WO2005074993A2 - Verfahren zur herstellung von konjugaten aus polysacchariden und polynukleotiden - Google Patents

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WO2005074993A2
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polynucleotide
aldonic acid
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hydroxyethyl starch
polysaccharide
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Klaus Sommermeyer
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Noxxon Pharma Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide and to the conjugates obtainable by such a method.
  • PEGylation or HESylation of pharmaceutically active compounds such as proteins is, among other things, that by coupling the proteins to the above-mentioned polymers such as polyethylene glycol (PEG) or hydroxyethyl starch (HES), the short ones, which are too short for the development of the full pharmaceutical potential biological half-life can be extended. Coupling can also have a positive effect on the antigenic properties of proteins. In the case of other active pharmaceutical ingredients, the water solubility can be increased considerably by the coupling. Examples of the HESylation of active pharmaceutical ingredients are described, for example, in international patent application WO 02/080979 A2 or in international patent application WO 03/000738 A2.
  • HES is the hydroxyethylated derivative of amylopectin, a glucose polymer that is found in waxy maize starch and is found to be over 95%.
  • Amylopectin consists of glucose units which are present in ⁇ -1,4-glycosidic bonds and have ⁇ -1, 6-glycosidic branches.
  • HES has advantageous rheological properties and is currently used as a volume substitute and clinically used for hemodilution therapy (Sommermeyer et al., Kranlcenhauspharmazie,
  • the present invention has for its object to provide a method for producing a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide.
  • the object is achieved in a first aspect by a method for producing a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide comprising the steps: a) providing an aldonic acid of the polysaccharide or a derivative thereof; b) reacting the aldonic acid with an alcohol derivative, preferably a carbonate derivative of an alcohol, to an aldonic acid ester, preferably to an activated aldonic acid ester; and c) reacting the aldonic acid ester with the polynucleotide, the polynucleotide having a functional ammo group, characterized in that the reaction of the aldonic acid with the alcohol derivative in step b) is carried out in a dry aprotic polar solvent.
  • the solvent is selected from the group comprising dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and dimethylacetamide.
  • the aldonic acid ester is purified and then used in step c).
  • reaction mixture from step b) with the aldonic acid ester is used directly in step c).
  • step c) is carried out at a pH value range from 7 to 9, preferably 7.5 to 9 and preferably 8.0 to 8.8.
  • step c) is carried out at a pH of about 8.4.
  • the molar ratio of aldonic acid to alcohol derivative is approximately 0.9 to 1.1, preferably approximately 1.
  • the alcohol is selected from the group comprising N-hydroxy succinimide, sulfonated N-hydroxy succinimide, phenol derivatives and N-hydroxy benzotriazole.
  • the polysaccharide is selected from the group comprising dextran, hydroxyethyl starch, hydroxypropyl starch and branched starch fractions.
  • the polysaccharide is hydroxyethyl starch.
  • the hydroxyethyl starch has a weight average molecular weight of about 3,000 to 100,000 daltons, preferably of about 5,000 to 60,000.
  • the hydroxyethyl starch has a number average molecular weight of approximately 2,000 to 50,000 daltons.
  • the hydroxyethyl starch has a ratio of weight average molecular weight to number average average molecular weight of approximately 1.05 to 1.20.
  • the hydroxyethyl starch has a molar substitution of 0.1 to 0.8, preferably 0.4 to 0.7.
  • the hydroxyethyl starch has a substitution pattern expressed as the C2 / C6 ratio of about 2 to 12, preferably of about 3 to 10.
  • the polynucleotide is a functional nucleic acid.
  • the functional nucleic acid is an aptamer or a mirror bucket.
  • the polynucleotide has a molecular weight of 300 to 50,000 Da, preferably 4,000 to 25,000 Da and preferably 7,000 to 16,000 Da.
  • the functional amino group is a primary or secondary amino group, preferably a primary amino group.
  • the functional amino group is bound to a terminal phosphate of the polynucleotide. In a preferred embodiment it is provided that the functional amino group is bound to the phosphate group via a linker.
  • the functional amino group is a 5-aminohexyl group.
  • the object is achieved according to the invention by a conjugate of a polysaccharide and a polynucleotide, obtainable by a method according to the first aspect of the present invention.
  • the present invention is based on the surprising finding that from hydroxyethyl starch aldonic acids and aldonic acids from other polysaccharides, such as. B. waxy corn starch degradation fractions, in dry aprotic, polar solvents such as dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF), with alcohols, especially with the carbonates of alcohols, i.e. the diesters of carbonic acid with alcohols, such as , B. N-hydroxy succinimides, the corresponding aldonic acid esters could be prepared, which can be implemented in an aqueous environment with nucleophilic amino groups of polynucleotides to more stable amides advantageously. As a side reaction, the aldonic esters are stranded with water to form free aldonic acid and free alcohol.
  • DMA dimethylacetamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • the present invention turns away from the teachings previously described in the prior art or is based on the knowledge that the various methods described in the prior art are not suitable for the efficient production of a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide.
  • EDC can be used in an aqueous medium to couple molecules containing amino functions to the terminal phosphate group of oligonucleotides with the formation of a phosphoramidate bond.
  • the internal phosphate groups do not react under the reaction conditions that are realized. In this way, in particular 5 'phosphate groups can be specifically modified (Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto (1996) page 52).
  • FIG. 1A The reaction scheme for the production of a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide according to the invention is shown in FIG. 1, FIG. 1A showing the structure of the aldonic acid group of the aldonic acid of the polysaccharide and FIG. IB clarifying the course of the reaction.
  • FIG. 2 The reaction equations in FIG. 2, which are the subject of Examples 4 to 14, summarize the unsuccessful attempts to prepare a conjugate from a polynucleotide and a polysaccharide.
  • hydroxyethyl starch is a particularly preferred polysaccharide.
  • starch derivatives such as e.g. Hydroxyprolyl starch
  • hyperbranched starch fractions described in German patent application 102 17 994 in particular hyperbranched starch fractions with degrees of branching greater than 10 mol%, preferably greater than 10 mol% and less than 16 mol%, can be used in the context of the present invention.
  • HES is essentially characterized by the weight average molecular weight Mw, the number average molecular weight Mn, the molecular weight distribution and the degree of substitution.
  • Substitution with hydroxyethyl groups in ether linkage is possible at the carbon atoms 2, 3 and 6 of the anhydroglucose units.
  • the substitution pattern is described as the ratio of C2 to C6 substitution (C2 / C6 ratio).
  • the degree of substitution can be described as DS (“for degree of substitution”), which refers to the proportion of substituted glucose molecules of all glucose units, or as MS (for “molar substitution”), which means the average number of hydroxyethyl groups is designated per glucose unit.
  • the aldonic acid esters used according to the invention are prepared by reacting the aldonic acid of the polysaccharide or its derivatives in dry, aprotic solvents such as, for. As dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethylacetamide (DMA) and the carbonates of the alcohol component.
  • aprotic solvents such as, for. As dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethylacetamide (DMA) and the carbonates of the alcohol component.
  • the aldonic acids described herein are known in the prior art and can be prepared, for example, in accordance with the disclosure of German patent application DE 196 28 705.
  • the molar ratio is about 0.9 to 1.1, preferably about 1.0, since with an excess of carbonate, as is the case with the alcohol -
  • selectively activated OH groups of the polysaccharide and excess acid functions are not implemented in the event of a deficit.
  • Particularly preferred alcohols in the context of the present invention are N-hydroxy succinimide, sulfonated N-hydroxy succinimide, phenol derivatives and N-hydroxy-benzotriazole.
  • Suitable phenol derivatives include, inter alia, chlorinated, fluorinated or nitrated compounds, these being able to be activated one or more times, in particular by the electrophilic groups mentioned above. Accordingly, it is within the scope of the present invention to use mono- or polychlorinated phenols, mono- or polyfluorinated phenols or mono- or polynitrated phenols.
  • the aldonic acid esters used according to the invention can be precipitated from the solution in DMF by dry ethanol, isopropanol or acetone and can be purified or enriched by repeating the process several times. Such aldonic acid esters can then be used in bulk for coupling to polysaccharides. However, the solution of the reaction products in inert apolar solvent can also be used directly, without isolation of the active aldonic acid ester, for coupling to polysaccharides.
  • any type of polynucleotide is conjugated to a polysaccharide.
  • the polynucleotide can be produced from L-nucleosides or D-nucleosides or mixtures thereof, whereby these, individually or as a whole, can have further modifications, such as modifications to increase the stability in biological systems.
  • Such a modification represents for example the fluorination at position 2 'of the sugar component of the nucleotides or
  • the sugar components of the nucleotides that make up the polynucleotide can have a sugar other than ribose or deoxyribose.
  • Such sugars can be, for example, other pentoses, such as arabinose, but also hexoses or tetroses.
  • Such sugars can also contain a nitrogen atom or sulfur atom, for example in an aza or thio sugar, and / or the sugar portion of the polynucleotide can be at least partially replaced by a morpholino ring.
  • the polynucleotide can be at least partially designed as a locked nucleic acid (LNA) or peptide nucleic acid (PNA).
  • OH groups of the molecular components making up the backbone of the polynucleotide can be chemically modified by means of suitable NH 2 , SH, aldehyde, carboxyacid, phosphate, iodine, bromine or chlorine groups.
