ES2318106T3 - Oligonucleotidos que comprenden segmentos alternos y usos de los mismos. - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleósido que comprende primero y segundo segmentos alternos, en el que dicho primer segmento comprende al menos un arabinonucleósido, en el que dicho segundo segmento comprende al menos un 2''-desoxirribonucleósido, en el que dicho oligonucleósido comprende al menos 2 de cada uno de dichos primero y segundo segmentos, comprendiendo por ello al menos 4 segmentos alternos, en el que el número de residuos dentro de cada primeros segmentos y cada segundos segmentos puede ser el mismo o variable de un segmento a otro y dicho oligonucleósido no es S-ATATCCTTg TCgTATCCC, en el que N = 2''-desoxi-2''-fluoro-beta-D-arabinonucleótido (nucleótido FANA); n = nucleótido ADN; S = que contiene enlaces fósforotioato.

Description

Oligonucleótidos que comprenden segmentos alternos y usos de los mismos.
Campo de la invención
La invención se refiere a oligonucleósidos y oligonucleótidos y a los usos de ellos, y se refiere en particular a oligonucleósidos y oligonucleótidos modificados y a los usos de ellos.
Fundamento de la invención
Los oligonucleótidos se utilizan para una variedad de aplicaciones biotecnológicas, en base a su capacidad para conferir especificidad en virtud de su composición de secuencia. Dada, por ejemplo, su capacidad para diseñarse para fijar como objetivo una molécula que codifica proteína, tal como ARN, un uso particular de oligonucleótidos es en tecnología antisentido.
Oligonucleótidos antisentido (AONs)
Los oligonucleótidos antisentido (AONs) han atraído un interés considerable en el sector de la biotecnología, y tienen un potencial excepcional para su uso en estrategias terapéuticas contra un intervalo de enfermedades humanas. La formación de un dúplex entre el AON y su secuencia complementaria en su objetivo (usualmente ARN mensajero [mARN]) impide la traducción de tal ARN, en parte por "detención de la traducción" (mediante formación de dúplex entre el AON y el ARN objetivo, inhibiendo/impidiendo así la traducción completa por bloqueo físico o estérico de la maquinaria de traducción) pero, más importantemente, obteniendo degradación del ARN fijado como objetivo mediante la acción de ribonucleasa H (RNasa H), una enzima celular ubicua y endógena que degrada específicamente la cadena de ARN en el dúplex AON/ARN.
Puesto que el sustrato natural de RNasa H es un heterodúplex de ADN/ARN, se ha utilizado ADN para tecnología antisentido. Sin embargo, como el suero y las necleasas intracelulares degradan rápidamente AONs con enlaces fosfodiéster (PDE), el AON consistente en PDE-ADN ha tenido utilidad limitada en tales sistemas. El ADN con enlaces fósforotioato (PS-ADN) puede inducir degradación con RNasa H del ARN fijado como objetivo, y es resistente a degradación por suero y nucleasas celulares, pero no obstante forma dúplex más débiles con el ARN objetivo en comparación con PDE-ADN.
RNasa H
RNasa H degrada selectivamente la cadena de ARN de un heterodúplex de ADN/ARN (Hausen, P.; Stein, H. Eur. J. Biochem., 1970, 14, 279). Estudios con extractos de células eucariotas que contienen RNasa H sugieren que ambas enzimas procariotas y eucariotas presentan propiedades similares de división de ARN (Monia et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Crooke et al. Biochem. J. 1995, 312, 599; Lima, W.F.; Crooke, S.T. Biochemistry 1997, 36, 390). Se piensa que RNasa H1 de E. coli se une a la ranura pequeña de la doble hélice de ADN/ARN y divide el ARN por actividades de endonucleasa y exonucleasa 3' a 5' elaboradora (Nakamura, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 11535; Fedoroff, O.Y. et al., J. Mol. Biol. 1993, 233, 509). La eficacia de la degradación por RNasa H presenta una dependencia de la secuencia mínima y, como se ha mencionado antes, es bastante sensible a cambios químicos en el oligonucleótido antisentido.
Hay por tanto necesidad de un oligonucleótido mejorado, para aplicarse a una o más de las limitaciomes indicadas antes.
El documento WO 9967378 describe oligonucleótidos de azúcar modificado uniformemente construidos a partir de residuos de arabinonucleótido o arabinonucleótido modificado.
Compendio de la invención
Según un primer aspecto, la invención proporciona un oligonucleósido que comprende primero y segundo segmentos alternos, en el que el primer segmento comprende al menos un arabino nucleósido, y en el que el segundo segmento comprende al menos un 2'-desoxirribonucleósido. El oligonucleósido comprende al menos 2 de cada uno de los primero y segundo segmentos, comprendiendo por ello al menos 4 segmentos alternos.
En una realización, el oligonucleósido comprende un enlace internucleósido que comprende un fosfato, siendo por ello un oligonucleótido. En algunas realizaciones, los arabino nucleósidos y/o 2'-desoxirribonucleósidos comprenden un fosfato, siendo por ello nucleótidos de azúcar modificado y/o 2'-desoxirribonucleótidos.
En una realización, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende segmentos o unidades alternadas de arabinonucleótidos y 2'-desoxirribonucleótidos, en los que dichos segmentos o unidades comprenden cada uno independientemente al menos un arabinonucleótido o 2'-desoxirribonucleótido, respectivamente. En una realización, el oligonucleótido comprende al menos 2 segmentos de arabinonucleótido y al menos 2 segmentos de 2'-desoxirribonucleótido, teniendo por ello al menos 4 de las unidades alternadas.
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En una realización, el arabino oligonucleótido es capaz de adoptar una conformación de tipo ADN.
En una realización, los segmentos comprenden cada uno independientemente de alrededor de 1 a aproximadamente 6 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos. En realizaciones adicionales, los segmentos comprenden cada uno independientemente de alrededor de 2 a aproximadamente 5 o de alrededor de 3 a aproximadamente 4 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos. En una realización adicional, los segmentos comprenden cada uno independientemente aproximadamente 3 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene una estructura seleccionada del grupo constituido por:
a)
(A_{x}-D_{y})_{n}
I
b)
(D_{y}-A_{x})_{n}
II
c)
(A_{x}-D_{y})_{m}-A_{x}-D_{y}-A_{x}
III
d)
(D_{y}-A_{x})_{m}-D_{y}-A_{x}-D_{y}
IV
en las que cada m, x e y son cada uno independientemente un número entero mayor que, o igual a, 1, n es un número entero mayor que, o igual a, 2, A es un arabino nucleótido y D es un 2'-desoxirribonucleótido.
En una realización, el arabino nucleótido mencionado antes comprende un sustituyente 2' seleccionado del grupo constituido por grupos flúor, hidroxilo, amino, ciano, azido, -CH=CH_{2}, -C\equivCH, alquilo, alquilo funcionalizado, alcoxi y alcoxi funcionalizado. En una realización, el grupo alquilo es un grupo alquilo inferior. En una realización, el grupo alquilo inferior se selecciona del grupo constituido por grupos metilo, etilo y propilo. En una realización, el grupo alquilo funcionalizado se selecciona del grupo constituido por grupos metilamino, etilamino y propilamino. En una realización, el grupo alcoxi se selecciona del grupo constituido por grupos metoxi, etoxi y propoxi. En una realización, el grupo alcoxi funcionalizado es -O(CH_{2})_{q}-R, en el que q = 2, 3 o 4 y -R se selecciona del grupo constituido por grupos -NH_{2}, -OCH_{3} y -OCH_{2}CH_{3}.
En una realización, el sustituyente 2' es flúor y el arabinonucleótido es un 2'-fluoroarabinonucleótido (2'F-ANA; también abreviado "FANA").
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes comprende uno o más enlaces internucleótido seleccionados del grupo constituido por:
a)
fosfodiéster;
b)
fosfotriéster;
c)
fósforotioato;
d)
fósforoditioato;
e)
Rp-fósforotioato;
f)
Sp-fósfototioato;
g)
boranofosfato;
h)
metileno (metilimino) (3'CH_{2}-N(CH_{3})-O5');
i)
3'-tioformacetal (3'S-CH_{2}-O5');
j)
amida (3'CH_{2}-C(O)NH-5');
k)
metilfosfonato;
l)
fósforoamidato (3'-OP(O_{2})-N5'); y
m)
cualquier combinación de (a) a (l).
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En una realización, el oligonucleótido mencionado antes consiste en aproximadamente 30 nucleótidos o menos, en una realización adicional, de alrededor de 8 a aproximadamente 25 nucleótidos, en una realización adicional todavía aproximadamente 18 nucleótidos.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura I en la que x = 1, y = 1 y n = 9, teniendo por ello una estructura:
A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura II en la que x = 1, y = 1 y n = 9, teniendo por ello una estructura:
D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura III en la que x = 2, y = 2 y m = 3, teniendo por ello una estructura:
A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura IV en la que x = 2, y = 2 y m = 3, teniendo por ello una estructura:
D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura I en la que x =3, y = 3 y n = 3, teniendo por ello una estructura:
A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura II en la que x = 3, y = 3 y n = 3, teniendo por ello una estructura:
D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura III en la que x = 4, y = 3 y m = 1, teniendo por ello una estructura:
A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes tiene la estructura IV en la que x = 4, y = 3 y m = 1, teniendo por ello una estructura:
D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D.
