DE102014016901B4 - Verfahren zur Herstellung für neue Dextranderivate als Wirkstoffträgersystem und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Dextranaminosäureester der allgemeinen Formel I:wobeiR unabhängig voneinander H und mindestens eine Aminosäure mit wenigstens einer Aminogruppe, die nicht α-ständig zur Carboxylgruppe der Aminosäure steht, sein kann, gekennzeichnet durch die Synthese gemäß Schema IIIwobei die Aminogruppen mit Di-tert-butyldicarbonat geschützt werden, die Aktivierung der geschützten Aminosäure durch 1,1' -Carbonyldiimidazol mit anschließender Veresterung mit Dextran erfolgt und die Entschützung in Gegenwart von Säure, insbesondere 10 % v/v Schwefelsäure, in Dioxan durchgeführt wird.

Description

• Verfahren zur Herstellung für neue Dextranderivate als Wirkstoffträgersystem und deren Verwendung
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung für neue Dextranderivate als Vektoren (Wirkstoffträger) zur zellulären Einschleusung von Wirkstoffen, beispielsweise Nukleinsäuren, in Zellen (Transfektion) und deren Verwendung.
• Therapeutische Ansätze nutzen das Einbringen von Nukleinsäure-Derivaten, wie DNA oder RNA, in die Körperzellen eines Individuums, um beispielsweise eine Krankheit zu behandeln, als Diagnostikum zu fungieren oder der Prophylaxe zu dienen und werden vor allem als neue therapeutische Ansätze mit sehr hohem Potential gesehen. Der Begriff Nukleinsäure-Derivate umfasst dabei einzel- und doppelsträngige sowie chimäre einzel-und doppelsträngige Mono-, Oligo- und Polynukleotide aus DNA (z.B. Plasmide, Decoys, Aptamere, Spiegelmere, CpG) und RNA (z.B. siRNA, mRNA, microRNA, shRNA, asRNA, circRNA, hnRNA, snoRNA, snRNA, tRNA, Riboswitches, tRNA, Ribozyme) einschließlich ihrer Modifikationen.
• Der Transfer von Nukleinsäure-Derivaten kann sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen, wobei in allen Fällen Vektoren nötig sind, um den effizienten und sicheren Transfer des transportierten Materials durch die Zellmembran ins Innere der Zelle und anschließend Targets, z. B. im Zytoplasma, in den Organellen, wie beispielsweise den Zellkern, zu erreichen. Nach dem Transfer von Nukleinsäuren in die Zellen kann durch Expression des eingebrachten Gens ein fehlendes oder defektes Protein produziert werden (sog. gene therapy). Außerdem kann die Expression eines unerwünschten oder krankmachenden Gens unterdrückt und somit die Produktion eines insbesondere unerwünschten oder krankmachenden Proteins gehemmt werden. Es lassen sich damit auch unter anderem in vitro therapeutische Proteine gewinnen oder die Produktion z. B. von krankheitsverursachenden Proteinen unterdrücken (F. Schlenk et al.: Recent developments and perspectives on gene therapy using synthetic vectors in Therapeutic Delivery, Vol. 4, 2013, 95-113).
• Weiterhin dienen Nukleinsäuren zur Diagnostik von Gensequenzen z. B. im Rahmen der DNA Chip Technologie. Dabei werden bestimmte Gensequenzen z.B. für eine genetische Erkrankung durch komplementäre, auf einem Chip aufgebrachte, DNA-Sequenzen detektiert. Die Technik ist allerdings nicht auf die reine Detektion genetischer Krankheiten beschränkt, sondern findet auch Anwendung in Grundlagenforschung, im Bereich der mikrobiologischen Diagnostik und der Krebsdiagnostik, Genotypisierung, Genexpression, Pharmakogenomik und Umweltanalytik (beispielweise M. Cuzin: DNA chips: a new tool for genetic analysis and diagnostics, Transfusion Clinique et Biologique 2001, Vol. 8, 291-296).
• Auch die Polymerase-Kettenreaktion ist ein probates Mittel zur Diagnose von Krankheiten und Mutagenesen. Hierbei werden zielgerichtet (fehlerhafte) DNA Sequenzen amplifiziert und anschließend sequenziert (P.A. Wright and D. Wynford-Thomas: The polymerase chain reaction: miracle or mirage? A critical review of its uses and limitations in diagnosis and research, J. Pathol. 162, 1990, 99-117; D.V. Zaletaev et al.: Diagnostics of Epigenetic Alterations in Hereditary and Oncological Disorders in Mol. Biol., Vol. 38, 2004, 174-182). Nach Diagnose einer genetischen Erkrankung wäre dann die Therapie selbiger mit den vorgenannten Verfahren möglich.