  • the polynucleotide is a ribonucleic acid or a deoxyribonucleic acid or combinations thereof, ie individual or a group of nucleotides are present as RNA and the other nucleotides that make up the nucleic acid are present as DNA and vice versa.
  • L-nucleic acid is used synonymously with the term L-oligonucleotide or L-polynucleotide and denotes, inter alia, both L-deoxyribonucleic acid and L-ribonucleic acid and combinations thereof, ie that individual or a group of nucleotides are present as RNA and the other nucleotides making up the nucleic acid are present as DNA and vice versa. It is also provided that other sugars form the sugar component of the nucleotide instead of deoxyribose or ribose.
  • nucleotides with further modifications at position 2 ' such as NH 2 , OMe, OEt, OAlkyl, NHAlkyl and the use of natural or unnatural nucleobases such as isocytidine, isoguanosine.
  • L-nucleic acid has so-called abasic positions, ie nucleotides that lack the nucleobase. Such abasic positions can be arranged both within the nucleotide sequence of the L-nucleic acid and at one or both of the ends, ie the 5 'and / or the 3' end.
  • polynucleotide is single-stranded, but it is also within the scope of the present invention that it is double-stranded. It is typically the one used according to the invention Polynucleotide around a single-stranded L-nucleic acid, which, however, due to its
  • Primary sequence can form defined secondary structures and also tertiary structures.
  • the conjugated nucleic acids described herein are preferably so-called Spiegelmers.
  • Spiegelmers are functional L-nucleic acids or L-polynucleotides, i.e. H. those nucleic acids that bind to a target molecule or a part thereof, and are the result of contacting a nucleic acid library, in particular a statistical nucleic acid library, with the target molecule.
  • combinatorial DNA libraries are first produced. As a rule, this involves the synthesis of DNA oligonucleotides which contain a central region of 10-100 randomized nucleotides which are flanked by two primer-binding regions 5'- and 3'-terminal.
  • the preparation of such combinatorial libraries is described, for example, in Conrad, RC, Giver, L., Tian, Y. and Ellington, AD, 1996, Methods Enzymol., Vol 267, 336-367.
  • Such a chemically synthesized single-stranded DNA library can be converted into a double-stranded library via the polymerase chain reaction, which library can be used for a selection in itself.
  • the individual strands are separated using suitable methods, so that a single strand library is used again, which is used for the in vitro selection method if it is a DNA selection (Bock, LC, Griffin, LC, Latham, JA, Vermaas, EH and Toole, JJ, 1992, Nature, Vol. 355, 564-566).
  • a DNA selection Bock, LC, Griffin, LC, Latham, JA, Vermaas, EH and Toole, JJ, 1992, Nature, Vol. 355, 564-566.
  • a suitable DNA-dependent polymerase e.g. B. the T7 RNA polymerase, an RNA library.
  • the targets can e.g. B. viruses, proteins, peptides,
  • Nucleic acids small molecules such as metabolites of metabolism, active pharmaceutical ingredients or their metabolites or other chemical, biochemical or biological components such as in Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. and Yarus, 1995, Annu. Rev.
  • Molecules are isolated from the library originally used and, after the selection step, are amplified by means of the polymerase chain reaction. This is the case with RNA selections
  • Upstream amplification step by polymerase chain reaction a reverse transcription.
  • a library enriched after a first round of selection can then be used in a new round of selection, so that the molecules enriched in the first round of selection have the chance to assert themselves again through selection and amplification and to go on with a further round of selection with even more daughter molecules.
  • Molecules prevailed. It has created an enriched pool, whose representatives through
  • Cloning can be isolated and then determined with the usual methods of sequence determination of DNA in its primary structure. The sequences obtained are then checked for their binding properties with respect to the target. The procedure for
  • the best binding molecules can be shortened to their essential binding domain by shortening the primary sequences and can be prepared by chemical or enzymatic synthesis.
  • a special form of aptamers that can be produced in this way are the so-called Spiegelmers, which are essentially characterized in that they are at least partially, preferably completely, composed of the non-natural L-nucleotides.
  • Methods for producing such Spiegelmers are described in PCT / EP97 / 04726, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the peculiarity of the method described therein lies in the generation of enantiomeric nucleic acid molecules, ie of L- Nucleic acid molecules that bind to a native target, that is to say in the natural form or configuration, or to such a target structure.
  • the selection procedure is used to first bind binding nucleic acids or sequences against the enantiomers, i.e. select non-naturally occurring structure of a naturally occurring target, for example in the case that the target molecule is a protein, against a D-protein.
  • the binding molecules obtained in this way (D-DNA, D-RNA or corresponding D-derivatives) are determined in their sequence and the identical sequence is then synthesized with mirror-image nucleotide building blocks (L-nucleotides or L-nucleotide derivatives).
  • Target shape or configuration present.
  • the polynucleotides in particular the functional nucleic acids such as aptamers or Spiegelmers, as are obtained in the selection and shortening processes described herein, have a molecular weight of approximately 300 Da to 50,000 Da. These preferably have a molecular weight of 4,000 Da to 25,000 Da, more preferably 7,000 to 16,000 Da.
  • target molecules described above can be molecules or structures, such as. B. viruses, viroids, bacteria, cell surfaces, cell organelles, proteins, peptides, nucleic acids, small molecules such as metabolites of metabolism, pharmaceutical agents or their metabolites or other chemical, biochemical or biological components.
  • the polynucleotide preferably on a phosphate group of the polynucleotide, has a nucleophilic group with which the aldonic acid ester reacts to form the conjugate. It is particularly preferred in the context of the present invention that this nucleophilic group is a functional amino group, preferably a primary amino group (NH 2 group). It is also within the scope of the invention that the polynucleotide reacted with the aldonic acid ester contains a functional secondary amino group, an imino group. In the context of the present invention, however, it is particularly preferred that the nucleophilic group is a primary amino group which is preferably bound to a phosphate group of the polynucleotide.
  • the amino group on the phosphate group is preferably present at the 5 'or 3' end, that is to say the terminal phosphate groups, of the polynucleotide.
  • the amino group can be bound either directly to the phosphate group or via a linker to the phosphate group.
  • linkers are known in the art.
  • Preferred linkers are alkyl radicals with a length of 1 to 8, preferably 2 to 6, carbon atoms.
  • the nucleophilic groups, such as the purine or pyrimidine base which are still present in the polynucleotide are not converted in the nucleic acids.
  • a polynucleotide as used herein is an oligonucleotide.
  • 1A shows the chemical structure of the aldonic acid group of the HES aldonic acid
  • IB shows a reaction scheme for the activation according to the invention of HES aldonic acid with a carbonate derivative of an alcohol to form an aldonic acid ester and its reaction with a polynucleotide carrying a functional amino group;
  • 2A shows the reaction scheme for the production of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid according to the prior art, in particular according to Examples 4-9;
  • 2B shows the reaction scheme for the production of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid according to the prior art, in particular according to example 10
  • 2C shows the reaction scheme for the production of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid according to the prior art, in particular according to example 11;
  • 2D shows the reaction scheme for the production of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid according to the prior art, in particular according to Examples 12-13;
  • 2E shows the reaction scheme for the production of conjugates from a polynucleotide and HES according to the prior art, in particular according to example 14;
  • FIG. 3 shows a chromatogram of the result of a reaction mixture for the HESylation of a Spiegelmer according to the present invention, in particular according to Example 1;
  • FIG. 5 shows a diagram of the inhibition of ghrelin-induced calcium 2+ release caused by HESylated mirror bucket or non-HESylated mirror bucket.
  • Example 1 Preparation of a conjugate from a mirror bucket and hydroxyethyl starch
  • a description of the production of the HES acid is disclosed, for example, in German patent application DE 196 28 705.
  • N-hydroxy succinimide ester of the HESylate was prepared as follows:
  • RNA-Spiegelmer 5 mg (corresponding to 1.3 ⁇ mol) 5'-aminohexyl functionalized RNA-Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 are dissolved in 0.7 ml of a 0.3 molar dicarbonate solution with a pH of 8.4.
  • the active ester, prepared as described above, is added directly to this solution and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the RNA Spiegelmer has the following sequence:
  • the conjugate is detected by low pressure GPC.
  • the analysis conditions used were the following, the analysis result being shown in FIG. 3:
  • reaction mixture yielded a yield of 62% (with solder precipitation with regard to the chromatogram) or 77% with tailing peak evaluation.
  • Example 3 Comparison of the inhibition of ghrelin-induced calcium release by ghrelin-binding HESylated and non-HESylated Spiegelmers.
  • Stably transfected CHO cells that express the human receptor for ghrelin (GHS-Rla) (obtained from Euroscreen, Gosselies, Belgium) are in a number of 5 - 7 x 10 4 per well of a black 96-well microtiter plate with clear bottom ( Greiner) and sown overnight at 37 ° C and 5% CO 2 in UltraCHO Medium (Cambrex), which also contains 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 400 ⁇ g / ml geneticin and 2.5 ⁇ g / ml fungi zone , cultivated.
