DE602004007155T2

DE602004007155T2 - Kationische polymere mit abbaubaren vernetzungen

Info

Publication number: DE602004007155T2
Application number: DE602004007155T
Authority: DE
Inventors: Sheng Vista LI; Chris San Diego CASTELLO; Sang San Diego VAN
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2004-10-07
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: US7163677B2; WO2005042620A1; US20050089503A1; HK1093216A1; JP4772686B2; EP1675888B1; EP1675888A1; DE602004007155D1; ATE365186T1; JP2007509224A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein abbaubare Polymere. Insbesondere betrifft die Erfindung vernetzte kationische Polymere, in denen die Vernetzungen unter physiologischen Bedingungen abbaubar sind. Bevorzugte abbaubare kationische Polymere sind zur Zufuhr biologisch aktiver Materialien (wie Nucleinsäuren) in die Kerne von Zellen verwendbar.
Beschreibung des Standes der Technik
Gentherapie umfasst die Zufuhr von Nucleinsäuren (wie DNA) zu Kernen von Zellen. Sowohl virale als auch nichtvirale Zufuhrsysteme wurden entwickelt (1-5). Die Vorteile von nichtviralen Zufuhrsystemen umfassen Nichtimmunogenität, geringe akute Toxizität und Gestaltungsflexibilität (6-10). Eine Vielzahl von Materialien wurde als nichtvirale Genträger entwickelt, wobei diese kationische Lipide und Liposome (11), endosomale Lysepeptide (12) und Polymere wie Poly-L-lysin (PLL) und deren Konjugate (13), Polyethylenimin (PEI) (14), Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere (15) und Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glykolsäure] (PAGA) (16) umfassen.
Nichtvirale Genzufuhrsysteme funktionieren typischerweise durch: (a) die Bildung eines Komplexes zwischen dem Genträger und einer Nucleinsäure, (b) die Aufnahme des Komplexes durch Zellen über Endocytose, (c) Austreten der Nucleinsäure aus den Endosomen und (d) Eindringen der Nucleinsäure in die Kerne (23). Biologisch abbaubare Polymergenträger wurden zur Verringerung einer potentiellen Cytotoxizität des Genträgers, der verbleibt, entwickelt (17-22). Jedoch kranken existierende biologisch abbaubare Polymergenträger an einer Zahl von Nachteilen. Beispielsweise besteht häufig die Tendenz, dass derartige Träger zu langsam abgebaut werden (wodurch das Risiko einer Schädigung von Gewebe besteht) oder nur über kurze Zeit im Inneren des Cytoplasmas verweilen, was zu einer unvollständigen Abgabe der Nucleinsäure führt.
LITERATURVERWEISE

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Zusammenfassung der Erfindung
Eine bevorzugte Ausführungsform stellt ein synthetisches Polymer bereit, das eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit umfasst, wobei die Vernetzungseinheit mindestens eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal, Imin und Hydrazon ausgewählt ist, und mindestens eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester, Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist, umfasst. Vorzugsweise ist die erste abbaubare Einheit säurelabil und die zweite abbaubare Einheit biologisch abbaubar (beispielsweise hydrolysierbar). Diese Erfindung ist nicht durch eine Theorie gebunden, doch wird angenommen, dass der Einbau von mindestens einer ersten abbaubaren Einheit und mindestens einer zweiten abbaubaren Einheit in eine einzige Polymerstruktur es ermöglicht, das das Polymer einen schnellen Abbau in sowohl Endosom- als auch Cytoplasmaumgebung erfährt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform stellt eine Trägerzusammensetzung bereit, die das oben beschriebene synthetische Polymer und ein biologisch aktives Mittel, das aus der Gruppe von einer Nucleinsäure, einem Polypeptid, Peptid, Lipid und Kohlehydrat ausgewählt ist, umfasst. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels bereit, das das Inkontaktbringen einer lebensfähigen Zelle mit dieser Trägerzusammensetzung unter zum Beibehalten der Zellenlebensfähigkeit wirksamen Bedingungen umfasst.
Diese und andere Ausführungsformen werden im folgenden detaillierter beschrieben.
Kurz Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Aspekte der Erfindung sind aus der im folgenden angegebenen Beschreibung und aus den angehängten Ansprüchen ohne weiteres ersichtlich, wobei diese die Erfindung erläutern und nicht beschränken sollen und wobei:
1 schematisch Beispiele für Polymersynthese und -abbau erläutert;
2 ein Balkendiagramm zeigt, das die Transfektions effizienz des Green Fluorescent Protein (GFP)-Reportergens, das 293-Zellen durch ein bevorzugtes kationisches Polymer (Probe 1) zugeführt wurde, im Vergleich mit einer Standardprobe (Nr. 51) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von Polymer zu DNA an.