• Das in vitro-Verfahren und die in vivo-Therapie mit Nukleinsäure-Derivaten benötigen unabdingbar einen Vektor, um das Einbringen der Nukleinsäure-Derivate in die Zielzellen zu gewährleisten, da diese aufgrund verschiedener Instabilitäten nicht alleine zur Transfektion geeignet sind (F. Schlenk et al.: Recent developments and perspectives on gene therapy using synthetic vectors in Therapeutic Delivery, Vol. 4, 2013, 95-113). Die Anwendung von Vektoren zum Einbringen von Nukleinsäure-Derivaten in Zellen bietet somit eine Möglichkeit, bisher nicht behandelbare Krankheiten zu heilen und Symptome zu lindern. Daneben können solche Therapiemaßnahmen zur Prophylaxe oder zur Diagnostik eingesetzt werden. Es ist daher von herausragender Bedeutung, Vektoren zu finden, die sich sowohl durch hohe Transfektionsraten als auch durch eine hohe Biokompatibilität und geringe Toxizität auszeichnen. Der Begriff Toxizität umfasst alle unerwünschten Effekte eines Materials auf seine biologische Umgebung. Der Begriff Biokompatibilität umfasst die Effekte der Toxizität sowie zusätzlich die unerwünschten und erwünschten Effekte der biologischen Umgebung auf das Material (R. Duncan and L. Izzo: Dendrimer biocompatibility and toxicity in Adv. Drug Delivery Rev., Vol. 57, 2005, 2215-2237).
• Bekannt sind virale und nicht-virale Vektoren. Obwohl virale Vektoren, wie u.a. Retroviren (A.D. Miller: Human gene therapy comes of age in Nature, Vol. 357, 1992, 455-460) oder Adenoviren (R.C. Mulligan: The basic science of gene therapy in Science, Vol. 260, 1993, 926-932) in vitro sehr erfolgversprechende Ergebnisse lieferten, ist ihre insbesondere wiederholte Anwendung in vivo vor allem aufgrund inflammatorischer und immunogener Eigenschaften sowie der Gefahr der Mutagenese und Integration ins zelleigene Genom und der limitierten Aufnahme von Nukleinsäure-Derivaten bisher eingeschränkt. Es wurden lediglich als virale vektorhaltige Fertigarzneimittel 2003 Gendicine® und 2004 Oncorine® in China zugelassen und auf dem Markt eingeführt. 2012 erfolgte für Glybera® die erste Zulassung auf dem europäischen Markt durch die Europäische Kommission, für die USA ist die Zulassung beantragt. (http://www.uniqure.com/products/glybera. abgerufen am 11.06.2014).
• Eine breite klinische Anwendung nicht-viraler Vektoren erfolgt allerdings bislang noch nicht. Die Ursachen sind vor allem auch die geringe Effizienz des Gentransfers und die begrenzte Expression der genetischen Information (M. Cotten et al.: Receptor-mediated transport of DNA into eukaryotic cells in Methods Enzymol, Vol. 217, 1993, 618-644) sowie die mangelnde Biokompatibilität (beispielsweise S. Choksakulnimitr et al.: In vitro cytotoxicity of macromolecules in different cell culture systems in J. Controlled Release, Vol. 34, 1995, 233-241) und biologische Risiken der verwendeten Trägermaterialien (Vektoren) sowie wenig kontrollierbare Variationsmöglichkeiten ihrer Struktur.
• Nichtvirale Vektoren können neben Lipiden synthetische Polymere oder natürliche Polymere, Kombinationen aus synthetischen und natürlichen Polymeren sowie ihre Derivate sein, die Polykationen sind oder dahingehend modifiziert werden können. Meist liegen Aminogruppen vor, die sich durch Protonierung in die korrespondierende positiv geladene Ammoniumstruktur überführen lassen, was die Grundlage für die Wechselwirkung mit den polyanionischen Nukleinsäure-Derivaten ist und demzufolge die Bildung sogenannter Polyplexe oder Komplexe ermöglicht. Der Begriff Komplex umfasst Nanostrukturen, die durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen anionischen Nukleinsäure-Derivaten und kationischen Polymeren entstehen. Der Begriff Polyplex im engeren Sinne wird verwendet, wenn es sich bei der kationischen Komponente um ein natürliches oder synthetisches Polymer oder eine Kombination beider handelt. Synthetische Vektoren können beispielsweise auf wasserlöslichen, kationischen Polymeren wie Poly-L-Lysin (PLL) (G.Y. Wu and C.H. Wu: Delivery systems for gene therapy in Biotherapy, Vol. 3, 1991, 87-95), Oligo- und Polyethyleniminen, kationischen linearen Methacrylsäure-Derivaten (M.A. Wolfert et al.: Characterization of vectors for gene therapy formed by self-assembly of DNA with synthetic block co-polymers in Hum Gene Ther, Vol. 7, 1996, 2123-2133) oder auch Dendrimeren wie Polyamidoamidin (PAMAM), das aus Methacrylat und Ethylendiamin gewonnen wird (J. Haensler and F.C.J. Szoka: Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture in Bioconjug Chem, Vol. 4, 1993, 372-379), sowie auf kationischen Lipiden (X. Gao and L. Huang: Cationic liposomemediated gene transfer in Gene Ther, Vol. 2, 1995, 710-722) für die sogenannte „Lipofektion“ und Amphiphilen, Moleküle die sowohl geladene Aminogruppen als auch langkettige, unpolare Alkylreste tragen, wie (Dioleoyloxypropyl)-trimethylammoniumbromide (DOTMA) (J.P. Behr: Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: prospects for gene therapy in Bioconjug Chem, Vol 5, 1994, 382-389), basieren.