  • GGS-Rla human receptor for ghrelin
  • the cells Before loading with the calcium indicator dye Fluo-4, the cells are washed once with 200 ⁇ l CHO-U +. Then 50 ⁇ l of the indicator dye solution (10 ⁇ M Fluo-4 (Molecular Probes), 0.08% Pluronic 127 (Molecular Probes) in CHO-U + are added and incubated for 60 min at 37 ° C. The cells are then 3 times with 180 ⁇ l CHO -U +, 90 ⁇ l of CHO-U + are then added to each well.
  • the indicator dye solution (10 ⁇ M Fluo-4 (Molecular Probes), 0.08% Pluronic 127 (Molecular Probes) in CHO-U + are added and incubated for 60 min at 37 ° C.
  • the cells are then 3 times with 180 ⁇ l CHO -U +, 90 ⁇ l of CHO-U + are then added to each well.
  • the fluorescence signals are measured at an excitation wavelength of 485 ⁇ m and an emission wavelength of 520 nm in an Fkuostar Optima multi-detection plate reader (BMG).
  • the stimulation solutions are added to the cells for a precise analysis of the time course of the changes in calcium concentrations caused by ghrelin.
  • the wells of a vertical row of a 96 well plate are measured together.
  • three measured values are first recorded every 4 seconds to determine the baseline.
  • the measurement is interrupted, the plate is extended from the reader and 10 ⁇ l of the stimulation solution from the “low profile 96-tube” plate in which the preincubation was carried out is added to the wells of the row to be measured using a multi-channel pipette.
  • the plate is then moved back into the device and the measurement is continued (a total of 20 measurements, each 4 seconds apart).
  • HESylated Spiegelmers cells expressing ghrelin receptor were stimulated with 5 nM ghrelin, or ghrelin which had been preincubated together with various amounts of HESylated or non-HESylated mirror bucket.
  • the measured fluorescence signals were normalized to the signals obtained without a mirror bucket.
  • the HESylated mirror bucket inhibits ghrelin-induced Ca ++ release with an IC 50 of about 6.5 nM, whereas the non-HESylated mirror bucket inhibits with an IC 50 of about 5 nM.
  • the result is shown in FIG. 5.
  • Example 4 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • RNA Spiegelmer according to SEQ. ID. No. 1 given at room temperature. 50 mg of N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyh-carbodiimide hydrochloride (261 ⁇ mol), dissolved in 1 ml of water, are then added in portions over a period of 2 hours at room temperature. A pH value is obtained by adding hydrochloric acid or sodium hydroxide solution kept constant at 5. After the reaction has ended, the mixture is stirred for a further 2 hours at room temperature, and the reaction mixture was checked by means of low-pressure GPC and the reaction rate of the mirror bucket used was less than 1%.
  • Example 5 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • Example 6 Preparation of conjugates from a polynucleotide xmd HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • reaction product After a further 2 hours of reaction, the mixture is analyzed using low-pressure GPC. No reaction product could be detected.
  • Example 7 Preparation of conjugates from a polynucleotide xmd HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • Example 8 Preparation of conjugates from a polynucleotide xmd HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • Examples 6 and 7 were repeated at pH 4.0 and 6.0.
  • Example 9 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • Example 4 was repeated at reaction temperatures of 4 ° C. and 37 ° C.
  • Example 10 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • RNA Spiegelmer according to Seq. JJD. No. 1 are dissolved in 10 mL water and the pH is adjusted to 8.5 with sodium hydroxide solution or dissolved in 10 mL 0.3 molar bicarbonate buffer of pH 8.4.
  • Example 11 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • Example 12 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • RNA Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 5 mg RNA Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 are dissolved in 5 mL water. 10 mL of the above-mentioned solution of imidazolyl-HES-aldonic acid 10 / 0.4 are added to this solution and the pH is adjusted to 7.5 with sodium hydroxide solution. After stirring at room temperature overnight, the mixture was examined for the reaction product by means of low-pressure GPC. Only traces of the reaction product were found.
  • Example 13 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES aldonic acid using methods according to the prior art
  • RNA Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 5 mg RNA Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 are dissolved in 12.5 mL 0.3 M pH 8.4 bicarbonate buffer. The mixture was cooled to 0 ° C. with ice water and 8.5 ml of the solution of HES 10 / 0.4 - aldonic acid imidazolyl in DMF listed in Example 12 were added. After 2 hours at 0 ° C. and a further 2 hours at room temperature, the mixture was examined for the reaction product. No product could be detected.
  • Example 14 Preparation of conjugates from a polynucleotide and HES using prior art methods 1 g HES 10 / 0.4 (0.25 mmol) are dissolved in 5 mL H 2 O while warm. After cooling, 10 mg (corresponding to 2.5 ⁇ mol) of RNA Spiegelmer according to Seq. ID. No. 1 added and the pH adjusted to 7.5 with sodium hydroxide solution. Then 200 ⁇ l of borane-pyridine complex (Sigma-Aldrich) are added and the mixture is stirred at room temperature in the dark for 10 days. The approach is then examined for possible reaction products by low pressure GPC. Only a conversion ⁇ 3% based on the mirror bucket used could be determined.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Aldonsäure des Polysaccharides oder eines Derivates davon; b) Umsetzen der Aldonsäure mit einem Alkohol-Derivat, bevorzugterweise einem Carbonat-Derivat eines Alkohols, zu einem Aldonsäure-Ester, bevorzugterweise zu einem aktivierten Aldonsäure-Ester; und c) Umsetzen des Aldonsäure-Esters mit dem Polynukleotid, wobei das Polynukleotid eine funktionale Amino-Gruppe aufweist, wobei das Umsetzen der Aldonsäure mit dem Alkohol-Derivat in Schritt (b) in einem trockenen aprotischen polaren Lösungsmittel erfolgt.

Description

Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Polysacchariden und Polynukleotiden
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid sowie die nach einem derartigen Verfahren erhältlichen Konjugate.
Die Konjugation von pharmazeutischen Wirkstoffen insbesondere von Proteinen mit Polyethylenglycol-Derivaten („PEGylierung") oder Polysacchariden wie Dextranen oder insbesondere Hydroxyethylstärke („HESylierung") hat in den letzten Jahren mit der Zunahme an pharmazeutischen Proteinen aus der biotechnologischen Forschung an Bedeutung gewonnen.
Die Wirkungen einer PEGylierung oder HESylierung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen wie beispielsweise Proteinen besteht unter anderem darin, dass durch eine Kopplung der Proteine an die oben angeführten Polymere wie Polyethylenglycol (PEG) oder Hydroxyethylstärke (HES) deren für die Entfaltung des vollen pharmazeutischen Potentials zu geringe kurze biologische Halbwertszeit gezielt verlängert werden kann. Durch die Kopplung können aber auch die antigenen Eigenschaften von Proteinen positiv beeinflusst werden. Im Falle von anderen pharmazeutischen Wirkstoffen kann durch die Kopplung die Wasserlöslichkeit erheblich vergrößert werden. Beispiele für die HESylierung von pharmazeutischen Wirkstoffen sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 02/080979 A2 oder in der internationalen Patentanmeldung WO 03/000738 A2 beschrieben.
Auch neuere Entwicklungen auf dem Gebiet von biologische Zielmoleküle hochaffin bindenden Oligonukleotiden, wie beispielsweise den als Aptamere bezeichneten D-Oligonukleotide oder den als Spiegelmere bezeichneten L-Oligonukleotide, nutzen die Möglichkeiten der Konjugation an Polymere wie Polyethylenglycol (B. Wlotzka et al. PNAS 13, Vol. 99 (2002) Seite 8898- 8902), um das pharmakokinetische Profil und die Bioverfügbarkeit in vorteilhafter Weise zu verändern.
HES ist das hydroxyethylierte Derivat des in Wachsmaisstärke zu über 95 % vorkommenden Glucosepolymers Amylopektin. Amylopektin besteht aus Glucoseeinheiten, die in α-1,4- glykosidischen Bindungen vorliegen und α-l,6-glykosidische Verzweigungen aufweisen. HES weist vorteilhafte rheologische Eigenschaften auf und wird zur Zeit als Volumenersatzmittel und zur Hämodilutionstherapie klinisch eingesetzt (Sommermeyer et al., Kranlcenhauspharmazie,
Vol. 8 (1987) Seite 271 - 278 und Weidler et. al., Arzneimittelforschung / Drag Res., 41 (1991)
Seite 494 - 498).
In DE 196 28 705 und DE 101 29 369 werden konkret für Hämoglobin bzw. Amphotericin B Verfahren beschrieben, wie die Kopplung mit Hydroxyethylstärke in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) über das entsprechende Aldonsäurelacton der Hydroxyethylstärke mit freien Aminogruppen von Hämoglobin bzw. Amphotericin B durchgeführt werden kann.
Da in wasserfreien, aprotischen Lösungsmitteln gerade im Falle der Proteine oft nicht gearbeitet werden kann, entweder aus Löslichkeitsgründen aber auch aus Gründen der Denaturierung der Proteine, sind in der Literatur auch Kopplungsverfahren mit HES im wasserhaltigen Milieu beschrieben. So offenbart zum Beispiel die internationale Patentanmeldung PCT/EP 02/02928 die Kopplung der am reduzierenden Kettenende selektiv zur Aldonsäure oxidieren Hydroxyethylstärke durch Vermittlung von wasserlöslichem Carbodiimid EDC (l-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid). Sehr oft jedoch ist der Einsatz von Carbodiimiden mit Nachteilen behaftet, da Carbodiimide sehr häufig inter- oder intramolekulare Vernetzungsreaktionen der Proteine als Nebenreaktionen verursachen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid bereitzustellen.
Erfmdungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Aldonsäure des Polysaccharides oder eines Derivates davon; b) Umsetzen der Aldonsäure mit einem Alkohol-Derivat, bevorzugterweise einem Carbonat-Derivat eines Alkohols, zu einem Aldonsäure-Ester, bevorzugterweise zu einem aktivierten Aldonsäure-Ester; und c) Umsetzen des Aldonsäure-Esters mit dem Polynukleotid, wobei das Polynukleotid eine funlctionale Ammo-Gruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen der Aldonsäure mit dem Alkohol-Derivat in Schritt b) in einem trockenen aprotischen polaren Lösungsmittel erfolgt.
In einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Dimethylacetamid umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Aldonsäure-Ester gereinigt wird und danach in Schritt c) verwendet wird.
In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Reaktionsansatz aus Schritt b) mit dem Aldonsäure-Ester direkt in Schritt c) eingesetzt wird.
hl einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass Schritt c) bei einem pH-Wertbereich von 7 bis 9, bevorzugterweise 7,5 bis 9 und bevorzugtererweise 8,0 bis 8,8 durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass Schritt c) bei einem pH- Wert von etwa 8,4 durchgeführt wird.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das molare Verhältnis von Aldonsäure zu Alkohol-Derivat etwa 0,9 bis 1,1, bevorzugterweise etwa 1 beträgt.
In einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe, die N-Hydroxy-Succinimid, sulfoniertes N-Hydroxy-Succinimid, Phenolderivate und N-Hydroxy- Benzotriazol umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe, die Dextran, Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und verzweigte Stärkefraktionen umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polysaccharid Hydroxyethylstärke ist. hi einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Hydroxyethylstärke ein gewichtsgemitteltes mittleres Molekulargewicht von etwa 3.000 bis 100.000 Dalton, bevorzugterweise von etwa 5.000 bis 60.000 aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausfülirungsform ist vorgesehen, dass die Hydroxyethylstärke ein Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichtes von etwa 2.000 bis 50.000 Dalton aufweist.
In einer Ausfülirungsform ist vorgesehen, dass die Hydroxyethylstärke ein Verhältnis von gewichtsgemitteltem Molekulargewicht zu Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichts von etwa 1,05 bis 1,20 aufweist.
In einer Ausftihrungsform ist vorgesehen, dass die Hydroxyethylstärke eine molare Substitution von 0,1 bis 0,8, bevorzugterweise von 0,4 bis 0,7 aufweist.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Hydroxyethylstärke ein Substitutionsmuster ausgedrückt als das C2/C6-Verhältnis von etwa 2 bis 12, bevorzugterweise von etwa 3 bis 10 aufweist. i einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass das Polynukleotid eine funktionelle Nukleinsäure ist.
hi einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die funktionale Nukleinsäure ein Aptamer oder ein Spiegeimer ist.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polynukleotid ein Molekulargewicht von 300 bis 50,000 Da, bevorzugterweise 4,000 bis 25,000 Da und bevorzugtererweise 7,000 bis 16,000 Da aufweist.
In einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass die funktionale Aminogruppe eine primäre oder sekundäre Aminogruppe ist, bevorzugterweise eine primäre Aminogruppe ist.
In einer Ausfülirungsform ist vorgesehen, dass die funktionale Aminogruppe an ein terminales Phosphat des Polynukleotids gebunden ist. In einer bevorzugten Ausfülirungsform ist vorgesehen, dass die funktionale Aminogruppe über einen Linker an die Phosphatgruppe gebunden ist.
In einer Ausfülirungsform ist vorgesehen, dass die funktionale Aminogruppe eine 5- Aminohexylgruppe ist.
In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelösut durch ein Konjugat aus einem Polysaccharid und einem Polynukleotid, erhältlich nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass aus Hydroxyethylstärke- Aldonsäuren sowie Aldonsäuren von anderen Polysacchariden, wie z. B. Wachsmaisstärke-Abbaufraktionen, in trockenen aprotischen, polaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dimethylacetamid (DMA), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF), mit Alkoholen, insbesondere mit den Carbonaten von Alkoholen, also den Diestern der Kohlensäure mit Alkoholen, wie z. B. N-Hydroxy-Succinimide, die entsprechenden Aldonsäureester hergestellt werden konnten, die sich im wässrigen Milieu mit nukleophilen Aminogruppen von Polynukleotiden zu stabileren Amiden vorteilhafterweise umsetzen lassen. Als INebenreaktion tritt eine Verseilung der Aldonsäureester mit Wasser zur freien Aldonsäure und zum freien Alkohol auf.
Überraschenderweise tritt dabei keine Aktivierung der Hydroxylgruppen der Anhydroglucoseeinheiten auf, sondern spezifisch die Aktivierung der Carboxylgruppe der Aldonsäuren, sofern man die molaren Verhältnisse der Reaktanten in der Nähe von 1 : 1 einstellt.
Die vorliegende Erfindung wendet sich insoweit von den bisher im Stand der Technik beschriebenen Lehren ab, bzw. beruht auf der Erkenntnis, dass die verschiedenen, im Stand der Technik beschriebenen Verfahren für eine effiziente Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid nicht geeignet sind.
So wurde von den vorliegenden Erfindern auch überraschenderweise gefunden, dass sich L-5'- aminofunktionalisierte Oligonukleotide nicht mit HES -Aldonsäuren umsetzen lassen über eine Carbodiimid (EDC)-vermittelte Bildung einer Amidbindung mit der 5 'Aminogruppe, trotz Variationen der möglichen Reaktionsparameter und Reaktantenverhältnisse. Zwar ist bekannt, dass Phosphate und Phosphatgruppen enthaltende Verbindungen den Verlust von Carbodiimiden anwachsen lassen, oft auch dramatisch, aber selbst große Überschüsse an EDC führten im vorliegenden Fall nicht zu messbarem Reaktionsprodukt (S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC-Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C. (1993) Seite 199).
Weiterhin ist bekannt, dass in wässrigem Milieu EDC eingesetzt werden kann, um Aminofunktionen enthaltende Moleküle an die terminale Phosphatgruppe von Oligonukleotiden unter Bildung einer Phosphoramidatbindung zu koppeln. Unter den dabei realisierten Reaktionsbedingungen reagieren die internen Phosphatgruppen nicht. Auf diesem Wege können insbesondere 5 'Phosphatgruppen spezifisch modifiziert werden (Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto (1996) Seite 52).
Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass auch andere etablierte Koppluiigsmethoden, die in der Literatur für Hydroxyethylstärke-Derivate beschreiben sind, sich nicht erfolgreich mit 5-aminofunktionalisieren L-Oligonukleotiden anwenden ließen. So ist es eine gängige Methode, zur Herstellung von Säureamiden im Sinne einer Bildung einer Amidbindung als Zwischenstufe aus der Säure das reaktive Säureimidazolid zu bilden, und anschließend mit diesem aktiven Acylierungsmittel die Umsetzung des Amins zum entsprechenden Amid unter Freisetzung von Imidazol durchzuführen.
hu Falle der HES-Aldonsäuren gelang die Herstellung des reaktiven HES-Imidazolids. Dieses zersetzte sich jedoch bei der Umsetzung in wässriger Lösung bei allen untersuchten pH-Werten und Reaktanten- Verhältnissen zu Imidazol und HES-Säure, ohne eine Kopplung mit dem an und für sich nukleophileren 5-aminofunktionalisierten Polynukleotid einzugehen.
Als weitere Möglichkeit wurde die Kopplung über einen aktiven Hydroxysuccinimid-Ester der HES-Säure angestrebt, der zuvor in wasserfreiem Milieu nach Literaturvorschriften entweder via EDC-Aktivierung, oder durch Umsetzung des HES-Lactons mit Hydroxysuccinimid in wasserfreiem Milieu hergestellt wurde. Keine der beiden Methoden war jedoch erfolgreich. Auch die Umsetzung von HES über die einzige reduzierende Endgruppe mit dem aminofunktionalisierten Polynukleotid im Sinne einer reduktiven Aminierung verlief erfolglos, trotz sehr langer Reaktionszeiten.
Das Reaktionsschema der erfindungsgemäßen Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid ist in Fig. 1 dargestellt, wobei Fig. 1A die Struktur der Aldonsäure-Gruppe der Aldonsäure des Polysaccharides zeigt und Fig. IB den Reaktionsablauf verdeutlicht. Die Reaktionsgleichungen in Fig. 2, die Gegenstand der Beispiele 4 bis 14 sind, fassen die nicht erfolgreichen Versuche zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid zusammen.
Obgleich das erfϊndungsgemäße Verfahren grundsätzlich nicht auf bestimmte Polysaccharide beschränkt ist, stellt Hydroxyethylstärke ein besonders bevorzugtes Polysaccharid dar. Es ist jedoch auch im Rahmen der Erfindung, dass andere Stärkederivate, wie z.B. Hydroxyprolylstärke verwendet werden. Ebenfalls können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die in der deutschen Patentanmeldung 102 17 994 beschriebenen hyperverzweigten Stärkefraktionen, insbesondere hyperverzweigte Stärkefraktionen mit Verzweigungsgraden größer als 10 mol%, bevorzugterweise größer als 10 mol% und kleiner als 16 mol%, verwendet werden.
