JP2021511022A - Ｐｉａｓ４発現を調節するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、標的細胞におけるＰＩＡＳ４の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＩＡＳ４プレｍＲＮＡにハイブリダイズする。本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、膵臓がん、乳がんなどのがんおよび肝線維症の治療のための、オリゴヌオチドのコンジュゲートおよび薬学的組成物および方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＰＩＡＳ４転写物に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。このようなオリゴヌクレオチドは、細胞内のＰＩＡＳ４転写物を減少させ、ＰＩＡＳ４の発現の調節をもたらすために使用することができる。ＰＩＡＳ４発現の調節は、がんまたは肝線維症などのさまざまな医的障害に有益である。

活性化ＳＴＡＴ ４（ＰＩＡＳ４）のタンパク質阻害剤は、ＵＢＥ２Ｉと基質との間の相互作用を安定させるＥ３タイプの小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）リガーゼとして、また、ＳＵＭＯテザリング因子として機能する。ＰＩＡＳ４は、ＳＴＡＴ経路、ｐ５３／ＴＰ５３経路、Ｗｎｔ経路およびステロイドホルモンシグナル伝達経路等、さまざまな細胞経路で転写コレギュレーターとして重要な役割を果たし、ＣＥＢＰＡ、ＰＡＲＫ７、ＨＥＲＣ２、ＭＹＢ、ＴＣＦ４およびＲＮＦ１６８のＳＵＭＯ化を媒介する。Ｗｎｔシグナル伝達では、ＰＩＡＳ４がＬＥＦ１を抑制し、ＳＵＭＯ化の促進を通じてＴＣＦ４転写活性を高め、さらに、ＰＩＡＳ４はＭＴＡ１のＳＵＭＯ化を強化し、そのパラログ選択ＳＵＭＯ化に関与することができる（例えば、Yamamoto H. et al., EMBO J. 22:2047-2059(2003); Dahle O. et al., Eur. J. Biochem. 270:1338-1348(2003); Subramanian L., J et al., Biol. Chem. 278:9134-9141(2003); Shinbo Y.et al., Cell Death Differ. 13:96-108(2006); Cong L. J. Biol. Chem. 286:43793-43808(2011); およびDanielsen J.R., J et al., Cell Biol. 197:179-187(2012）を参照）。

Chienら (2013) 109, 1795-1804には、２つの異なるエクソン特異的ｓｉＲＮＡを使用することにより、正常な膵臓と比較してＰＩＡＳ４発現が上昇している膵臓がん細胞株および腫瘍におけるＰＩＡＳ４遺伝子発現が抑制されることが開示されている。

ＰＩＡＳ４は、ＳＩＲＴ１を抑制することにより、肝細胞における炎症誘発性転写を調節する。ＰＩＡＳ４を標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のレンチウイルス送達によるＰＩＡＳ４の減少は、ＳＩＲＴ１発現ＰＩＡＳ４を回復させることによりＮＡＳＨマウスの肝炎症を弱めた（Lina Sun et. Al., Oncotarget, 2016 7(28): 42892-42903 and Xu et al. The Journal of Biomedical Research, 2016 30(6): 496-501)）。

特に直接ＡＭＰＫ活性化因子Ａ７６９６６２と組み合わせると、ｓｉＲＮＡを使用したＰＩＡＳ４枯渇は乳がん細胞の増殖を低下させ、ＡＭＰＫａ１ ＳＵＭＯ化の阻害がＡＭＰＫ活性を調節し、それによりがん細胞増殖を抑制することが可能であることを示唆している（Yan et al. Nature Communications, 2015, 6:8979）。

上記文献のいずれも、ＰＩＡＳ４を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示しておらず、特に、ＰＩＡＳ４遺伝子のイントロン配列または反復配列を標的とする概念を開示していない。

同じＲＮＡの反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの遺伝子導入実験のいくつかのケースで、標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションの効力を増強したことが示された。これは、ＧＣＧＲ、ＳＴＳＴ３、ＭＡＰＴ、ＯＧＦＲ、およびＢＯＫ ＲＮＡの場合であった（Vickers at al. PLOS one, October 2014, Volume 9, Issue 1０）。国際公開第２０１３／１２０００３号もまた、反復ターゲティングによるＲＮＡの調節に言及している。

発明の目的
ＰＩＡＳ４は、がんおよび肝線維症など、複数の病状の進行に関与している。本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でＰＩＡＳ４のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。特に、ＰＩＡＳ４の発現は、成熟したＰＩＡＳ４ ｍＲＮＡの形成を妨げるプレｍＲＮＡのレベルを標的としている。反復部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ標的配列内の単一領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、より高い用量効果を有する。したがって、本発明は、特にがんおよび肝線維症の治療において、標準治療療法との併用療法で使用することができる。

本発明は、配列番号１、２および／または３などの哺乳類ＰＩＡＳ４核酸に相補的であり、それを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびその使用を提供する。

本発明は、特定の領域に相補的である連続するヌクレオチド配列、または標的哺乳類ＰＩＡＳ４核酸のイントロンに存在する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明の化合物は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸を発現している細胞中の哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸を阻害することができる。

本発明は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの使用と、医薬におけるそれらの使用とを提供する。

したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号１および３からなる群から選択される哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸またはその天然に存在する変異体に対して、例えば完全に相補的など、少なくとも９０％の相補性を有する、１０−３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０−５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内の哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸の発現を低下させることができる。

さらなる態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のプレｍＲＮＡ（例えば配列番号１）中に存在するイントロン領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１および／または配列番号３の標的核酸に存在する少なくとも２の反復標的領域に対して少なくとも９０％の相補性を有する、１０‐３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

さらなる態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が配列番号１の標的核酸のうちの１０−２２、例えば１４−２０ヌクレオチド長の標的領域に対して９５％相補的、例えば完全に相補的であり、標的領域が標的核酸にわたって少なくとも５回以上反復されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明のさらなる態様では、連続するヌクレオチド配列が、配列番号１の２８４７８−２８４９７、２８５４０−２８５５９、２８８１６−２８８３５、２８９１０−２８９２９、２９０２４−２９０４３；２８４７８−２８４９５、２８５４０−２８５５７、２８６９６−２８７１３、２８８１６−２８８３３、２８９１０−２８９２７、２９０２４−２９０４１；２８４８２−２８４９７、２８５４４−２８５５９、２８８２０−２８８３５、２８９１４−２８９２９、２９０２８−２９０４３；２８４８４−２８４９７、２８５４６−２８５５９、２８８２２−２８８３５、２８９１６−２８９２９、２９０３０−２９０４３；２８１４２−２８１６１、２８１４４−２８１６１、２８１４５−２８１６０、２８１４７−２８１６０位からなる群から選択される配列番号１の領域に少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、ＧｇａｔｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｇＡＣ（化合物９＿１）；ＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇＧＡＣ（化合物１０＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔＧＴ（化合物１１＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃＧＧＴ（化合物１２＿１）からなる群から選択され、ここで大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡ Ｃは全て５−メチルシトシンであってもよく、少なくとも１つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、ＧｇａｔｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｇＡＣ（化合物９＿１）；ＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇＧＡＣ（化合物１０＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔＧＴ（化合物１１＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃＧＧＴ（化合物１２＿１）からなる群から選択され、ここで大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡ Ｃは全て５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

さらなる態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明によるコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。

さらなる態様では、哺乳類ＰＩＡＳ４を発現する標的細胞におけるＰＩＡＳ４発現を阻害するための方法は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩または薬学的組成物を前記細胞に有効な量で投与することを含む。

さらなる態様では、本発明は、疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩または薬学的組成物の治療的または予防的有効量を投与することを含む、疾患を治療または予防するための方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、がんまたは肝線維症の治療または予防用医薬の調製のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的に許容される塩また薬学的組成物の使用を提供する。

定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者が一般に理解するものを意味する。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーと呼ばれることもある。オリゴヌクレオチドは、固相化学合成後に精製することにより、実験室で一般的に製造される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾物の配列または順序に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいてもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部または間の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重構造）を形成することができる。

有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。

連続するヌクレオチド配列
「連続するヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書において、「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＦＧ−Ｆ’ギャップマー領域などの連続するヌクレオチド配列を含み、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明においては、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方が含まれる。自然界では、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「ユニット」または「モノマー」と呼ばれ得る。

