ES2629615T3 - Ácido L-nucleico modificado - Google Patents

Abstract

Ácido L-nucleico modificado que comprende una parte de ácido L-nucleico y una parte de ácido no L-nucleico, en donde la parte de ácido L-nucleico está conjugada con la parte de ácido no L-nucleico, en donde la parte de ácido Lnucleico es un spiegelmero y la parte de ácido no L-nucleico presenta un peso molecular mayor que 300 Da, para uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico o diagnóstico de un organismo, conduciendo la conjugación de la parte de ácido L-nucleico con la parte de ácido no L-nucleico a una segregación ralentizada del organismo, en comparación con un ácido L-nucleico que comprende sólo la parte de ácido L-nucleico.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

15

25

35

45

55

reducción 14, la amida de ácido partiendo de un ácido y una amina 15,16, los ésteres partiendo de ácido carboxílico o de los ácidos carboxílicos activados arriba mencionados y alcohol, sulfonamida partiendo de amina y cloruro de sulfonilo 17, aminas secundarias partiendo de un epóxido y una amina 18,19, tioéter partiendo de un epóxido y un tiol 20, disulfuro partiendo de un tiol y otro tiol o un disulfuro 21,22, hidrazonas partiendo de una hidrazina y un aldehído o una cetona, pudiendo reducirse la hidrazona adicionalmente para formar una hidrazina modificada estable 23, fosfotioatos partiendo de un fosfato o de un ácido fosfórico activado tal como, por ejemplo, fosforoimidazolida y un tiol 24, fosforoamidato partiendo de un fosfato o de un ácido fosfórico activado tal como, por ejemplo, fosforoimidazolida o fos-N-hidroxibenzotriazol y una amina 24-27 . En este caso, se encuentra en el marco de la presente invención acoplar primeramente un enlazador a través de un enlace fosforoamidato o fosfotioato a la parte de ácido L-nucleico y, a continuación, a la parte de ácido no L-nucleico. Enlazadores de este tipo pueden ser, en particular, etilendiamina o cisteamina.

Las explicaciones precedentes son válidas básicamente tanto para el caso de que el grupo lábil reactivo mencionado en primer lugar no esté dispuesto en la parte de ácido no L-nucleico, como para el caso de que esté dispuesto en la parte de ácido L-nucleico. La correspondiente modificación del ácido L-nucleico, en el sentido de que se proporcione un correspondiente grupo reactivo, es conocida por los expertos en este sector. Lo mismo es válido para la parte de ácido no L-nucleico.

La expresión ácido L-nucleico se utiliza en esta memoria de manera sinónima a la expresión L-oligonucleótidos o Lpolinucleótidos y designa, entre otros, tanto ácido L-desoxirribonucleico como también ácido L-ribonucleico y combinaciones de los mismos, es decir, que grupos individuales o un grupo de nucleótidos se presenta en forma de ARN y los otros nucleótidos que constituyen el ácido nucleico se presentan en forma de ADN, y viceversa. También en este caso está previsto que, en lugar de desoxirribosa o ribosa, otros azúcares configuren el componente azúcar del nucleótido. Está comprendido, además, el uso de nucleótidos con otras modificaciones en la posición 2’ tales como NH2, OMe, OEt, Oalquilo, NHalquilo y el uso de nucleobases naturales o no naturales tales como, por ejemplo, isocitidina, isoguanosina. Se encuentra en este caso también en el marco de la presente invención que el ácido Lnucleico presente las denominadas posiciones abásicas, es decir, nucleótidos a los que les falta la nucleobase. Posiciones abásicas de este tipo pueden estar dispuestas tanto dentro de la secuencia de nucleótidos del ácido Lnucleico como en uno o en los dos extremos, es decir, el extremo 5’ y/o el extremo 3’.

Además, se encuentra en el marco de la presente invención que el ácido L-nucleico contenga uno o varios Dnucleósidos o D-nucleótidos. En este caso, el uno o los varios D-nucleósidos o D-nucleótidos pueden estar dispuestos dentro del ácido L-nucleico, al igual que en uno o los dos extremos del ácido L-nucleico. El D-nucleósido

o el D-nucleótido individual puede portar en este caso una o varias modificaciones, por ejemplo para aumentar la estabilidad del nucleósido o bien nucleótido o bien su unión al ácido L-nucleico.

El ácido L-nucleico puede presentarse básicamente en forma de cadena doble o cadena sencilla. Típicamente, se trata de un ácido L-nucleico de cadena sencilla, el cual, sin embargo, condicionado por su secuencia primaria, puede configurar estructuras secundarias definidas y, con ello, también estructuras terciarias. En la estructura secundaria se presentan también tramos de doble cadena en el caso de una pluralidad de ácidos L-nucleicos.

Los ácidos L-nucleicos pueden designar, junto a la modificación de elevado peso molecular particularmente descrita en esta memoria, también modificaciones en relación con los distintos nucleótidos del ácido nucleico, pudiendo presentarse aquí, p. ej., el grupo 2’-OH de la porción de azúcar de los nucleótidos en forma de metiléter como ya se ha dado a conocer precedentemente.

En el caso de los ácidos L-nucleicos o bien partes de ácido L-nucleico descritos en esta memoria se trata preferiblemente de ácidos nucleicos funcionales. A los ácidos nucleicos funcionales pertenecen, entre otros, aptámeros, spiegelmeros, ribozimas y aptazimas. De manera preferida, los ácidos L-nucleicos o bien partes de ácido L-nucleico son spiegelmeros. Como ya se mencionó al comienzo, los spiegelmeros son ácidos nucleicos que se unen a una molécula diana o a una parte de la misma y están constituidos por L-nucleótidos, al menos en la parte del ácido nucleico que se une a la molécula diana. Preferiblemente, son el resultado de la puesta en contacto de un banco de ácidos nucleicos, en particular de un banco de ácidos nucleicos estadístico, con la molécula diana.