HES wird im wesentlichen über das gewichtsgemittelte mittlere Molekulargewicht Mw, das Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichts Mn, die Molekulargewichtsverteilung und den Substitutionsgrad gekennzeichnet. Die Substitution mit Hydroxyethylgruppen in Ätherbindung ist dabei an den Kohlenstoffatomen 2, 3 und 6 der Anhydroglucoseeinheiten möglich. Das Substitutionsmuster wird dabei als das Verhältnis der C2 zur C6 Substitution beschrieben (C2/C6-Verhältnis). Der Substitutionsgrad kann dabei als DS (engl. für „degree of Substitution"), welcher auf den Anteil der substituierten Glucosemoleküle aller Glucoseeinheiten Bezug nimmt, oder als MS (engl. für „molar Substitution") beschrieben werden, womit die mittlere Anzahl von Hydroxyethylgruppen pro Glucoseeinheit bezeichnet wird.
hi der wissenschaftlichen Literatur wie auch hierin wird als Kurzbezeichnung für Hydroxyethylstärke das Molekulargewicht Mw in der Einheit kDalton zusammen mit dem Substitutionsgrad MS angegeben. So bezeichnet HES 10/0,4 eine Hydroxyethylstärke des Molekulargewichtes Mw von 10.000 und des Substitutionsgrades MS von 0,4. Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Aldonsäureester erfolgt durch die Umsetzung der Aldonsäure des Polysaccharids bzw. ihrer Derivate in trockenen, aprotischen Lösungsmitteln wie z. B. Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylacetamid (DMA) und den Carbonaten der Alkoholkomponente. Die hierin beschriebenen Aldonsäuren sind im Stand der Technik bekannt und können beispielsweise gemäß der Offenbarung der Deutschen Patentanmeldung DE 196 28 705 hergestellt werden.
Bei der Reaktion der Aldonsäure mit dem Alkohol-Derivat, insbesondere den Carbonaten des jeweils verwendeten Alkohols, beträgt das molare Verhältnis etwa 0,9 bis 1,1, bevorzugterweise etwa 1,0, da bei einem Überschuss an Carbonat, wie dies durch das Alkohol-Derivat bereitgestellt wird, selektiv OH-Gruppen des Polysaccharids aktiviert werden und bei einem Unterschuss überschüssige Säurefunktionen nicht umgesetzt werden.
Besonders bevorzugte Alkohole im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind N-Hydroxy- Succinimid, sulfoniertes N-Hydroxy-Succinimid, Phenolderivate und N-Hydroxy-Benzotriazol. Geeignete Phenolderivate umfassen, unter anderem, chlorierte, fluorierte oder nitrierte Verbindungen, wobei diese insbesondere durch die vorstehend genannten elektrophilen Gruppen einfach oder mehrfach aktiviert sein können. Entsprechend ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, mono- oder polychlorierte Phenole, mono- oder polyfluorierte Phenole oder mono- oder polynitrierte Phenole zu verwenden.
Die erfmdungsgemäß verwendeten Aldonsäureester können aus der Lösung in DMF durch trockenes Ethanol, Isopropanol oder Aceton gefällt und durch mehrfaches Wiederholen des Vorganges gereinigt bzw. angereichert werden. Solche Aldonsäureester können dann in Substanz isoliert zur Kopplung an Polysaccharide verwendet werden. Die Lösung der Reaktionsprodukte in inertem apolarem Lösungsmittel kann jedoch auch direkt, ohne Isolierung des aktiven Aldonsäureesters zur Kopplung an Polysaccharide weiterverwendet werden.
Grundsätzlich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jegliche Art von Polynukleotiden mit einem Polysaccharid konjugiert wird. Das Polynukleotid kann dabei aus L- Nukleosiden oder D-Nukleosiden oder Mischungen davon hergestellt sein, wobei diese einzeln oder insgesamt weitere Modifizierungen aufweisen können, wie beispielsweise Modifizierungen zur Erhöhung der Stabilität in biologischen Systemen. Eine derartige Modifizierung stellt beispielsweise die Fluorierung an der Position 2' des Zuckerbestandteils der Nukleotide bzw.
Nukleoside dar. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zumindest ein Teil der Zuckerbestandteile der das Polynukleotid aufbauenden Nukleotide einen anderen Zucker als Ribose oder Desoxyribose aufweisen kann. Derartige Zucker können beispielsweise weitere Pentosen, wie zum Beispiel Arabinose, aber auch Hexosen oder Tetrosen sein. Derartige Zucker können auch ein Stickstoffatom oder Schwefelatom enthalten, wie zum Beispiel in einem Aza- oder einem Thiozucker, und/oder der Zuckeranteil des Polynukleotides zumindest teilweise durch einen Morpholino-Ring ersetzt sein. Weiterhin kann das Poynukleotid zumindest teilweise als locked Nukleinsäuren (LNA) oder Peptid-Nukleinsäure (PNA) ausgebildet sein. Die OH- Gruppen der das Rückgrat des Polynukleotids aufbauenden Molekülbestandteile können durch geeignete NH2-, SH-, Aldehyd-, Carboxysäure-, Phosphat-, Jod-, Brom-, oder Chlorgruppen chemisch modifiziert vorliegen.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es sich bei dem Polynukleotid um eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure oder Kombinationen davon handelt, d. h. einzelne oder eine Gruppe von Nukleotiden als RNA vorliegen und die weiteren, die Nukleinsäure aufbauende Nukleotide als DNA vorliegen und umgekehrt. Der Begriff L- Nukleinsäure wird hierin synonym zu dem Begriff L-Oligonukleotid oder L-Polynukleotid verwendet und bezeichnet, unter anderem, sowohl L-Desoxyribonukleinsäure wie auch L- Ribonukleinsäure und Kombinationen davon, d. h. dass einzelne oder eine Gruppe von Nukleotiden als RNA vorliegen und die weiteren die Nukleinsäure aufbauenden Nukleotide als DNA vorliegen und umgekehrt. Dabei ist auch vorgesehen, dass anstelle von Desoxyribose oder Ribose andere Zucker die Zuckerkomponente des Nukleotids ausbilden. Weiterhin umfasst ist die Verwendung von Nukleotiden mit weiteren Modifikationen an Position 2' wie NH2, OMe, OEt, OAlkyl, NHAlkyl und die Verwendung von natürlichen oder unnatürlichen Nukleobasen wie zum Beispiel Isocytidin, Isoguanosin. Es ist dabei auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die L-Nukleinsäure sogenannte abasische Positionen aufweist, d. h. Nukleotide, denen die Nukleobase fehlt. Derartige abasische Positionen können sowohl innerhalb der Nukleotidsequenz der L-Nukleinsäure angeordnet sein, wie auch an einem oder beiden der Enden, d. h. dem 5'- und/oder dem 3'- Ende.
Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Polynukleotid einzelsträngig vorliegt, wobei es jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, dass dieses doppelsträngig vorliegt. Typischerweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Polynukleotid um eine einzelsträngige L-Nukleinsäure, die jedoch bedingt durch ihre
Primärsequenz definierte Sekundär Strukturen und auch Tertiärstrukturen ausbilden kann. In der
Sekundärstruktur liegen bei einer Vielzahl von L-Nukleinsäuren auch doppelsträngige
Abschnitte vor.
Bei den hierin beschriebenen konjugierten Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugterweise um sog. Spiegelmere. Wie eingangs bereits erwähnt, sind Spiegelmere funktionale L-Nukleinsäuren oder L-Polynukleotide, d. h. solche Nukleinsäuren, die an ein Zielmolekül oder einen Teil davon binden, und das Ergebnis des Kontaktierens einer Nuklemsäurebibliothek, insbesondere einer statistischen Nuklemsäurebibliothek, mit dem Zielmolekül sind.
Für ein Selektionsverfahren zur Entwicklung funktionaler Nukleinsäuren werden zunächst kombinatorische DNA-Bibliotheken hergestellt. In der Regel handelt es sich um die Synthese von DNA-Oligonukleotiden, die zentral einen Bereich aus 10-100 randomisierten Nukleotiden enthalten, die von zwei primer-Bindungsregionen 5'- und 3'-terminal flankiert werden. Die Herstellung derartiger kombinatorischer Bibliotheken ist bspw. beschrieben in Conrad, R.C., Giver, L., Tian, Y. and Ellington, A.D., 1996, Methods Enzymol., Vol 267, 336-367. Eine solche chemisch synthetisierte einzelsträngige DNA-Bibliothek lässt sich über die Polymerase- Kettenreaktion in eine doppelsträngige Bibliothek überführen, die für sich genommen schon für eine Selektion eingesetzt werden kann. In der Regel erfolgt jedoch mit geeigneten Methoden eine Separation der einzelnen Stränge, so dass man wieder zu einer Einzelstrangbibliothek gelangt, die für das in vitro Selektionsverfahren eingesetzt wird, wenn es sich um eine DNA- Selektion handelt (Bock, L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.H. und Toole, J.J., 1992, Nature, Vol. 355, 564-566). Es ist jedoch ebenso möglich, die chemisch synthetisierte DNA- Bibliothek direkt in die in vitro Selektion einzusetzen. Darüber hinaus kann prinzipiell aus doppelsträngiger DNA, wemi zuvor ein T7 Promotor eingeführt worden ist, auch über eine geeignete DNA-abhängige Polymerase, z. B. die T7 RNA Polymerase, eine RNA-Bibliothek erzeugt werden. Mit Hilfe der beschriebenen Verfahren ist es möglich, Bibliotheken von 1015 und mehr DNA- oder RNA-Molekülen zu erzeugen. Jedes Molekül aus dieser Bibliothek hat eine andere Sequenz und somit eine andere dreidimensionale Struktur.
