DE60018564T2

DE60018564T2 - Funktionsfähige poly-alpha-aminosäurederivate zur modifizierung von biologisch wirksamen stoffen und deren herstellung

Info

Publication number: DE60018564T2
Application number: DE60018564T
Authority: DE
Inventors: Honore Etienne SCHACHT; Veska Toncheva
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 2000-06-19
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2020-06-20
Also published as: DE60018564D1; US7005123B1; EP1189971B1; WO2000078791A3; DK1189971T3; AU5376500A; ES2239602T3; CA2377267A1; WO2000078791A2; EP1189971A2; ATE290564T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung neuer funktioneller Poly-α-Aminosäurederivate, die zur Modifikation von Biomolekülen und zur Oberflächenmodifikation von Biomaterialien von Nutzen sind. Sie betrifft ebenfalls modifizierte synthetische Vektoren, die zum Gentransport bzw. zur Genabgabe von Nutzen sind, die aus den neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivaten gewinnbar sind. Die Erfindung betrifft zusätzlich Antikörper und verschiedene therapeutische Mittel, die durch die neuen Poly-α-Aminosäurederivate modifiziert wurden, wobei diese Konjugate zunehmende Plasmazirkulationszeiten und gesenkte Immunogenität zeigen. Die Erfindung betrifft somit das Gebiet der chemischen Modifikation bioaktiver Moleküle und der Biomaterialwissenschaft. Letztendlich betrifft die vorliegende Erfindung biologisch abbaubare Gegenstände, die zumindest eine Polymersequenz umfassen, gewonnen aus den neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivaten.
Hintergrund der Erfindung
In den letzten Jahrzehnten bestand ein großes Interesse an der Verwendung von Endgruppenfunktionalisiertem Polyethylenglykol zur Modifikation von Peptiden, Proteinen, Enzymen und Nichtpeptidarzneistoffen. Beispielsweise beschreiben A. Abuchowski et al. in J. Biol. Chem., 252, 3578–3581 (1977) und in Cancer Biochem. Biophys., 7, 175–186 (1984), das Modifizieren eines Proteins mittels Polyethylenglykol, das auf Aminoseiten-Ketten entlang des Proteins aufgepfropft war. Es wurde von S. Zalipsky, Bioconjugate Chem., 6, 150–165 (1995) und von C. Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, (3,4), 249–304 (1992) gezeigt, das Polyethylenglykol gepfropfte Proteine in vivo eine längere Halbwertszeit aufweisen, weniger immunogen und thermostabiler sind.
Zalipsky (oben erwähnt), Delgado (oben erwähnt), T. M. Allen et al. in Biochimica et Biophysica Acta, 1237, 99–108 (1995), J. M. Harris, Ed. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, ed., Plenum Press, New York, 1992, and G. Hooftman et al. in J. Bioact. Biocomp. Polymers, 11, 135–159 (1996) haben eine Vielzahl von Verfahren zum Einbringen reaktiver Gruppe am Kettenende von Polyethylenglykol durchgesehen, die in einer selektiven Art und Weise mit funktionellen Seitengruppen eines Proteins reagieren können, beispielsweise Amino-, Thiol-, Guanidyl und dergleichen.
WO 97/36616, WO 98/19710 und E. Schacht et al. in Makromol. Chem. (1992) 193 (12) 3023–30 offenbaren allen Poly-L-glutaminsäurederivate, die durch zunächst Umsetzen von 4-Nitrophenylchlorformiat mit Poly(N(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin) gewonnen werden. Diese Derivate tragen somit reaktive Gruppen an den hängenden Seitenketten des Polymers.
Kürzlich wurde Polyethylenglykol zur Modifikation synthetischer Vektoren zur Genabgabe verwendet, um Komplexe mit DNA vor Interaktionen mit Plasmaproteinen und Erythrocyten und vor einer enzymatischen Degradation bzw. Abbau in extra- und intrazellulären Kompartimenten zu bewahren (siehe beispielsweise M. Ogris et al., Gene Therapy (1999), 6: 595–605).
In der Biomaterialwissenschaft wurde das Aufpfropfen einer Polymermaterialoberfläche mit Polyethylenglykolketten (hierin nachstehend als „PEG-ylierung" bezeichnet) umfassend als Verfahren zur Verbesserung der Oberflächenbiokompatibilität beschrieben. Die Oberflächen-PEG-ylierung kann durch chemisches Aufpfropfen von Polyethylenglykol auf vorgeformten Oberflächen ebenso wie durch Aufbringen eines Polymers mit Polyethylenglykol als Baubestandteil seines Grundgerüstes oder alternativ als aufgepfropfte Seitengruppe erreicht werden. Solche Polymere können als Kernmaterial verwendet werden oder können als Oberflächenbeschichtung aufgebracht werden.
Polyethylenglykol ist ein ziemlich stabiles Polymer, das für die Proteinadhäsion ein Repellens darstellt und die dem enzymatischen oder hydrolytischen Abbau unter physiologischen Bedingungen nicht unterworfen ist. Jedoch sind biomedizinische Anwendungen für verbesserte biokompatible Polymermaterialien sehr zeitintensiv. Es besteht insbesondere dahingehend eine Besorgnis, daß Polyethylenglykol, das nicht biologisch abbaubar ist, Schwierigkeiten dabei aufweist, die Zellen zu verlassen und in Zellen gespeichert werden könnte, siehe J. Lloyd, Biochem. J. 261, 451–456 (1989). Es besteht deswegen ein Bedarf in der Technik zum Ersatz von Poly- ethylenglykol in solchen biomedizinischen Anwendungen durch ein Polymer mit ähnlichen Eigenschaften, das jedoch biologisch abbaubar ist. Auf einem anderen Gebiet besteht ein Bedarf nach dem permanenten Aufpfropfen von Polymerketten auf eine Polymermaterialoberfläche. Die oben erwähnten Probleme werden durch das Polymer und die Copolymerderivate, wie in dieser Erfindung beschrieben, gelöst, die Funktionalitäten enthalten, die zur Befestigung bzw. Anlagerung bzw. Bindung bioaktiver Substanzen verwendet werden können, beispielsweise kurzer Peptidmoleküle wie beispielsweise dem Tripeptid RGD (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) und dgl. oder von Sacchariden und Oligosacchariden wie beispielsweise Mannose und Galactose. Auf einem noch weiteren Gebiet besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, verbesserte Synthesevektoren bereitzustellen, die als Trägervehikel für die effiziente und wirksame Abgabe bzw. Transport von Nukleinsäurematerial und zur Transfektion von Zielzellen dienen, insbesondere in Verbindung mit der Gentherapie oder sogar möglicherweise in Verbindung mit der Entwicklung von DNA-Vakzinen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Poly-α-Aminosäurederivate bereit, vorzugsweise wasserlösliche Poly-α-Aminosäurederivate, die eine funktionelle (d. h. reaktive) Gruppe an einem oder beiden Enden des Polymergrundgerüstes und/oder nur eine einzige funktionelle Gruppe als Seitengruppen auf dem Polymergrundgerüst aufweisen, wobei die funktionelle Endgruppe und/oder Seitengruppe keine Alkoholgruppe sind. Gemäß eines zweiten Aspektes stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solcher neuen Poly-α-Aminosäurederivate bereit. In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung solcher neuen Poly-α-Aminosäurederivate zur Modifikation eines biologisch aktiven Inhaltstoffes wie beispielsweise eines Arzneistoffes, Peptides, Proteins, eines Enzyms, Antikörpers oder dgl. bereit, ebenso wie als Ergebnis einer solchen Modifikation, beispielsweise das Reaktionsprodukt der Kopplung solcher neuen Poly-α-Aminosäurederivate zusammen mit einem biologisch aktiven (beispielsweise therapeutischen) Inhaltsstoff. Gemäß eines vierten Aspektes stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Synthesevektors bzw. synthetischen Vektors bereit, der mittels solcher neuer Poly-α-Aminosäurederivate zum Gentransport modifiziert wurde. In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung verbesserte Verfahren zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Patienten bereit, einschließlich der Verabreichung therapeutisch aktiver Inhaltsstoffe, die mittels solcher neuen Poly-α-Aminosäurederivate modifiziert worden sind. In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung biologisch abbaubare Gegenstände bereit, die zumindest eine Polymersequenz umfassen, abgeleitet von den neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivaten und wahlweise eine oder mehrere Polymersequenzen, die von Monomeren abgeleitet sind, die damit copolymerisierbar sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung eines aktivierten Monomer-Verfahrens zur Herstellung der linearen Poly-α-Aminosäurederivate der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine Darstellung der Biodegradationseigenschaften von Poly(N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin) (hierin als PHEG bezeichnet).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung neue Poly-α-Aminosäurederivate, die an einem oder beiden Enden des Polymergrundgerüstes eine funktionelle (d. h. reaktive) Gruppe und/oder nur eine einzige funktionelle Gruppe als Seitengruppe am Polymergrundgerüst aufweisen, wobei die funktionelle Endgruppe und/oder Seitengruppe von Alkohol verschieden ist. Diese Ausführungsform betrifft insbesondere linear Poly-α-Aminosäurederivate, die zumindest Glutaminsäure-, Asparaginsäure-, Serinwiederholungseinheiten bzw. Grundeinheiten aufweist und zusätzlich eine funktionelle (d. h. reaktive) Gruppe an einem oder beiden Enden des Polymergrundgerüstes aufweist und/oder nur eine einzige funktionelle (d. h. reaktive) Gruppe als Seitengruppe am anderen Polymergrundgerüst, wobei die funktionelle Endgruppe und/oder Seitengruppe von Alkohol verschieden ist. Der Grund zur Bereitstellung einer einzigen funktionellen Gruppe, wenn sie als Seitengruppe am Polymergrundgerüst angehängt ist, ist die Fähigkeit, eine sehr präzise Kopplung des Poly-α-Aminosäurederivates der Erfindung mit speziellen Proteinen zu erreichen. Die funktionelle (d. h. reaktive) Endgruppe und/oder Seitengruppe kann irgendeine reaktive Gruppe sein, die von Alkohol verschieden ist, die an jedes Ende des Grundgerüstes des Poly-α-Aminosäurederivates, das zumindest Glutaminsäure- oder Asparaginsäure- oder Serinsäurewiederholungseinheiten aufweist gebunden und/oder angehängt sein kann. Es kann insbesondere aus den folgenden funktionellen Gruppen ausgewählt sein: funktionalisierte N-Acylamin, Ester, Carbonat, Thiol, Thiolvorläufer (wie beispielsweise Disulfid), Thioisocyanat, Thiocarbonat, Urea, Thiourea, Aldehyd, Acetal, N-Carboxyanhydrid, Oxycarbonyl (einschließlich Carbonatester, 2-Oxycarbonylpyridin, 2-Oxycarbonyloxypyridin, Succinimidocarbonat, N-Oxycarbonylimidazol und dergleichen), Maleimid oder irgendwelche Vinylgruppen, die für eine radikalische, anionische oder kationische Polymerisation geeignet sind wie beispielsweise Styryl, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylether, Propenylether. Die Begriffe „Glutamin", „Aparagin" und „Serin", wie hierin verwendet, sollen, soweit nichts anderes angegeben ist, die von Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Serin abgeleitete α-Aminosäuresequenz aufweisen oder, falls verfügbar, von irgendeinem Ester oder Amid solcher Säuren. Diese Ausführungsform betrifft insbesondere lineare Polymere, die mehrere Wiederholungseinheiten der folgenden Formel aufweisen. -CO-CHR-NH- wobei:

– R als -(CH₂)_n-CO-OR₁ oder -(CH₂)_n-CO-NHR₂ oder CH₂OH definiert ist,
– n 1 oder 2 ist,
– R₁ aus Wasserstoff, C_1-20 Alkyl, Polyhalo-C_1-6-Alkyl, Aryl-C_1-6-Alkyl und Heteroaryl-C_1-6-Alkyl ausgewählt ist und
– R₂ mit zumindest einer Alkoholgruppe C_1-6Alkyl substituiert ist,