• Die vorgenannt aufgeführten Beispiele stellen verschiedene Ansätze zur Gewinnung von Vektoren zur Transfektion dar. Zahlreiche Nachteile der synthetischen Vektoren sind die oftmals fehlende Bioabbaubarkeit und damit fehlende Ausscheidung, hohe Toxizität und geringe Biokompatibilität. Hämolyse, Erythrozytenaggregation, membranschädigende, nekrotische und apoptotische Effekte, Aktivierung des Immun- und des Komplementsystems sowie entzündliche Reaktionen wurden unter anderem von Parhamifar beschrieben (L. Parhamifar: Polycation cytotoxicity: a delicate matter for nucleic acid therapy-focus on polyethylenimine in Soft Matter, Vol. 6, 2010, 4001-4009).
• Durch Verwendung bzw. Modifikation von natürlichen Polymeren wie Polysacchariden besteht die Möglichkeit, die zellschädigenden Nebenwirkungen zu vermeiden. Ein verwendetes Polysaccharid ist Dextran, das im Gegensatz zu Chitosan (J.P. Behr: Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: prospects for gene therapy in Bioconjug Chem,Vol. 5, 1994, 382-389), einem natürlichen polykationischen Polysaccharid, erst durch chemische Modifikation seinen polykationischen Charakter erhält.
• Dextran ist ein hydrophiles Polysaccharid, bestehend aus α-D-Glucose-Einheiten, welches am Menschen als hervorragend verträgliches Blutplasma-Ersatzmittel eingesetzt wird. Als gut verträgliches, bioabbaubares und gut ausscheidbares Polymer (E.L. Rosenfeld and I.S. Lukomskaya: The splitting of dextran and isomaltose by animal tissues in Clin Chim Acta, Vol. 2, 1957, 105-114; T.W. Sery and E.J. Hehre: Degradation of dextrans by enzymes of intestinal bacteria in J. Bacteriol., Vol. 71, 1956, 373-380) wurden bereits 1967 erste Modifikationen von Dextran für den Transport von DNA beschrieben (J.S. Pagano et al.: Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran in J Virol, Vol. 1, 1967, 891-897).
• Auch bezüglich der Immunogenität erweist sich Dextran als vorteilhaft. So ist eine Aktivierung des Komplementsystems erst ab einem Molekulargewicht von > 60.000 Da beschrieben (C. Passirani: Complement Activation by Injectable Colloidal Drug Carriers in Biomaterials for Delivery and Targeting of Proteins and Nucleic Acids, Vol. 1(6), 2005, 187-230). Zusätzlich reduziert Dextran die Immunogenität konjugierter Proteine z. B. von Antikörpern (R. Fagnani et al.: Reduction of immunogenicity by covalent modification of murine and rabbit immunoglobulins with oxidized dextrans of low molecular weight in Cancer Res, Vol. 50, 1990, 3638-3645).
• In der Literatur beschriebene Modifikationen zeigen eine schwache Transfektion bei niedriger Toxizität oder eine gute Transfektion bei hoher Toxizität. Im Folgenden soll auf diese Modifikationen eingegangen werden.
• Jianhai Yang et al. modifizierten Dextrane mit Agmantin, dem Decarboxylierungsprodukt der Aminosäure Arginin, und Fettsäuren (J. Yang et al.: The biocompatibility of fatty acid modified dextran-agmatine bioconjugate gene delivery vector in Biomaterials, Vol. 33, 2012, 604-613). Diese Modifikation führte zu einer sehr guten Viabilität des Vektors über 24 h in Konzentrationen bis zu 2 mg/l. Die Transfektion nach 24 h Behandlung war allerdings mit der 100fachen Verbesserung gegenüber reiner DNA sehr niedrig. Im Unterschied dazu erreichte man mit Dextranen, die mit Poly(2-dimethylamino)ethyl methacrylat (P(DMAEMA))-Seitenketten modifiziert worden sind, zwar Transfektionswerte von 10⁴ bis 10⁵ RLU/µg Protein. Allerdings sind diese Dextranderivate bereits ab einer Konzentration von unter 50 µg/ml toxisch (Z.H. Wang et al.: Functionalized Nonionic Dextran Backbones by Atom Transfer Radical Polymerization for Efficient Gene Delivery in Macromolecules, Vol. 44, 2011, 230-239).