Über das in vitro Sele tions verfahren ist es nun möglich, aus der erwähnten Bibliothek durch mehrere Zyklen von Selektion und Amplifikation sowie gegebenenfalls Mutation ein oder mehrere DNA-Moleküle zu isolieren, die gegen ein gegebenes Target eine signifikante Bindungseigenschaft aufweisen. Die Targets können z. B. Viren, Proteine, Peptide,
Nukleinsäuren, kleine Moleküle wie Metaboliten des Stoffwechsels, pharmazeutische Wirkstoffe oder deren Metaboliten oder andere chemische, biochemische oder biologische Komponenten sein wie beispielsweise in Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. und Yarus, 1995, Annu. Rev.
Biochem. Vol. 64, 763-797 und Lorsch, J.R. und Szostak, J.W., 1996, Combinatorial Libraries,
Synthesis, Screening and application potential, ed. Riccardo Cortese, Walter de Gruyter, Berlin, beschrieben. Das Verfahren wird in der Weise durchgeführt, dass bindende DNA- oder RNA-
Moleküle aus der ursprünglich eingesetzten Bibliothek isoliert und nach dem Selektionsschritt mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden. Bei RNA-Selektionen ist dem
Amplifikationsschritt durch Polymerase-Kettenreaktion eine reverse Transkription vorzuschalten. Eine nach einer ersten Selektionsrunde angereicherte Bibliothek kann dann in eine erneute Selektionsrunde eingesetzt werden, so dass die in der ersten Selektionsrunde angereicherten Moleküle die Chance haben, durch Selektion und Amplifikation sich erneut durchzusetzen und mit noch mehr Tochtermolekülen in eine weitere Selektionsrunde zu gehen.
Gleichzeitig eröffnet der Schritt der Polymerase-Kettenreaktion die Möglichkeit, neue
Mutationen bei der Amplifikation einzubringen, z.B. durch die Variation der Salzkonzentration.
Nach genügend vielen Selektions- und Amplifikationsrunden haben sich die bindenden
Moleküle durchgesetzt. Es ist so ein angereicherter Pool entstanden, dessen Vertreter durch
Klonierung vereinzelt und anschließend mit den gängigen Methoden der Sequenzbestimmung von DNA in ihrer Primärstruktur bestimmt werden können. Die erhaltenen Sequenzen werden dann auf ihre Bindungseigenschaften hinsichtlich des Targets überprüft. Das Verfahren zur
Erzeugung derartiger Aptamere wird auch als SELEX- Verfahren bezeichnet und ist bspw. beschrieben in EP 0 533 838, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die besten Bindungsmoleküle können durch Verkürzung der Primärsequenzen auf ihre wesentliche Bindungsdomäne verkürzt und durch chemische oder enzymatische Synthese dargestellt werden.
Eine besondere Form von solchermaßen herstellbaren Aptameren sind die sogenannten Spiegelmere, die sich im wesentlichen dadurch auszeichnen, dass sie zumindest teilweise, bevorzugt vollständig aus den nicht-natürlichen L-Nukleotiden aufgebaut sind. Verfahren zur Herstellung derartiger Spiegelmere sind beschrieben in PCT/EP97/04726, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Besonderheit des darin beschriebenen Verfahrens liegt in der Erzeugung von enantiomeren Nukleinsäuremolekülen, d.h. von L- Nukleinsäuremolekülen, die an ein natives, d.h. in der natürlichen Form oder Konfiguration vorliegendes Target oder eine derartige Targetstruktur binden. Das oben beschriebene in vitro
Selektions verfahren wird dazu eingesetzt, bindende Nukleinsäuren oder Sequenzen zunächst gegen die Enantiomere, d.h. nicht natürlich vorkommenden Struktur eines natürlicherweise vorkommenden Targets zu selektieren, beispielsweise im Falle, dass das Zielmolekül ein Protein ist, gegen ein D-Protein. Die so erhaltenen Bindungsmoleküle (D-DNA, D-RNA bzw. entsprechende D-Derivate) werden in ihrer Sequenz bestimmt und die identische Sequenz wird dann mit spiegelbildlichen Nukleotidbausteinen (L-Nukleotide bzw. L-Nukleotidderivate) synthetisiert. Die so erhaltenen spiegelbildlichen, enantiomeren Nukleinsäuren (L-DNA, L-RNA bzw. entsprechende L-Derivate), sogenannte Spiegelmere, haben aus Symmetriegründen eine spiegelbildliche Tertiärstruktur und somit eine Bindungseigenschaft für das in der natürlichen
Form oder Konfiguration vorliegende Target.
Die Polynukleotide, insbesondere die funktionalen Nukleinsäuren wie Aptamere oder Spiegelmere, wie sie in den hierin bescliriebenen Selektions- und Verkürzungsverfahren erhalten werden, besitzen ein Molekulargewicht etwa von 300 Da bis 50,000 Da. Bevorzugterweise weisen diese ein Molekulargewicht von 4,000 Da bis 25,000 Da, bevorzugtererweise von 7,000 bis 16,000 Da auf.
Die vorstehend bescliriebenen Zielmoleküle, auch als Target bezeichnet, können Moleküle oder Strukturen sein, so z. B. Viren, Viroide, Bakterien, Zelloberflächen, Zellorganellen, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, kleine Moleküle wie Metaboliten des Stoffwechsels, pharmazeutische Wirkstoffe oder deren Metabolite oder andere chemische, biochemische oder biologische Komponenten.
Gemäß dem erfmdungsgemäßen Verfahren weist das Polynukleotid, bevorzugterweise an einer Phosphatgruppe des Polynukleotids, eine nukleophile Gruppe auf, mit der der Aldonsäure-Ester zur Ausbildung des Konjugates reagiert. Dabei ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, dass diese nukleophile Gruppe eine funktionale Aminogruppe, bervorzugterweise eine primäre Aminogruppe (NH2-Gruppe) ist. Es ist auch im Rahmen der Erfindung, dass das mit dem Aldonsäure-Ester umgesetzte Polynukleotid eine funktionelle sekundäre Aminogruppe, eine Iminogxuppe, enthält. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch besonders bevorzugt, dass es sich bei der nukleophilen Gruppe um eine primäre Amino-Gruppe handelt, die bevorzugterweise an eine Phosphatgruppe des Polynukleotids gebunden vorliegt. Bevorzugterweise liegt die Amino- Gruppe an der Phosphat-Gruppe am 5'- oder am 3 '-Ende, also den terminalen Phosphatgruppen, des Polynukleotids vor. Die Aminogruppe kann dabei in einer Ausführungsform entweder direkt an die Phosphatgruppe oder über einen Linker an die Phosphatgruppe gebunden sein. Derartige Linker sind in der Technik bekannt. Bevorzugte Linker sind Alkylreste mit einer Länge von 1 bis 8, bevorzugterweise 2 bis 6 C-Atomen. Insbesondere bei Verwendung von Aldonsäure-Estern des N-Hydroxy-Succinimids werden die in dem Polynukleotid weiterhin vorhandenen nukleophilen Gruppen wie die Purin- oder Pyrimidin-Base in den Nukleinsäuren nicht umgesetzt.
Es ist im Ralunen der vorliegenden Erfindung, dass anstelle eines Polynukleotids ein Oligonukleotid verwendet wird, hi einer Ausführungsform ist ein Polynukleotid, wie hierin verwendet, ein Oligonukleotid.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben. Dabei zeigt:
Fig. 1 A die chemische Struktur der Aldonsäure-Gruppe der HES-Aldonsäure;
Fig. IB ein Reaktionsschema zur erfindungsgemäßen Aktivierung von HES-Aldonsäure mit einem Carbonat-Derivat eines Alkohols zu einem Aldonsäure-Ester und dessen Umsetzung mit einem eine funlctionale Aminogruppe tragenden Polynukleotid;
Fig. 2A das Reaktionsschema der Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure gemäß dem Stand der Technik, insbesondere gemäß der Beispiele 4-9;
Fig. 2B das Reaktionsschema der Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure gemäß dem Stand der Technik, insbesondere gemäß dem Beispiel 10; Fig. 2C das Reaktionsschema der Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure gemäß dem Stand der Technik, insbesondere gemäß dem Beispiel 11 ;
Fig. 2D das Reaktionsschema der Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure gemäß dem Stand der Technik, insbesondere gemäß der Beispiele 12-13;
Fig. 2E das Reaktionsschema der Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES gemäß dem Stand der Technik, insbesondere gemäß dem Beispiel 14;
Fig. 3 ein Chromatogramm des Ergebnisses eines Reaktionsansatzes zur HESylierung eines Spiegelmeres gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere gemäß Beispiel 1;
Fig. 4 ein Chromatogramm des Ergebnisses eines weiteren Reaktionsansatzes zur HESylierung eines Spiegelmeres gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere gemäß Beispiel 1; und
Fig. 5 ein Diagramm der durch HESyliertes Spiegeimer bzw. nicht-HESyliertes Spiegeimer bedingten Hemmung von Ghrelin-induzierter Calcium2+-Freisetzung.