Wie nachstehend ausführlicher dargelegt wird, sind die neuen Poly-α-Aminosäurederivate dieser Erfindung nicht auf Homopolymere beschränkt, die die Glutamin-, Asparagin- oder Serinwiederholungseinheiten umfassen, sondern sie schließen ebenfalls Copolymere ein, die zusätzlich Wiederholungseinheiten eines oder mehrerer Comonomere umfassen (hierin als A in der nachfolgenden Formel bezeichnet), die mit der von Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Serin abgeleiteten α-Aminosäuresequenz copolymerisierbar sind (beispielsweise wie hierin vorstehend definiert, d. h. einschließlich von Estern oder Amiden hiervon, falls verfügbar). Nicht einschränkende Beispiele solcher Comonomerwiederholungseinheiten schließen beispielsweise irgendeine der 17 natürlich vorkommenden α-Aminosäuren, die nicht Glutaminsäure, Asparaginsäure und Serin sind (in welchem Falle entweder zufallsbedingte oder Blockcopolymere entstehen würden), ebenso wie Polymerblocks oder Sequenzen ein, die von Ethylenoxid oder Propylenoxid oder Gemischen hiervon oder von Polyhydroxyalkanoaten abgeleitet sind. Beispiele für die letztere Polymersequenzen umfassen beispielsweise Polymer und Copolymere (gleichgültig ob zufallsbedingt, Block, segmentiert oder aufgepfropft) von Lactonen wie beispielsweise Caprolacton, Glycolid, L-Lactid, D-Lactid, meso-Lactid, 1,4- Dioxan-2-on, Trimethylencarbonat (1,3-Dioxan-2-on), γ-Butyrolacton, δ-Valerolacton, 1,5-Dioxepan-2-on, 1,4-Dioxepan-2-on, 3-Methyl-1,4-dioxan-2,5-dion, 3,3 Diethyl-1,4-dioxan-2,5-on, ε-Decalacton, Pivalolacton und 4,4-Dimethyl-1,3-dioxan-2-on und dergleichen. Mehrere Ausführungsformen solcher Copolymere wurden unter anderem im US Patent Nr. 5,951,997, US Patent Nr. 5,854,383 und US Patent Nr. 5,703,200 beschrieben und sollen deswegen im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden.
In den obigen Definition von Gruppen, die in Formel (I) der Wiederholungseinheiten eingeschlossen sind und in anderen Teilen der vorliegenden Beschreibung sollen die Begriffe, soweit nichts anderes angegeben ist, die folgenden Bedeutungen aufweisen:

– Halo bedeutet generisch Fluor, Chlor, Brom und Iod;
– C_1-6Alkyl definiert geradkettige oder verzweigtkettige gesättete Kohlenwasserstoffradikale mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, n-Butyl, 1-Methylethyl, 2-Methylpropyl, Dimethylethyl, 2-Methylbutyl, n-Pentyl, Dimethylpropyl, n-Hexyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl und dergleichen;
– C_1-2Alkyl bedeutet und soll einschließen C_1-6Alkyl (wie oben beschrieben definiert) und die höheren Homologe hiervon mit 7 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise n-Heptyl, 2-Ethylhexyl, n-Octyl, n-Decyl, n-Dodecyl, n-Hexadecyl, n-Octadecyl und dergleichen;
– PolyhaloC_1-6Alkyl ist als polyhalosubstituiertes C_1-6 Alkyl definiert, insbesondere C_1-6 Alkyl substituiert mit bis zu 8 Halogenatomen wie beispielsweise Difluormethyl, Trichlorethyl, Trifluormethyl, Octafluorpentyl und dergleichen;
– Aryl ist als mono- oder polyaromatische Gruppe definiert, wie beispielsweise Phenyl, wahlweise mit einem bis drei Substituenten substituiert, jedoch unabhängig ausgewählt aus C_1-6 Alkyl, Nitro, Cyano, Halo und dergleichen;
– Heteroaryl ist als mono- oder polyheteroaromatische Gruppe definiert, d. h. die delokalisierte π Elektronen enthalten, wie beispielsweise solche, die ein oder mehrere Heteroatome einschließen, nämlich 1-Hetero-2,4-Cyclopentadienyl, Azabenzenyl und fusionierte Ringderivate hiervon, insbesondere Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Furanyl, Thienyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Pyranyl, Pyridazinyl, Triazinyl, Tetrazinyl, Benzothienyl, Isobenzothienyl, Benzofuranyl, Isobenzofuranyl, Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Purinyl, Pyrazolopyrimidinyl, Benzimidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Cinnolinyl, Phtalazinyl, Chinazolyl, Chinoxalinyl, Thiazolopyridinyl, Oxazolopyridinyl und Imidazothiazolyl, einschließlich aller möglichen isomeren Formen hiervon, wobei jede der genannten heteroaromatischen Gruppen wahlweise mit einem oder wenn möglich zwei oder mehr Substituenten substituiert sein kann, die jeweils unabhängig aus C_1-4Alkyl (wie beispielsweise N-Alkyl-2,5-Dialkylpyrrolyl, 2,5-Dialkylfuranyl und 2,5-Dialkylthienyl), C_1-4 Alkylcarbonyl, Hydroxy, Nitro, Halo und Cyano ausgewählt sind;
– C_3-7-Cycloalkyl generisch Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl ist.

Wenn die α-Aminosäuresequenz des Poly-α-Aminosäurederivates dieser Erfindung eine L-Aminosäuresequenz ist, wird das sich ergebende Polymer einen enzymatischen Abbau durchmachen und kann bequem für irgendeinen Zweck in der Biomaterialtechnologie verwendet werden, bei dem Polyethylenglykol bis jetzt verwendet wurde, einschließlich der chemischen Modifikation von Biomolekülen. Andererseits, wenn die α-Aminosäuresequenz des Poly-α-Aminosäurederivates dieser Erfindung eine D-Aminosäuresequenz ist, wird das sicher ergebende Polymer gegenüber peptidabbauenden Enzymen stabil sein und kann bequem zur permanenten Oberflächenmodifikation von Biomaterialien verwendet werden.
Als allgemeine Regel können die neuen multifunktionellen (d. h. zumindest zwei reaktive Gruppen, wie beispielsweise oben definiert an den Enden und/oder an der Seite des Grundgerüstes aufweisend) Poly-α-Aminosäurederivate der vorliegenden Erfindung durch irgendeine der nachfolgenden Formeln beschrieben werden: V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W (IIa) V-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x-W (IIb) V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x,-W (IIb)
wobei:

– R wie in Formel (I) definiert ist,
– X oder, falls anwendbar, x + x' sich von 2 bis ungefähr 2.000 bewegen, vorzugsweise von 4 bis ungefähr 500,
– jedes von V und W unabhängig eine funktionelle (d. h. reaktive) Gruppe repräsentiert, die dazu in der Lage ist, an das Ende oder an die Seite des Polymergrundgerüstes bzw. -rückgrates, das die Wiederholungseinheiten der Formel (I) enthält, gebunden zu werden,
– A zumindest ein Comonomer ist, das mit der α-Aminosäuresequenz copolymerisierbar ist, die Glutamin- oder Aspargin- oder Serinwiederholungseinheiten aufweist,
– y sich von 0 bis ungefähr 500, vorzugsweise von 0 bis ungefähr 100 bewegt,
– T eine Abstandseinheit ist, ausgewählt aus Lysin und Ornithin und
– V' eine nicht reaktive Endgruppe ist.

In der obigen Definition sollte „nicht reaktive Endgruppe" als eine chemische Gruppe aufgefaßt werden, die nicht zur Kopplung von Proteinen verwendet werden kann. Nicht einschränkende Beispiele für solche nicht reaktiven Endgruppen schließen C_1-20 Alkyl, Oxy C_1-20 Alkyl, Aryl, Aryl C_1-20 Alkyl, Amid, Heteroaryl und Heteroaryl C_1-20 Alkyl ein.
Wie früher erwähnt kann A beispielsweise durch die Formel -CO-CHR'-NH- repräsentiert werden, wobei R' die Seitenkettengruppe einer α-Aminosäure ist, die von Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Serin verschieden ist. Beispielsweise kann R' die Seitenkettengruppe irgendeiner der anderen 17 gut bekannten, natürlich vorkommenden α-Aminosäuren sein, beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin, Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Threonin, Tyrosin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan.
In einer anderen Durchführungsart der Erfindung kann A durch die Formel -CH₂-CHR''-X'- repräsentiert werden, wobei:

– R'' aus Wasserstoff und Methyl ausgewählt ist, und
– X' aus einer Einfachbindung und Sauerstoff ausgewählt ist,

_Y

In einer noch weiteren Durchführungsart der Erfindung kann A zumindest eine Wiederholungseinheit sein, die aus einem Hydroxyalkanoat, wie beispielsweise D oder L Milchsäure, Glycolsäure, ε-Caprolacton und dergleichen abgeleitet ist. Beispielsweise führt eine Kopplung eines aminoterminierten Poly-α-Aminosäurederivates dieser Erfindung mit einem Polyhydroxyalkanoat (basierend auf einem oder mehreren der oben erwähnten Wiederholungseinheiten), das ein oder zwei Hydroxylendgruppen aufweist, beispielsweise in Gegenwart von Carbonyldimidazol, zu amphiphilen Di-Block oder Tri-Block-Copolymeren, die in geeigneter Weise vom Fachmann entwickelt dazu in der Lage sind, in einem wäßrigen Medium Mizellen zu bilden und somit in geeigneter Weise als Arzneistoffabgabesystem verwendet werden können, nämlich um hydrophobe Arzneistoffe in den sich ergebenden Mizellen zu speichern.
In ähnlicher Weise könnten die neuen multifunktionellen (d. h. eine einzige reaktive Gruppe am einen Ende oder an der Seite des Polymergrundgerüstes aufweisenden) Poly-α-Aminosäurederivate der vorliegenden Erfindung durch irgendeine der nachfolgenden Formeln beschrieben werden: V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W (Va) V'-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W (Vb) V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x-W' (Vc) V'-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x-W' (Vd)
wobei:

– R, x, x', A, y, T, V, V' und W wie in den Formeln (IIa) bis (IIe) definiert sind und
– W' eine nicht reaktive Endgruppe wie beispielsweise eine solche ist, die bezüglich V' definiert ist.

Eine erste bevorzugte Klasse neuer Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung ist eine Klasse von Derivaten mit zumindest einer protektiven bzw. Schutzendgruppe, die durch die nachfolgenden Formeln repräsentiert sind:
wobei:

– R-(CH₂)_n-CO-NHR₂ ist,
– R₂ und n wie in Formel (I) definiert sind,
– x wie in den Formeln (IIa) bis (IIe) definiert ist,
– X₁ -R₄-Z₁-A₁ ist,
– wobei jedes von R₃ und R₄ unabhängig aus (CH₂)_m, Arylen, C_1-6 Alkylarylen und Aryl C_1-6 Alkylen ausgewählt ist,
– m von 2 bis 20 ist,
– Y₁ -Z₂-A₂, X₂ -R₄-Z₃-A₃ oder -O-R₄-Z₃-A₃ ist,
– Y₂ -Z₄-A₄ ist,
– jedes von Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ unabhängig aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist,
– jedes von A₁, A₂, A₃ und A₄ eine Schutzgruppe ist, die jeweils für Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ geeignet ist, und
– R₅ aus Wasserstoff, C_1-6 Alkyl, Aryl und C_1-6 Alkylaryl, Heteroaryl und C_1-6 Alkylheteroaryl ausgewählt ist.

Die Schutzgruppen A₁, A₂, A₃ und A₄, die zum schützen von Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ geeignet ist, d. h. NH, O, S, CO, CS und C=N-R₅ sind dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen und Peptidchemie wohlbekannt. Ein veranschaulichendes, jedoch nicht einschränkendes Beispiel einer Gruppe, die zum schützen der Aminogruppe NH geeignet ist, ist beispielsweise -C(O)-O-CH₂-C₆H₅. Illustrative, jedoch nicht einschränkende Beispiele einer Gruppe, die zum Schützen des Schwefelatomes geeignet sind, schließen Triphenylmethyl, 2-Thiopyridyl und Acyloxymethyl ein. Illustrative, jedoch nicht einschränkende Beispiele für eine Gruppe, die für Schutzgruppen geeignet ist, wie beispielsweise CO, CS und C=N-R₅ oder des Sauerstoffatoms sind beispielsweise Tetrahydropyranyl, tert-Butyl und dergleichen.
Eine weitere bevorzugte Klasse neuer Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung, die namentlich als Zwischenprodukte zur Herstellung der Derivate von Formel (VII) dienen können, wird durch die folgende Formel repräsentiert: X₁-NH-[CO-CHR-NH]_x-CO-CHR-NH₂ (IX)wobei:

– X₁ wie in Formel (VII) definiert ist,
– x wie in einer der Formeln (IIa) bis (IIe) definiert ist,
– R als -(CH₂)_n-CO-OR₁ definiert ist und
– R₁ und n wie in Formel (I) definiert sind.

Eine weitere bevorzugte Klasse neuer Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung, die namentlich als Zwischenprodukte dienen können, wird durch Formel (VIII) definiert, wobei R als -(CH₂)_n-CO-OR₁ anstelle von -(CH₂)_n-CO-NHR₂ definiert ist.
Eine weitere bevorzugte Klasse von Derivaten weist reaktive Endgruppen auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppen gekoppelt werden können, ausgewählt aus Amin, Alkohol, Thiol, Carbonsäure, Disulfid und Maleimid, oder die polymerisierbare Endgruppen enthalten können. Sie können jeweils durch die Formeln (X) und (XI) repräsentiert werden:
wobei:

– R -(CH₂)_n-CO-NHR₂ ist,
– R₂ und n wie in Formel (I) definiert sind,
– x wie in einer der Formeln (IIa) bis (IIe) definiert sind,
– X₁ -R₄-Z₁-D₁ ist,
– jedes von R₃ und R₄ unabhängig aus (CH₂)_m, Arylen, C_1-6 Alkylarylen und Aryl C_1-6 Alkylen ausgewählt ist,
– m von 2 bis 20 ist,
– jedes von R₃-Y₁ und R₃-Y₂ eine Gruppe sein kann, die eine Vinylendgruppe einschließt, wie beispielsweise Ethylidenyl oder Styryl,
– X₂ -R₄-Z₃-D₃ ist,
– jedes von Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ unabhängig aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist,
– jedes von D₁, D₂, D₃ und D₄ unabhängig aus Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Succinimidyl, Vinyl, C_1-6 Alkylcarbonyl ausgewählt ist,
– jedes von Z₁-D₁, Z₂-D₂, Z₃-D₃ und Z₄-D₄ unabhängig aus Maleimidyl, Disulfid, α-Haloacetoxy und C_1-6 Alkyloxymethylsulfid ausgewählt sein kann, und
– R₅ aus Wasserstoff, C_1-6 Alkyl, Aryl und C_1-6 Alkylaryl, Heteroaryl und C_1-6 Alkylheteroaryl ausgewählt ist.