En una realización, el oligonucleósido mencionado antes comprende además un tercer segmento que comprende un nucleósido modificado, en el que dicho tercer segmento es adyacente a (a) el extremo 5' de dichos primero y segundo segmentos alternos, (b) el extremo 3' de dichos primero y segundo segmentos alternos o (c) ambos (a) y (b).
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes comprende además un tercer segmento que comprende un nucleótido modificado, en el que dicho tercer segmento es adyacente a (a) el extremo 5' de dichos primero y segundos segmentos alternos, (b) el extremo 3' de dichos primero y segundo segmentos alternos o (c) ambos (a) y (b). En una realización, el ribonucleótido modificado comprende una modificación en su posición 2'. En una realización, la modificación 2' se selecciona del grupo constituido por grupos metoxi, metoxietilo, fluoro y propilamino.
En una realización, el oligonucleótido mencionado antes es antisentido para un ARN objetivo.
La invención proporciona además un método para impedir o disminuir la traducción, la transcripción inversa y/o la replicación de un ARN objetivo en un sistema, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido mencionado antes. En una realización, el sistema se elige del grupo constituido por una célula, tejido o sujeto. En una realización, la célula, tejido o sujeto es una célula, tejido o sujeto de mamífero. En una realización adicional, una célula, tejido o sujeto humanos.
La invención proporciona además un método para inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema, comprendiendo el método poner en contacto el ARN objetivo con el oligonucleótido mencionado antes. En una realización, la división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una transcriptasa inversa de un virus. En una realización, el virus es un virus patógeno humano, en una realización adicional, el virus se selecciona del grupo constituido por HIV (por ejemplo, HIV-1 y HIV-2) y hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B). En una realización, la división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una enzima RNasa H de origen procariota o eucariota. En una realización, la RNasa H eucariota es una RNasa H de mamífero, en una realización adicional, una RNasa H humana (por ejemplo, RNasa H1 y RNasa H2).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención proporciona además un método para impedir o disminuir la traducción, transcripción inversa y/o replicación de un ARN objetivo en un sistema, y/o para detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema y/o validar un objetivo génico en un sistema, cuyo método comprende:
a)
poner en contacto el ARN objetivo con el oligonucleótido mencionado antes; y
b)
permitir la división por RNasa H del ARN objetivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además un método para efectuar un procedimiento seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo en un sistema; y
(g)
cualquier combinación de (a) a (f);
cuyo método comprende poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido mencionado antes.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además un método para efectuar un procedimiento seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo en un sistema; y
(g)
cualquier combinación de (a) a (f);
cuyo método comprende introducir el oligonucleótido mencionado antes en dicho sistema.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere además a un uso del oligonucleótido mencionado antes para uso médico o de investigación. En algunas realizaciones, el uso médico o de investigación se selecciona del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
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La invención proporciona además un uso del oligonucleótido mencionado antes para la preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para un uso seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
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La invención proporciona además una composición que comprende el oligonucleótido mencionado antes mezclado con un vehículo aceptable farmacéuticamente. En una realización, la composición es para un uso seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
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La invención proporciona además un paquete comercial que comprende el oligonucleótido mencionado antes junto con instrucciones para su uso. En una realización, las instrucciones son para un uso seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
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Descripción breve de los dibujos
Figura 1. Estructuras de ejemplos de ciertos componentes nucleótidos utilizados en oligonucleótidos antisentido (AONs).
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Figura 2. División mediada por RNasa HII humana de ARN formando dúplex con diversos oligonucleótidos antisentido según ciertas realizaciones de la invención. (A). Análisis electroforético de productos de degradación de ARN objetivo marcado con ^{32}P. Se incubaron dúplex AON/5'-[^{32}P]-ARN con RNasa HII humana a temperatura ambiente, y se tomaron partes alícuotas a los 0, 5, 10 y 20 min, se sometieron a electroforesis y se visualizaron los productos de reacción por autorradiografía. (B). 5'-[^{32}P]-objetivo de longitud completa residual en función del tiempo de reacción. Se obtuvieron datos por análisis densitométrico del autorradiograma mostrado en A.
Figura 3. Capacidad de los diversos AONs listados en la Tabla 1, según ciertas realizaciones de la invención, para obtener degradación por RNasa H de ARN objetivo. Se incubaron dúplex AON/5'-[^{32}P]-ARN con RNasa HII humana (barras negras) o RNasa HI de E. coli (barras sombreadas) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se resolvieron después las mezclas de reacción por electroforesis, se visualizaron por autorradiografía y se cuantificó por densitometría la pérdida de ARN intacto. Los valores se normalizan a los encontrados para todos los AON 2 de 2'F-ANa como 100%.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a oligonucleósidos que comprenden segmentos alternos ("altímeros") de arabino nucleósidos y 2'-desoxirribonucleósidos. En una realización, el oligonucleósido o nucleósidos comprenden un fosfato, siendo por ello oligonucleótido u oligonucleótidos, respectivamente.
En una realización, tales "altímeros" comprenden segmentos alternos de arabinonucleótido (ANA) tales como 2'F-ANA (o FANA) y ADN. "Arabinonucleótido" según se usa aquí se refiere a un nucleótido que comprende un azúcar arabinofuranosa.
Los resultados presentados aquí incluyen estudios de (1) afinidad de unión de oligonucleótido a ARN objetivo y (2) capacidad de oligonucleótido para obtener división por RNasa H de un ARN objetivo. Se evaluaron ambos "altímeros" enlazados por fosfodiéster y fósforotioato en los resultados descritos aquí.
Por consiguiente, la invención se refiere a oligonucleótidos modificados que se usan en realizaciones para impedir selectivamente la expresión génica de manera específica de la secuencia. En una realización, la invención se refiere a la inhibición selectiva de biosíntesis de proteínas mediante una estrategia antisentido, usando cadenas cortas que comprenden segmentos o unidades alternadas de ácidos nucleicos de azúcar modificado (por ejemplo, ácidos arabinonucleicos [por ejemplo, FANA]) y ADN. Cada segmento o unidad puede contener uno o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso de oligonucleótidos modificados que comprenden unidades alternadas de ácidos nucleicos de azúcar modificado y ADN, para hibridarse con ARN complementario (en una realización, exactamente complementario) tales como ARN mensajero celular, ARN vírico, etc. En una realización adicional, la invención se refiere al uso de tales oligonucleótidos modificados para hibridarse con, e inducir división de, ARN complementario mediante activación/inducción por RNasa H de actividad de RNasa H.
En una realización, la invención se refiere a quimeras de oligonucleótido antisentido (AON) construidas a partir de arabino nucleótidos y 2'-desoxirribonucleótidos, que en ciertas realizaciones están modificados, que son capaces de formar un dúplex con una secuencia de ARN objetivo. En una realización, los dúplex AON/ARN resultantes son sustratos para RNasa H, una enzima que reconoce tal dúplex y degrada la porción objetivo de ARN. La división mediada por RNasa H de objetivos de ARN se considera un mecanismo principal de acción de olinucleótidos antisentido.
La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado y sorprendente de que quimeras antisentido construidas a partir de unidades o segmentos alternos de arabino nucleótidos tales como ANA modificado (tales como 2'-desoxi-2'-fluoro-p-D-arabinonucleótidos [FANA]), y 2'-desoxirribonucleótidos (ADN), conteniendo cada unidad uno o más de tales residuos, son superiores para obtener actividad de RNasa H (por ejemplo, RNasa H eucariota) in vitro en comparación con (a) la estructura de ADN nativa y (b) oligómeros de FANA modificados uniformemente. De modo similar, la presente invención muestra que la competencia de RNasa H de oligodesoxinucleótidos (tales como ADN) puede mejorarse insertando tales nucleótidos de azúcar modificado (por ejemplo, residuos de arabinonucleótido [por ejemplo, FANA]) dentro de la cadena de oligonucleótido. Por consiguiente, los oligonucleótidos de la invención que comprenden unidades o segmentos alternos de arabino nucleótido y desoxirribonucleótido, son útiles como agentes terapéuticos y/o herramientas para el estudio y control de la expresión génica específica en células y organismos, por ejemplo, para una variedad de usos médicos y de investigación. Los oligonucleótidos de la invención también son útiles para métodos de diagnóstico y detección para identificar la presencia de un ácido nucleico particular, en base a su capacidad para fijar como objetivo el ácido nucleico.