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入により、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。本明細書では、修飾ヌクレオシドという用語は、「ヌクレオシアナログ」または修飾「ユニット」または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡの糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソン・クリック塩基対を許容する場合でも、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共有結合させるホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されているものを指す。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合には、隣接するヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’のような修飾ヌクレオシドの領域内でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立ち得る。

ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性である１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合などの、天然ホスホジエステルから１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することによって決定することができ、いずれも当技術分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が修飾されており、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０、または例えば少なくとも９０％がヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルでもよいことが認識されよう。

本発明のオリゴヌクレオチドにおける使用のための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％がホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、ホスホロジチオエートヌクレオシド間結合以外に、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロジチオエートである。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート結合（単数または複数）に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および少なくとも１つのホスホジエステル結合（例えば、２、３または４ホスホジエステル結合）の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ内の連続するＤＮＡヌクレオシド間に好適には位置していない。

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーの領域Ｇなど、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員できるオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ動員領域および／またはギャップマーの領域ＦおよびＦ’のような親和性増強領域において有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦとＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含み得、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合、またはオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

ＥＰ第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間を含んでもよく、これは、ＥＰ第２７４２１３５号によれば、そうでなければＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域において例えば耐容性を示し得ることが理解される。

核酸塩基
核酸塩基という用語には、核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例：アデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例：ウラシル、チミンおよびシトシン）部分が含まれる。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と天然に存在しない変異体の両方を指す。このような変異体は、例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。

いくつかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、置換プリンまたは置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基など、修飾プリンまたはピリミジンに変更することによって修飾される。

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵによって示すことができ、ここで各文字には、同等の機能を持つ修飾核酸塩基を含まれてもよい。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５−メチルシトシンから選択される。ＬＮＡギャップマーには、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用してもよい。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを説明するために文献で使用されている用語である。

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）とアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含み得、例えば５−メチルシトシンは、シトシンの代わりにしばしば使用され、そのような用語としての相補性は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基間のワトソン・クリック塩基対形成を包含することが理解されよう（例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1参照）。

本明細書で使用される「％相補的」という用語は、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）における、連続するヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば標的配列または配列モチーフ）に相補的である、連続するヌクレオチド配列のうちのヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’と整列した場合）間で相補的である（ワトソン・クリック塩基対からの）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較では、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと呼ばれる。連続するヌクレオチド配列の相補性％の計算では、挿入や欠失は認められない。相補性を決定する際に、ワトソン・クリック塩基対を形成する核酸塩基の機能的能力が保持されている限り、核酸塩基の化学的修飾は無視されることが理解されるであろう（例えば５’−メチルシトシンは、同一性％を計算する目的でシトシンと同一であるとみなされる）。

「完全に相補的」という用語は、１００％の相補性を指す。

標的核酸（配列番号４）に完全に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１２）の例を以下に示す。
５’ ＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣ ３’ （配列番号４）
３’ ＴＧＧＣＡＧＴＧＴＧＴＡＧＧ ５’ （配列番号１２）

同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）における、連続するヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば配列モチーフ）と同一である、連続するヌクレオチド配列のうちのヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続するヌクレオチド配列ヌクレオチド配列および参照配列）間で同一である（マッチしている）整列した塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド総数で割り、１００を掛けることによって計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（マッチ数ｘ１００）／整列した領域の長さ（例：連続するヌクレオチド配列）。挿入および欠失は、連続するヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算では認められない。同一性を決定する際に、ワトソン・クリック塩基対を形成する核酸塩基の機能的能力が保持されている限り、核酸塩基の化学的修飾は無視されることが理解されるであろう（例えば５’−メチルシトシンは、同一性％を計算する目的でシトシンと同一であるとみなされる）。

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズすること」または「ハイブリダイズする」という用語は、対向する鎖の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する２つの核酸鎖（例：オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）と理解される。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強さである。それは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重になる温度である融解温度（Ｔｍ）で表される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密には比例しない（Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）［式中、Ｒはガス定数であり、Ｔは絶対温度である］による反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液の濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７°Ｃである反応に伴うエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自然発生的な反応であり、自然発生的な反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al.,1965,Chem. Comm. 36-38およびHoldgate et al.,2005, Drug Discov Todayに記載されている等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）の使用により実験で測定することができる。当業者であれば、市販の装置がΔＧ°測定のために利用可能であることを知っているであろう。ΔＧ°はまた、Sugimoto et al.,1995, Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigue et al.,2004, Biochemistry43:5388-5405によって記載されている適切に導出された熱力学的パラメータを使用する、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載されている最近傍モデルを使用することにより、数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０−３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８−３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、例えば−２５ｋｃａｌ未満などの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、−１０から−６０ｋｃａｌ、例えば−１２から−４０、例えば−１５から−３０ｋｃａｌ、または−１６から−２７ｋｃａｌ、例えば−１８から−２５ｋｃａｌなどの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＰＩＡＳ４標的核酸と呼ばれる場合がある。

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば哺乳類ＰＩＡＳ４のエクソン領域を標的とすることができ、または例えば、ＰＩＡＳ４プレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とすることができる（例えば表１を参照）。

適切には、標的核酸は、ヒトおよびサルのＰＩＡＳ４のゲノム配列、成熟ｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡ配列を提供するＰＩＡＳ４タンパク質、特に、ヒトＰＩＡＳ４などの哺乳類ＰＩＡＳ４（例えば表２および３を参照）をコードする。

いくつかの実施態様では、標的核酸は、配列番号１、２および３またはこれらの天然に存在する変異体（例えば、哺乳類ＰＩＡＳ４タンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。

標的核酸は、いくつかの実施態様において、ＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、成熟ｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡ、またはヒトＰＩＡＳ４などの哺乳類ＰＩＡＳ４タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ、例えば、配列番号１として開示されているヒトプレｍＲＮＡ配列、または配列番号２として開示されているヒト成熟ｍＲＮＡであってもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であってもよい。

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ適用の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＰＩＡＳ４標的核酸を発現している細胞におけるＰＩＡＳ４標的核酸の発現を低減することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続する配列は、典型的には、任意選択的に１または２のミスマッチを除いて、また、任意選択的に、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基または他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば領域Ｄ’またはＤ’）に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域を除いて、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合、ＰＩＡＳ４標的核酸に相補的である。

ＰＩＡＳ４のためのゲノムおよびアセンブリについてのさらなる種横断的情報を表２に、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの配列詳細を表３に示す。

注：配列番号３は複数のＮＮＮＮの領域を含み、そこではシーケンシングによって配列を正確に洗練化できなかったため、縮重配列が含まれる。疑義を避けるために、本発明の化合物は、実際の標的配列に相補的であり、したがって変性化合物ではない。

標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であり、核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列に相補的である、核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に、標的ヌクレオチド配列、標的配列または標的領域と呼ばれる場合があるいくつかの実施態様では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの連続する相補的配列よりも長く、例えば、本発明の複数のオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の標的配列などの標的核酸に相補的である連続するヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施態様では、標的配列は、ヒトとサルの間で保存されており、特に配列番号１および３に存在する配列である。ある好ましい実施態様では、そのような標的核酸配列は、配列番号４に存在する。
オリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続する核酸塩基配列を含む。連続するヌクレオチド配列は、１０‐５０ヌクレオチド、例えば１２‐３０、例えば１４‐２０、例えば１５‐１８の間の連続するヌクレオチドである。

本発明の一実施態様において、標的配列は配列番号４である。

本発明の別の実施態様において、標的配列は配列番号１３である。

反復標的領域
標的領域または標的配列は、標的核酸に固有のものであってもよい（一度だけ存在する）。

本発明のいくつかの態様において、標的領域は、標的核酸の範囲にわたって少なくとも２回反復される。本発明に包含されるように反復されるとは、異なる位置で標的核酸中に存在する、少なくとも１０、例えば少なくとも１１または少なくとも１２ヌクレオチド長の、少なくとも２つの同一のヌクレオチド配列（標的領域）があることを意味する。各反復標的領域は、標的核酸の連続する配列上の少なくとも１つの核酸塩基によって同一領域から分離されており、標的核酸内の重複しない異なる位置に位置している。

標的細胞
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施態様では、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏであってよい。いくつかの実施態様では、標的細胞は、例えばマウス細胞またはラット細胞などのげっ歯類細胞のような哺乳動物細胞、またはサル細胞もしくはヒト細胞などの霊長類細胞である。

