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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft allgemein abbaubare Polymere. Insbesondere betrifft
die Erfindung vernetzte kationische Polymere, in denen die Vernetzungen
unter physiologischen Bedingungen abbaubar sind. Bevorzugte abbaubare
kationische Polymere sind zur Zufuhr biologisch aktiver Materialien
(wie Nucleinsäuren)
in die Kerne von Zellen verwendbar.
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Beschreibung des Standes der
Technik
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Gentherapie
umfasst die Zufuhr von Nucleinsäuren
(wie DNA) zu Kernen von Zellen. Sowohl virale als auch nichtvirale
Zufuhrsysteme wurden entwickelt (1-5). Die Vorteile von nichtviralen
Zufuhrsystemen umfassen Nichtimmunogenität, geringe akute Toxizität und Gestaltungsflexibilität (6-10).
Eine Vielzahl von Materialien wurde als nichtvirale Genträger entwickelt,
wobei diese kationische Lipide und Liposome (11), endosomale Lysepeptide
(12) und Polymere wie Poly-L-lysin (PLL) und deren Konjugate (13),
Polyethylenimin (PEI) (14), Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere (15)
und Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glykolsäure] (PAGA)
(16) umfassen.
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Nichtvirale
Genzufuhrsysteme funktionieren typischerweise durch: (a) die Bildung
eines Komplexes zwischen dem Genträger und einer Nucleinsäure, (b)
die Aufnahme des Komplexes durch Zellen über Endocytose, (c) Austreten
der Nucleinsäure
aus den Endosomen und (d) Eindringen der Nucleinsäure in die
Kerne (23). Biologisch abbaubare Polymergenträger wurden zur Verringerung
einer potentiellen Cytotoxizität
des Genträgers,
der verbleibt, entwickelt (17-22). Jedoch kranken existierende biologisch
abbaubare Polymergenträger
an einer Zahl von Nachteilen. Beispielsweise besteht häufig die
Tendenz, dass derartige Träger
zu langsam abgebaut werden (wodurch das Risiko einer Schädigung von
Gewebe besteht) oder nur über
kurze Zeit im Inneren des Cytoplasmas verweilen, was zu einer unvollständigen Abgabe
der Nucleinsäure
führt.
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LITERATURVERWEISE
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- 21. Henrik R. Ihre, Omayra L. Padilla De Jesus, Francis C. Szoka,
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
stellt ein synthetisches Polymer bereit, das eine kationische Wiederholungseinheit
und eine Vernetzungseinheit umfasst, wobei die Vernetzungseinheit
mindestens eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von
einem Acetal, Imin und Hydrazon ausgewählt ist, und mindestens eine
zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester, Phosphoester,
Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist, umfasst. Vorzugsweise
ist die erste abbaubare Einheit säurelabil und die zweite abbaubare
Einheit biologisch abbaubar (beispielsweise hydrolysierbar). Diese
Erfindung ist nicht durch eine Theorie gebunden, doch wird angenommen,
dass der Einbau von mindestens einer ersten abbaubaren Einheit und mindestens
einer zweiten abbaubaren Einheit in eine einzige Polymerstruktur
es ermöglicht,
das das Polymer einen schnellen Abbau in sowohl Endosom- als auch
Cytoplasmaumgebung erfährt.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
stellt eine Trägerzusammensetzung
bereit, die das oben beschriebene synthetische Polymer und ein biologisch
aktives Mittel, das aus der Gruppe von einer Nucleinsäure, einem
Polypeptid, Peptid, Lipid und Kohlehydrat ausgewählt ist, umfasst. Eine weitere
bevorzugte Ausführungsform
stellt ein Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels
bereit, das das Inkontaktbringen einer lebensfähigen Zelle mit dieser Trägerzusammensetzung
unter zum Beibehalten der Zellenlebensfähigkeit wirksamen Bedingungen
umfasst.
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Diese
und andere Ausführungsformen
werden im folgenden detaillierter beschrieben.
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Kurz Beschreibung der Zeichnungen
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung sind aus der im folgenden angegebenen
Beschreibung und aus den angehängten
Ansprüchen
ohne weiteres ersichtlich, wobei diese die Erfindung erläutern und
nicht beschränken
sollen und wobei:
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1 schematisch
Beispiele für
Polymersynthese und -abbau erläutert;
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2 ein
Balkendiagramm zeigt, das die Transfektions effizienz des Green Fluorescent
Protein (GFP)-Reportergens, das 293-Zellen durch ein bevorzugtes
kationisches Polymer (Probe 1) zugeführt wurde, im Vergleich mit
einer Standardprobe (Nr. 51) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h
nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen
geben das Gewichtsverhältnis
von Polymer zu DNA an.
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3 zeigt
ein Balkendiagramm, das den Zellenüberlebensprozentsatz (293-Zellen)
nach Behandlung mit einer Reihe von bevorzugten kationisches Polymer/DNA-Komplexen
(Probe 1) im Vergleich mit einer Standardprobe (Nr. 51) angibt.
Die in Klammern angegebenen Zahlen geben das Gewichtsverhältnis von
Polymer zu DNA an.
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4 zeigt
ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines
bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in PBS-Pufferlösung (pH
= 7,4) bei Umgebungstemperatur (~ 22 °C) während 4 h (A1), 8 h (A2), 24
h (A3) und 48 h (A4) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der
Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben
das Gewichtsverhältnis
von Polymer zu DNA an.
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5 zeigt
ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines
bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in PBS-Pufferlösung (pH
= 7,4) bei 37 °C
während
4 h (B1), 8 h (B2), 24 h (B3) und 48 h (B4) angibt. Die GFP-Signale
wurden 24 h nach der Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen
Zahlen geben das Gewichtsverhältnis
von Polymer zu DNA an.
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6 zeigt
ein Balkendiagramm, das die GFP-Gen-Transfektionseffizienz eines
bevorzugten kationischen Polymers (Probe 1) nach Inkubation in einer
Pufferlösung
von pH = 5 bei Umgebungstemperatur (~ 22 °C) während 4 h (C1), 8 h (C2), 24
h (C3) und 48 h (C4) angibt. Die GFP-Signale wurden 24 h nach der
Transfektion beobachtet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben
das Gewichtsverhältnis
von Polymer zu DNA an.
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7 zeigt
die Namen und chemischen Strukturen von Beispielen bevorzugter kationischer
Wiederholungseinheiten sowie bevorzugter Monomere, die zur Bildung
kationischer Wiederholungseinheiten polymerisiert werden können.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
ist auf ein synthetisches Polymer gerichtet, das eine kationische Wiederholungseinheit
und eine Vernetzungseinheit umfasst. Der Ausdruck "kationische Wiederholungseinheit" wird hierin in seinem üblichen
Sinn derart verwendet, dass er verschiedene positiv geladene chemische Gruppen,
die in das synthetische Polymer, beispielsweise in das Polymerrückgrat oder
in eine Seitenkette, eingebaut sind oder zum Einbau geeignet sind,
bezeichnet. Bevorzugte kationische Wiederholungseinheiten umfassen
eine Amingruppe, die positiv geladen ist. Positiv geladene Amingruppen
umfassen primäre,
sekundäre und
tertiäre
Amine, die unter sauren Bedingungen positiv geladen sind, sowie
quaternäre
Amine, die über
einen breiten pH-Bereich
positiv geladen sind. Vorzugsweise umfassen kationische Wiederholungseinheiten eine
quaternäre
Amingruppe. Ein Poly(amidoamin)dendrimer, Polyethylenimin und Polypropylenimin
sind nichtbeschränkende
Beispiele bevorzugter synthetischer Polymere, die eine kationische
Wiederholungseinheit umfassen.
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Kationische
Wiederholungseinheiten können
in das Polymer durch Polymerisation der entsprechenden kationischen
Monomere oder durch eine Nachreaktion eingebaut werden. Die Polymerisation
kann eine Copolymerisation sein und durch verschiedene Polymerisationsmechanismen
unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken,
die stufenweise und Kettenpolymerisationsmechanismen umfassen, erfolgen,
siehe G. Odian, Principles of Polymerization, 3. Auflage, John Wiley
(1991). Nichtbeschränkende
Beispiele für
bevorzugte kationische Monomere, die zur Polymerisation geeignet
sind, umfassen Spermin, Spermidin, Pentaethylenhexamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin,
N-(3-Aminopropyl)-1,3-propandiamin, Tris(2-aminoethyl)amin, N,N'-Bis(2-aminoethyl)-1,3-propandiamin,
N,N'-Bis(2-aminopropyl)ethylendiamin, N,N'-Bis(2-aminopropyl)-1,3-propandiamin,
1-(2-Aminoethyl)piperazin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin und ein
Poly(amidoamin)dendrimer. Die Namen und chemischen Strukturen von
Beispielen für
bevorzugte kationische Wiederholungseinheiten sowie bevorzugte Monomere,
die zur Bildung kationischer Wiederholungseinheiten polymerisiert
werden können,
sind in 7 angegeben. Kationische Monomere
können
im Handel erhalten werden oder nach dem Fachmann bekannten Verfahren
synthetisiert werden.
