SC2BA）に加えて、標的タンパク質-アプタマー-標的タンパク質という三分子共有結合複合体（RBD-SC2BA-RBD）も生じることが見出された。これについては後述する。ダブルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用のタイムコースを調べたところ、T1/2はそれぞれ約30分と決定され、大部分の共有結合反応が1時間以内で迅速に起こると見られた（図示していない）。
　核酸アプタマーのコア配列の異なる２箇所にリンカーとウォーヘッドを導入してもアプタマーの特異的相互作用が失われずむしろ共有結合効率の著しい向上が得られるという驚くべき発見を受けて、次に、第12位、第29位、および第42位の３箇所すべてにリンカーおよびウォーヘッドを導入したトリプルウォーヘッドアプタマーを作製し実験を行った。リンカー・ウォーヘッドの増加が構造的悪影響を及ぼすであろうという予測に反して、アプタマーの標的特異的結合能は依然として堅牢に維持され、しかも80%を超える著しく高い共有結合形成率が達成された（図４）。
　図５は、トリプルウォーヘッドアプタマー（24μM）と標的タンパク質（6μM）との共有結合的相互作用のタイムコースを調べた結果を示す。アプタマーと標的タンパク質が混合されてから15分間以内で50%超の標的タンパク質に共有結合が形成され、60分間以内に反応がほとんど完了している。これは一般的にコバレントドラッグとしてかなり速い反応速度である。
　図６（ａ）は、トリプルウォーヘッドアプタマーと標的タンパク質との共有結合的相互作用の濃度依存性を調べた結果を示す。標的タンパク質（RBD）に対するアプタマーの濃度が相対的に低いときには、一分子のアプタマーが二分子の標的タンパク質に対して共有結合を形成できることが見出された（RBD-SC2BA-RBD）。これは２つのウォーヘッドを有するアプタマーを用いた実験でも観察されていたことである（図３）。１つの共有結合が形成された後に、アプタマー部分と標的分子とのドッキングがいったん解離して、両者がリンカーで繋ぎ止められた状態になる瞬間があり得ることは非特許文献３でも示唆されていた。マルチウォーヘッドアプタマーの場合には、その際に別の標的分子と新たなドッキングおよび共有結合を形成する機会が生じると考えられる。これはアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤に特有の事象であり、従来の共有結合性薬剤では知られていなかった新しい薬剤機序を表す。この機序の結果として、投与されたアプタマーが標的タンパク質の50%の濃度で存在している場合でも、標的タンパク質の50%超に共有結合が形成され得ることがわかる（図３ｂおよびｄ、図６ｂ）。
　図６（ａ）におけるRBD-SC2BA-RBDのバンドで顕著に見られるように、これらの実験において、ゲル上で共有結合複合体はスプリットしたバンドとして現れることがある。マルチウォーヘッドアプタマーの場合、どのウォーヘッドがどの標的分子のどの位置と共有結合するかに基づいて復数通りの組合せが理論上存在し、実際にそのような複数の複合体分子種が電気泳動速度のわずかな違いを生じていると考えられる。
　図７は、ヒト血清が存在する条件下で標的タンパク質RBDとトリプルウォーヘッドアプタマーとを混合した実験の結果を示す。高濃度の血清タンパク質群の共存下でも、標的タンパク質に対する共有結合形成の程度は実質的に減少しなかった（「RBD」バンドの強度参照）。血清タンパク質に対する非特異的な反応も少し起こっている可能性は排除できないが、タンパク質量比を考慮すれば圧倒的大部分の共有結合反応がRBDに対して選択的に起こっていることが明らかである。
　ヒトのACE2は、SARS-CoV-2にとっての主要な受容体であり、SARS-CoV-2がヒトに感染する開始点である。図８は、SARS-CoV-2のRBDとヒトのACE2との間のタンパク質-タンパク質相互作用をアッセイするELISA実験を示しており、投与されたアプタマー薬剤がウイルスとヒト受容体との相互作用をどれほど阻害できるかを調べることを目的としている。抗体を用いた研究で実証されてきたように、RBD-ACE2相互作用を阻害するとSARS-CoV-2ウイルスによる細胞への感染が阻害される。
　RBDに対するACE2のKd（解離定数）は34.6 nMであり、RBDに対する無修飾SC2BAのKdは約5.8 nMであると報告されている（非特許文献１）。図８の結果は、無修飾SC2BAが確かにSARS-CoV-2のRBDとヒトACE2との相互作用を阻害する能力を有するが、その効果は限定的であり得ることを示している。しかしながら、ウォーヘッドを１つ導入して共有結合性を持たせたアプタマーは、ウイルスタンパク質とヒト受容体との相互作用を阻害する効力を著しく改善させた（T12の例を図示している）。さらに、複数の共有結合性ウォーヘッドを導入したアプタマーは、驚くべきほど高いレベルに増強された阻害能を示し、トリプルウォーヘッドアプタマーに至ってはウイルスタンパク質とヒト受容体との相互作用を少なくとも90%以上阻害できた（図８）。
　上記で強調したように、本願で開示される原理は他の核酸アプタマーにも適用することができ、SARS-CoV-2スパイクタンパク質結合アプタマーについて説明および例示されることは他の核酸アプタマーでも観察することができる。図９はその一例として血管内皮細胞増殖因子（VEGF）結合アプタマーのデータを示す。このVEGF結合核酸アプタマー自体（5’-CAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGT-3’；配列番号２）は、Kaur and Yung, PLoS ONE, 2021, 7:e31196に記述されている。VEGFは、広く癌細胞で過剰発現される強力な血管新生性の分裂促進因子である。この核酸アプタマーは、より長い既存のVEGF結合アプタマーを切り詰めることによってKaurらによって作られた、Kd値0.5 ± 0.32 nMというきわめて高い標的結合親和性を有するものである。本質的に上記と同じようにしてマルチウォーヘッド修飾VEGF結合アプタマーを作製し、固定量の組換えVEGF165タンパク質（VES-H6248、ACROBiosystems社）と反応させ、SDS-PAGE上で、未反応の（すなわち共有結合を形成していない）VEGFバンドの強度を定量した。図９に示す実験において、各試料中のアプタマーの濃度は100μMである。VEGFはグリコシル化されているため正確な分子量およびモル濃度を決定することができないが、いずれにせよこれはVEGFに対してアプタマー過剰の条件である。「none」はアプタマーを加えていないVEGFタンパク質単独の試料を表しており、これを未反応バンドの相対的定量化の基準点とした。マルチウォーヘッド修飾VEGF結合アプタマー（T4/T17およびT4/T22；数字は配列番号２における残基番号を示す）は、単一ウォーヘッド修飾アプタマー（T4、T17、およびT22）と比べて、VEGFタンパク質への共有結合効率の明らかな増強を示している。