好ましい実施態様では、標的細胞は、ＰＩＡＳ４プレｍＲＮＡまたはＰＩＡＳ４成熟ｍＲＮＡなどのＰＩＡＳ４ ｍＲＮＡを発現する。ＰＩＡＳ４ ｍＲＮＡのポリＡテールは、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

天然に存在する変異体
「天然に存在する変異体」という用語は、ＰＩＡＳ４遺伝子の変異体または転写物であって、標的核酸と同じ遺伝子座に由来し、かつ標的核酸と同じ染色体位置および方向からの指向性転写物であるが、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多様性を引き起こす遺伝暗号の縮重のために、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシングもしくは、一塩基多型などの多型および対立遺伝子変異体の存在のために、異なることがあるＧＳＫ３Ｂ遺伝子の変異体または転写物を指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸およびその天然に存在する変異体を標的とすることができる。

いくつかの実施態様では、天然に存在する変異体は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸、例えば配列番号１、２および３からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。

発現の調節
本明細書で使用される「発現の調節」という用語は、オリゴヌクレオチドの投与前のＰＩＡＳ４の量と比較したときに、ＰＩＡＳ４の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された標的細胞であると一般的に理解されている。

本発明による調節は、例えばｍＲＮＡの分解または転写の遮断によって、ＰＩＡＳ４の発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、低減、低下、回避または終了させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力として理解されるべきである。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは修飾ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔ^ｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドあたり、好ましくは＋０．５から＋１２℃、より好ましくは＋１．５から＋１０℃、最も好ましくは＋３から＋８℃の間の融解温度の増加をもたらす。多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例： Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213参照）。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。

リボース糖部分を修飾したヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として数多く作製されてきた。

このような修飾には、リボース環構造が修飾されたもの、例えばヘキソース環との置換によって修飾されたもの（ＨＮＡ）、または典型的にはリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素の間にビラジカルブリッジ（biradicle bridge）を有する二環式環（ＬＮＡ）、または典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素の間に結合を欠いた未結合のリボース環（例：ＵＮＡ）が含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）またはトリシクロ核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されているヌクレオシドを含む。

糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに自然に見られる２’−ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’の位置に導入されてもよい。修飾糖部分を有するヌクレオシドには、２’置換ヌクレオシドなどの２’修飾ヌクレオシドも含まれる。２’置換ヌクレオシドの開発は多くの注目を集めており、実際、複数の２’置換ヌクレオシドで、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、ヌクレオシド耐性の強化や親和性の強化などの有益な特性を持つことが明らかにされた。

２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドとは、２’位置にＨもしくは−ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、または２’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する強化された結合親和性および／または強化されたヌクレアーゼ耐性を提供し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下に、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの図を示す。

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を結合するビラジカル（「２’−４’ブリッジ」とも呼ばれる）を含む２’−修飾ヌクレオシドであり、リボース環の立体配座を制限またはロックする。これらのヌクレオシドは、文献では、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれている。リボースの立体配座のロックは、ＬＮＡが相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれるときのハイブリダイゼーションの親和性の強化（二重安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／補体二本鎖の融解温度を測定することによって常套的に決定することができる。

ＬＮＡヌクレオシドの非限定的な例は、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９、Morita et al.,Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al.,J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁、およびMitsuoka et al.,Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

２’−４’ブリッジは、２‐４個の架橋原子を含み、特に、ＸがＣ４’に結合し、ＹがＣ２’に結合している式−Ｘ−Ｙ−のものであり、
上式中、
Ｘは酸素、硫黄、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ^ａ−；−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり；
Ｙは酸素、硫黄、−（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−、−ＮＲ^ａ−、−Ｃ（＝Ｊ）−、Ｓｅ、−Ｏ−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−または−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であるが；
ただし、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−Ｏ−、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−ＳＯ_２−ＳＯ_２−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−または−Ｓｅ−Ｓｅ−ではないことを条件とし；
Ｊは酸素、硫黄、＝ＣＨ_２または＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、−ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、−ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄおよび−ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから選択され；
あるいは、２つのジェミナルＲ^ａおよびＲ^ｂは一緒になって、場合によって置換されているメチレンを形成し；
あるいは、２つのジェミナルＲ^ａおよびＲ^ｂは、それらが結合している炭素原子と一緒になって、−Ｘ−Ｙ−；の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリール、およびヘテロアリールら独立に選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびメチレンであり；
Ｘ^ａは酸素、硫黄または−ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは独立に、水素およびアルキルから選択され；かつ、
ｎは１、２または３である。

本発明のさらなる特定の実施態様では、Ｘは酸素、硫黄、−ＮＲ^ａ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−、特に酸素、硫黄、−ＮＨ−、−ＣＨ_２−または−Ｃ（＝ＣＨ_２）−、とりわけ酸素である。
本発明の別の特定の実施態様では、Ｙは−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、特に−ＣＨ_２−ＣＨＣＨ_３−、−ＣＨＣＨ_３−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ−、−Ｓ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ^ａ）−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−である。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキルからなる群から選択される。

本発明の別の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチルおよび−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、特に水素、フルオロ、メチルおよび−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３からなる群から選択される。

有利には、−Ｘ−Ｙ−のＲ^ａおよびＲ^ｂのうちの１つは、上で定義された通りであると同時に、他方は全て水素である。

本発明のさらなる特定の実施態様では、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^ｂまたは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素である。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。

本発明のある特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時にメチルである。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ_２−、−Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｎ（ＯＣＨ_３）ＣＨ_２−または−Ｎ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−であり；
本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、および−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３からなる群から選択される。

特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ_２−または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、特に−Ｏ−ＣＨ_２−である。

２’−４’ブリッジは、式（Ａ）および式（Ｂ）でそれぞれ例示されるように、リボース環の平面の下（ベータ−Ｄ−配置）または該環の平面の上（アルファ−Ｌ−配置）のいずれかに配置されていてもよい。

本発明によるＬＮＡヌクレオシドは、特に式（Ａ）または（Ｂ）のものである。

［上式中、
Ｗは酸素、硫黄、−Ｎ（Ｒ^ａ）−または−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、特に酸素であり；
Ｂは核酸塩基または修飾核酸塩基であり；
Ｚは隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ^＊は隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は独立に、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミルおよびアリールから選択され；
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは上で定義した通りである。

特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。さらなる特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時にメチルである。

さらなる特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時にメチルである。

さらなる特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが水素である。ある特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時にメチルである。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は独立に、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから選択される。

本発明のさらなる特定の有利な実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。

本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方が水素であり、他方は上で定義した通りであり、特にアルキル、とりわけメチルである。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^５およびＲ^５＊は独立に、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキルおよびアジドか et al.,特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチルおよびアジドから選択される。本発明の特に有利な実施態様では、Ｒ^５およびＲ^５＊ｉの一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチルまたはアジドであり；あるいはＲ^５およびＲ^５＊は両方が同時に水素またはハロゲンであり、特に両方が同時に水素またはフルオロである。このような特定の実施態様では、Ｗは有利には酸素であり、−Ｘ−Ｙ−は有利には−Ｏ−ＣＨ_２−である。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号および国際公開第２００４／０４６１６０号（これは全て参照により本明細書に援用される）に開示されており、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして当技術分野で一般に知られているものを含む。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第９９／０１４２２６号および国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第９９／０１４２２６号および国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−または−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第００／０４７５９９号およびMorita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76に開示されており、２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として当技術分野で一般に知られているものを含む。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方が水素であり、他方は水素ではなく、例えばアルキル、例えばメチルである。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／１３４１号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、ここでＲ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方が水素であり、他方は水素ではなく、特にアルキル、例えはメチルである。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲ^ａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０３６６９８号および国際公開第２００７／０９００７号に開示されている。そのような６’−置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒ^ａは特にＣ_１−Ｃ_６アルキル、例えばメチルである。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−（「２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸」、Seth et al.,, J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁）である。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−（「２’Ｏ−エチル二環式核酸」、Seth et al.,, J. Org. Chem. 2010, 第75(5)巻、1569-81頁）である。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野で環状ＭＯＥｓ（ｃＭＯＥ）としても知られており、国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−である。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−（Ｓｅｔｈ et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010）である。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのような６’−メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野でｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／０９００７１号（ベータ−Ｄ）および国際公開第２０１０／０３６６９８号（アルファ−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）−ｃＥＴまたは（Ｒ）−ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれでもよい。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、ここでＲ^ａもＲ^ｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時にアルキルであり、特に両方が同時にメチルである。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／００６４７８号に開示されている。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲ^ａ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのような６’−置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１１／１５６２０２号に開示されている。そのような６’−置換チオＬＮＡの特定の実施態様では、Ｒ^ａはアルキル、特にメチルである。

本発明の別の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−または−Ｃ（＝ＣＦ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。有利には、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。特に、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方が同時に水素もしくはメチルであるか、またはＲ^ａおよびＲ^ｂの一方が水素であり、他方がメチルである。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、いずれも参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１５４４０１号および国際公開第２００９／０６７６４７号に開示されている。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（ＯＲ^ａ）−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒ^ａはメチルなどのアルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されている。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−Ｎ（Ｒ^ａ）−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−Ｏ−、−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−または−ＮＲ^ａ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。有利には、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。特定の実施態様では、Ｒ^ａはメチルなどのアルキルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素である（Seth et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010）。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−である（Seth et al.,前掲書、J. Org. Chem 2010）。

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^５およびＲ^５＊は両方が同時に水素である。本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルである。そのような実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は特に水素であり、−Ｘ−Ｙ−は特に−Ｏ−ＣＨ_２−または−Ｏ−ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３−、例えば−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−である。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、例えば−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。そのような特定の実施態様では、Ｒ^ａは特にメチルなどのアルキルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／０３６８６８号に開示されている。

本発明の特定の実施態様では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−Ｏ−ＣＲ^ａＲ^ｂ−、例えば−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は全て同時に水素である。有利には、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立に、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから選択される。そのような特定の実施態様では、Ｒ^ａは特にメチルなどのアルキルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、参照により本明細書に援用されるMitsuoka et al.,Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

特に明記しない限り、ＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄまたはアルファ−Ｌ立体異性体であってもよいことが認識されよう。

本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例は、スキーム１に示されている（ここでＢは、上で定義した通りである）。

特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。

本発明の出発物質または化合物の１つが１つまたは複数の反応工程の反応条件下で不安定または反応性である１つまたは複数の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、T. W. GreeneおよびP. G. M. Wutsによる「Protective Groups in Organic Chemistry」第3版, 1999, Wiley, New Yorkに記載されているもの）を、当技術分野で既知の方法を適用する重要な工程の前に導入することができる。このような保護基は、合成の後の段階で、前記文献に記載されている標準的な方法を用いて除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。

本明細書に記載の化合物は、いくつかの不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ化合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオマラセミ化合物、またはジアステレオマラセミ化合物の混合物などのエナンチオマーの混合物の形態で存在し得る。

「不斉炭素原子」という用語は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレローグ則によると、不斉炭素原子は「Ｒ」または「Ｓ」配置にすることができる。

化学基の定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独でまたは組み合わせて、１から８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１から６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、とりわけ１から４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ_１−Ｃ_８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル異性体、ヘキシル異性体、ヘプチル異性体およびオクチル異性体、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチルおよびプロピルである。

「シクロアルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、３から８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３から６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、特にシクロプロピルおよびシクロブチルである。シクロアルキルの特定の例はシクロプロピルである。

「アルコキシ」という用語は、単独または組み合わせて、式アルキル−Ｏ−の基を意味し、ここで「アルキル」という用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシおよびｔｅｒｔ．ブトキシなどの以前に与えられた意味を有する。特定の「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。

オキシという用語は、単独でまたは組み合せて、−Ｏ−基を意味する。

用語「アルケニル」は、単独でまたは組み合わせて、オレフィン結合と８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニルおよびイソブテニルである。

用語「アルキニル」は、単独でまたは組み合わせて、三重結合と８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。

「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、とりわけフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組み合わせて、少なくとも１つのハロゲンによる前記基の置換、特に１から５個のハロゲン、特に１から４個のハロゲン、すなわち１、２、３または４個のハロゲンで置換されたものを表す。

「ハロアルキル」という用語は、単独または組み合わせて、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１から５個のハロゲン、特に１から３個のハロゲンで置換されたアルキル基を示す。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−またはトリフルオロメチル、−エチルまたは−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチルまたはトリフルオロメチルを含む。フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルは特定の「ハロアルキル」である。

「ハロシクロアルキル」という用語は、単独または組み合わせて、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１から５個のハロゲン、特に１から３個のハロゲンで置換された上で定義したシクロアルキル基を表す。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。

「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＯＨ基を意味する。

「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＳＨ基を意味する。

カルボニルという用語は、単独でまたは組み合せて、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。

「カルボキシ」または「カルボキシル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＣＯＯＨ基を意味する。

「アミノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、第一級アミノ基（−ＮＨ_２）、第二級アミノ基（−ＮＨ−）または第三級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。

「アルキルアミノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、上で定義した１つまたは２つのアルキル基で置換された、上で定義したアミノ基を意味する。

「スルホニル」という用語は、単独または組み合わせて、−ＳＯ_２基を意味する。

「スルフィニル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＳＯ−基を意味する。

「スルファニル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−Ｓ−基を意味する。

「シアノ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＣＮ基を意味する。

「アジド」という用語は、単独または組み合わせて、−Ｎ_３基を意味する。

「ニトロ」という用語は、単独でまたは組み合わせて、ＮＯ_２基を意味する。

「ホルミル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。

「カルバモイル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基を意味する。

「カバミド」という用語は、単独でまたは組み合わせて、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ_２基を意味する。

用語「アリール」は、単独または組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される１から３個の置換基で場合によって置換されている、６から１０個の炭素環原子を含む一価の芳香族炭素環式単環または二環系を表す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。

用語「ヘテロアリール」は、単独でまたは組み合わせて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素であり、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される１から３個の置換基で場合によって置換されている、５から１２個の環原子からなる一価の芳香族複素環式単環または二環系を表す。ヘテロアリールの例は、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルを含む。

用語「ヘテロシクリル」は、単独でまたは組み合わせて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素であり、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立に選択される１から３個の置換基で場合によって置換されている、４から１２個、特に４から９個の環原子からなる一価の飽和もしくは部分不飽和単環または二環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルまたは３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。

薬学的に許容される塩
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的有効性と、遊離塩基または遊離酸の特性とを保持する塩であって、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではないものを指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステイン等の有機酸により形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸に無機塩基または有機塩基を添加することから調製され得る。無機塩基から誘導される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩を含むが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、限定されないが、一級、二級および三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニンＮ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれる。式（Ｉ）の化合物は、両性イオンの形態で存在することもできる。式（Ｉ）の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。

保護基
用語「保護基」は、単独または組み合わせて、別の非保護反応部位において選択的に化学反応を実施できるように、多官能化合物の反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。

ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的ヌクレオチド配列と二本鎖を形成するときに、相補的ヌクレオチド配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅ Ｈなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５または６のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーによって片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。

ＲＮａｓｅ Ｈ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的ＲＮＡ分子との二本鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供し、この方法はＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用することができる。通常、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を有するときに、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、かつ、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に援用される）の実施例９１−９５によって提供される方法を用いたときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％以上の、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定される初期測度を有する場合、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を有するとみなされる。ＲＮａｓｅ（ＲＨａｓｅ） Ｈ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１がスイスのルツェルンのＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨから入手可能である。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列はギャップマーであり得る。アンチセンスギャップマーは、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するために一般的に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、‘５−＞３’方向で、５’フランク、ギャップ、および３’フランクの少なくとも３つの異なる構造領域、Ｆ−Ｇ−Ｆを含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続するＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域の隣には、１または複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フ
ランキング領域（Ｆ）と、１または複数の糖修飾ヌクレオシドド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）とがある。領域ＦおよびＦ’における１または複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（すなわち、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’における１または複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡおよび２’−ＭＯＥから独立に選択される高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の５’および３’末端のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。これらのフランクは、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に、少なくとも１の糖修飾ヌクレオシドを有することでさらに定義することができる。

領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は連続するヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。

ギャップマー設計−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば、１３から２４、１４から２２ヌクレオシド、１から１７、１６から１８ヌクレオシド等の１２から３２ヌクレオシドであり得る。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式：
Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_１−８、例えば
Ｆ_１−８−Ｇ_７−１６−Ｆ’_２−８
によって表すことができるが、但し、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さであることを条件とする。

領域Ｆ、ＧおよびＦ’は以下でさらに定義され、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式に組み込むことができる。

ギャップマー−領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがヒトＲＮａｓｅ Ｈ１などのＲＮａｓｅＨ（通常はＤＮＡヌクレオシド）を動員できるようにするヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二本鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切には、ギャップマーは、少なくとも５または６の連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば５−１６の連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば６−１５の連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば７−１４の連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば８−１２の連続するＤＮＡヌクレオチド、例えば８−１２の連続するＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施態様では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続するＤＮＡヌクレオシドから構成される。ギャップ領域内のシトシン（Ｃ）ＤＮＡはメチル化されている場合があり、そのような残基は５−メチル−シトシン（^ｍｅＣ、またはｃの代わりにｅを有する）としてアノテーションが付けられる。ギャップでのシトシンＤＮＡのメチル化は、潜在的な毒性を低減するためにＣＧジヌクレオチドがギャップに存在する場合に有利であり、修飾はオリゴヌクレオチドの最大効果に大きな影響を及ぼさない。

いくつかの実施態様では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続するホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドから構成され得る。いくつかの実施態様では、ギャップ内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有する一方で、ギャップ領域内に使用されたときにＲＮａｓｅＨを動員することを可能にする修飾ヌクレオシドの複数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨを動員することが可能であると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えばアルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（いずれも参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＥＰ第２００９／０５０３４９号およびVesterら.、Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300に記載）、ＡＮＡおよび２’Ｆ−ＡＮＡのようなアラビノース由来のヌクレオシド（Mangos et al.,2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、ＵＮＡ（アンロック核酸）（参照により本明細書に援用されるFluiter et al.,Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載）が含まれる。ＵＮＡは、ロックされていない核酸で、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去された、アンロックされた「糖」残基を形成するアンロック核酸である。このようなギャップマーで使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されたときに２’エンド（ＤＮＡ様）構造、すなわちＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾を採用するヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、ギャップ領域に導入されたときに２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用する１から３の糖修飾ヌクレオシドを場合によって含んでもよい。

領域Ｇ−「ギャップブレーカー」
代替的には、ＲＮａｓｅＨ活性をある程度保持しつつ、３’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシドをギャップマーのギャップ領域に挿入した報告が複数ある。このような、１または複数の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊型」ギャップマーと呼ばれており、例えば国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、配列特異的、または化合物特異的でさえある（いくつかの例では標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している、Rukov et al.,2015 Nucl. Acids Res. 第43巻、8476-8487頁を参照）。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）もしくは２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの３’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシド、またはベータ−ＤＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間のブリッジがベータ立体配座にある）、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。

上記の領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊型ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドと、ギャップの３’末端（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドとを有している。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４の連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。

ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計には、
Ｆ_１−８−［Ｄ_３−４−Ｅ_１−Ｄ_３−４］₋Ｆ’_１−８
Ｆ_１−８−［Ｄ_１−４−Ｅ_１−Ｄ_３−４］−Ｆ’_１−８
Ｆ_１−８−［Ｄ_３−４−Ｅ_１−Ｄ_１−４］−Ｆ’_１−８
が含まれ、上式中、領域Ｇは括弧［Ｄ_ｎ−Ｅ_ｒ−Ｄ_ｍ］内にあり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続する配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦとＦ’は本明細書で定義されているフランキング領域であるが、但しギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

いくつかの実施態様では、ギャップ破壊型ギャップマーの領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のＤＮＡヌクレオシドなど、少なくとも６のＤＮＡヌクレオシドを含む。上記のように、ギャップ領域ＧがＲＮａｓｅＨ動員を媒介することができるという条件で、ＤＮＡヌクレオシドは連続していてもよいし、または場合によって１もしくは複数の修飾ヌクレオシドが散在していてもよい。

ギャップマー−フランキング領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ近くに隣接して配置される。領域Ｆの３’末端のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。

領域Ｆは、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ近くに隣接して配置される。領域Ｆの５’末端のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。

領域Ｆは、１−８の連続するヌクレオチド長、例えば２−６、例えば３−４の連続するヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの５’末端のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’末端の２つのヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’末端のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’末端の２つのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’末端の２つのヌクレオシドは、２つの３’ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’末端のヌクレオシドは、ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、２−８の連続するヌクレオチド長、例えば３−６、例えば４−５の連続するヌクレオチド長である。有利には、実施態様では、領域Ｆ’の３’末端のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’末端の２つのヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’末端の２つのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’末端のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’末端の２つのヌクレオシドは、２つの３’ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’末端のヌクレオシドは、ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。

領域ＦまたはＦ’の長さが１である場合、それは有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに留意されたい。

いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’は独立に、糖修飾ヌクレオシドの連続する配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施態様では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、および２’−フルオロ−ＡＮＡユニットから独立に選択されてもよい。

いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’は独立に、ＬＮＡと２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウィング設計）。

いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’は、ＭＯＥのみ、またはベータ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみなど、糖修飾ヌクレオシドの１つのタイプのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも呼ばれる。

いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の全てのヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立に選択されるようなＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆは、１−５、例えば２−４、例えば３−４、例えば１、２、３、４または５の連続するＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の全てのヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の全てのヌクレオシドは、ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆは１、２、３、４、５、６、７または８の連続するＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、フランキング領域の１つのみが、ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなることができる。いくつかの実施態様では、それは、ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなる５’（Ｆ）フランキング領域であり、一方、３’（Ｆ’）フランキング領域は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドなどの少なくとも１のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、それは、ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなる３’（Ｆ’）フランキング領域であり、一方、５’（Ｆ）フランキング領域は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドなどの少なくとも１のＬＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立に選択されるようなＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によってＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい（交互フランク；詳細についてはこれらの定義を参照のこと）。いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によってＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい（交互フランク；詳細についてはこれらの定義を参照のこと）。

いくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の５’末端および３’末端ヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施態様では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

さらなるギャップマー設計は、参照により本明細書に援用される国際公開第２００４／０４６１６０号、同第２００７／１４６５１１号および同第２００８／１１３８３２号に開示されている。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれかまたは両方がＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれらからなるギャップマーである。ベータ−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれかまたは両方がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれらからなるギャップマーである。

いくつかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１-５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］_１−５のものであり、式中、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義で定義される通りである。

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施態様では、ＭＯＥギャップマーは、例えば［ＭＯＥ］_２−７−［領域Ｇ］_５−１６−［ＭＯＥ］_２−７、例えば［ＭＯＥ］_３−６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_３−６のような設計［ＭＯＥ］_１−８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_１−８のものであり、領域Ｇは、ギャップマーの定義で定義されている。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）のＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されてきた。

混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーはＬＮＡギャップマーであり、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニットおよび２’−フルオロ−ＡＮＡユニットからなる群から独立に選択される２’置換ヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含む。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１のＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立に選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２のＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立に選択される。いくつかの混合ウィングの実施態様では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方は、１または複数のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

混合ウィングギャップマー設計は、いずれも参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／０４９０８５号および同第２０１２／１０９３９５号に開示されている。

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む場合があり、ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むため、「交互フランク」と呼ばれる。そのような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）フランクギャップマー」は、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方が少なくとも３のヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の５’および３’末端ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。

交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。

交互フランクを持つオリゴヌクレオチドは、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方が少なくとも３のヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の５’および３’末端ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施態様では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３のヌクレオシドを含み、ＦまたはＦ’領域の５’および３’末端のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方含むフランキング領域は、ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、交互フランクと呼ばれる。交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。

交互フランク領域は、３までの連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば１から２、または１もしくは２もしくは３の連続するＤＮＡヌクレオシドを含み得る。

交互フランクは、ＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）の数に続いてＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す一連の整数としてアノテーションを付けることができ、例えば
［Ｌ］_１−３−［Ｄ］_１−４−［Ｌ］_１−３
［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２

オリゴヌクレオチド設計では、これらは通常、２−２−１が５’［Ｌ］_２−［Ｄ］_２−［Ｌ］３’を表し、１−１−１−１−１が５’［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］３’を表すように、数字で表される。交互のフランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランク（領域ＦおよびＦ’）の長さは、独立に、３−１０ヌクレオシド、例えば４−８、例えば５−６ヌクレオシド、例えば４、５、６または７修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチドのフランクの一方のみが交互であり、他方のフランクはＬＮＡヌクレオチドで構成されている。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２のＬＮＡヌクレオシドを有することが有利なこともある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例には以下のものがある：
［Ｌ］_１−５−［Ｄ］_１−４−［Ｌ］_１−３−［Ｇ］_５−１６−［Ｌ］_２−６
［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−２−［Ｌ］_１−２−［Ｇ］_５−１６−［Ｌ］_１−２−［Ｄ］_１−３−［Ｌ］_２−４
［Ｌ］_１−５−［Ｇ］_５−１６−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］_２
ただし、ギャップマーの全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、ギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、さらに５’および／または３’ヌクレオシドなどの、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもなくてもよい。そのようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書において領域Ｄ’およびＤ’’と呼ばれ得る。

領域Ｄ’またはＤ’’の追加は、ギャップマーなどの連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分または別の官能基に結合する目的で使用することができる。連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合するために使用される場合、生体切断可能（ｂｉｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーとして機能し得る。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

領域Ｄ’とＤ’’は、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端にそれぞれ接続して、次の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’またはＤ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’の設計を生成できる。この例では、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ’’はオリゴヌクレオチドの別の部分を構成する。

領域Ｄ’またはＤ’’は独立に、標的核酸に対して相補的または非相補的であり得る、１、２、３、４または５の追加のヌクレオチドを含み得るかまたはそれらからなり得る。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの塩基修飾型ではない。Ｄ’またはＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能リンカーとして機能し得る（リンカーの定義を参照）。いくつかの実施態様では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結されており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’またはＤ’’としての使用に適したヌクレオチドベースの生体切断可能リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには、例として、ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能リンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、単一のオリゴヌクレオチド内の複数のアンチセンス構築物（例：ギャップマー領域）を結合するために使用される。

一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続するヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ’’を含む。

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる。
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’_１−３−Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８−Ｄ’’_１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’_１−３−Ｆ_１−８−Ｇ_５−１６−Ｆ’_２−８−Ｄ’’_１−３

いくつかの実施態様では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合されたオリゴヌクレオチドを指す。

本発明のオリゴヌクレオチドの１つ以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えばオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドの薬理を改善し得る。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変または増強する。特に、該コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、該コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えばオフターゲット活性または非標的細胞型、組織または器官における活性を低下させるのに役立ち得る。参照により本明細書に援用される国際公開第９３／０７８８３号および国際公開第２０１３／０３３２３０は、適切なコンジュゲート部分を提供する。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合することが可能なものである。特に、三価のＮ−アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒｒへの結合に適している。例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号および国際公開第２０１４／１７９６２０号（参照により本明細書に援用される。特に国際公開第２０１４／０７６１９６号の図１３、または国際公開第２０１４／１７９６２０号の請求項１５８−１６４）。

オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその合成は、Ｍａｎｏｈａｒａｎによる包括的なレビュー、Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001およびManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103（それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）でも報告されている。

ある実施態様では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばカプシド）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

リンカー
結合またはリンカーは、１つまたは複数の共有結合を介して目的の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接または連結部分（例えばリンカーまたはテザー）を介して結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を第１の領域、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合させる役割を果たし、これにより、領域Ａの一方の末端をＣに接続している。

本発明のいくつかの実施態様において、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／もしくは領域Ｙ）とコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）を場合によって含んでいてもよい。

領域Ｂは、哺乳類の体内で通常遭遇する条件またはそれに類似する条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むかまたはそれからなる生体切断可能リンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば切断）を受ける条件には、例えば、哺乳動物細胞で見られるｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤および塩濃度、またはそれらに類似するもの等の化学条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼ等の哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生体切断可能リンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断されやすい。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオシドなど、１から１０の間のヌクレオシド、より好ましくは２から６の間のヌクレオシド、最も好ましくは２から４の間の、例えば少なくとも３または４または５の連続するホスホジエステル結合など、少なくとも２の連続するホスホジエステル結合を含む結合されたヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。生体切断可能リンカーを含有するホスホジエステルは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に援用され）により詳しく開示されている。

コンジュゲートはまた、非生体切断可能リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合されてもよく、またはいくつかの実施態様では、コンジュゲートは、生体切断可能リンカーに共有結合される非切断可能リンカー（領域Ｙ）を含んでもよい。必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合する役割を果たすリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基等の反復単位の鎖状構造またはオリゴマーを含む場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、次の領域要素、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。いくつかの実施態様では、非切断可能リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６−Ｃ１２アミノアルキル基を含む、Ｃ２−Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施態様では、該リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドとコンジュゲート基上の活性化エステル基との使用を介して、オリゴヌクレオチドに常套的に結合され得る。

治療
本明細書で使用される「治療」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の防止、すなわち予防の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施態様では、予防的であり得ることが認識されるであろう。

本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＰＩＡＳ４の発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドに関する。該阻害は、ＰＩＡＳ４をコードするか、またはＰＩＡＳ４の制御に関与する標的核酸にハイブリダイズすることにより達成することができる。標的核酸は、配列番号１、２および３からなる群から選択される配列などの哺乳類ＧＳＫ３Ｂ配列であり得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＩＡＳ４を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的発現を阻害または低減することにより、標的の発現を調節することができる。好ましくは、このような発現の阻害は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の阻害である。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨｅＬａ細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＩＡＳ４ ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％または７０％阻害することが可能であり得る。いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、ＨｅＬａ細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＩＡＳ４タンパク質の発現レベルを少なくとも５０％阻害することが可能であり得る。適切には、実施例は、ＰＩＡＳ４ ＲＮＡまたはタンパク質阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば実施例１）。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＰＩＡＳ４発現の所望の調節を示すのに依然十分であり得る。ミスマッチに起因する結合親和性の低下は、有利には、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数の増加によって、および／または、例えば、オリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドなど、標的に対する結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数の増加によって補償され得る。

本発明の一態様は、哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１０−３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０−５０、例えば１０−３０ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸の発現を減少させることができる。

本発明のある態様は、哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸に対する、例えば完全な相補性など、少なくとも９０％の相補性を有する、１０−２２ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０−３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸の発現を減少させることができる。

本発明の別の態様は、連続するヌクレオチド配列が、哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸のプレｍＲＮＡ（例えば配列番号１）に存在するイントロン領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸または標的配列と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％または１００％相補的である連続する配列を含む。

好ましい実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、標的核酸または標的配列に対して完全に相補的（１００％相補的）であるか、またはいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つまたは２つのミスマッチを含み得る。

本発明の別の態様は、連続するヌクレオチド配列が配列番号１、２または３からなる群から選択される配列またはその天然に存在する変異体に少なくとも９０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号３に存在する対応する標的配列に少なくとも９０％相補的または少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続する配列は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸に完全に相補的である。

好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号８に存在する対応する標的配列に１００％相補的である。別の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１から８に存在する対応する標的核酸領域に１００％相補的である。

本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、連続するヌクレオチド配列は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のプレｍＲＮＡ（例えば配列番号１）に存在するイントロン領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

配列番号１上のイントロンの位置は、ＰＩＡＳ４プレｍＲＮＡの異なるスプライシングに応じて異なり得ることが理解されるべきである。本発明の文脈において、最終ＲＮＡ産物（成熟ｍＲＮＡ）の成熟中にＲＮＡスプライシングによってプレｍＲＮＡから除去される遺伝子配列またはプレｍＲＮＡ中の任意のヌクレオチド配列は、配列番号１上のそれらの位置に関係なくイントロンである。表１は、配列番号１の最も一般的なイントロン領域を示している。

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、イントロン１（配列番号１の１４３-５２７７）；イントロン２（配列番号１の５７０５-１６３９０）；イントロン３（配列番号１の１６４７６-２０５００）；イントロン４（配列番号１の２０５４３−２０８６４）；イントロン５（配列番号１の２０９５６-２１０７４）；イントロン６（配列番号１の２１２０４−２１２８５）；イントロン７（配列番号１の２１３９０−２５４５４）；イントロン８（配列番号１の２５５２９−２５７７４）；イントロン９（配列番号１の２５９３６−２９７２８）およびイントロン１０（配列番号１の２９８６０−２９９７０）から選択されるヒトＰＩＡＳ４のプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全相補的である。

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のヒトプレｍＲＮＡのイントロン９、例えば哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のヒトプレｍＲＮＡのヌクレオチド（ｎucleotides human pre-mRNA）、例えば配列番号１のヌクレオチド２５９３６−２９７２８（nucleotides 25936 - 29728 of SEQ ID NO 1）に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全相補的である。

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のヒトプレｍＲＮＡのイントロン９、例えば哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸のヒトプレｍＲＮＡのヌクレオチド、例えば配列番号１のヌクレオチド２８４７８−２９０４３に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全相補的である。

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号４に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施態様では、連続するヌクレオチド配列は、配列番号１３に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、配列番号１の２８４７８−２８４９７、２８５４０−２８５５９、２８８１６−２８８３５、２８９１０−２８９２９、２９０２４−２９０４３；２８４７８−２８４９５、２８５４０−２８５５７、２８６９６−２８７１３、２８８１６−２８８３３、２８９１０−２８９２７、２９０２４−２９０４１；２８４８２−２８４９７、２８５４４−２８５５９、２８８２０−２８８３５、２８９１４−２８９２９、２９０２８−２９０４３；２８４８４−２８４９７、２８５４６−２８５５９、２８８２２−２８８３５、２８９１６−２８９２９、２９０３０−２９０４３；２８１４２−２８１６１、２８１４４−２８１６１、２８１４５−２８１６０、２８１４７−２８１６０位からなる群から選択される標的核酸の領域に相補的である。

本発明の一態様によれば、標的配列は標的核酸内で反復され、すなわち、少なくとも１０ヌクレオチド長の、少なくとも２つの同一の標的ヌクレオチド配列（標的領域）が標的核酸内の異なる位置で生じる。反復標的領域は、一般に、１０−５０ヌクレオチドの間、例えば１１−３０ヌクレオチドの間、例えば１２−２５ヌクレオチドの間、例えば１３−２２ヌクレオチドの間、例えば１４−２０ヌクレオチドの間、例えば１５−１９ヌクレオチドの間、例えば１６−１８ヌクレオチドの間である。好ましい実施態様では、反復標的領域は、１４−２０ヌクレオチドの間である。

一態様では、本発明は、連続するヌクレオチド配列が、配列番号１の標的核酸にわたって少なくとも２回反復される標的領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この効果は、（同じ配列を持つ）複数のオリゴヌクレオチド化合物が同じ標的核酸上の１つ以上の標的領域に（同時に）ハイブリダイズでき、これにより、オリゴヌクレオチドを細胞または動物またはヒトに投与したとき、標的核酸の複数の切断事象が発生する可能性があることである。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列は、少なくとも３の反復標的領域、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９または１０の反復標的領域、または１０を超える反復標的領域に対して少なくとも９０％の相補的、例えば完全に相補的である。

さらなる実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１の標的核酸のうちの１０−２２、例えば１４−２０ヌクレオチド長の標的領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、該標的領域は、標的核酸のイントロンにわたって少なくとも２回以上反復される。

いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号１３の少なくとも５の反復標的領域に相補的である。

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０−３５ヌクレオチド長、例えば１０−３０、例えば１１−２２、例えば１２−２０、例えば１４−１８または１４−１６の連続するヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。有利には、オリゴヌクレオチドは、１４−２０ヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。

本明細書で与えられる任意の範囲は、範囲の終点を含むことが理解される。

いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１８未満、例えば１４、１５、１６または１７のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。

いくつかの実施態様では、本発明の連続するヌクレオチド配列は、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一性、例えば１００％同一性を有する、１０−３０のヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる。

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号９、１０、１１および１２から選択される配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１２−２０の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号９、１０、１１および１２から選択される配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、１４−２０の連続するヌクレオチド長からなるか、またはそれらを含む。

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号９および１０から選択される配列を含む。

いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、配列番号１１および１２から選択される配列を含む。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表され、好ましくは、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。連続する核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸への結合親和性を増加させるために修飾され得ることが理解される。修飾は、定義および以下の段落に記載される。表４に、各モチーフ配列の好ましい設計を示す。

連続する核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸への結合親和性を増加させるために修飾され得ることが理解される。修飾は、定義および以下の段落に記載される。表４に、各モチーフ配列の好ましい設計を示す。

修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と呼ばれる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。有利には、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。

ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６の修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１−１０の修飾ヌクレオシド、例えば２−９の修飾ヌクレオシド、例えば３−８の修飾ヌクレオシド、例えば４−７の修飾ヌクレオシド、例えば６または７の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「定義」セクションの「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、および「ロックド核酸（ＬＮＡ）」に記載されている。

ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１または複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アルビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立に選択される１または複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。１または複数の修飾ヌクレオシドがロックド核酸（ＬＮＡ）である場合が有利である。

さらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１の修飾ヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間修飾は、「定義」セクションの「修飾ヌクレオシド間結合」に記載されている。連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、例えば全部がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であると、有利である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの連続する配列中の全てのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１のＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７または８のＬＮＡヌクレオシド、例えば２−６のＬＮＡヌクレオシド、例えば３−７のＬＮＡヌクレオシド、４−８のＬＮＡヌクレオシド、または３、４、５、６、７または８のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％がＬＮＡヌクレオシドであり、修飾ヌクレオシドの例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施態様では、オリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオシドの全てがＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ配置またはその組み合わせのいずれかにおける次のＬＮＡヌクレオシド、すなわちチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、ＳｃＥＴおよび／またはＥＮＡ、のうちの１つ以上と、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡとの両方を含み得る。さらなる実施態様では、ＬＮＡシトシン単位は全て５−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性のために、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１のＬＮＡヌクレオシドを有し、ヌクレオチド配列の３’末端に少なくとも２のＬＮＡヌクレオシドを有することが有利である。

本発明の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる。

本発明において有利な構造設計は、「定義」のセクションの、例えば「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、「ＭＯＥギャップマー」、および「混合ウィングギャップマー」「交互フランクギャップマー」に記載されているようなギャップマー設計である。該ギャップマー設計には、均一フランク（uniform flank）、混合ウィングフランク、交互フランク、およびギャップブレーカー設計を有するギャップマーが含まれる。本発明において、本発明のオリゴヌクレオチドがＦ−Ｇ−Ｆ’設計を有するギャップマーであると、有利である。いくつかの実施態様では、ギャップマーは、均一フランクを有するＬＮＡギャップマーである。

本発明のいくつかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、次の均一フランク設計：１−１７−２、２−１３−３、４−１０−２および４−７−３から選択される。

本発明の例示的な化合物
例示的なオリゴヌクレオチド化合物では、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

本発明のいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、化合物番号９＿１、１０＿１、１１＿１および１２＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物の群から選択される。

本発明の一態様では、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１１＿１または１２＿１である。

製造方法
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合された連続するヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法はホスホラミダイト化学を使用する（例えばCaruthers et al., 1987, Methods in Enzymology 第154巻, 287-313頁参照）。さらなる実施態様では、この方法は、連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。

薬学的塩
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩またはそのコンジュゲートを提供する。好ましい実施態様では、薬学的に許容される塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。

薬学的組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／もしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはそれらの塩と、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される希釈剤中で、５０−３００μＭの溶液濃度で使用される。

本発明での使用に適した製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見出される。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントのさらに適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に援用される）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容される活性または不活性物質と混合されてもよい。薬学的組成物の製剤化のための組成物および方法は、限定されないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されていても凍結乾燥されていてもよく、凍結乾燥された製剤は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。該調製物のｐＨは、典型的には３−１１の間、より好ましくは５−９の間または６−８の間、最も好ましくは７−８の間、例えば７−７．５である。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封包装のように、それぞれが一定量の前記薬剤または薬物を含む複数の単回投与単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所的に塗布可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなど、柔軟な量のための容器に入れることもできる。

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関しては、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部位はオリゴヌクレオチドから切断される。

用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば診断、治療および予防のための研究用試薬として利用することができる。

研究では、このようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養）および実験動物におけるＰＩＡＳ４タンパク質の合成を特異的に調節し、それにより標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を容易にすることができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止するか、またはタンパク質を生成する遺伝子またはｍＲＮＡのモジュレーターを分解または阻害することにより達成される。プレｍＲＮＡを標的とし、それにより成熟ｍＲＮＡの形成を防ぐことにより、さらなる利点が達成され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であってもよい。

本発明は、ＰＩＡＳ４を発現している標的細胞においてＰＩＡＳ４発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供し、前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを有効量で前記細胞に投与することを含む。

いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞であってもよい。好ましい実施態様では、標的細胞は、精細管内の細胞、顆粒細胞、膵臓がん細胞および乳がん細胞などのがん細胞、または肝星細胞などの肝細胞に存在する。

診断において、オリゴヌクレオチドは、ノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは類似の技術により、細胞および組織におけるＰＩＡＳ４発現を検出および定量するために使用され得る。

治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＰＩＡＳ４の発現を調節することにより治療され得る疾患または障害を有する疑いのある動物またはヒトに、投与され得る。

本発明は、疾患に罹患しているか、または罹患しやすい対象に、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的に許容される組成物の治療的または予防的有効量を投与することを含む、疾患を治療または予防するための方法を提供する。

本発明はまた、医薬としての使用のための、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、組成物またはコンジュゲートに関する。

本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、典型的には有効量で投与される。

本発明はまた、障害、例えば本明細書で言及される障害の治療のための医薬の製造のための、または本明細書で言及されている障害の治療方法のための、記載されているような本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

本明細書で言及される疾患または障害は、ＰＩＡＳ４の発現に関連している。

本発明の方法は、好ましくは、ＰＩＡＳ４の異常なレベルおよび／またはＰＩＡＳ４の活性、特にＰＩＡＳ４のレベルの増加によって引き起こされる疾患の治療または予防のために使用される。

本発明はさらに、ＰＩＡＳ４の異常なレベルおよび／または活性の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物の使用に関する。

一実施態様では、本発明は、膵臓がん、肝臓がん、乳がん、精巣がん、黒色腫、神経膠腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、前立腺がん、子宮頸がん、および子宮内膜がん等のがんから選択される疾患または障害の治療における使用のためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物に関する。

一実施態様では、本発明は、特に肝線維症が非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連する場合、肝線維症を引き起こす肝疾患の治療における使用のためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物に関する。

投与
本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチコンジュゲートドまたは薬学的組成物は、経腸（例えば経口または胃腸管を通して）または非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内または髄腔内）に投与され得る。

非限定的な実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、薬学的塩または薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射または注入を含む非経口経路により投与される。

一実施態様では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、静脈内投与される。別の実施態様では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、皮下投与される。

いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、０．１−１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２−１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または月に１回、または３か月に１回であってもよい。

本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のための、記載されているような本発明オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

本発明はまた、静脈投与用の剤形である医薬の製造のための、記載されているような本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

実施態様
本発明の以下の実施態様は、本明細書に記載されている任意の他の実施態様と組み合わせて使用することができる。
１．配列番号１および３からなる群から選択される哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸またはその天然に存在する変異体に対して、例えば完全に相補的など、少なくとも９０％の相補性を有する、１０−３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０−５０ヌクレオチド長のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、細胞内の哺乳類ＰＩＡＳ４をコードする標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．連続するヌクレオチド配列が哺乳類ＰＩＡＳ４標的配列に対して完全に相補的である、実施態様１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３．連続するヌクレオチド配列が、哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸（例えば配列番号１）のプレｍＲＮＡ中に存在するイントロン領域に対し少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施態様１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．連続するヌクレオチド配列が、イントロン１（配列番号１の１４３−５２７７）；イントロン２（配列番号１の５７０５−１６３９０）；イントロン３（配列番号１の１６４７６−２０５００）；イントロン４（配列番号１の２０５４３−２０８６４）；イントロン５（配列番号１の２０９５６-２１０７４）；イントロン６（配列番号１の２１２０４−２１２８５）；イントロン７（配列番号１の２１３９０−２５４５４）；イントロン８（配列番号１の２５５２９−２５７７４）；イントロン９（配列番号１の２５９３６−２９７２８）およびイントロン１０（配列番号１の２９８６０−２９９７０）から選択される、ヒトＰＩＡＳ４のプレｍＲＮＡに存在するイントロン領域に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全相補的である、実施態様１−３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５．連続するヌクレオチド配列が配列番号１の２５９３６-２９７２８位に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施態様１−４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６．連続するヌクレオチド配列が配列番号１の２８４７８−２９０４３位に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施態様１−５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７．連続するヌクレオチド配列が配列番号４または配列番号１３に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施態様１−６のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８．連続するヌクレオチド配列が、配列番号１の２８４７８−２８４９７、２８５４０−２８５５９、２８８１６−２８８３５、２８９１０−２８９２９、２９０２４−２９０４３；２８４７８−２８４９５、２８５４０−２８５５７、２８６９６−２８７１３、２８８１６−２８８３３、２８９１０−２８９２７、２９０２４−２９０４１；２８４８２−２８４９７、２８５４４−２８５５９、２８８２０−２８８３５、２８９１４−２８９２９、２９０２８−２９０４３；２８４８４−２８４９７、２８５４６−２８５５９、２８８２２−２８８３５、２８９１６−２８９２９、２９０３０−２９０４３；２８１４２−２８１６１、２８１４４−２８１６１、２８１４５−２８１６０、２８１４７−２８１６０位からなる群から選択される配列番号１の標的領域に少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施態様１−７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９．連続するヌクレオチド配列が配列番号１の標的核酸のうちの１０−２２、例えば１４−２０ヌクレオチド長の標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的であり、標的配列が標的核酸にわたって少なくとも５回以上反復される、実施態様１−８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０．配列番号１、２および３からなる群から選択される標的核酸に、−１０ｋｃａｌを下回るΔＧ°でハイブリダイズすることが可能である、実施態様１−９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１．標的核酸がＲＮＡである、実施態様１−１０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２．ｍＲＮＡがプレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡである、実施態様１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３．連続するヌクレオチド配列が、少なくとも１０、特に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９の連続するヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる、実施態様１−１２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１４．連続するヌクレオチド配列が１２−２２のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる、実施態様１−１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５．連続するヌクレオチド配列が１４−２０のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる、実施態様１−１４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６．１２−３５のヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる、実施態様１−１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７．１４−２５のヌクレオチド長を含むか、またはそれらからなる、実施態様１−１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８．オリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列が一本鎖である、実施態様１−１７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．ｓｉＲＮＡでも自己相補的でもない、実施態様１−１８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．連続するヌクレオチド配列が、配列番号９、１０、１１および１２から選択される配列を含むか、またはそれからなる、実施態様１−１９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１．連続するヌクレオチド配列が、それが相補的である標的核酸と比較して０−３個のミスマッチを有する、実施態様１−２０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２．連続するヌクレオチド配列が標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施態様２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３．連続するヌクレオチド配列が標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施態様２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２４．１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１−２３いずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５．１つ以上の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施態様２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオがチド。
２６．１つ以上の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施態様２４または２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７．１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アルビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立に選択される、実施態様２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８．３から６つの２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施態様２６または２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施態様１から２８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０．修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である、実施態様２９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１．連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合ヌクレオシド間結合である、実施態様２９または３０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２．連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様２９−３１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３．ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる、実施態様１−３２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４．ギャップマーである、実施態様３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’（式中、領域ＦおよびＦ’は独立に、１−８ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり、そのうち１−４つは２’糖修飾されており、かつ、ＦおよびＦ’領域の５’および３’末端を画定し、ＧはＲＮａｓｅＨを動員することができる６−１６ヌクレオシド領域である）のギャップマーからなるか、またはそれを含む、実施態様１から３４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６．２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アルビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立に選択される、実施態様３５に記載のオリゴヌクレオチド。
３７．領域ＦおよびＦ’における１つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様３５または３６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８．領域ＦおよびＦ’における全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様３７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９．領域ＦおよびＦ’がＬＮＡヌクレオシドからなる、実施態様３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４０．領域ＦおよびＦ’における全ての修飾ヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４５−４７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１．ＬＮＡヌクレオシドが、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡから選択される、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２．ＬＮＡヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３．ＬＮＡヌクレオシドがベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４．ＬＮＡヌクレオシドがチオ−ＬＮＡである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５．ＬＮＡヌクレオシドがアミノ−ＬＮＡである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６．ＬＮＡヌクレオシドがｃＥＴである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４７．ＬＮＡヌクレオシドがＥＮＡである、実施態様３７−４０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４８．領域ＦまたはＦ’の少なくとも一方が、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、および２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群から独立に選択される少なくとも１の２’糖置換ヌクレオシドをさらに含む、実施態様４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４９．領域ＧのＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシドが、ＤＮＡ、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡおよび２’Ｆ−ＡＮＡおよびＵＮＡから独立に選択される、実施態様３５−４８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５０．領域ＧのