TW202102516A - 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種單股反義間隙子寡核苷酸，其包含至少一個式(I)之二核苷
Figure 109105509-A0101-11-0001-1
其中(A1 )、(A2 )及A如說明書及申請專利範圍中所定義。根據本發明之寡核苷酸可用作藥劑。

Description

膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
本發明尤其係關於一種單股反義間隙子寡核苷酸，其包含至少一個式(I)之二核苷
Figure 02_image005
其中(A1 )及(A2 )中之一者為經糖修飾之核苷且另一者為經糖修飾之核苷或DNA核苷且A為氧或硫，或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦尤其係關於適用於製備根據本發明之反義間隙子寡核苷酸之新穎亞磷醯胺。
近年來，作為治療劑之合成寡核苷酸取得了顯著進展，從而產生藉由不同機制起作用之臨床上證實之分子之廣泛組合，該等機制包括RNase H活化間隙子、剪接切換寡核苷酸、微RNA抑制劑、siRNA或適體(S. T. Crooke,Antisense drug technology:principles, strategies, and applications , 第2版, Boca Raton, FL: CRC Press, 2008)。天然寡核苷酸在生物系統中對於核分解降解本質上為不穩定的。此外，其展示高度不利之藥物動力學行為。為了改良此等缺點，近幾十年來已研究廣泛多種化學修飾。可認為最成功修飾中之一者為引入硫代磷酸酯鍵，其中非橋接磷酸酯氧原子中之一者經硫原子置換(F. Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009,10 , 117-121)。此類硫代磷酸酯寡去氧核苷酸展示增加的蛋白質結合以及明顯較高之核分解降解穩定性，且因此相比於其未經修飾之磷酸二酯類似物，其在血漿、組織及細胞中的半衰期實質上更長。此等關鍵特徵使第一代寡核苷酸療法之發展成為可能以及為其經由後代修飾(諸如鎖定核酸(Locked Nucleic Acid；LNA))而進一步改良鋪設道路。
出人意料地發現根據本發明之單股反義寡核苷酸有良好耐受性。其在活體外至少與僅包含硫代磷酸酯核苷間鍵之參考寡核苷酸一樣有效且在活體內比僅包含硫代磷酸酯核苷間鍵之參考寡核苷酸更有效。亦出人意料地，根據本發明之單股反義寡核苷酸在心臟細胞株(活體外)及心臟組織(活體內)尤其有效。
在本說明書中，單獨或組合形式之術語「烷基」表示具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，特定言之具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且更特定言之具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。直鏈及分支鏈C1 -C8 烷基之實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、異構戊基、異構己基、異構庚基及異構辛基，特定言之甲基、乙基、丙基、丁基及戊基。烷基之特定實例為甲基、乙基及丙基。
單獨或組合形式之術語「環烷基」表示具有3至8個碳原子之環烷基環且特定言之具有3至6個碳原子之環烷基環。環烷基之實例為環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基，更特定言之環丙基及環丁基。「環烷基」之特定實例為環丙基。
單獨或組合形式之術語「烷氧基」表示式烷基-O-之基團(其中術語「烷基」具有先前給出之意義)，諸如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基及第三丁氧基。特定「烷氧基」為甲氧基及乙氧基。甲氧基乙氧基為「烷氧基烷氧基」之特定實例。
單獨或組合形式之術語「氧基」表示-O-基團。
單獨或組合形式之術語「烯基」表示包含烯鍵及至多8個、較佳至多6個，尤佳至多4個碳原子之直鏈或分支鏈烴殘基。烯基之實例為乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基及異丁烯基。
單獨或組合形式之術語「炔基」表示包含參鍵及至多8個，特定言之2個碳原子之直鏈或分支鏈烴殘基。
單獨或組合形式之術語「鹵素」或「鹵基」表示氟、氯、溴或碘，且特定言之氟、氯或溴，更特定言之氟。與另一基團組合之術語「鹵基」表示該基團經至少一個鹵素取代，特定言之經一至五個鹵素取代，特定言之經一至四個鹵素(亦即，一個、兩個、三個或四個鹵素)取代。
單獨或組合形式之術語「鹵烷基」表示經至少一個鹵素取代，特定言之經一至五個鹵素、特定言之一至三個鹵素取代之烷基。鹵烷基之實例包括一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基或一氟丙基、二氟丙基或三氟丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。氟甲基、二氟甲基及三氟甲基為特定「鹵烷基」。
單獨或組合形式之術語「鹵環烷基」表示經至少一個鹵素取代，特定言之經一至五個鹵素、特定言之一至三個鹵素取代之如上文所定義的環烷基。「鹵環烷基」之特定實例為鹵環丙基，特定言之氟環丙基、二氟環丙基及三氟環丙基。
單獨或組合形式之術語「羥基(hydroxyl/hydroxy)」表示-OH基團。
單獨或組合形式之術語「硫羥基(thiohydroxyl/thiohydroxy)」表示-SH基團。
單獨或組合形式之術語「羰基」表示-C(O)-基團。
單獨或組合形式之術語「羧基(carboxy/carboxyl)」表示-COOH基團。
單獨或組合形式之術語「胺基」表示一級胺基(-NH2 )、二級胺基(-NH-)或三級胺基(-N-)。
單獨或組合形式之術語「烷基胺基」表示經一個或兩個如上文所定義之烷基取代之如上文所定義的胺基。
單獨或組合形式之術語「磺醯基」意謂-SO2 基團。
單獨或組合形式之術語「亞磺醯基」表示-SO-基團。
單獨或組合形式之術語「硫基」表示-S-基團。
單獨或組合形式之術語「氰基」表示-CN基團。
單獨或組合形式之術語「疊氮基」表示-N3 基團。
單獨或組合形式之術語「硝基」表示NO2 基團。
單獨或組合形式之術語「甲醯基」表示-C(O)H基團。
單獨或組合形式之術語「胺甲醯基」表示-C(O)NH2 基團。
單獨或組合形式之術語「胺甲醯胺基」表示-NH-C(O)-NH2 基團。
單獨或組合形式之術語「芳基」表示包含6至10個碳環原子之單價芳族碳環單環或雙環之環系統，其視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基及甲醯基。芳基之實例包括苯基及萘基，特定言之苯基。
單獨或組合形式之術語「雜芳基」表示5至12個環原子之單價芳族雜環單環或雙環之環系統，其包含1、2、3或4個選自N、O及S之雜原子，其餘環原子為碳，該環系統視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基及甲醯基。雜芳基之實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮呯基(azepinyl)、二氮呯基、異噁唑基、苯并呋喃基、異噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚基、異苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、喹喏啉基、咔唑基或吖啶基。
單獨或組合形式之術語「雜環基」表示4至12個，特定言之4至9個環原子的單價飽和或部分不飽和單環或雙環之環系統，其包含1、2、3或4個選自N、O及S之環雜原子，其餘環原子為碳，該環系統視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基及甲醯基。單環飽和雜環基之實例為氮雜環丁基、吡咯啶基、四氫呋喃基、四氫-噻吩基、吡唑啶基、咪唑啶基、噁唑啶基、異噁唑啶基、噻唑啶基、哌啶基、四氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、1,1-二側氧基-硫代嗎啉-4-基、氮雜環庚烷基、二氮雜環庚烷基、高哌嗪基或氧氮雜環庚烷基。雙環飽和雜環烷基之實例為8-氮雜-雙環[3.2.1]辛基、奎寧環基、8-氧雜-3-氮雜-雙環[3.2.1]辛基、9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基、3-氧雜-9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基或3-硫雜-9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基。部分不飽和雜環烷基之實例為二氫呋喃基、咪唑啉基、二氫-噁唑基、四氫-吡啶基或二氫哌喃基。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留游離鹼或游離酸(其合乎生物學上或其他方面需要)之生物有效性及特性之彼等鹽。該等鹽係由以下形成：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，尤其鹽酸；及有機酸，諸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯基半胱胺酸。另外，此等鹽可由將無機鹼或有機鹼添加至游離酸來製備。衍生自無機鹼之鹽包括(但不限於)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺；經取代之胺，包括天然存在之經取代胺；環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多元胺樹脂。本發明之寡核苷酸亦可以兩性離子形式存在。本發明之尤佳醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽及三烷基銨鹽。
單獨或組合形式之術語「保護基」表示選擇性地阻斷多官能性化合物之反應位點以使得化學反應可在另一無保護反應位點處選擇性地進行之基團。可移除保護基。例示性保護基為胺基保護基、羧基保護基或羥基保護基。
「磷酸酯保護基」為磷酸酯基之保護基。磷酸酯保護基之實例為2-氰基乙基及甲基。磷酸酯保護基之特定實例為2-氰基乙基。
「羥基保護基」為羥基之保護基且亦用於保護硫醇基。羥基保護基之實例為乙醯基(Ac)、苯甲醯基(Bz)、苯甲基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或雙-(4-甲氧基苯基)苯基甲基) (DMT)、三甲氧基三苯甲基(或參-(4-甲氧基苯基)苯基甲基) (TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基((4-甲氧基苯基)二苯基甲基) (MMT)、對甲氧基苯甲基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、特戊醯基(Piv)、四氫哌喃基(THP)、四氫呋喃(THF)、三苯甲基(trityl/triphenylmethyl) (Tr)、矽烷基醚(例如三甲基矽烷基(TMS)、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、三-異丙基矽烷氧基甲基(TOM)及三異丙基矽烷基(TIPS)醚)、甲基醚及乙氧基乙基醚(EE)。羥基保護基之特定實例為DMT及TMT，特定言之DMT。
「硫羥基保護基」為硫羥基之保護基。硫羥基保護基之實例為「羥基保護基」之彼等實例。
若本發明之起始材料或化合物中之一者含有在一或多個反應步驟之反應條件下並不穩定或具反應性之一或多個官能基，則可在應用此項技術中熟知之方法的關鍵步驟之前引入適當保護基(如例如T. W. Greene及P. G. M. Wuts之「Protective Groups in Organic Chemistry」, 第3版, 1999, Wiley, New York中所描述)。可使用文獻中所描述之標準方法在合成後期移除此類保護基。保護基之實例為第三丁氧基羰基(Boc)、胺基甲酸9-茀基甲酯(Fmoc)、胺基甲酸2-三甲基矽烷基乙酯(Teoc)、苯甲氧羰基(Cbz)及對甲氧基苯甲氧羰基(Moz)。
本文中所描述之化合物可含有若干不對稱中心且可以光學純對映異構體、對映異構體(諸如，外消旋體)之混合物、非對映異構體之混合物、非對映異構外消旋體或非對映異構外消旋體之混合物的形式存在。
寡核苷酸 如本文中所使用之術語「寡核苷酸」定義為，熟習此項技術者一般將其理解為包含兩個或更多個共價連接之核苷的分子。此類共價結合之核苷亦可稱作核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，提及共價連接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。
反義寡核苷酸 如本文中所使用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至目標核酸，尤其雜交至目標核酸上之連續序列而調節目標基因表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA或shRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸為單股。應理解，本發明之單股寡核苷酸可形成髮夾結構(hairpin)或分子間雙螺旋結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙螺旋)，只要寡核苷酸之全長內之序列內或序列間自身互補程度小於50%。
連續核苷酸序列 術語「連續核苷酸序列」係指與目標核酸互補之寡核苷酸之區域。該術語在本文中可與術語「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換地使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成連續核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列(諸如F-G-F'間隙子區域)，且可視情況包含其他一或多個核苷酸，例如可用於將官能基連接至連續核苷酸序列之核苷酸連接子區域。核苷酸連接子區域可與目標核酸互補或可能不與其互補。
核苷酸 核苷酸為寡核苷酸及聚核苷酸之建構嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾之核苷 如本文中所使用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾來修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾的「單體」互換地使用。具有未經修飾之DNA或RNA糖部分之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若DNA或RNA核苷之鹼基區域中具有修飾的核苷允許Watson Crick鹼基配對，則其通常仍稱為DNA或RNA。
經修飾之核苷間鍵 術語「經修飾之核苷間鍵」定義為，熟習此項技術者一般將其理解為除磷酸二酯(PO)鍵以外的將兩個核苷共價偶合在一起的鍵。本發明之寡核苷酸可因此包含經修飾之核苷間鍵。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵相比，經修飾之核苷間鍵增大寡核苷酸對核酸酶之耐性。對於天然存在之寡核苷酸，核苷間鍵包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基。經修飾之核苷間鍵尤其適用於使活體內使用之寡核苷酸穩定，且可用以在本發明之寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區域處(例如在間隙子寡核苷酸之間隙區內)，以及在經修飾之核苷區域(諸如區域F及F')中防止核酸酶裂解。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個由天然磷酸二酯修飾之核苷間鍵，例如對核酸酶攻擊具有更多耐性之此類一或多個經修飾之核苷間鍵。核酸酶耐性可藉由在血清中培育寡核苷酸或藉由使用核酸酶耐性分析(例如蛇毒液磷酸二酯酶(snake venom phosphodiesterase；SVPD))來測定，兩者皆為此項技術中所熟知。能夠增強寡核苷酸之核酸酶耐性之核苷間鍵被稱作耐核酸酶核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%之核苷間鍵經修飾，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%之核苷間鍵為耐核酸酶核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵為耐核酸酶核苷間鍵。應認識到，在一些實施例中將本發明之寡核苷酸連接至非核苷酸官能基(諸如結合物)之核苷可為磷酸二酯。
用於本發明之寡核苷酸中之較佳經修飾之核苷間鍵為硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷間鍵由於核酸酶耐性、有益之藥代動力學及製造簡易性而尤其有用。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%之核苷間鍵為硫代磷酸酯，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%之核苷間鍵為硫代磷酸酯。在一些實施例中，除三硫代磷酸酯核苷間鍵外，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯。在一些實施例中，除了三硫代磷酸酯鍵以外，本發明之寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷間鍵及至少一個磷酸二酯鍵(諸如2、3或4個磷酸二酯鍵)兩者。在間隙子寡核苷酸中，磷酸二酯鍵(若存在)適當地不位於間隙區G中之連續DNA核苷之間。
耐核酸酶鍵(諸如硫代磷酸酯鍵)尤其適用於能夠在與目標核酸形成雙螺旋時募集核酸酶之寡核苷酸區域，諸如用於間隙子之區域G。然而，硫代磷酸酯鍵亦可適用於非核酸酶募集區及/或親和力增強區，諸如用於間隙子之區域F及F'。在一些實施例中，間隙子寡核苷酸可包含區域F或F'或者區域F及F'兩者中之一或多個磷酸二酯鍵，其中區域G中之核苷間鍵可完全為硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸之連續核苷酸序列中之所有核苷間鍵或寡核苷酸之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵。
應認識到，如EP 2 742 135中所揭示，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵(除磷酸二酯及硫代磷酸酯外)，例如膦酸烷酯/膦酸甲酯核苷間，其根據EP 2 742 135可例如在另外DNA硫代磷酸酯中耐受間隙區。
立體無規硫代磷酸酯鍵 硫代磷酸酯鍵為核苷間磷酸酯鍵，其中非橋接氧中之一者經硫取代。經硫取代非橋接氧中之一者引入對掌性中心，且因此在單個硫代磷酸酯寡核苷酸內，各硫代磷酸酯核苷間連結將呈S (Sp)或R (Rp)立體異構形式。此類核苷間連結被稱作「對掌性核苷間鍵」。藉由比較，磷酸二酯核苷間鍵由於其具有兩個非末端氧原子而為非對掌性的。
立體中心之對掌性名稱藉由標準Cahn-Ingold-Prelog規則(CIP優先規則)確定，該等規則首次公佈於Cahn, R.S.；Ingold, C.K.；Prelog, V. (1966) 「Specification of Molecular Chirality」 Angewandte Chemie International Edition 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851中。
在標準寡核苷酸合成期間，偶合及後續硫化之立體選擇性不受控制。出於此原因，各硫代磷酸酯核苷間鍵之立體化學隨機為Sp或Rp，且因此，由傳統寡核苷酸合成產生之硫代磷酸酯寡核苷酸實際上可以多達2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體之形式存在，其中X為硫代磷酸酯核苷間鍵之數目。此類寡核苷酸在本文中被稱作立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸，且不含有任何立體限定核苷間鍵。因此，立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸為源自非立體限定合成之個別非對映異構體之混合物。在此上下文中，混合物定義為至多2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體。
立體限定核苷間鍵 立體限定核苷間鍵為對其兩種非對映異構體形式Rp或Sp中之一者而言具有非對映異構過量之對掌性核苷間鍵。
應認識到，此項技術中所使用之立體選擇性寡核苷酸合成方法通常在各對掌性核苷間鍵處提供至少約90%或至少約95%非對映立體選擇性，且因此至多約10%，諸如約5%之寡核苷酸分子可具有替代性非對映異構形式。
在一些實施例中各立體限定對掌性核苷間鍵之非對映異構比率為至少約90:10。在一些實施例中，各對掌性核苷間鍵之非對映異構比率為至少約95:5。
立體限定硫代磷酸酯鍵為立體限定核苷間鍵之特定實例。
立體限定硫代磷酸酯鍵 立體限定硫代磷酸酯鍵為對其兩種非對映異構體形式Rp或Sp中之一者而言具有非對映異構體過量之硫代磷酸酯鍵。
硫代磷酸酯核苷間鍵之Rp及Sp組態呈現於下方
Figure 02_image007
其中3'R基團表示相鄰核苷(5'核苷)之3'位置，且5'R基團表示相鄰核苷(3'核苷)之5'位置。
在本文中，Rp核苷間鍵亦可表示為srP，且Sp核苷間鍵可表示為ssP。
在一特定實施例中，各立體限定硫代磷酸酯鍵之非對映異構體比率為至少約90:10或至少95:5。
在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯鍵之非對映異構比率為至少約97:3。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯鍵之非對映異構比率為至少約98:2。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯鍵之非對映異構比率為至少約99:1。