Vorzugsweise sollte in der obigen Klasse reaktiver Derivate (X) und (XI) D₁ von D₂ verschieden sein und D₃ sollte von D₄ verschieden sein, ansonsten kann ein gewisses Ausmaß an Vernetzung nicht ausgeschlossen werden.
Eine noch weitere Klasse neuer Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung ist eine Klasse von Derivaten mit nur einer einzigen reaktiven Seitengruppe, die von Alkohol verschieden ist, am Polymergrundgerüst. Eine weitere bevorzugte Klasse neuer Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung ist eine Klasse von Derivaten mit zwei reaktiven Gruppen an beiden Enden des Polymergrundgerüstes und mit zusätzlich nur einer einzigen reaktiven Seitengruppe am Polymergrundgerüst, wobei die reaktiven Gruppen von Alkohol verschieden sind.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Gewinnung der neuen multifunktionellen und heterobifunktionellen Poly-α-Aminosäurederivate, die hierin oben beschrieben sind (der Begriff „heterobifunktionell" sollte als Derivate umfassend verstanden werden, die die obigen Formeln aufweisen und bei die funktionellen Gruppen V und W voneinander verschieden sind). Als allgemeines Verfahren schließen solche Prozesse einen Schritt ein, der das Polymerisieren eines Monomers oder eines Gemisches von Monomeren, das zumindest das N-Carboxy-Anhydrid einer Aminosäure umfaßt, ausgewählt aus Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin und sauerstoff-geschütztem Serin in Gegenwart einer wirksamen Menge eines multifunktionellen Starters, der zumindest eine primäre Aminogruppe enthält und weiterhin zumindest weiter eine funktionelle Gruppe enthält, die aus Maleimid, Thioisocyanat, Thiocarbonat, Urea, Thiourea, Aldehyd, Acetal, Oxycarbonyl, Vinyl (wie beispielsweise Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Methacrylamid und dergleichen), Ester, Carbonat, Thiolvorläufer, geschütztes Amin und geschützte Carbonsäure und/oder in Gegenwart einer wirksamen Menge eines bifunktionellen Terminierungsreagenzes umfaßt. Der Begriff „sauerstoffgeschütztes Serin", „geschütztes Amin" und „geschützte Carbonsäure" wie hierin verwendet, werden vom Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie wohl verstanden. Illustrative und nicht einschränkende Beispiele der üblichen multifunktionellen Starter schließen Aminosäureester, α-Amino-ω-di C_1-6 Alkylacetale, α,α'-Diamino C_1-6 Alkyldisulfide und α-Amino-ω-Maleimidoalkansäureamide ein. Ein Start unter Verwendung eines multifunktionellen Starters und die Termination durch Zusetzen eines multifunktionellen Terminierungsreagenzes ebenso wie der Start unter Verwendung eines monofunktionellen Starters und die Termination durch Zusätzen eines bifunktionellen Terminationreagenzes führt zur Derivaten mit nur einer einzigen funktionellen (d. h. reaktiven) Gruppe am einen Ende des linearen Polymergrundgerüstes. Eine Kombination aus multifunktionellen Initiations- und bifunktionellen Terminationsreaktionen stellt ein Polymer mit funktionellen (d. h. reaktiven) Gruppen an beiden Enden des linearen Polymergrundgerüstes bereit.
Der Start durch ein Diamin mit einer geschützten Carboxylgruppe wie beispielsweise des Terbutylester- oder die ω-Aminoalkylacylderivate von Lysin oder Ornithin führen zu einem Poly-α-Aminosäurederivat, das eine einzigen hängende geschützte Carboxylseitengruppe aufweist. Wenn das Terminierungsreagenz monofunktionell ist, dann werden die Kettenenden nicht reaktiv sein. Wenn das Terminierungsreagenz heterobifunktionell ist, dann werden die Kettenenden reaktiv sein. Wenn kein Terminierungsreagenz verwendet wird, dann wird das Polymergrundgerüst Aminoendgruppen aufweisen.
Wenn während der Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin oder sauerstoff-geschütztem Serin eine Termination durch Bildung eine Pyrrolidonendgruppe eintritt, dann wird dieses Verfahren nur zur Herstellung von Derivaten anwendbar sein, die eine einzige funktionelle Gruppe aufweisen. Jedoch können in einem solchen Fall heterofunktionelle Derivate noch durch das alternative, sogenannte „aktivierte Monomerverfahren" hergestellt werden, das unten beschrieben ist und das schematisch in 1 dargestellt ist.
Nicht einschränkende Beispiele multifunktioneller Initiatoren bzw. Starter, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind: Trityl-NH-(CH₂)_n-NH₂ n = 2–25
Trityl-S-(CH₂)_n-NH₂
H₂N-(CH₂)_n-S-S-(CH₂)_n-NH₂
Der Starter mit der Formel (XII), der durch Umsetzen einer im Handel erhältlichen Verbindung, repräsentiert durch Formel (XIV) hierin unten mit einem Diamin H₂N-(CH₂)_n'-NH₂ gewonnen werden kann, ist angenommenermaßen ein neues organisches Reagenz ebenso wie der Starter (XIII), der durch Umsetzen von Monotritylamin mit N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionat gewonnen werden kann.
Nicht einschränkende Beispiele von Terminationsreagenzien, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind:
Illustrative, jedoch nicht einschränkende Beispiele für die Hauptmonomere, die zur Durchführung des oben erwähnten Polymerisationsschrittes des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die N-Carboxyanhydride von γ-Methyl, γ-Benzyl und γ-Trichlorethylglutamaten und die N-Carboxyanhydride von β-Methyl, β-Benzyl und β-Trichlorethylaspartaten ein. Wie vorher gezeigt kann das Verfahren der Erfindung die Copolymerisation eines Comonomers wie beispielsweise des N-Carboxyanhydrids einer anderen α-Aminosäure miteinschließen.
Der Polymerisationsschritt des Verfahrens dieser Erfindung findet vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels für die oben beschriebenen Monomere, insbesondere das N-Carboxyanhydrid von Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin und sauerstoff-geschütztem Serin, statt. Beispiele für solche Lösungsmittel sind vorzugsweise aprotische Lösungsmittel, die chlorierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise 1,2-Dichlorethan, Amide wie beispielsweise Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Ester wie beispielsweise Ethylacetat und dergleichen einschließen. Abhängig von der Art des ausgewählten Lösungsmittels kann sich die Polymerisationstemperatur von ungefähr 0°C bis ungefähr 100°C bewegen vorzugsweise von 10–30°C. Die Polymerisation wird üblicherweise für eine Zeitspanne von ungefähr 0,25 bis 72 Stunden, vorzugsweise von 1–24 Stunden, bewirkt, abhängig von dem anvisierten Molekulargewicht.
Die Menge der multifunktionellen Initiators, der zumindest eine primäre Aminogruppe enthält und im Polymerisationsschritt des Verfahrens der Erfindung verwendet werden soll, bewegt sich vorzugsweise zwischen ungefähr 0,2 und 30 Mol% bezüglich des N-Carboxyanhydridmonomers. Die Menge des bifunktionellen Terminationsreagenzes, das im Polymerisationsschritt des Verfahrens der Erfindung verwendet werden soll, bewegt sich vorzugsweise zwischen ungefähr 2 und 5 Äquivalenten bezüglich der molaren Menge des verwendeten multifunktionellen Initiators.
Folgend dem Polymerisationsschritt kann das Verfahren der Erfindung eine Aminolyse der hängenden R₁ Gruppe der Wiederholungseinheit von Formel (I) mittels einer wirksamen Menge eines Aminoalkohols einschließen, beispielsweise 2-Aminoethanol, 2,3-Dihydroxypropylamin in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Aktivierungsmittels oder eines Reaktionspromotors wie beispielsweise 2-Hydroxypyridin, N,N-Dimethylaminopyridin, N-Methylimidazol und dergleichen. Eine wirksame Menge des Aminoalkohols, der während des Aminolyse-Schrittes verwendet werden soll, bewegt sich üblicherweise von ungefähr 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 5 Äquivalenten bezüglich der Monomereinheiten des im vorherigen Polymerisationsschritt gebildeten Polymers. Eine wirksame Menge des Aktivierungsmittels oder des Reaktionspromotors, der während der Aminolyse verwendet werden soll, bewegt sich üblicherweise von 0,5 bis 5 Äquivalenten bezüglich der Monomereinheiten im Polymer, das im vorherigen Polymerisationsschritt gebildet wurde. Der Aminolyseschritt des Verfahrens dieser Erfindung findet vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels für das Polymer statt, das vom N-Carboxyanhydrid von Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin oder sauerstoff-geschütztem Serin abgeleitet ist. Beispiele für geeignete Lösungsmittel für diesen Aminolyseschritt sind namentlich aprotische Lösungsmittel, einschließlich Amide wie beispielsweise Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Ester wie beispielsweise Ethylacetat und dergleichen.
Beispielsweise kann die Synthese von Poly (N⁵-(2-hydroxyethyl)L-glutamin) (PHEG) durch zunächst Polymerisieren des N-Carboxyanhydrids von γ-Benzyl-L-glutamat oder γ-Trichlorethyl-L-glutamat, gefolgt von Aminolyse des sich ergebenden Poly-γ-benzyl-L- glutamats oder Poly-γ-trichlorethyl-L-glutamats unter Verwendung eines großen Überschusses von 2-Aminoethanol in Gegenwart von 2-Hydroxypyridin durchgeführt werden.
Der erste Weg zur Gewinnung der neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivate der Erfindung ohne Termination aufgrund der Bildung einer Pyrrolidonendgruppe kann durch die Folge chemischer Reaktionen repräsentiert werden, die in 1 dargestellt sind und die nunmehr ausführlicher erklärt wird:
a) Polymerisationsschritt:
b) Endgruppenfunktionalisierungsschritt
Dieser Schritt schreitet durch Reaktion der Verbindung von Formel (IX) mit einem reaktiven Ester oder Anhydrid mit der Formel Y₁-R₃-COOR₆ voran, wobei R₆ ein reaktiver Ester oder Anhydrid ist.
c) Aminolyseschritt
wobei R -(CH₂)_n-CO-NHR₂ ist.
Mono- und bifunktionelle Poly-α-Aminosäurederivate gemäß der Erfindung können ebenfalls alternativ durch den sogenannten „aktivierten Monomermechanismus" der Polymerisation von N-Carboxyanhydriden wie schematisch in 1 dargestellt, hergestellt werden:
a) Herstellung eines geeigneten N-Carboxyanhydridgemisches aus der α-Aminosäure.
Im ersten Schritt wird ein Teil der relevanten α-Aminosäure (beispielsweise Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Serin) N-acyliert, beispielsweise mittels eines Haloformiates oder Carbonylhalogenids, das die Formel X₂COX aufweist, wobei X ein Halogenatom wie beispielsweise Chlor ist und X₂ wie in Formel (VIII) definiert ist, darauf werden sowohl die N- acylierte α-Aminosäure als auch der verbleibende Anteil derselben α-Aminosäure separat behandelt, beispielsweise mittels Phosgen oder Diphosgen, um die beiden unten dargestellten N-Carboxyanhydride zu bilden. Nicht einschränkende Beispiele von Haloformiaten, die in geeigneter Weise für diesen ersten Schritte verwendet werden können, sind:
Nicht einschränkende Beispiele für Carbonylhalogenide, die für diesen ersten Schritt geeignet sein können, sind die Verbindungen, die Formeln aufweisen, die mit den obigen Haloformiatformeln ähnlich sind, wobei jedoch die -O-C(O)-Cl Endgruppe durch eine -C(O)-Cl Endgruppe ersetzt ist.
b) Ringöffnungscopolymerisation und expliziter Kettenwachstumsmechanismus
In diesem zweiten Schritt wird ein aus den N-Carboxyanhydriden im ersten Schritt gewonnenes Gemisch in Gegenwart eines Überschusses eines Initiators wie beispielsweise eines tertiären Amins (beispielsweise Tributylamin) copolymerisiert. Das N-Carboxyanhydrid der α-Aminosäure wird vorzugsweise in einem kontrollierten Überschuß bezüglich des N-Carboxyanhydrids der N-acylierten α-Aminosäure verwendet, wobei deren Verhältnis das endgültige Molekulargewicht bestimmt.
c) Endgruppenmodifikation des Polymers.
In diesem dritten Schritt wird das im zweiten Schritt gewonnene N-Carboxyanhydrid terminierte Polymer mit einem Reagenz mit der Formel H₂N-R₃-Y₂ umgesetzt, wobei R₃ und Y₂ wie in Formel (VIII) definiert sind. Wenn das Terminierungsreagenz H₂N-R₃-Y₂ ein Diamin ist, das eine geschützte Carboxylgruppe enthält, dann wird die Terminationsreaktion zu einem Poly-α-Aminosäurederivat mit einer einzigen geschützten Carboxylseitenkette führen.
Nicht einschränkende Beispiele für funktionalisierte Amine, die zur Verwendung in diesem Schritt des zweiten Verfahrens der Erfindung geeignet sind, können beispielsweise aus der Liste multifunktioneller Initiatoren entnommen werden, die hierin vorstehend bezüglich des ersten Verfahrens der Erfindung bereitgestellt wurden.
d) Aminolyseschritt
Wie unten dargestellt, verläuft dieser Schritt im wesentlichen wie beim ersten Gewinnungsweg, der vorher beschrieben wurde.
Als Beispiel kann ein heterobifunktionelles Derivat der Erfindung über dieses zweite Verfahren durch Polymerisation von γ-Benzyl-L-glutamat oder des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat oder des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA) (im Überschuss) mit N-acyliertem TCEG-NCA und unter Verwendung von Tributylamin als Initiator gefolgt von der Termination mit einer Verbindung, die eine funktionelle Aminoendgruppe (oder ein Diamin mit einer geschützten Carbonsäure) und einer weiteren funktionellen Endgruppe enthält und eine anschließende Aminolyse der Trichlorethylesterseitengruppe mit Ethanolamin hergestellt werden.