Para un procedimiento de selección para el desarrollo de ácidos nucleicos funcionales se preparan primeramente bancos de ADN combinatorios. Por norma general, se trata de la síntesis de oligonucleótidos de ADN que contienen en el centro una zona a base de 10-100 nucleótidos aleatorizados que están flanqueados por dos regiones de unión de cebadores en los extremos 5’ y 3’. La preparación de bancos combinatorios de este tipo se describe, p. ej., en Conrad, R.C., Giver, L., Tian, Y. y Ellington, A.D., 1996, Methods Enzymol., Vol 267,336-367. Un banco de ADN de cadena sencilla sintetizado por vía química de este tipo se puede transformar, a través de la reacción en cadena de la polimerasa, en un banco de doble cadena que, tomado por sí solo puede ser empleado ya para una selección. Por norma general, una separación de las cadenas individuales tiene lugar, sin embargo, con métodos adecuados, de modo que se accede de nuevo a un banco de cadena sencilla que se emplea para el proceso de selección in vitro cuando se trata de una selección de ADN (Bock, L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.H. y Toole, J.J., 1992, Nature, Vol. 355, 564-566). Asimismo, sin embargo, es también posible emplear el banco de ADN sintetizado por vía química directamente en la selección in vitro. Además de ello, en principio, a partir de ADN de doble cadena, cuando previamente se ha introducido un promotor T7, es posible también, a través una polimerasa dependiente de ADN

5

15

25

35

45

55

adecuada, p. ej., la ARN polimerasa T7, generar un banco de ARN. Con ayuda de los procedimientos descritos es posible generar bancos de 1015 y más moléculas de ADN o ARN. Cada una de las moléculas de este banco tiene una secuencia diferente y, por consiguiente, una estructura tridimensional diferente. A través del proceso de selección in vitro es entonces posible aislar, a partir del banco mencionado, mediante varios ciclos de selección y amplificación, así como eventualmente mutación, una o varias moléculas de ADN que presentan una propiedad de unión significativa frente a una diana dada. Las dianas pueden ser, p. ej., virus, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeñas moléculas tales como metabolitos del metabolismo, principios activos farmacéuticos o sus metabolitos u otros componentes químicos, bioquímicos o biológicos, por ejemplo los descritos en Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. y Yarus, 1995, Annu: Rev. Biochem. Vol. 64, 763-797 y Lorsch, J.R. y Szostak, J.W., 1996, Combinatorial Libraries, Synthesis, Screening and application potential, ed. Riccardo Cortese, Walter de Gruyter, Berlin. El procedimiento se lleva a cabo de modo que se aíslan moléculas de ADN o ARN de unión a partir del banco originalmente empleado y se amplifican después de la etapa de selección mediante la reacción en cadena de la polimerasa. En el caso de selecciones de ARN se ha de anteponer, delante de la etapa de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, una transcripción inversa. Un banco enriquecido después de una primera ronda de selección puede emplearse entonces en una ronda de selección renovada, de modo que las moléculas enriquecidas en la primera ronda de selección tienen la posibilidad de recuperarse de nuevo mediante selección y amplificación y de pasar con todavía más moléculas hijas a otra ronda de selección. Al mismo tiempo, la etapa de la reacción en cadena de la polimerasa abre la posibilidad de incorporar nuevas mutaciones en el caso de la amplificación, p. ej., mediante la variación de la concentración salina. Después de muchas rondas de selección y amplificación suficientes se han establecido las moléculas de unión. De esta forma, se ha formado una agrupación enriquecida, cuyos representantes pueden ser individualizados mediante clonación y a continuación ser determinados con los métodos habituales de la determinación de la secuencia de ADN en su estructura primaria. Las secuencias obtenidas se examinan entonces en cuanto a sus propiedades de unión en relación con la diana. El procedimiento para la generación de aptámeros de este tipo se designa también como procedimiento SELEX y se describe, p. ej., en el documento EP 0 533 838, a cuya divulgación se hace referencia en esta memoria.

Las mejores moléculas de unión pueden acortarse mediante el acortamiento de las secuencias primarias a sus dominios de unión esenciales y prepararse mediante síntesis química o enzimática.

Una forma particular de aptámeros producibles de esta manera los denominados spiegelmeros que se distinguen esencialmente porque al menos en parte, de preferencia por completo están constituidos por los L-nucleótidos no naturales. Procedimientos para la preparación de spiegelmeros de este tipo se describen en el documento PCT/EP97/04726, cuya divulgación se recoge con ello como referencia. La particularidad del procedimiento descrito en dicho documento estriba en la generación de moléculas de ácido nucleico enantioméricas, es decir, de moléculas de ácido L-nucleico que se unen a una diana nativa, es decir, en la forma o configuración natural, o una estructura diana de este tipo. El proceso de selección in vitro arriba descrito se emplea para seleccionar ácidos nucleicos o secuencias de unión primeramente frente a los enantiómeros, es decir, la estructura que no se presenta de forma natural de una diana que se presenta de forma natural, por ejemplo en el caso de que la molécula diana sea una proteína, frente a una proteína D. Las moléculas de unión (D-ADN, D-ARN o bien correspondientes derivados D) así obtenidas se determinan en su secuencia, y la secuencia idéntica se sintetiza entonces con componentes nucleótidos especulares (L-nucleótidos o bien derivados de L-nucleótidos). Los ácidos nucleicos especulares y enantioméricos (L-ADN, L-ARN o bien correspondientes derivados L), así obtenidos, los denominados spiegelmeros, tienen por motivos de simetría una estructura terciaria especular y, por consiguiente, una propiedad de unión para la diana presente en forma o configuración natural.

Las moléculas diana precedentemente descritas, designadas también como diana, pueden ser moléculas o estructuras, así, p. ej., virus, viroides, bacterias, superficies de células, organelas celulares, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeñas moléculas tales como metabolitos del metabolismo, principios activos farmacéuticos o sus metabolitos u otros componentes químicos, bioquímicos o biológicos.

La invención se explica adicionalmente en lo que sigue con ayuda de las figuras y ejemplos de los cuales resultan otras ventajas, formas de ejecución y características de la invención.

La Fig. 1 muestra un enlazador de hexilamina que dispone de un distanciador (“espaciador”) lineal

consistente en seis átomos de carbono, así como un grupo amino terminal y un radical fosfato

terminal. La sustitución indicada con R puede representar en este caso también un ácido nucleico

o bien la parte de ácido L-nucleico de un ácido L-nucleico modificado. A través del grupo amino, la parte de ácido no L-nucleico puede ser acoplada a la parte de ácido L-nucleico y, con ello, configurar el ácido L-nucleico modificado conforme a la invención.