Beispiel 1 : Herstellen eines Konjugates aus einem Spiegeimer und Hydroxyethylstärke
Eingesetztes HESylat
Es wurde HES 10/0.4 mit den molekularen Parametern Mw 11092 D, MS 0,4 und C2/C6 >8, welches am reduzierenden Kettenende zur Carbonsäure oxidiert war, verwendet. Eine Beschreibung der Herstellung der HES-Säure ist beispielsweise in der Deutschen Patentanmeldung DE 196 28 705 offenbart. Herstellen des NHS-Esters
Der N-Hydroxy-Succinimid-Ester des HESylats wurde wie folgt hergestellt:
0,2 g (0,05 mMoi) wasserfreie HES-Säure 10/0.4 werden in 1 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und mit einer äquimolaren Menge an N,N'-Disuccinimidylcarbonat (12,8 mg) 1,5 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt.
Herstellung des Spiegelmer-HESylates
5 mg (entsprechend 1,3 μmol) 5'-Aminohexyl funktionalisiertes RNA-Spiegelmer gemäß_Seq. ID. Nr.l werden in 0,7 ml einer 0,3 molaren Dicarbonatlösung mit einem pH von 8,4 gelöst. Zu dieser Lösung wird der aktive Ester, hergestellt wie vorstehend beschrieben, direkt hinzugegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden umgesetzt.
Das RNA-Spiegelmer weist die folgende Sequenz auf:
5'-Aminohexyl-UGAGUGACUGAC-3' (SEQ. ID. NO. 1)
Analyse des solchermaßen hergestellten Konjugates
Der Nachweis des Konjugates erfolgt durch Niederdruck-GPC. Die dabei verwendeten Analysebedingungen waren die folgenden, wobei das Analysenergebnis in Fig. 3 dargestellt ist:
Säule: Superose 12 HR 10/30, 300 mm x 10 mm i.D. (Pharmacia, Art.-Nr. 17-0538-01 )
Laufmittel: Phosphatpuffer pH 7,0 (27,38 mM Na2HPO4, 12,62 mM NaH2PO4, 0,2 M NaCl, 0,005% NaN3 in Milli-Q Wasser)
Flussrate: 0,4 ml/min
Detektion: UV 280 um Laufzeit: 70 min
Injektionsvolumen: 20 μl Originalansatz
Bei dem Reaktionsansatz ergab sich eine Ausbeute von 62% (bei Lotfällung bezüglich des Chromatogramms) bzw. 77% bei tailingpeak-Auswertung.
Die vorstehende Reaktion wurde mit einer weiteren Form von Hydroxyethylstärke (50/0.7) durchgeführt, welche die folgenden molekularen Parameter aufwies: Mw: 54110 D, MS: 0,7 und C2/C6: ~5.
Bei ansonsten identischer Reaktionsführung wurde eine Ausbeute von 53% erhalten. Das entsprechende GPC-Chromatogramm des Reaktionsproduktes ist in Fig. 4 dargestellt.
Beispiel 2: Erhöhung der Ausbeute des Konjugates
Unter Zugrundelegung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise wurde das Verhältnis von portionsweise zugegebenem aktivierten Aldonsäure-Ester zu Test-RNA-Spiegelmer auf 2:1 bzw. 3:1 erhöht. Dabei wurde im Falle der Verdoppelung des Verhältnisses eine Ausbeute von mehr als 95% und bei Verdreifachung des Überschusses des aktivierten Aldonsäure-Esters eine nahezu quantitative Ausbeute (> 98 bis 99%) erhalten.
Beispiel 3: Vergleich der Hemmung der Ghrelin-induzierten Calciumfreisetzung durch Ghrelin-bindende HESylierte und nicht-HESylierte Spiegelmere.
Stabil transfizierte CHO-Zellen, die den humanen Rezeptor für Ghrelin (GHS-Rla) exprimieren (bezogen von Euroscreen, Gosselies, Belgien) werden in einer Zahl von 5 - 7 x 104 pro well einer schwarzen 96 well-Mikrotiterplatte mit klarem Boden (Greiner) ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO2 in UltraCHO Medium (Cambrex), das zusätzlich 100 units/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 400 μg/ml Geneticin und 2,5 μg/ml Fungizone enthält, kultiviert. Nicht-HESylierte sowie gemäß Beispiel 1 hergestellte 5 '-HESylierte Formen des Ghrelin- bindenden Spiegeimers mit der internen Bezeichnung SOT-Bl 1 gemäß SEQ. ID Nr. 2 werden zusammen mit humanem oder Ratten-Ghrelin (Bachern) in UltraCHO Medium, dem 5 mM
Probeneeid und 20 mM HEPES zugesetzt wurde (CHO-U+), 1 5 - 60 min bei RT oder 37°C in einer 0,2 ml "low profile 96-tube"-Platte inkubiert. Diese Stimulationlösungen werden als zehnfach konzentrierte Lösungen in CHO-U+ angesetzt.
Sequenz von SOT-Bl1: 5'- CGU GUG AGG CAA UAA AAC UUA AGU CCG AAG GUA ACC AAU CCUACA CG -3' (Seq. ID. Nr.2)
Vor der Beladung mit dem Calcium-Indikatorfarbstoff Fluo-4 werden die Zellen 1 x mit je 200 μl CHO-U+ gewaschen. Dann werden 50 μl der Indikatorfarbstofflösung (10 μM Fluo-4 (Molecular Probes), 0.08% Pluronic 127 (Molecular Probes) in CHO-U+ zugegeben und 60 min bei 37°C inlcubiert. Danach werden die Zellen 3 x mit je 180 μl CHO-U+ gewaschen. Pro well werden dann 90 μl CHO-U+ zugegeben.
Die Messung der Fluoreszenzsignale erfolgt bei einer Anregungungswellenlänge von 485 um und einer Emissionswellenlänge von 520 nm in einem Fkuostar Optima Multidetektions- Plattenlesegerät (BMG).
Zur genauen Analyse des Zeitverlaufs der durch Ghrelin hervorgerufenen Änderungen der Calcium-Konzentrationen werden die Stimulationlösungen zu den Zellen hinzugefügt. Für die parallele Messung mehrerer Proben werden jeweils die wells einer senkrechten Reihe einer 96 well Platte gemeinsam vermessen. Dazu werden zunächst irn Abstand von 4 Sekunden drei Messwerte zur Feststellung der Basislinie registriert. Dann wird die Messung unterbrochen, die Platte aus dem Lesegerät ausgefahren und mit einer Mehrkanalpipette 10 μl der Stimulationslösung aus der "low profile 96-tube"-Platte, in der die Vorinkubation durchgeführt wurde, zu den wells der zu messenden Reihe zugegeben. Darm wird die Platte wieder in das Gerät eingefahren und die Messung fortgesetzt (insgesamt 20 Messungen mit je 4 Sekunden Abstand).
Aus den erhaltenen Messkurven wird für jedes einzelne well die Differenz zwischen maximalem Fluoreszenzsignal und Fluoreszenzsignal vor der Stimulation bestimmt und gegen die Konzentration an Ghrelin bzw., bei Versuchen zur Hemmung der Calcium-Freisetzung mit
Spiegelmeren, gegen die Konzentration an Spiegeimer aufgetragen.
Um die Wirksamkeit der HESylierten Spiegelmere zu zeigen, wurden Ghrelinrezeptor- exprimierende Zellen mit 5 nM Ghrelin, oder Ghrelin, das zusammen mit verschiedenen Mengen HESyliertem bzw. nicht-HESyliertem Spiegeimer vorinkubiert worden war, stimuliert. Die gemessenen Fluoreszenzsignale wurden auf die Signale, die ohne Spiegeimer erhalten wurden, normiert. Das HESylierte Spiegeimer hemmt die Ghrelin-induzierte Ca++-Freisetzung mit einer IC5Ö von ca. 6,5 nM wohingegen das nicht-HESylierte Spiegeimer mit einer IC50 von ca. 5 nM hemmt. Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt.
Beispiel 4: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
0,25 g HES 10/0,4 - Aldonsäure (62,5 μmol) werden unter Rühren in 10 mL Wasser gelöst. Zu der Lösung werden 9,95 mg (2,5 μmol) RNA-Spiegelmer gemäß SEQ. ID. Nr. 1 bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend werden unter Rühren 50 mg N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyh-carbodiimid Hydrochlorid (261 μmol), gelöst in 1 mL Wasser, portionsweise über 2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Durch Zugabe von Salzsäure oder Natronlauge wird ein pH- Wert von 5 konstant gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wird der Ansatz noch 2 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Die Überprüfung des Reaktionsansatzes über Niederdruck-GPC ergab einen Reaktionsumsatz des eingesetzten Spiegeimers von weniger als 1%.