3 zeigt ein Balkendiagramm, das den Zellenüberlebensprozentsatz (293-Zellen) nach Behandlung mit einer Reihe von bevorzugten kationisches Polymer/DNA-Komplexen (Probe 1) im Vergleich mit einer Standardprobe (Nr. 51) angibt. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von Polymer zu DNA an.
4 zeigt ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in PBS-Pufferlösung (pH = 7,4) bei Umgebungstemperatur (~ 22 °C) während 4 h (A1), 8 h (A2), 24 h (A3) und 48 h (A4) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von Polymer zu DNA an.
5 zeigt ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in PBS-Pufferlösung (pH = 7,4) bei 37 °C während 4 h (B1), 8 h (B2), 24 h (B3) und 48 h (B4) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von Polymer zu DNA an.
6 zeigt ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in einer Pufferlösung von pH = 5 bei Umgebungstemperatur (~ 22 °C) während 4 h (C1), 8 h (C2), 24 h (C3) und 48 h (C4) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von Polymer zu DNA an.
7 zeigt die Namen und chemischen Strukturen von Beispielen bevorzugter kationischer Wiederholungseinheiten sowie bevorzugter Monomere, die zur Bildung kationischer Wiederholungseinheiten polymerisiert werden können.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Eine bevorzugte Ausführungsform ist auf ein synthetisches Polymer gerichtet, das eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit umfasst. Der Ausdruck "kationische Wiederholungseinheit" wird hierin in seinem üblichen Sinn derart verwendet, dass er verschiedene positiv geladene chemische Gruppen, die in das synthetische Polymer, beispielsweise in das Polymerrückgrat oder in eine Seitenkette, eingebaut sind oder zum Einbau geeignet sind, bezeichnet. Bevorzugte kationische Wiederholungseinheiten umfassen eine Amingruppe, die positiv geladen ist. Positiv geladene Amingruppen umfassen primäre, sekundäre und tertiäre Amine, die unter sauren Bedingungen positiv geladen sind, sowie quaternäre Amine, die über einen breiten pH-Bereich positiv geladen sind. Vorzugsweise umfassen kationische Wiederholungseinheiten eine quaternäre Amingruppe. Ein Poly(amidoamin)dendrimer, Polyethylenimin und Polypropylenimin sind nichtbeschränkende Beispiele bevorzugter synthetischer Polymere, die eine kationische Wiederholungseinheit umfassen.
Kationische Wiederholungseinheiten können in das Polymer durch Polymerisation der entsprechenden kationischen Monomere oder durch eine Nachreaktion eingebaut werden. Die Polymerisation kann eine Copolymerisation sein und durch verschiedene Polymerisationsmechanismen unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken, die stufenweise und Kettenpolymerisationsmechanismen umfassen, erfolgen, siehe G. Odian, Principles of Polymerization, 3. Auflage, John Wiley (1991). Nichtbeschränkende Beispiele für bevorzugte kationische Monomere, die zur Polymerisation geeignet sind, umfassen Spermin, Spermidin, Pentaethylenhexamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, N-(3-Aminopropyl)-1,3-propandiamin, Tris(2-aminoethyl)amin, N,N'-Bis(2-aminoethyl)-1,3-propandiamin, N,N'-Bis(2-aminopropyl)ethylendiamin, N,N'-Bis(2-aminopropyl)-1,3-propandiamin, 1-(2-Aminoethyl)piperazin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin und ein Poly(amidoamin)dendrimer. Die Namen und chemischen Strukturen von Beispielen für bevorzugte kationische Wiederholungseinheiten sowie bevorzugte Monomere, die zur Bildung kationischer Wiederholungseinheiten polymerisiert werden können, sind in 7 angegeben. Kationische Monomere können im Handel erhalten werden oder nach dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden.
Vernetzte Polymere können Polymerketten enthalten, die an anderen Punkten als an ihren Enden aneinander gebunden sind, siehe G. Odian, Principles of Polymerization, 3. Auflage, John Wiley (1991). Der hierin verwendete Ausdruck "Vernetzungseinheit" bezeichnet eine chemische Gruppe, die einen Teil des Verbindungspunkts bzw. den gesamten Verbindungspunkt zwischen den zwei Ketten bildet. Daher ist eine Vernetzungseinheit an zwei oder mehr Polymerketten an einer anderen Stelle als den Enden der Ketten gebunden. Vernetzungseinheiten können in die Polymerkette durch Bildung des Polymers in Gegenwart eines geeigneten Vernetzungsmittels oder durch Umsetzung von Polymeren miteinander unter Bildung von Bindungspunkten eingebaut werden.