• Dextrane, die mit verzweigtem Polyethylenimin (PEI) mit einer Molmasse von 800 g/mol und Hexamethylendiisocyanat als Linkergruppe modifiziert wurden, zeigen ebenfalls den Nachteil einer geringen Zellviabilität bei unter 50 µg/ml (Y.X. Sun et al.: Synthesis of (dex-HMDI)-g-PEIs as effective and low cytotoxic nonviral gene vectors in Journal of Controlled Release, Vol. 128, 2008, 171-178). Bei der Untersuchung verschiedener Linkerstrategien von PEI an Dextran konnten Ochrimenko et al. zwar keine Toxizität der verwendeten Polyplexe feststellen, allerdings zeigte sich die Toxizität der reinen Polymere getestet an Erythrozyten durch Aggregation bereits bei 6,25 µg/ml (S. Ochrimenko, et al.: Dextran-graft-linear poly(ethylene imine)s for gene delivery: Importance of the linking strategy in Carbohydrate Polymer, Vol. 113, 2014, 597-606). Weitere Modifikationen mit PEI zeigen wie bei allen beschriebenen Produkten, dass hohe Transfektionswerte mit hoher Toxizität korrelieren, was der Interaktion der positiven Ladung der Vektoren mit den negativ geladenen Zellmembranen oder Proteinen zugeschrieben wird. Zudem sind die synthetischen PEIs nicht bioabbaubar. Andererseits findet man bei Verbesserung der Viabilität verringerte Transfektionswerte (F. Schlenk et al.: Recent developments and perspectives on gene therapy using synthetic vectors in Ther Deliv, Vol. 4, 2013, 95-113; Z.H. Wang et al.: Functionalized Nonionic Dextran Backbones by Atom Transfer Radical Polymerization for Efficient Gene Delivery in Macromolecules, Vol. 44, 2011, 230-239; Y.X. Sun et al.: Synthesis of (dex-HMDI)-g-PEIs as effective and low cytotoxic nonviral gene vectors in Journal of Controlled Release, Vol. 128, 2008, 171-178; M. Chu et al.: Biocompatible polyethylenimine-graft-dextran catiomer for highly efficient gene delivery assisted by a nuclear targeting ligand in Polymer Chemistry, Vol. 4, 2013, 2528-2539; Y.X. Sun et al.: The influence of RGD addition on the gene transfer characteristics of disulfide-containing polyethyleneimine/DNA complexes in Biomaterials, Vol. 29, 2008, 4356-4365; Y.X. Sun et al.: A low-toxic and efficient gene vector: Carboxymethyl dextran-graft-polyethylenimine in Journal of Biomedical Materials Research Part A, Vol. 84A, 2008, 1102-1110; W.C. Tseng et al.: Dependence of transgene expression and the relative buffering capacity of dextran-grafted polyethylenimine in Molecular Pharmaceutics, Vol. 2, 2005, 224-232; W.C. Tseng and C.-M. Jong: Improved stability of polycationic vector by dextran-grafted branched polyethylenimine in Biomacromolecules, Vol. 4, 2003, 1277-1284; W.C. Tseng et al.: The role of dextran conjugation in transfection mediated by dextran-grafted polyethylenimine in Journal of Gene Medicine, Vol. 6, 2004, 895-905; D. Jiang and A.K. Salem: Optimized dextranpolyethylenimine conjugates are efficient non-viral vectors with reduced cytotoxicity when used in serum containing environments in International Journal of Pharmaceutics, Vol. 427, 2012, 71-79).
• Die Modifikation von Dextranen mit Aminosäuren ist eine Möglichkeit, polykationische Dextrane zu erhalten. In der WO 96/21036 A2 werden Dextrane mit einer Molmasse zwischen 1000 g/mol und 90000 g/mol der nicht vollständigen selektiven Oxidation mit NaIO₄ unterzogen und die gebildeten Aldehydgruppen mit Poly-L-Lysin umgesetzt. Die Synthese hat den Nachteil, dass das Produkt in einem weiteren Schritt mit NaBH₄ umgesetzt werden muss, um Vernetzung und damit Unwirksamkeit als Vektor zu verhindern. Weitere Oligo- und Polyamine wie Spermin, Spermidin oder andere poly-L-Aminosäuren wurden ebenfalls auf diese Art umgesetzt. Die entstandenen Produkte zeichnen sich durch niedrige Immunogenität und durch hohe Biokompatibilität aus. Die Transfektionsleistung liegt aber teilweise bei nur 10 % von Poly-L-Lysin, welches bekanntermaßen aufgrund der fehlenden Freisetzung der Komplexe nach Aufnahme in das Endosom ins Zytoplasma nicht aktiv ist (M. Cotten, et al.: Transferrin Polycation-Mediated Introduction of DNA into Human Leukemic-Cells - Stimulation by Agents That Affect the Survival of Transfected DNA or Modulate Transferrin Receptor Levels in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 87, 1990, 4033-4037).
• In US 2012 / 0 041 079 A1 wird auf eine Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen für den Wirkstofftransport und damit als möglicher Vektor zum Nukleinsäure-Transport von mit hydrophoben Aminosäuren modifizierten Dextranen hingewiesen. Diese Aminosäuren können beispielsweise Tryptophan, Phenylalanin oder Valin sein. Die Aminosäuren sind nicht direkt, sondern über Spacer an das Polymerrückgrat gebunden. Diese Spacer sind Mono- oder Dicarbonsäuren unterschiedlicher Alkylkettenlängen, die noch eine weitere funktionale Gruppe zur Bindung an das Dextranrückgrat enthalten. Die Aminosäuren werden an die Carboxylgruppe des Spacers über eine Amidbindung mit der α-Aminogruppe gebunden. Der zweite Schritt verläuft nicht vollständig. In der Folge entstehen Produkte, die zwei Arten von Substituenten tragen, den Spacer-Aminosäure-Substituenten und den nicht abreagierten Spacer, wobei der Spacer keine zum Wirkstofftransport notwendige Eigenschaft in das Polymer einbringt. Im Sinne einer effizienten Reaktionsführung ist das nachteilig. Die resultierenden Produkte sind zwar biokompatibel. Allerdings wird ihre Funktionalität im Wirkstofftransport nicht belegt.
• Die in DE 41 36 324 A1 beschriebenen Dextranderivate sollen mit den niedermolekularen Gallensäuren (im Gegensatz zu den bei uns zu verwendenden polymeren DNS oder oligomerer Ribonukleinsäuren) Komplexe bilden und diese so im Verdauungstrakt zur Verfügung stellen. Die gemäß DE 41 36 324 A1 synthetisierten Polymere haben ausschließlich die Funktion des Transports und der reversiblen Bindung. Die Verwendung hydrophober Substituenten verhindert, dass die Substanzen in wässrigen Systemen löslich sind.
• Die DE 689 01 924 T2 betrifft Paramagnetismus als Eigenschaft der angemeldeten modifizierten Dextrane gefordert. Dieser soll zur Kontrastverstärkung bei der MRI-Methode in der medizinischen Diagnose genutzt werden. Der Paramagnetismus wird durch die Bindung eines Metalliones in das Polymer eingeführt, dass mit Hilfe eines Chelatbilders gebunden wird. Zur Bindung der daraus resultierenden Metallkomplexe werden aufgrund ihrer Bifunktionalität Aminosäuren (z.B. auch das von uns bevorzugte ß-Alanin) eingesetzt. Dabei wird die Aminosäure als Ester am Polymerrückgrat gebunden und die Aminogruppe zur Bindung des Chelatkomplexes genutzt. Hier wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, das Zwischenprodukt des Dextran-Aminosäure-Esters nicht isoliert und genutzt, sondern in situ weiterverwendet und chemisch verändert. Die Bindung des pharmazeutischen Agens (des Chelatkomplexes) erfolgt mittels sehr stabiler und nichtreversibler kovalenter Bindungen.
• Weitere modifizierte Dextrane werden in US 2012 / 0 283 427 A1 beschrieben. Diese weisen zwei Substituenten auf: „[...] including an ester-linked amine-containing substituent AND an alkyl ester substituent [...]‟.
• Auch in WO 02 / 083 154 A1 werden Dextrane mit Aminosäuren substituiert. Diese sollen durch Wechselwirkung mit dem Gewebe der zu schützenden Organe ein Eindringen und dadurch den Abbau des Medikamentes im Organ in einem bestimmten Umfang verhindern und so die Verweilzeit im Blutstrom zu erhöhen. Damit sind diese Dextrane zum gene delivery unbrauchbar.
• Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Vektoren zur Transfektion von Wirkstoffen in Zellen zu finden, die sich durch hohe Transfektionsrate, geringe Toxizität und hohe Bioverträglichkeit auszeichnen sowie möglichst aufwandgering synthetisierbar sind.
• Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein neues Verfahren zur Herstellung von Dextranderivaten bestehend aus einem Dextranaminosäureester der allgemeinen Formel I:

  

  wobei

R

unabhängig voneinander H und mindestens eine Aminosäure, mit wenigstens einer Aminogruppe, die nicht α-ständig zur Carboxylgruppe der Aminosäure steht, sein kann

und die Synthese gemäß Schema III

wobei die Aminogruppen mit Di-tert-butyldicarbonat geschützt werden, die Aktivierung der geschützten Aminosäure durch 1,1'-Carbonyldiimidazol mit anschließender Veresterung mit Dextran erfolgt und die Entschützung in Gegenwart von Säure, insbesondere 10 % v/v Schwefelsäure, in Dioxan durchgeführt wird.
