JP2021532075A - ホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、明細書および特許請求の範囲に定義された式（Ｉ）の少なくとも１つのホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、薬剤として使用することができる。

Description

本発明は、式（Ｉ）

［式中、２つの架橋硫黄原子の一方は、ＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシド（Ａ^１）の３’炭素原子に結合されており、他方は、別のヌクレオシド（Ａ^２）の５’炭素原子に結合されており、Ｒは、水素またはリン酸保護基である］
の少なくとも１つのホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。

短い合成核酸は、治療薬として高い可能性を示している。１９７０年代後半の最初の概念実証研究で、未修飾のデオキシヌクレオチドがインビトロでウイルス産生を阻害することが実証されて以来（Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｍ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７８，７５，２８０−２８４（非特許文献１））、化学修飾によって顕著な進歩が達成されている。核酸分解に対する感度が高いために、核酸のホスホジエステル骨格の安定化は、治療用オリゴヌクレオチドの化学的最適化の明らかな出発点であった。その結果、ホスホロチオエート（ＰＳ）（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９，１０，１１７−１２１．（非特許文献２））、ホスホロジチオエート（例えば、Ｗ．Ｔ．Ｗｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９９６，６１，４２７２−４２８１．（非特許文献３））、ボラノホスフェート（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ．Ｒ．Ｓｈａｗ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，８，１１４７−１１５５．（非特許文献４））、（チオ）ホスホロアミデート（例えばＳ．Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｔ．Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｃ．Ｃｕｃｃｏ，Ｍ．Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ，Ｃ．Ｙ．Ｃｈｉｕ，Ｄ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ Ｂ．Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６，２４，１５０８−１５１４．（非特許文献５））およびメチルホスホネート（例えば、Ｐ．Ｓ．Ｓａｒｉｎ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．Ｐ．Ｃｉｖｅｉｒａ，Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｔ．Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，２０，７４４８−７４５１（非特許文献６））をはじめとする、多種多様なリン酸修飾が検討されてきた。これらのリン酸類似体の中で、おそらく最も成功した修飾は、非架橋リン酸酸素原子の１つが硫黄に置き換えられているホスホロチオエートである。ヌクレアーゼに対するその高い安定性とその薬物動態上の利点により、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド治療薬の第一世代となり、ロックド核酸（ＬＮＡ）または２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−オリゴリボヌクレオチド（２’−ＭＯＥ）などの後世代の修飾への道を切り開いてきた。

Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｍ．Ｌ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７８，７５，２８０−２８４ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９，１０，１１７−１２１． Ｗ．Ｔ．Ｗｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ １９９６，６１，４２７２−４２８１． Ｊ．Ｓ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ．Ｒ．Ｓｈａｗ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００１，８，１１４７−１１５５． Ｓ．Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｔ．Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｃ．Ｃｕｃｃｏ，Ｍ．Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ，Ｃ．Ｙ．Ｃｈｉｕ，Ｄ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ Ｂ．Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６，２４，１５０８−１５１４． Ｐ．Ｓ．Ｓａｒｉｎ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．Ｐ．Ｃｉｖｅｉｒａ，Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｔ．Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｐ．Ｃ．Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，２０，７４４８−７４５１

本発明は、ホスホロトリチオエート結合がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれる（チオ）ホスフェート修飾に関する。この種のホスホロトリチオエートでは、非架橋リン酸酸素原子の１つが硫黄に置き換えられているだけでなく、隣接するリボース糖環の３’および５’位置にある２つの架橋酸素原子も硫黄に置き換えられている。

驚くべきことに、本発明による１つの修飾のみが、未修飾のホスホロチオエートアナログと比較して、インビトロとインビボの両方で改善された活性を有するオリゴヌクレオチドをもたらし得ることを見出した。

図１は、２４時間および７２時間のインキュベーション時間後の、１μＭの処置濃度での初代ラット肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルと細胞内オリゴヌクレオチド濃度（取り込み）を示す。 図２は、７日目の犠牲時に生理食塩水および未修飾対照と比較した、本発明による修飾を有するオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｋｇ単回投与で処置されたＣ５７ＢＬ／６ＪｂｏｍＴａｃ雌マウスの肝臓および腎臓におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルを示す。 図３は、生理食塩水および未修飾対照と比較した、本発明による修飾を有するオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｋｇ単回投与後の０日目、３日目および７日目におけるＣ５７ＢＬ／６ＪｂｏｍＴａｃ雌マウスの血中で測定された血清コレステロールレベルを示す。 図４は、７日目の犠牲時に未修飾対照と比較した、本発明による修飾を有するオリゴヌクレオチドの１ｍｇ／ｋｇ単回投与で処置されたＣ５７ＢＬ／６ＪｂｏｍＴａｃ雌マウスの肝臓、腎臓および心臓におけるオリゴヌクレオチド組織含有量を示す。

本明細書において、用語「アルキル」は、単独または組み合わせで、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より特には１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチルおよび異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチルおよびプロピルである。

用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせで、３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、より特にはシクロプロピルおよびシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。

用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせで、式アルキル−Ｏ−の基（用語「アルキル」は、前で付与した意味を有する）、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。

用語「オキシ」は、単独または組み合わせで、−Ｏ−基を意味する。

用語「アルケニル」は、単独または組み合わせで、オレフィン結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニルおよびイソブテニルである。

用語「アルキニル」は、単独または組み合わせで、三重結合と、８個まで、特に２個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素残基を意味する。

用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独または組み合わせで、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、より特にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、他の基と組み合わせて、少なくとも１つのハロゲン、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜４個のハロゲン、即ち１個、２個、３個または４個のハロゲンで置換された前記基の置換を示す。

用語「ハロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１個のハロゲンで置換された、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロメチル、ジフルオロメチルもしくはトリフルオロメチル、またはモノフルオロエチル、ジフルオロエチルもしくはトリフルオロエチル、またはモノフルオロプロピル、ジフルオロプロピルもしくはトリフルオロプロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロエチルまたはトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルは、特定の「ハロアルキル」である。

用語「ハロシクロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１個のハロゲンで置換された、特に１〜５個のハロゲン、特に１〜３個のハロゲンで置換された、上記に定義したシクロアルキル基を意味する。用語「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。

用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、−ＯＨ基を意味する。

用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、−ＳＨ基を意味する。

用語「カルボニル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。

用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独または組み合わせで、−ＣＯＯＨ基を意味する。

用語「アミノ」は、単独または組み合わせで、第一級アミノ基（−ＮＨ_２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）、または第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。

用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせで、１個または２個の上記に定義したアルキル基で置換された、上記に定義したアミノ基を意味する。

用語「スルホニル」は、単独または組み合わせで、−ＳＯ_２基を意味する。

用語「スルフィニル」は、単独または組み合わせで、−ＳＯ−基を意味する。

用語「スルファニル」は、単独または組み合わせで、−Ｓ−基を意味する。

用語「シアノ」は、単独または組み合わせで、−ＣＮ基を意味する。

用語「アジド」は、単独または組み合わせで、−Ｎ_３基を意味する。

用語「ニトロ」は、単独または組み合わせで、ＮＯ_２基を意味する。

用語「ホルミル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。

用語「カルバモイル」は、単独または組み合わせで、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基を意味する。

用語「カバミド」は、単独または組み合わせで、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ_２基を意味する。

用語「アリール」は、単独または組み合わせで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、６〜１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式単環または二環式環系を示す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。

用語「ヘテロアリール」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい炭素である、５〜１２個の環原子の一価芳香族複素環式単環または二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルが含まれる。

用語「ヘテロシクリル」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい炭素である、４〜１２個、特に４〜９個の環原子の一価飽和または部分不飽和単環または二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例には、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、またはオキサゼパニルが含まれる。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、または３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。

用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたはそれ以外の点で望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、双性イオンの形態で存在することもできる。本発明の特に好ましい薬学的に許容される塩は、ナトリウム、リチウム、カリウムおよびトリアルキルアンモニウム塩である。

用語「保護基」は、単独または組み合わせで、化学反応が別の非保護の反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能性化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。

「リン酸保護基」は、リン酸基の保護基である。リン酸保護基の例は、２−シアノエチルおよびメチルである。リン酸保護基の特定の例は、２−シアノエチルである。

「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、チオール基を保護するためにも使用される。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（またはビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル（またはトリス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＴＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチルまたはトリフェニルメチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル）、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）である。ヒドロキシル保護基の特定の例は、ＤＭＴおよびＴＭＴ、特にＤＭＴである。

「チオヒドロキシル保護基」は、チオヒドロキシル基の保護基である。チオヒドロキシル保護基の例は、「ヒドロキシル保護基」のものである。

本発明の出発物質または化合物のうちの１つが、１つ以上の反応ステップの反応条件下で安定でないかまたは反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｂｙ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているもの）を、当該技術分野で周知の重要なステップ適用方法の前に導入することができる。そのような保護基は、文献に記載の標準的な方法を用いて、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。

本明細書に記載される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在することができる。

オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも呼ばれ得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域を含み、任意に更なるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と呼ばれ得る。

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。未修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてがヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。

本発明のオリゴヌクレオチドで使用するための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、ホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合以外に、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてがホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロトリチオエート結合に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合と少なくとも１つのホスホジエステル結合、例えば２、３または４個のホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドでは、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ内の連続ＤＮＡヌクレオシドの間に適切に位置していない。

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦおよびＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中の全ヌクレオシド間結合、またはオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

立体不規則性ホスホロチオエート結合
ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の１つを硫黄で置換すると、キラル中心が導入され、したがって単一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内で、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＳ（Ｓｐ）またはＲ（Ｒｐ）立体アイソフォームのいずれかになる。そのようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と呼ばれる。それと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、２つの非末端酸素原子を有しているため、非キラルである。

立体中心のキラリティーの指定は、Ｃａｈｎ，Ｒ．Ｓ．；Ｉｎｇｏｌｄ，Ｃ．Ｋ．；Ｐｒｅｌｏｇ，Ｖ．（１９６６）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５（４）：３８５−４１５．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．１９６６０３８５１．で最初に公開された標準的なＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ則（ＣＩＰ順位則）によって決定される。

標準的なオリゴヌクレオチド合成中、カップリングの立体選択性とそれに続く硫化は制御されていない。このため、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の立体化学は不規則的にＳｐまたはＲｐであり、したがって従来のオリゴヌクレオチド合成によって生成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実際には２^Ｘもの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体に存在し得、ここで、Ｘは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数である。そのようなオリゴヌクレオチドは、本明細書では立体不規則性ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと呼ばれ、任意の立体選択的ヌクレオシド間結合を含まない。したがって、立体不規則性ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、立体的に規定された合成に由来する個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、混合物は最大２^Ｘの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体として定義される。

立体的に規定されたヌクレオシド間結合
立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、その２つのジアステレオマー形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオ異性体過剰を有するキラルなヌクレオシド間結合である。

当該技術分野で使用される立体選択的オリゴヌクレオチド合成法は、典型的には、各キラルヌクレオシド間結合において少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のジアステレオ選択性を提供し、したがってオリゴヌクレオチド分子の最大約１０％、例えば約５％が代替ジアステレオ異性体を有していてもよいことが認識されるべきである。

いくつかの実施形態では、各立体的に規定されたキラルヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９０：１０である。いくつかの実施形態では、各キラルヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９５：５である。

立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、立体的に規定されたヌクレオシド間結合の特定の例である。

立体的に規定されたホスホロチオエート結合
立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、その２つのジアステレオマー形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオマー過剰を有するホスホロチオエート結合である。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のＲｐおよびＳｐ配置を以下に示す：

式中、３’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（５’ヌクレオシド）の３’位を表し、５’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（３’ヌクレオシド）の５’位を表す。

本明細書では、Ｒｐヌクレオシド間結合はｓｒＰとして表すこともでき、Ｓｐヌクレオシド間結合はｓｓＰとして表すこともできる。

特定の実施形態では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９０：１０または少なくとも９５：５である。

いくつかの実施形態では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９７：３である。いくつかの実施形態では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９８：２である。いくつかの実施形態では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９９：１である。

いくつかの実施形態では、立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、または（本質的に）すべてが同じジアステレオマー形態（ＲｐまたはＳｐ）である。

ジアステレオマーの純度は、アキラルな骨格（すなわち、ホスホジエステル）のみを有するモデルシステムで測定することができる。各モノマーのジアステレオマー純度は、例えば、立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有するモノマーを以下のモデルシステム「５’ ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ ３’」にカップリングすることによって測定することができる。この結果は次のようになる：５’ ＤＭＴｒ−ｔ−ｓｒｐ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ ３’または５’ ＤＭＴｒ−ｔ−ｓｓｐ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ−ｔ−ｐｏ ３’であって、これらはＨＰＬＣを使用して分離することができる。ジアステレオマーの純度は、２つの可能なジアステレオ異性体からのＵＶ信号を積分し、これらの比、例えば、９８：２、９９：１または＞９９：１を与えることによって決定される。

特定の単一のジアステレオ異性体（単一の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド分子）のジアステレオマー純度は、各ヌクレオシド間位置での定義された立体中心に対するカップリング選択性、および導入されるべき立体的に規定されたヌクレオシド間結合の数の関数であることが理解されるであろう。例として、各位置でのカップリング選択性が９７％である場合、１５個の立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有する立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの結果として生じる純度は、０．９７^１５であり、すなわち、他のジアステレオ異性体の３７％と比較して所望のジアステレオ異性体の６３％である。定義されたジアステレオ異性体の純度は、合成後、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどのＨＰＬＣによる精製によって改善することができる。

いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、当該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望のジアステレオ異性体であるものを指す。

別様に記載すると、いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、当該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望の（特定の）立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（立体的に規定されたモチーフとも称される）からなるものを指す。

立体不規則性および立体的に規定されたヌクレオシド間キラル中心の両方を含む立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの場合、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの純度は、所望の立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフを保持するオリゴヌクレオチドの％集団を参照して決定され、立体不規則性結合は計算上無視される。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン）部分を包含し、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。これに関連して、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’−チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーには、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ”オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。

立体的に規定されたオリゴヌクレオチド
立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。

立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。

相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば、５−メチルシトシンはシトシンの代わりに使用されることが多く、したがって相補性という用語は、未修飾および修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。

本明細書で使用される用語「％相補性」は、所定の位置において、別個の核酸（例えば、標的核酸）の所定の位置における連続ヌクレオチド配列に相補的な（即ち、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの割合を指す。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’を整列させたとき）、整列された塩基の数を数え、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割って１００を掛けることにより計算される。そのような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。

用語「完全に相補的な」は、１００％の相補性を指す。

同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、所定の位置において、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所定の位置における連続ヌクレオチド配列と同一な（即ち、相補的なヌクレオシドとＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成するそれらの能力において）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるパーセント表記におけるオリゴヌクレオチドの数を指す。百分率は、２つの配列間で同一である整列された塩基の数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割って１００を掛けることによって計算される。同一性パーセント＝（マッチ×１００）／整列された領域の長さ。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するものと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）によって記述されることが多い。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５−５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．３６−３８およびＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１−１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８−５４０５に記載される適切に導出された熱力学的パラメータを使用して、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に記載されているように、最近傍モデルを使用して数値的に推定することができる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌまたは−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含んでもよい。

リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。

そのような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、またはモルホリノ核酸も含まれる。

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによる修飾が含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入され得る。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）である。

実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、向上された結合親和性および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７に見出すことができる。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。

本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。

ロックされた核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するビラジカル（「２’−４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）と称されている。リボースのコンフォメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる際のハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。

非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１およびＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５−１２３８に開示されている。

２’−４’架橋は、２〜４個の架橋原子を含み、特に式−Ｘ−Ｙ−であって、ＸはＣ４’に結合され、ＹはＣ２’に結合されており、
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ^ａ−；−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、
Ｙは、酸素、硫黄、−（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ^ａ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ（Ｒ^ａ）２−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−ＳＯ_２−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−または−Ｓｅ−Ｓｅ−ではないことを条件とし、
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２または＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、−ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄおよび−ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され、
または、２つのジェミナルなＲ^ａとＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａとＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、−Ｘ−Ｙ−の炭素原子が１つだけのシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１〜３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Ｘ^ａは、酸素、硫黄または−ＮＲ^ｃであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、水素およびアルキルから独立して選択され、
ｎは、１、２または３である。

本発明の更なる特定の実施形態では、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ^ａ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−、特に酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ_２−または−Ｃ（＝ＣＨ_２）−、より特には酸素である。

本発明の別の特定の実施形態では、Ｙは、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、特に−ＣＨ_２−ＣＨＣＨ_３−、−ＣＨＣＨ_３−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ−、−Ｓ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ^ａ）−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−である。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキルからなる群から独立して選択される。

本発明の別の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチルおよび−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、特に水素、フルオロ、メチルおよび−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３からなる群から独立して選択される。

有利には、−Ｘ−Ｙ−のＲ^ａおよびＲ^ｂの一方は上記で定義されたとおりであり、他方はすべて同時に水素である。

本発明の更なる特定の実施形態では、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方が水素である。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。

本発明の１つの特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ_２−、−Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｎ（ＯＣＨ_３）ＣＨ_２−または−Ｎ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−である。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、式中、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチルおよび−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３からなる群から独立して選択される。

特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ_２−または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、特に−Ｏ−ＣＨ_２−である。

２’−４’架橋は、それぞれ式（Ａ）および式（Ｂ）に示されるように、リボース環平面よりも下（β−Ｄ−構成）、または環平面よりも上（α−Ｌ−構成）のいずれかに配置され得る。

本発明によるＬＮＡヌクレオシドは、特に式（Ｂ１）または（Ｂ２）

［式中、
Ｗは、酸素、硫黄、−Ｎ（Ｒ^ａ）−または−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、特に酸素であり、
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｚ^＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミルおよびアリールから独立して選択され、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、上記で定義されたとおりである］
のものである。

特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。更なる特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方が水素である。特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

更なる特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方が水素である。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

更なる特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方が水素である。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから独立して選択される。

本発明の更なる特定の有利な実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。

本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方は上記で定義されたとおりであり、特にアルキル、より特にはメチルである。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキルおよびアジドから、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチルおよびアジドから独立して選択される。特に、本発明の有利な実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチルまたはアジドであるか、またはＲ^５とＲ^５＊は両方とも同時に水素またはハロゲンであり、特に両方とも同時に水素またはフルオロである。そのような特定の実施形態では、Ｗは、有利には酸素であり得、−Ｘ−Ｙ−は、有利には−Ｏ−ＣＨ_２−であり得る。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号および国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれ、当該技術分野でβ−Ｄ−オキシＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般的に知られているものを含む。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号および国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号および国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−または−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第００／０４７５９９号およびＭｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれ、当該技術分野で２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般的に知られているものを含む。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方は水素ではなく、例えばメチルなどのアルキルである。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００７／１３４１８１号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素ではなく、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方は水素ではなく、特にアルキル、例えばメチルである。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲ^ａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１０／０３６６９８号および国際公開第２００７／０９００７１号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドでは、Ｒ^ａは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、特にメチルである。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１）である。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−である。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野で環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−（「２’Ｏ−エチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１）である。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−（上記で引用した文献Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０）である。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野でｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、国際公開第２００７／０９００７１（β−Ｄ）および国際公開第２０１０／０３６６９８（α−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）−ｃＥＴまたは（Ｒ）−ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであり得、これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、Ｒ^ａもＲ^ｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にアルキルであり、特に両方とも同時にメチルである。そのような６’二置換ＬＮＡヌクレオシドは国際公開第２００９／００６４７８号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲ^ａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１１／１５６２０２号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれるそのような６’置換チオＬＮＡの特定の実施形態では、Ｒ^ａは、アルキル、特にメチルである。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−または−Ｃ（ＣＦ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、特に両方とも同時に水素またはメチルであるか、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方は水素であり、他方はメチルである。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００８／１５４４０１号および国際公開第２００９／０６７６４７号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（ＯＲ^ａ）−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。特定の実施形態では、Ｒ^ａは、アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても知られており、国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されおり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−ＯＮ（Ｒ^ａ）−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。特定の実施形態では、Ｒａは、アルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは、水素またはメチル、特に水素である（上記で引用した文献Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０）。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−（上記で引用した文献Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０）である。

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊は両方とも同時に水素である。本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルである。そのような実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、特に水素であり得、−Ｘ−Ｙ−は、特に−Ｏ−ＣＨ_２−または−Ｏ−ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３−、例えば−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−であり得る。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、例えば−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような特定の実施形態では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは、水素またはメチル、特に水素であり得る。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、立体配座制限ヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、国際公開第２０１３／０３６８６８号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の特定の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はすべて同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。そのような特定の実施形態では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは、水素またはメチル、特に水素であり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、Ｍｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５−１２３８に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

特に明記されていない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄまたはα−Ｌ立体アイソフォームであり得ることが認識されるであろう。

本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例は、スキーム１に示されている（ここで、Ｂは上記で定義されたとおりである）。
スキーム１

特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（（Ｓ）−ｃＥＴ）およびＥＮＡである。

ＲＮａｓｅ Ｈ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１がＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’−フランク、ギャップおよび３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を５’−＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドの伸長を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（即ち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡおよび２’−ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。

ギャップマー設計Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシドであってもよい。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_１−８、例えば
Ｆ_１−８−Ｇ_７−１６−Ｆ’_２−８
ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

領域Ｆ、ＧおよびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式に組み込まれることができる。

ギャップマー領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切なギャップマーは、少なくとも５または６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５〜１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６〜１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７〜１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有していてもよい。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ＤＮＡヌクレオシドから成っていてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、場合によってはメチル化されていてもよく、そのような残基は、５−メチル−シトシン（^ｍｅＣまたはｃの代わりにｅ）としてアノテーションされている。ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドがギャップ内に存在して潜在的な毒性を低減する場合に有利であり、この修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に大きな影響を与えない。

いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドから成っていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびＶｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６−２３００に記載されており、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＮＡおよび２’Ｆ−ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４−６６１）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（Ｆｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド核酸である。そのようなギャップマーに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（即ち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、任意に、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採択する１〜３糖修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。

領域Ｇ−「ギャップブレーカー」
あるいは、いくつかのＲＮａｓｅＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計がＲＮａｓｅＨを動員する能力は、典型的には、配列または化合物固有である−Ｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３ ｐｐ．８４７６−８４８７を参照されたい。これは、場合によっては、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）または２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはβ−Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋は、βコンフォメーションである）、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。

上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーは、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。

ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ_１−８−［Ｄ_３−４−Ｅ_１−Ｄ_３−４］₋Ｆ’_１−８
Ｆ_１−８−［Ｄ_１−４−Ｅ_１−Ｄ_３−４］−Ｆ’_１−８
Ｆ_１−８−［Ｄ_３−４−Ｅ_１−Ｄ_１−４］−Ｆ’_１−８
を含み、領域Ｇは、［Ｄ_ｎ−Ｅ_ｒ−Ｄ_ｍ］内にあり、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは、修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は、本明細書に定義したフランキング領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ＤＮＡヌクレオシドを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、任意に、１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただしギャップ領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨ動員を媒介できることを条件とする。

ギャップマー−フランキング領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆは、１〜８連続ヌクレオチド長、例えば２〜６、例えば３〜４連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、２〜８連続ヌクレオチド長、例えば３〜６、例えば４〜５連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆ’の最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域Ｆまたは領域Ｆ’の長さが１である場合、それはＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択されてもよい。

いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、ＬＮＡと２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウィング設計）。

いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、またはβ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみからなる。そのような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレオシド、またはＦおよびＦ’は、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１〜５、例えば２〜４、例えば３〜４、例えば１、２、３、４または５連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全ヌクレシドは、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレシド、またはＦおよびＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７または８連続ＯＭｅまたはＭＯＥからなる。いくつかの実施形態では、フランキング領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは５’（Ｆ）フランキング領域であり、一方、３’（Ｆ’）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは３’（Ｆ’）フランキング領域であり、一方、５’（Ｆ）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、任意にＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、任意にＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の最も５’および最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

更なるギャップマー設計は、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第２００７／１４６５１１号および国際公開第２００８／１１３８３２号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる、

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかで、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。β−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかで、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１−５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］_１−５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に定義したとおりである。

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１−８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_１−８、例えば［ＭＯＥ］_２−７−［領域Ｇ］_５−１６−［ＭＯＥ］_２−７、例えば［ＭＯＥ］_３−６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_３−６のものであり、領域Ｇはギャップマーの定義に定義したとおりである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。

混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウィング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

混合ウィングギャップマー設計は、国際公開第２００８／０４９０８５号および国際公開第２０１２／１０９３９５号に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。そのような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互フランクギャップマー」は、フランク（ＦまたはＦ’）の少なくとも一方がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’のうちの少なくとも１つ、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。

交互フランク領域は、最大３連続ＤＮＡ、例えば１〜２または１もしくは２もしくは３連続ＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい。

交互フランクは、例えば、ＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）の数に続いてＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す一連の整数としてアノテーションすることができ、例えば
［Ｌ］_１−３−［Ｄ］_１−４−［Ｌ］_１−３
［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２
である。

オリゴヌクレオチド設計では、これらは、２−２−１が５’［Ｌ］_２−［Ｄ］_２−［Ｌ］３’を表し、１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すような数字として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのフランク（領域ＦおよびＦ’）の長さは、独立して、３〜１０ヌクレオシド、例えば４〜８、例えば５〜６ヌクレオシド、例えば４、５、６または７修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドの一方のフランクのみが交互になっており、他方はＬＮＡヌクレオチドで構成されている。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は、

のとおりであり、ただし、ギャップマー領域の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、または完全に相補的でなくてもよい。そのような更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ”と呼ばれ得る。

領域Ｄ’またはＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

領域Ｄ’およびＤ”は、各々、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”またはＤ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、または相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’およびＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ”としての使用に適切なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’_１−３−Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８−Ｄ’’_１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’_１−３−Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８−Ｄ’’_１−３

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

トータルマー（Ｔｏｔａｌｍｅｒ）
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシドのすべてが糖修飾ヌクレオシドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、本明細書ではトータルマーと呼ばれる。

いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドのすべては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてＬＮＡヌクレオシドであっても、すべて２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドおよび／または（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＡトータルマーオリゴヌクレオチドは、７〜１２ヌクレオシド長である（例えば、国際公開第２００９／０４３３５３を参照されたい）。そのような短い完全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの阻害に特に有効である。

さまざまなトータルマー化合物は、治療用オリゴマーとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として高い効果を発揮する。

いくつかの実施形態では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸまたはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’−ＯＭｅ ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチド類似体である。上記の配列モチーフは、いくつかの実施形態では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであり得る。

いくつかの実施形態では、トータルマーは、７〜２４ヌクレオチド、例えば、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。

いくつかの実施形態では、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡ単位を含む。完全なＬＮＡ化合物の場合、１２ヌクレオチド長未満、例えば７〜１０であることが有利である。

残りの単位は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’ＭＯＥ ＲＮＡ単位からなる群、または２’−ＯＭｅ ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチド類似体から選択されてもよい。

ミックスマー
用語「ミックスマー」は、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドの両方を含むオリゴマーを指し、ＲＮａｓｅＨを動員するには連続ＤＮＡヌクレオシド長が不十分である。適切なミックスマーは、最大３つまたは最大４つの連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの交互領域を含む。オリゴヌクレオチドに組み込まれたときにＲＮＡ様（３’エンド）コンフォメーションを形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域と交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチドを作製することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。

オリゴヌクレオチドミックスマーは、スプライスモジュレーターやマイクロＲＮＡ阻害剤などの標的遺伝子の作業ベースの調節を提供するために使用されることが多い。

いくつかの実施形態では、ミックスマー中の糖修飾ヌクレオシド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド、例えば（Ｓ）ｃＥＴまたはβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはすべてそれらである。

いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドのすべては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてＬＮＡヌクレオシドであっても、すべて２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、ミックスマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドのみを含み、そのようなＬＮＡミックスマーオリゴヌクレオチドは、例えば、８〜２４ヌクレオシド長であり得る（例えば、マイクロＲＮＡのＬＮＡ ａｎｔｍｉＲ阻害剤を開示する国際公開第２００７１１２７５４号を参照されたい）。

さまざまなミックスマー化合物は、治療用オリゴマーとして、特にマイクロＲＮＡ（ａｎｔｉｍｉＲ）を標的とする場合や、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として高い効果を発揮する。

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、次のモチーフを含む：

ここで、Ｌは、ＬＮＡまたは２’置換ヌクレオシド（例えば２’−Ｏ−ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドを表し、各ｍは、１〜６から独立して選択され、各ｎは、１、２、３および４、例えば１〜３から独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡおよび２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、１０〜２４ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。

いくつかの実施形態では、ミックスマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ単位を含む。

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、ヌクレオチド類似体と天然に存在するヌクレオチドとの繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列、または１種のヌクレオチド類似体と第２のタイプのヌクレオチド類似体を含むか、またはそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置きもしくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体であり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、または本明細書で言及される２’フルオロ類似体の２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチド類似体、またはいくつかの実施形態では、本明細書で言及されるヌクレオチド類似体の群から選択されたものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端または３’末端でヌクレオチド類似体と組み合わせられ得ることが認識されている。

いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。

同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。

同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、オリゴマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチド類似体である。

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続するヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも２つの連続するＬＮＡ単位を含む少なくとも１つの領域を含む。

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続するヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも３つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を含む。

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフターゲット活性または活性）。

国際公開第９３／０７８８３号および国際公開第２０１３／０３３２３０号は、適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。更なる適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるものである。特に、３価のＮ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号および国際公開第２０１４／１７９６２０号（これは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込み促進する一方で、腎臓におけるその存在を減少させ、それにより、同じオリゴヌクレオチドの非コンジュゲートバージョンと比較して、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を増加させる。

オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその合成については、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１およびＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３による包括的なレビューでも報告されており、この各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

リンカー
リンケージまたはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物の細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合、少なくとも３つまたは４つまたは５つの連続したホスホジエステル結合を含む、１〜１０ヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオシド、より好ましくは２〜６ヌクレオシド、最も好ましくは２〜４連結ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃで構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドは式（ＩＩ）

［式中、（Ａ^１）および（Ａ^２）は、上記で定義されたとおりである］
のものである。

したがって、本発明は、特に次のものに関する：

ヌクレオシド（Ａ^１）がＤＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^２）がＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^２）がＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

糖修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^２）が２’−アルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシ−ＲＮＡ、２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡまたは２’−フルオロ−ＡＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^２）がＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ＬＮＡヌクレオシドが、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびＥＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシＬＮＡから独立して選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^１）および（Ａ^２）の少なくとも一方が２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡが２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ヌクレオシド（Ａ^１）および（Ａ^２）が両方ともＤＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

上記で定義された式（Ｉ）のホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合およびホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合から選択される更なるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；

上で定義された式（Ｉ）のホスホロチオエートヌクレオシド間結合およびホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合から選択される更なるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；

上記で定義された式（Ｉ）の１〜１５個、特に１〜５個、より特には１、２、３、４または５個のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；

更なるヌクレオシド間結合がすべて、
式−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ_２−［式中、Ｒは、上記で定義されたとおりである］
のホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドから選択される更なるヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；

１つ以上のヌクレオシドが核酸塩基修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物またはリボザイムである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合がギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域にある、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウィングギャップマーまたは２’置換ギャップマー、特に２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

ギャップマーオリゴヌクレオチドが式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｇは、ＲｎａｓｅＨを動員することができる５〜１８ヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇは、５’および３’がそれぞれフランキング領域ＦおよびＦ’によって隣接されており、領域ＦおよびＦ’は、独立して、１〜７つの２’糖修飾ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドは２’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドは２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

上記で定義された式（Ｉ）の前記少なくとも１つのホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合が、領域Ｇの隣接するヌクレオシド間に、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に配置されている、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；

オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマー、特にスプライススイッチングオリゴヌクレオチドまたはマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；

本発明によるオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特にナトリウムまたはカリウム塩；

本発明によるオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、任意にリンカー部分を介して前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容される塩に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート；

本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、医薬組成物；

治療上活性な物質として使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲート；

心臓または血液疾患の治療または予防に使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲート；

心臓または血液疾患の治療または予防のための薬剤の調製のための、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートの使用；

心臓または血液疾患の治療または予防における、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートの使用；

心臓または血液疾患の治療または予防を必要とする患者に、本発明による有効量のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートを投与することを含む、心臓または血液疾患の治療または予防のための方法；

細胞内の標的ＲＮＡ、特にヒトｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを阻害する方法であって、前記標的ＲＮＡを発現する細胞に本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法；

本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドを前記標的ＲＮＡを発現する細胞に投与することを含む、細胞内の標的ＲＮＡ、特にヒトｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを調節または阻害するインビトロ方法；

以下のステップを含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法：
（ａ）３’Ｓ−修飾ヌクレオシドホスホロアミダイトを５’Ｓ−修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの末端５’硫黄原子にカップリングして、ジチオホスファイトトリエステル中間体を生成するステップ；
（ｂ）ステップａ）で得られたジチオホスファイトトリエステル中間体をチオ酸化するステップ；および
（ｃ）任意に前記オリゴヌクレオチドをさらに伸長させるステップ；

ステップ（ａ）の５’Ｓ−修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させる、本発明による方法；

固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断をさらに含む、本発明による方法；および

本発明の方法に従って製造されたオリゴヌクレオチド。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、対応する完全にホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチドと比較して、その標的核酸を調節する際のより高い活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、増強された活性、増強された効力、増強された特異的活性、または増強された細胞取り込みを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、インビトロまたはインビボでの作用の持続期間の延長など、インビトロまたはインビボでの作用の持続期間が変更されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、標的核酸を調節する際のより高い活性は、標的核酸を発現している細胞においてインビトロまたはインビボで決定される。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、毒性の低下、例えば、腎毒性の低下、肝毒性の低下、または免疫刺激の低下などの薬理学的特性を変化させた。肝毒性は、例えば、インビボで、または国際公開第２０１７／０６７９７０号に開示されたインビトロアッセイを使用することによって決定することができ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。腎毒性は、例えば、インビトロで、またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４７７０に開示されたアッセイを使用することによって決定することができ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’ ＣＧ ３’ジヌクレオチド、例えばＤＮＡ ５’ＣＧ ３’ジヌクレオチドを含み、ＣとＧとの間のヌクレオシド間結合は、上記で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ耐性、例えば血清中の改善された生体安定性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドは、ＡまたはＧ塩基、例えば３’末端ＬＮＡ−ＡまたはＬＮＡ−Ｇヌクレオシドを有する。適切には、オリゴヌクレオチドの２つの最も３’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、上記で定義された式（Ｉ）によるホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、増強された生物学的利用能を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、より大きな血液曝露、例えばより長い血中滞留時間を有する。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のスキームに従って調製することができる。

非架橋位置ならびに隣接するフラノース環の３’および５’位に硫黄原子を有するトリチオホスフェート結合は、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。合成は、支持体としてユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）を使用して行った。そのような固体支持体上で、オリゴヌクレオチドは、典型的には、５’Ｏ−ＤＭＴ保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトビルディングブロックのカップリングと、それに続く（チオ）酸化、キャッピングおよびＤＭＴ基の脱保護からなる連続的なサイクルによって３’−５’方向に構築される。本出願に記載されているホスホロトリチオエートの導入のために、ＤＭＴ保護された５’−デオキシ−５’−メルカプトホスホロアミダイトビルディングブロックが、固体支持体結合オリゴヌクレオチド鎖の遊離５’−ヒドロキシ基に結合されている。（チオ）酸化およびキャッピング後、得られた中間体を脱保護して５’−チオール基を遊離させる。

スキーム１

この脱保護は困難であり、標準的な脱保護条件（典型的にはジクロロメタン中３〜５％のジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸）を繰り返し（１５回以上）適用するか、またはより高い酸濃度（例えば、ジクロロメタン中最大１０％のトリクロロ酢酸）もしくはより強い酸（例えば、ジクロロメタン中５％のトリフルオロ酢酸）を使用するかのいずれかによって、適切なカチオンスカベンジャー（典型的には、トリエチルシラン２０％、４−メトキシチオフェノール５％または両方の組み合わせ）を優先的に使用して最適な方法で行う。

スキーム２

このようにして得られた遊離５’チオール基を、次いで、適切な５’Ｏ−ＤＭＴ保護された３’−デオキシ−３’−メルカプトホスホロアミダイトビルディングブロックにカップリングする。そのようなビルディングブロックの反応性は低いために、一般的な手順には、４つの等価物を使用した１２回のカップリングと、長い反応時間（７．５分）が含まれる。次いで、得られたジチオホスファイト中間体は、適切な試薬（例えば、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン）を使用してチオ酸化を受けて、所望のホスホロトリチオエート結合を提供することができる。

スキーム３

上記のスキームでは：
Ｒ^２ａとＲ^４ａは一緒になって、上記で定義された−Ｘ−Ｙ−を形成するか、または
Ｒ^４ａは、水素であり、Ｒ^２ａは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシおよびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシから選択され、
Ｒ^２ｂとＲ^４ｂは一緒になって、上記で定義された−Ｘ−Ｙ−を形成するか、または
Ｒ^２ｂとＲ^４ｂは両方とも同時に水素であるか、または
Ｒ^４ｂは、水素であり、Ｒ^２ｂは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシおよびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシから選択され、
Ｒ^３は、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Ｒ^５は、ヒドロキシルまたはチオヒドロキシル保護基であり、
Ｒは、上記で定義されたとおりである。

これから本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって説明する。

実施例１
オリゴヌクレオチド合成
Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社のＭｅｒＭａｄｅ １２自動ＤＮＡ合成装置を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで行った。

ＤＮＡとＬＮＡホスホロアミダイトのカップリングの標準サイクル手順において、ＤＭＴ脱保護は、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を用いて２００μＬを３０秒間で３回適用して行った。アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液１００μＬ（またはＬＮＡ−^ＭｅＣビルディングブロックの場合はアセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２ １：１）と、活性化剤としてアセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾール０．１Ｍ溶液１１０μＬと、１８０秒のカップリング時間とを用いて、それぞれのホスホロアミダイトを３回カップリングした。チオ酸化には、アセトニトリル／ピリジン１：１中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．１Ｍ溶液を使用した（３×１９０μＬ、５５秒）。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを５５秒間行った。

２’，３’−ジデオキシ−３’−メルカプトホスホロアミダイトを組み込むための合成サイクルには、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を使用したＤＭＴ脱保護が含まれ、２００μＬを３０秒間３回適用した。アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液４０μＬと、アセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾール０．１Ｍ溶液４４μＬを使用して、カップリング時間９００秒で１０回ホスホロアミダイトカップリングを行った。アセトニトリル／ピリジン １：１中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．１Ｍ溶液１９０μＬを５５秒間で３回適用することにより、カップリング直後にチオ酸化を行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを５５秒間行った。

２’，５’−ジデオキシ−５’−メルカプトホスホロアミダイトを組み込むための合成サイクルには、アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液１００μＬと、アセトニトリル中の５−（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル））−１Ｈ−テトラゾール０．１Ｍ溶液１１０μＬを使用したホスホロアミダイトビルディングブロックのカップリングが含まれ、１８０秒のカップリング時間で行った。トリプルカップリングを行った。アセトニトリル／ピリジン １：１中の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．１Ｍ溶液（３×１９０μＬ、５５秒）を使用して、チオ酸化を行った。キャッピングのために、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ−メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を５５秒間適用した。ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を用いて、２００μＬを３０秒間で１５回適用し、ＤＭＴ脱保護およびチオールの遊離を行った。チオールのＤＭＴ脱保護および遊離はまた、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５〜３０％（ｖ／ｖ）トリエチルシランおよび／またはＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜１０％ｐ−メトキシチオフェノールの存在下に、１〜１０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸または５〜１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を２００μＬで４５秒間にわたり３〜６回適用することで有利に行った。

核酸塩基保護基の除去および固体支持体からの切断は、３２％水性アンモニアを用いた標準的な条件下で５５℃にて最低８時間達成された。粗ＤＭＴ−オンオリゴヌクレオチドは、固相抽出カートリッジを使用してイオン交換クロマトグラフィーで再精製するか、またはＣ１８カラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ精製と、それに続く８０％酢酸水溶液によるＤＭＴ除去およびエタノール沈殿によって精製した。

上記の一般的な手順に従って、以下の分子を調製した。

太字と下線のヌクレオチド間のトリチオエート修飾
Ａ、Ｇ、^ｍＣ、Ｔは，ＬＮＡヌクレオチドを表す。
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す。
他のすべてのリンケージは、ホスホロチオエートとして調製した。

化合物＃１〜８は配列番号１に基づく。それらは、上記の表に示されているように、式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合の位置が異なる。

実施例２
インビトロでのｍＲＮＡ減少と細胞内濃度（取り込み）
初代ラット肝細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、抗生物質を添加せずに１０％ＦＣＳを含むウィリアムズ培地Ｅで処理した。細胞は、完全細胞培養培地中の指示された濃度のＬＮＡ溶液で処理した。それぞれ２４時間および７２時間のインキュベーション時間後、細胞をＣａ^２＋およびＭｇ^２＋を含むＰＢＳで３回洗浄し、１６５μＬのＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ溶解バッファーで溶解した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＲＯ９６ ＲＮＡキットを製造元の指示に従って使用して総ＲＮＡを単離し、ＲｎＡｐｏＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用プライマープローブセット付きＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲＴ−ｑＰＣＲを行った。得られたデータはＲｉｂｏｇｒｅｅｎに対して正規化した。

ＬＮＡオリゴヌクレオチドの細胞内濃度は、ハイブリダイゼーションに基づくＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。すべてのデータポイントは重複して行い、データはその平均値として与えている。

結果を図１に示す。

データから分かるように、本発明による修飾は忍容性が非常に高く、オリゴヌクレオチドは、良好な効力と同時に適切な細胞内濃度を示す。

実施例３
肝臓と腎臓における生体内でのｍＲＮＡ減少
約２０グラムのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ雌マウスに、０日目に１０ｍｌ／ｋｇの容量で０．１ｍｇ／ｋｇの濃度にて１ｍｇ／ｋｇの単回投与を受けさせ、動物を７日目に犠牲にした。血清、肝臓、腎臓および心臓の組織は、終了時に採取した。

組織からのｍＲＮＡ解析は、Ｑａｎｔｉｇｅｎｅ ｍＲＮＡ定量化キット（「ｂＤＮＡ−ａｓｓａｙ」、Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）を製造元のプロトコルに従って用いることにより行った。組織溶解物については、５０〜８０ｍｇの組織を、プロテイナーゼＫを含む１ｍｌの溶解バッファー中で超音波溶解した。溶解物を、ＲＮＡ抽出せずにｂＤＮＡアッセイに直接使用した。ターゲットとＧＡＰＤＨのプローブセットは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社からカスタム設計されたものを入手した。解析のために、標的遺伝子について得られた発光単位をハウスキーパーＧＡＰＤＨに対して正規化した。

結果を図２に示す。

図２は、未修飾ホスホロチオエート対照と比較して、本発明による修飾を有するオリゴヌクレオチドの肝臓における改善された標的減少を示す。これらの知見は、この特定の分子が、このシリーズの中で最も低いインビトロでの標的減少を示したという事実に照らすと一層驚くべきものである。

実施例４
血清コレステロール値
約２０グラムのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ雌マウスに、０日目に１０ｍｌ／ｋｇの容量で０．１ｍｇ／ｋｇの濃度にて１ｍｇ／ｋｇの単回投与を受けさせ、動物を７日目に犠牲にした。血清、肝臓、腎臓および心臓の組織は、終了時に採取した。

コレステロールの血清分析は、「Ｃｏｂａｓ ＩＮＴＥＧＲＡ ４００ｐｌｕｓ」臨床化学プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により、１０μｌの血清を使用して行った。

結果を図３に示す。

データは、本発明による修飾を有するオリゴヌクレオチドの、観察された、より高い標的減少（図２、実施例３）が、血清コレステロールレベルの改善された低下をもたらすことを実証しており、これはこの特定の配列に対する活性の機能的な読み出しである。これらの知見は、この特定の分子が、このシリーズの中で最も低いインビトロでの標的減少を示したという事実に照らすと一層驚くべきものである。

実施例５
肝臓、腎臓、心臓における生体内組織への取り込み
約２０グラムのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ雌マウスに、０日目に１０ｍｌ／ｋｇの容量で０．１ｍｇ／ｋｇの濃度にて１ｍｇ／ｋｇの単回投与を受けさせ、動物を７日目に犠牲にした。血清、肝臓、腎臓および心臓の組織は、終了時に採取した。

オリゴヌクレオチドの定量化のために、蛍光標識されたＰＮＡプローブを組織溶解物中の目的のオリゴにハイブリダイズさせる。組織の量を正確に加重しただけで、ｂＤＮＡアッセイと同じ溶解物を使用した。ヘテロ二本鎖は、ＡＥＸ−ＨＰＬＣと蛍光検出を用いて定量化する。

結果を図４に示す。

図４は、組織取り込みに対する本発明による修飾の有益な効果を実証している。このデータは、肝臓と腎臓における高い組織含量だけでなく、心臓への組織分布を改善するこの修飾の驚くべき可能性も示している。これらの知見は、この特定の分子が、このシリーズの中で最も低いインビトロでの標的減少を示したという事実に照らすと一層驚くべきものである。

Claims (35)

1. 式（Ｉ）
   

   

   ［式中、２つの架橋硫黄原子の１つは、ＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシド（Ａ^１）の３’炭素原子に結合されており、もう１つは、別のヌクレオシド（Ａ^２）の５’炭素原子に結合されており、Ｒは、水素またはリン酸保護基である］
   の少なくとも１つのホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド。
2. 前記ヌクレオシド（Ａ^１）がＤＮＡヌクレオシドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記ヌクレオシド（Ａ^２）が、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、または糖修飾ヌクレオシドである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記ヌクレオシド（Ａ^２）が、ＤＮＡヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記糖修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記ヌクレオシド（Ａ^２）が、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシ−ＲＮＡ、２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡ、特に２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡまたは２’−フルオロ−ＡＮＡである、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記ヌクレオシド（Ａ^２）がＬＮＡヌクレオシドである、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記ＬＮＡヌクレオシドが、β−Ｄ−オキシＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡおよびＥＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシＬＮＡから独立して選択される、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記ヌクレオシド（Ａ^１）および（Ａ^２）の少なくとも一方が２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 前記２’−アルコキシアルコキシ−ＲＮＡが２’−メトキシエトキシ−ＲＮＡである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 前記ヌクレオシド（Ａ^１）および（Ａ^２）が両方ともＤＮＡヌクレオシドである、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
12. ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項１で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合から選択される更なるヌクレオシド間結合を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
13. ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項１で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合から選択される更なるヌクレオシド間結合を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
14. １〜１５個、特に１〜５個、より具体的には１、２、３、４または５個の、請求項１で定義された式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 前記更なるヌクレオシド間結合がすべて、
    式−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ_２−［式中、Ｒは、請求項１で定義されたとおりである］
    のホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
16. ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドから選択される更なるヌクレオシドを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
17. １つ以上のヌクレオシドが核酸塩基修飾ヌクレオシドである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物またはリボザイムである、請求項１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
19. 前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項１から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
20. 前記式（Ｉ）のホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合が前記ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域にある、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
21. 前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウィングギャップマー、または２’置換ギャップマー、特に２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである、請求項１９または２０に記載のオリゴヌクレオチド。
22. 前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’の連結ヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｇが、ＲｎａｓｅＨを動員することができる５〜１８ヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇが、５’および３’がそれぞれフランキング領域ＦおよびＦ’によって隣接されており、領域ＦおよびＦ’が、独立して、１〜７つの２’糖修飾ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
23. 請求項１で定義された前記式（Ｉ）の少なくとも１つのホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合が、領域Ｇの隣接するヌクレオシド間、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に配置されている、請求項２２に記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
24. 前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドミックスマーまたはトータルマー、特にスプライススイッチングオリゴヌクレオチドまたはマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチドである、請求項１から２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
25. 特にナトリウムまたはカリウム塩である、請求項１から２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩。
26. 請求項１から２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、任意にリンカー部分を介して前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容される塩に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
27. 請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、医薬組成物。
28. 治療上有効な物質として使用するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲート。
29. 心臓または血液疾患の治療または予防に使用するための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲート。
30. 心臓または血液疾患の治療または予防のための薬剤の調製のための、請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートの使用。
31. 心臓または血液疾患の治療または予防における、請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートの使用。
32. 心臓または血液疾患の治療または予防を必要とする患者に、請求項１から２６のいずれか一項に記載の有効量のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩またはコンジュゲートを投与することを含む、心臓または血液疾患の治療または予防のための方法。
33. 以下のステップ：
    （ａ）３’Ｓ−修飾ヌクレオシドホスホロアミダイトを５’Ｓ−修飾ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの末端５’硫黄原子にカップリングして、ジチオホスファイトトリエステル中間体を生成するステップ；
    （ｂ）ステップａ）で得られたジチオホスファイトトリエステル中間体をチオ酸化するステップ；および
    （ｃ）任意に前記オリゴヌクレオチドをさらに伸長させるステップ
    を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを製造するための方法。
34. 請求項３３に記載の方法に従って製造されたオリゴヌクレオチド。
35. 本明細書において記載した発明。

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