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Vernetzte
Polymere können
Polymerketten enthalten, die an anderen Punkten als an ihren Enden
aneinander gebunden sind, siehe G. Odian, Principles of Polymerization,
3. Auflage, John Wiley (1991). Der hierin verwendete Ausdruck "Vernetzungseinheit" bezeichnet eine
chemische Gruppe, die einen Teil des Verbindungspunkts bzw. den
gesamten Verbindungspunkt zwischen den zwei Ketten bildet. Daher
ist eine Vernetzungseinheit an zwei oder mehr Polymerketten an einer
anderen Stelle als den Enden der Ketten gebunden. Vernetzungseinheiten
können
in die Polymerkette durch Bildung des Polymers in Gegenwart eines
geeigneten Vernetzungsmittels oder durch Umsetzung von Polymeren
miteinander unter Bildung von Bindungspunkten eingebaut werden.
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Die
Vernetzungseinheit umfasst vorzugsweise mindestens eine erste abbaubare
Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal, Imin und Hydrazon
ausgewählt
ist, und mindestens eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe
von einem Ester, Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist.
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Die
erste abbaubare Einheit ist vorzugsweise säurelabil und die zweite abbaubare
Einheit ist vorzugsweise hydrolysierbar. Bevorzugte Vernetzungsmittel
umfassen typischerweise polymerisierbare Gruppen, die zur Reaktion
mit den Monomeren geeignet sind, wobei eine Verbindung des gebildeten
Polymers und der Vernetzungseinheit miteinander erhalten wird. Bevorzugte
Vernetzungsmittel können
auch die oben beschriebenen ersten und zweiten abbaubaren Einheiten
umfassen oder die abbaubaren Einheiten können durch eine Nachreaktion
der Vernetzungseinheit, die durch Einbau des Vernetzungsmittels
in das Polymer gebildet wurde, gebildet werden. Bevorzugte Vernetzungsmittel
werden durch die Formel R1 x-(-X-R3-Y-)z-R2 y, worin R1 und R2 für
polymerisierbare Gruppen stehen, R3 für eine Verknüpfungsgruppe
steht, X für
eine erste abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Acetal,
Imin und Hydrazon ausgewählt
ist, steht, Y für
eine zweite abbaubare Einheit, die aus der Gruppe von einem Ester,
Phosphoester, Amid, Anhydrid und Urethan ausgewählt ist, steht, x und y ganze
Zahlen im Bereich von 1-3 sind und z eine ganze Zahl im Bereich
von 1 bis 5 ist, dargestellt. Vorzugsweise sind R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe
von einem Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Isothiocyanat, Isocyanat,
Epoxid, Aldehyd, Acylchlorid, Sulfonylchlorid, Anhydrid, Maleimid,
einer Carbonsäure,
einem Carbonsäureester,
Hydroxyl, Amin und Amid ausgewählt.
Vorzugsweise ist R3 aus der Gruppe von einem
Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffen, Cycloalkyl mit 4 bis 10 Kohlenstoffen,
-(CH2)n-, -(CH2O)n- und -(CH2CH-O2-O)n-, worin n im Bereich von 1 bis etwa 100,
noch besser im Bereich von 1 bis etwa 5 liegt, ausgewählt. Vernetzungsmittel
können
von Handelslieferanten erhalten werden oder nach dem Fachmann bekannten
Verfahren in Abhängigkeit
von der Natur der einzuarbeitenden Gruppen, beispielsweise polymerisierbare
Gruppen, erste abbaubare Gruppe und zweite abbaubare Gruppe, synthetisiert
werden.
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Synthetische
Polymere, die eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit
umfassen, werden vorzugsweise durch Polymerisation eines kationischen
Monomers in Gegenwart eines Vernetzungsmittels hergestellt. Verschiedene
Polymerisationsverfahren können
in Abhängigkeit
von der Natur der polymerisierbaren Gruppen in dem Monomer und des
Vernetzungsmittels verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das kationische Monomer ein aliphatischer, alicyclischer oder
aromatischer Kohlenwasserstoff, der zwei oder mehr aktive Wasserstoffe
derart trägt,
dass das Monomer zur Reaktion mit einem geeigneten Vernetzungsmittel
fähig ist.
Polyamine wie die in 7 angegeben sind Beispiele für bevorzugte kationische
Monomere, die aktive Aminwasserstoffatome tragen. Bevorzugte kationische
Monomere umfassen drei oder mehr aktive Wasserstoffe.