• Als besonders zweckmäßig haben sich dabei Aminosäuren erwiesen, die der allgemeinen Formel II HO-C(O)-(CH-NH₂)_x-(CH₂)_y-(CH₂)-NH₂ (II) entsprechen, wobei x in Formel II die Werte 0 oder 1 und y beliebige Werte ≥ 0, bevorzugt im Bereich 1 ≤ y ≤ 5 mit x = 0 annehmen können; besonders bevorzugt ist β-Alanin mit x = 0 und y = 1.
• Überraschend wurde gefunden, dass sich diese Dextranaminosäureester, bestehend aus Dextran sowie der besagten und an sich bekannten mindestens einen Aminosäure, als Vektoren (Trägersysteme) mit ebenfalls an sich bekannten Nukleinsäuren einen Komplex bilden, welcher hervorragend geeignet ist, Wirkstoffe in vitro oder in vivo mit hoher Transfektionsrate bei gleichzeitig niedriger Zelltoxizität und hoher Blutverträglichkeit in biologische Zellen zu transportieren, so dass diese eingebrachten Wirkstoffe dort effizient zur Expression oder Nicht-Expression von Genen führen können.
• Mit der Erfindung wird gleichzeitig der bisher anwendungshemmende Widerspruch zwischen Toxizität und mangelnder Transfektion gelöst, in der Art, dass bei hoher Transfektionsrate die Toxizität für die Zellen nunmehr niedrig bleibt (< 30%).
• Das verwendete Dextran kann aus verschiedenen Quellen stammen. Als Quellen bieten sich insbesondere verschiedene Stämme von Leuconostoc als auch von Streptococcus an, was andere Quellen nicht ausschließt. Verwendet werden können sowohl lineare als auch verzweigte Dextrane; die Wirksamkeit der Produkte wird davon nicht berührt. Der Anteil an Verzweigungen variiert je nach Ursprung des Dextrans.
• Ferner können die Produkte sowohl unter heterogenen als auch unter homogenen Bedingungen gewonnen werden. Als Lösungsmittel für die Reaktion eignen sich z. B. DMSO und DMAc. Als besonders geeignet erwies sich die homogene Reaktion von Dextran und der an den Aminogruppen mit einer Schutzgruppe versehenen Aminosäure in DMSO unter Aktivierung mit CDI.
• Zur Synthese der Dextranaminosäureester ist es möglich, Dextrane unterschiedlicher Molmassen einzusetzen. Dabei können die kommerziell erhältlichen Dextrane mit Molmassen von ca. 1.000 g/mol bis 670.000 g/mol eingesetzt werden. Laborprodukte mit anderen Molmassen bis zu 1.500.000 g/mol sind ebenfalls verwendbar. Als besonders geeignet stellte sich ein von Leuconostoc mesenteroides produziertes Dextran mit einer Molmasse von 60.000 g/mol heraus, das weitgehend linear ist. Die resultierenden Ester wurden mittels SEC vermessen.
• Es ergaben sich Molmassen 140.000 g/mol < M_w < 235.000 g/mol. Als Standard diente Pullulan.
• Für die erhaltenen Dextranaminosäureester erweist sich ein durchschnittlicher Substitutionsgrad (DS) im Bereich von 0,5 ≤ DS ≤ 1,7 als besonders vorteilhaft.
• Nachfolgend wird die Wirksamkeit am Beispiel eines β-Alanin-Dextranesters mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad von 1.68 beschrieben. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Modifikationen weisen die entwickelten Dextranaminosäureester eine Viabilität von über 70 % bei Konzentrationen bis 31,25 µg/mL auf. In Abhängigkeit vom durchschnittlichen Substitutionsgrad des Polymers und dem Verhältnis von Polymer zu DNA werden Transfektionsraten von 711.000 bis 870.000 RLU/µg Protein erreicht.
• Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
• Es zeigen:
• 1: Zellviabilität von L929 Mausfibroblasten nach 24-stündiger Behandlung mit β-Alanin-Dextranestern bei verschiedenen Konzentrationen [n=7]
• 2: Transfektionseffizienz von β-Alanin-Dextranestern untersucht mit pG13-Luciferase-Reportergen an CHO-Zellen; freie DNA ohne Trägersystem wurde als Vergleich eingesetzt [n=4]
• In 1 ist die Viabilität von kationischen β-Alanin-Dextranestern mit DS von 1,66 in % der Negativkontrolle (unbehandelte Zellen, 100 %) dargestellt. Diese wurde mittels MTT-Assay ermittelt. Nach DIN EN ISO 10993-5 gilt eine Substanz mit Viabilität größer 70 % als untoxisch. Erkennbar ist, dass die Grenze von 70 % bei einer Konzentration von 62,5 µg/ml unterschritten wird. Ab dieser Konzentration gilt das Polymer als toxisch.