Die Vernetzungseinheit umfasst vorzugsweise mindestens eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal, Imin und Hydrazon ausgewählt ist, und mindestens eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester, Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist.
Die erste abbaubare Einheit ist vorzugsweise säurelabil und die zweite abbaubare Einheit ist vorzugsweise hydrolysierbar. Bevorzugte Vernetzungsmittel umfassen typischerweise polymerisierbare Gruppen, die zur Reaktion mit den Monomeren geeignet sind, wobei eine Verbindung des gebildeten Polymers und der Vernetzungseinheit miteinander erhalten wird. Bevorzugte Vernetzungsmittel können auch die oben beschriebenen ersten und zweiten abbaubaren Einheiten umfassen oder die abbaubaren Einheiten können durch eine Nachreaktion der Vernetzungseinheit, die durch Einbau des Vernetzungsmittels in das Polymer gebildet wurde, gebildet werden. Bevorzugte Vernetzungsmittel werden durch die Formel R¹ _x-(-X-R³-Y-)_z-R² _y, worin R¹ und R² für polymerisierbare Gruppen stehen, R³ für eine Verknüpfungsgruppe steht, X für eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal, Imin und Hydrazon ausgewählt ist, steht, Y für eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester, Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist, steht, x und y ganze Zahlen im Bereich von 1-3 sind und z eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist, dargestellt. Vorzugsweise sind R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe von einem Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Isothiocyanat, Isocyanat, Epoxid, Aldehyd, Acylchlorid, Sulfonylchlorid, Anhydrid, Maleimid, einer Carbonsäure, einem Carbonsäureester, Hydroxyl, Amin und Amid ausgewählt. Vorzugsweise ist R³ aus der Gruppe von einem Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffen, Cycloalkyl mit 4 bis 10 Kohlenstoffen, -(CH₂)_n-, -(CH₂O)_n- und -(CH₂CH-O₂-O)_n-, worin n im Bereich von 1 bis etwa 100, noch besser im Bereich von 1 bis etwa 5 liegt, ausgewählt. Vernetzungsmittel können von Handelslieferanten erhalten werden oder nach dem Fachmann bekannten Verfahren in Abhängigkeit von der Natur der einzuarbeitenden Gruppen, beispielsweise polymerisierbare Gruppen, erste abbaubare Gruppe und zweite abbaubare Gruppe, synthetisiert werden.
Synthetische Polymere, die eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit umfassen, werden vorzugsweise durch Polymerisation eines kationischen Monomers in Gegenwart eines Vernetzungsmittels hergestellt. Verschiedene Polymerisationsverfahren können in Abhängigkeit von der Natur der polymerisierbaren Gruppen in dem Monomer und des Vernetzungsmittels verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das kationische Monomer ein aliphatischer, alicyclischer oder aromatischer Kohlenwasserstoff, der zwei oder mehr aktive Wasserstoffe derart trägt, dass das Monomer zur Reaktion mit einem geeigneten Vernetzungsmittel fähig ist. Polyamine wie die in 7 angegeben sind Beispiele für bevorzugte kationische Monomere, die aktive Aminwasserstoffatome tragen. Bevorzugte kationische Monomere umfassen drei oder mehr aktive Wasserstoffe.
Eine schematische Darstellung der Herstellung eines synthetischen Polymers, das eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit umfasst, ist in 1 angegeben. Die Synthese eines Polymers, das von Pentaethylenhexamin (PEHA) und dem Vernetzungsmittel BDADPTA abgeleitet ist, ist in den im folgenden angegebenen Arbeitsbeispielen beschrieben und dient als Richtlinie für andere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, die zur Synthese verschiedener kationischer Polymere verwendet werden können. Die Polymerisation kationischer Monomere in Gegen wart eines Vernetzungsmittels wird vorzugsweise in einem geeigneten Lösemittel oder Suspendiermedium durchgeführt. Die Anteile von kationischem Monomer und Vernetzungsmittel sind unkritisch und können durch Routinearbeiten bestimmt werden. Für Polyaminmonomere liegt das Verhältnis der Reaktionsteilnehmer (ausgedrückt als die Zahl der Äquivalente der aminreaktiven funktionellen Gruppe in dem Vernetzungsmittel zur Zahl der Aminwasserstoffäquivalente im Polyaminmonomer) vorzugsweise im Bereich von etwa 1:10 bis etwa 1:1. Noch besser wird ein Verhältnis der Reaktionsteilnehmer im Bereich von etwa 1:5 bis etwa 4:5 verwendet. Für Vernetzungsmittel der Formel R¹ _x-(-X-R³-Y-)_z-R² _y ist die Zahl der Äquivalente der aminreaktiven funktionellen Gruppe gleich x + y. Für Polyamine wie die in 7 angegebenen ist die Zahl der Aminwasserstoffäquivalente die Zahl von an die Stickstoffatome gebundenen reaktiven Wasserstoffatomen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist auf eine Trägerzusammensetzung gerichtet, die das oben beschriebene synthetische Polymer und ein bioaktives Mittel, das aus der Gruppe von einer Nucleinsäure, einem Polypeptid, Peptid, Lipid und Kohlehydrat ausgewählt ist, umfasst. Eine "Nucleinsäure" ist ein Polymer, das mindestens zwei Nucleotide enthält. Ein "Nucleotid" enthält eine Zuckerdesoxyribose (in DNA) oder eine Ribose (in RNA), eine Base und eine Phosphatgruppe. Nucleotide sind über die Phosphatgruppen miteinander verbunden und sie sind die Monomereinheiten von Nucleinsäurepolymeren. Der Ausdruck Nucleinsäure umfasst Desoxyribonucleinsäure ("DNA") und Ribonucleinsäure ("RNA"). DNA kann in der Form von Antisense-, Plasmid-DNA, Teilen einer Plasmid-DNA, Vektoren, Expressionskassetten, chimären Sequenzen, chromosomaler DNA oder Derivaten dieser Gruppen sein. RNA kann in der Form von Oligonucleotid-RNA, tRNA, snRNA, rRNA, mRNA, Antisense-RNA, Ribozymen, chimären Sequenzen oder Derivaten dieser Gruppen sein.
Ein "Peptid" ist eine natürliche oder synthetische Verbindung, die zwei oder mehr Aminosäuren, die durch die Carboxylgruppe von einer Aminosäure und die Aminogruppe einer anderen verbunden sind, enthält. Die Klasse der Peptide umfasst viele Hormone, Antibiotika und andere Verbindungen, die an Stoffwechselfunktionen lebender Organismen beteiligt sind. "Polypeptid" bezeichnet eine lineare Reihe von Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen zwischen der alpha-Aminogruppe und der Carboxylgruppe fortlaufender Aminosäurereste miteinander verbunden sind. "Lipide" sind eine breite Gruppe biologischer Substanzen, die primär oder ausschließlich aus nichtpolaren Gruppen bestehen. Infolge ihres nichtpolaren Charakters lösen sich Lipide typischerweise leichter in nichtpolaren Lösemitteln wie Aceton, Ether, Chloroform und Benzol als in Wasser. Diese Löslichkeitseigenschaft ist in Zellen von äußerster Bedeutung, da Lipide dazu tendieren, sich zu nichtpolaren Gruppen und Barrieren wie in den Zellmembranen, die Grenzen zwischen und innerhalb von Zellen bilden, zu assoziieren. Neben der Eigenschaft, dass sie wichtige Rollen in Membranen spielen, werden Lipide in Zellen als Energiequelle gespeichert und verwendet.
"Kohlehydrat" ist ein Ausdruck für eine große Klasse polyhydroxylierter Aldehyde und Ketone mit der allgemeinen Formel C_x(H₂O)_x. Aldehyde und Ketone enthalten beide eine Carbonylgruppe. In Ketonen sind die beiden Atome, die an die Carbonylgruppe gebunden sind, Kohlenstoffe, während in Aldehyden eines ein Wasserstoff ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine Trägerzusammensetzung, die vernetzte kationische Polymere gemäß der Beschreibung hierin und ein biologisch aktives Mittel umfasst. Bevorzugte vernetzte kationische Polymere besitzen die Eigenschaft, dass sie, wenn sie in Wasser dispergiert werden, stark über deren kationische Bereiche mit negativ geladenen biologisch aktiven Mitteln, vorzugsweise Plasmid- oder Oligonucleotid-DNA, assoziieren, wodurch die biologisch aktiven Mittel kompaktiert werden, wodurch eine Trägerzusammensetzung, die das vernetzte kationische Polymer und das biologisch aktive Mittel umfasst, gebildet wird. Auf der Basis des Ladungsverhältnisses umfasst die Trägerzusammensetzung vorzugsweise einen Überschuss an vernetztem kationischem Polymer, bezogen auf die Nucleinsäure, wodurch die Adsorption der Trägerzusammensetzung an Zellmembranen und die Aufnahme des biologisch aktiven Mittels durch die Zellen ermöglicht wird.