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Eine
schematische Darstellung der Herstellung eines synthetischen Polymers,
das eine kationische Wiederholungseinheit und eine Vernetzungseinheit
umfasst, ist in 1 angegeben. Die Synthese eines
Polymers, das von Pentaethylenhexamin (PEHA) und dem Vernetzungsmittel
BDADPTA abgeleitet ist, ist in den im folgenden angegebenen Arbeitsbeispielen
beschrieben und dient als Richtlinie für andere Syntheseverfahren,
die ähnliche
Verbindungen umfassen, die zur Synthese verschiedener kationischer
Polymere verwendet werden können.
Die Polymerisation kationischer Monomere in Gegen wart eines Vernetzungsmittels
wird vorzugsweise in einem geeigneten Lösemittel oder Suspendiermedium
durchgeführt.
Die Anteile von kationischem Monomer und Vernetzungsmittel sind
unkritisch und können
durch Routinearbeiten bestimmt werden. Für Polyaminmonomere liegt das
Verhältnis
der Reaktionsteilnehmer (ausgedrückt
als die Zahl der Äquivalente
der aminreaktiven funktionellen Gruppe in dem Vernetzungsmittel
zur Zahl der Aminwasserstoffäquivalente im
Polyaminmonomer) vorzugsweise im Bereich von etwa 1:10 bis etwa
1:1. Noch besser wird ein Verhältnis der
Reaktionsteilnehmer im Bereich von etwa 1:5 bis etwa 4:5 verwendet.
Für Vernetzungsmittel
der Formel R1 x-(-X-R3-Y-)z-R2 y ist die Zahl der Äquivalente der aminreaktiven
funktionellen Gruppe gleich x + y. Für Polyamine wie die in 7 angegebenen
ist die Zahl der Aminwasserstoffäquivalente
die Zahl von an die Stickstoffatome gebundenen reaktiven Wasserstoffatomen.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
ist auf eine Trägerzusammensetzung
gerichtet, die das oben beschriebene synthetische Polymer und ein
bioaktives Mittel, das aus der Gruppe von einer Nucleinsäure, einem
Polypeptid, Peptid, Lipid und Kohlehydrat ausgewählt ist, umfasst. Eine "Nucleinsäure" ist ein Polymer,
das mindestens zwei Nucleotide enthält. Ein "Nucleotid" enthält eine Zuckerdesoxyribose
(in DNA) oder eine Ribose (in RNA), eine Base und eine Phosphatgruppe.
Nucleotide sind über
die Phosphatgruppen miteinander verbunden und sie sind die Monomereinheiten
von Nucleinsäurepolymeren.
Der Ausdruck Nucleinsäure umfasst
Desoxyribonucleinsäure
("DNA") und Ribonucleinsäure ("RNA"). DNA kann in der
Form von Antisense-, Plasmid-DNA, Teilen einer Plasmid-DNA, Vektoren,
Expressionskassetten, chimären
Sequenzen, chromosomaler DNA oder Derivaten dieser Gruppen sein.
RNA kann in der Form von Oligonucleotid-RNA, tRNA, snRNA, rRNA,
mRNA, Antisense-RNA, Ribozymen, chimären Sequenzen oder Derivaten
dieser Gruppen sein.
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Ein "Peptid" ist eine natürliche oder
synthetische Verbindung, die zwei oder mehr Aminosäuren, die durch
die Carboxylgruppe von einer Aminosäure und die Aminogruppe einer
anderen verbunden sind, enthält. Die
Klasse der Peptide umfasst viele Hormone, Antibiotika und andere
Verbindungen, die an Stoffwechselfunktionen lebender Organismen
beteiligt sind. "Polypeptid" bezeichnet eine
lineare Reihe von Aminosäureresten, die
durch Peptidbindungen zwischen der alpha-Aminogruppe und der Carboxylgruppe fortlaufender
Aminosäurereste
miteinander verbunden sind. "Lipide" sind eine breite
Gruppe biologischer Substanzen, die primär oder ausschließlich aus
nichtpolaren Gruppen bestehen. Infolge ihres nichtpolaren Charakters
lösen sich
Lipide typischerweise leichter in nichtpolaren Lösemitteln wie Aceton, Ether,
Chloroform und Benzol als in Wasser. Diese Löslichkeitseigenschaft ist in
Zellen von äußerster
Bedeutung, da Lipide dazu tendieren, sich zu nichtpolaren Gruppen
und Barrieren wie in den Zellmembranen, die Grenzen zwischen und
innerhalb von Zellen bilden, zu assoziieren. Neben der Eigenschaft,
dass sie wichtige Rollen in Membranen spielen, werden Lipide in
Zellen als Energiequelle gespeichert und verwendet.