　本実施例で例示した結果は、核酸アプタマーに複数の共有結合性ウォーヘッドを連結させても概してアプタマーの構造的統一性および標的特異的結合能を維持できること、それどころか、標的に対する共有結合形成が速くなり、ときには複数個の標的分子に対して共有結合が形成されて、特異的結合に基づく薬理効果を顕著に増強できることを実証している。本実施例では特に、SARS-CoV-2に対する特異的かつ効果的な薬剤としてのアプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤を実証した。
　本実施例で示されるように、アプタマー型マルチウォーヘッド共有結合性薬剤は、環境応答性（ER: Environment Responsive）コバレントドラッグという新しい側面も有し得る。すなわち、薬剤の濃度が比較的低いときには、各々の薬剤分子が孤軍奮闘して、一薬剤分子につき二つの標的分子に共有結合を形成し得る一方、薬剤の濃度が比較的高いときは、一点集中で、一薬剤分子が一つの標的分子に複数の共有結合を形成することができる。本発明者が知る限り、このように環境に応じて共有結合特性を変えるコバレントドラッグが報告されたことは今までなかった。

Claims (13)

  1. 　複数のフッ化スルホニル基を有するマルチウォーヘッド核酸アプタマーであって、前記複数のフッ化スルホニル基は、核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にリンカーを介して連結されている、マルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  2. 　リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第１の核酸残基と、リンカーを介してフッ化スルホニル基が連結された第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れている、請求項１に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  3. 　前記複数のフッ化スルホニル基は、前記核酸アプタマーにアジド－アルキン間クリックケミストリー反応により連結されており、前記リンカーは、アジド－アルキン間クリックケミストリー反応により形成される連結部分を含むリンカーである、請求項１に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  4. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合核酸アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して共有結合することができる、請求項１に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  5. 　５’－ＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＧＧＡＣＡ－３’
    の核酸配列（配列番号１）を有し、
    　前記核酸配列中の複数の核酸残基に、それぞれリンカーを介してフッ化スルホニル基が連結されている、
    　請求項４に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  6. 　前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、請求項１～５のいずれか一項に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマー。
  7. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物。
  8. 　請求項４または５に記載のマルチウォーヘッド核酸アプタマーを含む医薬組成物であって、対象の細胞上の受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害するための、医薬組成物。
  9. 　標的タンパク質に対する結合効率が増強された核酸アプタマーの製造方法であって、
    　ａ）アプタマーの核酸配列中の複数の核酸残基にそれぞれ第１の反応基が連結または結合されるように修飾された、標的タンパク質に特異的な核酸アプタマーと、
    　ｂ）前記第１の反応基に対応する第２の反応基とフッ化スルホニル基とが連結または結合された構造を有する、ウォーヘッド化合物と
    を反応させて、前記第１の反応基と前記第２の反応基の間の反応により形成された連結部分を含むリンカーを介して前記核酸アプタマーの前記複数の核酸残基のそれぞれとフッ化スルホニル基とが連結されたマルチウォーヘッド構造を取得することを含む、方法。
  10. 　前記複数の核酸残基のうちの第１の核酸残基と第２の核酸残基とが、少なくとも３残基離れている、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記第１の反応基が、（ａ１）炭素間三重結合を有する基、または（ａ２）アジド基であり、
    　前記第１の反応基に対応する前記第２の反応基が、（ｂ１）アジド基、または（ｂ２）炭素間三重結合を有する基であり、
    　前記反応はアジド－アルキン間クリックケミストリー反応である、
    　請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　前記マルチウォーヘッド構造において、前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、請求項９または１０に記載の方法。
  13. 　前記マルチウォーヘッド構造において、前記フッ化スルホニル基は－アリール－ＳＯ２Ｆの形態で存在している、請求項１１に記載の方法。
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