JP2022521510A - ホスホノアセテートギャップマー型オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
(式中、(A1)および(A2)の一方は糖修飾ヌクレオシドであり、他方は糖修飾ヌクレオシドまたはDNAヌクレオシドであり、Aは酸素または硫黄である)
の少なくとも1つのジヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩に関する。
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に一般的に理解されているように、共有結合した2つ以上のヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で調製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾に対して言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでよい。
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAまたはshRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部(intra)または相互(inter)の自己相補性の程度が50%未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの2分子間の二重鎖)を形成できることが理解される。
用語「連続するヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続する核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列、例えばF-G-F’ギャップマー領域を含み、任意に、さらなるヌクレオチド(複数可)、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つまたは複数のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称され得る。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと比較して、糖部分または(核酸)塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、本明細書で用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」と互換的に使用され得る。非修飾DNAまたはRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと称される。DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Watson Crick塩基対形成が可能であれば、依然として一般にDNAまたはRNAと称される。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、2つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として、当業者に一般的に理解されているように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのDNAまたはRNAヌクレオシドの領域、例えばギャップマー型オリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域FおよびF’などの修飾ヌクレオシドの領域中でヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素の1個が硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の1個を硫黄で置換することにより、キラル中心が導入され、したがって単一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内で、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はS(Sp)またはR(Rp)立体アイソフォームのいずれかになる。このようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と称される。それと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、2個の非末端酸素原子を有しているため、非キラルである。
立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、その2つのジアステレオ異性形態であるRpまたはSpの一方に対してジアステレオ異性体過剰率を有するキラルなヌクレオシド間結合である。
立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、その2つのジアステレオ異性形態であるRpまたはSpの一方に対してジアステレオマー過剰率を有するホスホロチオエート結合である。
式中、3’R基は、隣接するヌクレオシド(5’ヌクレオシド)の3’位を表し、5’R基は、隣接するヌクレオシド(3’ヌクレオシド)の5’位を表す。
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在する、プリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然のバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えばHiraoら(2012)Accounts of Chemical Research、第45巻、第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 付録37 1.4.1に記載されている。
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。
立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも1つが立体的に規定されたヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
用語「相補性」は、ヌクレオシド/ヌクレオチドのWatson-Crick塩基対形成の能力を表す。Watson-Crick塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、5-メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のWatson Crick塩基対形成を包含することが理解されよう(例えば、Hiraoら(2012)Accounts of Chemical Research、第45巻、第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 付録37 1.4.1を参照されたい)。
本明細書で使用される用語「同一性」は、所与の位置において、別個の核酸分子(例えば標的核酸)の所与の位置における連続するヌクレオチド配列と同一である(すなわち、相補的なヌクレオシドとWatson Crick塩基対を形成する核酸分子の能力において)、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)中の連続するヌクレオチド配列におけるパーセント表記でのヌクレオチドの数を指す。百分率は、2つの配列間で同一である整列した塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除し、100を乗じることにより計算される。同一性パーセント=(マッチ×100)/整列した領域の長さ。好ましくは、挿入および欠失は、連続するヌクレオチド配列の相補性%の計算において許容されない。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、2つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。2つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度(Tm)によって表される。生理学的条件では、Tmは親和性に厳密には比例しない(MergnyおよびLacroix、2003、Oligonucleotides13:515~537)。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔG°=-RTln(Kd)によって反応の解離定数(Kd)と関連付けられており、ここで、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液濃度が1M、pHが7、温度が37℃で、ある反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔG°は、ゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansenら、1965、Chem.Comm.36~38およびHoldgateら、2005、Drug Discov Todayに記載されているような等温滴定熱量測定(ITC)の使用により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔG°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔG°は、SantaLucia、1998、Proc Natl Acad Sci USA.95:1460~1465に記載されているように、Sugimotoら、1995、Biochemistry34:11211~11216およびMcTigueら、2004、Biochemistry43:5388~5405に記載されている適切に得られた熱力学パラメータを使用した最近接モデルを使用することにより、数値的に概算することもできる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、10~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcal未満の概算ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔG°により測定される。オリゴヌクレオチドは、8~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcalの範囲未満、例えば-15kcal未満、例えば-20kcal未満、および例えば-25kcal未満の概算ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、-10~-60kcal、例えば-12~-40、例えば-15~-30kcal、または-16~-27kcal、例えば-18~-25kcalの概算ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、DNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合に糖部分の修飾を有する、1つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にHもしくは-OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)、または2’炭素とリボース環の第2の炭素との間に架橋を形成することができる2’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’-4’ビラジカル架橋)ヌクレオシドである。
「LNAヌクレオシド」は、ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’とを結合させるビラジカル(「2’-4’架橋」とも称される)を含む2’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも称されている。リボースの立体配座の固定は、LNAが相補的RNAまたはDNA分子のオリゴヌクレオチドに取り込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上(二重鎖安定化)に関連している。これは通常、オリゴヌクレオチド/相補的二重鎖の融解温度を測定することにより決定され得る。
式中、
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-;-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
但し、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-または-Se-Se-ではなく、
Jは、酸素、硫黄、=CH2または=N(Ra)であり、
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRdおよび-NReC(=Xa)NRcRdから独立して選択されるか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と共に、-X-Y-の炭素原子を1個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される1~3つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Xaは、酸素、硫黄または-NRcであり、
Rc、RdおよびReは、水素およびアルキルから独立して選択され、
nは、1、2または3である。
(式中、
Wは、酸素、硫黄、-N(Ra)-または-CRaRb-、特に酸素であり、
Bは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Zは、隣接するヌクレオシドまたは5’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Z*は、隣接するヌクレオシドまたは3’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
R1、R2、R3、R5、およびR5*は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、およびアリールから独立して選択され、
X、Y、Ra、およびRbは、上に定義した通りである)
である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNaseH活性は、相補的RNA分子と二重鎖を形成する場合にRNaseHを動員する、その能力を指す。WO01/23613は、RNaseH活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、RNaseHを動員する能力の決定に使用することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列が提供されたときに、被験修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用し、WO01/23613(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例91~95により提供される方法論を使用して決定された初期速度(pmol/l/分で測定)の少なくとも5%、例えば少なくとも10%または20%超の初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはRNaseHを動員することができるとみなされる。RHaseH活性の決定に使用するために、組換えヒトRNaseH1が、Lubio Science GmbH、Lucerne、Switzerlandから入手可能である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、RNaseH媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも3つの別個の構造領域、5’-フランク、ギャップおよび3’-フランク、F-G-F’を5’→3’方向で含む。「ギャップ」領域(G)は、オリゴヌクレオチドがRNaseHを動員することを可能にする、連続するDNAヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む5’フランキング領域(F)と、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む3’フランキング領域(F’)が隣接する。領域FおよびF’の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる(すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである)。いくつかの実施形態では、領域FおよびF’の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばLNAおよび2’-MOEから独立して選択される、高親和性2’糖修飾などの2’糖修飾ヌクレオシドである。
F1-8-G5-16-F’1-8、例えば
F1-8-G7-16-F’2-8
但し、ギャップマー領域F-G-F’の全長は、少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
ギャップマーの領域G(ギャップ領域)は、オリゴヌクレオチドがRNaseH、例えばヒトRNaseH1を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはDNAヌクレオシドの領域である。RNaseHは、DNAとRNAとの間の二重鎖を認識し、RNA分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。適切なギャップマーは、少なくとも5または6連続するDNAヌクレオシド、例えば5~16連続するDNAヌクレオシド、例えば6~15連続するDNAヌクレオシド、例えば7~14連続するDNAヌクレオシド、例えば8~12連続するDNAヌクレオチド、例えば8~12連続DNAヌクレオチド長のギャップ領域(G)を有し得る。ギャップ領域Gは、いくつかの実施形態では、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16連続するDNAヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域のシトシン(C)DNAは、場合によってはメチル化されていてもよく、このような残基は、5-メチルシトシン(meCまたはcの代わりにe)として注記される。ギャップ内のシトシンDNAのメチル化は、cgジヌクレオチドがギャップ内に存在して潜在的な毒性を低減させる場合に有利であり、この修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に有意な影響を与えない。
一方、いくつかのRNaseH活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に3’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。1つまたは複数の3’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するこのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称され、例えば、WO2013/022984を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、RNaseH動員を可能にするために、ギャップ領域内にDNAヌクレオシドの十分な領域を保持する。RNaseHを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列特異的、または化合物特異的でさえある(Rukovら2015 Nucl.Acids Res.第43巻、第8476~8487頁を参照されたい)。当該文献は、いくつかの場合、標的RNAのより特異的な切断を提供するRNaseHを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、3’エンドコンファメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば2’-O-メチル(OMe)もしくは2’-O-MOE(MOE)ヌクレオシド、またはβ-D LNAヌクレオシド(ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’との間の架橋が、β立体配座である)、例えばβ-D-オキシLNAまたはScETヌクレオシドであり得る。
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F’1-8
を含み、領域Gは角括弧[Dn-Er-Dm]内であり、DはDNAヌクレオシドの連続する配列であり、Eは修飾ヌクレオシド(ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド)であり、FおよびF’は本明細書に定義したフランキング領域であるが、但し、ギャップマー領域F-G-F’の全長は、少なくとも12、例えば14ヌクレオチド長であることを条件とする。
領域Fは、領域Gの5’DNAヌクレオシドにすぐ隣接して位置する。領域Fの最も3’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば2’置換ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである。
LNAギャップマーは、領域FおよびF’のいずれか一方または両方が、LNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。β-D-オキシギャップマーは、領域FおよびF’のいずれか一方または両方が、β-D-オキシLNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。
MOEギャップマーは、領域FおよびF’がMOEヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、MOEギャップマーは、設計[MOE]1-8-[領域G]-[MOE]1-8、例えば[MOE]2-7-[領域G]5-16-[MOE]2-7、例えば[MOE]3-6-[領域G]-[MOE]3-6のものであり、領域Gはギャップマーの定義に規定した通りである。5-10-5設計(MOE-DNA-MOE)を有するMOEギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
混合ウイングギャップマーは、領域FおよびF’の一方または両方が、2’置換ヌクレオシド、例えば2’-O-アルキル-RNA単位、2’-O-メチル-RNA、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、2’-アルコキシ-RNA、MOE単位、アラビノ核酸(ANA)単位および2’-フルオロ-ANA単位から独立して選択される2’置換ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドを含むLNAギャップマーである。領域FおよびF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域FおよびF’の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群から独立して選択される。領域FおよびF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方が少なくとも2つのLNAヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域FおよびF’の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域FおよびF’の一方または両方が、1つまたは複数のDNAヌクレオシドをさらに含んでもよい。
フランキング領域は、LNAおよびDNAヌクレオシドの両方を含み得、それらがLNA-DNA-LNAヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。したがって、「代替フランクギャップマー」は、フランク(FまたはF’)の少なくとも一方がLNAヌクレオシド(複数可)に加えてDNAを含む、LNAギャップマー型オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域FもしくはF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方は、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域FもしくはF’、またはFおよびF’の両方は、少なくとも3つのヌクレオシドを含み、Fおよび/またはF’領域の最も5’および3’のヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである。
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2の一連の整数として注記することができる。
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2であり、
但し、ギャップマーの全長は、少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーF-G-F’、ならびにさらに5’および/または3’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、本明細書では領域D’およびD’’と称され得る。
F-G-F’、特にF1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’、特にD’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D’’、特にF1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3
D’-F-G-F’-D’’、特にD’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシドの全てが糖修飾ヌクレオシドである。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書ではトータルマーと称される。
用語「ミックスマー」は、DNAヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドとの両方を含むオリゴマーを指し、RNaseHを動員するには連続するDNAヌクレオシド長が不十分である。適切なミックスマーは、最大3つまたは最大4つの連続するDNAヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、糖修飾ヌクレオシドとDNAヌクレオシドとの交互領域を含む。オリゴヌクレオチドに取り込まれたときにRNA様(3’エンド)立体配座を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、DNAヌクレオシドの短い領域と交互に配置することにより、非RNaseH動員オリゴヌクレオチドを作製することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、または
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、または
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...、または
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m...
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cまたは第3の領域)に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
結合またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、2個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、または結合部分(例えば、リンカーまたはテザー)を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第3の領域(領域C)を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列などの第1の領域(領域A)に共有結合させるよう機能する。
(A1)および(A2)の一方が糖修飾ヌクレオシドであり、他方がDNAである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
(A1)および(A2)が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
糖修飾ヌクレオシドが、独立して2’糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNA、特に2’-メトキシ-RNA、2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、または2’-フルオロ-ANAから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNAである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
2’糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAから独立して選択され、特にβ-D-オキシLNAである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および式(I)に定義されたヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および式(I)に定義されたヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
1~15個、特に1~5個、より詳細には1、2、3、4、または5個の、式(I)に定義された式(I)のジヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
さらなるヌクレオシド間結合が全て、式-P(=S)(OR)O2-(式中、Rは、水素またはリン酸保護基)のホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
DNAヌクレオシド、RNAヌクレオシド、および糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
1つまたは複数のヌクレオシドが、5-メチルシトシン核酸塩基を含むヌクレオシドなどの、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
式(I)の少なくとも1つのジヌクレオシドが、アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのフランキング領域中にあるか、またはアンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのギャップ領域とフランキング領域との間に位置する、すなわち、(A1)および(A2)が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドであるか、または(A1)および(A2)の一方がDNAヌクレオシドもしくはRNAヌクレオシドであり、他方が糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、LNAギャップマー、混合ウイングギャップマーまたは2’-置換ギャップマー、特に2’-O-メトキシエチルギャップマーである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
Aが硫黄である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド。
アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式5’-F-G-F’-3’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Gは、RNaseHを動員することができる5~18個のヌクレオシドの領域であり、前記領域Gは、5’および3’がそれぞれフランキング領域FおよびF’によって隣接されており、領域FおよびF’は、独立して、1~7つの2’-糖修飾ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、領域Gに隣接する領域Fのヌクレオシドは2’-糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接する領域F’のヌクレオシドは2’-糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
式(I)の少なくとも1つのジヌクレオシドが、領域FもしくはF’中に、または領域Gと領域Fとの間に、または領域Gと領域F’との間に位置する、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方における2’-糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNA、特に2’-メトキシ-RNA、2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方における全ての2’-糖修飾ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方における2’-糖修飾ヌクレオシドが、全て2’-アルコキシ-RNA、特に2’-メトキシ-RNA、全て2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNA、全て2’-アミノ-DNA、全て2’-フルオロ-RNA、全て2’-フルオロ-ANAまたは全てLNAヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA2’-糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
ギャップ領域Gが、5~16個、特に8~16個、より詳細には8、9、10、11、12、13、または14個の連続するDNAヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fおよび領域F’が、独立して、1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオシド長である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
領域Fおよび領域F’が、それぞれ独立して、1、2、3、または4つのLNAヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列(F-G-F’)が、10~30ヌクレオチド長、特に12~22、より詳細には14~20オリゴヌクレオチド長である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式5’-D’-F-G-F’-D’’-3’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、F、G、およびF’は、請求項17から28のいずれか一項に記載される通りであり、領域D’およびD’’は、それぞれ独立して、0~5つのヌクレオチド、特に2、3、または4つのヌクレオチド、特にDNAヌクレオチド、例えばホスホジエステル結合したDNAヌクレオシドからなる、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
各フランキング領域FおよびF’が独立して、1、2、3、4、5、6、または7つ、特に、式(I)の1つのジヌクレオシドを含む、請求項17から29のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド;
式(I)の、合計で1つのジヌクレオシド、特に領域F’または領域Gと領域F’との間に位置する、式(I)の1つのジヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドがヒトRNaseH1を動員することができる、本発明に記載のオリゴヌクレオチド;
本発明に記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩、特にナトリウム、カリウム塩、またはアンモニウム塩;
本発明に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容され得る塩と、任意選択的にリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容され得る塩に共有結合した、少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート;
本発明に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、薬学的組成物;ならびに
治療的に活性な物質として使用するための、本発明に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲート。
(式中、
R2は、アルコキシ、アルコキシアルコキシまたはアミノであり、
R4は、水素であるか、または
R4およびR2は、一緒になって、X-Yを形成し、
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-;-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
但し、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-または-Se-Se-ではなく、
Jは、酸素、硫黄、=CH2または=N(Ra)であり、
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRdおよび-NReC(=Xa)NRcRdから独立して選択されるか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と共に、-X-Y-の炭素原子を1個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される1~3つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Xaは、酸素、硫黄または-NRcであり、
Rc、RdおよびReは、水素およびアルキルから独立して選択され、
R5は、ヒドロキシル保護基であり、
Rxは、シアノアルキルまたはアルキルであり、
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基であり、
nは、1、2または3である)
の化合物に関する。
(式中、
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-;-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-または-O-CRaRb-であり、
但し、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-または-Se-Se-ではなく、
Jは、酸素、硫黄、=CH2または=N(Ra)であり、
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRdおよび-NReC(=Xa)NRcRdから独立して選択されるか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、2つのジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と共に、-X-Y-の炭素原子を1個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される1~3つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Xaは、酸素、硫黄または-NRcであり、
Rc、RdおよびReは、水素およびアルキルから独立して選択され、
R5は、ヒドロキシル保護基であり、
Rxは、シアノアルキルまたはアルキル、特にシアノアルキルであり、
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基であり、
nは、1、2または3である)
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。
-X-Y-が-CH2-O-、-CH(CH3)-O-または-CH2CH2-O-である、本発明に記載の化合物;
本発明に記載の、式(III)または(IV):
(式中、R5、Rx、RyおよびNuは上に定義した通りである)
の化合物;
Rxが2-シアノ-1,1-ジメチル-エチル、メチル、エチル、プロピルまたはtert-ブチルである、本発明に記載の化合物;
Rxが2-シアノ-1,1-ジメチル-エチルである、本発明に記載の化合物;
Ryがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、本発明に記載の化合物;
Ryがジアルキルアミノである、本発明に記載の化合物;
Ryがジイソプロピルアミノである、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物;
本発明に記載の、式(V):
(式中、R5およびNuは、上に定義した通りである)
の化合物;
Nuがチミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシルまたは保護されたウラシルである、本発明に記載の化合物。
の化合物と、式P(Ry)2(CH2)COO(Rx)の化合物との反応を含む(式中、X、Y、R5、Nu、RxおよびRyは上に定義した通りである)、プロセス;
カップリング剤が1H-テトラゾール、5-エチルチオ-1H-テトラゾール、2-ベンジルチオテトラゾールまたは4,5-ジシアノイミダゾール(DCI)、特にテトラゾールである、本発明に記載のプロセス;ならびに
オリゴヌクレオチドの製造における本発明に記載の化合物の使用。
(式中、
R2は、アルコキシ、アルコキシアルコキシまたはアミノ、特にアルコキシまたはアルコキシアルコキシであり、
R5は、ヒドロキシル保護基であり、
Rxは、シアノアルキルまたはアルキル、特にシアノアルキルであり、
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基である)
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。
R2がメトキシ、メトキシエトキシまたはアミノ、特にメトキシまたはメトキシエトキシである、本発明に記載の化合物;
本発明に記載の、式(VII):
(式中、R5、Rx、RyおよびNuは上に定義した通りである)
の化合物;
Rxが2-シアノ-1,1-ジメチル-エチル、メチル、エチル、プロピルまたはtert-ブチルである、本発明に記載の化合物;
Rxが2-シアノ-1,1-ジメチル-エチルである、本発明に記載の化合物;
Ryがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、本発明に記載の化合物;
Ryがジアルキルアミノである、本発明に記載の化合物;
Ryがジイソプロピルアミノである、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物;
本発明に記載の、式(VIII):
(式中、R5およびNuは、上に定義した通りである)
の化合物;
Nuがチミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシルまたは保護されたウラシルである、本発明に記載の化合物。
の化合物と、式P(Ry)2(CH2)COO(Rx)の化合物との反応を含む(式中、R2、R5、Nu、RxおよびRyは上に定義した通りである)、プロセス;
カップリング剤が1H-テトラゾール、5-エチルチオ-1H-テトラゾール、2-ベンジルチオテトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール(DCI)、特にDCIである、本発明に記載のプロセス;ならびに
オリゴヌクレオチドの製造における本発明に記載の化合物の使用。
A アデニン
G グアニン
mC メチルシトシン
T チミン
LNA ロックド核酸
RNA リボ核酸
DMT ジメトキシトリチル
DCA ジクロロ酢酸
DCM ジクロロメタン
THF テトラヒドロフラン
Anh.無水
TLC 薄層クロマトグラフィー
NMR 核磁気共鳴
CPG 制御された細孔ガラス
RT 逆転写
qPCR 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ds 二本鎖
Tm 熱融解
1.1. 1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-ブロモアセテート
2-ブロモアセチルブロミド(14.7g、6.31mL、72.6mmol、1.2当量)のトルエン(67.2mL)溶液に、撹拌しながら3-ヒドロキシ-3-メチルブタンニトリル(6g、6.28ml、60.5mmol、1当量)をゆっくり添加した。丸底フラスコにフリードリッヒ冷却器および酸トラップ(NaOH水溶液を含有)に通気した乾燥管を取り付けた。反応混合物を一晩加熱還流した。反応物を室温に冷却し、次いで、混合物を真空中で濃縮して無色油状物を得た。粗生成物を、酢酸エチル/ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物をヘキサン中の30%酢酸エチルで溶出して、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(8.14g、37mmol、収率58%)を得た。
1-クロロ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスファンジアミン(7.75g、29mmol、1当量)を無水THF(69.4ml)に溶解した。さらに41.6mlの無水ジエチルエーテルを添加した。無水THF(34.7ml)中の1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-ブロモアセテート(7.03g、32mmol、1.1当量)を丸底フラスコに入れた。亜鉛(2.85g、43.6mmol、1.5当量)、無水ジエチルエーテル(22.2ml)および磁気撹拌子を、フリードリッヒ冷却器を取り付けた500mLの三口丸底フラスコに入れた。ホスフィン(36mL)およびブロモアセテート溶液(10mL)を三口丸底フラスコに同時に非常にゆっくりと添加した。次いで、発熱反応が顕著になる(わずかに濁った無色の反応が透明でわずかに黄色になる)まで、反応混合物を還流下で加熱した。ホスフィンおよびブロモアセテート溶液の残りを添加することにより、反応を還流下で継続した。添加が完了したら、反応物を加熱により45分間還流を維持し、室温に冷却し、31P NMRによって完了について分析した。δ=135ppmの出発物質をδ=48ppmの単一生成物に変換した。冷却した反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な油状物を得た。得られた物質を無水ヘプタンおよび少量のアセトニトリルで溶解して、粗生成物を完全に溶解した。この溶液を無水ヘプタンで2回抽出した。アセトニトリル層を、δ=48ppmの生成物が存在しないことについて31P NMRによって分析し、廃棄した。全てのヘプタン画分を合わせ、真空中で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。次いで、これを高真空下で一晩乾燥させて、白色固体(7.096g、19mmol、収率62%)を得た。
1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-5-メチル-ピリミジン-2,4-ジオン(0.7g、1.22mmol、1当量)を無水DCM(15.3ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(545mg、1.47mmol、1.2当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール(2.17ml、978μmol、0.8当量)を無水CH3CN中の0.45M溶液として反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(99mg、136μl、978μmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー(80/20:酢酸エチル/ヘプタン)を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水DCMに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、743mgの標的化合物を白色固体として得た(743mg、0.88mmol、収率69%)。
N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]プリン-6-イル]ベンズアミド(3g、4.37mmol、1当量)を無水DCM(54.7ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(1.95g、5.25mmol、1.2当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール(7.78ml、3.5mmol、0.8当量)を無水CH3CN中の0.45M溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(354mg、488μl、3.5mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー(80/20:酢酸エチル/ヘプタン)を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水DCMに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、1.86gの標的化合物を白色固体として得た(1.86g、1.9mmol、収率45%)。
N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-5-メチル-2-オキソ-ピリミジン-4-イル]ベンズアミド(2.8g、4.14mmol、1当量)を無水DCM(59.2ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(1.85g、4.97mmol、1.2当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール(7.37ml、3.31mmol、0.8当量)を無水CH3CN中の0.45M溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(335mg、462μl、3.31mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠なわずかに黄色の油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー(50/50:酢酸エチル/ヘプタン)を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水DCMに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、2.35gの標的化合物を淡黄色固体として得た(2.35g、2.22mmol、収率46%)。
N’-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-6-オキソ-1H-プリン-2-イル]-N,N-ジメチル-ホルムアミジン(2.6g、3.89mmol、1当量)を無水DCM(55.6ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(1.74g、4.67mmol、1.2当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール(6.92ml、3.12mmol、0.8当量)を無水CH3CN中の0.45M溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(315mg、434μl、3.12mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー(100%酢酸エチル)を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水DCMに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、1.4gの標的化合物を白色固体として得た(1.4g、1.4mmol、収率38%)。
Bioautomation社のMerMade 12自動DNA合成装置を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体(500Å)を使用して1μmolスケールで行った。
*隣接ヌクレオチド間のPACEホスホロチオエート修飾。
A、G、mC、Tは、LNAヌクレオチドを表す。
a、g、c、tは、DNAヌクレオチドを表す。
他の結合は全て、ホスホロチオエートとして調製した。
HeLaおよびA549細胞株をATCCから購入し、サプライヤーの推奨に従って、37℃、5%CO2の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、3000細胞/ウェル(HeLa)および3500細胞/ウェル(A549)を96マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を24時間インキュベートした後、PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲:8段階の最高濃度25μM、1:1希釈。オリゴヌクレオチドを添加した3日後、細胞を採取した。RNAを、製造者の説明書に従い、PureLink Pro 96 RNA精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して抽出し、50μlの水に溶出した。その後、RNAをDNase/RNaseフリーの水(Gibco)で10倍希釈し、90℃に1分間加熱した。
HeLaおよびA549細胞株をATCCから購入し、サプライヤーの推奨に従って、37℃、5%CO2の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、3000細胞/ウェル(HeLa)および3500細胞/ウェル(A549)を96マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を24時間インキュベートした後、PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲:8段階の最高濃度25μM、1:1希釈。オリゴヌクレオチドを添加した3日後、細胞を採取した。RNAを、製造者の説明書に従い、PureLink Pro 96 RNA精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して抽出し、50μlの水に溶出した。その後、RNAをDNase/RNaseフリーの水(Gibco)で10倍希釈し、90℃に1分間加熱した。
初代マウス肝細胞を、文献(BerryおよびFriend、1969、J.Cell Bio;Paternaら、1998、Toxicol.Appl.Pharmacol.)に従って、2段階灌流プロトコルの後にペントバルビタールで麻酔したC57BL/6Jマウスの肝臓から単離した。第1の工程は、HBSS+15mM HEPES+0.4mM EGTAで5分間、続いてHBSS+20mM NaHCO3+0.04%BSA(Sigma #A7979)+4mM CaCL2(Sigma #21115)+0.2mg/mlコラゲナーゼ2型(Worthington #4176)で12分間行った。肝細胞を氷上で5mlの冷Williams培地E(WME)(Sigma#W1878、1×Pen/Strep/グルタミン、10%(v/v)FBS(ATCC#30-2030)で補完)に捕捉した。粗細胞懸濁液を70μm、続いて40μmセルストレーナー(Falcon#352350および#352340)でフィルタにかけ、WMEを25mlまで充填し、室温で5分間、50×gで遠心分離して肝細胞をペレット化した。上清を除去し、肝細胞を25mlのWMEに再懸濁した。25mlの90%パーコール(Percoll)溶液(Sigma#P4937、pH=8.5~9.5)を添加し、10分間25℃で、50×gで遠心分離した後、上清および浮遊細胞を除去した。残りのパーコールを除去するために、ペレットを50mLのWME培地に改めて再懸濁し、3分間25℃で、50×gで遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを20mLのWMEに再懸濁し、細胞数および生存率を決定し(Invitrogen、Cellcount)、250,000細胞/mlに希釈した。25,000細胞/ウェルをコラーゲン被覆96ウェルプレート(PD Biocoat Collagen I #356407)に播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。3時間後、細胞をWMEで洗浄して、付着していない細胞を除去し、培地を置き換えた。播種の24時間後、オリゴヌクレオチドをある範囲の濃度で添加した:最高濃度3,125μM、8段階のハーフログ希釈。オリゴヌクレオチドを添加した3日後、細胞を採取した。RNAを、製造者の説明書に従い、PureLink Pro 96 RNA精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して抽出し、50μlの水に溶出した。その後、RNAをDNase/RNaseフリーの水(Gibco)で10倍希釈し、90℃に1分間加熱した。
dsLNA/DNAまたはdsLNA/RNAヘテロ二重鎖(熱融解=Tm)の変性点を以下の手順に従って測定した:
等モル量のRNAまたはDNAおよびLNAオリゴヌクレオチド(ApoBについては20μMおよびMalat-1については10μM)の溶液は、緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、pH7.4)中で10μMのdsオリゴヌクレオチド(ApoB)および5μMのdsオリゴヌクレオチド(Malat-1)をもたらす。溶液を95℃に2分間加熱(ハイブリダイゼーション)し、次いで、15分間室温に冷却した。260nmでのUV吸光度を、Thermo ScientificからのEvolution 600UV-Vis分光光度計(加熱速度1℃/分、読取速度20/分)を使用して記録した。変性点(すなわち、融点、Tm)の決定のために、融解転移をLOWESS曲線に適合させ、変曲点(=Tm)を記述的適合の一次導関数のピーク位置によって同定した。
以下のオリゴヌクレオチドを生成し、それに対して試験した:
*隣接ヌクレオチド間のPACEホスホロチオエート修飾。
°隣接ヌクレオチド間のPACEホスホロジエステル修飾。
A、G、mC、Tは、LNAヌクレオチドを表す。
a、g、c、tは、DNAヌクレオチドを表す。
他の結合は全て、ホスホロチオエートとして調製した。
マウス(C57/BL6)に、オリゴヌクレオチドを15mg/kg用量、1、2および3日目に3回用量で皮下投与した(n=5)。8日目にマウスを屠殺し、MALAT-1 RNAの低減を心臓に対して測定した。親化合物は、3×15mg/kgおよび3×30mg/kgの2回用量で投与した。
9.1. 1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-ブロモアセテート
2-ブロモアセチルブロミド(14.7g、6.31mL、72.6mmol、1.2当量)の溶液を、トルエン(67.2mL)を含む250mL丸底フラスコに添加した。3-ヒドロキシ-3-メチルブタンニトリル(6g、6.28ml、60.5mmol、1当量)を撹拌しながらゆっくり添加した。丸底フラスコにフリードリッヒ冷却器および酸トラップ(NaOH水溶液を含有)に通気した乾燥管を取り付けた。反応混合物を加熱還流し、一晩還流した。反応物を室温に冷却し、次いで、混合物を真空中で濃縮して油状物を得た。粗油状物を、酢酸エチル/ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製した:生成物をヘキサン中の30%酢酸エチルで溶出し、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル-2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(8.14g、37mmol、収率58%)を得た。
栓をした250mL丸底フラスコに無水THF(69.4ml)、1-クロロ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスファンジアミン(7.75g、29mmol、1当量)および磁気撹拌子を加え、ホスフィンが溶解するまで溶液を撹拌した。溶解後、無水ジエチルエーテル(41.6ml)を添加した。1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-ブロモアセテート(7.03g、32mmol、1.1当量)を100mL丸底フラスコに入れ、無水THF(34.7ml)を添加した。亜鉛(2.85g、43.6mmol、1.5当量)、無水ジエチルエーテル(22.2ml)および磁気撹拌子を、フリードリッヒ冷却器を取り付けた500mLの三口丸底フラスコに入れた。ホスフィン(36mL)およびブロモアセテート溶液(10mL)を三口丸底フラスコに添加した。次いで、発熱反応が顕著になる(わずかに濁った無色の反応が透明でわずかに黄色になる)まで、反応混合物を還流下で加熱した。ホスフィンおよびブロモアセテート溶液の残りを添加することにより、反応を還流下で継続した。添加が完了したら、反応物を加熱により45分間還流を維持し、室温に冷却し、31P NMRによって完了について分析した。δ=135ppmの出発物質をδ=48ppmの単一生成物に変換した。冷却した反応混合物を真空中で粘稠な油状物に濃縮した。得られた粘稠な油状物を、無水ヘプタンで溶解した。次いで、形成した固体をアセトニトリルに溶解し、この溶液を無水ヘプタンで2回抽出した。アセトニトリル溶液を、δ=48ppmの生成物が存在しないことについて31P NMRによって分析し、廃棄した。全てのヘプタン画分を合わせ(上層)、真空中で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。次いで、これを高真空下で一晩乾燥させた。一晩乾燥させたところ、得られた生成物は良好な白色固体(7.096g、19mmol、収率62%)であった。
5-メチル-1-[rac-(2R,5R)-4-ヒドロキシ-3-(2-メトキシエトキシ)-5-[[rac-(2E)-1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-2-[rac-(Z)-プロパ-1-エニル]ペンタ-2,4-ジエノキシ]メチル]オキソラン-2-イル]ピリミジン-2,4-ジオン(800mg、1.29mmol、1当量)を無水DCM(16.2ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(721mg、1.94mmol、1.5当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、4,5-DCI(122mg、1.03mmol、0.8当量)を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって反応の程度を分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(105mg、144μl、1.03mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、80/20:酢酸エチル/ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水DCMに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、736mgの標的化合物を白色固体として得た(736mg、収率61%)。LCMS(ES+)実測値:889.5g/mol.
Rac-N-(9-((2R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシ-3-(2-メトキシエトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ベンズアミド(600mg、0.82mmol、1当量)を、無水DCM(10.2ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(457mg、1.23mmol、1.5当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、4,5-DCI(77.5mg、0.66mmol、0.8当量)を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって反応の程度を分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(66.4mg、91.4μl、0.65mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、80/20:酢酸エチル/ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水DCMに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、260mgの標的化合物を白色固体として得た(260mg、収率32%)。LCMS(ES+)実測値:1002.5g/mol.
2-メチル-N-[6-オキソ-9-[rac-(2R,5R)-5-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニルメトキシ]メチル]-4-ヒドロキシ-3-(2-メトキシエトキシ)オキソラン-2-イル]-1H-プリン-2-イル]プロパンアミド(700mg、0.98mmol、1当量)を無水DCM(12.3ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(546mg、1.47mmol、1.5当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、4,5-DCI(93mg、0.79mmol、0.8当量)を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって反応の程度を分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(80mg、109μl、0.79mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、酢酸エチルで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水DCMに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、520mgの標的化合物を白色固体として得た(520mg、収率49%)。LCMS(ES+)実測値:984.5g/mol.
N-[5-メチル-2-オキソ-1-[rac-(2R,5R)-5-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニルメトキシ]メチル]-4-ヒドロキシ3-(2-メトキシエトキシ)オキソラン-2-イル]ピリミジン-4-イル]ベンズアミド(950mg、1.32mmol、1当量)を無水DCM(16.5ml)に溶解し、次いで、1-シアノ-2-メチルプロパン-2-イル2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファネイル)アセテート(733mg、1.97mmol、1.5当量)を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、4,5-DCI(124mg、1.05mmol、0.8当量)を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、31P NMRおよびシリカゲルTLC(酢酸エチルで溶出)によって反応の程度を分析した。TLC上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト31P NMRシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン(107mg、147μl、1.05mmol、0.8当量)を添加することによって反応をクエンチした。5分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、80/20:酢酸エチル/ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水DCMに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、722mgの標的化合物を淡黄色固体として得た(722mg、収率55%)。LCMS(ES+)実測値:992.4g/mol.
Bioautomation社のMerMade 12自動DNA合成装置を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体(500Å)を使用して1μmolスケールで行った。
HeLa細胞をATCCから購入し、サプライヤーの推奨に従って、37℃、5%CO2の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、3000細胞/ウェルを96マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を24時間インキュベートした後、PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲:8段階の最高濃度25μM、1:1希釈。オリゴヌクレオチドを添加した3日後、細胞を採取した。RNAを、製造者の説明書に従い、PureLink Pro 96 RNA精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して抽出し、50μlの水に溶出した。その後、RNAをDNase/RNaseフリーの水(Gibco)で10倍希釈し、90℃に1分間加熱した。
Claims (37)
- (A1)および(A2)の一方が糖修飾ヌクレオシドであり、他方がDNAである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- (A1)および(A2)が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドである、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記糖修飾ヌクレオシドが、独立して、2’糖修飾ヌクレオシドである、請求項1~3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNA、特に2’-メトキシ-RNA、2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、または2’-フルオロ-ANAから独立して選択される、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記2’糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAから独立して選択され、特にβ-D-オキシLNAである、請求項6に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項1に記載のヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項1に記載のヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 1~15個、特に1~5個、より詳細には1、2、3、4、または5個の、請求項1に記載の式(I)のジヌクレオシドを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記さらなるヌクレオシド間結合が、全て、式-P(=S)(OR)O2-のホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、式中、Rが水素またはリン酸保護基である、請求項1~10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- DNAヌクレオシド、RNAヌクレオシド、および糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 1つまたは複数のヌクレオシドが、5-メチルシトシン核酸塩基を含むヌクレオシドなどの、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、請求項1~12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載の式(I)の少なくとも1つのジヌクレオシドが、前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのフランキング領域中にあるか、または前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌセオチドのギャップ領域とフランキング領域との間に位置する、請求項1~13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、LNAギャップマー、混合ウイングギャップマー、または2’-置換ギャップマー、特に2’-O-メトキシエチルギャップマーである、請求項1~14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式5’-F-G-F’-3’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Gが、RNaseHを動員することができる5~18ヌクレオシドの領域であり、前記領域Gは、5’および3’がそれぞれフランキング領域FおよびF’によって隣接されており、領域FおよびF’が、独立して、1~7つの2’-糖修飾ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、領域Gに隣接する領域Fのヌクレオシドが2’-糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接する領域F’のヌクレオシドが2’-糖修飾ヌクレオシドである、請求項1~15のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載の式(I)の前記少なくとも1つのジヌクレオシドが、領域FもしくはF’中に、または領域Gと領域Fとの間に、または領域Gと領域F’との間に位置する、請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方における前記2’-糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNA、特に2’-メトキシ-RNA、2’-アルコキシアルコキシ-RNA、特に2’-メトキシエトキシ-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドから独立して選択される、請求項16または17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方における全ての前記2’-糖修飾ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、請求項16~18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドを含む、請求項16~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fもしくは領域F’、または領域FおよびF’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA2’-糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオシドを含む、請求項16~20のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ギャップ領域Gが、5~16個、特に8~16個、より詳細には8、9、10、11、12、13、または14個の連続するDNAヌクレオシドを含む、請求項16~21のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fおよび領域F’が、独立して、1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオシド長である、請求項16~22のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 領域Fおよび領域F’が、それぞれ独立して、1、2、3、または4つのLNAヌクレオシドを含む、請求項16~23のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAから独立して選択される、請求項16~24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、請求項16~25のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列(F-G-F’)が、10~30ヌクレオチド長、特に12~22、より詳細には14~20オリゴヌクレオチド長である、請求項16~26のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式5’-D’-F-G-F’-D’’-3’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、F、G、およびF’は、請求項17~28のいずれか一項に記載の通りであり、領域D’およびD’’は、それぞれ独立して、0~5つのヌクレオチド、特に2、3、または4つのヌクレオチド、特にDNAヌクレオチド、例えばホスホジエステル結合したDNAヌクレオシドからなる、請求項16~27のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 各フランキング領域FおよびF’が、独立して、1、2、3、4、5、6、または7つ、特に1つの、請求項1に記載のジヌクレオシドを含む、請求項16~28のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載のジヌクレオシドを合計で1つ含む、請求項16~29のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載のジヌクレオシドが、領域F’中、または領域Gと領域F’との間に位置する、請求項30に記載のアンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ヒトRNaseH1を動員することができる、請求項1~32のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 特にナトリウム、カリウム塩、またはアンモニウム塩である、請求項1~32のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容され得る塩と、
任意選択的にリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容され得る塩に共有結合した、少なくとも1つのコンジュゲート部分と
を含む、コンジュゲート。 - 請求項1~34のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、薬学的組成物。
- 治療的に活性な物質としての使用のための、請求項1~35のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲート。
- 本明細書に記述した通りの発明。
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