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"Kohlehydrat" ist ein Ausdruck
für eine
große
Klasse polyhydroxylierter Aldehyde und Ketone mit der allgemeinen
Formel Cx(H2O)x. Aldehyde und Ketone enthalten beide eine
Carbonylgruppe. In Ketonen sind die beiden Atome, die an die Carbonylgruppe
gebunden sind, Kohlenstoffe, während
in Aldehyden eines ein Wasserstoff ist.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
ist eine Trägerzusammensetzung,
die vernetzte kationische Polymere gemäß der Beschreibung hierin und
ein biologisch aktives Mittel umfasst. Bevorzugte vernetzte kationische
Polymere besitzen die Eigenschaft, dass sie, wenn sie in Wasser
dispergiert werden, stark über
deren kationische Bereiche mit negativ geladenen biologisch aktiven
Mitteln, vorzugsweise Plasmid- oder
Oligonucleotid-DNA, assoziieren, wodurch die biologisch aktiven
Mittel kompaktiert werden, wodurch eine Trägerzusammensetzung, die das
vernetzte kationische Polymer und das biologisch aktive Mittel umfasst,
gebildet wird. Auf der Basis des Ladungsverhältnisses umfasst die Trägerzusammensetzung
vorzugsweise einen Überschuss
an vernetztem kationischem Polymer, bezogen auf die Nucleinsäure, wodurch
die Adsorption der Trägerzusammensetzung
an Zellmembranen und die Aufnahme des biologisch aktiven Mittels
durch die Zellen ermöglicht
wird.
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Eine
weitere Ausführungsform
ist auf ein Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven Mittels
gerichtet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer lebensfähigen Zelle
mit der oben beschriebenen Trägerzusammensetzung
unter zum Beibehalten der Zellenlebensfähigkeit wirksamen Bedingungen
umfasst. Eine In-vitro-Transfektion (Abgabe eines biologisch aktiven
Mittels in die Kerne von Zellen) wird vorzugsweise durch Inkontaktbringen
einer Zellsuspension mit einem Transfektionsgemisch, das vorzugsweise
zum Zeitpunkt der Verwendung aus einer Lösung der oben beschriebenen
Trägerzusammensetzung
in einem geeigneten Medium erhalten wird, durchgeführt. Die
Transfektionsdauer liegt typischerweise im Bereich von etwa 10 min
bis etwa 48 h in Abhängigkeit
von der Natur der Zellen.
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Ein
bevorzugtes In-vitro-Transfektionsprotokoll ist das folgende: Zellen
werden mit einer Dichte von 10000 Zellen/Vertiefung in einer 96-Vertiefungen-Platte
ausgesät
und in Minimal Essential Medium (MEM), das mit 10 fetalem Rinderserum
(FBS), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und
1,0 mM Natriumpyruvat ergänzt
ist, zum Erreichen von 60-70 % Konfluenz vor der Transfektion gezüchtet. Vor
der Transfektion werden die Zellen gespült und serumfreies oder 10
% FBS enthaltendes Medium wird zu jeder Vertiefung gegeben. Die
Zellen werden mit einer Lösung,
die den Trägerkomplex
und 1 μg
Plasmid-DNA enthält,
4 h bei 37 °C
behandelt. Die Konzentration eines kationischen Polymers wird typischerweise über einen
Bereich von Polymer/DNA-Verhältnissen
variiert. Das Transfektionsgemisch wird durch frisches Medium ersetzt
und die Zellen werden des weiteren 48 h bei 37 °C inkubiert.
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Die
Luciferasegenexpression wird vorzugsweise durch einen Lumineszenzassay
ermittelt. Das Züchtungsmedium
wird entfernt und die Zellen werden zweimal mit PBS gespült und 20
min bei Raumtemperatur in 100 μl
Reporter Lysis Buffer (Promega) lysiert. Das Lysat wird durch Zentrifugation
geklärt
und der Proteingehalt wird durch Verwendung des Micro BCA Protein
Assay Reagent Kit (Pierce) bestimmt. 30 μl des Lysats werden in ein Luminometerröhrchen abgemessen
und die Luciferaseaktivität
wird über
10 s mit einer Messverzögerung
von 2 s in einem Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold, Deutschland)
mit automatischer Injektion von 100 μl von Luciferase Assay Reagent
(Promega) integriert. Die Ergebnisse werden als relative Lichteinheiten
pro mg Zellprotein ausgedrückt.