La Fig. 2 muestra otros enlazadores, correspondiendo las estructuras designadas con (2), (4) y (6) a los enlazadores conformes a (1), (3) y (5), en donde en el caso de los últimos, sin embargo, la parte fosfato provista del radical R representa preferiblemente la parte de ácido L-nucleico y a través del grupo funcional designado con X, la parte de ácido no L-nucleico del ácido L-nucleico modificado es acoplada al ácido L-nucleico. La denominación “oligo” representa en este caso a modo de ejemplo un oligonucleótido, pudiendo tratarse también en el alcance de protección de la presente invención que en este caso o bien en el caso de los ácidos L-nucleicos o partes de ácido L

nucleico se trata en esta memoria, en general, de L-polinucleótidos. Los distintos sustituyentes

designan en este caso los siguientes grupos reactivos que individualmente y en cada caso

independientemente uno de otro, son:

X = OH, NH2, HS, Hal, CHO, COOH

5

Y = O, NH, NMe, S, CH2

Z1, Z2, Z3, Z4, Z5 y Z6 = H, Me, alquilo, HO(CH2)n, HO, H2N (CH2)n, H2N, F, designando n un número

entero entre 1 y 20 y designando alquilo cadenas hidrocarbonadas lineales y ramificadas con

preferiblemente 1-20 átomos de C, de manera preferida 1 a 4 átomos de C, y/o -(CH2)nH,

-CH[(CH2)nH][(CH2)mH], -C[(CH2)nH][(CH2)mH][(CH2)lH], -(CH2)n(CH)m[(CH2)lH][(CH2)kH],

10

-(CH2)n(C)m[(CH2)lH] [(CH2)kH][(CH2)jH], en donde n, m, l, k y j, independientemente uno de otro,

son números enteros ente 1 y 8, preferiblemente 1 a 4 átomos de C.

La Fig. 3

muestra una perspectiva de diferentes enlazadores que están acoplados a diversas posiciones de

las nucleobases. En este caso, es notable que la porción de azúcar del nucleósido representado

en cada caso pueda ser una ribosa, una desoxirribosa o una ribosa modificada o bien

15

desoxirribosa modificada, y el radical X puede ser H, HO, H2N, MeO, EtOH o alcoxi. Alcoxi designa

en este caso, en particular, cadenas oxihidrocarbonadas lineales y ramificadas con 1-20 átomos de

C, preferiblemente 1 a 4 átomos de C y/o -O(CH2)nH, -OCH[(CH2)nH][(CH2)mH],

-OC[(CH2)nH][(CH2)mH][(CH2)lH], -O(CH2)n(CH)m[(CH2)lH][(CH2)kH], -O(CH2)n(C)m[(CH2)lH]

[(CH2))kH][(CH2)jH], siendo n, m, l, k y j, independientemente uno de otro, números enteros entre 1

20

y 20, preferiblemente 1 a 4 átomos de C. La estructura del enlazador propiamente dicha es en el

caso de los cuatro nucleósidos (1), (2), (3) y (4) representados X1-[Y]n, en donde n es un número

entero entre 0 y 20, X1 representa un grupo funcional que se elige del grupo que comprende HO,

H2N, HRN, HS, SSR, Hal, CHO, COOH, COOR y COHal. En el caso de los enlazadores indicados

en las fórmulas estructurales (5-12), n es asimismo un número entero entre 0 y 20 y Z significa,

25

independientemente de los otros sustituyentes, O, NH, NR o S, representando R alquilo tal como

se define en esta memoria.

La Fig. 4

muestra posibles enlazadores en la posición 5 de nucleósidos o bien nucleótidos de pirimidina. En

relación con los radicales R’, R” y R’” se cumple análogamente lo indicado en relación con la Fig. 5.

El enlazador R presenta la estructura -[Y]n-X1 y puede adoptar preferiblemente las formas

30

mostradas en las estructuras (2) a (9), pudiendo significar también aquí Z, independientemente de

la elección de los otros sustituyentes, O, NH, NHR o S y n puede ser un número entero entre 1 y

20. El grupo funcional X1 se elige preferiblemente del grupo que presenta HO, H2N, HRN, HS,

SSR, Hal, CHO, COOH, COOR y COHal.

La Fig. 5

muestra en 1 la estructura básica de citosina, la cual puede presentar en su amina exocíclica

35

diferentes estructuras de enlazador. En este caso, R’ designa un ácido L-nucleico o un L

polinucleótido, OH o fosfato, R” un ácido L-nucleico o un L-polinucleótido, OH o fosfato y R’” H,

OH, OMe, OEt, NH2. El radical R designa en este caso el enlazador que presenta la estructura

base -[Y]n-Xl y puede presentar las fórmulas estructurales mostradas en (2) a (9), pudiendo ser Z

O, NH, NR, S y n un número entero entre 1 y 20. El grupo funcional Xl se elige preferiblemente del

40

grupo que presenta HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hal, CHO, COOH, COOR y COHal.

La Fig. 6

muestra la configuración de un ácido L-nucleico modificado conforme a la invención mediante

reacción de PEG-NHS con un ácido L-nucleico provisto de un enlazador. Después de un

acoplamiento con éxito se presenta el ácido L-nucleico modificado que en el presente caso

comprende PEG como parte de ácido no L-nucleico y como ácido L-nucleico en este caso concreto

45

un oligonucleótido, estando intercalado entre ambos un enlazador o bien espaciador portador de

un grupo amino, y entre el enlazador y PEG se produce un enlace de amida de ácido. Junto al

ácido L-nucleico modificado, como producto de reacción adicional se obtiene la N

hidroxisuccinimida disociada de PEG. Como posibles radicales R se prefieren H, CH3 y, en

general, cadenas de alquilo con una longitud de 1-20. El grupo funcional puede ser, en principio, el

50

producto de uno de cada una de las reacciones recogidas precedentemente en esta memoria. A

este respecto sirven también las configuraciones del enlazador allí descritas y en unión con las

otras figuras, en particular las Figs. 2 y 3. Lo mismo es válido también para los sustituyentes

representados en la fórmula y las variables control tales como n.

La Fig. 7

muestra la reacción de diferentes derivados de PEG con diferentes enlazadores. En este caso, las

55

dos reacciones (1) y (2) se diferencian únicamente en que en el caso de la reacción (1) el grupo

carboxilo está presente en PEG y en la reacción (2) el grupo carboxilo está presente en un L

oligonucleótido provisto de un enlazador. En el caso del grupo funcional del participante en la

reacción en cada caso correspondiente, es decir, en el caso de la reacción (1) el ácido L-nucleico

provisto de un enlazador, en el caso de la reacción (2) el PEG provisto de un grupo amino. Con

5

ello, en relación con las distintas reacciones arriba expuestas que son posibles entre la parte de ácido L-nucleico y la parte de ácido no L-nucleico, eventualmente bajo participación de uno o varios enlazadores intercalados, se confirma la afirmación hecha de que básicamente los grupos reactivos mencionados pueden estar presentes en el caso de todos los participantes en la reacción implicados. Las estructuras obtenidas en última instancia se diferencian de manera correspondiente, así en el caso de la reacción (1), en donde está presente un grupo amida de ácido en el PEG y en el caso de la reacción (2), en donde el enlace amida de ácido está presente en la construcción a base de enlazador y oligonucleótido, es decir, ácido L-nucleico. En relación con los sustituyentes R se cumple correspondientemente lo dicho en relación con la Fig. 6.

10 15 20

La Fig. 8 muestra la reacción de un haluro con un tioéster que están incorporados en la parte de ácido no Lnucleico o bien en la parte de ácido L-nucleico. En el caso de las reacciones (1) a (3) está previsto en este caso que el ácido L-nucleico, aquí como en todas las figuras, abreviado como oligo, está provisto de un enlazador y el enlazador porta un haluro tal como, por ejemplo, I, Br, Cl. Este ácido L-nucleico derivatizado se hace reaccionar acto seguido con un PEG provisto de un grupo tiol, preferiblemente de un grupo tiol terminal. En el caso de la reacción (1) se produce en este caso un enlace tioéter entre el enlazador y PEG. Mediante oxidación puede producirse, tal como se representa en la reacción (2), la formación de un sulfóxido o bien de una sulfona. En el caso de las reacciones conforme a (4) a (6) tiene lugar asimismo una reacción entre un tiol y un haluro, en donde en estos casos el ácido L-nucleico está provisto del grupo tiol y el enlazador porta el haluro. De manera correspondiente, se produce la configuración de compuestos en los que el azufre está dispuesto entre el ácido L-nucleico y el enlazador y éste, como se representa en las reacciones (5) y (6) se puede oxidar de nuevo en los correspondientes derivados.

25

La Fig. 9 muestra la reacción del PEG provisto de un grupo maleimida con un ácido L-nucleico, allí designado como oligo, que presenta un enlazador que porta un grupo tiol. En el caso del producto de reacción se trata de un tioéter.

La Fig. 10

muestra la reacción de un ácido L-nucleico portador de fosfato con un PEG que está provisto de un enlazador portador de un grupo tiol. El producto de reacción es un fosfotioato.

30

La Fig. 11 muestra la reacción de un ácido L-nucleico provisto de un radical fosfato, eventualmente terminal, con un PEG que está provisto de un enlazador que presenta una amina. En el caso del producto de la reacción se trata de un fosforoamidato. En relación con el radical R se cumple lo dicho en relación con la Fig. 6.

35

La Fig. 12 muestra la incorporación de un grupo amino o bien tiol reactivo en un ácido L-nucleico utilizando un grupo fosfato activado, preferiblemente un grupo fosfato terminal del ácido L-nucleico. En este caso, en una primera etapa se prepara una fosforoimidazolida (I) que, con el empleo de una etilendiamina en el caso de la reacción (2), conduce a la formación de un 2-aminoetilen-1fosforoamidato (II) o bien, en el caso de la reacción (3) utilizando cisteamina, conduce a 2-tioetilen1-fosforoamidato (III). Los compuestos conformes a (II) y (III) pueden hacerse reaccionar acto seguido con ácidos no L-nucleicos, en particular los compuestos dados a conocer en esta memoria.

40

La Fig. 13 muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo cloruro de sulfonilo con un ácido L-nucleico que presenta un enlazador que porta un grupo amino. El producto de reacción es una sulfonamida. En relación con el radical R se cumple lo expuesto en relación con la Fig. 6.

45

La Fig. 14 muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo epóxido con un ácido L-nucleico que presenta un enlazador provisto de un grupo amino, bajo formación de una amina. En relación con el radical R se cumple lo expuesto en relación con la Fig. 6.

La Fig. 15

muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo epóxido con un ácido L-nucleico que porta un enlazador que presenta un grupo tiol. En el caso del producto de reacción se trata de un tioéter.

50

La Fig. 16 muestra la reacción de un PEG que presenta un grupo isotiocianato con un ácido L-nucleico que porta un enlazador que presenta un grupo amino. El producto de reacción es una isotiourea. En relación con el radical R se cumple lo expuesto en relación con la Fig. 6.

La Fig. 17

muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo isocianato con un ácido L-nucleico que presenta un enlazador portador de un grupo amino, bajo la formación de una isourea. En relación con el radical R se cumple lo expuesto en relación con la Fig. 6.

55

La Fig. 18 muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo isocianato con un ácido L-nucleico que porta un grupo OH libre, que puede proceder directamente del ácido L-nucleico tal como, por ejemplo, un grupo fosfato o la parte de azúcar del nucleósido, es decir, las posiciones 2’-OH, 3’-OH o 5’-OH. Alternativamente, el grupo OH puede estar enlazado al ácido L-nucleico a través de un enlazador

adecuado. En el caso del producto de reacción se trata de un carbamato.

5 10

La Fig. 19 muestra la reacción de un grupo aldehído o ceto con un grupo amino que en cada caso está presente en la parte ácido no L-nucleico (reacción (1)), en el caso representado en PEG, o en la parte de ácido L-nucleico (reacción (2)). La parte de ácido L-nucleico presenta en este caso preferiblemente un enlazador que porta el grupo reactivo respectivo, es decir, el grupo amino o el grupo carbonilo. En el caso de la reacción (1), el PEG porta el grupo amino, mientras que, por el contrario, el ácido L-nucleico presenta un enlazador que porta un grupo carbonilo. El producto de reacción imina obtenido directamente se transforma acto seguido mediante reducción en una amina. En el caso de la reacción (2), el PEG portador de un grupo carbonilo se hace reaccionar con un ácido L-nucleico que porta un enlazador que presenta un grupo amino. El producto de reacción imina se reduce y conduce a una amina. En relación con el radical R se cumple lo expuesto para la Fig. 6.

15

La Fig. 20 muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo tiol con un ácido L-nucleico que asimismo porta un enlazador provisto de un grupo tiol. En el caso del producto de reacción se trata de un ácido L-nucleico modificado que dispone de un grupo disulfuro entre el PEG y el ácido L-nucleico, dicho más exactamente el enlazador unido al mismo.

20

La Fig. 21 muestra la reacción de un PEG provisto de un grupo hidrazina con un ácido L-nucleico que porta un enlazador que comprende un grupo carbonilo. En una primera etapa de reacción se obtiene una hidrazona que acto seguido es transformada por reducción en una hidrazina sustituida. En relación con el radical R es válido lo expuesto en relación con la Fig. 6.

25 30

La Fig. 22 muestra en la reacción (1) la reacción de un PEG provisto de un dieno conjugado con un ácido Lnucleico que porta un enlazador con un denominado grupo dienófilo. El dienófilo se compone de un doble enlace C-C que de nuevo presenta un sustituyente Z que comprende un grupo sustractor de electrones. En este caso se puede tratar preferiblemente de NO2, CH2Cl, COOR, CN o maleimida. En relación con el radical R es válido lo expuesto para la Fig. 6. Como consecuencia de estas reacciones, se produce la configuración de un ácido L-nucleico modificado que entre el PEG y el ácido L-nucleico provisto de un enlazador porta un grupo hexenilo. La reacción de Diels-Alder mostrada en la reacción (2) parte de un PEG que presenta un dienófilo con el sustituyente Z que reacciona con un ácido L-nucleico que comprende un enlazador que porta un dieno conjugado. En relación con el sustituyente Z es válido lo dicho en relación con la reacción (1). El producto de reacción es en el caso de esta reacción (2) asimismo un conjugado de ácido L-nucleico unido a través de un grupo hexenilo.

La Fig. 23

muestra la estructura de los ésteres de mPEG-NHS ramificados y lineales utilizados.

35 40

La Fig. 24 muestra en (1) la estructura básica de un L-nucleósido abásico que, en lugar de la nucleobase, puede presentar un átomo de hidrógeno o una o varias estructuras de enlazador opcionalmente distintas. En este caso, R’ designa un ácido L-nucleico o un L-polinucleótido, OH o fosfato, R” designa un ácido L-nucleico o un L-polinucleótido, OH o fosfato y X = H, OH, OMe, OEt, NH2. El radical R designa el átomo de hidrógeno en lugar de la nucleobase o el enlazador que puede presentar las fórmulas estructurales mostradas en (2) a (8) en donde Z = CH2, O, NH, NR, S y n puede ser un número entero entre 1 y 20. El grupo funcional X1 se elige preferiblemente del grupo que presenta HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hal, CHO, COOH, COOR y COHal.

La Fig. 25

muestra un test de actividad de un spiegelmero de ADN que une GnRH, PEGilado, en ratas machos orquidectomizadas.

La Fig. 26a

muestra un ensayo de actividad de un spiegelmero de ADN que une GnRH, PEGilado, in vitro.

45

La Fig. 26b muestra un ensayo de actividad de un spiegelmero de ADN que une GnRH, no PEGilado y PEGilado, in vitro.

La Fig. 27

muestra una farmacocinética de un spiegelmero de ADN que une GnRH, PEGilado, en ratas.

La Fig. 28a

muestra un perfil farmacocinético de un L-ARN PEGilado después de la administración intravenosa a ratas.

50

La Fig. 28b muestra un perfil farmacocinético de intravenosa a ratas. un L-ARN no PEGilado después de la administración

La Fig. 28c

muestra un perfil farmacocinético de un L-ARN PEGilado después de la administración subcutánea a ratas.

La Fig. 28d

muestra un perfil farmacocinético de un L-ARN no PEGilado después de la administración

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

subcutánea a ratas.

La Fig. 29 muestra un ensayo de actividad de un spiegelmero de ADN que une GnRH in vivo en ratas machos orquidectomizadas.

Ejemplo 1: Síntesis de conjugados de ácido L-nucleico-PEG

Se examinaron las condiciones para la síntesis de conjugados de ácido L-nucleico-PEG partiendo de ácido Lnucleico representado en SEQ ID NO:2 y PEG, en donde el PEG estaba modificado de manera que se presentaba en forma de éster de NHS o en forma de amina primaria para el acoplamiento a una amina o bien a un fosfato. En este caso, se procedió de manera que el ácido nucleico se disolvió en un sistema acuoso. El pH se ajustó a pH 6,59,0 mediante diferentes tampones o bases tales como, por ejemplo, NaHCO3, NaH2PO4/Na2HPO4, HEPES, MOPS, NH4OAc, trietilamina. Se sometió a ensayo la influencia de una adición de diferentes disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, DMF, DMSO, acetonitrilo y otros, variándose la proporción del disolvente orgánico entre 0-100%. A continuación, tuvo lugar la adición de diferentes derivados de PEG tales como, por ejemplo, éster de mPEG2-NHS ramificado, éster de mPEG-NHS lineal o mPEG-NH2 (Shearwatcr Corporations) de diferentes pesos moleculares entre 10.000 Da y 40.000 Da. La adición de éster de PEG-NHS puede tener lugar de diferentes maneras. Así, por ejemplo, éster de PEG-NHS se disuelve en un ácido poco concentrado tal como, por ejemplo, HCl 0,01 N y se añade lentamente gota a gota disuelto en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, DMF o se añade en forma de un sólido. La forma preferida de adición de PEG-NHS es en porciones en forma de un sólido. Además, se sometió a ensayo la influencia de la temperatura de reacción entre 4ºC-65ºC. Como ácidos nucleicos se utilizaron ácidos nucleicos con las siguientes secuencias 5’-NH2-TAT TAG AGA C -3’ (SEQ ID NO:2) y 5’-PO4-TAT TAG AGA C -3’ (SEQ. ID. No 3), así como el ácido nucleico conforme a SEQ ID No 1. Los rendimientos en las reacciones arriba recopiladas oscilaban entre 5-78%.

La variante de reacción preferida era la adición durante seis veces en total de en cada caso dos equivalentes de éster de PEG-NHS sólido a un intervalo de aproximadamente 30 minutos a un ácido nucleico disuelto en un disolvente consistente en 60 partes de H2O y 40 partes de DMF bajo la adición de NaHCO3 (0,2 M), un pH de 8,0 y 37º. Estas condiciones de reacción condujeron a un rendimiento de 78%.

Ejemplo 2: Síntesis de un conjugado de ácido L-nucleico-fosforoamidato-PEG

Partiendo de un ácido L-nucleico con la secuencia 5’-PO4-TAT TAG AGA C -3’ (SEQ. ID. NO: 3) se preparó un conjugado de fosforoamidita-PEG correspondiente. El ácido L-nucleico (10 OD) se hizo reaccionar con PEG-NH2

(20.000 Da, lineal, 1 -10 equivalentes) en disolución acuosa con EDCl a 50ºC para formar un conjugado de ácido Lnucleico-fosforoamidato-PEG. El análisis y la purificación discurrieron análogamente a la PEGilación de ácidos Lnucleicos con PEG-NHS tal como se describe en el Ejemplo 1. Las condiciones de reacción no fueron optimizadas y condujeron a un rendimiento de < 8%.

Ejemplo 3: PEGilación de un ligando de spiegelmero para GnRH

La hormona peptídica GnRH I (hormona liberadora de gonadotropina, gonadoliberina) que en general se designa también como GnRH, es un deca-péptido que se forma en el hipotálamo y estimula la secreción de la hormona luteinizante de la hormona gonadotropina (LH) y la hormona estimulante de folículos (FSH) a través de la hipófisis. GnRH se segrega a partir de las neuronas del hipotálamo en forma pulsada y se une entonces a su receptor en la superficie celular de la hipófisis. El complejo ligando-receptor se internaliza, con lo que se produce una secreción de FSH y LH que de nuevo estimula la formación de hormonas sexuales tales como estrógeno, progesterona o testosterona. Se pudo generar un spiegelmero, es decir, un ácido L-nucleico que se une específicamente a GnRH y que presenta la siguiente secuencia:

imagen7

La síntesis del spiegelmero con la secuencia precedentemente mostrada se llevó a cabo en un sintetizador de ADN Oligopilot II de Amersham Pharmacia Biotech a escala de 780-μmol en una fase sólida de CPG (vidrio de poro controlado) de 1000 Ǻ según la química de 2-cianoetil-fosforoamidita (Sinha et al. NAR, 12, 1984, págs. 4539 y siguientes). A continuación, se acopló 6-(monometoxitritilamino)-hexil-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforoamidita al extremo 5’ del spiegelmero (5’-MMT-aminohexilo-spiegelmero) con el fin de posibilitar la conjugación post-sintética con PEG.

Después de finalizada la síntesis, el 5’-MMT-aminohexilo-spiegelmero se disoció de la fase sólida mediante incubación durante 8 horas en disolución de amoníaco al 33% a 65ºC y se desprotegió por completo, después se concentró a sequedad, se recogió en NaOH 10 mM y se purificó mediante RP-HPLC. La disociación del grupo protector monometoxitritilo tuvo lugar con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,4% en 30 min a TA. El TFA se separó mediante co-evaporación durante dos veces con etanol y el 5’-aminohexilo-spiegelmero conforme a SEQ ID NO 1 se purificó mediante precipitación en etanol (rendimiento: 5,000 OD, 7,5 μmol). El pico del producto se recogió y se desaló mediante cromatografía de exclusión por tamaño a través de una columna Sephadex G10 o mediante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ultrafiltración (sistema Labscale TFF, Millipore).

El spiegelmero para GnRH 5’-amino-modificado de este tipo (5,000 OD, 7,5 μmol) se dispuso en NaHCO3 0,2 M, pH 8,5 / DMF 60:40 (v/v) (125 mL), se calentó hasta 37ºC y se mezcló en porciones con éster activado con Nhidroxisuccinimidilo (NHS) en forma de polvo de polietilenglicol 40.000 Da ramificado (añadir 2 eq (equivalentes) cada 30 min, en total 12 eq. 6 x 600 mg, 180 μmol). El transcurso de la reacción se vigiló mediante electroforesis en gel analítica (poliacrilamida al 8%, urea 8,3 M). El producto bruto se purificó primeramente mediante HPLC de intercambio de iones de PEG en exceso (Source Q 30; agente eluyente A: H2O, agente eluyente B: NaCl 2M, caudal 20 mL/min; carga de la columna y elución de PEG libre con 10% de B; elución del conjugado PEG-GnRHspiegelmero con 50% de B), a continuación, mediante RP-HPLC, se separó spiegelmero para GnRH PEGilado de spiegelmero para GnRH no PEGilado (Source RPC 15; agente eluyente A: acetato de trietilamonio (TEAA), 100 mM, agente eluyente B: TEAA 100 mM en H2O/acetonitrilo 5:95; caudal 40 mL/min; carga de la columna con 10% de B; gradiente de 10% a 70% de B en 10 volúmenes de la columna, elución de PEG-GnRH-spiegelmero a 45-50% de B); se intercambió con éster (Source Q 30; agente eluyente A: H2O, agente eluyente B: NaCl 2 M; caudal 20 mL/min; carga de la columna y elución de PEG libre con 10% de B; elución de PEG-GnRH-spiegelmero con 50% de B y a continuación mediante filtración en gel (Sephadex G10; agente eluyente H2O; caudal 5 mL/min) o se desaló mediante ultrafiltración (sistema Labscale TFF, Millipore). Mediante liofilización se obtuvo el producto deseado en forma de un polvo blanco (3,900 OD, 375 mg, 78%).

De manera análoga se enlazaron y purificaron otros ácidos L-nucleicos, incluida la secuencia conforme a SEQ ID No 1 con diferentes PEG (lineal 10.000 Dalton, lineal 20.000 Dalton, ramificado 20.000 Dalton, lineal 35.000 Dalton).

Ejemplo 4: Síntesis de conjugados de ácido L-nucleico-FITC: acoplamiento de isotiocianato de fluoresceína a spiegelmero para GnRH con un enlazador 5’-NH2-C6

El spiegelmero para GnRH 5’-amino-modificado, preparado conforme al Ejemplo 3, se dispuso en NaHCO3 0,5 M, pH 8,5, se calentó hasta 65ºC y a la mezcla de reacción se añadió un exceso de isotiocianato de fluoresceína (FITC, 10 eq.). La reacción se vigiló mediante RP-HPLC analítica. Se agitó durante 48 h a 65ºC, FITC en exceso se separó mediante Centri-Spin 10 (Princeton Separations) y el ácido L-nucleico marcado con fluoresceína se purificó con RP-HPLC. La liofilización proporcionó el producto deseado en forma de un polvo amarillento en un rendimiento cuantitativo.

Ejemplo 5: Ensayo de actividad de un spiegelmero de ADN que une GnRH, PEGilado, in vivo en ratas machos orquidectomizadas

Ratas machos fueron orquidectomizadas, con lo cual el nivel de LH de las ratas aumentó continuamente como consecuencia de la carente señal de retroalimentación de testosterona a lo largo de los siguientes ocho días. El día 8 se administró por vía intravenosa el spiegelmero para PEG-GnRH-ADN, es decir, el conjugado a base de PEG y spiegelmero para GnRH, a siete ratas (150 mg/kg). Se tomaron muestras de sangre el día 0 (antes de la orquidectomía), el día 8 (0 horas antes de la administración i. v. del spiegelmero para PEG-GnRH), tanto 0,5 h, 1,5 h, 3 h, 6 h como 24 h después de la administración i. v., y el nivel de LH respectivo se determinó mediante radioinmunoensayo (RIA). Paralelamente a ello, a siete ratas machos orquidectomizadas se les administró solo el vehículo (tampón PBS, pH 7,4) i. v. en forma de control negativo y a siete ratas machos orquidectomizadas se les administró el antagonista estándar Cetrorelix (100 μg/kg) como control positivo s. c. El resultado está representado en la Fig. 25.

Con excepción del control negativo (designado en la Fig. 25 con triángulos) bajo la acción del spiegelmero para PEG-GnRH se produce, también después de 24 horas, además un nivel de LH que es equiparable al de ratas no orquidectomizadas o bien de aquellas ratas a las que se había administrado el antagonista estándar Cetrorelix. Esto confirma la idoneidad del spiegelmero para PEG-GnRH-ADN, de influir de manera duradera sobre el efecto de PEG-GnRH a lo largo de un espacio de tiempo prolongado. El que el efecto precedentemente descrito del spiegelmero para PEG-GnRH-ADN se remonta a la PEGilación del spiegelmero para GnRH resulta del hecho de que en el caso de la aplicación del spiegelmero para GnRH sin una correspondiente modificación en el caso de la aplicación subcutánea de 100 mg/kg ya se pudo observar después de unas pocas horas una disminución de la actividad del spiegelmero para GnRH. El resultado está representado asimismo en la Fig. 29.

Ejemplo 6: Ensayo de actividad de spiegelmeros de ADN que unen GnRH, PEGilados y no PEGilados in vitro en células de CHO

El estudio del cultivo celular descrito aquí se llevó a cabo en células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan el receptor humano para GnRH. En este caso, se midió la liberación intracelular de iones Ca2+, dado que esta liberación importante para la transducción de señales tiene lugar después de la formación del complejo agonistareceptor. El nivel de Ca2+ se determinó entonces mediante un colorante de fluorescencia sensible a Ca2+. El spiegelmero para PEG-GnRH-ADN o bien el spiegelmero para GnRH debería captar el agonista GnRH y, con ello, inhibir su unión al receptor sobre la membrana celular. En este caso, se procedió experimentalmente de manera que el agonista GnRH (2 mM) se pre-incubó durante 20 min con el spiegelmero para GnRH o bien con el spiegelmero para PEG-GnRH-ADN en un intervalo de concentraciones de 100 pM a 1 μM. Acto seguido, esta disolución se

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ml/min; 2 -3 min 30% de eluyente B con 2 ml/min; 3-13 min 60% de eluyente B con 2 ml/min; 13 -19 min 10% de eluyente B con 2 ml/min.

La concentración de spiegelmero de ADN PEGilado que se une a GnRH a los distintos momentos de la toma de muestras se representa en la Fig. 27. La semivida del spiegelmero de ADN PEGilado, que se une a GnRH, en el caso de inyección intravenosa asciende en ratas a aproximadamente 4 horas.

Ejemplo 8: Perfil farmacocinético de L-ARN no modificado y PEGilado en ratas

Secuencias de nucleótidos:

L-ARN, 40mero (NOX_M039)

5’ uaa gga aac ucg guc uga ugc ggu agc gcu gug cag agc u 3’ (SEQ. ID. No. 4)

PEG-L-ARN de 40kDalton, 40 mero (NOX_M041)

PEG 5’ uaa gga aac ucg guc uga ugc ggu agc gcu gug cag agc u 3’ (SEQ. ID. No.5)

El perfil farmacocinético del L-ARN no PEGilado (NOX_M039) y L-ARN PEGilado (NOX_041) se examinó en ratas machos (CD®, Charles River Deutschland GmbH; peso: 280-318 g). Después de un tiempo de adaptación de 7 días, 3 animales recibieron por sustancia una administración única aplicada por vía intravenosa de 150 nmo/kg. En cada caso 4 ratas por sustancia recibieron en cada caso 150 nmol/kg como dosis subcutánea única. Las sustancias se disolvieron en 1 x PBS, pH 7,4 (disolución patrón: 383 μM). Después de la administración intravenosa, se tomaron muestras de sangre para el L-ARN no modificado antes de la adición de la sustancia (0 min) y 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h después de la administración de la sustancia y se trasladaron para el análisis a recipientes Eppendorf de EDTA. Después de la administración intravenosa se tomaron muestras de sangre para el L-ARN PEGilado antes de la adición de sustancia (0 min) y 5 min, 30 min, 1 h, 3 h, 8 h, 16 h, 24 h, 36 h así como 48 h después de la adición de la sustancia y se transfirieron a recipientes Eppendorf de EDTA para el análisis. En el caso de los animales tratados por vía subcutánea, para el L-ARN no modificado se tomaron muestras de sangre antes de la adición de sustancia (0 min), y 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h después de la adición de la sustancia y se transfirieron a recipientes Eppendorf de EDTA para el análisis. En el caso de los animales tratados por vía subcutánea, para el L-ARN PEGilado se tomaron muestras de sangre antes de la adición de la sustancia (0 min) y 1 h, 3 h, 8 h, 16 h, 24 h, 36 h y 48 h después de la administración de la sustancia y se transfirieron a recipientes Eppendorf de EDTA para el análisis.

La cantidad de L-ARN o bien L-ARN PEGilado en las muestras de sangre se examinó mediante un ensayo de hibridación (véase Drolet, D.W. et al. (2000) Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Phamaceutical Res 17 (12): 1503-1510). El ensayo de hibridación se basa en el siguiente principio: la molécula de L-ARN a detectar se hibrida a una sonda de oligonucleótido de L-ADN inmovilizada (= sonda de captura; aquí: 5’-CCG CAT CAG ACC GAG TTT CCT TA T TTT TTT TT -(C7) NH2 -3’ (SEQ. ID. No. 6)) y se detecta con una sonda de L-ADN de detección de ADN biotinilada (= sonda de detector; aquí: 5’-(BB)TTT TTT TT A GCT CTG CAC AGC GCT -3’ (SEQ. ID. No. 7)). Para ello, al complejo se une en una etapa adicional un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Después de la adición de un sustrato de quimioluminiscencia, se genera luz y se mide en un luminómetro.

