MX2008004513A - Aptameros que comprenden nucleotidos modificados con arabionosa - Google Patents

Abstract

Se proporcionan ligandos deácido nucleico (o aptámeros) que forman un tetrad-G que contienen al menos un nucleótido modificado con arabinosa. Preferentemente, el nucleótido modificado con arabinosa es nucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).

Description

APTÁMEROS QUE COMPRENDEN NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS CON ARABINOSA Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a aptámeros y más específicamente a aptámeros que contienen al menos un nucleótido modificado con arabinosa. Antecedentes de la Invención Los terapéuticos a base de oligonucleótido tienen enorme potencial para terapia dirigida de cáncer, así como enfermedades inflamatorias e infecciosas, exhibiendo una mayor especificidad y menos toxicidad que los fármacos quimioterapeuticos convencionales. Los denominados "antisentido" (AON) y "ARN de poca interferencia" (siRNA) son los miembros más prominentes de esta clase de agentes [Stull, R.A. and Szoka, P. C. (1995) Pharmaceutical Research, 1_2: 465-483; Uhlmann E. and Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90: 544-584.; Mittal, V. (2004) Nature Rev., 5: 355-365]. Los aptámeros y los oligonucleotidos inmunoestimuladores son las adiciones más recientes al gran número de moléculas de ácido nucleico que están siendo dedicados como agentes terapéuticos potenciales. Los AONs y siRNAs están diseñados para dirigir un mARN específico, en tanto que los aptámeros y oligonucleotidos inmunoestimuladores generalmente funcionan mediante objetivos de proteína específicos o activando una amplia formación de células inmuno efectoras [Nimjee, S.M. y asociados (2005) Annu. Rev. Med. 56.: 555-83; Uhlmann E. and Vollmer J. (2003) Current Opinión in Drug Discovery & Development 6 : 204-217] . Se ha realizado un excelente progreso hacia aplicaciones clínicas de los aptámeros [Hicke, B.J. y asociados (1996) J. Clin. Investig. 9_8: 2688-2692; Pietras, K. y asociados (2002) Cáncer Res. 62: 5476-5484; White, R. R. y asociados (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 100: 5028-5033)]. Los aptámeros han ganado aceptación con la reciente aprobación de la FDA de Macugen®, un análogo de ARN modificado con azúcar (2'F-ribosa, 2'-0-metilribosa, aptámero 3'-pegilado, M.Wt. 50 kD) indicado para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad neovascular (AMD) [(a) Eyetech Study Group (2002) evaluación clínica y preclínica fase 1A de un aptámero pegilado anti-VEGF (EYE001) para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad exudativa, retina 22: 143-52; b) Eyetech Study Group (2003) terapia de factor de crecimiento endotelial antivascular para neovascularización coroidal subfoveal secundaria a degeneración macular relacionada con la edad: resultados de estudio fase II, Ophthalmology, 110 : 979- 86]. Los aptámeros de ácido nucleico también han mostrado controlar la expresión de genes ideales, incluyendo VIH, in vitro [(a) Sullenger B.A., Gallardo H. F., Ungers G. E. and Gilboa E. (1991) análisis de inhibición transmitida por ARN que atrae respuesta transactivación de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1, Journal of Virology, 65: 6811-6816; (b) Zimmermann K., Weber S., Dobrovnik M., Hauber J. and Bohnlein E. (1992). La expresión de las secuencias de elemento de respuesta neo-revquiméricas interfieren con expresión gag VIH-1 dependiente-rev, Human Gene Therapy, 3: 155-161; (c) Lee T. C, Gallardo H. F., Ungers G. E. and Gilboa E. (1992). La sobreexpresión de las secuencias derivadas de RRE inhiben la réplica de VIH- en células CEM. New Biologist, 4: 66-74]. Los aptámeros también han probado ser útiles para el tratamiento de otras malignidades humanas importantes, incluyendo enfermedades infecciosas, cáncer y enfermedad cardiovascular. Una técnica común a través de la cual se obtienen los aptámeros de oligonucleótidos depende de la evolución sistémica de los ligandos mediante un proceso de enriquecimiento exponencial (SELEX) [Tuerk, C. and Gold, L. (1990) Science, 249, 505-510); Ellington, A.D. and Szostak, J.W. (1990) Nature, 346: 818-822]. Los oligonucleótidos resultantes son más comúnmente referidos como "aptámeros", derivados de la palabra latina "aptus" que significa "ajustar". Estas moléculas de hebra simple o doble normalmente tienen la capacidad de enlazar proteínas, y por lo tanto, sirven como "sumideros" bloqueando la proteína de su función adicional [Baltimore D. (1988) Nature 335: 395-396]. La utilidad de los aptámeros de ácido nucleico in vivo y su posible aplicación en farmacoterapia, como con otras terapias a base de oligonucleótido, enfrentan algunos obstáculos, por ejemplo, suministro, captación y biodisponibilidad celular. Existe la necesidad de desarrollar modificaciones químicas para producir moléculas clínicamente útiles. El trabajo inicial con oligodesoxinucleótidos (ADN) se tomó con moléculas naturales, no modificadas. Pronto quedó claro, sin embargo, que el ADN nativo estaba sometido a una degradación relativamente rápida, principalmente a través de la acción de 3'-exonucleasas, aunque como resultado también del ataque de endonucleasa. Los oligorribonucleótidos (ARN) se someten a las mismas consideraciones, y de hecho, generalmente son más susceptibles a degradación de nucleasa. Los mismos aspectos aplican a aptámeros en donde la estabilidad de nucleasa es altamente deseada. Debido a que la actividad de enlace d proteína de los aptámeros es fuertemente dependiente del doblez de la estructura de oligonucleótido (estructura 3D) es altamente deseable que dicha estructura sea de alta estabilidad térmica. Hasta ahora, se han considerado varios métodos para mejorar la estabilidad de los aptámeros, la mayoría de los cuales hace uso de SELEX. Nolte et al. ha reportado un aptámero de ARN de diseño de espejo (o "espieguelmeros"), que consiste en seleccionar un aptámero de ARN normal (D-ARN) contra el enantiómero de una proteína objetivo, la imagen de espejo de la proteína objetivo (D-aminoácidos), utilizando SELEX estándar. Cuando el aptámero de ARN resultante (D-ARN) se convierte a su forma enantiomérica, L-ARN, con la misma composición base, el L-ARN exhibe alta afinidad de enlace con la molécula de proteína nativa (L-aminoácido) y alta resistencia contra disociación mediante nucleasas. Esta estrategia está limitada a casos en donde un enantiomero de la molécula objetivo está disponible [Nolte.A. y asociados (1996) Nat. Biotechnol., 14: 1116-1119]. Otro método para la estabilización de aptámeros de ARN consiste en una modificación química después de que las moléculas de ARN han sido seleccionadas mediante SELEX. Normalmente, dichas modificaciones son introducidas mediante la incorporación de 2'-0-metilrribonucleótidos en la estructura de ARN nativa. Sin embargo, esta estrategia origina cambios estructurales de las moléculas de ARN y con frecuencia da como resultado la pérdida de actividad del aptámero de ARN [Lebruska.L.L. and Maher.L.J. (1999) Biochemistry , 38.: 3168-3174]. Una variación del método SELEX selecciona moléculas de ARN de trifosfatos de nucleósido de los substratos naturales (dNTPs o rNTPs) [Patente Norteamericana Número 5,660,985, ambas tituladas "Ligandos de Acido Nucleico de Alta Afinidad que Contienen Nucleótidos Modificados" y la Patente Norteamericana Número 6,387,620, titulada "SELEX libre de transcripción"]. Sin embargo, algunos de estos químicos son incompatibles con SELEX, ya que las unidades de 5'-trifosfatos monoméricos no son substratos de polimerasas de ADN/ARN. Por lo tanto, los 5'-trifosfatos de 2'-modificados-2'-desoxinucleósido [Pagratis.N.C, y asociados (1997) Nat. Biotechnol. , 15:68-731. los 5'-(alfa-P-borano) trifosfatos de nucleósido [Lato, S.M. (2002) Nucleic Acids Res., 30.: 1401-1407], los 5'-(alfa-tio) trifosfatos de nucleósido [Jhaveri.S. y asociados (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 2285-2290], y más recientemente, los 5'-trifosfatos de 4'-tiorribonucleósido [Kato, Y. y asociados (2005) Nucleic Acids Res. 33.: 2942-2951], son