Beispiel 5: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
Zu einer Mischung von HES 10/0.4 - Aldonsäure und RNA-Spiegelmer gemäß Seq. ID. Nr.l, werden 150 mg EDC analog dem Beispiel 4 über 3 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren zugegeben. Es konnte über analytische Niederdruck-GPC kein Reaktionsumsatz festgestellt werden. Beispiel 6: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid xmd HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
1,0 g HES 10/0,4 - Aldonsäure (240 μmol) werden unter Rühren in 1O mL Wasser in der Wärme gelöst. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden dem Ansatz 10 mg des RNA- Spiegelmers gemäß Seq. FD. Nr. 1 zugegeben. Anschließend werden unter Rühren 50 mg EDC (260 μmol), gelöst in 1 mL Wasser, über 2 Stunden bei Raumtemperatur portionsweise zugegeben, wobei mit Salzsäure oder Natronlauge der pH- Wert bei 5 konstant gehalten wird.
Nach weiteren 2 Stunden Reaktionszeit wird der Ansatz mittels Niederdruck-GPC analysiert. Es konnte kein Reaktionsprodukt nachgewiesen werden.
Beispiel 7: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid xmd HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
Der Ansatz nach Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei in diesem Falle 100 mg EDC über 3 Stunden zugegeben wurden.
Nach Beendigung der Reaktion konnte kein Reaktionsprodukt nachgewiesen werden.
Beispiel 8: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid xmd HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
Die Beispiele 6 und 7 wurden wiederholt bei pH- Werten von 4,0 und 6,0.
Es konnte in beiden Reaktionsansätzen mittels Niederdruck-GPC kein Reaktionsprodukt nachgewiesen werden. Beispiel 9: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
Das Beispiel 4 wurde bei Reaktionstemperaturen von 4°C und 37°C wiederholt.
In beiden Fällen wurde kein Reaktionsprodukt nachgewiesen.
Beispiel 10: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
In 10 mL trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) werden 303,7 mg (2,6 mmol) Succinimid und
0,502 g HES 10/0,4 - Aldonsäure (0,125 mmol) bei Raumtemperatur gelöst.
Danach werden 50 mg EDC (0,25 mmol) zugegeben und der Ansatz über Nacht gerührt.
Jeweils 5 mg (entsprechend 1,3 μmol) RNA-Spiegelmer gemäß Seq. JJD. Nr. 1 werden in 10 mL Wasser gelöst und der pH- Wert auf 8,5 mit Natronlauge eingestellt bzw. in 10 mL 0,3 molarem Bicarbonat-Puffer von pH 8,4 gelöst.
Zu den beiden Teilansätzen werden jeweils 5 mL der oben genannten Dimethylsulfoxid-Lösung zugegeben, wobei der pH- Wert der wässrigen Lösung des ersten Teilansatzes durch die Zugabe von Natronlauge bei pH 8,5 konstant gehalten wird.
Die Ansätze wurden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die analytische Niederdruck-GPC ergab in beiden Teilansätzen kein Reaktionsprodukt.
Beispiel 11: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
In 10 mL trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) werden 300 mg (2,6 mmol) Succinimid gelöst und 0,5 g (0,125 mmol) bei 80°C über Nacht zur Bildung des entsprechenden Lactons getrocknete HES 10/0,4 - Aldonsäure zugefügt. Der Ansatz reagiert über Nacht bei 70°C. Die Lösung wird anschließend bei Raumtemperatur zu 5 mL einer Lösung von 5 mg RNA- Spiegelmer gemäß Seq. ID. Nr.l in 10 mL 0,3 molaren Bicarbonatpuffer des pH 8,4 gegeben und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Es wurde mittels analytischer Niederdruck- GPC kein Reaktionsprodukt gefunden.
Beispiel 12: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
5,0 g HES 10/0,4 - Aldonsäure (1,2 mmol) werden in 30 mL trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst. Zu der Lösung werden 195 mg (1,2 mmol) Carbonyldiimidazol (CDI) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
5 mg RNA-Spiegelmer gemäß Seq. ID. Nr. 1 werden in 5 mL Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden 10 mL der oben genannten Lösung der Imidazolyl-HES-Aldonsäure 10/0,4 gegeben und der pH- Wert auf 7,5 mit Natronlauge eingestellt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde der Ansatz mittels Niederdruck-GPC auf Reaktionsprodukt untersucht. Es wurden nur Spuren von Reaktionsprodukt festgestellt.
Beispiel 13: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES-Aldonsäure unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik
5 mg RNA-Spiegelmer gemäß Seq. ID. Nr. 1 werden in 12,5 mL 0,3 M Bicarbonatpuffer des pH 8,4 gelöst. Der Ansatz wurde mit Eiswasser auf 0°C gekühlt und mit 8,5 mL der in Beispiel 12 aufgeführten Lösung von HES 10/0,4 - Aldonsäure-Imidazolyl in DMF versetzt. Nach 2 Stunden bei 0°C und weiteren 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde der Ansatz auf Reaktionsprodukt untersucht. Es konnte kein Produkt detektiert werden.
Beispiel 14: Herstellung von Konjugaten aus einem Polynukleotid und HES unter Anwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik 1 g HES 10/0,4 (0,25 mmol) werden in 5 mL H2O in der Wärme gelöst. Zu der Lösung werden nach Abkühlen 10 mg (entsprechend 2,5 μmol) RNA-Spiegelmer gemäß Seq. ID. Nr. 1 zugegeben und der pH- Wert mit Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Danach werden 200 μl Boran- Pyridin-Komplex (Sigma-Aldrich) zugegeben und der Ansatz bei Raumtemperatur im Dunkeln 10 Tage gerührt. Danach wird der Ansatz auf eventuelle Reaktionsprodukte durch Niederdruck- GPC untersucht. Es konnte nur ein Umsatz < 3% bezogen auf das eingesetzte Spiegeimer festgestellt werden.
Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausfuhrungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugates aus einem Polynukleotid und einem Polysaccharid umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Aldonsäure des Polysaccharides oder eines Derivates davon; b) Umsetzen der Aldonsäure mit einem Alkohol-Derivat, bevorzugterweise einem Carbonat-Derivat eines Alkohols, zu einem Aldonsäure-Ester, bevorzugterweise zu einem aktivierten Aldonsäure-Ester; und c) Umsetzen des Aldonsäure-Esters mit dem Polynukleotid, wobei das Polynukleotid eine funktionale Amino-Gruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen der Aldonsäure mit dem Alkohol-Derivat in Schritt b) in einem trockenen aprotischen polaren Lösungsmittel erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Grappe, die Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und Dimethylacetamid umfasst.
3. Verfahren nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldonsäure-Ester gereinigt wird und danach in Schritt c) verwendet wird.
4. Verfahren nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsansatz aus Schritt b) mit dem Aldonsäure-Ester direkt in Schritt c) eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) bei einem pH- Wertbereich von 7 bis 9, bevorzugterweise 7,5 bis 9 und bevorzugtererweise 8,0 bis 8,8 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) bei einem pH- Wert von etwa 8,4 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis von Aldonsäure zu Alkohol-Derivat etwa 0,9 bis 1,1, bevorzugterweise etwa 1 beträgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Grappe, die N-Hydroxy-Succinimid, sulfoniertes N-Hydroxy- Succinimid, Phenolderivate und N-Hydroxy-Benzotriazol umfasst.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Grappe, die Dextran, Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und verzweigte Stärkefraktionen umfasst.
10. Verfahren nach Ansprach 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid Hydroxyethylstärke ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyethylstärke ein gewichtsgemitteltes mittleres Molekulargewicht von etwa 3.000 bis 100.000 Dalton, bevorzugterweise von etwa 5.000 bis 60.000 aufweist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyethylstärke ein Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichtes von etwa 2.000 bis 50.000 Dalton aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyethylstärke ein Verhältnis von gewichtsgemitteltem Molekulargewicht zu Zahlenmittel des mittleren Molekulargewichts von etwa 1,05 bis 1,20 aufweist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyethylstärke eine molare Substitution von 0,1 bis 0,8, bevorzugterweise von 0,4 bis 0,7 aufweist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyethylstärke ein Substitutionsmuster ausgedrückt als das C2/C6-Verhältnis von etwa 2 bis 12, bevorzugterweise von etwa 3 bis 10 aufweist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid eine funktionelle Nukleinsäure ist.
17. Verfahren nach Ansprach 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Nukleinsäure ein Aptamer oder ein Spiegeimer ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid ein Molekulargewicht von 300 bis 50,000 Da, bevorzugterweise 4,000 bis 25,000 Da und bevorzugtererweise 7,000 bis 16,000 Da aufweist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Aminogruppe eine primäre oder sekundäre Aminogruppe ist, bevorzugterweise eine primäre Aminogruppe ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Aminogruppe an ein terminales Phosphat des Polynukleotids gebunden ist.
21. Verfahren nach Ansprach 20, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Aminogruppe über einen Linker an die Phosphatgruppe gebunden ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Aminogruppe eine 5-Aminohexylgrappe ist.
23. Konjugat aus einem Polysaccharid und einem Polynukleotid, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22.
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