In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung biologisch abbaubare Gegenstände, die ein Copolymer enthalten, das zumindest eine Komponente enthält, die aus einem Poly-α-Aminosäurederivat wie beispielsweise oben beschrieben gewonnen wurden, insbesondere eines, das irgendeine der Formeln (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (VI), (VII) und (VIII) aufweist, vorausgesetzt, daß die funktionelle Gruppe an einem oder beiden Enden hiervon – d. h. V und/oder W in den Formeln (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Va), (Vb), (Vc) (Vd) und (VI), R₃-Y₂ und/oder R₃-Y₁ in den Formeln (VII) und (VIII) eine ungesättigte Gruppe ist und zumindest eine Komponente von einem ungesättigten Comonomer abgeleitet ist, die hiermit copolymerisierbar ist. Das ungesättigte Comonomer, das mit dem ungesättigten Poly-α-Aminosäurederivat der vorliegenden Erfindung copolymerisierbar ist, kann beispielsweise ein α-Olefin, eine α,β-ungesättigte Monocarbonsäure, Ester, Nitril oder Amid sein (wie beispielsweise Acryl, Methacryl und dergleichen), ein ungesättigtes Dicarbonsäureanhydrid (wie beispielsweise Maleinsäureanhydrid) oder irgendein anderes vinylterminiertes Monomer (wie beispielsweise Styrol, α-Methylstyrol, Vinylether, Propenylether und dergleichen) oder irgendeine Kombination hiervon. Die jeweiligen Anteile des ungesättigten Comonomers und des ungesättigten Poly-α-Aminosäurederivates können in einfacher Weise ausgewählt und vom Fachmann auf dem Gebiet angepaßt werden, abhängig vom Reaktionsverhältnis der Comonomere und vom Niveau der biologischen Abbaubarkeit und der Kinetik, die im endgültigen biologischen abbaubaren Artikel erreicht werden soll, der zusätzlich übliche biologisch abbaubare Additive umfassen kann.
In einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung neuer funktioneller Poly-α-Aminosäurederivate, wie sie beispielsweise oben beschrieben sind, insbesondere ein solches mit irgendeiner der Formeln (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (VI), (VII), (VIII) und (IX), zur Modifikation eines biologisch aktiven Inhaltsstoffes. Diese Erfindung betrifft deswegen ebenfalls irgendein Produkt, das sich aus einer solchen Modifikation ergibt, einschließlich des Produktes, dessen Kopplung mit oder des Aufpfropfens auf das Biomolekül. Wie bereits hierin vorstehend erwähnt wurde, sind Derivate, die eine L-Aminosäuresequenz, die enzymatisch abbaubar ist, enthalten, für diese Zwecke am meisten von Nutzen. Der biologisch aktive Inhaltsstoff, der gemäß dieser Erfindung modifiziert werden soll und der vorzugsweise in einer biologisch wirksamen Menge verwendet werden soll, kann beispielsweise ein therapeutisches, diagnostisches oder prophylaktisches Mittel sein. Das therapeutische Mittel oder der Arzneistoff kann bezüglich seiner antimikrobiellen Eigenschaften, Fähigkeit zur Förderung der Reparatur oder Rekonstruktion spezieller Gewebe oder für spezielle Indikationen ausgewählt sein. Diese schließen beispielsweise antimikrobielle Mittel, wie beispielsweise Breitspektrumantibiotika zur Bekämpfung klinischer und subklinischer Infektionen ein, beispielsweise Gentamycin, Vancomycin und dergleichen. Weitere therapeutische Mittel oder Arzneistoffe, die zur Modifikation mittels des Poly-α-Aminosäurederivates dieser Erfindung in Erwägung gezogen werden können, sind natürlich vorkommende oder synthetische organische oder anorganische Verbindungen, die in der Technik wohlbekannt sind, einschließlich von Proteinen und Peptiden (hergestellt entweder durch Isolation aus natürlichen Quellen oder rekombinant), Hormone, Kohlehydrate, antineoplastische Mittel, antiangiogenetische Mitteln, vasoaktive Mittel, Antikoagulantien, Immunmodulatoren, cytotoxische Mittel, Antivirusmittel, Antikörper, Neurotransmitter, Oligonucleotide, Lipide, Plasmide, DNA und dergleichen. Therapeutisch aktive Proteine, die zusätzlich gemäß dieser Erfindung modifiziert werden können, schließen ohne eine spezielle Beschränkung Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermale Wachstumsfaktoren, Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren, Macrophagen-abgeleitete Wachstumsfaktoren wie Beispielsweise Granulozyten, Makrophagen, Koloniestimulierende Faktoren, ziliäre neurotrophe Faktoren, zystische Fibroseregulatorgene, Gewebsplasminogenaktivator, B-zell stimulierende Faktoren, knorpelinduzierender Faktor, differenzierende Faktoren, Wachstumshormonfreisetzungsfaktoren, humanes Wachstumshormon, Hepatocytenwachstumsfaktoren, Immunglobuline, insulinartige Wachstumsfaktoren, Interleukine, Cytokine, Interferone, Tumornekrosefaktoren, Nervenwachstumsfaktoren, Endothelwachstumsfaktoren, nicht steroidale anti-inflammatorische Arzneistoffe, osteogenetischer Faktor-Extrakt, T-Zell Wachstumsfaktoren, Tumorwachstumsinhibitoren, Enzyme (beispielsweise Superoxiddismutase, Asparaginase, Ribonuklease, Adenindeaminase, Xanthinoxidase und dergleichen), ebenso wie Fragmente hiervon ein. Weitere Biomoleküle, die ebenfalls auf diese Art und Weise modifiziert werden können, schließen humanes Serumalbumin, Lysin, Cystein und dergleichen ein.
Diagnostische Mittel, die als biologisch aktive Inhaltsstoffe betrachtet werden können, die gemäß dieser Erfindung modifiziert werden sollen (und die vorzugsweise in einer wirksamen Menge zur Durchführung der relevanten Diagnostik verwendet wird) schließen ohne spezifische Einschränkung herkömmliche Bildgebungsmittel (wie sie beispielsweise in der Tomographie, Fluoroskopie, Magnetresonanzbildgebung und dergleichen verwendet werden), wie beispielsweise Übergangsmetallchelate, ein.
Die neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivate dieser Erfindung sind ebenfalls zur Modifikation von Antikörpern und Fragmenten hiervon von Nutzen, die eine Thiolgruppe und/oder eine Aminogruppe aufweisen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die mittels der funktionellen Poly-α-Aminosäurederivate modifiziert werden und die eine zweite Funktionalität aufweisen, um eine andere Targetinggruppe „an den Haken zu nehmen" und/oder an diese zu binden, wie beispielsweise einen Antikörper oder ein Fragment hiervon, ein Oligopeptid, das durch Zellmembranintegrine erkannt wird, wie beispielsweise das Tetrapeptid RGD (Arginin-Glycin-Asparaginsäure), das Tetrapeptid RGDS (das RGD-Serin bedeutet) oder dergleichen (wie es dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, ist RGD in den integrinbindenden Domänen von mehreren Liganden zu finden und es wird angenommen, daß Sequenzen, die dieses Tripeptid flankieren, die exakte Bindungsspezifität bestimmen), Peptide (wie beispielsweise Mellitin), das die Zellmembranpenetration simuliert, Transferin, Saccharide und Oligosaccharide wie beispielsweise Galactose, Mannose und dergleichen.
Wie bereits oben angezeigt, sind Derivate, die eine D-Aminosäuresequenz enthalten, für die Oberflächenmodifikation von Biomaterialien nützlich. Solche modifizierten Oberflächen können entweder durch Aufpfropfen von Poly-α-Aminosäurederivaten wie beispielsweise PHEG auf die Oberfläche oder durch Beschichtung der Oberfläche mit einem PHEG enthaltenden Copolymer gewonnen werden. Als Beispiel kann Poly-[N-(2-hydroxethyl)-L-glutamin] mit einer ungesättigten Endgruppe (beispielsweise Styryl, Acrylat, Acrylamid, Methacrylat, Methacrylamid und dergleichen) aus einer Lösung, die Eosin Y und Triethanolamin enthält, auf eine Materialoberfläche adsorbiert werden. Eine anschließende Bestrahlung mit Licht hat eine Polymerisation der ungesättigten Endgruppen zur Folge. Über dasselbe Verfahren können Comonomere und Vernetzungsmittel wie beispielsweise Bismethacrylat ebenfalls coabsorbiert und copolymerisiert werden. Ein weiteres Verfahren der Verwendung von Poly-[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin] mit einer ungesättigten Endgruppe besteht aus dem Polymerisieren hiervon mit einem Comonomer und die Aufbringung des sich ergebenden Copolymers aus einer Lösung auf ein Substrat. Ein noch weiteres Verfahren besteht aus der Erzeugung reaktiver Gruppen (beispielsweise Carbonsäure oder -Anhydrid) auf eine Materialoberfläche und danach daraus, diese mit einer geeigneten PHEG Endgruppe (beispielsweise einer Aminoendgruppe) umsetzen zu lassen.
Die neuen funktionellen Poly-α-Aminosäurederivate dieser Erfindung sind ebenfalls zum Aufbau und/oder Modifikation eines synthetischen Vektorbestandteils von Nutzen, beispielsweise zur Genabgabe bzw. zum Gentransport wie beispielsweise Polyethylenimin (entweder verzweigtkettig oder linear), Poly-L-lysine, ein sternförmiges Dendrimer (beispielsweise des Polypropylenimintyps oder des Polyamidoamintyps) oder Chitosan. Somit trägt die vorliegende Erfindung zur Lösung des Problems bei, einen effizienten Transport zu Zielzellen in vivo bereitzustellen. Gegenwärtig stellen Viren die populärsten Vektoren zum in vivo Transport bereit, insbesondere mit verbesserten DNA Verpackungstechniken. Jedoch scheinen ihre ihnen eigene Immunogenität, die Möglichkeit der Fixierung von Komplement, die schlechte Zielselektivität und eine Schwierigkeit einer Produktion in größerer Menge zusammen mit Bedenken hinsichtlich einer potentiellen Toxizität ihre weit verbreitete Akzeptanz zu verhindern. Es besteht deswegen ein Bedarf nach alternativen sicheren und effizienten DNA oder Gentransportsystemen, vorzugsweise auf Basis vollständig synthetischer Trägervehikel. Ein synthetisches Trägervehikel oder Vektor, der zu effizienten zielgerichteten Abgabe bzw. Transport von DNA oder anderem Nukleinsäurematerial in vivo geeignet ist, muß verschiedene biologische Erfordernisse erfüllen. Idealerweise wäre er im Blutkreislauf stabil, nicht immunogen und gegenüber einem enzymatischen Abbau resistent, zu einer effizienten Zielunterscheidung in der Lage und dazu in der Lage, die Zielzellmembran selektiv zu durchdringen, um einen Zugang zum Kern zu gewinnen, die Nukleinsäure freizusetzen, und eine effiziente Transkription innerhalb der Zielzelle zu ermöglichen. Für eine erfolgreiche und vielseitige in vivo Anwendbarkeit ist es sehr wichtig, daß die Nukleinsäuretransportvehikel klein genug sein sollten, um einen Zugang zu den Zielzellen zu ermöglichen.
Deswegen ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein synthetisches Polymer für ein polymerbasiertes Trägervehikel oder einen Vektor zum Transport von DNA oder eines anderen Nukleinsäurematerials zu Zielzellen in einem biologischen System, das ein lineares Poly-α-Aminosäurederivat wie beispielsweise oben beschrieben umfaßt. Insbesondere kann das Polymer eines sein, das eines der Formeln (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (VI), (VII), (VIII) und (IX) aufweist. Das Nukleinsäurematerial kann beispielsweise genomische DNA, DNA Fragmente irgendeiner Länge, Plasmid DNA, cDNA, RNA, Oligonukleotide, DNA Expressionsvektoren, RNA, Ribozyme und dergleichen einschließen. Eine Antisensenukleinsäure kann ebenfalls für bestimmte Therapien verwendet werden. In den von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten DNA Trägervehikeln ist der DNA Expressionsvektor üblicherweise ein plasmidbasierter Expressionsvektor, der eine geeignete Promotorsequenz miteinschließt.
Die vorliegende Erfindung ist zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten von Nutzen (d. h. ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch), der einer solchen Behandlung bedarf, umfassend die Verabreichung eines modifizierten biologisch aktiven Inhaltsstoffes (wie beispielsweise einer der oben offenbart ist) oder eines Nukleinsäurematerials, das von einem Polymersystem mit einem linearen Poly-α-Aminosäurederivat, wie beispielsweise oben offenbart, mit sich getragen wird, an einen Patienten. Beispielsweise ist die Erfindung zur Herstellung zur Verwendung in einem Verfahren zum Transport von Gen-DNA-Material an einen Patienten bei der Durchführung einer somatischen Gentherapiebehandlung von Nutzen, wobei das Verfahren die Verpackung der ausgewählten DNA als Expressionsvektor in einem Trägervehikel, das wie hierin beschrieben konstruiert ist und eine Verabreichung des Polyelektrolytkomplexmaterials, das das DNA Trägervehikel bildet, an den Patienten umfaßt.
Beispiel 1 – Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat
2 g N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA, gewonnen beispielsweise aus Glutaminsäure, Trichlorethanol und Phosgen) wird in 20 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst und die sich ergebende Lösung wird auf 10°C abgekühlt. 1-Triphenylmethylaminoethylamin (0,099 g, d. h. 5 Mol-% bezüglich TCEG-NCA) wird in 2 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und der Lösung von TCEG-NCA zugesetzt. Die Polymerisation von TCEG-NCA wird danach durch Aufrechterhalten der Temperatur bei 10°C bewirkt. Nach zwei Stunden wird die Polymerisation durch Infrarotspektroskopie als vollständig bestimmt, danach wird ein dreifacher molarer Überschuß an Essigsäureanhydrid und eine äquimolare Menge Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für zwei weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das Polymerprodukt wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht wird durch ¹H NMR (DMF-d₇) und Gelpermeationschromatographie (Polystyrolstandard, Tetrahydrofuran als Eluent) als M_n = 6.000 bestimmt. ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 2 – Aminolyse des Trichlorethylester von Poly-L-glutaminsäure
1 g (3,8 mmol) des in Beispiel 1 gewonnenen Polymers wird in 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird auf 10°C abgekühlt und 0,69 ml (11,5 mmol) Ethanolamin und 0,36 g (3,8 mmol) 2-Hydroxypyridin werden dann zugesetzt. Der Reaktion folgt eine Infrarotspektroskopie und nach zwei Stunden wird bestimmt, daß die Reaktion vollständig war (100% Umwandlung). Das sich ergebende aminolysierte Polymer wird durch Präzipitation in Ether isoliert, filtriert, unter Vakuum getrocknet und danach durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) gereinigt und durch Gefriertrocknung isoliert. Das aufgereinigte Polymer wird durch ¹H NMR (D₂O) charakterisiert und eine Gelpermeationschromatographie (Dextranstandards, Wasser als Eluent) mit einem Molekulargewicht von M_n 4000. Die ¹H NMR Analyse bestätigt die folgende Struktur für dieses Polymer:
Beispiel 3 – Schutzentziehung bzw. Entschützung von Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] PHEG
1 g des Polymers von Beispiel 2 wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde gerührt. Trifluoressigsäure wird dann durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das sich ergebende Polymer wird in Wasser gelöst und zentrifugiert, danach wird der Überstand durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 aufgereinigt (Wasser als Eluent) und durch Lyophilisation isoliert.
¹H NMR (D₂O/DCl) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 4 – Funktionalisierung von Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] mittels Disulfidgruppen
1 g des Polymers aus Beispiel 3 wird in 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,5 (100 ml) gelöst. 0,6 g N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)-propionat (SPDP) wird in 30 ml Ethanol gelöst und der Polymerlösung zugesetzt. Nach zwei Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wird das Gemisch aus Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgetrennt und das sicher ergebende funktionelle Polymer (PHEG-SPDP) wird durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Die Konzentration der Pyridyldithiogruppen wird ebenfalls in Gegenwart von 0,1 M Dithiothreitol (hierin nachstehend als DTT bezeichnet), unter Verwendung von ε = 8080 M^–1cm^–1 bei 343 nm für freigesetztes Pyridin-2-thion bestimmt.
Beispiel 5 – Funktionalisierung von Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] mittels einer Thiolendgruppe
Das funktionelle Polymer aus Beispiel 4 (PHEG-SPDP) wird in 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,5, gelöst, der 0,1 M NaCl (10 mg/ml) enthält, und DTT wird zugesetzt, um eine Konzentration von 10 mM bereitzustellen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das DTT behandelte Gemisch in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), der 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, entsalzt. Die Anzahl der Thiolgruppen, die erzeugt werden, wird mittels 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzosäure) bestimmt.
Beispiel 6 – Funktionalisierung von Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] mittels einer Maleimidendgruppe
1 g des Polymers aus Beispiel 3 wird in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 (200 ml). Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester (0,2 g) wird in 10 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und der Polymerlösung zugesetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde wird das Gemisch aus Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgetrennt und das sich ergebende funktionelle Polymer wird durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 7 – Polymerisation von N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethylglutamat
Die Herstellungs-, Isolierungs- und Charakterisierungsverfahren von Beispiel 1 werden wiederholt, außer daß eine Polymerisation durch 0,017 g Aminoacetaldehyd-Dimethylacetal (4 Mol%) initiiert wird. ¹H NMR (DMF-d₇) bestätigt die folgende Struktur des gewonnenen Polymers:
Beispiel 8 – Aminolyse des Trichlorethylesters von Poly-L-glutaminsäure
Die Aminolyse des Polymers aus Beispiel 7 wird durchgeführt, während das wie in Beispiel 2 beschriebene Verfahren verwendet wird. ¹H NMR (D₂O) bestätigt die folgende Struktur für das gewonnene Polymer:
Beispiel 9 – Herstellung eines Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamins] mit einer Aldehydendgruppe
1 g des funktionellen Polymers aus Beispiel 8 werden in 10 ml Salzsäure (3%) gelöst und bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt, danach wird das Gemisch auf Sephadex G-25 aufgetrennt und das erzielte Polymer wird durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O) und Bestimmung der Aldehydgruppen durch Reaktion mit Hydroxylaminhydrochlorid bestätigt die folgende Struktur für das gewonnene Polymers:
Beispiel 10 – Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat.
TCEG-NCA (2 g) wird in 20 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst und die Lösung auf 10°C abgekühlt. 2-Methoxyethylamin (0,023 g, d. h. 5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) werden in 2 ml 1,2 Dichlorethan gelöst und der vorherigen Lösung zugesetzt. Nach zwei Stunden wird die Polymerisation durch Infrarotspektroskopie auf Vollständigkeit geprüft, danach wird ein dreifacher molarer Überschuß an Methacrylsäureanhydrid und eine äquimolare Menge an Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Das Molekulargewicht wird durch ¹H NMR (DMF-d₇) und Gelpermeationschromatographie (Polystyrolstandard, Tetrahydrofuran als Eluent) als 6500 bestimmt. ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 11 – Aminolyse von Trichloressigsäureester und Poly-L-glutaminsäure
Die Aminolyse des Polymers aus Beispiel 10 wird durchgeführt, während das wie in Beispiel 2 beschriebene Verfahren verwendet wird. ¹H NMR (D₂O) bestätigt die folgende Struktur des gewonnenen Polymers:
Beispiel 12 – Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat.
TCEG-NCA (2 g) wird in 20 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst, danach wird die Lösung auf 10°C abgekühlt. 2-Methoxyethylamin (0,023 g, 5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) wird in 1,2-Dichlorethan (2 ml) gelöst und der vorherigen Lösung zugesetzt. Nach zwei Stunden wird die Polymerisation durch Infrarotspektroskopie auf Vollständigkeit geprüft, danach werden ein dreifacher molarer Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid und eine äquimolare Menge an Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Danach werden 1,2 g Citronensäure in 50 ml Wasser gelöst und dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das sich ergebende Polymer wird mit 1,2-Dichlorethan gelöst, die Lösung wird über MgSO₄ getrocknet und in Pentan ausgefällt. Das Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. ¹H NMR (DMF-d₇) bestätigt die folgende Struktur des gewonnenen Polymers:
Beispiel 13 – Aminolyse des Trichlorethylesters von Poly-L-glutaminsäure
Die Aminolyse des Polymers aus Beispiel 12 wird durchgeführt, während das Verfahren verwendet wird, das in Beispiel 2 beschrieben wurde. ¹H NMR (D₂O) bestätigt die folgende Struktur des gewonnenen Polymers:
Beispiel 14 – Herstellung von Poly-[N-(3-Hydroxyethyl)-L-glutamin] mit funktionellen Endgruppen.
Die Polymerisation von TCEG-NCA wird zunächst mittels geeigneter Starter begonnen oder mittels geeigneter Terminationsmittel wie in Beispielen 1, 6 und 7 beschrieben beendet. Danach wird eine Aminolyse solcher Polymere durchgeführt, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde, außer daß Ethanolamin durch 3-Amino-1-propanol ersetzt wird. Nach Entschützung (wie in Beispiel 3) oder Hydrolyse (wie in Beispiel 9) wurden funktionelle Polymere mit den nachfolgenden Strukturen erhalten:
R₁ = NH₂, R₂ = COCH₃ (Vergleich)
R₁ = SS-Py, R₂ = COCH3
R₁ = Maleanid, R₂ = COCH₃
R₁ = CHO, R₂ = COCH₃
R₁ = CH₃O, R₂ = COOH (Vergleich)
Beispiel 15 – Herstellung von Poly-[N-(2-3-Dihydroxyethyl)-L-glutamin] mit funktionellen Endgruppen.
Die Polymerisation von TCEG-NCA wird zunächst mittels geeigneter Starter begonnen oder mittels geeigneter Terminationsmittel wie in den Beispielen 1, 6 und 7 beschrieben, beendet. Danach wird eine wie in Beispiel 2 beschriebene Aminolyse derartiger Polymere durchgeführt, außer daß Ethanolamin durch 3-Amino-1,2-Propandiol ersetzt wird. Nach Entschützung (wie in Beispiel 3) oder Hydrolyse (wie in Beispiel 9) wurden funktionelle Polymere mit den folgenden Strukturen erzielt:
R₁ = NH₂, R₂ = COCH₃
R₁ = SS-Py, R₂ = COCH₃
R₁ = Maleimid, R₂ = COCH₃
R₁ = CHO, R₂ = COCH₃
R₁ = CH₃O, R₂ = COOH
Beispiel 16 – Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-aspartat.
Das N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-Aspartat (TCEA-NCA) (2 g) wird in 20 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst, darauf wird die Lösung auf 10°C abgekühlt. 1-Triphenylmethylamin (0,099 g, d. h. 5 Mol% bezüglich TCEA-NCA) wird in 1,2-Dichlorethan (2 ml) gelöst und der vorherigen Lösung zugesetzt. Nach zwei Stunden wir die Vollständigkeit der Polymerisation durch Infrarotspektroskopie bestimmt, danach werden ein dreifacher molarer Überschuß an Essigsäureanhydrid und eine äquimolare Menge Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird dann in Pentan ausgefällt und das sich ergebende Polymer durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Das Molekulargewicht wird durch ¹H NMR (DMF-d₇) und Gelpermeationschromatographie (Polystyrolstandard, Tetrahydrofuran als Eluent) als Mn = 5000 bestimmt. ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 17 – Aminolyse des Trichlorethylesters von Poly-L-asparaginsäure
1 g (3,8 mmol) des Polymers aus Beispiel 16 werden in 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 10°C abgekühlt, danach werden 0,69 ml (11,5 mmol) Ethanolamin und 0,36 g (3,8 mmol) 2-Hydroxypyridin zugesetzt. Der Reaktion folgt eine Infrarotspektroskopie und nach zwei Stunden wird die Vollständigkeit der Reaktion bestimmt (100% Umsetzung). Das sich ergebende aminolysierte Polymer wird durch Ausfällung in Ether isoliert, filtriert und unter Vakuum getrocknet und danach durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgereinigt und durch Gefriertrockung isoliert. Das aufgereinigte Polymer wird durch ¹H NMR (D₂O) charakterisiert und durch Gelpermeationschromatographie (Dextrandstandard, Wasser als Eluent) mit einem Molekulargewicht von M_n von 3500. ¹H NMR Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 18 – Entschützung von Poly-(N-(hydroxyethyl)-L-aspartat)
1 g des Polymers aus Beispiel 17 wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde gerührt. Die Trifluoressigsäure wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das Polymer wird in Wasser gelöst und zentrifugiert, danach wird der Überstand durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgereinigt und durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O/DCl) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 19 – Kopplung eines aldehydterminierten PHEG mit humanem Serumalbumin.
Das aldehydterminierte Poly-[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] (PHEG) aus Beispiel 9 in einem 0,1 M Natriumacetatpuffer (10 mg/ml) bei pH 4,0 wird einer Lösung aus humanem Serumalbumin (hierin nachstehend als HAS bezeichnet) im selben Puffer (10 mg/ml) zugesetzt. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das sich ergebende Produkt durch Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G-50 aufgereinigt, das mit Phosphatpuffersalzlösung äquilibriert wurde (hierin nachstehend als PBS bezeichnet). Fraktionen, die aufgereinigt 1:1 PHEG-CH=N-HSA Konjugate enthalten, werden gepoolt, durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat konzentriert, in PBS gelöst und bei 4°C aufbewahrt. Wenn eine Kopplung in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beispielsweise Natriumcyanoborhydrid durchgeführt wird, wurde ein stabileres Konjugat PHEG-CH₂-NH-HSA gewonnen.
Beispiel 20 – Kopplung eines disulfidterminierten PHEG mit humanem Serumalbumin
Zunächst wird eine Thiolierung von HSA gemäß des folgenden Verfahrens bewirkt: zu HSA (10 mg/ml) in PBS wird ein fünffacher Überschuß an SPDP zugesetzt, gelöst in einer minimalen Länge Dimethylformamid. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten wird die Lösung in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) entsalzt, die 0,1 M NaCl enthält und Dithiotreitol (DTT) wird zugesetzt, um eine Konzentration von 10 mM zu ergeben. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird das DTT behandelte Gemisch in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) entsalzt, der 1 mM Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) enthält. Die Nummer der Thiolgruppen, die erzeugt wurden, werden mittels 5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenoesäure) bestimmt.
Danach wird thioliertes HSA mit disulfid-terminiertem PHEG wie folgt umgesetzt: das Polymer aus Beispiel 4 in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), der 1 mM EDTA (10 mg/ml) enthält, wird mit thioliertem HSA im selben Puffer vermischt, um ein 4:1 HAS/PHEG Molverhältnis bereitzustellen. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden wird das gewonnene Konjugat durch Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G-50 aufgereinigt, das mit ABS äquilibriert war. Fraktionen, die aufgereinigte 1:1 HSA-SS-PHEG Konjugate enthielten, wurden gepoolt, durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat konzentriert, in PBS gelöst und bei 4°C aufbewahrt. Dasselbe Konjugat kann ebenfalls durch Umsetzen des funktionellen PHEG aus Beispiel 5 mit HAS, das durch SPDP modifiziert wurde, bei ähnlichen Bedingungen hergestellt werden.
Beispiel 21 – Kopplung eines maleimid-terminierten PHEG mit humanem Serumalbumin.
Zunächst wird eine Thiolierung von HSA wie in Beispiel 20 beschrieben durchgeführt. Danach wird thioliertes HSA mit einem maleimid-terminierten PHEG wie folgt umgesetzt: zur Herstellung eines Konjugats mit einer Thioetherbindung wird das Polymer aus Beispiel 6 in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), der 1 mM EDTA (10 mg/ml) enthält, mit thioliertem HSA im selben Puffer vermischt, um ein Molverhältnis von 4:1 HAS/PHEG bereitzustellen. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden wird das gewonnene Konjugat durch Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G-50 aufgereinigt, das mit PBS äquilibriert ist. Fraktionen, die aufgereinigte 1:1 HSA-S-PHEG Konjugate enthalten, werden gepoolt, durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat konzentriert, in PBS gelöst und bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 22 – Biodegradation bzw. biologischer Abbau von Poly[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin
10 mg Poly[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin) (PHEG) erzeugt gemäß Beispiel 3 außer daß sein Molekulargewicht M_n 102.000 beträgt, wird in 1,2 ml Phosphat-Citrat-Puffer (pH 5,5) gelöst, der 0,2% (Gewicht/Volumen) Triton X-100 enthält. 200 μl EDTA (10 ml im Puffer), 200 μl reduziertes Glutathion (50 ml im Puffer) und 400 μl Tritosomen (2,5 mg/ml im Puffer) werden hinzugesetzt. Diese Gemisch werden 37°C inkubiert. Die Proben werden bei vorherbestimmten Zeitspannen entnommen und durch Gelpermeationschromatographie analysiert (Dextranstandard, Phosphat-Citrat-Puffer pH 6,0 als Eluent), um ihre mittlere Molekülmasse bzw. mittleres Molekulargewicht zu ermitteln. Die nachfolgende Tabelle ebenso wie 1 zeigen die biologische Abbaubarkeit von PHEG mittels des abnehmenden Molekulargewichts deutlich.
Beispiel 23 – Kopplung eines aldehydterminierten PHEG mit Enzymsuperoxiddismutase
Das aldehydterminierte Poly[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] (PHEG) aus Beispiel 9 in 0,1 M Phosphatpuffer (10 mg/ml), pH 5,5, wird einer Lösung aus Superoxiddismutase (hierin nachstehend als SOD bezeichnet) im selben Puffer (10 mg/ml) zugesetzt. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wird ein Reduktionsmittel, beispielsweise Natriumcyanoborhydrat, zugesetzt, und ein stabiles Konjugat PHEG-CH₂NH-SOD wird gewonnen. Das Produkt wird unter Verwendung eines Amicon-Ultrafiltrationssystems mit einer PM-10 Membran aufgereinigt und lyophilisiert. Der Substitutionsgrad (definiert als der Anteil von Aminogruppen in SOD, die gekoppelt bzw. gebunden sind), bestimmt durch 2,4,5-Trinitrobenzosulfonsäure (hierin nachstehend als TNBS bezeichnet) – Verfahren beträgt 50 Mol%.
Beispiel 24 – Kopplung eines carboxylterminierten PHEG mit dem Enzym Superoxiddismutase
PHEG mit einer Carboxylendgruppe von Beispiel 13 wird in 0,1 M Phosphatpuffer (10 mg/ml) gelöst, pH 7,4. 1-Ethyl-2-(Dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (1 Äquivalent) wird zugesetzt. Superoxiddismutase (SOD) wird im selben Puffer (10 mg/ml) gelöst und der obigen Lösung zugesetzt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wird das Produkt, wie in Beispiel 23 aufgereinigt und lyophilisiert. Der Substitutionsgrad, bestimmt durch das TNBS Verfahren, beträgt 40 Mol%.
Beispiel 25 – Kopplung eines aldehydterminierten PHEG mit Polyethylenimin
Das aldehydterminierte Poly[N-(2-Hydroxyethyl)-L-glutamin] PHEG aus Beispiel 9 in 0,1 M Phosphatpuffer (10 mg/ml), pH 5,5, wird einer Lösung aus Polyethylenimin (hierin nachstehend als PEI bezeichnet) im selben Puffer (10 mg/ml) zugesetzt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wird das Produkt mittels Natriumcyanoborhydrat reduziert und ein stabiles Konjugat, nämlich PEI-g-PHEG, wird gewonnen. Das Produkt wird, wie in Beispiel 23, aufgereinigt und gefriergetrocknet. Der Substitutionsgrad, bestimmt durch Verwendung von ¹H NMR Spektroskopie und durch das TNBS Verfahren beträgt 20 Mol%. Ähnliche Konjugate können durch Kopplung des aldehydterminierten PHEG mit Poly-L-lysin oder einem anderen kationischen Polymer hergestellt werden, das primäre Aminogruppen in seinen Seitenketten enthält.
Beispiel 26 – Kopplung eines carboxylterminierten PHEGs mit Poly-L-lysin
PHEG mit einer Carboxylendgruppe aus Beispiel 13 wird im 0,1 M Phosphatpuffer gelöst (10 mg/ml), pH 7,4. Ein Äquivalent 1-Ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid wird zugesetzt. Poly-L-lysin (hierin nachstehend als PLL bezeichnet) wird im selben Puffer (10 mg/ml) gelöst und der obigen Lösung zugesetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das gewonnene Konjugat PLL-g-PHEG wie in Beispiel 23 aufgereinigt und lyophilisiert. Der Substitutionsgrad wird durch ¹H NMR Spektroskopie und das TNBS Verfahren bestimmt und beträgt 20 Mol%.
Beispiel 27 – Synthese einer N-acylierten N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat
Dieses Syntheseverfahren ist im unten dargestellten Schema gezeigt und umfaßt die folgenden Schritte:
a) Synthese von Terbutoxycarbonylaminoethanol:
Eine Lösung von 2,1 ml Ethanolamin (10 mmol) in einem Gemisch aus Dioxan (20 ml), Wasser (10 ml) und 1 N NaOH (10 ml) wird in einem Eiswasserbad abgekühlt. 2,4 g Di-tert-butyldicarbonat (11 mmol) wird unter Rühren zugesetzt und die Reaktion schreitet für eine halbe Stunde fort. Die Lösung wird unter Vakuum konzentriert, in einem Eiswasserbad gekühlt, mit einer Schicht aus Ethylacetat (30 ml) bedeckt und mit einer verdünnten Lösung aus KHSO₄ auf einen pH von 2–3 angesäuert. Die wäßrige Phase wird mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum abgedampft, wodurch sich 95% Terbutoxycarbonylaminoethanol ergeben, dessen Struktur durch ¹H NMR (CDCl₃) Analyse bestimmt wird.
b) Synthese von Terbutoxycarbonylaminoethylchlorcarbonat:
Eine Lösung aus 1 g Diphosgen (5 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wird in einem Eiswasserbad abgekühlt und eine Lösung aus 1,02 g Terbutoxcarbonylaminoethanol (5 mmol, hergestellt in Schritt a) in Dichlormethan (10 ml) wird in kleinen Portionen unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wird für ungefähr 2 Stunden fortgeführt. Das Lösungsmittel und der Phosgenüberschuß werden unter Vakuum entfernt und das Produkt durch Umkristallisation aus Ether aufgereinigt, wodurch sich 96% Terbutoxycarbonylaminoethanolchlorcarbonat ergeben, dessen Struktur durch ¹H NMR (CDCl₃) Analyse bestätigt wird.
c) Synthese von Terbutoxycarbonylaminoethyloxycarbonyl-N-γ-Trichlorethyl-L-glutamat
2,63 g γ-Trichlorethylester von L-glutaminsäure (10 mmol) wird in Tetrahydrofuran (150 ml) unter leichtem Erhitzen gelöst und danach auf 15°C abgekühlt. Die Lösung wird mit 21 g wäßriger Lösung Natriumdicarbonat (25 mmol) und mit 3,16 g Terbutoxycarbonylaminoethanolchlorcarbonat (12 mmol) unter heftigem Rühren behandelt. Das Rühren wird für ungefähr 3 Stunden fortgesetzt. Die Lösung wird mit Ether extrahiert und auf einen pH von 2–3 mit Salzsäure angesäuert. Das feste Produkt, das gewonnen wird, wird mit Wasser gewaschen, über Phosphorpentoxid unter Vakuum getrocknet und durch Umkristallisation aus Ethylacetat aufgereinigt, wodurch sich 94% Terbutoxycarbonylaminoethyloxycarbonyl-N-γ-trichlorethyl-L-glutamat ergeben, dessen Struktur durch ¹H NMR (CDCl₃) Analyse bestätigt wird.
d) Synthese von N-acyliertem N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat
1 g N-acyliertes Trichlorethylmonoester der L-glutaminsäure (2 mmol) wird in 30 ml Tetrahydrofuran unter Rühren gelöst. 0,4 g Diphosgen (2 mmol) wird in Portionen zugesetzt, die Lösung wird unter Rückfluß für 2 Stunden gerührt und mit Stickstoffgas unter Rühren für weitere 2 Stunden gespült. Das sich ergebende Produkt wird in Pentan ausgefällt, filtriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch sich 75% N-acyliertes N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat ergeben, dessen Struktur durch ¹H NMR (CDCl₃) Analyse bestätigt wird.
Beispiel 28 – Polymerisation von TCEG-NCA mit N-acyliertem TCEG-NCA
2 g N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA) wird in 20 ml Dichlormethan gelöst. Lösungen des N-acylierten TCEG-NCA (0,17 g, d. h. 5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) in 5 ml Dichlormethan und Tributylamin (0,06 g, d. h. 5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) in 2 ml. Dichlorethan werden der Lösung aus TCEG-NCA zugesetzt. Nach dem Ende der Polymerisation (ungefähr 3 Stunden), bestimmt durch Infrarotspektroskopie, wird eine Lösung aus 2-Aminoethylpropionamid-3-maleimid (hergestellt aus Triphenylmethylethylamin und 6-Maleimidocapronsäure und dann mit Trifluoressigsäure entschützt) (dreifacher Überschuß bezüglich des Starters) in 5 ml Dichlormethan und eine äquimolare Menge an Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das sich ergebende Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht bestimmt durch ¹H NMR (DMF-d₇) beträgt 6000. ¹H NMR (DMF-d₇) bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 29 – Aminolyse eines Poly-γ-trichlorethyl-L-glutamats das eine Maleimidoendgruppe und eine Terbutoxycarbonyl N-acylierte Endgruppe enthält
Das Aminolyseverfahren wird wie in Beispiel 2 durchgeführt, und ergibt ein Polymer mit einem Molekulargewicht, bestimmt durch ¹H NMR (D₂O), von 4000. ¹H NMR (D₂O) bestätigt die folgende Struktur des Polymers.
Beispiel 30 – Entschützung einer Terbutoxycarbonylgruppe in einem Polymer
1 g des Polymers aus Beispiel 29 wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Trifluoressigsäure wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das sich ergebende Polymer wird in Wasser gelöst und zentrifugiert. Das Überstandsprodukt wird durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) gereinigt und durch Gefriertrocknung isoliert. ¹H NMR (D₂O) bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 31 – Synthese eines heterobifunktionellen PHEG
a) Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat
2 g N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA) wird in 20 ml wasserfreiem 1,2 Dichlorethan gelöst. Die Lösung wird auf 10°C abgekühlt. 0,099 g 1-Triphenylmethylaminoethylamin (5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) wird in 2 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und der Lösung aus NCA zugesetzt. Nach dem Ende der Polymerisation, bestimmt durch Infrarotspektroskopie, wird ein dreifacher molarer Überschuß an N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das sich ergebende Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht, bestimmt durch ¹H NMR (DMF-d₇) und GPC (Polystyrolstandards, THF als Eluent) beträgt M_n = 6000. ¹H NMR (DMF-d₇) bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
b) Aminolyse des Trichlorethylesters von Poly-L-glutaminsäure
1 g (3,8 mmol) des obigen Polymers wird in 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 10°C abgekühlt und 0,69 ml (11,5 mmol) Ethanolamin und 0,36 g (3,8 mmol) 2-Hydroxypyridin werden zugesetzt. Der Reaktion folgt eine Infrarotspektroskopie. Nach dem Ende der Aminolyse wird das sich ergebende Polymer in Ether ausgefällt, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Es wird dann durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgereinigt, durch Lyophilisation isoliert und durch ¹H NMR (D₂O) und GPC (Dextranstandards, Wasser als Eluent) als Molekulargewicht M_n = 4500 charakterisiert. Eine ¹H NMR Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