los trifosfatos más utilizados para SELEX. Entre estos, los rNTPs modificados 2'-, los trifosfatos de nucleósido de 2'-fluoro-2'-desoxi-ribopirimidina (2'F-ARN) y 2'-amino-2'-desoxi-ribopirimidina (2'-NH2-RNA) son frecuentemente utilizados. Un número de ARNs resistentes a nucleasa, incluyendo el aptámero de enlace de factor de crecimiento endotelial vascular, Macugen, fueron aislados utilizando principalmente 5'-trifosfatos 2'-F-rU/rC y 2'-NH2-rU/rC [Ruckman, J. (1998) J. Biol. Chem. 273: 20556-20567]. Un aptámero de ADN dirigido hacia trombina, una proteasa clave implicada en la cascada de coagulación de sangre, ha sido identificado, y se han llevado a cabo estudios relacionados. Este aptámero, primero identificado mediante SELEX, consiste en una secuencia 15-nt que contiene seis nucleótidos de timidina (dT) y nueve de desoxiguanosina (dG), es decir, 5'-dGGTTGGTGTGGTTGG-3\ Bajo ciertas condiciones, este oligonucleótido es conocido por doblarse en una estructura cuádruple, la cual contiene dos cuartetos-G y tres circuitos laterales, normalmente referidos como una "estructura de silla" (figura 1) [Bock, L. C. y asociados (1992) Nature 355: 564]. Cada cuarteto adopta una configuración plana cuadrada, cada residuo dG interactúa con uno adyacente a través de dos enlaces de hidrógeno y se comporta tanto como un aceptor como un donante enlazado-H. Los iones de potasio estabilizan toda la estructura mediante la coordinación con las bases de guanina. Se reportó un doblez similar en la estructura de cristal del complejo de aptámero-trombina [Padmanabhan, K. y asociados (1993) J. Biol. Chem. 268: 17651]. Existen otros diversos ejemplos de estructuras cuádruple-G reportadas en la literatura, algunas de las cuales están siendo probadas como agentes terapéuticos por si mismos, específicamente como agentes antivirales y anticáncer [ver la publicación de Saccá, B. y asociados (2005) Nucleic Acids Res. 33: 1182-119, y las referencias ahí mencionadas]. Varios estudios que se enfocan en modificar este aptámero han sido reportados aunque muy pocos, si es que existen, han conducido a una mejoría con respecto a la molécula original. Por ejemplo, Heckel y Mayer reportaron que la introducción de timinas modificadas con una porción de nitrofenilpropilo (T-NPP) en ciertas posiciones generalmente abolió la interacción del aptámero con trombina [Heckel, A. and Mayer, G. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 822-823]. Di Giusto y King reportaron la síntesis de aptámeros circulares dirigidos contra trombina con resistencia a nucleasa mejorada y actividad anticoagulante comparada con las del aptámero de ADN de trombina canónica [Di Giusto, D.A. and King, G. C. (2004; J. Biol. Chem. 279: 46483-46489]. Sin embargo, la circulación de los aptámeros produce una mezcla de construcciones y requiere una enzima de ligasa, haciendo muy difícil que el método sea escalado. Otros intentos de circular el aptámero de ADN de enlace-trombina mediante métodos químicos abolieron la actividad anti-trombina [Buijsman, R. C. y asociados (1997) Bioorg. Med. Chem. Letters 7 2027 -2032]. Recientemente, Seela y asociados reportaron la inserción de una secuencia que forma hairpin GCGAAG en la posición de circuito central del aptámero de enlace-trombina. Esta construcción tuvo la capacidad de formar tanto un cuarteto-G como una estructura de minihoquilla unida. De acuerdo con los datos Tm, la minihorquilla induce un cambio estructural en la sección del aptámero. El enlace a trombina no fue investigado [Rosemeyer, H. y asociados (2004) Helvética Chimica Acta 87: 536-552]. Saccá y asociados, estudió el efecto de la carga de esqueleto y tamaño de átomo, sustituciones base así como el efecto de la modificación en la posición-2 de azúcar, tal como se analiza mediante espectroscopia. Todo el azúcar (ribosa, 2'-0-metilribosa) y fosfato (metilfosfonato, fosforotioato) condujeron a una reducción en la estabilidad térmica del aptámero [Saccá, B. y asociados (2005) Nucleic Acids Res. 33.: 1182-1192]. De hecho, la modificación de 2'-0-metilribosa condujo no únicamente a una desestabilización de la estructura, sino también a un cambio completo de la conformación de cuarteto-G. Por lo tanto, la estructura del aptámero de trombina es particularmente sensible a modificaciones químicas. Además, los estudios previos han mostrado que el reemplazo de las bases de ADN nativas mediante bases modificadas, generalmente interrumpe la estructura de aptámeros. El octanucleótido de fosforotioato dTTGGGGTT [PS-dT2G4 2], es un compuesto que enlaza a la proteína de envoltura viral gp120 del virus de inmunodeficiencia humana (HIV), evitando la función del VIH al receptor CD4 celular [Wyatt J.R. y asociados (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 90.: 1356-1360]. PS-dT2G4T2 forma un tetrámero con hebra paralela estabilizado mediante cuartetos-G (G-tetrads). Wyatt y asociados [Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 90.: 1356-1360] también mostró que su estructura de tetrahedro-G y ciertas ligaduras de fosforotioato fueron necesarias para la inhibición de infección viral [Stoddart, CA. y asociados. (1998) Antimicrob Agents Chemother. 42.: 2113-2115]. El oligómero dGGGGTTTTGGGG se deriva de la repetición de telómero d(T G4) de Oxytricha [Smith, F.W. and Feigon, J. (1992) Nature, 356: 164-168). Los estudios RMN mostraron que este compuesto, igual que el aptámero antitrombina, forma una estructura de cuarteto-G [Smith, F.W. and Feigon, J. (1992) Nature, 356: 164-168; Smith F.W. and Feigon J. (1993) Biochemistry 3_2: 8682]. Conforme se encuentran tetrads-G en telómeros humanos, son de particular interés para esfuerzos de descubrimiento de fármacos anticáncer. Estas estructuras de tetrad-G pueden ser utilizadas para inhibir la extensión del telómero (mediante inhibición de la telomerasa) un proceso que ocurre en forma selectiva en células de cáncer [Kerwin, M. (2000) Current Pharmaceutical Design: 441-471]. El oligómero anti-trombina dGGTTGGTGTGGTTGG despliega un espectro de dicroismo circular característico (CD) referido como un espectro CD "tipo II". Un perfil CD tipo II es indicativo de un cuarteto-G unimolecular en el cual dos de los residuos de guanina están en la conformación anti, y los otros dos en la conformación syn [Macaya, R. F. y asociados (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 90.: 3745-3749]. El término G (anti) se refiere a una estructura de nucleósido de guanosina en la cual la base de guanina está orientada fuera del anillo de azúcar al cual se adhiere, mientras que en la conformación G (syn) la base de guanina se coloca directamente arriba de la estructura de anillo de azúcar. El cambio en la conformación anti y syn viene aproximadamente de la rotación del enlace nucleosídico C1'-N9 [W. Saenger, in "Principies of Nucleic Acids Structure", C.R. Cantor (editor); Springer-Verlag, 1983]. El espectro CD "Tipo M" despliega una banda positiva en ~ 295 nm y una banda negativa en ~ 260 nm. Por otra parte, un espectro CD "Tipo I" despliega una banda CD positiva en - 295 nm y una banda negativa en ~ 265 nm, que se correlaciona con un tetrad-G intermolecular únicamente con residuos G (anti) [Williamson, J. R. (1994) G-Quartet Structures in Telomeric DNA. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23.: 703-730]. Por lo tanto, estos dos tipos de espectro CD se correlacionan fuertemente con la conformación del núcleo de cuarteto-G. La secuencia telomérica dGGGGTTTTGGGG, igual que la secuencia anti-trombina descrita anteriormente, exhibe un espectro CD Tipo II, consistente con un tetrad-G con guaninas en conformaciones tanto syn como anti (Lu, M. y asociados (1993) Biochemistrv. 32: 598-601; Smith, F.W. and Feigon, J. (1992) Nature, 356: 164-168). En contraste, la secuencia dTTGGGGTT (ya sea con una ligadura de fosfodiéster (PO) o ligadura de fosfotioato (PS)) muestra un espectro CD Tipo I, que resulta de una estructura cuádruple-G en la cual todas las bases de guanina adoptan la conformación anti (Wyatt, J. R. y asociados (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 9J_: 1356-1360).

Existe la necesidad en la técnica de mejorar la estabilidad de nucleasa de aptámeros, que incluyen generalmente, en particular, las que tienen la capacidad de formar un tetrad-G tal como las descritas anteriormente. Además, se prefiere que modificación no disminuya en forma significativa la interacción de subtítulo del aptámero nativo seleccionado. Breve Descripción de la Invención De acuerdo con un amplio aspecto de la presente invención, los ligandos de ácido nucleico (o aptámeros) con la capacidad de formar un tetrad-G y que comprenden al menos un nucleótido modificado con arabinosa, son proporcionados. Preferentemente, el nucleótido modificado con arabinosa es 2'-dexosi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). El nucleótido modificado con arabinosa está preferentemente en el circuito del tetrad-G como alternativa, un residuo de guanosina del tetrad-G. En una modalidad de la presente invención, el aptámero es un aptámero de antitrombina, que tiene preferentemente la secuencia dGGTTGGTGTGGTTGG (15-nt). En otra modalidad preferida, el aptámero es un aptámero anti-VIH, que tiene preferentemente la secuencia: dT2G4T2 (8-nt). En otra modalidad preferida de la presente invención, el aptámero comprende una repetición dG4T4, preferentemente dG4T G4 (12-nt), dG4T4G4T4G4 (20-nt) y dG4T4G4T4G4T4G4 (28-nt). En modalidades específicas de la presente invención, el aptámero tiene una secuencia de acuerdo con cualesquiera de las SEQ ID NOS. 1-3, 4-14, 19-24 y 26-28.

En modalidades específicas, el aptámero puede tener cualquier número de arabinonucleótidos en cualquier ubicación en el aptámero, por ejemplo: 5'-ADADADADADADADA-3' 5'-AADADDADDDAADAD-3' 5'-AAAADAAADADDDAD-3' etc. en donde A es un arabinonucleótido y D es un 2'-desoxirribonucleótido. En otras modalidades de la presente invención, el aptámero está completamente sustituido con arabinonucleótidos. Por ejemplo: 5'-AAAAAAAAAAAAAAA-3' En una modalidad preferida de la presente invención, las quimeras construidas de 2'-desoxirribonucleótido (ADN) y 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA) con la capacidad de enlazar a trombina selectivamente, son proporcionadas. En otras modalidades de la presente invención, se proporciona un aptámero de cualesquiera de las secuencias 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3', dT2G4T2 y d[G4T4G4]n que tiene una composición de esqueleto de azúcar-fosfato seleccionado de cualquier combinación de nucleótidos de arabinosa y desoxirribosa. Preferentemente, los nucleótidos de arabinosa son 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). En otras modalidades de la presente invención, el arabinonucleótido comprende substituyentes 2' seleccionados del grupo que consiste en grupos de fluoro, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxi y alcoxialquilo. En una modalidad adicional de la presente invención, el grupo alquilo seleccionado del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, butilo y grupos alquilo funcionalizados tales como grupos etilamino, propilamino y butilamino. En modalidades, el grupo alcoxi es seleccionado del grupo que consiste en grupos metoxi, etoxi, propoxi y alcoxi funcionalizados tales como -0(CH2)q-R, en donde q = 2-4 y -R son un grupo -NH2, -OCH3 o -OCH2CH3. En modalidades, el grupo alcoxialquilo seleccionado del grupo que consiste en metoxietilo y etoxietilo. En modalidades, el su bstituyente 2' es flúor y el arabinonucleótido es un 2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). Preferentemente, el nucleótido FANA es araF-G y araF-T. En otras modalidades de la presente invención, el aptámero comprende una o más ligaduras de i ntern ucleótido seleccionada del grupo que consiste en: a) fosfodiéster; b) fosfotriéster; c) fosforotioato; d) metilfosfonato,- e) boranofosfato y f) cualquier combinación de (a) a (e). De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método para implementar al menos la estabilidad de nucleasa o el enlace selectivo de un aptámero.