"Nucleósido de azúcar modificado" o "nucleótido de azúcar modificado" según se usan aquí, se refieren a un nucleósido o nucleótido, respectivamente, que tiene una estructura de azúcar diferente o modificada en comparación con el resto de azúcar de un desoxirribonucleósido o desoxirribonucleótido, respectivamente, o ribonucleósido o ribonucleótido, respectivamente, nativo. Tales modificaciones incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cambios en la conformación del anillo de azúcar, sustitución o adición de diferentes estructuras de anillo y modificación (sustitución, supresión o adición) de cualesquiera sustituyentes del anillo. En una realización adicional, tal nucleósido o nucleótido de azúcar modificado, es capaz de adoptar una conformación de tipo ADN. Una "conformación de tipo ADN" según se usa aquí se refiere a la estructura de azúcar del nucleósido o nucleótido, y se refiere a una conformación que recuerda la conformación de un residuo 2'-desoxirribonucleósido o 2'-dsoxirribonucleótido nativo, es decir, una cuyo residuo de azúcar es capaz de adoptar una conformación C2'-endo (frunce sur) y/o O4'-endo (frunce este). Como los arabinonucleótidos pueden adoptar tal conformación C2'-endo (frunce sur) y/o O4'-endo (frunce este), los ácidos arabinonucleicos y el ADN presentan preferencias de conformación similares (Venkateswarlu, D. et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5609; Trempe, J-F. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4896; Denison, A.Y. et al., Nucleic Acids Res. 2001, 29, 4284), y así, en realizaciones ANA y sus derivados (por ejemplo, FANA) son un tipo de nucleótido tipo ADN como se define aquí. Otros nucleótidos de tipo ADN incluyen, aunque sin limitarse a ellos, alfa-L-LNA (Petersen, M. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001; 123; 7431) y ácidos ciclohexeno nucleicos (Wang, J. et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595).
En algunas realizaciones, los enlaces internucleótidos de los oligonucleótidos de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, grupos fosfodiéster, fosfotriéster, fósforotioato (5'O-P(S)O-3'O-, 5'O-P(O)O-3'O- y 5'O-P(O)O-3'S-), fósforoditioato, Rp-fósforotioato, Sp-fósforotioato, boranofosfato, metileno (metilimino), amida (3'-CH_{2}-CO-NH-5' y 3'-CH_{2}-NH-CO-5'), metilfosfonato, 3'-tioformacetal, (3'S-CH_{2}-O5'), amida (3'-CH_{2}-C(O)NH-5'); fósforoamidato (por ejemplo, 5'N-3'P) o cualesquiera combinaciones de ellos. El sustituyente 2', por ejemplo, del azúcar arabinosa en residuos de ANA, incluye, aunque sin limitarse a ellos, grupos flúor, hidroxilo, amino, ciano, azido, -CH=CH_{2}, -C\equivCH, alquilo (por ejemplo, alquilo inferior [por ejemplo, alquilo C_{1}-C_{9}], por ejemplo, metilo, etilo, propilo, etc.), alcoxi ([por ejemplo, alcoxi inferior, por ejemplo, alcoxi C_{1}-C_{9}], por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, etc.) y alquilo funcionalizado (por ejemplo, alquilo inferior funcionalizado [por ejemplo, 2'-CF_{3}]) y alcoxi (por ejemplo, grupos etilamino, propilamino y butilamino), y alcoxialquilo (por ejemplo, metoxietilo, etoxietilo, etc.). En una realización, el sustituyente 2' del azúcar arabinosa es flúor y el derivado de arabinonucleótido es 2'F-ANA (o FANA). Además de los descritos antes, el azúcar arabinosa incluye también el derivado carbocíclico (4'-CH_{2}) (por ejemplo, FANA carbocíclico). En algunas realizaciones, el nucleótido de azúcar modficado comprende otras cadenas principales que obtienen actividad de RNasa H (por ejemplo, ácidos nucleicos cerrados con alfa-L, ácidos ciclohexeno nucleicos) o por ribosas que carecen del átomo de oxígeno 2' electronegativo (por ejemplo, 2'-alquil-D-ribosa, 2'-SCH_{3}-D-ribosa).
Los solicitantes demuestran aquí que AON de cadena principal mezclada que comprenden segmentos alternos de un nucleótido de azúcar modificado (por ejemplo, ANA [por ejemplo, FANA]) y ADN ("altímeros") son capaces de obtener degradación por RNasa H (por ejemplo, RNasa HII humana) de ARN objetivo. Ciertos AON "altímeros", a saber, los que poseen segmentos de trinucleótidos alternos, son particularmente mejores a este respecto.
Por tanto, un oligonucleótido de la invención comprende segmentos o unidades alternos de arabino nucleótidos (por ejemplo, análogos de arabinonucleótidos [por ejemplo, FANA]) y 2'-desoxirribonucleótidos (ADN). El oligonucleótido comprende al menos 2 de cada uno de los segmentos de nucleótidos de azúcar modificado y 2'-desoxinucleótidos, teniendo por ello al menos 4 segmentos alternos en conjunto. Cada segmento o unidad alterna puede contener 1 o una pluralidad de nucleótidos. En algunas realizaciones, la pluralidad de nucleótidos puede consistir en 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos. El oligonucleótido puede contener en algunas realizaciones un número par o impar de segmentos o unidades alternos. El oligonucleótido puede comenzar y/o terminar con un segmento que contenga residuos de nucleótidos de azúcar modificado o residuos de ADN. Por consiguientes, en algunas realizaciones, los oligonucleótidos de la invención pueden representarse como sigue:
A_{1}-D_{1}-A_{2}-D_{2}-A_{3}-D_{3}...A_{z}-D_{z}
en los que cada uno de los A_{1}, A_{2}, etc. representa una unidad de uno más residuos de nucleótidos de azúcar modificado y cada uno de los D_{1}, D_{2}, etc. representa una unidad de uno o más residuos de ADN. El número de residuos dentro de cada unidad puede ser el mismo o variable de una unidad a otra. El oligonucleótido puede tener un número par o impar de unidades. El oligonucleótido puede empezar (es decir, en su extremo 5') con una unidad que contenga ANA o una unidad que contenga ADN. El oligonucleótido puede terminar (es decir, en su extremo 3') con una unidad que contenga nucleótido de azúcar modificado o una unidad que contenga ADN. El número total de unidades puede ser tan poco como 4 (es decir, al menos 2 de cada tipo).
En algunas realizaciones, la porción "altímero" de un oligonucleósido u oligonucleótido de la invención puede comprender adicionalmente uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados en (es decir, adyacentes a) sus extremos 5' y/o 3', incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, ribonucleósidos o ribonucleótidos modificados, tales como ribonucleósidos o ribonucleótidos 2'-modificados, tales como 2'-metoxi ARN (2'-O-Me-ARN) o 2'-metoxietil ARN (2'-MOE-ARN). Tal oligonucleótido basado en altímero 2'-O-Me-ARN -2'-Ome-ARN es capaz de obtener actividad de RNasa H de un objetivo de ARN adecuado, como se describe en los presentes Ejemplos.
En algunas realizaciones, la longitud total de un oligonucleótido de la invención es aproximadamente 30 o menos residuos de nucleótidos, en una realización adicional de alrededor de 8 a aproximadamente 25 residuos de nucleótidos. En realizaciones adicionales, la longitud es de alrededor de 9 a aproximadamente 24, de alrededor de 10 a aproximadamente 23, de alrededor de 11 a aproximadamente 22, de alrededor de 12 a aproximadamente 21, de alrededor de 13 a aproximadamente 20, de alrededor de 14 a aproximadamente 19, de alrededor de 15 a aproximadamente 18 o de alrededor de 16 a aproximadamente 17 residuos de nucleótidos. En una realización, la longitud de un oligonucleótido de la invención es 18 residuos de nucleótidos.
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En algunas realizaciones, los residuos de ADN pueden contener cualquiera de las bases seleccionadas entre adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T) o versiones que comprenden modificaciones de la base de nucleótidos o estructuras de la cadena principal. En algunas realizaciones, los residuos de ANA pueden contener cualquiera de las bases seleccionadas entre adenina (A), inosina (I), 2,6-diaminopurina (2,6-DAP), citosina (C), 5-metilcitosina (5meC), guanina (G) o timina (T) o uracilo (U).
Los AONs de esta invención contienen una secuencia que es complementaria (en ciertas realizaciones parcialmente complementaria y en otras realizaciones exactamente complementaria) con un "ARN objetivo". "Hibridación" según se usa aquí se refiere a unión con hidrógeno entre nucleótidos complementarios. El grado de complementariedad entre un AON y su secuencia objetivo puede ser variable, y en algunas realizaciones el AON es exactamente complementario con su secuencia objetivo como se ha indicado antes. Se entiende que no es esencial que un AON sea exactamente complementario con su secuencia objetivo para conseguir suficiente especificidad, es decir, para minimizar la unión no específica del oligonucleótido a secuencias no objetivo en las condiciones de unión particulares usadas (por ejemplo, condiciones fisiológicas in vivo o condiciones de ensayo in vitro). "ARN objetivo" se refiere a una molécula de ARN de interés que es el objetivo para hibridarse con/unirse a un oligonucleótido de la invención para impedir o disminuir por ejemplo la traducción, la transcripción inversa y/o la replicación del ARN. En algunas realizaciones, tal impedimento e inhibición es mediante una inducción de la división mediada por RNasa H del ARN objetivo, y por tanto, en una realización, la invención proporciona un método para dividir un ARN objetivo, cuyo método comprende poner en contacto el ARN con un oligonucleótido de la invención. En algunas realizaciones, tal división puede facilitarse adicionalmente proporcionando adicionalmente condiciones que conduzcan a actividad de RNasa H, tales como medios de tampón (por ejemplo, para controlar el pH y la fuerza iónica), medios de control de la temperatura y cualesquiera otros componentes que puedan contribuir a una inducción de actividad de RNasa H. En ciertas realizaciones, la actividad de RNasa H es de una enzima RNasa H o de una enzima multifuncional que posea actividad de RNasa H (por ejemplo, transcriptasa inversa de HIV). En ciertas realizaciones, tal actividad de RNasa H incluye, aunque sin limitarse a ella, actividad de RNasa H asociada con las transcriptasas inversas de virus patógenos humanos tales como HIV (por ejemplo, los retroviris HIV-1 y HIV-2) y hepadnavirus, por ejemplo, virus de la hepatitis B. En realizaciones adicionales, tal actividad de RNasa H incluye, aunque sin limitarse a ella, actividad de RNasa H asociada con una enzima RNasa H de origen procariota o eucariota, en una realización, de origen en mamíferos, en una realización, de origen humano. En realizaciones adicionales, tal actividad de RNasa H incluye, aunque sin limitarse a ella, actividad de RNasa H asociada con RNasa H1 y RNasa H2 (a las que se hace referencia a veces como RNasa HII) de origen eucariota o procariota. En una realización, tal actividad de RNasa H está asociada con RNasa H2 humana.
En algunas realizaciones, el ARN señalado antes incluye ARN mensajero, o ARN genómico vírico, de tal modo que el oligonucleótido pueda inhibir específicamente la biosíntesis de proteínas codificadas por el mARN, o inhibir la replicación del virus, respectivamente. Están dentro del alcance de la invención modificaciones parciales del oligonucleótido dirigidas al término 5' y/o 3', o a la cadena principal de fosfato o residuos de azúcar para aumentar sus propiedades antisentido (por ejemplo, resistencia a nucleasa). Como se demuestra en esta invención (véase después), estos oligonucleótidos cumplen uno de los requisitos para agentes terapéuticos antisentido, es decir, son capaces de unirse a ARN objetivo formando un dúplex AON/ARN, que en una realización es reconocido y degradado por RNasa H. Además, como se muestra en los Ejemplos posteriores, la eficacia mediante la cual los oligonucleótidos de "altímeros" de la invención promueven división de ARN es superior a la vista con AON que contiene sólo FANA y en algunos casos superior a la vista con AON que contiene sólo residuos de ADN. Esto sigue siendo cierto si los enlaces internucleótidos del "altímero" son enlaces fosfodiéster o fósforotioato.
Por tanto, los resultados presentados aquí establecen que los oligonucleósidos u oligonucleótidos que comprenden "altímeros" de la invención pueden usarse en realizaciones como agentes antisentido, y deben servir como agentes terapéuticos y/o herramientas valiosas para estudiar y controlar la expresión génica en células y organismos.
Como tales, en realizaciones alternativas, la invención proporciona moléculas antisentido que se unen a, inducen degradación de, y/o inhiben la traducción de (por ejemplo, induciendo actividad de RNasa H y/o efectuando "detención de la traducción" o bloqueo) un ARN objetivo (por ejemplo, mARN). Los ejemplos de aplicaciones de oligonucleótidos antisentido terapéuticos, incorporados aquí como referencia, incluyen: Patente de los EE.UU. Nº 5.135.917, otorgada el 4 de Agosto de 1992; Patente de los EE.UU. Nº 5.098.890, otorgada el 24 de Marzo de 1992; Patente de los EE.UU. Nº 5.087.617, otorgada el 11 de Febrero de 1992; Patente de los EE.UU. Nº 5.166.195, otorgada el 24 de Noviembre de 1992; Patente de los EE.UU. Nº 5.004.810, otorgada el 2 de Abril de 1991; Patente de los EE.UU. Nº 5.194.428, otorgada el 16 de Marzo de 1993; Patente de los EE.UU. Nº 4.806.463, otorgada el 21 de Febrero de 1989; Patente de los EE.UU. Nº 5.286.717, otorgada el 15 de Febrero de 1994; Patente de los EE.UU. Nº 5.276.019 y Patente de los EE.UU. Nº 5.269.423; Bioworld Today, 29 de Abril de 1994, pág. 3.
Preferiblemente, en moléculas antisentido, hay un grado suficiente de complementariedad con el ARN objetivo para evitar unión no específica de la molécula antisentido a secuencias no objetivo en condiciones en las que se desea unión específica, tales como condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico o, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos. El ARN objetivo para unión antisentido puede incluir no sólo la información para codificar una proteína, sino también ribonucleótidos asociados, los cuales nucleótidos por ejemplo de la región 5'-no traducida, la región 3'-no traducida, la región 5'de remate y de unión intrón/exón. Un método de examen para ácidos nucleicos antisentido y de ribozimas que puede usarse para proporcionar tales moléculas como inhibidores de PLA_{2} de la invención se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 5.932.435.
Las moléculas antisentido (oligonucleósidos u oligonucleótidos) de la invención pueden incluir las que contienen enlaces de la cadena principal interazúcar tales como fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, 3'-tioformacetal, amida, enlace interazúcar alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces interazúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta, fósforotioatos y aquellos con cadenas principales CH_{2}-NH-O-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2} (conocida como cadena principal metilen(metilimino) o MMI), CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2} y O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2} (en las que fosfodiéster es O-P(O)_{2}-O-CH_{2}). En realizaciones alternativas, los oligonucleótidos antisentido pueden tener una cadena principal ácido nucleico péptido (PNA, al que se hace referencia a veces como ácido nucleico "proteína" o "péptido"), en los que la cadena principal fosfodiéster del oligonucleótido puede sustituirse con una cadena principal poliamida en la que las bases nucleósidas se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno de aza o grupos metileno en la cadena principal poliamida (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 y Patente de los EE.UU. Nº 5.539.082). Los enlaces fosfodiéster pueden sustituirse con estructuras que son quirales y específicas enantiómeramente.
Como se ha indicado antes, los oligonucleótidos pueden incluir también especies que incluyen al menos una base de nucleótido modificado. Así, pueden usarse purinas y pirimidinas distintas de las encontradas normalmente en la naturaleza. Como se ha indicado antes, un nucleótido del segmento de nucleótidos de azúcar modificado (por ejemplo, el segmento ANA) puede comprender modificaciones en su porción pentofuranosilo. Son ejemplos de tales modificaciones nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo- y 2'-halógeno. Algunos ejemplos específicos de modificaciones en posición 2' de restos de azúcar que son útiles en la presente invención son OH, SH, SCH_{3}, F, OCN, O(CH_{2})_{n} NH_{2} o O(CH_{2})_{n} CH_{3} en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C_{1} a C_{10}, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF_{3}; OCF_{3}; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH_{3}; SO_{2} CH_{3}; ONO_{2}; NO_{2}; N_{3}; NH_{2}; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de división de ARN; un grupo informador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Uno o más grupos pentofuranosilo del nucleótido del segmento de nucleótidos de azúcar modificado puede sustituirse por otro azúcar, por un azúcar mímico tal como ciclobutilo o por otro resto que tome el lugar del azúcar.
"Nucleósido" se refiere a una base (por ejemplo, una purina [por ejemplo, A y G] o pirimidina [por ejemplo, C, 5-metil-C, T y U]) combinada con un azúcar (por ejemplo, [desoxi]ribosa, arabinosa y derivados). "Nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene un grupo fosfato incorporado a su resto de azúcar. En algunas realizaciones estas estructuras pueden incluir diversas modificaciones, por ejemplo, en los restos de base, azúcar y/o fosfato. "Nucleótido/nucleósido modificado" según se usa aquí se refiere a un nucleótido/nucleósido que difiere de, y excluye así, la forma nativa definida. "Oligonucleótido" según se usa aquí se refiere a una secuencia que comprende una pluralidad de nucleótidos unidos entre sí. Un oligonucleótido puede comprender estructuras modificadas en su estructura de cadena principal y/o en uno o más de sus componentes nucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de la invención tienen una longitud de aproximadamente 1 a 200 bases, en realizaciones adicionales de alrededor de 5 a aproximadamente 50 bases, de alrededor de 8 a aproximadamente 40 bases, y en realizaciones adicionales todavía, de alrededor de 12 a aproximadamente 25 bases de longitud.
"Alquilo" se refiere a grupos hidrocarbonados saturados de cadena recta y ramificada (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, etc.). "Alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos hidrocarbonados que tienen al menos un doble enlace C-C y un triple enlace C-C, respectivamente. "Alcoxi" se refiere a una estructura -O-alquilo. "Alquilamino" se refiere a estructuras -NH(alquilo) o -N(alquilo)_{2}. "Arilo" se refiere a estructuras cíclicas aromáticas sustituidas y no sustituidas (por ejemplo, grupos fenilo, naftilo, antracilo, fenantrilo, pirenilo y xililo). "Hetero" se refiere a un átomo distinto de C, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, N, O o S. En algunas realizaciones, los grupos mencionados antes pueden estar sustituidos.
Por consiguiente, en diversas realizaciones, puede usarse terapéuticamente un oligonucleótido modificado de la invención en formulaciones o medicamentos para prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de un ARN objetivo particular. En ciertas realizaciones, tal ácido nucleico objetivo está contenido en, o se deriva de, un agente infeccioso y/o se requiere para la función y/o viabilidad y/o replicación/propagación del agente infeccioso. En ciertas realizaciones, tal agente infeccioso es un virus, en ciertas realizaciones, un retrovirus, en una realización adicional, HIV. En realizaciones adicionales, la expresión de tal ácido nucleico objetivo está asociada con enfermedades que incluyen, aunque sin limitarse a ellas, enfermedades inflamatorias, diabetes, enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, restinosis) y cáncer. La invención se refiere a métodos correspondientes de tratamiento médico, en el que se administra una dosis terapéutica de un oligonucleótido modificado de la invención en una formulación aceptable farmacológicamente. Por consiguiente, la invención proporciona también composiciones terapéuticas que comprenden un oligonucleótiedo modificado de la invención y un excipiente o vehículo aceptable farmacológicamente. La composición terapéutica puede ser soluble en una solución acuosa a un pH aceptable fisiológicamente.
En una realización, tales composiciones incluyen un oligonucleótido de la invención en una cantidad eficaz terapéutica o profilácticamente suficiente para tratar o prevenir una enfermedad caracterizada por la expresión de un ácido nucleico objetivo particular, y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
Una "cantidad eficaz terapéuticanente" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durantes períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado, tal como una disminución en, o una prevención de, la expresión de un ácido nucleico objetivo particular. Una cantidad eficaz terapéuticamente de un ácido nucleico modificado de la invención puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del ácido nucleico modificado para obtener en el individuo una respuesta deseada. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz terapéuticamente es también una en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del compuesto son superados por los efectos beneficiosos terapéuticamente. Una "cantidad eficaz profilácticamente" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado, tal como prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de un ácido nucleico objetivo particular. Una cantidad eficaz profilácticamente puede determinarse como se ha descrito antes para la cantidad eficaz terapéuticamente. Para cualquier sujeto particular, pueden ajustarse con el tiempo regímenes de dosificación específicos según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.
Según se usa aquí "vehículo aceptable farmacéuticamente" o "excipiente" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares, que sean compatibles fisiológicamente. En una realización, el vehículo es adecuado para administración parenteral. Alternativamente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los vehículos aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias activas farmacéuticamente es muy conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se considera su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. Pueden incorporarse también en las composiciones compuestos activos suplementarios.
Las composiciones terapéuticas deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de ellos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como una lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearatos y gelatina. Además, un oligonucleótido de la invención puede administrarse en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo en una composición que incluya un polímero de liberación lenta. El oligonucleótido modificado puede prepararse con vehículos que protegerán al oligonucleótido modificado contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico) y copolímeros polilácticos poliglicólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la técnica.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando un compuesto ativo, tal como un oligonucleótido de la invención, en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de polvos estériles para preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado bajo vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril previamente del mismo. Según un aspecto alternativo de la invención, puede formularse un oligonucleótido de la invención con uno o más compuestos adicionales que aumenten su solubilidad.
Puesto que los oligonucleótidos de la invención son capaces de inducir la división mediada por RNasa H de un ARN objetivo, disminuyendo así la producción de la proteína codificada por el ARN objetivo, los oligonucleótidos modificados de la invención pueden usarse en cualquier sistema en el que sea deseable la inactivación o inhibición selectiva de un ARN objetivo particular. Como se ha indicado antes, los ejemplos de tales usos incluyen agentes terapéuticos antisentido, en los que la expresión del ARN objetivo está asociada con mal o enfermedad.
Un ejemplo adicional de tal uso es el agotamiento selectivo de un producto génico objetivo particular en un sistema para estudiar el(los) efecto(s) fenotípico(s) de tal supresión en el sistema. Observaciones hechas mediante tales estudios de agotamiento pueden permitir así la determinación de la función del producto génico objetivo. En ciertas realizaciones, tales usos incluyen "validación del objetivo", en la que la estrategia descrita antes permite la confirmación de si un ácido nucleico objetivo particular está asociado con un fenotipo o actividad particular, y permite así la "validación" del objetivo. El sistema indicado antes puede ser célula o exento de célula; in vitro o in vivo; procariota o eucariota.
La invención proporciona además paquetes comerciales que comprenden un oligonucleótido de la invención. En una realización, el paquete comercial comprende además instrucciones de uso del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, tales instrucciones de uso incluyen al menos una de las siguientes: uso del oligonucleótido para (a) disminuir la expresión de una secuencia de ARN objetivo; (b) inducir la división por RNasa H de una secuencia de ARN objetivo; (c) prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de un objetivo de ARN particular; (d) impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema; (e) impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema; (f) detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema; (g) validar un objetivo génico en un sistema; y (h) cualquier combinación de (a) a (g).
La invención se refiere además a un uso de un oligonucleótido de la invención, tal como para (a) disminuir la expresión de una secuencia de ARN objetivo; (b) inducir la división por RNasa H de una secuencia de ARN objetivo; (c) prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de un objetivo de ARN particular; (d) impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema; (e) impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema; (f) detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema; (g) validar un objetivo génico en un sistema; y (h) cualquier combinación de (a) a (g).
La invención proporciona además un uso de un oligonucleótido de la invención para la preparación de un medicamento, tal como para (a) disminuir la expresión de una secuencia de ARN objetivo; (b) inducir la división por RNasa H de una secuencia de ARN objetivo; (c) prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de un objetivo de ARN particular; (d) impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema; (e) impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema; (f) detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema; (g) validar un objetivo génico en un sistema; y (h) cualquier combinación de (a) a (g).
Aunque se han descrito aquí diversas realizaciones de la invención, pueden hacerse muchas adaptaciones y modificaciones dentro del alcance de la invención según el conocimiento general común de los expertos en esta técnica. Tales modificaciones incluyen la sustitución de equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invención con el fin de conseguir el mismo resultado de sustancialmente igual manera. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En las reivindicaciones, la expresión "que comprende" se usa como una expresión de extremo abierto, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a". Los siguientes ejemplos son ilustrativos
de diversos aspectos de la invención, y no limitan los amplios aspectos de la invención como se describe aquí.
Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y método
Síntesis de AONs. Se sintetizaron monómeros 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleósido 3'-O-cianoetilfósforoamidita 5'-monometoxitritilados como se ha descrito previamente [Wilds, C.J. & Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 3625; Elzagheid, M.I. et al., en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unidad 1.7, Beaucage, S.L., Bergstrom, D.E., Gli, G.D., reds., 2002]. Los oligonucleótidos mostrados en las Tablas 1 y 2 se sintetizaron a escala de 1 micromol usando un sintetizador de ADN Expedite 8909. Se usó como soporte sólido vidrio de poros controlados de alquilamina de cadena larga (LCAA-CPG). El ciclo de síntesis consistió en las siguientes etapas: (a) destritilación de nucleósido/flujo unido a CPG (3% de ácido tricloroacético/diclorometano): 150 s; (b) acoplamiento de monómeros 2'-F-arabinonucleósido (15 min) o 2'-desoxirribonucleósido 3'-fósforoamidita (2 min). La concentración de monómeros usados fue 50 mg/ml para monómeros de araF-T, araF-C y ADN, y 60 mg/ml para araA y araF-G (acetonitrilo como disolvente): (c) acetilación usando la etapa de remate estándar: 20 s. La solución de remate consistía en 1:1 (v/v) de reactivos "cap A" y "cap B". (Cap A: anhídrido acético/colidina/THF, 1:1:8; cap B: N-metilimidazol/THF, 4:21); (d) lavado extenso con acetonitrilo (50 impulsos); (e) oxidación con yodo/agua de 20 segundos (en el caso de oligómeros enlazados con fosfodiéster) o sulfuración de 10 min (en el caso de PS-oligómeros) con una solución reciente de 3-amino-1,2,4-ditiazolina-5-tiona (ADTT) 0,1 M en piridina/acetonitrilo (1/1, v/v); (f) lavado con acetonitrilo: 20 impulsos; (g) secado del soporte sólido por adición del reactivo de remate (véase etapa c anterior): 5 s; (h) lavado con acetonitrilo (20 impulsos).