• In 2 ist die Transfektionseffizienz der Polymere für das Luciferase-Reportergen pGl 3 dargestellt. Die Transfektionseffizienz wird in relative light units pro µg Protein angegeben (RLU/µg Proteingesamtmenge). Nach Transfektion der Plasmide in Zellen durch mit β-Alanin substituiertem Dextran mit Substitutionsgraden von 1,50 und 1,66 erfolgt die Transkription und Translation zu Luciferase, welche als lumineszenter Marker zur Quantifizierung mittels einer enzymatischen Reaktion dient.
• Ausführungsbeispiel 1:
• Schützen von L-Lysin mit Boc 50,86 g (0,28 mol) L-Lysine Monohydrochlorid werden in 350 mL eines 1: 1-Gemisches von Wasser und 2-Propanol suspendiert. Nach Zugabe von 35,28 g (0,88 mol) Natriumhydroxid in 100 mL Wasser unter stetigem Rühren liegt eine klare Lösung vor. Nach Zugabe von 124,28 g (0,57 mol) Di-tert-butylcarbonat in 350 mL des 1:1-Gemisches von Wasser und 2-Propanol lässt man die Reaktionsmischung unter stetigem Rühren bei Raumtemperatur 20 h reagieren. Nachdem das 2-Propanol am Rotationsverdampfer entfernt wurde und die Lösung mit Salzsäure auf pH=1 gebracht wurde, wodurch das Rohprodukt auszufallen beginnt, wird die Reaktionslösung mit dreimal 250 mL Ethylacetat extrahiert und anschließend die organische Phase je zweimal mit 250 mL Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wird für 12 h über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend filtriert. Das Filtrat wird bis zur Trockne eingeengt und man erhält 74,91 g (0,22 mol, Ausbeute 77,3 %) eines farblosen Öls.
• Ausführungsbeispiel 2:
• Herstellen eines L-Lysin-Dextranesters 12,82 g (37,0 mmol) Boc-geschützten L-Lysins und 6,19 g (38,2 mmol) Carbonyldiimidazol werden in 100 mL DMSO gelöst und reagieren gelassen. Der Verlauf der Reaktion wird über einen Blasenzähler verfolgt. Steigt kein Gas mehr auf, werden 6,00 g (37,0 mmol) Dextran (M~60.000 g/mol, Leuconostoc mesenteroides) hinzugegeben und für 16 h auf 80°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wird in ca. 400 mL eines Eis/Wasser-Gemischs ausgefällt, anschließend filtriert und mit Wasser gewaschen. Ungefähr ein Drittel der erhaltenen Substanz werden in 100 mL Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 10 mL Schwefelsäure wird 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Produkt in 300 mL Diethylether ausgefällt, filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wird in 50 mL Wasser gelöst; anschließende Dialyse im Celluloseschlauch (Molmassen-Cutoff bei 3.500 g/mol) sowie Gefriertrocknung ergeben 0,58 g (2,8 mmol, Ausbeute 22,7 %) L-Lysin-Dextranester.
• Ausführungsbeispiel 3:
• Herstellen eines β-Alanin-Dextranesters 14,07 g (74,4 mmol) Boc-geschützten β-Alanins und 12,23 g (75,5 mmol) Carbonyldiimidazol werden in 70 mL DMSO gelöst und zur Reaktion gebracht. Der Verlauf der Reaktion wird über einen Blasenzähler verfolgt. Steigt kein Gas mehr auf, werden 3,02 g (18,6 mmol) Dextran (M~60.000 g/mol, Leuconostoc mesenteroides) hinzugegeben und für 18 h auf 80°C erhitzt. Die Reaktionsmischung wird in ca. 400 mL eines Eis/Wasser-Gemischs ausgefällt und anschließend filtriert und mit Wasser gewaschen. Ungefähr die Hälfte der erhaltenen Substanz wird in 80 mL Dioxan gelöst. Nach Zugabe von 8 mL Schwefelsäure wird 90 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Produkt in 300 mL Diethylether ausgefällt, filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wird in 50 mL Wasser gelöst; anschließende Dialyse im Celluloseschlauch (Molmassen-Cutoff bei 3.500 g/mol) sowie Gefriertrocknung ergeben 0,39 g (2,3 mmol, Ausbeute 5,3 %) β- Alanin-Dextranester.
• Ausführungsbeispiel 4:
• Herstellung von Komplexen aus aminosubstituierten Dextranen und Nukleinsäuren Dieses Beispiel beschreibt die erfindungsgemäße Herstellung von Komplexen aus pG13-Plasmid-DNA und β-Alanin-Dextranestern. Dazu werden 4 µg Plasmid und die geeigneten Mengen der β-Alanin-Dextranester in jeweils 150 mM NaCl auf ein Endvolumen von 200 µl verdünnt, mittels Vortexer gemischt und 10 Minuten inkubiert. Die Dextranlösung wurde zur Plasmidlösung pipettiert und gevortext. Bevor die Komplexe eingesetzt werden, werden sie noch einmal 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
• Ausführungsbeispiel 5:
• Zytotoxizitätsuntersuchungen L929 Mausfibroblasten wurden unter den dem Fachmann geläufigen Standardbedingungen kultiviert. Diese Zellen werden in einer Dichte von 8500 Zellen/Well in 96-Well-Zellkulturschalen ausgesät und 24 h lang kultiviert, bevor sie für Toxizitätsexperimente verwendet werden. Die Toxizität der Polymere wird mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay nach der Methode von Mosmann et al. (T. Mosmann: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays in Journal of Immunological Methods, Vol. 65, 1983, 55-63) an L929 Mausfibroblasten bestimmt. Die Verdünnungsreihen des β-Alanin-Dextranesters DEXala-1,66 werden in RPMI mit 10 % FKS und 1 % Glutamin hergestellt. Nach einer Vorinkubation von 8.500 Zellen pro Well der 96-Well-Platte über 24 h werden die Zellen mit den Polymerlösungen versetzt und 24 h inkubiert. Anschließend erfolgt eine Inkubation für 4 h mit einer 0,5 mg/ml Lösung MTT in FKS-freiem RPMI. Nach Lyse in DMSO wird die metabolische Aktivität der Zellen als Viabilität durch Quantifizierung des enstandenen Formazans bei 570 nm UV/VIS-spektrophotometrisch gemessen. Die Zellviabilität zeigt nach 24 h Behandlung mit den Lösungen des β-Alanin-Dextranesters DEXala-1,66 eine Konzentrationsabhängigkeit. Bis zu einer Konzentration von 62,5 µg/ml sind die Polymere untoxisch (≥ 70 % Zellviabilität).
• Ausführungsbeispiel 6:
• Prüfung der Transfektionseffizienz CHO-Zellen werden ebenfalls unter Standardbedingungen kultiviert. 50.000 Zellen pro Well werden in eine 12-Well-Zellkulturschale 24 h vor Beginn der Transfektionsexperimente ausgesät. Die Transfektionseffizienz wird mit Hilfe eines Luciferase Assays (Promega, Mannheim, Deutschland) nach einer dem Fachmann bekannten Standardtechnik und unter Vermessung der Proteinmenge mittels BCA-Assay (Pierce®BCA assay kit, Thermo scientific, Rockford, USA) geprüft. Zur Transfektion werden Komplexe der β-Alanin-Dextranester DEXala-1,50 und DEXala-1,66 in einem Stickstoff des Polymers (N) zu Phosphat der DNA (P) Verhältnis von 10, 20 und 40 hergestellt und zu den 24 h vorinkubierten Zellen gegeben. Nach 4 h erfolgt ein Medienwechsel gefolgt von einer weiteren Inkubation für 44 h. Anschließend werden mittels CCLR (Cell Culture Lysis Reagent, Promega, Madison, WI, USA) die Zellen lysiert, und das Lysat abzentrifugiert. Mit dem Überstand wird die Luciferaseaktivität als Lumineszenzstärke (RLU) sowie der Proteingehalt in µg/ml UV-photometrisch bei 570 nm vermessen und als RLU/ µg Protein angegeben.
• Die substituierten Dextranderivate DEXala-1,50 und DEXala-1,66 erreichten bei N/P 40 rund 870.000 bzw 711.000 RLU/ µg Protein, was einer 2650 fachen bzw. 2170 fachen Erhöhung der Transfektion im Vergleich zu reiner DNA entspricht.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Dextranaminosäureester der allgemeinen Formel I:

   

   wobei R unabhängig voneinander H und mindestens eine Aminosäure mit wenigstens einer Aminogruppe, die nicht α-ständig zur Carboxylgruppe der Aminosäure steht, sein kann, gekennzeichnet durch die Synthese gemäß Schema III

   

   wobei die Aminogruppen mit Di-tert-butyldicarbonat geschützt werden, die Aktivierung der geschützten Aminosäure durch 1,1' -Carbonyldiimidazol mit anschließender Veresterung mit Dextran erfolgt und die Entschützung in Gegenwart von Säure, insbesondere 10 % v/v Schwefelsäure, in Dioxan durchgeführt wird.
2. Verwendung der neuen Dextranderivate gemäß Anspruch 1 als Trägersystem von Wirkstoffen, insbesondere zum Transfer von Nukleinsäuren, in biologische Zellen (Transfektion).

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