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In-vivo-Untersuchungen
werden allgemein an Mäusen
oder Kaninchen durch intravenöse
Verabreichung zur Bestimmung der biologischen Verteilung und Kinetik
der Blutclearance der injizierten nackten DNA oder Trägerzusammensetzung
durchgeführt.
Die Zelllebensfähigkeit
ist das Verhältnis
der Zahl der lebenden Zellen, die mit der Trägerzusammensetzung in PBS-Pufferlösung behandelt
wurden, zur Zahl der lebenden Zellen, die nur mit PBS behandelt
wurden. Die Beurteilung der Zellenlebensfähigkeit wird vorzugsweise durch den
MTT- Assay durchgeführt: Zelllebensfähigkeit
(%) = (ODProbe/ODKontrolle) × 100, wobei
ODProbe für die Messung der optischen
Dichte (OD) bei 570 nm der Vertiefungen, die mit der Trägerzusammensetzung
behandelt wurden, steht und ODKontrolle für die Vertiefungen,
die nur mit PBS-Pufferlösung
behandelt wurden, steht. Siehe T. Mosman, "Rapid colorimetric assay for cellular
growth and survival: application to proliferation and cyctotoxicity
assay", J. Immunol.
Methods, 183, 65, 55-63.
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Durch
Einbau von sowohl hydrolysierbaren als auch säurelabilen Eigenschaften in
eine einzige Polymerstruktur gemäß der Beschreibung
in bevorzugten Ausführungsformen
hierin kann der Abbauprozess durch die Verwendung einer Kombination
von beiden Merkmalen, beispielsweise das Ermöglichen eines gesteuerten Abbaus
des Polymers nach der gesteuerten Abgabe des biologisch aktiven
Mittels, gesteuert werden. Diese Erfindung ist nicht durch eine
Theorie gebunden, doch wird angenommen, dass der Abbau im Inneren
des Endosoms beginnt, wo der relativ niedrige pH-Wert (pH = 5,0-5,5)
zur Spaltung von säurelabilen
Bindungen und zur Freisetzung des biologisch aktiven Mittels führt, worauf
der hydrolytische Abbau des verbleibenden Polymers in der Cyctoplasmaumgebung
folgt, was zu kleinen Molekülkomponenten,
die vorzugsweise nichttoxisch sind, führt.
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Trägerzusammensetzungen,
die säurelabile
Verbindungen umfassen, sind besonders günstig zur Abgabe einer aktiven
Substanz an bestimmte Zellen (Tumorzellen und dgl.), wobei der relativ
niedrige pH-Wert den Abbau des Polymers beschleunigt. Bevorzugte
Zusammensetzungen sind relativ einfach herzustellen und einem Scale-up
zugänglich.
Ferner können
zahlreiche nichttoxische kleine Moleküle, die Amingruppen enthalten,
als Anfangskomponenten gewählt
werden, so dass die letztendlichen Abbauendmoleküle nichttoxisch sind. BEISPIEL
1 Synthese
von Vernetzungsmittel (BDADPTA) Stufe
A: Bildung von Benzo-1,4-diacetal-dipentaerythrit (BDADP)
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1,4-Dibenzaldehyd
(10,0 g) wurde in 125 ml Methanol in einem 500-ml-Rundkolben gelöst und auf
45 °C erhitzt.
Getrennt wurden 25,0 Gramm (g) Pentaerythrit in 250 ml von 50:50
Methanol/Wasser bei 45 °C
gelöst.
Die Pentaerythritlösung
wurde dann tropfenweise über
1 h unter Rühren
bei 45 °C
zu der 1,4-Dibenzaldehydlösung
gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 45 °C gerührt. Während dieses Zeitraums bildete sich
ein weißer
Niederschlag, der heißfiltriert
wurde (45 °C)
und mit wässrigem
NaHCO3 gewaschen wurde. Das gewonnene rohe
Produkt wurde von der Ausgangsverbindung Pentaerythrit durch Erhitzen
auf 70 °C
in 200 ml einer NaHCO3-Lösung während 1 h und Heißfiltration
gereinigt. Das feuchte wasserhaltige Produkt wurde dann durch Refluxieren
mit Toluol über
eine Dean-Stark-Wasserfalle und anschließende Filtration nach Kühlen auf
Raumtemperatur getrocknet. 18 g (65 %) Produkt wurden als weißer Feststoff
gewonnen.
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Stufe
B: Bildung von Benzo-1,4-diacetal-dipentaerythrittetraacrylat (BDADPTA)
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BDADP
(25 g) wurden in 500 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) bei 70 °C in einem
mit zwei Tropftrichtern ausgestatteten 1-1-Dreihalsrundkolben gelöst. Das
System wurde mit Argon gespült
und die Lösung
wurde in einem Eisbad gekühlt.
Triethylamin (TEA, 25 g) in 25 ml NMP wurde tropfenweise zugegeben,
worauf tropfenweise 42 g Acryloylchlorid in 25 ml NMP mit einer
etwas langsameren Geschwindigkeit als TEA, um sicherzustellen, dass
die gebildete Lösung
basisch ist, zugegeben wurden. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch
sich auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen und über
Nacht gerührt.
Das NMP wurde durch Ausfällen
des Reaktionsgemischs in durch NaHCO3 basisch
gemachtes Wasser entfernt. Der als Rohprodukt erhaltene Feststoff
wurde dann in DCM gelöst, über MgSO4 getrocknet und über Flashchromatographie (SiO2, Ethylacetat/Hexan: 10/90) gereinigt. Das
Produkt wurde als farbloser Feststoff gewonnen (22,0 g, 56 %).
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BEISPIEL 2
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Herstellung
von vernetztem kationischem Polymer: 0,46 g Pentaethylenhexamin
(PEHA) (von Aldrich) wurden abgewogen und in eine kleine Ampulle
gegeben und 5 ml Methylenchlorid wurden zugegeben. Nach vollständigem Auflösen des
PEHA wurden 0,58 g BDADPTA in 2 ml Methylenchlorid in einer Portion
unter Rühren
bei Raumtemperatur in die PEHA-Lösung
gegeben. Weiteres Methylenchlorid wurde zu der Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen
von etwa 10 ml herzustellen. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde
9 h bei Raumtemperatur gerührt,
bevor es in 100 ml Ether gegeben wurde. Das erhaltene ver netzte
Polymer wurde ausgefällt
und als gelähnlicher
Feststoff nach Zentrifugieren erhalten, worauf Trocknen unter vermindertem Druck
folgte. Das 1H-NMR-Spektrum zeigte, dass
die Acryl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vollständig verschwand.
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BEISPIEL 3
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In-vitro-Transfektionseffizienz:
Dieses Beispiel zeigt, dass das Polymer von Beispiel 2 (Probe 1)
zur Zufuhr von Plasmid-DNA (oder einer anderen biologisch aktiven
Spezies) in die Kerne von Säugerzellen
fähig ist.
Dies wird durch ein Transfektionseffizienzexperiment gezeigt, in
dem die GFP (Green Fluorescence Protein)-Plasmid-DNA als Reportergen
verwendet wurde.
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Verfahren:
Permanente Zellen (293- oder HT1080-Zellen, ATCC) wurden in 24-Vertiefungen-Gewebekulturplatten ausplattiert
(2 × 104 Zellen/Vertiefung für 293-Zellen und 8 × 104 Zellen/Vertiefung für HT1080) und über Nacht
in DMEM (Gibco) mit 10 % FBS (Gibco) inkubiert. Für jede Vertiefung
wurde ein Aliquot von 30 μl
DMEM, das verschiedene Mengen des vernetzten Polymers von Beispiel
2, die DNA/Polymer-Gewichtsverhältnissen
von 16/1 und 8/1 entsprachen, enthielt, tropfenweise in 30 μl DMEM-Lösung, die
0,6 μg Plasmid-DNA
(pCMV-GFP-Plasmid-DNA) enthielt, unter Verwirbeln gegeben. Die Polymer-DNA-Lösungen (Trägerzusammensetzungen)
wurden 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von DNA-Polymer-Komplexen
zu ermöglichen.
150 μl DMEM-Medium,
das 10 % FBS und Antibiotika enthielt, wurden zu dem DNA-Polymer-Komplex
gegeben und dann wurde das Gemisch zu den Zellen in individuellen
Vertiefungen nach Waschen der Zellen mit PBS gegeben. Die Zellen
wurden 3 h inkubiert (37 °C,
7,5 % CO2) und dann wurde das Medium zu
DMEM-Medium, das 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Strepto mycin enthielt,
geändert.
24 h nach der Transfektion wurden GFP-Signale in Zellen unter einem
Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Filter 515-550 nm) beobachtet. Der
Prozentsatz von Zellen mit GFP-Signal in transfizierten Kulturen
wurde aus den Zählraten
von drei Feldern für
optimale kationische Polymermengen bestimmt. Die Transfektionsprozentsätze vernetzter
Polymere, die in 2 angegeben sind, betrugen 50
% (16/1) und 45 % (8/1) verglichen mit einem kommerziellen kationischen
Standardpolymer Nr. 51 mit Transfektionseffizienzwerten von 60 %
(16/1) und 50 % (8/1).
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BEISPIEL 4
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Toxizität des vernetzten
Polymers gegenüber
Zellen: Die Cytotoxizität
des vernetzten kationischen Polymers von Beispiel 2 (Probe 1) auf
Säugerzellen
wurde unter Verwendung eines 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT)-Verfahrens beurteilt. Kurz gesagt wurden HT1080-Zellen, 2 × 104 Zellen/Vertiefung oder 4 × 104 293-Zellen
in 96-Vertiefungen-Platten ausgesät und 16-24 h inkubiert. Ein Aliquot
von 15 μl
DMEM, das das Polymer enthielt, wurde Tropfen für Tropfen in 15 μl DMEM, das
0,3 μg Plasmid
enthielt, gegeben und es wurde 15 min zur Bildung von Polymer/DNA-Komplexen
inkubiert. Fünfundsiebzig
Mikroliter (75 μl)
DMEM wurden zu den Polymer-DNA-Komplexen gegeben und 50 μl des Gemischs
wurden zu den Zellen gegeben und es wurde 3 h inkubiert (37 °C, 7,5 %
CO2). Das Medium wurde dann entfernt und
DMEM-Medium, das 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin
enthielt, wurde zugegeben. Nach weiterer Inkubation während 24
h wurden das Medium entfernt und 10 μl MTT-Lösung (5,0 mg/ml, Sigma) zu
jeder Vertiefung gegeben und es wurde 3 h inkubiert. Das Medium
wurde dann entfernt und 200 μl DMSO
wurden zum Lösen
der Formazankristalle zugegeben. Alle Experimente wurden dreifach
durchgeführt. Die
Extinktion der Lösung
wurde bei 570 nm gemessen. Die Zellenlebensfähigkeiten wurden unter einem
Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Filter 515-550 nm) sichtbar gemacht
und unter Verwendung der Gleichung: Lebensfähigkeit (%) = {Abs570(Probe)/Abs570(Kontrolle)} × 100 berechnet.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Cytotoxizität des vernetzten Polymers signifikant
niedriger als die des kationischen Standard-NDT-Polymers war, da
viel mehr Zellen nach der Transfektion überlebten. Die Ergebnisse sind
graphisch in 3 angegeben (Probe 1 ist das
vernetzte kationische Polymer von Beispiel 2, Nr. 51 ist die kommerzielle
Kontrolle).
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BEISPIEL 5
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Abbau
der vernetzten Polymere in verschiedenen Umgebungen: Um den Abbau
des vernetzten Polymers von Beispiel 2 in verschiedenen Umgebungen
zu beurteilen, wurde eine Probe des vernetzten Polymers von Beispiel
2 (Probe 1) in einer PBS-Pufferlösung mit
einer Konzentration von 5 mg/ml bei sowohl Umgebungstemperatur (~
22 °C) als
auch 37 °C über 4 h,
8 h, 24 h bzw. 48 h inkubiert, um den hydrolytischen Abbau der Proben
unter neutralen Bedingungen zu beurteilen. Proben der verschiedenen,
partiell abgebauten Polymere wurden dann durch Verwendung einer
GFP-Transfektionsmessung beurteilt (4 und 5).
Die gleiche GFP-Transfektionsmessung wurde auch an dem vernetzten
Polymer von Beispiel 2 nach einer Inkubation in einer Pufferlösung von
pH = 5 mit einer Konzentration von 5 mg/ml bei Umgebungstemperatur
(~ 22 °C)
für die
gleichen Zeitabstände
durchgeführt.
In Säure
(6) zeigen die Ergebnisse, dass die Transfektionseffizienz
rasch abnahm, wenn die Inkubationsdauer auf 24 h zunahm. Unter neutralen
Bedingungen war die Probe jedoch stabiler (4 und 5).
Die Transfektionseffizienz der Probe nach der Inkubation in PBS
bei Raumtemperatur über
48 h behielt immer noch 80 % von deren ursprünglichem Wert bei. Eine beschleunigte
Zersetzung wurde bei erhöhten
Temperaturen beobachtet, wobei die Transfektionseffizienz auf 10
von deren ursprünglichem
Wert nach Inkubation in PBS bei 37 °C während 4 h fiel.
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Dem
Fachmann ist klar, dass verschiedene Weglassungen, Zusätze und
Modifikationen bei den oben beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen
gemacht werden können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, und alle derartigen Modifikationen
und Änderungen
sollen in den Umfang der Erfindung, die durch die angehängten Ansprüche definiert
ist, fallen.