El método comprende reemplazar al menos un nucleótido del aptámero, preferentemente en un circuito de un aptámero que forma un tetrad-G, con un nucleótido modificado con arabinosa, preferentemente 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA). De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el aptámero de la presente invención junto con un transportador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un aptámero de la presente invención para la preparación de un medicamento para la inhibición de trombina. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de un aptámero de la presente invención para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir infección VIH. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un aptámero de la presente invención para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir cáncer. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método para inhibir trombina o prevenir o tratar VIH o cáncer en un paciente que necesita del mismo. El método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la presente invención. De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un paquete comercial. El paquete comercial comprende la composición farmacéutica de la presente invención, junto con instrucciones para su uso. Breve Descripción de los Dibujos A continuación la presente invención será descrita con mayor detalle haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales: La figura 1, ilustra el cuádruple de guanina (cuarteto-G) (izquierdo) y diagrama del cuarteto-G intramolecular del aptámero de ADN de enlace de trombina (derecha). La estructura de las unidades FANA (base de timina y guanina) también se muestran (parte inferior izquierda). Las figuras 2a y 2b ilustran perfiles de condición térmicos medidos en 295 nm en el amortiguador a) 10 mM Tris, pH 6.8; b) 10 mM Tris, pH 6.8, 25mM KCI, en una concentración de hebra final de 8 µ?. Los datos Tm (temperatura de condición) se proporcionan en la tabla 1. La figura 3, ilustra un estudio de dependencia de Tm versus concentración llevado a cabo en un amortiguador que consiste en 10 mM Tris, pH 6.8, 25mM KCI. La figura 4, ilustra transiciones Tm de calentamiento y enfriamiento de tetrads-G formados mediante oligonucleótidos modificados con arabinosa y oligonucleótido de ADN de control en un amortiguador 10 mM Tris, 25mM KCI, pH 6.8, en una concentración de hebra final de 8 µ?. La figura 5, ilustra espectros CD de oligonucleótidos en un amortiguador que consiste en 10 mM Tris, pH 6.8 sin/con 25mM KCI a una temperatura de 15°C en una concentración de hebra final de 8 µ?. La figura 6a, ilustra la estabilidad de los aptámeros en suero de bovino fetal al 10% (FBS), tal como se monitorea mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (puntos de tiempo: 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 24h). Las figuras 6b y 6c, ilustran la curva de estabilidad de los aptámeros en FBS al 10% tal como se monitorea mediante electroforesis de gel de poliacrilamida. Las figuras 7a y 7b ilustran curvas de enlace de filtro de nitrocelulosa para aptámeros, después de la exposición a trombina de bovino. La figura 8, ilustra un espectro CD de dT2G T2 y secuencias relacionadas (PG17, 28, 19, 20, 21, 22, 23 y 24) obtenidas en solución salina regulada con fosfato (amortiguador PBS), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04, pH 7.2 a una temperatura de 25°C, concentración de hebra: 20 µ?. La figura 9, ilustra espectro CD dependientes de la temperatura de PG17, PG18, PG19 y PG20 e ilustra curvas Tm de cada complejo. El solvente es solución salina amortiguada con fosfato (amortiguador PBS), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04, pH 7.2 a una temperatura de 25°C; concentración de hebra: 20 µ?; 10 min tiempo de equilibrio se ajustó en cada temperatura estudiada. Las curvas Tm fueron generadas trazando la absorbancia máxima en una longitud de onda 265 nm (normalizada) versus temperatura; los datos Tm se muestran en la tabla 2. La figura 10, espectro CD dependiente de temperatura de PG24: solución salina amortiguada con fosfato (amortiguador PBS), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04, pH 7.2 a una temperatura de 25°C; concentración de hebra: 20 µ?, las soluciones se dejaron equilibrar durante 10 minutos después de cada cambio de temperatura. Figura 11. Espectro CD de dT4G4T4 y secuencias relacionadas (PG25-28): 10 mM amortiguador de fosfato de sodio 0.1 mM EDTA, pH 7 y 200 mM NaCI; concentración de hebra: 10 µ?. Figuras 12a-e ilustra a: Perfil Tm de dT G T4 y secuencias relacionadas (PG25-28), en tanto que la figura 12b-e: ilustra el efecto del proceso de calentamiento y enfriamiento durante medida de condición térmicas en amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, 0.1 mM EDTA, pH 7 y 200 mM NaCI; concentración de hebra: 100 µ?.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a oligonucleótidos modificados que tienen la capacidad de enlazar selectivamente a un objetivo de proteína. En particular, los aptámeros que tienen hebras cortas de ADN y ácidos arabinonucleicos modificados son mostradas, en contraste con los métodos comunes descritos anteriormente, los cuales se han concentrado en el uso de enlazadores, horquillas y nucleósidos modificados derivados de unidades que ocurren naturalmente (por ejemplo nucleótidos ADN y ARN). La presente invención comprende la caracterización de una serie de ligandos de ácido nucleico modificados con azúcar que enlazan trombina. Estos ligandos de ácido nucleico (o aptámeros) contienen nucleótidos modificados con arabinosa que confieren características mejoradas en el ligando, tal como doblez mejorado (estabilidad térmica Tm) y estabilidad contra las nucleasas presentes en los fluidos del cuerpo. La presente invención también comprende la inducción y estabilización de tetrads-G que comprenden azúcares de arabinosa. Preferentemente, los nucleótidos modificados con azúcar son 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótidos (FANA). El método para generar el ligando modificado con FANA, necesita la substitución de bases de ADN en un aptámero anti-trombina conocido dGGTTGGTGTGGTTGG (15-nt), aptámero anti-VIH dTTGGGGTT (8-nt) y oligonucleótido telomérico dGGGGTTTTGGGG (12-nt), para residuos FANA. En todos los casos, el doblez fue ensayado utilizando un dicroismo circular y experimentos de fundición UV, en tanto que para dGGTTGGTGTGGTTGG, se determinó el enlace de trombina utilizando un filtro de nitrocelulosa que enlaza al ensayo. El enlace selectivo, específico y eficiente de ligandos de ácido nucleico modificados con FANA a trombina es demostrado. Los estudios previos con el aptámero anti-trombina dGGTTGGTGTGGTTGG han mostrado que el reemplazo de las bases de ADN nativas a través de bases modificadas, generalmente interrumpe la estructura del aptámero. Los compuestos aquí descritos representan los primeros ejemplos de los aptámeros modificados con FANA, que enlazan efectivamente la trombina. La presente invención proporciona nucleótidos FANA que son compatibles con la estructura y actividad del aptámero de ADN de enlace a trombina; además, se muestra que la modificación FANA puede ser efectuadas en SELEX; más bien, esto implica la incorporación de un número suficiente de unidades FANA (a través de métodos químicos de fase sólida) que permiten la estabilidad de nucleasa y térmica incrementadas sin pérdida significativa de la propia afinidad de enlace de la biomolécula. En forma inesperada, en algunos casos, se mejora la actividad de enlace objetivo a través del aptámero de ADN que enlaza a trombina conocido.

La estabilidad térmica de los cuádruples-G (tetrads-G) también mostró ser mejorada mediante la inserción de residuos FANA dentro de la cadena de oligonucleótido del aptámero de enlace de trombina 5'-dGGTTGGTGTGGTTGG , el aptámero anti-VIH dT2G4T2 y el oligonucleótido telomérico dG T4G4. Por consiguiente, 2'-desoxi-2'-fluoro- -D-arabinoguanosina (araF-G) solo, o en combinación con unidades de desoxiguanosina, tienen la capacidad de doblarse en una estructura de cuarteto-G. Con base en estos descubrimientos, el araF-G solo, o en combinación con desoxiguanosina (dG) puede emplearse para estabilizar otras estructuras de cuarteto-G, incluyendo las de interés terapéuticas descritas anteriormente, aumentando de esta manera sus propiedades in vivo. Por lo tanto, de acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporcionan quimeras de oligonucleótido FANA-ADN del cuarteto-G que contienen aptámeros. La "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico modificado de la presente invención, puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de ácido nucleico modificado para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto es ponderado a través de los efectos terapéuticamente benéficos. Para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ser ajustados con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y juicio profesional de quien administra o supervisa la administración de las composiciones. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "transportador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el transportador es adecuado para administración parenteral. Como alternativa, el transportador puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención está contemplado. Los compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones. Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada, como una solución, microemulsión , liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármacos. El transportador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensoactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, un oligonucleótido de la presente invención puede ser administrado en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. El oligonucleótido modificado puede ser preparado con transportadores que protegerán el oligonucleótido modificado contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo sistemas de implantes y de suministro microencapsulados. Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden ser utilizados, tales como acetato de viniletileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos, poliglucólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de un compuesto activo, tal como un oligonucleótido de la presente invención, en la cantidad requerida en un solvente adecuado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, requerido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional procedente de una solución estéril-filtrada previamente. De acuerdo con un aspecto alternativo de la presente invención, un oligonucleótido de la presente invención puede ser formulado con uno o más compuestos adicionales que aumentan su solubilidad. Aunque varias modalidades de la presente invención se describen en la misma, se pueden realizar muchas adaptaciones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención de acuerdo con el conocimiento general y común de los expertos en la técnica. Dichas modificaciones incluyen la substitución de equivalentes conocidos de cualquier aspecto de la presente invención, con el objeto de lograr el mismo resultado substancialmente en la misma forma. Los rangos numéricos son inclusivos de los números que definen el rango. En las reivindicaciones, la palabra "que comprende" se utiliza como un término de extremo abierto, substancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a". Los siguientes ejemplos son ilustrativos de varios aspectos de la presente invención, y no limitan los amplios aspectos de la misma, tal como aquí se describen. Ejemplo 1: Síntesis Química de Oligonucleótidos La secuencia y composición de los oligómeros preparados en este estudio se muestra en la tabla 1 y tabla 2. Las síntesis de aptámero modificado FANA se llevaron a cabo en una escala de 1/µ???? en un sintetizador Applied Biosystems (ABI) 3400A utilizando la química ß-cianoetilfosforamidita estándar de acuerdo con protocolos publicados [E. Viazovkina, M.M.