Inmovilización de la sonda de oligonucleótidos: 100 μl de la sonda de captura (0,75 pmol/μl en tampón de acoplamiento: Na2HPO4 500 mM pH 8,5, EDTA 0,5 mM) se transfirieron por pocillo (pocillo o cavidad en una placa) en placas de DNA BIND (COSTAR) y se incubaron durante una noche a 4ºC. A continuación, se lavó tres veces en cada caso con 200 μl de tampón de acoplamiento y se incubó durante 1 h a 37ºC con sendos 200 μl de tampón de bloqueo (BSA al 0,5% (p/v) en tampón de acoplamiento). Después de un lavado renovado con 200 μl de tampón de acoplamiento y 3 x 200 μl de tampón de hibridación 1 (0,5 x SSC pH 7,0; SDS al 0,5% (p/v)) se pueden utilizar las placas para la detección.

Hibridación y detección: se preparó una disolución de 20 pmol/μl de la sonda de L-ADN de detección (= sonda de detector) en Tris-Cl 10 mM pH 8,0. 10 μl de EDTA plasma (o agua bidestilada) se mezclaron con 90 μl de tampón de hibridación 1 (0,5 x SSC pH 7,0, SDS al 5% (p/v)) y se centrifugaron. A continuación, se añadieron a ello 2 μl de la disolución de la sonda de detección (20 pmol/μl), se mezclaron y centrifugaron. Siguió una etapa de desnaturalización a 95ºC durante 10 min en el termociclador (MJ Research). Las tandas se transfirieron a los pocillos de DNA-BIND correspondientemente preparados (véase arriba) y se incubaron durante 2 h a 50ºC. Siguieron después etapas de lavado: 2 x 200 μl de tampón de hibridación 1 (0,5 x SSC pH 7,0, SDS al 0,5 (p/v)) y 3 x 200 μl de 1 x THS/Tween 20 (Tris-Cl 20 mM pH 7,6, NaCl 137 mM, Tween 20 al 0,1% (v/v)). 1 μl de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Promega) se diluyeron con 5 ml de 1 x TBS/Tween 20. Por pocillo se añadieron 100 μl del conjugado diluido y se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente. Siguieron etapas de lavado: 1 x 200 μl 1 x TBS/Tween 20 y 3 x 200 μl 1 x tampón de ensayo (Tris-Cl 20 mM pH 9,8 MgCl2 1 mM). A continuación, se incubaron 100 μl de “Ready-To-Use Substrate” CSPD (Applied Biosystems), se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente y la quimioluminiscencia se midió en un aparato de lectura de placas de multidetección POLARstar Galaxy (BMG Labtechnologies).

imagen9

y alcanzan su punto bajo después de 1,5 h y se mantiene durante aprox. 3 h. Esta reducción es equiparable a ratas no castradas o bien tratadas con Cetrorelix (antagonista estándar). Seis horas después de la administración del spiegelmero para GnRH-ADN, los niveles de LH aumentan lentamente y alcanzan el nivel del grupo control no tratado en el espacio de 24 h.

Por consiguiente, a lo largo de un espacio de tiempo de 3 horas se puede observar el efecto biológico del spiegelmero para GnRH-ADN, mientras que el spiegelmero para GnRH-ADN PEGilado es activo a lo largo de un espacio de tiempo de 24 horas (véase el Ej. 5).

Las citas bibliográficas indicadas en lo que sigue corresponden a las indicaciones bibliográficas indicadas en esta memoria y provistas de los números en superíndice.

Bibliografía

1.

Bragg, P. D. y Hou, C. Subunit composition, function, and spatial arrangement in the Ca2+-and Mg2+-activated adenosine triphosphatases of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Arch Biochem Biophys 167, 311 (1975).

2.

Lomant, A. J. y Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol 104, 243-261 (1976).

3.

Buter, J. y Kellogg, R. M. Synthesis of macrocyclic and medium ring dithia compounds using cesium thiolates.

J. Chem. Soc. Chem. Commun., 466-468 (1980).

4.

Buter, J. y Kellogg, R. M. Synthesis of sulfur-containing macrocycles using cesium thiolates. J. Org. Chem. 46, 4481-4485 (1981).

5.

Kennedy, R. J. y Stock, A. M. The oxidation of organic substances by potassium peroxymonosulfates. J. Org. Chem. 25, 1901-1906 (1960).

6.

Huang, Z., Schneider, K. C. y Benner, S. A. Oligonucleotide analogs with dimethylenesulfide, -sulfoxide, and -sulfone groups replacing phosphodiester linkages. Methods Mol Biol 20, 315-353 (1993).

7.

Connolly, B. A. y Rider, P. Chemical synthesis of oligonucleotides containing a free sulphydryl group and subsequent attachment of thiol specific probes. Nucleic Acids Res 13, 4485-4502 (1985).

8.

Smyth, D. G., Blumenfeld, O. O. y Konigsberg, W. Reactions of N-ethylmaleimide with peptides and amino acids. Biochem J 91, 589-595 (1964).

9.

Heitz, J. R., Anderson, C. D. y Anderson, B. M. Inactivation of yeast alcohol dehydrogenase by N-alkylmaleimides. Arch Biochem Biophys 127, 627-636 (1968).

10.

Podhradsky, D., Drobnica, L. y Kristian, P. Reactions of cysteine, its derivatives, glutathione coenzyme A, and dihydrolipoic acid with isothiocyanates. Experientia 35, 154-155 (1979).

11.

Vishnyakova, Golubeva y Glebova. Russ. Chem. Rev. 54, 249-261 (1985).

12.

Hazzard, Lammiman, Poon, Satchell y Satchell. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1029 (1985).

13.

Pieken, W. et al. (Patente Internacional, 1998).

14.

Mokhir, A. A., Tetzlaff, C. N., Herzberger, S., Mosbacher, A. y Richert, C. Monitored selection of dna-hybrids forming duplexes with capped terminal c:g base pairs. J Comb Chem 3, 374-386 (2001).

15.

Bischoff, R., Coull, J. M. y Regnier, F. E. Introduction of 5’-terminal functional groups into synthetic oligonucleotides for selective immobilization. Anal Biochem 164, 336-344 (1987).

16.

Ghosh, S. S. y Musso, G. F. Covalent attachment of oligonucleotides to solid supports. Nucleic Acids Res 15, 5353-5372 (1987).

17.

Allen, D. J., Darke, P. L. y Benkovic, S. J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates:

Claims (1)

1. imagen1