在一些實施例中，立體限定核苷間鍵在存在於寡核苷酸分子群體中之至少97%，諸如至少98%、諸如至少99%或(基本上)所有寡核苷酸分子中呈相同非對映異構形式(Rp或Sp)。
可在僅具有非對掌性主鏈(亦即磷酸二酯)之模型系統中量測非對映異構純度。有可能藉由例如使具有立體限定核苷間鍵之單體偶合至以下模型系統「5' t-po-t-po-t-po 3'」來量測各單體之非對映異構純度。此偶合之結果隨後將得到：5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3'或5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'，可使用HPLC對其進行分離。非對映異構純度藉由整合來自兩個可能非對映異構體之UV信號且得到此等非對映異構體之比率(例如98:2、99:1或＞99:1)來測定。
應理解，特定單一非對映異構體(單一立體限定寡核苷酸分子)之非對映異構純度將取決於各核苷間位置處之經限定立體中心之偶合選擇性以及待引入的立體限定核苷間鍵之數目。藉助於實例，若各位置處之偶合選擇性為97%，則具有15個立體限定核苷間鍵之立體限定寡核苷酸之所得純度將為0.9715 ，亦即63%的所要非對映異構體相比於37%的其他非對映異構體。經限定非對映異構體之純度可在合成後藉由純化，例如藉由HPLC，諸如離子交換層析法或逆相層析法改良。
在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指寡核苷酸之群體，其中該群體中之至少約40%，諸如至少約50%具有所要非對映異構體。
換言之，在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指寡核苷酸之群體，其中該群體中之至少約40%，諸如至少約50%由所要(特定)立體限定核苷間鍵基元(亦稱為立體限定基元)組成。
對於包含立體無規及立體限定核苷間對掌性中心兩者之立體限定寡核苷酸，參考保留所要立體限定核苷間鍵基元之寡核苷酸群體%來測定立體限定寡核苷酸之純度，在計算時忽略立體無規鍵。
核鹼基 術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交時形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，其可與天然存在之核鹼基不同，但在核酸雜交期間具有官能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤；以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶來修飾，該經修飾之嘌呤或嘧啶諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并(thiozolo)-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
核鹼基部分可藉由各對應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)指示，其中各字母可視情況包括當量功能的經修飾核鹼基。舉例而言，在所例示之寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙子，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
經修飾之寡核苷酸 術語經修飾之寡核苷酸描述包含一或多個經糖修飾之核苷及/或經修飾之核苷間鍵的寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸為已在文獻中用於描述具有經修飾之核苷之寡核苷酸的術語。
立體限定寡核苷酸 立體限定寡核苷酸為其中核苷間鍵中之至少一者為立體限定核苷間鍵之寡核苷酸。
立體限定硫代磷酸酯寡核苷酸為其中核苷間鍵中之至少一者為立體限定之硫代磷酸酯核苷間鍵之寡核苷酸。
互補 術語「互補」描述核苷/核苷酸之Watson-Crick鹼基配對之能力。Watson-Crick鹼基對為鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因此術語互補涵蓋未經修飾及經修飾之核鹼基之間的Watson Crick鹼基配對(參見例如Hirao等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1)。
如本文所使用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中既定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如目標核酸)之既定位置處之連續核苷酸序列互補(亦即，與其形成Watson Crick鹼基對)的核苷酸比例。藉由以下來計算百分比：(當與目標序列5'-3'及寡核苷酸序列3'-5'比對時)對兩個序列之間形成對的比對鹼基之數目進行計數，將其除以寡核苷酸中核苷酸的總數目且乘以100。在此類比較中，未比對(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為錯配。較佳地，在計算連續核苷酸序列之互補%時不允許插入及刪除。
術語「完全互補」係指100%互補性。
一致性 如本文中所使用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中既定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如目標核酸)之既定位置處之連續核苷酸序列一致(亦即，其與互補核苷形成Watson Crick鹼基對之能力一致)的核苷酸數目之百分比。藉由以下來計算百分比：對兩個序列之間一致的比對鹼基之數目進行計數，將其除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。一致性%=(匹配×100)/比對區域之長度。較佳地，在計算連續核苷酸序列之互補%時不允許插入及刪除。
雜交 如本文中所使用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」應理解為兩個核酸股(例如寡核苷酸及目標核酸)在相對股上之鹼基對之間形成氫鍵，藉此形成雙螺旋。兩個核酸股之間的結合親和力為雜交之強度。通常描述，就熔融溫度(Tm )而言定義為一半寡核苷酸與目標核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下Tm 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯自由能(Gibbs free energy) ΔG°為結合親和力之更精確表示，且藉由ΔG° = -RTln(Kd )與反應之解離常數(Kd )相關聯，其中R為氣體常數且T為絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間的反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與目標核酸之間的強雜交。ΔG°為與其中水性濃度為1 M，pH為7且溫度為37℃之反應相關之能量。寡核苷酸與目標核酸之雜交為自發性反應且就自發性反應而言，ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)量測，如Hansen等人, 1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之適當導出的熱力學參數來在數值上估算。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸預定核酸目標的可能性，本發明之寡核苷酸針對10-30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至所估算之ΔG°值低於-10 kcal之目標核酸。在一些實施例中，雜交度或雜交強度藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°來量測。針對8-30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至所估算之ΔG°值低於-10 kcal範圍、諸如低於-15 kcal、諸如低於-20 kcal及諸如低於-25 kcal之目標核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至所估算之ΔG°值為-10至-60 kcal，諸如-12至-40、諸如-15至-30 kcal或-16至-27 kcal、諸如-18至-25 kcal之目標核酸。
糖修飾 本發明之寡聚物可包含一或多個具有經修飾之糖部分(亦即當與DNA及RNA中發現之核糖部分相比時糖部分之修飾)之核苷。
已製備許多具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸之某些特性，諸如親和力及/或核酸酶耐性。
此類修飾包括其中核糖環結構例如藉由經以下置換來修飾之彼等修飾：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳之間具有雙基團(biradical)橋；或未連接核糖環，其通常缺少C2與C3碳之間的鍵(例如UNA)。其他經糖修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO 2011/017521)或三環核酸(WO 2013/154798)。經修飾之核苷亦包括糖部分經非糖部分置換之核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。
糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基更改成除氫以外之基團，或DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而得到的修飾。可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入取代基。
經 2' 糖修飾之核苷 . 經2'糖修飾之核苷為具有除2'位置處之H或-OH以外的取代基(2'取代之核苷)或包含能夠在核糖環中之2'碳與第二碳之間形成橋鍵的2'連接雙基團的核苷，諸如LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。
實際上，大量焦點已聚集在形成2'取代之核苷上，且已發現許多2'取代之核苷在併入至寡核苷酸中時具有有益特性。舉例而言，2'修飾之糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶耐性。2'取代之經修飾核苷之實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。其他實例可見於例如Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937中。以下為一些2'取代之經修飾核苷之說明。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
關於本發明，2'取代者並不包括如LNA之2'橋接分子。
鎖定核酸核苷 (LNA 核苷 ) 「LNA核苷」為2'修飾之核苷，其包含連接該核苷之核糖環之C2'及C4'的雙基團(亦稱作「2'-4'橋鍵」)，其限定或鎖定核糖環之構形。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。當LNA併入至互補RNA或DNA分子之寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與增強之雜交親和力(雙螺旋體穩定)相關聯。此可常規地藉由量測寡核苷酸/補體雙螺旋體之熔融溫度來測定。
非限制性的例示性LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁及Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238中。
2'-4'橋鍵包含2至4個橋接原子且特定言之具有式-X-Y-，X連接至C4'且Y連接至C2'， 其中 X為氧、硫、-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(=CRa Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -；-O-NRa -、-NRa -O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； Y為氧、硫、-(CRa Rb )n -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； 其限制條件為-X-Y-不為-O-O-、Si(Ra )2 -Si(Ra )2 -、-SO2 -SO2 -、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=N-C(Ra )=N-、-C(Ra )=N-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=N-或-Se-Se-； J為氧、硫、=CH2 或=N(Ra )； Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、胺甲醯胺基、烷醯基氧基、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基硫烷基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、-OC(=Xa )Rc 、-OC(=Xa )NRc Rd 及-NRe C(=Xa )NRc Rd ； 或兩個成對之Ra 及Rb 一起形成視情況經取代之亞甲基； 或兩個成對之Ra 及Rb 與其所連接之碳原子一起形成具有僅-X-Y-之一個碳原子的環烷基或鹵環烷基； 其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基及經取代之亞甲基為經1至3個取代基取代的烷基、烯基、炔基及亞甲基，該等取代基獨立地選自：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基及雜芳基； Xa 為氧、硫或-NRc ； Rc 、Rd 及Re 獨立地選自氫及烷基；且 n為1、2或3。
在本發明之另一特定實施例中，X為氧、硫、-NRa -、-CRa Rb -或-C(=CRa Rb )-，特定言之氧、硫、-NH-、-CH2 -或-C(=CH2 )-，更特定言之氧。
在本發明之另一特定實施例中，Y為-CRa Rb -、-CRa Rb -CRa Rb -或-CRa Rb- CRa Rb- CRa Rb -，特定言之-CH2 -CHCH3 -、-CHCH3 -CH2 -、-CH2 -CH2 -或-CH2 -CH2 -CH2 -。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-(CRa Rb )n -、-S-CRa Rb -、-N(Ra )CRa Rb -、-CRa Rb -CRa Rb -、-O-CRa Rb -O-CRa Rb -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(=CRa Rb )-CRa Rb -、-N(Ra )CRa Rb -、-O-N(Ra )-CRa Rb -或-N(Ra )-O-CRa Rb -。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、羥基、烷基及烷氧基烷基，特定言之氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基。
在本發明之另一實施例中，Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、氟、羥基、甲基及-CH2 -O-CH3 ，特定言之氫、氟、甲基及-CH2 -O-CH3 。
有利地，-X-Y-之Ra 及Rb 中之一者如上文所定義且其他者全部同時為氫。
在本發明之另一特定實施例中，Ra 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。
在本發明之另一特定實施例中，Rb 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。
在本發明之一個特定實施例中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 皆同時為甲基。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -、-S-CH2 -、-S-CH(CH3 )-、-NH-CH2 -、-O-CH2 CH2 -、-O-CH(CH2 -O-CH3 )-、-O-CH(CH2 CH3 )-、-O-CH(CH3 )-、-O-CH2- O-CH2 -、-O-CH2 -O-CH2 -、-CH2 -O-CH2 -、-C(=CH2 )CH2 -、-C(=CH2 )CH(CH3 )-、-N(OCH3 )CH2 -或-N(CH3 )CH2 -。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基及烷氧基烷基，特定言之氫、甲基及-CH2 -O-CH3 。
在一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -或-O-CH(CH3 )-，特定言之-O-CH2 -。
2'-4'橋鍵可如式(A)及式(B)中分別說明，定位於核糖環之平面下方(β-D-組態)或該環之平面上方(α-L-組態)。
根據本發明之LNA核苷特定言之具有式(B1)或(B2)
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； 其中 W為氧、硫、-N(Ra )-或-CRa Rb -，特定言之氧； B為核鹼基或經修飾之核鹼基； Z為與相鄰核苷之核苷間鍵或5'端基； Z*為與相鄰核苷之核苷間鍵或3'端基； R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自氫、鹵素、烷基、鹵烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烷氧基烷基、疊氮基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基及芳基；且 X、Y、Ra 及Rb 如上文所定義。
在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在另一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Rb 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在另一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 皆同時為甲基。
在另一特定實施例中，在X之定義中，Ra 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在另一特定實施例中，在X之定義中，Rb 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 皆同時為甲基。
在另一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在另一特定實施例中，在Y之定義中，Rb 為氫或烷基，特定言之氫或甲基。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 皆同時為甲基。
在本發明之一特定實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自氫及烷基，特定言之氫及甲基。
在本發明之另一特定有利實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。
在本發明之另一特定實施例中，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者如上文所定義，特定言之為烷基，更特定言之為甲基。
在本發明之一特定實施例中，R5 及R5* 獨立地選自氫、鹵素、烷基、烷氧基烷基及疊氮基，特定言之選自氫、氟、甲基、甲氧基乙基及疊氮基。在本發明之特定有利實施例中，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者為烷基(特定言之甲基)、鹵素(特定言之氟)、烷氧基烷基(特定言之甲氧基乙基)或疊氮基；或R5 及R5* 皆同時為氫或鹵素，特定言之皆同時為氫或氟。在此類特定實施例中，W可有利地為氧，且-X-Y-有利地為-O-CH2 -。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352及WO 2004/046160中，其全部以引用之方式併入本文中，且包括此項技術中通常已知為β-D-氧基LNA及α-L-氧基LNA核苷之該等LNA核苷。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-S-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類硫基LNA核苷揭示於WO 99/014226及WO 2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-NH-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類胺基LNA核苷揭示於WO 99/014226及WO 2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 CH2 -或-OCH2 CH2 CH2 -，W為氧，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷揭示於WO 00/047599及Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括此項技術中通常已知為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)之該等LNA核苷。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -，W為氧，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者不為氫，諸如為烷基(例如甲基)。此類5'取代之LNA核苷揭示於WO 2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 中之一者或兩者不為氫，特定言之為烷基(諸如甲基)，W為氧，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者不為氫，特定言之為烷基(例如甲基)。此類經雙修飾之LNA核苷揭示於WO 2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CHRa -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'取代之LNA核苷揭示於WO 2010/036698及WO 2007/090071中，其皆以引用之方式併入本文中。在此類6'取代之LNA核苷中，Ra 特定言之為C1 -C6 烷基，諸如甲基。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 -O-CH3 )- (「2'O-甲氧基乙基雙環核酸」，Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 CH3 )-。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 -O-CH3 )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦已知為環狀MOE (cMOE)且揭示於WO 2007/090071中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH3 )- (「2'O-乙基雙環核酸」，Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -O-CH2 - (Seth等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH3 )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'-甲基LNA核苷在此項技術中亦已知為cET核苷，且可為(S)-cET或(R)-cET非對映異構體，如WO 2007/090071 (β-D)及WO 2010/036698 (α-L)中所揭示，其皆以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 或Rb 兩者中無一者為氫，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在一特定實施例中，Ra 及Rb 皆同時為烷基，特定言之皆同時為甲基。此類6'二取代之LNA核苷揭示於WO 2009/006478中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-S-CHRa -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'取代之硫基LNA核苷揭示於WO 2011/156202中，其以引用之方式併入本文中。在此類6'取代之硫基LNA之一特定實施例中，Ra 為烷基，特定言之甲基。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-C(=CH2 )C(Ra Rb )-、-C(=CHF)C(Ra Rb )-或-C(=CF2 )C(Ra Rb )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特定言之氫、甲基、氟及甲氧基甲基。特定言之，Ra 及Rb 均同時為氫或甲基，或Ra 及Rb 中之一者為氫且另一者為甲基。此類乙烯基碳LNA核苷揭示於WO 2008/154401及WO 2009/067647中，其皆以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-N(ORa )-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在一特定實施例中，Ra 為烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦已知為N取代之LNA，且揭示於WO 2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-N(Ra )-、-N(Ra )-O-、-NRa -CRa Rb -CRa Rb -或-NRa -CRa Rb -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特定言之氫、甲基、氟及甲氧基甲基。在一特定實施例中，Ra 為烷基(諸如甲基)，Rb 為氫或甲基，特定言之氫(Seth等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-N(CH3 )- (Seth等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之一特定實施例中，R5 及R5* 皆同時為氫。在本發明之另一特定實施例中，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者為烷基，諸如甲基。在此類實施例中，R1 、R2 及R3 可特定言之為氫，且-X-Y-可特定言之為-O-CH2 -或-O-CHC(Ra )3 -，諸如-O-CH(CH3 )-。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-CRa Rb -O-CRa Rb - (諸如-CH2 -O-CH2 -)，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在此類特定實施例中，Ra 可特定言之為烷基(諸如甲基)，Rb 為氫或甲基，特定言之氫。此類LNA核苷亦已知為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO 2013/036868中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -O-CRa Rb - (諸如-O-CH2 -O-CH2 -)，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特定言之氫、甲基、氟及甲氧基甲基。在此特定實施例中，Ra 可特定言之為烷基(諸如甲基)，Rb 為氫或甲基，特定言之氫。此類LNA核苷亦已知為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。
應認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。
本發明之LNA核苷之特定實例呈現於流程1 (其中B如上文所定義)中。流程 1
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特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基-LNA，諸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA ((S)-cET)及ENA。
RNase H 活性及募集 反義寡核苷酸之RNase H活性係指其在與互補RNA分子成雙螺旋體時募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定RNaseH活性之活體外方法，其可用於測定募集RNaseH之能力。通常認為寡核苷酸能夠募集RNase H，當提供有互補目標核酸序列時其具有如下初始速率，如以pmol/l/min為單位所量測，該初始速率為當使用與正測試的經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有在寡核苷酸中之所有單體之間具有硫代磷酸酯鍵的DNA單體之寡核苷酸，且使用WO01/23613 (在此以引用之方式併入)之實例91至95所提供之方法時所測定的初始速率之至少5%，諸如至少10%或大於20%。為測定RHase H活性，重組人類RNase H1可購自Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerland。
間隙子 本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為間隙子。反義間隙子通常用於經由RNase H介導之降解來抑制目標核酸。間隙子寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側接、間隙及3'-側接，呈「5 -＞ 3」定向之F-G-F'。「間隙」區(G)包含使得寡核苷酸能夠募集RNase H之一段連續DNA核苷酸。間隙區藉由包含一或多個經糖修飾之核苷(有利地高親和力之經糖修飾核苷)之5'側接區(F)且藉由包含一或多個經糖修飾之核苷(有利地高親和力之經糖修飾核苷)之3'側接區(F')來側接。區域F及F'中之一或多個經糖修飾之核苷增強寡核苷酸對目標核酸之親和力(亦即，其為增強親和力的經糖修飾核苷)。在一些實施例中，區域F及F'中之一或多個經糖修飾之核苷為經2'糖修飾之核苷，諸如高親和力2'糖修飾，諸如獨立地選自LNA及2'-MOE。
在間隙子設計中，間隙區之5'及3'最末核苷為DNA核苷，且分別鄰近於5' (F)或3' (F')區域之經糖修飾之核苷定位。側接可藉由使至少一個經糖修飾之核苷處於距間隙區最遠的末端處，亦即處於5'側接之5'端及3'側接之3'端處來進一步界定。
區域F-G-F'形成連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含具有式F-G-F'之間隙子區域。
間隙子設計F-G-F'之總體長度可為例如12至32個核苷，諸如13至24個、諸如14至22個核苷、諸如14至17個、諸如16至18個核苷。
藉助於實例，本發明之間隙子寡核苷酸可由下式表示： F1-8 -G5-16 -F'1-8 ，諸如 F1-8 -G7-16 -F'2-8 其限制條件為間隙子區域F-G-F'之總體長度為至少12個、諸如至少14個核苷酸長度。
區域F、G及F'在下文進一步加以定義，且可併入至F-G-F'式中。
間隙子 - 區域 G 間隙子之區域G (間隙區)為使得寡核苷酸能夠募集RNaseH (諸如人類RNase H1)之核苷區域，通常為DNA核苷。RNaseH為識別DNA與RNA之間的雙螺旋體且酶促裂解RNA分子之細胞酶。合適之間隙子可具有長度為至少5或6個連續DNA核苷、諸如5至16個連續DNA核苷、諸如6至15個連續DNA核苷、諸如7至14個連續DNA核苷、諸如8至12個連續DNA核苷酸、諸如8至12個連續DNA核苷酸的間隙區(G)。在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續DNA核苷組成。在一些情況下，間隙區中之胞嘧啶(C) DNA經甲基化，此類殘基標註為5-甲基-胞嘧啶(me C或用e代替c)。若間隙中存在cg二核苷酸以降低潛在毒性時，則間隙中之胞嘧啶DNA之甲基化為有利的，修飾不會對寡核苷酸之功效具有顯著影響。
在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續硫代磷酸酯連接之DNA核苷組成。在一些實施例中，間隙中之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵。
儘管傳統間隙子具有DNA間隙區，但存在當其用於間隙區內時允許RNaseH募集之經修飾核苷之許多實例。已報導在包括於間隙區內時能夠募集RNaseH的經修飾核苷包括例如α-L-LNA、C4'烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300中所描述，兩者均以引用之方式併入本文中)、如ANA及2'F-ANA之阿拉伯糖衍生之核苷(Mangos等人 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (未鎖定核酸) (如Fluiter等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所描述，其以引用之方式併入本文中)。UNA為未鎖定核酸，通常其中核糖之C2與C3之間的鍵經移除，從而形成未鎖定之「糖」殘基。此類間隙子中所使用之經修飾核苷在引入至間隙區中時可為採用2'內型(DNA樣)結構(亦即，允許RNaseH募集之修飾)之核苷。在一些實施例中，本文中所描述之DNA間隙區(G)可視情況含有1至3個在引入至間隙區中時採用2'內型(DNA樣)結構之經糖修飾之核苷。
區域 G- 「間隙阻斷子」 可替代地，存在許多報導將賦予3'內型構形之經修飾核苷插入至間隙子之間隙區中但保留一定RNaseH活性。具有包含一或多個3'內型經修飾核苷的間隙區之此類間隙子被稱作「間隙阻斷子」或「間隙中斷」間隙子，參見例如WO2013/022984。間隙阻斷子寡核苷酸在間隙區內保留足夠的DNA核苷區域以允許RNaseH募集。間隙阻斷子寡核苷酸設計募集RNaseH之能力通常具有序列或甚至化合物特異性，參見Rukov等人 2015 Nucl. Acids Res. 第43卷第8476-8487頁，其揭示募集RNaseH之「間隙阻斷子」寡核苷酸，該等寡核苷酸在一些情況下提供目標RNA之更特異性裂解。間隙阻斷子寡核苷酸之間隙區內所使用之經修飾核苷可例如為賦予3'內型構形之經修飾核苷，諸如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE (MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷之核糖環之C2'與C4'之間的橋鍵呈β構形)，諸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
如同上文所描述之含有區域G之間隙子一樣，間隙阻斷子或間隙中斷間隙子之間隙區在間隙之5'端(鄰近於區域F之3'核苷)處具有DNA核苷，且在間隙之3'端(鄰近於區域F'之5'核苷)處具有DNA核苷。包含中斷間隙之間隙子通常在間隙區之5'端或3'端處保留至少3或4個連續DNA核苷之區域。
間隙阻斷子寡核苷酸之例示性設計包括 F1-8 -[D3-4 -E1 - D3-4 ]- F'1-8 F1-8 - [D1-4 -E1 - D3-4 ]-F'1-8 F1-8 - [D3-4 -E1 - D1-4 ]-F'1-8 其中區域G在方括號[Dn -Er -Dm ]內，D為DNA核苷之連續序列，E為經修飾核苷(間隙阻斷子或間隙中斷核苷)，且F及F'為如本文中所定義之側接區，且其限制條件為間隙子區域F-G-F'之總體長度為至少12個、諸如至少14個核苷酸長度。
在一些實施例中，間隙中斷間隙子之區域G包含至少6個DNA核苷，諸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個DNA核苷。如上文所描述，DNA核苷可為連續的，或可視情況穿插有一或多個經修飾核苷，其限制條件為間隙區G能夠介導RNaseH募集。
間隙子 - 側接區 F 及 F' 區域F緊鄰區域G之5' DNA核苷定位。區域F之3'最末核苷為經糖修飾之核苷，諸如高親和力之經糖修飾核苷，例如2'取代之核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區域F'緊鄰區域G之3' DNA核苷定位。區域F'之5'最末核苷為經糖修飾之核苷，諸如高親和力之經糖修飾核苷，例如2'取代之核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區域F為1至8個連續核苷酸長度，諸如2至6個、諸如3至4個連續核苷酸長度。有利地，區域F之5'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區域F之5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為2'取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區域F之5'最末核苷為2'取代之核苷，諸如MOE核苷。
區域F'為2至8個連續核苷酸長度，諸如3至6個、諸如4至5個連續核苷酸長度。有利地，在一些實施例中，區域F'之3'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為經糖修飾之核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F'之3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為2'取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區域F'之3'最末核苷為2'取代之核苷，諸如MOE核苷。
應注意，當區域F或F'之長度為一時，其有利地為LNA核苷。
在一些實施例中，區域F及F'獨立地由以下組成或包含以下：經糖修飾之核苷之連續序列。在一些實施例中，區域F之經糖修飾之核苷可獨立地選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元。
在一些實施例中，區域F及F'獨立地包含LNA及2'取代之經修飾核苷兩者(混合翼設計)。
在一些實施例中，區域F及F'僅由一種類型之經糖修飾之核苷組成，諸如僅由MOE或僅由β-D-氧基LNA或僅由ScET組成。此類設計亦稱為均一側接或均一間隙子設計。
在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'中之所有核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，區域F由1至5個，諸如2至4個、諸如3至4個、諸如1、2、3、4或5個連續LNA核苷組成。在一些實施例中，區域F及F'中之所有核苷為β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'中之所有核苷為2'取代之核苷，諸如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，區域F由1、2、3、4、5、6、7或8個連續OMe或MOE核苷組成。在一些實施例中，側接區中僅一者可由2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成。在一些實施例中，5' (F')側接區由2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而3' (F)側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，3' (F)側接區由2'取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而5' (F')側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些實施例中，區域F及F'中之所有經修飾核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中區域F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接，更多細節參見此等者之定義)。在一些實施例中，區域F及F'中之所有經修飾核苷為β-D-氧基LNA核苷，其中區域F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接，更多細節參見此等者之定義)。
在一些實施例中，區域F及F'之5'最末及3'最末核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些實施例中，區域F與區域G之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，區域F'與區域G之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'之核苷之間的核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
其他間隙子設計揭示於WO 2004/046160、WO 2007/146511及WO 2008/113832中，該等文獻以引用之方式併入本文中。
LNA 間隙子 LNA間隙子為其中區域F及F'中之一者或兩者包含LNA核苷或由其組成之間隙子。β-D-氧基間隙子為其中區域F及F'中之一者或兩者包含β-D-氧基LNA核苷或由其組成之間隙子。
在一些實施例中，LNA間隙子具有下式：[LNA]1-5 -[區域G]-[LNA]1-5 ，其中區域G如間隙子區域G定義中所定義。
MOE 間隙子 MOE間隙子為其中區域F及F'由MOE核苷組成之間隙子。在一些實施例中，MOE間隙子具有設計[MOE]1-8 -[區域G]-[MOE]1-8 ，諸如[MOE]2-7 -[區域G]5-16 -[MOE]2-7 、諸如[MOE]3-6 -[區域G]-[MOE]3-6 ，其中區域G如間隙子定義中所定義。具有5-10-5設計之MOE間隙子(MOE-DNA-MOE)已廣泛用於此項技術中。
混合翼間隙子 混合翼間隙子為如下LNA間隙子，其中區域F及F'中之一者或兩者包含2'取代之核苷，諸如獨立地選自由2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元組成之群的2'取代之核苷，諸如MOE核苷。在區域F及F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷的一些實施例中，區域F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在區域F及F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含至少兩個LNA核苷的一些實施例中，區域F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在一些混合翼實施例中，區域F及F'中之一者或兩者可進一步包含一或多個DNA核苷。
混合翼間隙子設計揭示於WO 2008/049085及WO 2012/109395中，該兩者以引用之方式併入本文中。
交替型側接間隙子 側接區可包含LNA及DNA核苷兩者且被稱作「交替型側接」，因為其包含LNA-DNA-LNA核苷之交替型基元。包含此類交替型側接之間隙子被稱作「交替型側接間隙子」。「可替代側接間隙子」由此為如下LNA間隙子寡核苷酸，其中側接中之至少一者(F或F')包含除LNA核苷以外的DNA。在一些實施例中，區域F或F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含LNA核苷及DNA核苷兩者。在此類實施例中，側接區F或F'或者F及F'兩者包含至少三個核苷，其中F及/或F'區之5'及3'最末核苷為LNA核苷。
交替型側接LNA間隙子揭示於WO 2016/127002中。
交替側接區可包含至多3個連續DNA核苷，諸如1至2個或者1或2或3個連續DNA核苷。
交替型側接可標註為表示LNA核苷(L)之數目接著表示DNA核苷(D)之數目的一系列整數，例如 [L]1-3 -[D]1-4 -[L]1-3 [L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 。
在寡核苷酸設計中，此等者將通常表示為如下數目，使得2-2-1表示5' [L]2 -[D]2 -[L] 3'，且1-1-1-1-1表示5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'。具有交替型側接的寡核苷酸中之側接(區域F及F')之長度可獨立地為3至10個核苷，諸如4至8個、諸如5至6個核苷，諸如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，間隙子寡核苷酸中之側接區中僅一者為交替的，而另一者由LNA核苷酸構成。可為有利的係，在3'側接(F')之3'端處具有至少兩個LNA核苷以賦予額外核酸外切酶耐性。具有交替型側接之寡核苷酸之一些實例為： [L]1-5 -[D]1-4 -[L]1-3 -[G]5-16 -[L]2-6 [L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[G]5-16 -[L]1-2 -[D]1-3 -[L]2-4 [L]1-5 -[G]5-16 -[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2 其限制條件為間隙子之總體長度為至少12個、諸如至少14個核苷酸長度。
寡核苷酸中之區域 D' 或 D" 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含以下或由以下組成：與目標核酸互補的寡核苷酸之連續核苷酸序列，諸如間隙子F-G-F'，及其他5'及/或3'核苷。其他5'及/或3'核苷可或可不與目標核酸完全互補。此類其他5'及/或3'核苷在本文中可被稱作區域D'及D"。
可出於將連續核苷酸序列(諸如間隙子)連接至結合部分或另一官能基之目的而添加區域D'或D"。當用於連接連續核苷酸序列與結合部分時，其可充當生物可裂解連接子。可替代地，其可用於提供核酸外切酶保護或提供合成或製造簡易性。
區域D'及D''可分別連接至區域F之5'端或區域F'之3'端，以產生下式之設計：D'-F-G-F'、F-G-F'-D''或D'-F-G-F'-D''。在此情況下，F-G-F'為寡核苷酸之間隙子部分，且區域D'或D"構成寡核苷酸之獨立部分。
區域D'或D''可獨立地包含以下或由以下組成：1、2、3、4或5個額外核苷酸，該等核苷酸可與目標核酸互補或不互補。鄰近於F或F'區之核苷酸不為經糖修飾之核苷酸，諸如DNA或RNA或此等之經鹼基修飾之型式。D'或D'區可充當對核酸酶敏感之生物可裂解連接子(參見連接子之定義)。在一些實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵連接，且為DNA或RNA。適用作區域D'或D''之基於核苷酸之生物可裂解連接子揭示於WO 2014/076195中，藉助於實例，該等連接子包括磷酸二酯連接之DNA二核苷酸。生物可裂解連接子於聚寡核苷酸構築體中之用途揭示於WO 2015/113922中，其中其用於連接單一寡核苷酸內之多個反義構築體(例如，間隙子區域)。
在一個實施例中，除構成間隙子之連續核苷酸序列以外，本發明之寡核苷酸亦包含區域D'及/或D"。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'，特定言之F1-8 -G5-16 -F'2-8 D'-F-G-F'，特定言之D'1-3 -F1-8 -G5-16 -F'2-8 F-G-F'-D"，特定言之F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3 D'-F-G-F'-D"，特定言之D'1-3 - F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3 。
在一些實施例中，定位於區域D'與區域F之間的核苷間鍵為磷酸二酯鍵。在一些實施例中，定位於區域F'與區域D"之間的核苷間鍵為磷酸二酯鍵。
總子 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之全部核苷為經糖修飾之核苷。此類寡核苷酸在本文中被稱作總子。
在一些實施例中，總子之全部經糖修飾之核苷包含相同糖修飾，例如其可全部為LNA核苷，或可全部為2'O-MOE核苷。在一些實施例中，總子之經糖修飾之核苷可獨立地選自LNA核苷及2'取代之核苷，諸如選自由以下組成之群的2'取代之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'取代之核苷兩者，諸如選自由以下組成之群的2'取代之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸之各核苷單元為2'取代之核苷。在一些實施例中，寡核苷酸之各核苷單元為2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之全部核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基-LNA核苷及/或(S)cET核苷。在一些實施例中，此類LNA總子寡核苷酸之長度在7-12個核苷之間(參見例如WO 2009/043353)。此類較短完全LNA寡核苷酸在抑制微RNA方面特別有效。
各種總子化合物尤其在靶向微RNA (antimiR)時作為治療性寡聚物或作為剪接切換寡聚物(splice switching oligomer；SSO)高度有效。
在一些實施例中，總子包含以下或由以下組成：至少一個XYX或YXY序列基元(諸如重複序列XYX或YXY)，其中X為LNA且Y為可替代(亦即，非LNA)核苷酸類似物，諸如2'-OMe RNA單元及2'-氟DNA單元。在一些實施例中，上述序列基元可為例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些實施例中，總子可包含以下或由以下組成：具有介於7與24個核苷酸之間，諸如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸之連續核苷酸序列。
在一些實施例中，總子之連續核苷酸序列包含至少30%，諸如至少40%、諸如至少50%、諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%、諸如至少90%、諸如95%、諸如100% LNA單元。對於完整LNA化合物，有利的係其長度小於12個核苷酸，諸如7-10個。
其餘單元可選自本文中所提及之非LNA核苷酸類似物，諸如選自由以下組成之群的彼等：2'-O-烷基-RNA單元、2'-OMe-RNA單元、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、INA單元及2'MOE RNA單元或基團2'-OMe RNA單元以及2'-氟DNA單元。
混合子 術語「混合子」係指包含DNA核苷及經糖修飾之核苷兩者之寡聚物，其中存在不足長度之連續DNA核苷以募集RNaseH。合適混合子可包含至多3個或至多4個連續DNA核苷。在一些實施例中，混合子包含經糖修飾之核苷及DNA核苷之交替區。藉由在併入至具有DNA核苷之較短區域的寡核苷酸中時形成RNA類(3'內型)構形的經糖修飾之核苷之交替區，可產生非RNaseH募集之寡核苷酸。有利地，經糖修飾之核苷為親和力增強的經糖修飾之核苷。
寡核苷酸混合子通常用於提供目標基因之基於佔據之調節，諸如剪接調節劑或微RNA抑制劑。
在一些實施例中，混合子或其連續核苷酸序列中之經糖修飾之核苷包含或全部為LNA核苷，諸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，混合子之全部經糖修飾之核苷包含相同糖修飾，例如其可全部為LNA核苷或可全部為2'O-MOE核苷。在一些實施例中，混合子之經糖修飾之核苷可獨立地選自LNA核苷及2'取代之核苷，諸如選自由以下組成之群的2'取代之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'取代之核苷兩者，諸如選自由以下組成之群的2'取代之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子或其連續核苷酸序列僅包含LNA及DNA核苷，諸如長度可例如在8與24個核苷之間的LNA混合子寡核苷酸(參見例如WO2007112754，其揭示微RNA之LNA antmiR抑制劑)。
各種混合子化合物尤其在靶向微RNA (antimiR)時作為治療性寡聚物或作為剪接切換寡聚物(SSO)高度有效。
在一些實施例中，混合子包含基元 …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或 …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m …或 …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m …或 …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m … 其中L表示經糖修飾之核苷，諸如LNA或2'取代之核苷(例如，2'-O-MOE)，D表示DNA核苷，且其中各m獨立地選自1至6，且各n獨立地選自1、2、3及4，諸如1至3。在一些實施例中，各L為LNA核苷。在一些實施例中，至少一個L為LNA核苷且至少一個L為2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，各L獨立地選自LNA及2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子可包含以下或由以下組成：具有介於10與24個核苷酸之間，諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸之連續核苷酸序列。
在一些實施例中，混合子之連續核苷酸序列包含至少30%，諸如至少40%、諸如至少50% LNA單元。
在一些實施例中，混合子包含以下或由以下組成：核苷酸類似物及天然產生之核苷酸，或一種類型之核苷酸類似物及第二類型之核苷酸類似物的重複模式之連續核苷酸序列。舉例而言，重複模式可為：每兩個或每三個核苷酸為核苷酸類似物(諸如LNA)，且其餘核苷酸為天然產生之核苷酸(諸如DNA)，或為2'取代之核苷酸類似物，諸如如本文中所提及之2'氟類似物的2'MOE，或在一些實施例中，選自本文中所提及之核苷酸類似物之群組。應認識到，核苷酸類似物(諸如LNA單元)之重複模式可在固定位置處(例如在5'或3'末端處)與核苷酸類似物組合。
在一些實施例中，寡聚物中自3'端計數之第一個核苷酸為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在可能相同或不同之一些實施例中，寡聚物中自3'端計數之第二個核苷酸為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在可能相同或不同之一些實施例中，寡聚物之5'末端為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子包含至少一個區域，該區域包含至少兩個連續核苷酸類似物單元，諸如至少兩個連續LNA單元。
在一些實施例中，混合子包含至少一個區域，該區域包含至少三個連續核苷酸類似物單元，諸如至少三個連續LNA單元。
結合物 如本文中所使用之術語結合物係指共價連接至非核苷酸部分(結合部分或區域C或第三區)之寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸與一或多個非核苷酸部分之結合可例如藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞吸收或穩定性而改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，結合部分藉由改良寡核苷酸之細胞分佈、生物利用率、代謝、分泌、滲透性及/或細胞吸收而修改或增強寡核苷酸之藥物動力學特性。特定言之，結合物可使寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型，且藉此增強寡核苷酸在彼器官、組織或細胞類型中之有效性。同時，結合物可用以降低寡核苷酸在非目標細胞類型、組織或器官中之活性，例如在非目標細胞類型、組織或器官中之偏離目標活性或活性。
WO 93/07883及WO 2013/033230提供合適的結合部分，該等文獻以引用之方式併入本文中。其他合適的結合部分為能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(asialoglycoprotein receptor；ASGPR)之彼等結合部分。特定言之，三價之N-乙醯基半乳胺糖結合部分適合於結合至ASGPR，參見例如WO 2014/076196、WO 2014/207232及WO 2014/179620 (在此以引用之方式併入)。此類結合物用於增強肝對寡核苷酸之吸收，同時降低其在腎臟中之存在度，藉此與相同寡核苷酸之非結合型式相比，增加經結合寡核苷酸之肝臟/腎臟比率。
寡核苷酸結合物及其合成亦已報導於Manoharan在Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001中及Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103之全面綜述中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一實施例中，非核苷酸部分(結合部分)選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如，細菌毒素)、維生素、病毒蛋白(例如，衣殼蛋白(capsid))或其組合。
連接子 鍵或連接子為兩個原子之間的連接，其經由一或多個共價鍵將所關注之一個化學基團或片段連接至所關注之另一化學基團或片段。結合部分可直接或藉由鍵聯部分(例如連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用來將第三區(例如結合部分(區域C))共價連接至第一區(例如與目標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區域A))。
在本發明之一些實施例中，本發明之結合物或寡核苷酸結合物可視情況包含連接子區域(第二區域或區域B及/或區域Y)，其定位於與目標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區域A或第一區域)與結合部分(區域C或第三區域)之間。
區域B係指包含生理學上不穩定鍵或由其組成之生物可裂解連接子，該鍵通常在哺乳動物身體內遇到之條件下或類似於在哺乳動物身體內遇到之彼等條件下為可裂解的。生理學上不穩定連接子進行化學轉化(例如裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中發現的鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中遇到的鹽濃度。哺乳動物胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之存在。在一個實施例中，生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感之連接子包含1與10個核苷之間，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳地2與6個核苷之間且最佳地2與4個連接核苷之間，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵。較佳地，核苷為DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195 (在此以引用之方式併入)中。
區域Y係指未必為生物可裂解的但主要用來將結合部分(區域C或第三區域)共價連接至寡核苷酸(區域A或第一區域)之連接子。區域Y連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。本發明之寡核苷酸結合物可由以下區域要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接子(區域Y)為胺基烷基，諸如C2-C36胺基烷基，包括例如C6至C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接子(區域Y)為C6胺基烷基。
因此，本發明尤其係關於： 一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為經糖修飾之核苷且另一者為DNA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )皆同時為經糖修飾之核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中經糖修飾之核苷獨立地為經2'糖修飾之核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中經2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基-RNA；2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA；2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA或2'-氟-ANA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中經2'糖修飾之核苷為2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中經2'糖修飾之核苷為LNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA，特定言之β-D-氧基LNA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其包含選自以下之其他核苷間鍵：磷酸二酯核苷間鍵、硫代磷酸酯核苷間鍵及如式(I)中所定義之核苷間鍵； 一種根據本發明之寡核苷酸，其包含選自以下之其他核苷間鍵：硫代磷酸酯核苷間鍵及如式(I)中所定義之核苷間鍵； 一種根據本發明之寡核苷酸，其包含介於1與15個之間、特定言之1與5個之間、更特定言之1、2、3、4或5個如式(I)中所定義的式(I)之二核苷。 一種根據本發明之寡核苷酸，其中其他核苷間鍵全部為式-P(=S)(OR)O2 -之硫代磷酸酯核苷間鍵，其中R為氫或磷酸酯保護基； 一種根據本發明之寡核苷酸，其包含選自DNA核苷、RNA核苷及經糖修飾之核苷之其他核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中一或多個核苷為經核鹼基修飾之核苷，諸如包含5-甲基胞嘧啶核鹼基之核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中至少一個式(I)之二核苷處於反義間隙子寡核苷酸之側接區中或位於反義間隙子寡核苷酸之間隙區與側接區之間，亦即(A1 )及(A2 )皆同時為經糖修飾之核苷或(A1 )及(A2 )中之一者為DNA核苷或RNA核苷且另一者為經糖修飾之核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸為LNA間隙子、混合翼間隙子或2'取代之間隙子，特定言之2'-O-甲氧基乙基間隙子； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中A為硫； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中反義間隙子寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'之連續核苷酸序列，其中G為能夠募集RNaseH之5至18個核苷的區域，且該區域G分別藉由側接區F及F'來側接5'及3'，其中區域F及F'獨立地包含1至7個經2'糖修飾之核苷酸或由其組成，其中與區域G相鄰之區域F之核苷為經2'糖修飾之核苷且其中與區域G相鄰之區域F'的核苷為經2'糖修飾之核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中該至少一個式(I)之二核苷定位於區域F或F'中或區域G與區域F之間或區域G與區域F'之間。 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F或區域F'中或區域F及F'兩者中之經2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基-RNA；2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-ANA及LNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F或區域F'中或區域F及F'兩者中之所有經2'糖修飾之核苷為LNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F或區域F'中或區域F及F'兩者中之經2'糖修飾之核苷全部為2'-烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基-RNA；全部為2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA；全部為2'-胺基-DNA；全部為2'-氟-RNA；全部為2'-氟-ANA或全部為LNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F或區域F'或者區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個DNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F或區域F'或者區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA之經2'糖修飾之核苷，諸如至少一個2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中間隙區G包含5至16個、特定言之8至16個、更特定言之8、9、10、11、12、13或14個連續DNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F及區域F'獨立地為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷之長度； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中區域F及區域F'各自獨立地包含1、2、3或4個LNA核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列(F-G-F')具有10至30個核苷酸之長度，特定言之12至22個、更特定言之14至20個寡核苷酸之長度； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含式5'-D'-F-G-F'-D''-3'之連續核苷酸序列，其中F、G及F'如技術方案17至28中之任一項中所定義，且其中區域D'及D''各自獨立地由0至5個核苷酸，特定言之2、3或4個核苷酸，特定言之DNA核苷酸(諸如磷酸二酯連接之DNA核苷)組成； 一種根據技術方案17至29中之任一項之寡核苷酸，其中各側接區F及F'獨立地包含1、2、3、4、5、6或7個，特定言之一個式(I)之二核苷； 一種根據本發明之寡核苷酸，其總共包含一個式(I)之二核苷，且特定言之，一個式(I)之二核苷定位於區域F'中或區域G與區域F'之間； 一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸能夠募集人類RNaseH1； 一種根據本發明之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特定言之鈉鹽、鉀鹽或銨鹽； 一種結合物，其包含根據本發明之寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個結合部分，該至少一個結合部分視情況經由連接子部分共價連接至該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽； 一種醫藥組合物，其包含根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或結合物及治療上惰性載劑；且 一種根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或結合物，其用作治療上活性物質。
本發明尤其係關於一種式(I-a)化合物
Figure 02_image039
其中 R2 為烷氧基、烷氧基烷氧基或胺基；及 R4 為氫；或 R4 及R2 一起形成X-Y； X為氧、硫、-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(=CRa Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -；-O-NRa -、-NRa -O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； Y為氧、硫、-(CRa Rb )n -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； 其限制條件為-X-Y-不為-O-O-、Si(Ra )2 -Si(Ra )2 -、-SO2 -SO2 -、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=N-C(Ra )=N-、-C(Ra )=N-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=N-或-Se-Se-； J為氧、硫、=CH2 或=N(Ra )； Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、胺甲醯胺基、烷醯基氧基、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基硫烷基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、-OC(=Xa )Rc 、-OC(=Xa )NRc Rd 及-NRe C(=Xa )NRc Rd ； 或兩個成對之Ra 及Rb 一起形成視情況經取代之亞甲基； 或兩個成對之Ra 及Rb 與其所連接之碳原子一起形成具有僅-X-Y-之一個碳原子的環烷基或鹵環烷基； 其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基及經取代之亞甲基為經1至3個取代基取代的烷基、烯基、炔基及亞甲基，該等取代基獨立地選自：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基及雜芳基； Xa 為氧、硫或-NRc ； Rc 、Rd 及Re 獨立地選自氫及烷基； R5 為羥基保護基； Rx 為氰基烷基或烷基； Ry 為二烷基胺基或吡咯啶基； Nu為核鹼基或受保護之核鹼基；及 n為1、2或3。
根據本發明之寡核苷酸可例如根據以下流程來製備。流程 2
Figure 02_image041
在流程2中，B1及B2為核鹼基且A如上文所定義。
包含膦醯基乙酸酯或硫代膦醯基乙酸酯修飾之寡核苷酸可使用固相寡核苷酸化學反應來合成。將受DMT保護之去氧核苷3'-O -二異丙胺基膦基乙酸二甲基-β-氰基乙酯與連接至固體載體之去氧核苷縮合。接著，使用例如低氧化劑試劑(含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2)氧化或使用例如3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液硫化亞膦酸酯鍵。在用乙酸酐封端且用二氯乙酸處理以移除5'-O -二甲氧基三基之後，重複循環適當次數以獲得含有膦醯基乙酸酯修飾之寡核苷酸。
適用於製造根據本發明之寡核苷酸之單體建構嵌段可例如根據以下流程來製備。
二甲基氰基乙基溴乙酸酯藉由在回流下使溴乙醯溴與3-羥基-3-甲基丁腈在甲苯中縮合隔夜來合成。接著，經由與二異丙胺基氯化膦之瑞弗爾馬斯基反應(Reformatsky reaction)來製備亞磷酯衍生物。使用四唑使此反應物與受保護之2'-去氧核苷之進一步縮合產生LNA PACE亞磷醯胺。流程 3
Figure 02_image043
在流程3中，R5 、Rx 、Ry 及Nu如上文所定義。
特定言之，單體可在上述程序之後根據以下流程來製備。流程 4
Figure 02_image045
在流程4中，Nu如上文所定義。
因此，本發明亦係關於一種式(II)化合物
Figure 02_image047
其中 X為氧、硫、-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(=CRa Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -；-O-NRa -、-NRa -O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； Y為氧、硫、-(CRa Rb )n -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -； 其限制條件為-X-Y-不為-O-O-、Si(Ra )2 -Si(Ra )2 -、-SO2 -SO2 -、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=N-C(Ra )=N-、-C(Ra )=N-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=N-或-Se-Se-； J為氧、硫、=CH2 或=N(Ra )； Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、胺甲醯胺基、烷醯基氧基、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基硫烷基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、-OC(=Xa )Rc 、-OC(=Xa )NRc Rd 及-NRe C(=Xa )NRc Rd ； 或兩個成對之Ra 及Rb 一起形成視情況經取代之亞甲基； 或兩個成對之Ra 及Rb 與其所連接之碳原子一起形成具有僅-X-Y-之一個碳原子的環烷基或鹵環烷基； 其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基及經取代之亞甲基為經1至3個取代基取代的烷基、烯基、炔基及亞甲基，該等取代基獨立地選自：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基及雜芳基； Xa 為氧、硫或-NRc ； Rc 、Rd 及Re 獨立地選自氫及烷基； R5 為羥基保護基； Rx 為氰基烷基或烷基，特定言之氰基烷基； Ry 為二烷胺基或吡咯啶基；及 Nu為核鹼基或受保護之核鹼基；及 n為1、2或3； 或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明尤其進一步係關於： 一種根據本發明之化合物，其中-X-Y-為-CH2 -O-、-CH(CH3 )-O-或-CH2 CH2 -O-； 一種式(III)或(IV)之根據本發明之化合物
Figure 02_image049
； 其中R5 、Rx 、Ry 及Nu如上文所定義； 一種根據本發明之化合物，其中Rx 為2-氰基-1,1-二甲基-乙基、甲基、乙基、丙基或第三丁基； 一種根據本發明之化合物，其中Rx 為2-氰基-1,1-二甲基-乙基； 一種根據本發明之化合物，其中Ry 為二異丙胺基或吡咯啶基； 一種根據本發明之化合物，其中Ry 為二烷胺基； 一種根據技術方案1至6中任一項之化合物，其中Ry 為二異丙胺基； 一種式(V)之根據本發明之化合物
Figure 02_image051
其中R5 及Nu如上文所定義； 一種根據本發明之化合物，其中Nu為胸腺嘧啶、受保護之胸腺嘧啶、腺苷、受保護之腺苷、胞嘧啶、受保護之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保護之5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、受保護之鳥嘌呤、尿嘧啶基或受保護之尿嘧啶基； 一種根據本發明之化合物，其選自
Figure 02_image053
Figure 02_image055
； 一種用於製造根據本發明之式(II)化合物之方法，其包含使式(C)化合物
Figure 02_image057
與式P(Ry )2 (CH2 )COO(Rx )之化合物在偶合劑及鹼之存在下反應，其中X、Y、R5 、Nu、Rx 及Ry 如上文所定義； 一種根據本發明之方法，其中偶合劑為1H -四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苯甲硫基四唑或4,5-二氰基咪唑(DCI)，特定言之四唑；及 一種根據本發明之化合物之用途，其用於製造寡核苷酸。
本發明之方法可適宜地用鹼，例如用三乙胺、吡啶、二異丙胺或N,N-二異丙基乙胺淬滅。
根據本發明之包含2'-烷氧基-RNA (特定言之2'-甲氧基-RNA)、2'-烷氧基烷氧基-RNA (特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA)的寡核苷酸可根據以下程序來合成。流程 5
Figure 02_image059
在流程5中，B1及B2為核鹼基且A如上文所定義。
包含MOE(或其他2'取代基)膦醯基乙酸酯或硫代膦醯基乙酸酯修飾之寡核苷酸可使用固相寡核苷酸化學反應來合成。將受DMT保護之去氧核苷3'-O -二異丙胺基膦基乙酸二甲基-β-氰基乙酯與連接至固體載體之去氧核苷縮合。接著，使用例如低氧化劑試劑(含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2)氧化或使用例如3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液硫化亞膦酸酯鍵。在用乙酸酐封端且用二氯乙酸處理以移除5'-O -二甲氧基三基之後，重複循環適當次數以獲得含有膦醯基乙酸酯修飾之寡核苷酸。
適用於製造根據本發明之寡核苷酸之單體建構嵌段可例如根據以下流程來製備。
二甲基氰基乙基溴乙酸酯藉由在回流下使溴乙醯溴與3-羥基-3-甲基丁腈在甲苯中縮合隔夜來合成。接著，經由與二異丙胺基氯化膦之瑞弗爾馬斯基反應來製備亞磷酯衍生物。使用4,5-DCI使此反應物與受保護之2'-去氧核苷之進一步縮合產生MOE PACE亞磷醯胺。流程 6
Figure 02_image061
在流程6中，R5 、Rx 、Ry 及Nu如上文所定義。
特定言之，單體可在上述程序之後根據以下流程來製備。流程 7
Figure 02_image063
在流程7中，Nu如上文所定義。
因此，本發明亦係關於一種式(VI)化合物
Figure 02_image065
其中 R2 為烷氧基、烷氧基烷氧基或胺基，特定言之烷氧基或烷氧基烷氧基； R5 為羥基保護基； Rx 為氰基烷基或烷基，特定言之氰基烷基； Ry 為二烷胺基或吡咯啶基；及 Nu為核鹼基或受保護之核鹼基；及 或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明尤其進一步係關於： 一種根據本發明之化合物，其中R2 為甲氧基、甲氧基乙氧基或胺基，特定言之甲氧基或甲氧基乙氧基； 一種式(VII)之根據本發明之化合物
Figure 02_image067
； 其中R5 、Rx 、Ry 及Nu如上文所定義； 一種根據本發明之化合物，其中Rx 為2-氰基-1,1-二甲基-乙基、甲基、乙基、丙基或第三丁基； 一種根據本發明之化合物，其中Rx 為2-氰基-1,1-二甲基-乙基； 一種根據本發明之化合物，其中Ry 為二異丙胺基或吡咯啶基； 一種根據本發明之化合物，其中Ry 為二烷胺基； 一種根據技術方案1至6中任一項之化合物，其中Ry 為二異丙胺基； 一種式(VIII)之根據本發明之化合物
Figure 02_image069
其中R5 及Nu如上文所定義； 一種根據本發明之化合物，其中Nu為胸腺嘧啶、受保護之胸腺嘧啶、腺苷、受保護之腺苷、胞嘧啶、受保護之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保護之5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、受保護之鳥嘌呤、尿嘧啶基或受保護之尿嘧啶基； 一種根據本發明之化合物，其選自
Figure 02_image071
Figure 02_image073
Figure 02_image075
Figure 02_image077
； 一種用於製造根據本發明之式(VI)化合物之方法，其包含使式(D)化合物
Figure 02_image079
與式P(Ry )2 (CH2 )COO(Rx )之化合物在偶合劑及鹼之存在下反應，其中R2 、R5 、Nu、Rx 及Ry 如上文所定義； 一種根據本發明之方法，其中偶合劑為1H -四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苯甲硫基四唑或4,5-二氰基咪唑(DCI)，特定言之DCI；及 一種根據本發明之化合物之用途，其用於製造寡核苷酸。
本發明之方法可適宜地用鹼，例如用三乙胺、吡啶、二異丙胺或N,N-二異丙基乙胺淬滅。
現將藉由以下不具有限制特徵之實例來說明本發明。
實例 縮寫 ： A           腺嘌呤 G           鳥嘌呤m C         甲基胞嘧啶 T           胸腺嘧啶 LNA      鎖定核酸 RNA      核糖核酸 DMT      二甲氧基三苯甲基 DCA      二氯乙酸 DCM      二氯甲烷 THF       四氫呋喃 Anh.      無水 TLC       薄層層析法 NMR      核磁共振 CPG       受控微孔玻璃 RT         逆轉錄 qPCR          定量聚合酶鏈反應 ds          雙股 Tm        熱熔融
實例 1 ： 單體合成 1.1. 2- 溴乙酸 1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯
Figure 02_image081
在攪拌的同時向2-溴乙醯溴(14.7 g，6.31 mL，72.6 mmol，1.2當量)於甲苯(67.2 mL)中之溶液中緩慢添加3-羥基-3-甲基丁腈(6 g，6.28 ml，60.5 mmol，1當量)。圓底燒瓶裝配有弗里德利希冷凝器(Friedrich's condenser)及通向酸阱(含有NaOH水溶液)之乾燥管。將反應混合物加熱至回流隔夜。使反應冷卻至室溫且接著將混合物在真空中濃縮以產生無色油狀物。粗物質使用乙酸乙酯/己烷作為梯度，藉由Combiflash層析法純化，產物以30%乙酸乙酯/己烷溶離以獲得2-(雙(二異丙胺基)磷烷基(phosphaneyl))乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(8.14 g，37 mmol，58%產率)。1 H NMR (氯仿-d, 300 MHz) δ 3.8 (s, 2H), 2.9 (s, 2H), 1.6 (s, 6H)。
1.2. 2-( 雙 ( 二異丙胺基 ) 磷烷基 ) 乙酸 1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯
Figure 02_image083
將1-氯-N,N,N',N'-四異丙基磷烷二胺(7.75 g，29 mmol，1當量)溶解於無水THF (69.4 ml)中。添加另一41.6 ml之無水乙醚。將含2-溴乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(7.03 g，32 mmol，1.1當量)之無水THF (34.7 ml)置放於圓底燒瓶中。將鋅(2.85 g，43.6 mmol，1.5當量)、無水乙醚(22.2 ml)及磁性攪拌棒置放於裝配有弗里德利希冷凝器之500 mL三頸圓底燒瓶中。將膦(36 mL)及溴乙酸酯溶液(10 mL)同時且極緩慢地添加至三頸圓底燒瓶中。接著，在回流下加熱反應混合物直至放熱反應為可辨的(略微混濁，無色反應變得清晰且略帶黃色)。反應藉由添加膦及溴乙酸酯溶液之剩餘物而在回流下繼續。一旦添加完成，則反應藉由加熱而在回流下保持45 min，使其冷卻至室溫且藉由31 P NMR對完全性進行分析。將δ=135 ppm下之起始材料轉化為δ=48 ppm下之單一產物。在真空中濃縮經冷卻之反應混合物以獲得黏稠油狀物。所得材料用無水庚烷及少量乙腈溶解以完全溶解粗產物。此溶液用無水庚烷萃取兩次。對於δ=48 ppm下之不存在之產物，乙腈層藉由31 P NMR分析且丟棄。所有庚烷餾份經合併且在真空中濃縮以得到淺黃色油狀物。接著，將其在較高真空下乾燥隔夜，從而產生白色固體(7.096 g，19 mmol，62%產率)。1 H NMR (氯仿-d, 300 MHz) δ 3.3-3.5 (m, 4H), 2.9 (s, 2H), 2.7 (d, 2H), 1.60 (s, 6H), 1.3 (m, 24H)。
1.3. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[[ 外消旋 -(1R ,3R )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-3-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基嘧啶 -1- 基 )-2,5- 二氧雜雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 ] 磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image085
將1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雜雙環[2.2.1]庚-6-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(0.7 g，1.22 mmol，1當量)溶解於無水DCM (15.3 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(545 mg，1.47 mmol，1.2當量)添加至反應混合物。在完全溶解反應組分後，將四唑(2.17 ml，978 µmol，0.8當量)以於無水CH3 CN中之0.45 M溶液形式添加至反應混合物中。接著，使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)分析。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯(phosphinodiamite)31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(99 mg，136 µl，978 µmol，0.8當量)來淬滅。在5 min之後，在真空中濃縮反應混合物以獲得黏稠無色油狀物。將產物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且經由管柱層析法(80/20：乙酸乙酯/庚烷)純化。合併且濃縮含有產物之餾份，從而產生再溶解於最小量之無水DCM中之發泡體。逐滴添加庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之743 mg目標化合物(743 mg，0.88 mmol，69%產率)。31 P NMR (氯仿-d, 121 MHz) δ 126.91 (s, 1P), 122.25 (s, 1P)。1 H NMR (600 MHz, 乙腈-d 3) δ ppm 8.89 - 9.22 (m, 1 H), 7.57 - 7.59 (m, 1 H), 7.50 (d,J =7.6 Hz, 1 H), 7.33 - 7.39 (m, 3 H), 7.33 - 7.37 (m, 2 H), 7.26 - 7.31 (m, 1 H), 6.88 - 6.95 (m, 4 H), 5.58 (s, 1 H), 4.62 (s, 1 H), 4.14 (dJ ,=6.8 Hz, 1 H), 3.79 - 3.81 (m, 5 H), 3.79 - 3.85 (m, 2 H), 3.47 - 3.50 (m, 2 H), 3.42 - 3.50 (m, 1 H), 2.92 - 2.95 (m, 1 H), 2.67 - 2.71 (m, 1 H), 2.61 - 2.66 (m, 1 H), 1.72 (s, 2H), 1.52 (d,J =5.2 Hz, 4 H), 1.09 (d,J =6.7 Hz, 4 H), 1.01 (br d,J =6.7 Hz, 4 H)。LCMS (ES+)實驗值：843.37 g/mol。
1.4. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[[ 外消旋 -(1R ,3R )-3-(6- 苯甲醯胺基嘌呤 -9- 基 )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-2,5- 二氧雜雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 ] 磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image087
將N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雜雙環[2.2.1]庚-6-基]嘌呤-6-基]苯甲醯胺(3 g，4.37 mmol，1當量)溶解於無水DCM (54.7 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(1.95 g，5.25 mmol，1.2當量)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將四唑(7.78 ml，3.5 mmol，0.8當量)以於無水CH3 CN中之0.45 M溶液形式添加至反應混合物中。使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)分析。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(354 mg，488 µl，3.5 mmol，0.8當量)來淬滅。在5 min之後，在真空中濃縮反應混合物以獲得黏稠無色油狀物。將產物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且經由管柱層析法(80/20：乙酸乙酯/庚烷)純化。合併且濃縮含有產物之餾份，從而產生再溶解於最小量之無水DCM中之發泡體。逐滴添加庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之1.86 g目標化合物(1.86 g，1.9 mmol，45%產率)。31 P NMR (乙腈-d3 , 121 MHz) δ 125.2 (s, 1P), 120.9 (s, 1P)。LCMS (ES+)實驗值：956.40 g/mol。
1.5. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[[ 外消旋 -(1R ,3R )-3-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基嘧啶 -1- 基 )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-2,5- 二氧雜雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 ] 磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image089
將N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雜雙環[2.2.1]庚-6-基]-5-甲基-2-側氧基-嘧啶-4-基]苯甲醯胺(2.8 g，4.14 mmol，1當量)溶解於無水DCM (59.2 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(1.85 g，4.97 mmol，1.2當量)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將四唑(7.37 ml，3.31 mmol，0.8當量)以於無水CH3 CN中之0.45 M溶液形式添加至反應混合物中。使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)分析。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(335 mg，462 µl，3.31 mmol，0.8當量)來淬滅。在5 min之後，在真空中濃縮反應混合物以獲得黏稠之淺黃色油狀物。將產物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且經由管柱層析法(50/50：乙酸乙酯/庚烷)純化。合併且濃縮含有產物之餾份，從而產生再溶解於最小量之無水DCM中之發泡體。逐滴添加庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈淡黃色固體狀之2.35 g目標化合物(2.35 g，2.22 mmol，46%產率)。31 P NMR (乙腈-d3 , 121 MHz) δ 126.78 (s, 1P), 122.73 (s, 1P)。LCMS (ES+)實驗值：947.41 g/mol。
1.6. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[[ 外消旋 -(1R ,3R )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-3-[2-(2- 甲基丙醯基胺基 )-6- 側氧基 -1H- 嘌呤 -9- 基 ]-2,5- 二氧雜雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 ] 磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image091
將N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雜雙環[2.2.1]庚-6-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]-N,N-二甲基-甲脒(2.6 g，3.89 mmol，1當量)溶解於無水DCM (55.6 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(1.74 g，4.67 mmol，1.2當量)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將四唑(6.92 ml，3.12 mmol，當量：0.8)以於無水CH3 CN中之0.45 M溶液形式添加至反應混合物中。使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)分析。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(315 mg，434 µl，3.12 mmol，0.8當量)來淬滅。在5 min之後，在真空中濃縮反應混合物以獲得黏稠無色油狀物。將產物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且經由管柱層析法(100%乙酸乙酯)純化。合併且濃縮含有產物之餾份，從而產生再溶解於最小量之無水DCM中之發泡體。逐滴添加庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之1.4 g目標化合物(1.4 g，1.4 mmol，38%產率)。31 P NMR (乙腈-d3 , 121 MHz) δ 126.48 (s, 1P), 121.3 (s, 1P)。LCMS (ES+)實驗值：938.42 g/mol。
實例 2 ：寡核苷酸合成 寡核苷酸使用Bioautomation之MerMade 12自動化DNA合成儀來合成。使用攜帶通用連接器之受控微孔玻璃支撐物(500Å)以1 µmol規模來進行合成。
在標準循環程序中，為了偶合標準DNA及LNA亞磷醯胺，以230 µL之三次施用形式用含3% (w/v)二氯乙酸之CH2 Cl2 執行DMT去保護105秒。將各別亞磷醯胺與95 µL之0.1 M乙腈溶液(或用於LNA-Me C建構嵌段之乙腈/CH2 Cl2 1:1)及110 µL作為活化劑之0.25 M 5-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]-2H -四唑溶液偶合三次且偶合時間為180秒。以200 µL之一次施用形式使用3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液執行硫化3分鐘。以一次施用形式使用含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2執行氧化3分鐘。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N -甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端70秒。
用於引入PACE LNA之合成循環包括以230 µL之三次施用形式使用含3% (w/v)二氯乙酸之CH2 Cl2 進行DMT去保護105秒。將新製備之LNA PACE與95 µL之0.1 M乙腈溶液及110 µL作為活化劑的0.25 M 5-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]-2H -四唑溶液偶合兩次且偶合時間為15分鐘。以一次施用形式使用3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液執行硫化3分鐘。以一次施用形式使用含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2執行氧化3分鐘。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N -甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端70秒。
在合成之後，使1.5% DBU於無水CH3 CN中之溶液小心地通過管柱數次以使二甲基氰基乙基保護基去保護且在去保護期間防止鹼基之烷基化作用。接著，使其在室溫下靜置60分鐘。接著，丟棄溶液且管柱用2-3 mL之無水CH3 CN沖洗。接著，將其在氬氣流下乾燥。接著，將CPG小心地轉移至其中添加1 mL含7N NH3 之MeOH的4 mL小瓶中，且在55℃下在攪拌下保持24小時。
關於粗DMT之寡核苷酸藉由使用C18管柱之RP-HPLC純化來純化，隨後用80%水性乙酸及乙醇沈澱或藉由濾筒純化來移除DMT。在巴塞爾(Basel)中合成PACE LNA亞磷醯胺。普通亞磷醯胺以及用於固相合成中之所有試劑自sigma Aldrich訂購。
已根據上述程序製備以下分子。
化合物ID 編號 序列 質量計算值 質量實驗值
#1 G*m CaagcatcctGT 4295.5 4296.6
#2 Gm C*aagcatcctGT 4295.5 4295.7
#3 Gm CaagcatcctG*T 4295.5 4296.9
#4 G*m C*aagcatcctGT 4337.5 4340.1
#5 G*m CaagcatcctG*T 4337.5 4338.3
#6 Gm C*aagcatcctG*T 4337.5 4338.3
#7 G*AGttacttgccaAm CT 5321.3 5322.3
#8 GA*GttacttgccaAm CT 5321.3 5321.7
#9 GAG*ttacttgccaAm CT 5321.3 5323.8
#10 GAGttacttgccaA*m CT 5321.3 5321.7
#11 GAGttacttgccaAm C*T 5321.3 5322.6
#12 G*AgttacttgccaAm C*T 5363.3 5364.3
#13 Gm CattggtatT*m CA 4367.6 4368.9
#14 Gm C*attggtatTm CA 4367.6 4368.9
#15 Gm CattggtatTm C*A 4367.6 4368.6
#16 G*m CattggtatTm CA 4367.6 4368.0
#17 G*m CattggtatTm C*A 4409.6 4409.7
#18 Gm C*attggtatT*m CA 4409.6 4409.4
#19 Gm C*attggtatTm C*A 4409.6 4409.4
#20 G*m C*attggtatTm CA 4409.6 4408.5
#21 Gm CattggtatT*m C*A 4409.6 4409.4
#22 G*m CattggtatT*m CA 4409.6 4410.3
#23 G*m C*attggtatT*m CA 4451.6 4451.4
*相鄰核苷酸之間的PACE硫代磷酸酯修飾 A、G、m C、T表示LNA核苷酸 a、g、c、t表示DNA核苷酸 所有其他鍵聯經製備為硫代磷酸酯
實例 3 ： 寡核苷酸在不同濃度下靶向人類 HeLa 及 A549 細胞中之 HIF1a mRNA 之 活體外功效以用於劑量反應曲線。 HeLa及A549細胞株購自ATCC且如由供應商建議維持於37℃下具有5% CO2 之含濕氣培育箱中。對於分析，將3000個細胞/孔(HeLa)及3500個細胞/孔(A549)接種於96多孔盤中之培養基中。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞24小時。寡核苷酸之濃度範圍：最高濃度25 µM，在8個步驟中1:1稀釋。在添加寡核苷酸後三天，捕獲細胞。RNA根據製造商說明書，使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Thermo Fisher Scientific)萃取且用50 µl水溶離。RNA隨後用無DNA酶/RNA酶之水(Gibco)稀釋10次且加熱至90℃持續一分鐘。
對於基因表現分析，使用qScript™ XLT單步RT-qPCR ToughMix®，Low ROX™ (Quantabio)在雙螺旋體設置中執行單步RT-qPCR。以下TaqMan引物分析用於qPCR：具有內源性對照GUSB，Hs99999908_m1 (VIC-MGB)之HIF1A，Hs00936368_m1。所有引物集購自Thermo Fisher Scientific。HIF1A mRNA之相對表現量展示為對照(PBS處理之細胞)之百分比且已使用GraphPad Prism7對來自n=2次生物學重複實驗之資料測定IC50 值。
結果展示於下表中且展示於圖1中。
化合物ID 編號 HeLa 中之 IC50 ( µ M) SD A549 中之 IC50 ( µ M) SD
對照 2.85 0.34 9.44 0.59
#1 3.28 0.35 9.21 0.23
#2 5.28 1.05 9.72 0.19
#3 2.08 0.24 7.93 0.19
#4 7.44 0.71 15.51 0.09
#5 3.06 0.43 11.26 0.20
#6 3.32 0.47 11.25 0.40
圖1之曲線中所描繪之資料報導於下表中。HeLa 中之 HIF1A 表現 ( 生物學重複實驗之平均值 )
   # 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 參考
25.00 µM 16 17 13 25 16 20 16
12.50 µM 23 26 20 39 24 27 23
6.25 µM 36 42 28 55 37 43 34
3.13 µM 55 66 41 69 52 58 52
1.56 µM 70 78 61 80 72 64 66
0.78 µM 78 77 76 84 76 79 74
0.39 µM 83 95 82 90 85 94 81
0.20 µM 91 92 84 88 103 91 84
A549 中之 HIF1A 表現 ( 生物學重複實驗之平均值 )
   # 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 參考
25.00 µM 31 33 30 42 36 37 32
12.50 µM 45 49 43 58 50 55 48
6.25 µM 62 65 64 82 74 75 70
3.13 µM 82 83 81 88 88 101 88
1.56 µM 88 87 94 95 100 105 97
0.78 µM 92 106 99 102 97 102 97
0.39 µM 96 98 102 103 99 106 102
0.20 µM 96 94 97 95 97 103 99
實例 4 ： 寡核苷酸在不同濃度下靶向人類 HeLa 及 A549 細胞中之 MALAT1 mRNA 之 活體外效能及功效以用於劑量反應曲線。 HeLa及A549細胞株購自ATCC且如由供應商建議維持於37℃下具有5% CO2 之含濕氣培育箱中。對於分析，將3000個細胞/孔(HeLa)及3500個細胞/孔(A549)接種於96多孔盤中之培養基中。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞24小時。寡核苷酸之濃度範圍：最高濃度25 µM，在8個步驟中1:1稀釋。在添加寡核苷酸後三天，捕獲細胞。RNA根據製造商說明書，使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Thermo Fisher Scientific)萃取且用50 µl水溶離。RNA隨後用無DNA酶/RNA酶之水(Gibco)稀釋10次且加熱至90℃持續一分鐘。
對於基因表現分析，使用qScript™ XLT單步RT-qPCR ToughMix®，Low ROX™ (Quantabio)在雙螺旋體設置中執行單步RT-qPCR。以下TaqMan引物分析用於qPCR：具有內源性對照GAPDH之MALAT1，Hs00273907_s1 (FAM-MGB)。所有引物集購自Thermo Fisher Scientific。MALAT1 mRNA之相對表現量展示為對照(PBS處理之細胞)之百分比且已使用GraphPad Prism7對來自n=2次生物學重複實驗之資料測定IC50 值。
結果展示於下表中且展示於圖2中。
化合物ID 編號 HeLa 中之 IC50 ( µ M) SD A549 中之 IC50 ( µ M) SD
對照 0.44 0.06 0.79 0.11
#7 0.34 0.07 0.59 0.06
#8 0.28 0.05 0.61 0.05
#9 0.31 0.03 0.62 0.05
#10 0.20 0.03 0.47 0.08
#11 0.22 0.01 0.49 0.07
#12 0.29 0.02 0.43 0.05
圖2之曲線中所描繪之資料報導於下表中。HeLa 中之 MALAT1 表現 ( 生物學重複實驗之平均值 ) ：
   # 7 # 8 # 9 # 10 # 11 # 12 參考
25.00 µM 5 4 3 3 3 3 6
12.50 µM 6 5 4 3 3 4 7
6.25 µM 9 7 7 5 4 5 9
3.13 µM 13 13 8 7 7 8 15
1.56 µM 23 22 14 10 12 13 22
0.78 µM 29 27 32 19 19 20 37
0.39 µM 49 40 35 32 40 37 64
0.20 µM 73 65 77 64 67 70 79
A549 中之 MALAT1 表現 ( 生物學重複實驗之平均值 )
   # 7 # 8 # 9 # 10 # 11 # 12 參考
25.00 µM 8 7 5 5 5 4 12
12.50 µM 9 9 7 7 6 6 14
6.25 µM 13 11 11 10 10 9 18
3.13 µM 22 18 18 14 14 13 27
1.56 µM 31 32 30 25 24 22 38
0.78 µM 45 44 43 35 38 37 51
0.39 µM 64 66 67 56 57 50 71
0.20 µM 80 86 90 79 76 79 96
實例 5 ： 靶向小鼠原代肝細胞中之 ApoB mRNA 之 寡核苷酸的活體外效能及功效 在根據文獻(Berry及Friend, 1969, J. Cell Biol；Paterna等人, 1998, Toxicol.Appl. Pharmacol.)之2步灌注方案後，自用戊巴比妥(Pentobarbital)麻醉之C57BL/6J小鼠之肝臟分離原代小鼠肝細胞。第一步為用HBSS+15 mM HEPES+0.4 mM EGTA灌注5 min，隨後用HBSS+20 mM NaHCO3+0.04% BSA (Sigma，#A7979)+4 mM CaCL2 (Sigma，#21115)+0.2 mg/ml 2型膠原蛋白酶(Worthington，#4176)灌注12 min。將肝細胞擷取在冰上之5 ml冷威廉姆斯氏培養基E (Williams medium E；WME) (Sigma，#W1878，補充有1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10% (v/v) FBS (ATCC，#30-2030))中。粗細胞懸浮液經由70 µm細胞過濾器接著經由40 µm細胞過濾器(Falcon，#352350及#352340)過濾，用WME填充直至25 ml，且在室溫下以50× g離心5 min以使肝細胞成離心塊。移除上清液且將肝細胞再懸浮於25 ml WME中。在添加25 ml 90% Percoll溶液(Sigma，#P4937；pH=8.5-9.5)且在25℃下以50× g離心10 min之後，移除上清液及浮動細胞。為移除剩餘Percoll，再次將離心塊再懸浮於50 mL WME培養基中，在25℃下以50× g離心3 min，且丟棄上清液。將細胞離心塊再懸浮於20 mL WME中，測定細胞數目及存活力(Invitrogen，Cellcount)且將其稀釋至250,000個細胞/毫升。將25,000個細胞/孔接種在經膠原蛋白塗佈之96孔盤(PD Biocoat Collagen I，#356407)上，且在37℃、5% CO2下進行培育。在3 h之後，細胞用WME洗滌以移除未附著之細胞，且置換培養基。在接種後24 h，以一系列之濃度添加寡核苷酸：最高濃度3,125 µM，在8個步驟中半對數稀釋。在添加寡核苷酸後三天，捕獲細胞。RNA根據製造商說明書，使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Thermo Fisher Scientific)萃取且用50 µl水溶離。RNA隨後用無DNA酶/RNA酶之水(Gibco)稀釋10次且加熱至90℃持續一分鐘。
對於基因表現分析，使用qScript™ XLT單步RT-qPCR ToughMix®，Low ROX™ (Quantabio)在雙螺旋體設置中執行單步RT-qPCR。以下TaqMan引物分析用於qPCR：具有內源性對照Gapdh，Mm99999915_g1 (VIC-MGB)之Apob Mm_01545150_m1 (FAM-MGB)。所有引物集購自Thermo Fisher Scientific。ApoB mRNA之相對表現量展示為對照(PBS處理之細胞)之百分比且已使用GraphPad Prism7測定IC50值。
結果展示於下表中且展示於圖3中。
化合物ID 編號 IC50 ( µ M, N=2)
對照 0.07
#13 0.10
#14 0.23
#15 0.23
#16 0.21
#17 0.39
#18 0.39
#19 0.29
#20 0.19
#21 0.17
#22 0.21
#23 0.75
圖3之曲線中所描繪之資料報導於下表中。原代小鼠肝細胞中 ApoB mRNA 之相對表現
   # 13 # 14 # 15 # 16 # 17 # 18 # 19 # 20 # 21 # 22 # 23 參考
3.125 µM 13 11 12 13 12 16 13 11 11 11 18 16
0.989 µM 12 13 14 13 18 22 20 13 14 14 24 15
0.313 µM 16 19 22 19 27 30 28 20 24 26 42 26
0.099 µM 25 42 44 41 59 56 43 42 40 33 62 34
0.031 µM 54 73 72 75 79 86 81 67 60 76 75 44
0.010 µM 73 81 86 83 89 88 86 74 113 127 89 69
0.003 µM 94 87 92 86 86 86 85 104 108 89 83 88
0.001 µM 94 108 110 117 120 111 102 96 89 83 91 88
實例 6 ： 與 RNA 及 DNA 雜交之含有 膦醯基乙酸核苷間鍵之寡核苷酸的熱熔融 (Tm) 根據以下程序量測dsLNA/DNA或dsLNA/RNA異雙螺旋體之變性點(熱熔融=Tm)： 等莫耳量之RNA或DNA及LNA寡核苷酸(對於ApoB為20 µM及對於Malat-1為10 µM)之溶液在緩衝液(137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2 HPO4 ，pH 7.4)中產生10 µM ds寡核苷酸(ApoB)及5 µM ds寡核苷酸(Malat-1)。將溶液加熱至95℃持續2 min (雜交)且接著使其冷卻至室溫持續15 min。使用來自Thermo Scientific之Evolution 600 UV-VIS分光光度計記錄260 nm下之UV吸光度(加熱速率1℃/分鐘；讀取速率二十個/分鐘)。對於變性點(亦即，熔點，Tm)之測定，熔融轉移用LOWESS曲線擬合且拐點(=Tm)藉由描述性擬合之一階導數之峰位置來鑑別。
ApoB寡核苷酸之Tm量測值(RNA及DNA)展示於以下表中。
化合物 序列 Tm DNA (℃) Tm RNA (℃)
#13 Gm CattggtatT*m CA 57.5 65.8
#14 Gm C*attggtatTm CA 58.4 65.9
#15 Gm CattggtatTm C*A 58.3 65.9
#16 G*m CattggtatTm CA 57.3 67.5
#17 G*m CattggtatTm C*A 57.7 65.7
#18 Gm C*attggtatT*m CA 55.2 65.7
#19 Gm C*attggtatTm C*A 55.4 65.8
#20 G*m C*attggtatTm CA 55.5 65.8
#21 Gm CattggtatT*m C*A 55.9 66.2
#22 G*m CattggtatT*m CA 54.0 65.7
#23 G*m C*attggtatT*m CA 51.0 62.1
對照 Gm CattggtatTm CA 58.8 69.1
根據本發明之化合物保留對對照之RNA及DNA的高親和力。
實例 7 ： 靶向 LTK 細胞 ( 纖維母細胞 ) 中之 MALAT1 mRNA 之 所選寡核苷酸之活體外效能及功效 因此，產生且測試以下寡核苷酸：
化合物ID 編號 序列 質量計算值 質量實驗值
#24 GAGttacttgcca*Am CT 5321.3 5321.7
#25 GAGt*tacttgcca*Am CT 5363.3 5363.4
#26 GAGt°tacttgcca°Am CT 5331.3 5331.9
#27 GAGttacttgcca°Am CT 5305.2 5304.9
*相鄰核苷酸之間的PACE硫代磷酸酯修飾 °相鄰核苷酸之間的PACE磷酸二酯修飾 A、G、m C、T表示LNA核苷酸 a、g、c、t表示DNA核苷酸 所有其他鍵聯經製備為硫代磷酸酯
化合物ID 編號 LTK 細胞中之 IC50 (n M)  N=2
對照 138/165/188
#24 172
#25 142
#26 202
#27 121
在小鼠纖維母細胞(LTK細胞)中使用72小時之自主吸收測試一系列濃度下之靶向Malat-1的上述化合物，以測定化合物效能(IC50)。
LTK細胞之濃度範圍：50 µM，½對數稀釋，8個濃度。
Malat1之RNA含量使用qPCR定量(正規化為GAPDH含量)且測定IC50值。
IC50結果展示於上表中，其指示此化學修飾在目標阻斷基因表現方面(此處以疾病有關之骨骼肌細胞為例)具有良好耐受性。
實例 8 ： 以 15 mg/kg 之劑量量測心臟中之目標 mRNA 含量 (Malat1) 在第1天、第2天及第3天，以三個劑量對小鼠(C57/BL6)皮下投與15 mg/kg劑量之寡核苷酸(n=5)。在第8天處死小鼠，且量測心臟MALAT-1 RNA之減少。以3×15 mg/kg及3×30 mg/kg兩種劑量投與親本化合物。
結果展示於圖4中。
活體內結果說明經硫基-PACE修飾之化合物#24在阻斷心臟中MALAT-1之基因表現方面之效力為約參考化合物之兩倍(在15 mg/kg下之功效與在30 mg/kg劑量下之參考相同)。具有12位置處引入之額外硫基PACE修飾之化合物#25展示比#24較低之功效，但仍比參考更好。對應側氧基-PACE類似物(#26)展示實質上減少之活性。
已用根據本發明之單股反義寡核苷酸在活體內觀測到對功效之主要影響。應注意，根據本發明之寡核苷酸之劑量僅為參考劑量之50%。
實例 9 ： MOE PACE 單體合成 9.1. 2- 溴乙酸 1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯
Figure 02_image093
將2-溴乙醯溴(14.7 g，6.31 mL，72.6 mmol，當量：1.2)之溶液添加至含有甲苯(67.2 mL)之250 mL圓底燒瓶。在攪拌下緩慢添加3-羥基-3-甲基丁腈(6 g，6.28 ml，60.5 mmol，當量：1)。圓底燒瓶裝配有弗里德利希冷凝器及通向酸阱(含有NaOH水溶液)之乾燥管。將反應混合物加熱至回流且回流隔夜。使反應冷卻至室溫且接著將混合物在真空中濃縮為油狀物。粗油狀物使用乙酸乙酯/己烷作為梯度，藉由Combiflash層析法純化：產物以30%乙酸乙酯/己烷溶離以獲得2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(8.14 g，37 mmol，58%產率)。1 H NMR (氯仿-d, 300 MHz) δ 3.8 (s, 2H), 2.9 (s, 2H), 1.6 (s, 6H)。
9.2. 2-( 雙 ( 二異丙胺基 ) 磷烷基 ) 乙酸 1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯
Figure 02_image095
將無水THF (69.4 ml)、1-氯-N,N,N',N'-四異丙基磷烷二胺(7.75 g，29 mmol，當量：1)及磁性攪拌棒添加至加塞之250 mL圓底燒瓶，且將溶液攪拌直至膦溶解。在溶解之後，添加無水乙醚(41.6 ml)。將2-溴乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(7.03 g，32 mmol，當量：1.1)置放於100 mL圓底燒瓶中，且添加無水THF (34.7 ml)。將鋅(2.85 g，43.6 mmol，當量：1.5)、無水乙醚(22.2 ml)及磁性攪拌棒置放於裝配有弗里德利希冷凝器之500 mL三頸圓底燒瓶中。將膦(36 mL)及溴乙酸酯溶液(10 mL)添加至三頸圓底燒瓶。接著，在回流下加熱反應混合物直至放熱反應為可辨的(略微混濁，無色反應變得清晰且略帶黃色)。反應藉由添加膦及溴乙酸酯溶液之剩餘物而在回流下繼續。一旦添加完成，則反應藉由加熱而在回流下保持45 min，使其冷卻至室溫且藉由31 P NMR對完全性進行分析。將δ=135 ppm下之起始材料轉化為δ=48 ppm下之單一產物。經冷卻之反應混合物在真空中濃縮為黏稠油狀物。所得黏稠油狀物用無水庚烷溶解。接著，將所形成之固體溶解於乙腈中，且此溶液用無水庚烷萃取兩次。對於δ=48 ppm下之不存在之產物，乙腈溶液藉由31 P NMR分析且丟棄。所有庚烷餾份經合併(頂層)且在真空中濃縮以得到淺黃色油狀物。接著將其在較高真空下乾燥隔夜。在乾燥隔夜之後，所獲得之產物為良好之白色固體(7.096 g，19 mmol，62%產率)。1 H NMR (氯仿-d, 300 MHz) δ 3.3-3.5 (m, 4H), 2.9 (s, 2H), 2.7 (d, 2H), 1.60 (s, 6H), 1.3 (m, 24H)。
9.3. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[ 外消旋 -(2R ,5R )-2-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-4-(2- 甲氧基乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基嘧啶 -1- 基 ) 氧雜環戊 -3- 基 ] 氧基磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image097
將5-甲基-1-[外消旋-(2R,5R)-4-羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)-5-[[外消旋-(2E)-1,1-雙(4-甲氧基苯基)-2-[外消旋-(Z)-丙-1-烯基]戊-2,4-二烯氧基]甲基]氧雜環戊-2-基]嘧啶-2,4-二酮(800 mg，1.29 mmol，當量：1)溶解於無水DCM (16.2 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(721 mg，1.94 mmol，當量：1.5)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將4,5-DCI (122 mg，1.03 mmol，當量：0.8)添加至反應混合物中。接著，使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)來分析反應程度。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(105 mg，144 µl，1.03 mmol，當量：0.8)來淬滅。在5 min之後，將反應混合物在真空中使用旋轉蒸發器濃縮為黏稠油狀物。將黏稠油狀物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且添加至用80/20：乙酸乙酯/庚烷預平衡之矽膠管柱的頂部以收集產物。含有產物之餾份經合併且在旋轉蒸發器上在真空中濃縮為發泡體(再溶解於最小量之無水DCM中)，且逐滴添加無水庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之736 mg目標化合物(736 mg，61%產率)。LCMS (ES+)實驗值：889.5 g/mol。
9.4. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[ 外消旋 -(2R ,5R )-5-(6- 苯甲醯胺基嘌呤 -9- 基 )-2-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-4-(2- 甲氧基乙氧基 ) 氧雜環戊 -3- 基 ] 氧基磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image099
將外消旋-N-(9-((2R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(600 mg，0.82 mmol，當量：1)溶解於無水DCM (10.2 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(457 mg，1.23 mmol，當量：1.5)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將4,5-DCI (77.5 mg，0.66 mmol，當量：0.8)添加至反應混合物中。接著，使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)來分析反應程度。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。 在完成後，反應藉由添加三乙胺(66.4 mg，91.4 µl，0.65 mmol，當量：0.8)來淬滅。在5 min之後，將反應混合物在真空中使用旋轉蒸發器濃縮為黏稠油狀物。將黏稠油狀物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且添加至用80/20：乙酸乙酯/庚烷預平衡之矽膠管柱的頂部以收集產物。含有產物之餾份經合併且在旋轉蒸發器上在真空中濃縮為發泡體(再溶解於最小量之無水DCM中)，且逐滴添加無水庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之260 mg目標化合物(260 mg，32%產率)。LCMS (ES+)實驗值：1002.5 g/mol。
9.5. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[ 外消旋 -(2R ,5R )-2-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-4-(2- 甲氧基乙氧基 )-5-[2-(2- 甲基丙醯基胺基 )-6- 側氧基 -1H - 嘌呤 -9- 基 ] 氧雜環戊 -3- 基 ] 氧基磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image101
將2-甲基-N -[6-側氧基-9-[外消旋-(2R ,5R )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)氧雜環戊-2-基]-1H -嘌呤-2-基]丙醯胺(700 mg，0.98 mmol，當量：1)溶解於無水DCM (12.3 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(546 mg，1.47 mmol，當量：1.5)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將4,5-DCI (93 mg，0.79 mmol，當量：0.8)添加至反應混合物中。接著，使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)來分析反應程度。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(80 mg，109 µl，0.79 mmol，當量：0.8)來淬滅。在5 min之後，將反應混合物在真空中使用旋轉蒸發器濃縮為黏稠油狀物。將黏稠油狀物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且添加至用乙酸乙酯預平衡之矽膠管柱的頂部以收集產物。含有產物之餾份經合併且在旋轉蒸發器上在真空中濃縮為發泡體(再溶解於最小量之無水DCM中)，且逐滴添加無水庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈白色固體狀之520 mg目標化合物(520 mg，49%產率)。LCMS (ES+)實驗值：984.5 g/mol。
9.6. 2-[[ 二 ( 丙 -2- 基 ) 胺基 ]-[ 外消旋 -(2R ,5R )-5-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基嘧啶 -1- 基 )-2-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基甲氧基 ] 甲基 ]-4-(2- 甲氧基乙氧基 ) 氧雜環戊 -3- 基 ] 氧基磷烷基 ] 乙酸 (1- 氰基 -2- 甲基丙 -2- 基 酯 )
Figure 02_image103
將N -[5-甲基-2-側氧基-1-[外消旋-(2R ,5R )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基-3-(2-甲氧基乙氧基)氧雜環戊-2-基]嘧啶-4-基]苯甲醯胺(950 mg，1.32 mmol，當量：1)溶解於無水DCM (16.5 ml)中，接著將2-(雙(二異丙胺基)磷烷基)乙酸1-氰基-2-甲基丙-2-基酯(733 mg，1.97 mmol，當量：1.5)添加至反應混合物中。在完全溶解反應組分後，將4,5-DCI (124 mg，1.05 mmol，當量：0.8)添加至反應混合物中。接著，使反應混合物在氬氣下在室溫下攪拌隔夜且藉由31 P NMR及矽膠TLC (用乙酸乙酯溶離)來分析反應程度。藉由在TLC上點對點轉化成更快溶離之產物且藉由完全缺失乙酸膦基二胺酯31 P NMR信號來判定反應完成。在完成後，反應藉由添加三乙胺(107 mg，147 µl，1.05 mmol，當量：0.8)來淬滅。在5 min之後，將反應混合物在真空中使用旋轉蒸發器濃縮為黏稠油狀物。將黏稠油狀物再溶解於最小體積之乙酸乙酯中且添加至用80/20：乙酸乙酯/庚烷預平衡之矽膠管柱的頂部以收集產物。含有產物之餾份經合併且在旋轉蒸發器上在真空中濃縮為發泡體(再溶解於最小量之無水DCM中)，且逐滴添加無水庚烷以快速攪拌。固體沈澱物藉由過濾分離且在真空中乾燥隔夜以獲得呈淡黃色固體狀之722 mg目標化合物(722 mg，55%產率)。LCMS (ES+)實驗值：992.4 g/mol。
實例 10 ：寡核苷酸合成 寡核苷酸使用Bioautomation之MerMade 12自動化DNA合成儀來合成。使用攜帶通用連接器之受控微孔玻璃支撐物(500Å)以1 µmol規模來進行合成。
在標準循環程序中，為了偶合標準DNA及LNA亞磷醯胺，以230 µL之三次施用形式用含3% (w/v)二氯乙酸之CH2 Cl2 執行DMT去保護105秒。將各別亞磷醯胺與95 µL之0.1 M乙腈溶液(或用於LNA-Me C建構嵌段之乙腈/CH2 Cl2 1:1)及110 µL作為活化劑之0.25 M 5-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]-2H -四唑溶液偶合三次且偶合時間為180秒。以200 µL之一次施用形式使用3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液執行硫化3分鐘。以一次施用形式使用含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2執行氧化3分鐘。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N -甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端70秒。
用於引入MOE PACE之合成循環包括以230 µL之三次施用形式使用含3% (w/v)二氯乙酸之CH2 Cl2 進行DMT去保護105秒。將新製備之MOE PACE亞磷醯胺與95 µL之0.1 M乙腈溶液及110 µL之作為活化劑的0.25 M 5-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]-2H -四唑溶液偶合兩次且偶合時間為15分鐘。以一次施用形式使用3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮於乙腈/吡啶中之0.1 M溶液執行硫化3分鐘。 以一次施用形式使用含0.02 M I2 之THF/吡啶/H2 O:88/10/2執行氧化3分鐘。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N -甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端70秒。
在合成之後，使1.5% DBU於無水CH3 CN中之溶液小心地通過管柱數次以使二甲基氰基乙基保護基去保護且在去保護期間防止鹼基之烷基化作用。接著，使其在室溫下靜置60分鐘。接著，丟棄溶液且管柱用2-3 mL之無水CH3 CN沖洗。接著，將其在氬氣流下乾燥。接著，將CPG小心地轉移至其中添加1 mL含40% MeNH2 之水的4 mL小瓶中，且在55℃下在攪拌下保持15 min。
關於粗DMT之寡核苷酸藉由使用C18管柱之RP-HPLC純化來純化，隨後用80%水性乙酸及乙醇沈澱或藉由濾筒純化來移除DMT。在巴塞爾中合成MOE PACE亞磷醯胺。普通亞磷醯胺以及用於固相合成中之所有試劑自Sigma Aldrich訂購。
實例 11 ： 寡核苷酸在不同濃度下靶向人類 HeLa 細胞 中之 MALAT1 mRNA 之活體外效能及功效以用於劑量反應曲線。 HeLa細胞株購自ATCC且如由供應商建議維持於37℃下具有5% CO2 之含濕氣培育箱中。對於分析，將3000個細胞/孔接種於96多孔盤中之培養基中。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞24小時。寡核苷酸之濃度範圍：最高濃度25 µM，在8個步驟中1:1稀釋。在添加寡核苷酸後三天，捕獲細胞。RNA根據製造商說明書，使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Thermo Fisher Scientific)萃取且用50 µl水溶離。RNA隨後用無DNA酶/RNA酶之水(Gibco)稀釋10次且加熱至90℃持續一分鐘。
對於基因表現分析，使用qScript™ XLT單步RT-qPCR ToughMix®，Low ROX™ (Quantabio)在雙螺旋體設置中執行單步RT-qPCR。以下TaqMan引物分析用於qPCR：具有內源性對照GAPDH之MALAT1，Hs00273907_s1 (FAM-MGB)。所有引物集購自Thermo Fisher Scientific。MALAT1 mRNA之相對表現量展示為對照(PBS處理之細胞)之百分比且已使用GraphPad Prism7對來自n=2次生物學重複實驗之資料測定IC50 值。
結果提供於以下表中。
參考序列 IC50 [ µ M] 化合物ID 編號 序列 IC50 [ µ M]
GAGttacttgccaACT 0.32         
GAGt(ps) tacttgccaACT 2.06 #28 GAGt* tacttgccaACT 0.38
GAGtt(ps) acttgccaACT 1.95 #29 GAGtt* acttgccaACT 0.57
GAGtta(ps) cttgccaACT 0.19 #30 GAGtta* cttgccaACT 0.33
GAGttac(ps) ttgccaACT 0.40 #31 GAGttac* ttgccaACT 0.83
GAGttact(ps) tgccaACT 0.58 #32 GAGttact* tgccaACT 1.07
GAGttactt(ps) gccaACT 0.64 #33 GAGttactt* gccaACT 0.48
GAGttacttg(ps) ccaACT 0.93 #34 GAGttacttg* ccaACT 1.89
GAGttacttgc(ps) caACT 0.76 #35 GAGttacttgc* caACT 0.86
GAGttacttgcc(ps) aACT 0.51 #36 GAGttacttgcc* aACT 0.44
GAGttacttgcca(ps) ACT 0.60 #37 GAGttacttgcca* ACT 0.23
參考序列 IC50 [ µ M] 化合物ID 編號 序列 IC50 [ µ M]
GAGttacttgccaACT 0.32         
GAGt(po) tacttgccaACT 1.97 #38 GAGto tacttgccaACT 0.40
GAGtt(po) acttgccaACT 2.19 #39 GAGtto acttgccaACT 0.46
GAGtta(po) cttgccaACT 0.29 #40 GAGttao cttgccaACT 0.40
GAGttac(po) ttgccaACT 0.68 #41 GAGttaco ttgccaACT 0.42
GAGttact(po) tgccaACT 0.75 #42 GAGttacto tgccaACT 0.59
GAGttactt(po) gccaACT 1.15 #43 GAGttactto gccaACT 0.25
GAGttacttg(po) ccaACT 1.85 #44 GAGttacttgo ccaACT 1.77
GAGttacttgc(po) caACT 1.22 #45 GAGttacttgco caACT 0.51
GAGttacttgcc(po) aACT 0.37 #46 GAGttacttgcco aACT 0.25
GAGttacttgcca(po) ACT 0.46 #47 GAGttacttgccao ACT 0.14
參考序列 IC50 [ µ M] 化合物ID 編號 序列 IC50 [ µ M]
GAGttacttgccaACT 0.32      
GAGttacttgccaAc(ps) T 0.14 #48 GAGttacttgccaAc* T 0.07
GAGttacttgccaa(ps) CT 0.12 #49 GAGttacttgccaa* CT 0.11
GAg(ps) ttacttgccaACT 0.27 #50 GAg* ttacttgccaACT 0.11
Ga(ps) GttacttgccaACT 0.40 #51 Ga* GttacttgccaACT 0.21
g(ps) AGttacttgccaACT 0.46 #52 g* AGttacttgccaACT 0.86
GAGttacttgccaAc(po) T 0.14 #53 GAGttacttgccaAco T 0.11
GAGttacttgccaa(po) CT 0.16 #54 GAGttacttgccaao CT 0.19
GAg(po) ttacttgccaACT 0.42 #55 GAgo ttacttgccaACT 0.14
Ga(po) GttacttgccaACT 0.54 #56 Gao GttacttgccaACT 0.52
g(po) AGttacttgccaACT 0.58 #57 go AGttacttgccaACT 0.60
加粗字母t 、a 、g 、c 表示MOE修飾。 (ps)相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯修飾 (po)相鄰核苷酸之間的磷酸二酯修飾 *相鄰核苷酸之間的PACE硫代磷酸酯修飾 °相鄰核苷酸之間的PACE磷酸二酯修飾 A、G、m C、T表示LNA核苷酸 a、g、c、t表示DNA核苷酸 所有其他鍵聯經製備為硫代磷酸酯。
圖1展示靶向人類HeLa細胞株中之MALAT1 mRNA之根據本發明之寡核苷酸的劑量反應曲線及靶向人類A549細胞株中之MALAT1 mRNA之根據本發明之寡核苷酸的劑量反應曲線。 圖2展示靶向人類HeLa細胞株中之HIF1A mRNA之根據本發明之寡核苷酸的劑量反應曲線及靶向人類A549細胞株中之HIF1A mRNA之根據本發明之寡核苷酸的劑量反應曲線。 圖3展示靶向小鼠原代肝細胞中之ApoB mRNA之根據本發明之寡核苷酸的劑量反應曲線。 圖4展示用根據本發明之寡核苷酸治療之動物之心臟中的Malat1 mRNA含量之量。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 109105509-A0101-11-0002-3

Claims (40)

  1. 一種單股反義間隙子寡核苷酸，其包含至少一個式(I)之二核苷
    Figure 03_image105
    其中(A1 )及(A2 )中之一者為經糖修飾之核苷且另一者為經糖修飾之核苷或DNA核苷且A為氧或硫，或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為經糖修飾之核苷且另一者為DNA。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )皆同時為經糖修飾之核苷。
  4. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該經糖修飾之核苷獨立地為經2'糖修飾之核苷。
  5. 如請求項4之寡核苷酸，其中該經2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基-RNA；2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA；2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA或2'-氟-ANA。
  6. 如請求項4之寡核苷酸，其中該經2'糖修飾之核苷為LNA核苷。
  7. 如請求項6之寡核苷酸，其中該LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA，特定言之β-D-氧基LNA。
  8. 如請求項1或2之寡核苷酸，其包含選自以下之其他核苷間鍵：磷酸二酯核苷間鍵、硫代磷酸酯核苷間鍵及如請求項1之核苷間鍵。
  9. 如請求項1或2之寡核苷酸，其包含選自以下之其他核苷間鍵：硫代磷酸酯核苷間鍵及如請求項1之核苷間鍵。
  10. 如請求項1或2之寡核苷酸，其包含介於1與15個之間、特定言之1與5個之間、更特定言之1、2、3、4或5個如請求項1之式(I)之二核苷。
  11. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該等其他核苷間鍵為式-P(=S)(OR)O2 -之所有硫代磷酸酯核苷間鍵，其中R為氫或磷酸酯保護基。
  12. 如請求項1或2之寡核苷酸，其包含選自以下之其他核苷：DNA核苷、RNA核苷及經糖修飾之核苷。
  13. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中一或多個核苷為經核鹼基修飾之核苷，諸如包含5-甲基胞嘧啶核鹼基之核苷。
  14. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中如請求項1之該至少一個式(I)之二核苷處於該反義間隙子寡核苷酸之側接區中或位於該反義間隙子寡核苷酸之間隙區與側接區之間。
  15. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該間隙子寡核苷酸為LNA間隙子、混合翼間隙子或2'取代之間隙子，特定言之2'-O-甲氧基乙基間隙子。
  16. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該反義間隙子寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'之連續核苷酸序列，其中G為能夠募集RNaseH之5至18個核苷的區域，且該區域G藉由側接區F及F'分別側接5'及3'，其中區域F及F'獨立地包含1至7個經2'糖修飾之核苷酸或由其組成，其中與區域G相鄰之區域F之核苷為經2'糖修飾之核苷且其中與區域G相鄰之區域F'之核苷為經2'糖修飾之核苷。
  17. 如請求項16之寡核苷酸，其中如請求項1之該至少一個式(I)之二核苷定位於區域F或F'中或區域G與區域F之間或區域G與區域F'之間。
  18. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F或區域F'中或區域F及F'兩者中之該等經2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基-RNA；2'-烷氧基烷氧基-RNA，特定言之2'-甲氧基乙氧基-RNA；2'-胺基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-ANA及LNA核苷。
  19. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F或區域F'中或區域F及F'兩者中之所有該等經2'糖修飾之核苷為LNA核苷。
  20. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F或區域F'或者區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個DNA核苷。
  21. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F或區域F'或者區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經2'糖修飾之核苷，諸如至少一個2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷。
  22. 如請求項16之寡核苷酸，其中該間隙區G包含5至16個、特定言之8至16個、更特定言之8、9、10、11、12、13或14個連續DNA核苷。
  23. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F及區域F'獨立地為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷之長度。
  24. 如請求項16之寡核苷酸，其中區域F及區域F'各自獨立地包含1、2、3或4個LNA核苷。
  25. 如請求項16之寡核苷酸，其中該等LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
  26. 如請求項16之寡核苷酸，其中該等LNA核苷為β-D-氧基LNA。
  27. 如請求項16之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列(F-G-F')具有10至30個核苷酸之長度，特定言之12至22個，更特定言之具有14至20個寡核苷酸之長度。
  28. 如請求項16之寡核苷酸，其中該間隙子寡核苷酸包含式5'-D'-F-G-F'-D''-3'之連續核苷酸序列，其中F、G及F'如請求項17至27中之任一項中所定義，且其中區域D'及D''各自獨立地由0至5個核苷酸，特定言之2、3或4個核苷酸，特定言之DNA核苷酸，諸如磷酸二酯連接之DNA核苷組成。
  29. 如請求項16之寡核苷酸，其中各側接區F及F'獨立地包含1、2、3、4、5、6或7個、特定言之一個如請求項1之二核苷。
  30. 如請求項16之寡核苷酸，其總共包含一個如請求項1之二核苷。
  31. 如請求項30之反義間隙子寡核苷酸，其中如請求項1之該二核苷定位於區域F'中或區域G與區域F'之間。
  32. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠募集人類RNaseH1。
  33. 一種如請求項1至32中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特定言之鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
  34. 一種結合物，其包含如請求項1至32中任一項之寡核苷酸或如請求項33之醫藥學上可接受之鹽及至少一個結合部分，該至少一個結合部分視情況經由連接子部分共價連接至該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至32中任一項之寡核苷酸、如請求項33之醫藥學上可接受之鹽或如請求項34之結合物及治療上惰性載劑。
  36. 如請求項1或2之寡核苷酸，其用作治療上活性物質。
  37. 如請求項33之醫藥學上可接受之鹽，其用作治療上活性物質。
  38. 如請求項34之結合物，其用作治療上活性物質。
  39. 如請求項35之醫藥組合物，其用作治療上活性物質。
  40. 一種如請求項1至32中任一項之寡核苷酸、如請求項33之醫藥學上可接受之鹽或如請求項34之結合物或如請求項35之醫藥組合物的用途，其用於製造藥劑。
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Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE239484T1 (de) 1991-10-24 2003-05-15 Isis Pharmaceuticals Inc Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
IL135000A0 (en) 1997-09-12 2001-05-20 Exiqon As Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
EP1152009B2 (en) 1999-02-12 2017-09-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
KR100782896B1 (ko) 1999-05-04 2007-12-06 엑시콘 에이/에스 Ｌ-리보-ｌｎａ 유사체
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
KR20130042043A (ko) 2006-01-27 2013-04-25 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 6-변형된 바이시클릭 핵산 유사체
DK2666859T3 (en) 2006-04-03 2019-04-08 Roche Innovation Ct Copenhagen As PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ANTI-miRNA ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES
US20090326042A1 (en) 2006-05-05 2009-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc Compounds and methods for modulating expression of crp
DK2066684T3 (da) 2006-05-11 2012-10-22 Isis Pharmaceuticals Inc 5´-Modificerede bicycliske nukleinsyreanaloge
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP2410053B2 (en) 2006-10-18 2020-07-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
WO2008150729A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
WO2009006478A2 (en) 2007-07-05 2009-01-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
ES2463665T3 (es) 2007-10-04 2014-05-28 Stella Aps Tratamiento de combinación para el tratamiento de infección por virus de la hepatitis C
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10017764B2 (en) 2011-02-08 2018-07-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US10202599B2 (en) 2011-08-11 2019-02-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US9751909B2 (en) 2011-09-07 2017-09-05 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
US20150291958A1 (en) 2012-11-15 2015-10-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Anti apob antisense conjugate compounds
AU2014259759B2 (en) 2013-05-01 2020-06-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods
EP3591054A1 (en) 2013-06-27 2020-01-08 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
CA2935426C (en) 2014-01-30 2023-07-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyoligomer compound with biocleavable conjugates for reducing or inhibiting expression of a nucleic acid target
US20180023081A1 (en) 2015-02-04 2018-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Lna oligonucleotides with alternating flanks
GB201612011D0 (en) * 2016-07-11 2016-08-24 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel processes for the production of oligonucleotides

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