Mangos, M.l. Elzagheid, and M.J. Damha (2002) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Unit 4.15)]. Las concentraciones finales de los monómeros fueron 0.10 M para fosforamidita de 2'-desoxirribonucleósido y 0.125 M para las F-fosforamiditas ara. El tiempo de acoplamiento se prolongó a 150 segundos para las fosforamiditas de 2'-desoxirribonucleósido (dC, dG), 15 minutos para los nucleósidos araF modificados. Estas condiciones produjeron aproximadamente rendimientos de acoplamiento promedio del 99%, y normalmente a través de 100 unidades de densidad óptica (A260) en rendimiento. Los aptámeros fueron purificados mediante HPLC de intercambio de aniones y se mantuvieron a temperatura de -20°C para uso adicional . Ejemplo 2. Estudios de desnaturalización térmica UV de aptámeros de enlace de trombina Se obtuvieron datos de desnaturalización térmica UV en un espectrofotómetro Varían CARY 1 equipado con un controlador de temperatura Peltier. Los aptámeros se disolvieron en un amortiguador Tm (10 mM Tris, pH 6.8 con y sin 25mM KCI) en una concentración final de 8 µ?. Los aptámeros fueron endurecidos en un amortiguador Tm a una temperatura de 80°C durante 10 minutos, enfriados naturalmente a temperatura ambiente, y refrigerados (4°C) durante la noche antes de las medidas. Las muestras endurecidas fueron transferidas a celdas de cuarzo Hellma QS-1.000 (Cat #114) enfriadas previamente, selladas con tapón envuelto con teflón y con extracción de gases colocándolas en un baño de ultrasonido durante 1 minuto. Se obtuvieron coeficientes de extinción del siguiente sitio de Internet (http://paris.chem.vale.edu/extinct.html). y se asumió que los aptámeros modificados con FANA tienen el mismo coeficiente de extinción que el aptámero de ADN regular. Se adquirieron curvas de desnaturalización en 295 nm en un rango de calentamiento de 0.5°C/min. Los datos se analizaron con el software proporcionado por Varian Canadá y se convirtieron a Microsoft Excel. Se adaptaron los perfiles de absorbancia versus temperatura para una transición unimolecular. Se lograron líneas de base dependiente construyendo las líneas de mínimos cuadrados lineales para partes asociadas y disasociadas y extrapolando a ambos extremos de la curva de fundición. En consecuencia, se construyó un trazo de las fracciones de las hebras simples en el estado G-cuádruples (a) versus temperatura, y se utilizaron para calcular el valor Tm interpolando a a = 0.5 (figuras 2a y 2b). También se llevaron a cabo estudios de dependencia de concentración Tm en la misma forma en 295 nm, utilizando aptámeros con diferentes concentraciones que fluctúan de 4 a 76 µ?. Las celdas de cuarzo Starna (Starna Cells, Inc., Cat. # 1-Q-1) con longitud de trayectoria de 1 mm, fueron utilizadas para reducir la cantidad de aptámeros requeridos (figura 3). Los datos muestran que la incorporación de residuos FANA en el esqueleto de oligonucleótidos conduce a un incremento en la temperatura de fundición del complejo formado ( Tm hasta modificación +3°C/FANA). La estructura es estabilizada mediante ión de potasio tal como se muestra en la figura 2, consistente con la formación de una estructura de tetrad-G unimolecular (ver ejemplo 3). La unimolecularidad del doblez, se confirmó para algunas de las secuencias, midiendo el valor Tm en diversas concentraciones de oligonucleótido (figura 3) y obteniendo curvas Tm de calentamiento y enfriamiento (figura 4). El doblez unimolecular está caracterizado por un valor Tm que es independiente de la concentración de oligonucleótido, por ejemplo, AP34, AP35, APT-13 y APT-F14, pero no AP32 y AP33 (figura 3) y mediante cinéticas rápidas de fundición y reendurecimiento, por ejemplo AP34, AP35, APT-13 y APT-F14, pero no AP32 y AP33 (figura 4). Se debe observar que todos los aptámeros tipo II (tal como se evalúa mediante CD; ver ejemplo 3) mostraron curvas de calentamiento y enfriamiento idénticas Tm consistentes con las cinéticas rápidas de doblez/desdoblez que caracteriza la estructura unimolecular mostrada en la figura 1. Ejemplo 3. Espectro de dicroismo circular (CD) de aptámeros de enlace a trombina Se recolectaron espectros CD (200-320 nm) en un espectropolarímetro Jasco J-710 en un rango de 100 nm/min utilizando células de cuarzo fusionadas (Hellma, 165-QS). Las medidas se llevaron a cabo en un amortiguador (10 TT¡M Tris, pH 6.8 con y sin 25mM KCI) a una concentración de 8 µ?. La temperatura fue controlada mediante un baño de circulación interno (VWR Scientific) a temperatura constante (15°C). Los datos fueron procesados en una computadora PC utilizando un software Windows J-700 suministrado por el fabricante (JASCO, Inc.). Para facilitar las comparaciones, los espectros CD fueron sustraídos, suavizados por fondo y fueron corregidos para concentración, de modo que se puedan obtener las elipses molares (figuras 5a-c). Estos experimentos evalúan el impacto de la modificación FANA en las estructuras de aptámero. Los espectros CD de los aptámeros revelaron la formación de dos diferentes estructuras tetrad-G, referidas como "I" y "M" (tabla I y figura 5). La signatura CD tipo "M" corresponde a la estructura de tetrad-G, inducida por potasio (K + ) bien caracterizada adoptada por todo el aptámero de ADN dGGTTGGTGTGGTTGG. De hecho, únicamente los aptámeros tipo-ll mostraron una afinidad con la proteína objetivo (trombina humana) y no todos los aptámeros tipo II se enlazaron a trombina (tabla I y figura 7). Por ejemplo, los aptámeros tipo II AP-F13 y AP-F14 se descubrieron que enlazan a trombina humana con mayor afinidad con relación a todo el aptámero-ADN , en tanto que APT-F1 y F3 se enlazan débilmente, sino es que no enlazan en lo absoluto a trombina. Las estructuras de tetrad-G tipo II también se descubrieron como muy estables, particularmente cuando los residuos de ADN-G (dG) con enlaces "anti" glucosídicos son reemplazados por FANA-G. La estabilización de los residuos G (anti) con respecto a G (syn), surgen de las interacciones estéricas del átomo de 2'-flúor y la base G en la conformación syn. Como un resultado, los residuos FANA-G inducen y estabilizan los tetrads-G tipo II que contienen residuos G anti. Si las posiciones dG (syn) son reemplazadas por residuos FANA-G, el aptámero se conmuta al tetrad-G tipo "I", en donde todas las guaninas adoptan de igual manera la conformación anti (tabla 1 y figura 5). En estos caso.s, el enlace trombina se perdió, en forma consistente con la especificidad exquisita de la trombina con el ADN tipo II y estructuras FANA-ADN. Los mismos principios se aplican para la serie de oligonucleótidos teloméricos tipo II derivadas de dGGGGTTTTGGGG (ejemplo 6). Ejemplo 4. Ensayo de estabilidad de nucleasa Se llevó a cabo la estabilidad de nucleasa de los aptámeros en Suero de Bovino Fetal al 10% (FBS, Wisent Inc., Cat. #080150) diluido con medio de Eagle's con modificación de Dulbeco's de célula múltiple (DMEM, Wisent Inc., Cat. #319005-CL) a una temperatura de 37°C. Un ADN de una sola hebra (ssADN) 23mer (P-8), el cual no tuvo la capacidad de formar un cuádruple-G, fue utilizado como un control. Se liofilizó una solución de aptámeros de existencia de aproximadamente 8 pmol y control ssADN (-1.2 O.D.U) hasta secarse y posteriormente se incubó con 300µ? 10% FBS a una temperatura de 37°C. En 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6 y 24 h, 50 µ? de las muestras fueron recolectadas y almacenadas a una temperatura de -20°C durante al menos 20min. Las muestras fueron liofilizarse hasta secarse y se agregaron 10 µ? de amortiguador de carga de gel y 10 µ? de agua de autoclave. Se utilizaron 10 µ? de la mezcla para electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) la cual se llevó a cabo a temperatura ambiente utilizando gel de poliacrilamida al 20% en amortiguador 0.5xTBE (Tris-borato-EDTA). El patrón de degradación en los geles fue visualizado mediante Stains-AM (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La solución se elaboró de bromuro de 1 -etil-2-[3-(1 -etilnafto[1,2-d]tiazolin-2-iliden)-2-metilpropenil]nafto[1,2-d]tiazolio (figuras 6a, 6b y 6c). Los datos muestran que la estabilidad de nucleasa puede depender de una o ambas de la posición y número de residuos FANA dentro del esqueleto de oligonucleótido, y que los residuos FANA confieren estabilidad significativa contra nucleasas hidrolíticas. Por ejemplo, la estabilidad de nucleasa de APT-F13 y F14 se aumenta con respecto a la estructura APT-35 nativa por un factor de 4-7. Ejemplo 5. Etiquetación de extremo-5' de oligonucleótidos sintéticos y ensayo de enlace de filtro Los aptámeros fueron etiquetados en forma radioactiva en el término 5'-hidroxilo con una sonda de fósforo radioactiva y la cinasa de polinucleótido de enzima T4 (T4 PNK) de acuerdo con las especificaciones del fabricante (MBI Fermentas Life Sciences, Burlington, ON). La incorporación de la etiqueta 32P se logró en las mezclas de reacción que consisten en substrato de aptámeros de ADN (100 pmol), amortiguador de 2 µ I 10 x reacción (amortiguador A para seguir la reacción: 500mM Tris-HCI, pH 7.6 a una temperatura de 25°C, 100mM MgCI2, 50mM DTT, 1mM spermidina y 1mM EDTA), 1 µ? de solución de enzima T4 PNK (100??/1µ? en una solución de 20mM Tris-HCI, pH 7.5, 25mM KCI, 0.1mM EDTA, 2mM DTT y 50% glicerol), 6 µ? de solución [?-32?]-??? (6000Ci/mmol, 10mCi/ml; Amersham Biosciences, Inc.) y agua estéril de autoclave hasta un volumen final de 20 µ?. La mezcla de reacción se incubó durante aproximadamente 45-60 min a una temperatura de 37°C, seguido de una segunda incubación durante 10 minutos a una temperatura de 95°C para calentar, desnaturalizar y desactivar la enzima de cinasa. La solución se purificó de acuerdo con un protocolo estándar [Carriero, S. and Damha, M.J. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 6157-6167] y la producción aislada de 32P-5'-ADN después de la extracción de gel promedió el 50%. Las muestras etiquetadas como puras fueron mantenidas a una temperatura de -20°C para un uso futuro. El enlace de filtro de nitrocelulosa es para confirmar si existen enlace entre aptámeros seleccionados y trombina. La cantidad constante de aptámeros etiquetados (1.25 pmol) fue calentada a una temperatura de 95°C durante 5 minutos en el amortiguador de enlace (Tris-Ac, pH 7.4, 140mM NaCI, 5mM KCI, 1mM CaCI2, 1mM MgCI2) e inmediatamente se colocaron sobre hielo durante 5 minutos antes de enlazar a concentraciones en incremento de proteasa de trombina (Amersham Biosciences, Inc.), que fluctúa de 6-1380 nM en el amortiguador de enlace a una temperatura de 37°C en un volumen final de 20 µ? durante 30 minutos. Las mezclas fueron filtradas a través de un filtro de nitrocelulosa (13 mm Millipore, HAWP, 0.45 µ??), humedecidas previamente con amortiguador de enlace en un aparato de enlace de filtro Millipore, e inmediatamente enjuagadas con 600 µ? de amortiguador de lavado enfriado con hielo (Tris-Ac, pH 7.4, 140mM NaCI, 5mM KCI, 1mM CaCI2, 1mM MgCI2, 1% de pirofosfato de sodio (p/v)), posteriormente en filtro fue secado con aire y el aptámero enlazado fue cuantificado mediante conteo por cetelleo. El porcentaje de enlace (%) fue calculado a través de la substracción de conteos en el microtubo y fondo. Ka puede determinarse en forma rigurosa mediante ajuste de mínimos cuadrados de los puntos de datos a una ecuación de enlace que asume una interacción de ARN-trombina biomolecular simple. Las curvas de enlace de los diversos aptámeros, incluyendo controles, se muestran en las figuras 7a y 7b, en tanto que los datos de enlace se proporcionan en la tabla 1. Los datos muestran que el enlace de dos (APT-F13 y F14) de los aptámeros probó que es cuantitativo y mejoró con respecto al aptámero de ADN nativo AP35. Estos compuestos también adoptan la estructura de tetrad-G requerida reconocida por trombina (estructura "tipo II"), tal como se evalúa mediante espectroscopia CD. Además, la estabilidad de nucleasa de APT-F13 y F14 aumenta con respecto a APT-35 por un factor de 4-7. Ejemplo 6. Los estudios de espectroscopia de dicroismo circular (CD) v desnaturalización térmica revelan la formación y estabilización de tetrad-G mediante oliqonucleótidos modificados con arabinosa (dTTGGGGTT v dGGGGTTTTGGGG) Se obtuvieron datos de desnaturalización térmica UV en un espectrofotómetro Varían CARY 1 equipado con un controlador de temperatura Peltier. dT2G4T2 y las secuencias relacionadas (PG17-24) fueron disueltas en solución salina amortiguada por fosfato (amortiguador PBS, pH 7.2), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04 a una concentración final de 20 µ?. dG4T4G4 y las secuencias relacionadas (PG25-28) fueron disueltas en 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 7, 0.1 mM EDTA y 200 mM NaCI; en una concentración final de 100 µ?. Todas las muestras fueron endurecidas a una temperatura de 95°C durante 5 minutos, enfriadas naturalmente a temperatura ambiente y refrigeradas (4°C) durante la noche antes de las medidas. Las muestras endurecidas fueron transferidas a celdas de cuarzo Hellma QS-1.000 (Cat #114) enfriadas previamente, selladas con un tapón envuelto con teflón y con extracción de gases colocándolas en un baño de ultrasonido durante 1 minuto. Los coeficientes de extinción fueron obtenidos del siguiente sitio de internet (http://www.idtdna.com/analvzer/Applications/OliqoAnalvzer/) y se asumió que las secuencias modificadas con FANA tienen el mismo coeficiente de extinción que la secuencia de ADN regular. Se adquirieron curvas de desnaturalización en 260 nm para dT2G4T2 y secuencias relacionadas (PG17-24), 295 nm para dG4T4G4 y secuencias relacionadas (PG25-28) en un rango de calentamiento/enfriamiento de 0.5°C/min comenzando a una temperatura de 20°C a 90°C (para PG17-24) ó 40°C a 98°C (para PG25-28). Los datos fueron analizados con el software proporcionado por Varían Canadá y convertidos a Microsoft Excel (Tabla 2). Se recolectaron espectros CD (220-320 nm) en un espectropolarímetro Jasco J-710 en un rango de 100nm/min, utilizando celdas de cuarzo fusionadas (Hellma, 165-QS). Las medidas se llevaron a cabo ya sea en amortiguador PBS para dT2G4T2 y secuencias relacionadas PG17-24 (pH 7.2, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04) a una concentración final de 20 µ?, o en amortiguador de fosfato de sodio para dG4T G4 y secuencias relacionadas PG25-28 (10 mM amortiguador de fosfato de sodio, pH 7, 0.1 mM EDTA, y 200 mM NaCI) a una concentración final de 100 µ?. La temperatura fue controlada mediante un baño de circulación interna (VWR Scientific) a una temperatura constante de (20°C). Los datos se procesaron en una computadora PC utilizando el software J-700 Windows suministrado por el fabricante (JASCO, Inc.). Para facilitar las comparaciones, los espectros CD se sustrajeron, y se suavizaron del fondo y se corrigieron para las concentraciones, de modo que se pudieran obtener elipses molares. Estos experimentos anteriores evalúan el impacto de la modificación FANA en las estructuras de cuarteto-G. El oligómero dT2G4T2, es conocido por adoptar una estructura en la cual todos los residuos G están en la conformación. Como resultado, la asignatura "Tipo I" caracteriza este aptámero (Tabla 2 y Figuras 8 y 9). Los perfiles Tm se obtuvieron trazando las elipcidades molares máximas versus temperatura (figura 10). En comparación con los controles PG17 (PO-ADN) y PG18 (PS-ADN), las secuencias modificadas con FANA PG19 y PG20 mostraron elipcidades molares muy incrementadas que indican una mejor indicación de guanina-guanina dentro de la estructura tratada-G. Los perfiles Tm (figura 9) obtenidos mediante espectros CD dependientes de temperatura, confirmaron claramente la estabilización térmica significativa proporcionada por las unidades FANA-G (PG-18, 19 y 20; Tabla 2)· Los mismos principios aplican a las series teloméricas derivadas de dG4T4G4 (Tabla 2, y Figuras 11 y 12). Cuando los residuos dG (anti) fueron reemplazados por residuos FANA G, resultó una estabilización térmica modesta de la estructura de tetrad-G sin la interrupción de la estructura tridimensional (Tabla 2, y Figuras 11 y 12). Cuando los residuos dG (syn) fueron reemplazados, resultó un incremento de marcado en la estabilización térmica de la estructura tetrad-G (hasta 25 grados; Tabla 2), con un cambio conformacional concomitante de tipo II a tipo I inducido por los residuos FANA G(anti) (Figura 11). Todas las referencias mencionadas están incorporadas a la presente invención como referencia. Aunque las modalidades preferidas de la presente invención han sido descritas en la misma, los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden realizar variaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Tabla 1. Secuencias, datos CD y Tm de Oligonucleótidos SEQ T. Tipo Kd Nombre ID Tipo Secuencia* No. ("O* II (nM)d CD" AP32 1 Todo FANA 5' -GG-TT-GG-TGT-GG-TT- 54.1 >24 500 GG-3' AP33 2 G- 5' -GG-tt-GG-tgt-GG-tt- 50.2 4.0 450 FANA/ADN GG-3' AP34 3 G- 5' -gg-TT-gg-TGT-gg-TT- 56.3 + 5.9 280 ADN/FANA gg-3' AP35 4 Todo ADN 5' -gg-tt-gg-tgt-gg-tt- 47.4 + 0.5 210 gg-3' APT- FANA G- 5' -gG-tt-gG-tgt-gG-tt- 53.3 + 5 4.8 >700 Fl anti gG-3' APT- FANA G- 5' -Gg-tt-Gg-tgt-Gg-tt- 45.4 0.8 6 >700 F2 syn Gg-3' FANA G- 5' -gG-TT-gG-TGT-gG-TT- 61.6 + 9.4 APT- 7 anti & T- gG-3' 500 F3 circuito FANA G- 5' -Gg-TT-Gg-TGT-Gg-TT- 48.5 0.6 APT- _ 8 s n & T- Gg-3' >700 F4 circuito APT- FANA T- 5' -gg-TT-gg-TgT-gg-TT- 57.1 + 2.8 9 300 F9 clrcuito 99-3' APT- FANA T- 5' -gg-tT-gg-TgT-gg-TT- 51.2 + 2.7 10 250 F10 circuito gg-3' APT- FANA T- 5' -gg-TT-gg-TgT-gg-Tt- 56.6 + 5.1 11 370 Fll circuito gg-3' APT- FANA T- 5' -gg-TT-gg-tgt-gg-TT- 59.1 + 3.5 12 310 F12 clrcuito 99-3' APT- FANA T- 5' -gg-tt-g'g-TgT-gg-TT- 51.0 + 3.4 13 58 F13 circuito 99-3' APT- FANA T- 5' -gg-TT-gg-.TgT-gg-tt- 50.6 + 2 14 40 F14 circuito 99-3' P-8 15 SSADN 5'-gtc tet tgt gtg act NA NA NC 0.5 control ctg gta ac-3' Hl 16 Hairpin 5'-GGAC (UUCG) GUCC-3' NA NA NC NA control a Letras mayúsculas y negritas: FANA; Letras minúsculas: dna; Mayúsculas: ARN b NA: no aplicable CD "Tipo II" se refiere a un espectro CD con una banda positiva en ~ 295 nm y una banda negativa en ~ 260 nm, lo cual indica una conformación G-anti y G-syn alternativa en el cuarteto-G. Se midió CD en un amortiguador que consiste en 10 mM Tris, 25mM KCI, pH 6.8.

Kd se estimó rigurosamente a partir de la concentración de trombina (nM) necesaria para lograr 50% del enlace máximo al aptámero; NC: no calculado.