c) Entschützung der Triphenylmethylgruppe
1 g des obigen Polymers werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Trifluoressigsäure wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Das sich ergebende Polymer wird in Wasser gelöst und zentrifugiert. Der Überstand wird durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgereinigt und durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O/DCl) Analyse bestätigt die nachfolgende Struktur des Polymers:
Beispiel 32 – Synthese eines PHEG Derivates terminiert mit einer Carboxylgruppe und einer Disulfidgruppe
1 g des Polymers aus Schritt (c) von Beispiel 31 (0,22 mmol) wird in 50 ml N,N-Dimethylformamid gelöst. 0,024 g Bernsteinsäureanhydrid (0,24 mmol) und eine äquimolare Menge an Dimethylaminopyridin werden zugesetzt und die Lösung wird für eine Stunde gerührt. Danach wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst. Der unlösliche Teil wird abfiltriert und das Filtrat durch Dialyse aufgereinigt und lyophilisiert. ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 33 – Synthese eines PHEG terminiert mit einem N-Hydroxysuccinimidester und einer Disulfidgruppe
1 g des Polymers aus Beispiel 32 (0.22 mmol) werden in 30 ml N,N-Dimethylformamid bei 0°C gelöst. 0,05 g N-Hydroxysuccinimid (0,44 mmol) werden unter Rühren gefolgt von 0,09 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,44 mmol) zugesetzt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur stehengelassen und für 4 Stunden unter Rühren gehalten, wonach das ausgefällte Dicyclohexylurea durch Filtration entfernt wird. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und das Produkt wird mit Ether pulverisiert bzw. verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet. ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers.
Beispiel 34 – Kopplung eines heterobifunktionellen PHEG mit Superoxiddismutase
Das Polymer aus Beispiel 33 wird in 0,02 M Boratpuffer, pH 8,0 (10 mg/ml) gelöst und einer Lösung aus Superoxiddismutase (SOD) im selben Puffer (10 mg/ml) zugesetzt. Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Das sich ergebende Produkt wird unter Verwendung eines Amicon-Ultrafiltrationssystemes mit einer PM-10 Membran aufgereinigt und gefriergetrocknet. Der Substitutionsgrad, bestimmt durch TNBS, beträgt 40%. Eine schematische Darstellung des Produkts ist wie folgt:
SOD~~PHEG~~S-S-Py
Beispiel 35 – Kopplung von SOD~~PHEG~~S-S-Py mit einem RGD-Peptid
Das Produkt aus Beispiel 34 wird in einem 0,1 M Phosphatpuffer (10 mg/ml), pH 7,5 gelöst. Ein RGD-Peptid (HS-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH₂) wird im selben Puffer gelöst (10 mg/ml, zweifacher Überschuß bezüglich der S-S-Py Komponente) und der obigen Lösung zugesetzt. Die Freisetzung von Pyridin-2-thion, gemessen durch Ultraviolett-Spektroskopie, wird zur Bestimmung des Endes der Reaktion (ungefähr 1 Stunde) verwendet. Das Produkt wird durch Verwendung eines Amicon-Ultrafiltrationssystems mit einer PM-10 Membran aufgereinigt und gefriergetrocknet. Eine schematische Darstellung des Produktes ist wie folgt:
SOD~~PHEG~~RGD-Peptid
Beispiel 36 – Synthese eines PHEG Derivates konjugiert mit einem Poly-L-lysin (PLL-g-PHEG) und kovalent gebunden an ein RGD-Peptid
a) Kopplung von NHS~~PHEG~~S-S-Py mit Poly-L-lysin
1 g Poly-L-lysin (M_n = 20.000) wird in 20 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, gelöst. NHS~~PHEG~~S-S-Py (aus 15,2) wird im selben Puffer gelöst und der Lösung zugesetzt. Nach Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur wird das Gemisch auf Sephadex G-25 aufgetrennt (Wasser als Eluent). PLL-g-PHEG wird durch Lyophilisation isoliert. ¹H NMR (D₂O) Analyse zeigt 10 und 20 Mol% gepfropftes PHEG auf der PLL Kette.
b) Kopplung von PLLG-g-PHEG~~S-S-Py mit einem RGD-Peptid
Das obige Polymer PLL-g-PHEG~~S-S-Py wird in 0,1 M Phosphatpuffer (10 mg/ml), pH 7,5 gelöst. Ein RGD-Peptid (HS-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH₂) wird im selben Puffer gelöst (10 mg/ml, zweifacher Überschuß bezüglich der S-S-Py Komponente) und der obigen Lösung zugesetzt. Die Freisetzung von Pyridin-2-thion, gemessen durch Ultraviolett-Spektroskopie wird zur Bestimmung des Endes der Reaktion verwendet (ungefähr 1 Stunde). Das Produkt wird durch Verwendung eines Amicon-Ultrafiltrationssystems mit einer PM-10 Membran aufgereinigt und gefriergetrocknet. Eine schematische Darstellung des Produktes ist wie folgt:
PLL-g-PHEG~~RGD.
Beispiel 37 – Synthese eines Blockcopolymers aus Poly-γ-Hydroxyethyl-L-glutamin mit Polyglycolsäure
a) Synthese von Polyglycolsäure mit Hydroxylgruppen an beiden Enden der Polymerkette
Ein silanisiertes Glasröhrchen bzw. Reagenzglas wird mit 1 g Glycolid (9 mmol), 0,02 g 1,6-Hexandiol (0,18 mmol) und zwei Tropfen Stannooctoat beladen. Das Reagenzglas wird entgast, unter Argonschutz versiegelt und in einem mit einem Thermostat ausgerüsteten Ölbad bei einer Temperatur von 120–130°C angeordnet. Nach 15 Stunden wird die Polymerisation durch Abkühlen auf 4°C beendet. Die sich ergebende Polyglycolsäure (hierin nachstehend als PGA bezeichnet) wird durch Lösen des Reaktionsgemisches in Dichlormethan gefolgt von Ausfüllung in Hexan isoliert, dann aus Dichlormethan/Methanol umkristallisiert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht, bestimmt durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung eines Polystyrolstandards und von Tetrahydrofuran als Eluent, ist M_n = 10.000 und seine Hydroxylfunktionalität, bestimmt durch ¹H NMR beträgt 2. ¹H NMR (CDCl₃) bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
b) Kopplung von Poly-γ-Hydroxyethyl-L-glutamin mit Aminoendgrupppen mit Polyglycolsäure
1 g Polyglycolsäure, gewonnen in Schritt (a) wird zunächst gemäß des unten dargestellten Schemas aktiviert, indem es in 20 ml Dichlormethan gelöst und wird und 0,04 g Carbonyldiimidazol (1,3 molarer Überschuß bezüglich der Hydroxylgruppen) zugesetzt wird. Die Lösung wird unter Rückflußkühlung für 12 Stunden gerührt, dann mit 20 ml Dichlormethan verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die Dichlormethanschichten werden gesammelt und über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wird abgedampft und das sich ergebende Produkt unter Vakuum getrocknet.
¹H NMR (CDCl₃) bestätigt die obige Struktur des aktivierten Polymers.
c) Kopplung von aktiviertem PGA mit PHEG~NH₂
1 g aktiviertes Polymer, hergestellt im Schritt (b) wird in 30 ml N,N-Dimethylformamid gelöst, 0,97 g des Polymers aus Beispiel 3 werden in 40 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und der Lösung aus aktiviertem PGA zugesetzt. Das Gemisch wird für 24 Stunden bei 60°C gerührt, danach wird ein Teil des Lösungsmittels unter Vakuum entfernt und das sich ergebende Produkt wird in Pentan ausgefällt, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Die Struktur des Polymers (PHEG~~PGA~~PHEG) wird durch ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt.
Beispiel 38 – Synthese von verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamin
In diesem Beispiel wird ein modifiziertes L-lysin, daß zwei primäre Aminogruppen enthält, als Starter für die Polymerisation eines N-Carboxyanhydrids des γ-Hydroxyethyl-L-glutamats verwendet.
a) Synthese eines bifunktionell modifizierten L-lysins
Diese Synthese schreitet gemäß des hierin nachstehend dargestellten Schemas voran. 1 g L-Lysin Terbutylester (4,9 mmol) wird in 10 ml Dichlormethan gelöst und auf 0°C abgekühlt, danach wird eine Lösung aus 3,5 g einer fluorenylmethyloxycarbonyl-geschützter 6-Aminocapronsäure (9,8 mmol) in 20 ml Dichlormethan zugesetzt. 2,02 g Dicyclocarbodiimid (9,8 mmol) wird zugesetzt und die Lösung für eine Stunde bei 0°C gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefällte Dicyclohexylurea wird filtriert und das Filtrat in Hexan ausgefällt. Das sich ergebende Produkt 3 (Struktur bestätigt durch ¹H NMR (CDCl₃) Analyse) wird filtriert und unter Vakuum getrocknet.
1 g aus Produkt 3 wird in 10 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und 10 ml einer 10% Lösung aus Piperidin in N,N-Dimethylformamid wird zugesetzt. Nach Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der Rest mit Ether verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet. ¹H NMR (CDCl₃) Analyse bestätigt die Struktur von Produkt 4.
b) Polymerisation des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat unter Verwendung von modifiziertem L-Lysin als Starter mit Essigsäureanhydrid als Terminationsmittel
1 g N-Carboxyanhydrid von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA) wird in 10 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und die Lösung auf 10°C abgekühlt. 0,023 g des modifizierten L-Lysins aus Schritt (a) wird in 2 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und unter Rühren der Lösung aus TCEG-NCA zugesetzt. Nach dem Ende der Polymerisation, bestimmt durch Infrarotspektroskopie (ungefähr 3 Stunden), werden Essigsäureanhydrid (sechsfacher molarer Überschuß bezüglich des Starters) und eine äquimolare Menge an Triethylamin zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das sicher ergebende Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht, bestimmt durch ¹H NMR (DMF-d₇) beträgt M_n = 10.500. ¹H NMR (DMF-d₇) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
c) Aminolyse eines verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamats mit Ethanolamin
Eine Aminolyse des verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamats aus Schritt (b) wird durchgeführt und das Produkt wird isoliert und wie bereits in Beispiel 2 beschrieben charakterisiert. Eine ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
d) Entschützung der Tert-Butylgruppe an einem verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamin.
1 g des in Schritt (b) gewonnenen Polymers wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Trifluoressigsäure wird unter Vakuum entfernt. Das Polymer wird in Wasser gelöst und zentrifugiert. Der Überstand wird durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Wasser als Eluent) aufgereinigt, danach wird das sich ergebende Produkt durch Lyophilisation isoliert. Eine ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die folgende Struktur des Polymers:
Beispiel 39 – Kopplung eines verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamins
Das verzweigtkettige Poly-γ-Hydroxyethyl-L-glutamin gewonnen in Beispiel 38 kann über seine reaktive Carbonsäureendgruppe mit einem Protein, Peptid, Enzym (wie beispielsweise SOD) oder kationische Polymer enthaltende Aminogruppen gekoppelt werden, während die Verfahren der Beispiele 34 bis 36 angewendet werden. Schematische Darstellungen der Produkte, die somit gewonnen werden können, sind wie folgt:
Beispiel 40 – Synthese eines verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamins
Dieses Beispiel veranschaulicht den „aktivierte Monomerprozess"-Weg gefolgt von einer Termination bzw. Abbruch mit einem modifizierten L-Lysin gemäß des hierin nachstehend dargestellten Schemas.
2 g des N-Carboxyanhydrids von γ-Trichlorethyl-L-glutamat (TCEG-NCA) wird in 20 ml Dichlormethan gelöst. Lösungen aus 0,114 g N-acetyliertem TCEG-NCA (5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) in 5 ml Dichlormethan und 0,06 Tributylamin (5 Mol% bezüglich TCEG-NCA) in 2 ml Dichlorethan werden der Lösung aus TCEG-NCA zugesetzt. Nach dem Ende der Polymerisation (ungefähr 3 Stunden), bestimmt durch Infrarotspektroskopie, wird eine Lösung aus 3,9 g des modifizierten L-Lysins aus Beispiel 38 in 5 ml Dichlormethan zugesetzt und das Reaktionsgemisch für weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Pentan ausgefällt und das sich ergebende Polymer wird durch Filtration isoliert und unter Vakuum getrocknet. Sein Molekulargewicht, bestimmt durch ¹H NMR (DMF-d₇) beträgt 12.000. ¹H NMR (DMF-d₇) bestätigt die Struktur von Polymer 6 des nachfolgenden Schemas.
wobei R = (CH₂)₂-CO-OO-CH₂-CCl₃
wobei R = (CH₂)₂-CO NH-(CH₂)₂-OH
Eine Aminolyse des verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamats mit Ethanolamin wird danach ausgeführt und das Produkt wird isoliert und wie bereits in der Aminolyse des verzweigtkettigen Polymers in Beispiel 2 beschrieben, charakterisiert. Eine ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die obige Polymerstruktur.
Eine Entschützung der Tertbutylgruppe auf dem verzweigtkettigen Poly-γ-hydroxyethyl-L-glutamin wird wie in Beispiel 38 durchgeführt. Eine ¹H NMR (D₂O) Analyse bestätigt die nachfolgende Polymerstruktur:

Claims

Lineares mono- oder multifunktionelles Poly-α-aminosäurederivat mit mindestens Glutamin- oder Asparagin- oder Serinwiederholeinheiten im Polymerrückgrat, wobei die Glutamin- oder Asparagin- oder Serinwiederholeinheiten folgende Formel haben: -CO-CHR-NH- (I)in welchem: – R als -(CH₂)_n-CO-OR₁ oder -(CH₂)_n-CO-NHR₂ oder CH₂OH definiert ist, – n 1 oder 2 ist, – R₁ aus Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, Polyhalogen-C₁-C₆-alkyl, Aryl-C₁-C₆-alkyl und Heteroaryl-C₁-C₆-alkyl ausgewählt ist, und – R₂ ist C₁-C₆-Alkyl, substituiert mit mindestens einer Alkoholgruppe, gekennzeichnet zusätzlich durch eine funktionelle Gruppe an einem oder beiden Enden des Polymerrückgrates, wobei die funktionelle(n) Endgruppe(n) aus funktionalisierten Aminen, N-Acyl, Ester, Carbonat, Thiol, Thiolvorläufer, Thioisocyanat, Thiocarbonat, Harnstoff, Thioharnstoff, Aldehyd, Acetat, N-Carboxyanhydrid, Oxycarbonyl, Maleimid und einer Vinylgruppe, geeignet für radikalische, anionische oder kationische Polymerisation, ausgewählt wird (werden).
Lineares multifunktionelles Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1 mit einer funktionellen Gruppe an beiden Enden des Polymerrückgrates, und zusätzlichen einer einfachen funktionellen Gruppe als eine Seitengruppe.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1 oder 2, das zusätzlich Wiederholeinheiten eines oder mehrerer Comonomere beinhaltet, die mit der α-Aminosäure-sequenz, die Glutamin- oder Asparagin- oder Serinwiederholeinheiten enthält, copolymerisierbar sind.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 3, worin das Comonomer aus der Gruppe ausgewählt ist die aus einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure mit Ausnahme von Glutaminsäure, Asparaginsäure und Ethylenoxid oder Propylenoxid oder Polyhydroxyalkanoaten besteht.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das multifunktionell ist und eine der folgenden Formeln trägt: V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W (IIa) V-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x-W (IIb) V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x'-W (IIc)
in welchem: – R wie in Anspruch 1 definiert ist; – x oder gegebenenfalls x + x' von 2 bis 2.000 reichen, – sowohl V wie W unabhängig voneinander eine funktionelle Gruppe repräsentieren, – A mindestens ein Comonomer ist, das mit der α-Aminosäuresequenz, die Glutamin- oder Asparagin- oder Serinwiederholeinheiten enthält, copolymerisiert werden kann, – y von 0 bis 500 reicht, – – T ein Platzhalter ist, ausgewählt aus Lysin oder Ornithin, und – V' eine nicht-reaktive Endgruppe ist.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das monofunktionell ist und eine der folgenden Formeln hat: V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W' (Va) V'-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-W (Vb) V-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x'-W' (Vc) V'-[CO-CHR-NH]_x-[A]_y-[CO-CHR-NH]_x'-W (Vd)
in welchem: – R wie in Anspruch 1 definiert ist. – x oder gegebenenfalls x + x' von 2 bis 2.000 reichen, – sowohl V wie W unabhängig voneinander eine funktionelle Gruppe repräsentieren, – A mindestens ein Comonomer ist, das mit der α-Aminosäuresequenz, die Glutamin- oder Asparagin- oder Serinwiederholeinheiten enthält, copolymerisiert werden kann, – y von 0 bis 500 reicht, – T ein Platzhalter ist, ausgewählt aus Lysin oder Ornithin, und – V' und W' nicht-reaktive Endgruppen sind.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1, das mindestens eine Schutzgruppe am Ende trägt und durch die folgenden Formeln wiedergegeben wird:
in welchem: – R ist -(CH₂)_n-CO-NHR₂, – R₂ und n wie in Anspruch 1 definiert sind, – x von 2 bis 2.000 reicht, – X₁ ist -R₄-Z₁-A₁, – sowohl R₃ wie R₄ werden unabhängig voneinander ausgewählt aus (CH₂)_m, Arylen, C₁-C₆-Alkylarylen und Aryl-C₁-C₆-alkylen, – m von 2 bis 20 geht, – Y₁ ist -Z₂-A₂, – X₂ ist -R₄-Z₃-A₃ oder -O-R₄-Z₃-A₃, – Y₂ ist -Z₄-A₄, – jedes Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig voneinander aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist, – jedes A₁, A₂, A₃ und A₄ jeweils eine Schutzgruppe, die für Z₁, Z₂, Z₃ bzw. Z₄ geeignet ist, ist, und – R₅ aus Wasserstoff C₁-C₆-Alkyl, Aryl und C₁-C₆-Alkylaryl, Heteroaryl und C₁-C₆-Alkylheteroaryl ausgewählt ist.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1, das durch folgende Formel repräsentiert wird: X₁-NH-[CO-CHR-NH]_x-CO-CHR-NH₂ (IX)in welchem: – X₁ ist -R₄-Z₁-A₁, – R₄ aus (CH₂)_m, Arylen, C₁-C₆-Alkylarylen und Aryl-C₁-C₆-alkylen ausgewählt ist, – m von 2 bis 20 geht, – λ von 2 bis 2.000 reicht, – R als -(CH₂)_n-CO-OR₁ definiert ist, – R₁ und n wie in Anspruch 1 definiert sind, – Z₁ aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist, – A₁ eine Schutzgruppe, die für Z₁ geeignet ist, ist, und – R₅ aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, Aryl und C₁-C₆-Alkylaryl, Heteroaryl und C₁-C₆-Alkylheteroaryl ausgewählt ist.
Lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1, das durch eine der jeweiligen Formeln repräsentiert wird:
in welchem: – R ist -(CH₂)_n-CO-OR₂, – R₂ und n wie in Anspruch 1 definiert sind, – x von 2 bis 2.000 reicht. – X₁ ist -R₄-Z₁-D₁, – jedes R₃ und R₄ unabhängig voneinander aus (CH₂)_m, Arylen, C₁-C₆-Alkylarylen und Aryl-C₁-C₆-alkylen ausgewählt ist, – m von 2 bis 20 geht, – jedes R₃-Y₁ und R₃-Y₂ jeweils eine Gruppe, die einen endständigen Vinylrest enthält, ist, – X₂ ist -R₄-Z₃-D₃, – jedes Z₁, Z₂, Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig voneinander aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist, – jedes D₁, D₂, D₃ und D₄ jeweils unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Succinimidyl, Vinyl, C₁-C₆-Alkylcarbonyl ausgewählt ist, – jedes Z₁-D₁, Z₂-D₂, Z₃-D₃ und Z₄-D₄ jeweils unabhängig voneinander aus Maleimidyl, Disulfid, α-Halogenacetoxy und C₁-C₆-Alkyloxymethylsulfid ausgewählt ist, und – R₅ aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, Aryl und C₁-C₆-Alkylaryl, Heteroaryl und C₁-C₆-Alkylheteroaryl ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines linearen Poly-α-aminosäurederivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, das einen Schritt enthält, in dem ein Monomer oder eine Mischung von Monomeren, das (die) zumindest das N-Carboxyanhydrid einer Aminosäure, ausgewählt aus Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin und Sauerstoff-geschütztem Serin, enthält, in Gegenwart einer wirksamen Menge eines multifunktionellen Initiators, der zumindest eine primäre Aminogruppe und des Weiteren zumindest eine andere funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Maleimid, Thioisocyanat, Thiocarbonat, Harnstoff, Thioharnstoff, Aldehyd, Acetal, Oxycarbonyl, Vinyl, Ester, Carbonat, Thiolvorläufer, geschütztes Amin und geschützte Carbonsäure, enthält, und/oder in Gegenwart einer wirksamen Menge eines bifunktionellen Terminierungsreagens polymerisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, das zusätzlich die Aminolyse der an der Glutamin-, Asparagin- oder Serinwiederholeinheit hängenden Gruppe, die von Glutaminsäure Asparaginsäure oder Serin mit Hilfe einer wirksamen Menge an Aminoalkohol abgeleitet wurde, in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Reaktionspromoters beinhaltet.
Verfahren zur Herstellung eines linearen Poly-α-aminosäurederivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, das aufweist: – als ersten Schritt eine N-Acylierung eines Teils einer α-Aminosäure, ausgewählt aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Serin, und anschließende getrennte Behandlung der N-acylierten α-Aminosäure und des restlichen Teils der α-Aminosäure, um eine Mischung der entsprechenden N-Carboxyanhydride herzustellen, und – als zweiten Schritt eine Copolymerisation der Mischung aus N-Carboxyanhydriden in Gegenwart eines Initiators.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin das N-Carboxyanhydrid-terminierte Polymer, das im zweiten Schritt erhalten wurde, mit einem Reagens der Formel H₂N-R₃-Y₂ umgesetzt wird, wobei: – R₃ aus (CH₂)_m, Arylen, C₁-C₆-Alkylarylen und Aryl-C₁-C₆-alkylen ausgewählt ist, – m von 2 bis 20 geht, – Y₂ ist -Z₄-A₄, – Z₄ aus NH, O, S, C(O)O, C(S)O, CO, CS, -OCH-O- und C=N-R₅ ausgewählt ist, – A₄ eine Schutzgruppe, die für Z₄ geeignet ist, ist, und – R₅ aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, Aryl und C₁-C₆-Alkylaryl, Heteroaryl und C₁-C₆-Alkyl-heteroaryl ausgewählt ist.
Biologisch abbaubarer Gegenstand, der ein Copolymer aufweist, das mindestens einen Rest beinhaltet, der aus einem Poly-α-aminosäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 abgeleitet ist, vorausgesetzt, dass die funktionelle(n) Endgruppe(n) eine ungesättigte Gruppe ist.
Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1, das eine L-Aminosäuresequenz aufweist und enzymatisch abgebaut werden kann.
Poly-α-aminosäurederivat gemäß Anspruch 1, das eine D-Aminosäuresequenz, die nicht abbaubar ist, zur Oberflächenveränderung eines Biomaterials aufweist.
Erzeugnis der Kopplung eines Biomoleküls mit einem Poly-α-aminosäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Erzeugnis gemäß Anspruch 17, worin das besagte Biomolekül aus einem therapeutischen Mittel, einem prophylaktischen Mittel, einem diagnostischen Mittel, Proteinen, Peptiden, Hormonen, Antikörpern und deren Fragmenten, Oligonucleotiden, Plasmiden, DNAs, Interleukinen, Interferonen und Enzymen und deren Fragmenten ausgewählt ist.
Synthetisches Polymer für ein Polymer-basiertes Trägervehikel oder -vektor zum Transport von DNA oder anderem Nucleinsäurematerial zu Targetzellen in einem biologischen System, das ein lineares Poly-α-aminosäurederivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.
Synthetisches Polymer für einen Polymer-basiertes Trägervehikel oder -vektor gemäß Anspruch 19, das zusätzlich eine synthetische Vektorkomponente wie Polyethylenimin, Poly-L-lysin, ein sternförmiges Dendrimer oder Chitosan aufweist.