Eine weitere Ausführungsform ist auf ein Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels gerichtet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer lebensfähigen Zelle mit der oben beschriebenen Trägerzusammensetzung unter zum Beibehalten der Zellenlebensfähigkeit wirksamen Bedingungen umfasst. Eine In-vitro-Transfektion (Abgabe eines biologisch aktiven Mittels in die Kerne von Zellen) wird vorzugsweise durch Inkontaktbringen einer Zellsuspension mit einem Transfektionsgemisch, das vorzugsweise zum Zeitpunkt der Verwendung aus einer Lösung der oben beschriebenen Trägerzusammensetzung in einem geeigneten Medium erhalten wird, durchgeführt. Die Transfektionsdauer liegt typischerweise im Bereich von etwa 10 min bis etwa 48 h in Abhängigkeit von der Natur der Zellen.
Ein bevorzugtes In-vitro-Transfektionsprotokoll ist das folgende: Zellen werden mit einer Dichte von 10000 Zellen/Vertiefung in einer 96-Vertiefungen-Platte ausgesät und in Minimal Essential Medium (MEM), das mit 10 fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1,0 mM Natriumpyruvat ergänzt ist, zum Erreichen von 60-70 % Konfluenz vor der Transfektion gezüchtet. Vor der Transfektion werden die Zellen gespült und serumfreies oder 10 % FBS enthaltendes Medium wird zu jeder Vertiefung gegeben. Die Zellen werden mit einer Lösung, die den Trägerkomplex und 1 μg Plasmid-DNA enthält, 4 h bei 37 °C behandelt. Die Konzentration eines kationischen Polymers wird typischerweise über einen Bereich von Polymer/DNA-Verhältnissen variiert. Das Transfektionsgemisch wird durch frisches Medium ersetzt und die Zellen werden des weiteren 48 h bei 37 °C inkubiert.
Die Luciferasegenexpression wird vorzugsweise durch einen Lumineszenzassay ermittelt. Das Züchtungsmedium wird entfernt und die Zellen werden zweimal mit PBS gespült und 20 min bei Raumtemperatur in 100 μl Reporter Lysis Buffer (Promega) lysiert. Das Lysat wird durch Zentrifugation geklärt und der Proteingehalt wird durch Verwendung des Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce) bestimmt. 30 μl des Lysats werden in ein Luminometerröhrchen abgemessen und die Luciferaseaktivität wird über 10 s mit einer Messverzögerung von 2 s in einem Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold, Deutschland) mit automatischer Injektion von 100 μl von Luciferase Assay Reagent (Promega) integriert. Die Ergebnisse werden als relative Lichteinheiten pro mg Zellprotein ausgedrückt.
In-vivo-Untersuchungen werden allgemein an Mäusen oder Kaninchen durch intravenöse Verabreichung zur Bestimmung der biologischen Verteilung und Kinetik der Blutclearance der injizierten nackten DNA oder Trägerzusammensetzung durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit ist das Verhältnis der Zahl der lebenden Zellen, die mit der Trägerzusammensetzung in PBS-Pufferlösung behandelt wurden, zur Zahl der lebenden Zellen, die nur mit PBS behandelt wurden. Die Beurteilung der Zellenlebensfähigkeit wird vorzugsweise durch den MTT- Assay durchgeführt: Zelllebensfähigkeit (%) = (OD_Probe/OD_Kontrolle) × 100, wobei OD_Probe für die Messung der optischen Dichte (OD) bei 570 nm der Vertiefungen, die mit der Trägerzusammensetzung behandelt wurden, steht und OD_Kontrolle für die Vertiefungen, die nur mit PBS-Pufferlösung behandelt wurden, steht. Siehe T. Mosman, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cyctotoxicity assay", J. Immunol. Methods, 183, 65, 55-63.