Seq. Código ID Tipo Secuencia* TipoCD "·» NO. dTTGGGGT y secuencias relacionadas Todo po- PG17 17 5' -PO-tt-gggg-tt-3 ' I 66 ADN Todo PS- 73.5' PG18 18 5' -PS-tt-gggg-tt-3 ' I ADN 74 (+8) Todo PS- PG19 19 5 ' -PS-TT-GGGG-TT-31 I 83 (+17) FANA Todo FANA- PG20 20 5' -PS-tt-GGGG-tt-3' I 87 (+21) G Todo FANA- PG21 21 5' -PS-TT-gggg-TT-31 I n.d.9 T PG22 22 2x FANA-G 5' -PS-tt-GgGg-tt-3 ' I n.d. PG23 23 2x FANA-G 5' -PS-tt-gGgG-tt-3 ' I n.d. PG2 24 2x FANA-G 5' -PS-tt-GggG-tt-3 ' I n.d. dGGGGTTTTGGGG y secuencias relacionadas Todo PO- 65h PG25 25 51 -PO-gggg-tttt-gggg- 3 ' II ADN 64.4 Todo PO- PG26 26 5 ' -PO-GGGG- TTT -GGGG- 3 ' I -90(+25. 6) FANA PG27 27 G-syn 5' -PO-GgGg-tttt-GgGg- 3 ¦ I 72.5(+8. 1) PG28 28 G-anti 5' ' -PO-gGgG-tttt-gGgG- 31 II 66.2 (+1. 8) Tabla 2. Secuencias, datos CD y Tm de ol igon ucleótidos a Letras minúsculas: dna; Letras mayúsculas y negritas: FANA; PO: ligadura de fosfato; PS: ligadura de fósforotioato. "CD tipo I se refiere a una banda CD positiva -265 nm y una banda negativa ~ 240; CD tipo II se refiere a una banda positiva en ~ 295 nm y una banda negativa en ~ 260 nm [Williamson, J.R. (1994) G-Quartet Structures en Telomeric DNA. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23.: páginas 703-730]. cdT2G4T2 y secuencias relacionadas (PG17-24): solución salina amortiguada con fosfato (amortiguador PBS, pH 7.2 a una temperatura de 25°C), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP04; concentración de hebra: 20 µ? para experimentos tanto CD y Tm; el CD se condujo en una longitud de onda de 260 nm. dG4T4G4 y secuencias relacionadas (PG25-28): amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, 0.1 mM EDTA, pH 7 y 200 mM NaCI; concentración de hebra: 10 µ?. ddT2G4T2 y secuencias relacionadas (PG17-24): solución salina regulada por fosfato (amortiguador PBS, pH 7.2 a una temperatura de 25°C), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH2P04, 8 mM Na2HP0 ; concentración de hebra: 20 µ?; Tm las medidas se llevaron a cabo en una longitud de onda de 260 nm. dG4T4G4 y secuencias relacionadas (PG25-28): amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, 0.1 mM EDTA, pH 7 y 200 mM NaCI; concentración de hebra: 100µ?; Tm las medidas se llevaron a cabo a una longitud de onda de 295 nm. eATm (°C) es el cambio Tm de PG17-24 ó PG26-27 en forma relativa al control PG17 ó PG25, respectivamente. fTm de la referencia: Wyatt, J. R., P. W. Davis, y asociados (1996) Kinetics of G-quartet-mediated tetramer formation. Biochemistry 3_5: páginas 8002 a 8008. 9n.d.: no determinado hTm de la referencia: Lu, M., Q. Guo, y asociados (1993) Biochemistry 3_2: páginas 598 a 601.

Claims (40)

1. REIVINDICACIONES 1. Un aptámero con la capacidad de formar un tetrad-G que comprende al menos un nucleótido modificado con arabinosa.
2. 2. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el nucleótido modificado con arabinosa tiene un substituyente 2' seleccionado del grupo que consiste en grupos flúor, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxi, y alcoxialquilo.
3. 3. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el grupo alquilo es seleccionado del grupo que consiste en grupos metilo, etilo, propilo, butilo, y alquilo funcionalizado tal como grupos etilamino, propilamino y butilamino, el grupo alcoxi es seleccionado en grupos que consiste de metoxi, etoxi, propoxi, y alcoxi funcionalizado tal como -0(CH2)q-R, en donde q = 2-4 y -R es un grupo -NH2, -OCH3, ó -OCH2CH3 y el grupo alcoxialquilo es seleccionado del grupo que consiste de metoxietilo, y etoxietilo.
4. 4. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque el grupo alquilo funcionalizado es seleccionado del grupo que consiste en un grupo etilamino, propilamino y butilamino y el grupo alcoxi funcionalizado seleccionado del grupo que consiste en -0(CH2)q-R, en donde q = 2-4 y -R es un grupo -N H2, -OCH3, ó -OCH2CH3.
5. 5. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque al menos un nucleótido modificado con arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
6. 6. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque al menos un nucleótido modificado con arabinosa es un circuito del Tetrad-G.
7. 7. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque al menos un nucleótido modificado con arabinosa es un residuo de guanosina del tetrad-G.
8. 8. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado porque el aptámero enlaza selectivamente a la trombina.
9. 9. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el aptámero tiene la secuencia del nucleótido dGGTTGGTGTGGTTGG.
10. 10. El aptámero tal como se describe en la reivindicación I, caracterizado porque tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS. 1-3 y 4-14.
11. 11. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado porque el aptámero enlaza selectivamente a HIV gp120.
12. 12. El aptámero tal como se describe en la reivindicación I , caracterizado porque el aptámero tiene una secuencia de nucleótido dTTGGGGTT.
13. 13. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS. 19-24.
14. 14. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado porque el aptámero es una repetición dG4T4.
15. 15. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el aptámero es cualquiera de dG4T4G4, dG4T4G4T4G4 y dG4T4G4T4G4T4G4.
16. 16. El aptámero tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS. 26-28.
17. 17. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, 11, 12, 14 y 15 caracterizado porque tiene una estructura de fosfato de azúcar.
18. 18. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, 11, 12, 14, 15 y 17 caracterizado porque el aptámero es una quimera de nucleótidos 2'-desoxiribonucleótido (ADN) y 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
19. 19. El aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, 11, 12, 14 y 15 caracterizado porque contiene al menos una ligadura de ¡nternucleótido seleccionado del grupo que consiste en fosfodiéster, fosfotriéster, fósforotioato, metilfosfonato, boranofosfato y cualesquiera combinaciones de los mismos.
20. 20. Un método para incrementar al menos una estabilidad de nucleasa o enlace selectivo de un aptámero que comprende reemplazar al menos un nucleotido del aptámero con un nucleotido modificado con arabinosa.
21. 21. El método tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el nucleotido modificado con arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
22. 22. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 21, caracterizado por el aptámero forma un tetrad-G.
23. 23. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque al menos un nucleotido que está siendo reemplazado está en un circuito del tetrad-G.
24. 24. El método tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque al menos un nucleotido que está siendo reemplazado es un residuo de guanosina del tetrad-G.
25. 25. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 24, caracterizado porque el aptámero enlaza selectivamente la trombina y tiene la secuencia de nucleotido dGGTTGGTGTGGTTGG .
26. 26. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 24, caracterizado porque el aptámero enlaza selectivamente a HIV gp120 y tiene la secuencia de nucleótidos dTTGGGGTT.
27. 27. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 24 caracterizado porque el aptámero es una repetición dG4T4 y es cualesquiera de dG4T4G4l dG4T4G4T G4 y dG4T4G T4G4T4G .
28. 28. Una composición farmacéutica que comprende el aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19 junto con un transportador farmacéuticamente aceptable.
29. 29. Una composición farmacéutica que comprende el aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 10 junto con un transportador farmacéuticamente aceptable.
30. 30. Una composición farmacéutica que comprende el aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 11 a la 13, junto con un transportador farmacéuticamente aceptable.
31. 31. Una composición farmacéutica que comprende el aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 14 a la 16 junto con un transportador farmacéuticamente aceptable.
32. 32. El uso del aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 10 para la preparación del medicamento para la inhibición de trombina.
33. 33. Un método de inhibición de trombina en un paciente que necesita del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 29.
34. 34. Un empaque comercial que comprende la composición de la reivindicación 29 junto con instrucciones para su uso para inhibir trombina e incrementar los tiempos de coagulación.
35. 35. El uso del aptámero tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 11 a la 13 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la infección de VIH.
36. 36. Un método para tratar o prevenir infección de VIH en un paciente que necesita el mismo, caracterizado porque administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición tal como se describe en la reivindicación 30.
37. 37. Un aparato comercial que comprende la composición tal como se describe en la reivindicación 30, junto con instrucciones para su uso para tratar o prevenir infección de VIH.
38. 38. El uso de aptámeros tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 14 a la 16, para la preparación de un medicamento para tratar cáncer.
39. 39. Un método para tratar o prevenir cáncer en un paciente que necesita el mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición tal como se describe en la reivindicación 31.
40. 40. Un empaque comercial que comprende la composición tal como se describe en la reivindicación 31, junto con instrucciones para su uso para tratar o prevenir cáncer.