Tras el montaje de la cadena, se dividieron del soporte sólido oligonucleótidos y se desprotegieron como se ha descrito previamente [Wilds, C.J. & Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 3625; Viazovkina, E. et al., en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unidad 4.15, Beaucage, S.L., Bergstrom, D.E., Gli, G.D., reds., 2002]. Los oligómeros crudos se purificaron por HPLC de intercambio aniónico seguida por desalación (cartuchos SepPak). Rendimientos: 50-100 unidades A_{260}. Condiciones para la purificación por HPLC: Columna Protein Pak DEAE-5PW (7,5 mm x 7,5 cm, Waters), Disolventes: Tampón A: H_{2}O; Tampón B: LiClO_{4} 1 M (o NaClO_{4} 1 M), Gradiente: 100% de tampón A isocrático durante 12 min, 100% de A-15% de B, lineal (durante 5 min), 15% de B- 55% de B, lineal (durante 60 min); el caudal se fijó en 1 ml/min, la temperatura se ajustó en 50ºC. El detector se fijó en 260 nm para cromatografía analítica y 290 nm para cromatografía preparativa. En estas condiciones, el oligómero de longitud completa deseado eluyó el último. Los oligonucleótidos se caracterizaron por electroforesis en gel y espectrometría de masas. Las secuencias de los oligonucleótidos usados se proporcionan en las Tablas 1 y 2.
Mediciones de T_{m}. AON y oligonucleótidos de ARN objetivo complementarios se mezclaron en relaciones equimolares en tampón de KCl 140 mM, MgCl_{2} 1 mM y Na_{2}HPO_{4} 5 mM, pH 7,2, para proporcionar una concentración de dúplex total de aprox. 5 \muM. Se calentaron muestras a 90ºC durante 15 min, y se enfriaron después lentamente a temperatura ambiente. La solución de dúplex AON/ARN se expuso después a temperatura creciente (0,5ºC/medición) y se determinó la absorbancia UV a 260 nm después de equilibrio de temperatura. Los valores de T_{m} proporcionados en las Tablas 1 y 2 se calcularon usando el método de línea de base y tienen una incertidumbre de \pm 0,5ºC.
Purificación de RNasa H. Se purificó RNasa HI de E. coli como se ha descrito previamente (7). Se sobreexpresó y purificó RNasa HII humana siguiendo procedimientos publicados (Wu, H. et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 28270).
Ensayo de RNasa H. Los ensayos de RNasa H se realizaron a temperatura ambiente (\sim20ºC) (oligonucleótidos homopolímeros mostrados en la Tabla 1) o 37ºC (oligonucleótidos de base mezclada mostrados en la Tabla 2). Los sustratos de dúplex de ácido nucleico homopolímero se prepararon mezclando el AON enlazado con fosfodiéster (2 pmoles) con ARN oligo-rA_{18} objetivo complementario 5'-marcado con ^{32}P (0,5 pmoles; SEQ ID NO: 21) en 10 \mul de Tris-HCl 60 mM (pH 7,8) que contenía KCl 60 mM y MgCl_{2} 2,5 mM, seguido por calentamiento a 90ºC durante 2 minutos y enfriamiento lento a temperatura ambiente. Las soluciones de sustrato de dúplex se dejaron permanecer a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usar. Las reacciones se iniciaron por adición de RNasa H (7 ng de enzima en 2 \mul de tampón) y se separaron en diversos momentos partes alícuotas y se apagaron por adición de un volumen igual de formamida desionizada del 98% que contenía EDTA 10 mM, 1 mg/ml de azul de bromofenol y 1 mg/ml de xileno cianol. Después de calentar a 100ºC durante 5 min, los productos de reacción se resolvieron por electroforesis en geles de determinación de secuencia de poliacrilamida del 16% que contenían urea 7 M, se visualizaron por autorradiografía y se cuantificó la formación de producto por densitometría.
Se prepararon híbridos de AON/ARN de composición de base mezclada mezclando la cadena de AON con fósforotioato (véanse oligómeros listados en la Tabla 2) con el correspondiente ARN objetivo radiomarcado 5' (AAG GGA UAC GAC AAG GAU AUA A [SEQ ID NO: 22]). Este ARN se marcó en el extremo 5' con ^{32}P usando [\gamma-^{32}P]-ATP usando quinasa de polinucleótido T4. Veinte pmoles (20 pmoles) de oligonucleótidos antisentido y 10 pmoles de ARN marcado 5' con ^{32}P se mezclaron en un tampón (100 \mul final) que contenía Tris.HCl 60 mM (pH 7,8), KCl 60 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, se calentó a 90ºC durante 5 minutos y se enfrió lentamente a temperatura ambiente. Para iniciar las reacciones, se añadió RNasa H humana (5 ng en 2 \mul de tampón) a 8 \mul de la solución de sustrato anterior. Después de incubar a 37ºC, se terminaron las reacciones añadiendo un volumen igual de tampón de carga desnaturalizante (formamida desionizada del 98%, EDTA 10 mM, 1 g/ml de azul de bromofenol y 1 mg/ml de xileno cianol). Los productos se separaron en un gel del 16% (p/v) de poliacrilamida desnaturalizante/gel de urea 7 M en tampón Tris-borato/EDTA a 2000 v durante aproximadamente 2 h. Después de electroforesis, se expuso el gel a una película de rayos X y los autorradiogramas resultantes se escanearon y cuantificaron.
Ensayo de luciferasa. Se cultivaron células HeLa X1/5 (transfectadas establemente con el gen de luciferasa y que expresan una enzima luciferasa funcional) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS). Se sembraron células en placas de 96 pocillos a razón de 2 x 10^{4} células/pocillo. Se realizaron experimentos antisentido 24 h después de sembrar, en cuyo momento las células eran 80% confluentes. Se usó lipofectina para suministrar a las células oligonucleótidos antisentido. Brevemente, se diluyeron oligonucleótidos antisentido y lipofectina con DMEM sin suero para proporcionar una concentración final 10x de antisentido y 50 \mug/ml de lipofectina. Se mezclaron en tubos de plástico volúmenes iguales de soluciones de oligonucleótido y lipofectina y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejo. Este complejo se diluyó 5 veces con DMEM que contenía 10% de FBS, y se sustituyó después el medio de cultivo de células con esta mezcla y se incubaron las células durante 4 horas a 37ºC. Se separó de las células la mezcla antisentido/lipofectina y se sustituyó con DMEM que contenía 10% de FBS, y se incubaron después las células durante 16 horas más a 37ºC. Después de esta incubación de 16 horas adicional, se valoró la actividad celular de luciferasa usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se separó el medio de cultivo, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato y se lisaron después las células. Se transfirieron partes alícuotas de los lisados de células a microplacas de ensayo, se añadió solución de sustrato de luciferina y se midió inmediatamente la luminiscencia resultante usando un espectrofluorómetro de microplacas SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) fijado en modo de lectura de luminiscencia.
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Ejemplo 2 Estabilidad de dúplex altímero:ARN
Los solicitantes demuestran aquí que oligonucleótidos de "altímeros" de ANA/ADN (por ejemplo, FANA/ADN) forman dúplex con ARN objetivo (Tablas 1 & 2), y que la temperatura de fusión para estas quimeras de AON se correlaciona directamente con el contenido de FANA. Estudios previos han mostrado que 2'-OMe ARN AON se une también a ARN objetivo con mayor afinidad que el correspondiente ADN AON. Sin embargo, la cadena principal mezclada 2'-OMe ARN/ADN AON (SEQ ID NOs: 8-10) sólo mostró afinidad de unión térmica similar o más baja para ARN objetivo en comparación todos los ADN AON (SEQ ID NO: 1).
TABLA 1 AONs de altímeros y su formación de dúplex con ácido octadecarriboadenílico (r-A_{18}) objetivo
1 
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Ejemplo 3 Capacidad de AON de la invención para obtener degradación por RNasa H de ARN objetivo
Estudios con AON de cadena principal mezclada sugieren que la capacidad de estos AON para obtener degradación por RNasa H del ARN objetivo in vitro predice la capacidad de estos AON para inhibir la expresión génica intracelular (Monia, B.P. et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Gutierrez, A.J. et al., Biochemistry 1997, 36, 743; Flanagan, W.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3513). Los solicitantes evaluaron por tanto dúplex de los diversos AON listados en la Tabla 1 unidos a ARN complementario como sustratos para RNasa HI de El coli y RNasa HII humana. La Figura 2 muestra que todas las quimeras de FANA/ADN indujeron división de ARN objetivo por RNasa HII humana. La eficacia de división por RNasa H aumentó a medida que aumentaba el tamaño de los segmentos de ADN alternos dentro del fondo de FANA. Se notó una actividad óptima con SEQ ID NO: 5, que comprende segmentos de trinucleótidos alternos de FANA y ADN. La capacidad de este AON de "altímeros" para obtener degradación por RNasa HII humana de ARN objetivo era significativamente mejor que la del equivalente de todo ADN SEQ ID NO: 1. Además,
esta característica de SEQ ID NO: 5 se mejoró con relación a la SEQ ID NO: 7 de FANA/ADN/FANA (Figura 3).
A diferencia de AON de "altímeros" constituido por FANA y ADN, un AON similar (SEQ ID NOs: 8 y 9) constituido por 2'-O-metil ARN y ADN mostró sólo mala capacidad para obtener degradación por RNasa H de ARN objetivo (Figura 3).
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Ejemplo 4 Efecto de oligonucleótidos antisentido en expresión de luciferasa
Se prepararon diversos oligonucleótidos y se caracterizaron por unión a un ARN objetivo que codifica luciferasa, y se ensayó su efecto en la expresión de luciferasa, como se ha descrito antes. Los resultados se presentan en la Tabla 2. Con la excepción de los testigos "arrebatados" y "desadaptados" mostrados después, todos los oligonucleótidos que comprendían segmentos alternos de FANA/ADN presentaban inhibición significativa de la actividad de luciferasa. Aunque tal inhibición era mayor con un oligonucleótido de 3 segmentos alternos de nucleótido (SEQ ID NO: 12), se observó también en los que se añadieron nucleótidos de 2'-metoxi ARN flanqueantes a un oligonucleótido alterno de FANA/ADN (por ejemplo, SEQ ID NOs. 15 y 16). Los oligonucleótidos que comprendían segmentos alternos de FANA/ADN eran superiores a este respecto en comparación con un oligonucleótido de ADN puro (SEQ ID NO: 11) o un oligonucletido "de huecos" 2'-metoxi ARN-ADN-2'-metoxi ARN (SEQ ID NO: 20) que sólo presentaba niveles muy marginales de inhibición en comparación con testigos no oligonucleótidos.
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TABLA 2 Propiedades físicas y biológicas de oligonucleótidos AON
2 
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<110> MCGILL UNIVERSITY ET AL.
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<120> OLIGONUCLEÓTIDOS QUE COMPRENDEN SEGMENTOS ALTERNOS Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> 85827-63
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<150> US 60/352,873
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<151> 2002-02-01
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<160> 22
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 1
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tttttttttt ttttttt 
\hfill
18 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<220>
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<221> característica variada
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<222> (1)..(18)
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<223> Restos 1 a 18, son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
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<400> 2
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nnnnnnnnnn nnnnnnnn 
\hfill
18 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<220>
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<221> característica variada
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<222> (1)..(17)
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<223> Restos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
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<220>
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<221> característica variada
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<222> (1)..(17)
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<223> Restos 1, 3, 5, 7; 9, 11, 13, 15 y 17 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
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<400> 3
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ntntntntnt ntntntnt 
\hfill
18 
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<210> 4
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<220>
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<221> característica variada
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<222> (1)..(18)
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<223> Restos 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17 y 18 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
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<400> 4
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nnttnnttnn ttnnttnn 
\hfill
18 
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<210> 5
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<220>
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<221> característica variada
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<222> (1)..(15)
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<223> Restos 1-3, 7-9 y 13-15 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nnntttnnnt ttnnnttt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-4, 8-11 y 15-18 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nnnntttnnn ntttnnnn 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-6 y 13-18 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nnnnnntttt ttnnnnnn 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17 son 2'-O-metil-D-uridina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ututututut utututut 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-3, 7-9, y 13-15 son 2'-O-metil-D-uridina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
uuutttuuut ttuuuttt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-6 y 13-18 son 2'-O-metil-D-uridina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
uuuuuutttt ttuuuuuu 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatccttgt cgtatccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 2,7,8,13 y 15 son 2'-deoxi-2'-fluoroaminotimidina; restos 1,3 y 14 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina; resto 9 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina 14 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina; resto 9 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nnntccnnnt cgnnnccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; restos 2, 4, 7 y 8 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina; restos 5 y 6 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nnnnnnnngt cgtatccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 2, 8 y 13 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; restos 3 y 5 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina; restos 12 y 16-18 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-17 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
nngctnnnca nnngann 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-O-metil-D-adenosina; restos 2, 4 y 15 son 2'-O-metil-D-uridina; restos 16-18 son 2'-O-metil-D-citidina; restos 7 y 8 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; resto 11 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina; resto 12 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada <222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auauccnngt nntauccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-O-metil-D-adenosina; restos 2, 4 y 15 son 2'-O-metil-D-uridina; restos 16-18 son 2'-O-metil-D-citidina; resto 7 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; restos 5, 6 y 11 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina; resto 12 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada <222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auaunnntgt nntauccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-O-metil-D-adenosina; restos 2, 4 y 15 son 2'-O-metil-D-uridina; restos 16-18 son 2'-O-metil-D-citidina; restos 7 y 8 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; restos 5 y 6 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina; resto 9 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auaunnnnnt cgtauccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-O-metil-D-adenosina; restos 2, 4 y 15 son 2'-O-metil-D-uridina; restos 16-18 son 2'-O-metil-D-cytidine; restos 7, 8, 10 y 13 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; resto 14 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina; restos 5, 6 y 11 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinocitidina; restos 9 y 12 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoguanosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auaunnnnnn nnnnuccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1, 3, 4 y 16 son 2'-O-metil-D-adenosina; resto 2 es 2'-O-metil-D-uridina; restos 17-19 son 2'-O-metil-D-citidina; restos 9 y 12 son 2'-deoxi-2'-fluoroarabinotimidina; resto 14 es 2'-deoxi-2'-fluoroarabinoadenosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auaaccttnt cntnaccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1 y 3 son 2'-O-metil-D-adenosina; restos 2, 4 y 15 son 2'-O-metil-D-uridina; restos 16-18 son 2'-O-metil-D-citidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 1-18 están unidos por enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
auauccttgt cgtauccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN de oligonucleótido diana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 
\hfill
18 
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<210> 22
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<211> 22
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<212> ARN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> ARN de oligonucleótido diana
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagggauacg acaaggauau aa 
\hfill
22

Claims (68)

1. Un oligonucleósido que comprende primero y segundo segmentos alternos, en el que dicho primer segmento comprende al menos un arabinonucleósido, en el que dicho segundo segmento comprende al menos un 2'-desoxirribonucleósido, en el que dicho oligonucleósido comprende al menos 2 de cada uno de dichos primero y segundo segmentos, comprendiendo por ello al menos 4 segmentos alternos, en el que el número de residuos dentro de cada primeros segmentos y cada segundos segmentos puede ser el mismo o variable de un segmento a otro y dicho oligonucleósido no es S-ATATCCTTg TCgTATCCC, en el que N = 2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleótido (nucleótido FANA); n = nucleótido ADN; S = que contiene enlaces fósforotioato.
2. El oligonucleósido de la reivindicación 1, en el que (a) dicho oligonucleósido comprende además un enlace internucleósidos que comprende un fosfato, siendo por ello un oligonucleótido, (b) en el que dicho arabinonucleósido comprende un fosfato incorporado, siendo por ello un arabinonucleótido, (c) en el que dicho 2'-desoxirribonucleósido comprende un fosfato incorporado, siendo por ello un 2'-desoxirribonucleótido o (d) cualquier combinación de (a) a (c).
3. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el que dicho arabinonucleótido es capaz de adoptar una conformación de tipo ADN.
4. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el que dichos segmentos comprenden cada uno independientemente de 1 a 6 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos.
5. El oligonucleótido de la reivindicación 4, en el que dichos segmentos comprenden cada uno independientemente de 2 a 5 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos.
6. El oligonucleótido de la reivindicación 5, en el que dichos segmentos comprenden cada uno independientemente de 3 a 4 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos.
7. El oligonucleótido de la reivindicación 6, en el que dichos segmentos comprenden cada uno independientemente 3 arabinonucleótidos o 2'-desoxirribonucleótidos.
8. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido tiene una estructura seleccionada del grupo constituido por:
a)
(A_{x}-D_{y})_{n}
I
b)
(D_{y}-A_{x})_{n}
II
c)
(A_{x}-D_{y})_{m}-A_{x}-D_{y}-A_{x}
III
d)
(D_{y}-A_{x})_{m}-D_{y}-A_{x}-D_{y}
IV
en las que cada m, x e y son cada uno independientemente un número entero mayor que, o igual a, 1, n es un número entero mayor que, o igual a, 2, A es un arabinonucleótido y D es un 2'-desoxirribonucleótido.
9. El oligonucleótido de la reivindicación 2, en el que el arabinonucleótido comprende un sustituyente 2' seleccionado del grupo constituido por grupos flúor, hidroxilo, amino, ciano, azido, -CH=CH_{2}, -C\equivCH, alquilo, alquilo funcionalizado, alcoxi y alcoxi funcionalizado.
10. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en el que dicho grupo alquilo es un grupo alquilo C_{1}-C_{9}.
11. El oligonucleótido de la reivindicación 10, en el que dicho grupo alquilo C_{1}-C_{9} se selecciona del grupo constituido por grupos metilo, etilo y propilo.
12. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en el que dicho grupo alquilo funcionalizado se selecciona del grupo constituido por grupos metilamino, etilamino y propilamino.
13. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en el que dicho grupo alcoxi se selecciona del grupo constituido por grupos metoxi, etoxi y propoxi.
14. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en el que dicho grupo alcoxi funcionalizado es -O(CH_{2})_{q}-R, en el que q = 2, 3 o 4 y -R se selecciona del grupo constituido por grupos -NH_{2}, -OCH_{3} y -OCH_{2}CH_{3}.
15. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en el que el sustituyente 2' es flúor.
16. El oligonucleósido de la reivindicación 1, en el que dicho oligonucleósido comprende uno o más enlaces internucleósido seleccionados del grupo constituido por:
a)
fosfodiéster;
b)
fosfotriéster;
c)
fósforotioato;
d)
fósforoditioato;
e)
Rp-fósforotioato;
f)
Sp-fósfototioato;
g)
boranofosfato;
h)
3'-tioformacetal
i)
metileno (metlimino)
j)
amida;
k)
metilfosfonato;
l)
fósforoamidato (5'P-N3'); y
m)
cualquier combinación de (a) a (l).
\vskip1.000000\baselineskip
17. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, en el que dicho oligonucleótido consiste en 30 o menos nucleótidos.
18. El oligonucleótido de la reivindicación 17, en el que dicho oligonucleótido consiste en 8 a 25 nucleótidos.
19. El oligonucleótido de la reivindicación 18, en el que dicho oligonucleótido consiste en 18 nucleótidos.
20. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura I en la que x = 1, y = 1 y n = 9, teniendo por ello una estructura:
A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D.
21. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura II en la que x = 1, y = 1 y n = 9, teniendo por ello una estructura:
D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A.
22. El oligonucleótido de la reivindicación 8ª, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura III en la que x = 2, y = 2 y m = 3, teniendo por ello una estructura:
A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A.
23. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura IV en la que x = 2, y = 2 y m = 3, teniendo por ello una estructura:
D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D.
24. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura I en la que x =3, y = 3 y n = 3, teniendo por ello una estructura:
A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D.
\newpage
25. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura II en la que x = 3, y = 3 y n = 3, teniendo por ello una estructura:
D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A.
26. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura III en la que x = 4, y = 3 y m = 1, teniendo por ello una estructura:
A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A.
27. El oligonucleótido de la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido tiene la estructura IV en la que x = 4, y = 3 y m = 1, teniendo por ello una estructura:
D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D.
28. El oligonucleósido de la reivindicación 1, que comprende además un tercer segmento que comprende un nucleósido modificado, en el que dicho tercer segmento es adyacente a (a) el extremo 5' de dichos primero y segundo segmentos alternos, (b) el extremo 3' de dichos primero y segundo segmentos alternos o (c) ambos (a) y (b).
29. El oligonucleótido de la reivindicación 2, que comprende además un tercer segmento que comprende un nucleótido modificado, en el que dicho tercer segmento es adyacente a (a) el extremo 5' de dichos primero y segundo segmentos alternos, (b) el extremo 3' de dichos primero y segundo segmentos alternos o (c) ambos (a) y (b).
30. El oligonucleótido de la reivindicación 29, en el que dicho nucleótido modificado es un ribonucleótido modificado.
31. El oligonucleótido de la reivindicación 30, en el que dicho ribonucleótido modificado comprende una modificación en su posición 2'.
32. El oligonucleótido de la reivindicación 30, en el que dicha modificación 2' se selecciona del grupo constituido por grupos metoxi, metoxietilo, fluoro y propilamino.
33. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-32, en el que dicho oligonucleótido es antisentido para un ARN objetivo.
34. Un método para impedir o disminuir la traducción, transcripción inversa y/o replicación de un ARN objetivo, cuyo método comprende poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en el que dicho método no es un método terapéutico practicado en el cuerpo humano o de animal.
35. Un método para inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo, cuyo método comprende poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en el que dicho método no es un método terapéutico practicado en el cuerpo humano o de animal.
36. El método de la reivindicación 35, en el que dicha división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una transcriptasa inversa de un virus.
37. El método de la reivindicación 36, en el que el virus es un virus patógeno humano.
38. El método de la reivindicación 37, en el que el virus patógeno humano se selecciona del grupo constituido por HIV y hepadnavirus.
39. El método de la reivindicación 38, en el que el HIV se selecciona del grupo constituido por HIV-1 y HIV-2.
40. El método de la reivindicación 38, en el que el hepadnavirus es virus de la hepatitis B.
41. El método de la reivindicación 38, en el que dicha división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una enzima RNasa H de origen procariota o eucariota.
42. El método de la reivindicación 41, en el que la RNasa H eucariota es una RNasa H de mamífero.
43. El método de la reivindicación 42, en el que la RNasa H eucariota es una RNasa H humana.
44. El método de la reivindicación 43, en el que la RNasa H humana se selecciona del grupo constituido por RNasa H1 y RNasa H2.
\newpage
45. Un método para impedir o disminuir la traducción, transcripción inversa y/o replicación de un ARN objetivo, cuyo método comprende:
a)
poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33; y
b)
permitir la división por RNasa H de dicho ARN objetivo,
en el que dicho método no es un método terapéutico practicado en el cuerpo humano o de animal.
\vskip1.000000\baselineskip
46. Un método para efectuar un procedimiento, en el que dicho procedimiento se selecciona del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo; y
(g)
cualquier combinación de (a) a (f);
comprendiendo dicho método poner en contacto dicho ARN objetivo con el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en el que dicho método no es un método terapéutico practicado en el cuerpo humano o de animal.
\vskip1.000000\baselineskip
47. Un método para efectuar un procedimiento, en el que dicho procedimiento se selecciona del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo; y
(g)
cualquier combinación de (a) a (f);
comprendiendo dicho método introducir el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en el que dicho método no es un método terapéutico practicado en el cuerpo humano o de animal.
\vskip1.000000\baselineskip
48. Una composición que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, mezclado con un vehículo aceptable farmacéuticamente.
49. La composición de la reivindicación 48, en la que dicha composición es para un uso seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
\vskip1.000000\baselineskip
50. Un paquete comercial que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, junto con instrucciones para su uso.
51. El paquete comercial de la reivindicación 50, en el que dichas instrucciones son para un uso seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g).
\vskip1.000000\baselineskip
52. El uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en la preparación de un medicamento para impedir o disminuir tradución, transcripción inversa y/o replicación de un ARN objetivo en un sistema, en el que dicho oligonucleótido toma contacto con dicho ARN objetivo.
53. El uso de la reivindicación 52, en el que dicho sistema se selecciona del grupo constituido por una célula, un tejido o un sujeto.
54. El uso de la reivindicación 53, en el que dicha célula, tejido o sujeto es una célula, tejido o sujeto de mamífero.
55. El uso de la reivindicación 53, en el que dicha célula, tejido o sujeto es una célula, tejido o sujeto humano.
56. El uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en la preparación de un medicamento para inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema, en el que dicho oligonucleótido toma contacto con dicho ARN objetivo.
57. El uso de la reivindicación 56, en el que dicha división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una transcriptasa inversa de un virus.
58. El uso de la reivindicación 57, en el que el virus es un virus patógeno humano.
59. El uso de la reivindicación 58, en el que el virus patógeno humano se selecciona del grupo constituido por HIV y hepadnavirus.
60. El uso de la reivindicación 59, en el que el HIV se selecciona del grupo constituido por HIV-1 y HIV-2.
61. El uso de la reivindicación 59, en el que el hepadnavirus es virus de la hepatitis B.
62. El uso de la reivindicación 56, en el que dicha división mediada por RNasa H se efectúa por actividad de RNasa H asociada con una enzima RNasa H de origen procariota o eucariota.
63. El uso de la reivindicación 62, en el que la RNasa H eucariota es una RNasa H de mamífero.
64. El uso de la reivindicación 63, en el que la RNasa H eucariota es una RNasa H humana.
65. El uso de la reivindicación 64, en el que la RNasa H humana se selecciona del grupo constituido por RNasa H1 y RNasa H2.
66. El uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15ª, 17-27 y 29-33, en la preparación de un medicamento para impedir o disminuir la traducción, transcripción inversa y/o replicación de un ARN objetivo en un sistema, en el que:
a)
dicho ARN objetivo toma contacto con dicho oligonucleótido; y
b)
una RNasa H divide dicho ARN objetivo.
\vskip1.000000\baselineskip
67. El uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en la preparación de un medicamento para efectuar un procedimiento seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g),
en el que dicho oligonucleótido toma contacto con dicho ARN objetivo.
\vskip1.000000\baselineskip
68. El uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, 17-27 y 29-33, en la preparación de un medicamento para efectuar un procedimiento seleccionado del grupo constituido por:
(a)
inducir división mediada por RNasa H de un ARN objetivo en un sistema;
(b)
impedir o disminuir la traducción de un ARN objetivo en un sistema;
(c)
impedir o disminuir la transcripción inversa de un ARN objetivo en un sistema;
(d)
impedir o disminuir la replicación de un ARN objetivo en un sistema;
(e)
detectar la presencia de un ARN objetivo en un sistema;
(f)
validar un objetivo génico correspondiente a un ARN objetivo en un sistema;
(g)
prevenir o tratar una enfermedad relacionada con un ARN objetivo en un sistema; y
(h)
cualquier combinación de (a) a (g);
en el que dicho oligonucleótido se introduce en dicho sistema.
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