Durch Einbau von sowohl hydrolysierbaren als auch säurelabilen Eigenschaften in eine einzige Polymerstruktur gemäß der Beschreibung in bevorzugten Ausführungsformen hierin kann der Abbauprozess durch die Verwendung einer Kombination von beiden Merkmalen, beispielsweise das Ermöglichen eines gesteuerten Abbaus des Polymers nach der gesteuerten Abgabe des biologisch aktiven Mittels, gesteuert werden. Diese Erfindung ist nicht durch eine Theorie gebunden, doch wird angenommen, dass der Abbau im Inneren des Endosoms beginnt, wo der relativ niedrige pH-Wert (pH = 5,0-5,5) zur Spaltung von säurelabilen Bindungen und zur Freisetzung des biologisch aktiven Mittels führt, worauf der hydrolytische Abbau des verbleibenden Polymers in der Cyctoplasmaumgebung folgt, was zu kleinen Molekülkomponenten, die vorzugsweise nichttoxisch sind, führt.
Trägerzusammensetzungen, die säurelabile Verbindungen umfassen, sind besonders günstig zur Abgabe einer aktiven Substanz an bestimmte Zellen (Tumorzellen und dgl.), wobei der relativ niedrige pH-Wert den Abbau des Polymers beschleunigt. Bevorzugte Zusammensetzungen sind relativ einfach herzustellen und einem Scale-up zugänglich. Ferner können zahlreiche nichttoxische kleine Moleküle, die Amingruppen enthalten, als Anfangskomponenten gewählt werden, so dass die letztendlichen Abbauendmoleküle nichttoxisch sind. BEISPIEL 1 Synthese von Vernetzungsmittel (BDADPTA) Stufe A: Bildung von Benzo-1,4-diacetal-dipentaerythrit (BDADP)
1,4-Dibenzaldehyd (10,0 g) wurde in 125 ml Methanol in einem 500-ml-Rundkolben gelöst und auf 45 °C erhitzt. Getrennt wurden 25,0 Gramm (g) Pentaerythrit in 250 ml von 50:50 Methanol/Wasser bei 45 °C gelöst. Die Pentaerythritlösung wurde dann tropfenweise über 1 h unter Rühren bei 45 °C zu der 1,4-Dibenzaldehydlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 45 °C gerührt. Während dieses Zeitraums bildete sich ein weißer Niederschlag, der heißfiltriert wurde (45 °C) und mit wässrigem NaHCO₃ gewaschen wurde. Das gewonnene rohe Produkt wurde von der Ausgangsverbindung Pentaerythrit durch Erhitzen auf 70 °C in 200 ml einer NaHCO₃-Lösung während 1 h und Heißfiltration gereinigt. Das feuchte wasserhaltige Produkt wurde dann durch Refluxieren mit Toluol über eine Dean-Stark-Wasserfalle und anschließende Filtration nach Kühlen auf Raumtemperatur getrocknet. 18 g (65 %) Produkt wurden als weißer Feststoff gewonnen.
Stufe B: Bildung von Benzo-1,4-diacetal-dipentaerythrittetraacrylat (BDADPTA)
BDADP (25 g) wurden in 500 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) bei 70 °C in einem mit zwei Tropftrichtern ausgestatteten 1-1-Dreihalsrundkolben gelöst. Das System wurde mit Argon gespült und die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Triethylamin (TEA, 25 g) in 25 ml NMP wurde tropfenweise zugegeben, worauf tropfenweise 42 g Acryloylchlorid in 25 ml NMP mit einer etwas langsameren Geschwindigkeit als TEA, um sicherzustellen, dass die gebildete Lösung basisch ist, zugegeben wurden. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt. Das NMP wurde durch Ausfällen des Reaktionsgemischs in durch NaHCO₃ basisch gemachtes Wasser entfernt. Der als Rohprodukt erhaltene Feststoff wurde dann in DCM gelöst, über MgSO₄ getrocknet und über Flashchromatographie (SiO₂, Ethylacetat/Hexan: 10/90) gereinigt. Das Produkt wurde als farbloser Feststoff gewonnen (22,0 g, 56 %).
BEISPIEL 2
Herstellung von vernetztem kationischem Polymer: 0,46 g Pentaethylenhexamin (PEHA) (von Aldrich) wurden abgewogen und in eine kleine Ampulle gegeben und 5 ml Methylenchlorid wurden zugegeben. Nach vollständigem Auflösen des PEHA wurden 0,58 g BDADPTA in 2 ml Methylenchlorid in einer Portion unter Rühren bei Raumtemperatur in die PEHA-Lösung gegeben. Weiteres Methylenchlorid wurde zu der Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen von etwa 10 ml herzustellen. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde 9 h bei Raumtemperatur gerührt, bevor es in 100 ml Ether gegeben wurde. Das erhaltene ver netzte Polymer wurde ausgefällt und als gelähnlicher Feststoff nach Zentrifugieren erhalten, worauf Trocknen unter vermindertem Druck folgte. Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte, dass die Acryl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vollständig verschwand.
BEISPIEL 3
In-vitro-Transfektionseffizienz: Dieses Beispiel zeigt, dass das Polymer von Beispiel 2 (Probe 1) zur Zufuhr von Plasmid-DNA (oder einer anderen biologisch aktiven Spezies) in die Kerne von Säugerzellen fähig ist. Dies wird durch ein Transfektionseffizienzexperiment gezeigt, in dem die GFP (Green Fluorescence Protein)-Plasmid-DNA als Reportergen verwendet wurde.
Verfahren: Permanente Zellen (293- oder HT1080-Zellen, ATCC) wurden in ²⁴-Vertiefungen-Gewebekulturplatten ausplattiert (2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung für 293-Zellen und 8 × 10⁴ Zellen/Vertiefung für HT1080) und über Nacht in DMEM (Gibco) mit 10 % FBS (Gibco) inkubiert. Für jede Vertiefung wurde ein Aliquot von 30 μl DMEM, das verschiedene Mengen des vernetzten Polymers von Beispiel 2, die DNA/Polymer-Gewichtsverhältnissen von 16/1 und 8/1 entsprachen, enthielt, tropfenweise in 30 μl DMEM-Lösung, die 0,6 μg Plasmid-DNA (pCMV-GFP-Plasmid-DNA) enthielt, unter Verwirbeln gegeben. Die Polymer-DNA-Lösungen (Trägerzusammensetzungen) wurden 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von DNA-Polymer-Komplexen zu ermöglichen. 150 μl DMEM-Medium, das 10 % FBS und Antibiotika enthielt, wurden zu dem DNA-Polymer-Komplex gegeben und dann wurde das Gemisch zu den Zellen in individuellen Vertiefungen nach Waschen der Zellen mit PBS gegeben. Die Zellen wurden 3 h inkubiert (37 °C, 7,5 % CO₂) und dann wurde das Medium zu DMEM-Medium, das 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Strepto mycin enthielt, geändert. 24 h nach der Transfektion wurden GFP-Signale in Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Filter 515-550 nm) beobachtet. Der Prozentsatz von Zellen mit GFP-Signal in transfizierten Kulturen wurde aus den Zählraten von drei Feldern für optimale kationische Polymermengen bestimmt. Die Transfektionsprozentsätze vernetzter Polymere, die in 2 angegeben sind, betrugen 50 % (16/1) und 45 % (8/1) verglichen mit einem kommerziellen kationischen Standardpolymer Nr. 51 mit Transfektionseffizienzwerten von 60 % (16/1) und 50 % (8/1).
BEISPIEL 4
Toxizität des vernetzten Polymers gegenüber Zellen: Die Cytotoxizität des vernetzten kationischen Polymers von Beispiel 2 (Probe 1) auf Säugerzellen wurde unter Verwendung eines 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Verfahrens beurteilt. Kurz gesagt wurden HT1080-Zellen, 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung oder 4 × 10⁴ 293-Zellen in 96-Vertiefungen-Platten ausgesät und 16-24 h inkubiert. Ein Aliquot von 15 μl DMEM, das das Polymer enthielt, wurde Tropfen für Tropfen in 15 μl DMEM, das 0,3 μg Plasmid enthielt, gegeben und es wurde 15 min zur Bildung von Polymer/DNA-Komplexen inkubiert. Fünfundsiebzig Mikroliter (75 μl) DMEM wurden zu den Polymer-DNA-Komplexen gegeben und 50 μl des Gemischs wurden zu den Zellen gegeben und es wurde 3 h inkubiert (37 °C, 7,5 % CO₂). Das Medium wurde dann entfernt und DMEM-Medium, das 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, wurde zugegeben. Nach weiterer Inkubation während 24 h wurden das Medium entfernt und 10 μl MTT-Lösung (5,0 mg/ml, Sigma) zu jeder Vertiefung gegeben und es wurde 3 h inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und 200 μl DMSO wurden zum Lösen der Formazankristalle zugegeben. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Extinktion der Lösung wurde bei 570 nm gemessen. Die Zellenlebensfähigkeiten wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Filter 515-550 nm) sichtbar gemacht und unter Verwendung der Gleichung: Lebensfähigkeit (%) = {Abs570(Probe)/Abs570(Kontrolle)} × 100 berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Cytotoxizität des vernetzten Polymers signifikant niedriger als die des kationischen Standard-NDT-Polymers war, da viel mehr Zellen nach der Transfektion überlebten. Die Ergebnisse sind graphisch in 3 angegeben (Probe 1 ist das vernetzte kationische Polymer von Beispiel 2, Nr. 51 ist die kommerzielle Kontrolle).
BEISPIEL 5
Abbau der vernetzten Polymere in verschiedenen Umgebungen: Um den Abbau des vernetzten Polymers von Beispiel 2 in verschiedenen Umgebungen zu beurteilen, wurde eine Probe des vernetzten Polymers von Beispiel 2 (Probe 1) in einer PBS-Pufferlösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml bei sowohl Umgebungstemperatur (~ 22 °C) als auch 37 °C über 4 h, 8 h, 24 h bzw. 48 h inkubiert, um den hydrolytischen Abbau der Proben unter neutralen Bedingungen zu beurteilen. Proben der verschiedenen, partiell abgebauten Polymere wurden dann durch Verwendung einer GFP-Transfektionsmessung beurteilt (4 und 5). Die gleiche GFP-Transfektionsmessung wurde auch an dem vernetzten Polymer von Beispiel 2 nach einer Inkubation in einer Pufferlösung von pH = 5 mit einer Konzentration von 5 mg/ml bei Umgebungstemperatur (~ 22 °C) für die gleichen Zeitabstände durchgeführt. In Säure (6) zeigen die Ergebnisse, dass die Transfektionseffizienz rasch abnahm, wenn die Inkubationsdauer auf 24 h zunahm. Unter neutralen Bedingungen war die Probe jedoch stabiler (4 und 5). Die Transfektionseffizienz der Probe nach der Inkubation in PBS bei Raumtemperatur über 48 h behielt immer noch 80 % von deren ursprünglichem Wert bei. Eine beschleunigte Zersetzung wurde bei erhöhten Temperaturen beobachtet, wobei die Transfektionseffizienz auf 10 von deren ursprünglichem Wert nach Inkubation in PBS bei 37 °C während 4 h fiel.
Dem Fachmann ist klar, dass verschiedene Weglassungen, Zusätze und Modifikationen bei den oben beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, und alle derartigen Modifikationen und Änderungen sollen in den Umfang der Erfindung, die durch die angehängten Ansprüche definiert ist, fallen.

Claims

Synthetisches Polymer, das eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit umfasst, wobei die Vernetzungseinheit mindestens eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal, Imin und Hydrazon ausgewählt ist, und mindestens eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester, Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist, umfasst.
Synthetisches Polymer nach Anspruch 1, wobei die kationische Wiederholungseinheit eine Amingruppe oder ein Salz derselben umfasst.
Synthetisches Polymer nach Anspruch 2, wobei die Amingruppe oder ein Salz derselben eine tertiäre Amingruppe ist.
Synthetisches Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das wasserquellbar ist.
Synthetisches Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ein massegemitteltes Molekulargewicht im Bereich von etwa 1000 bis etwa 100 000 Dalton aufweist.
Synthetisches Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste abbaubare Einheit ein Acetal ist.
Synthetisches Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite abbaubare Einheit ein Ester ist.
Synthetisches Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste abbaubare Einheit ein Acetal ist und die zweite abbaubare Einheit ein Ester ist.
Trägerzusammensetzung, die das synthetische Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche und ein biologisch aktives Mittel, das aus der Gruppe von einer Nucleinsäure, einem Polypeptid, Peptid, Lipid und Kohlenhydrat ausgewählt ist, umfasst.
Trägerzusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das biologisch aktive Mittel eine Nucleinsäure ist.
Trägerzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe von DNA, RNA, einem Ribosom und einem DNA-RNA-Hybrid ausgewählt ist.
Trägerzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Nucleinsäure DNA ist.
Trägerzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Nucleinsäure RNA ist.
Trägerzusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die RNA doppelsträngig ist.
Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels in vitro, das das Inkontaktbringen einer lebensfähigen Zelle mit der Trägerzusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 unter zum Beibehalten der Zellenlebensfähigkeit wirksamen Bedingungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, das ferner die Transfektion der Zelle mit dem biologisch aktiven Mittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das biologisch aktive Mittel DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die erste abbaubare Einheit des synthetischen Polymers ein Acetal ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die zweite abbaubare Einheit des synthetischen Polymers ein Ester ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Zelle eine humane Zelle ist.
Trägerzusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung einer Trägerzusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels an eine lebensfähige Zelle.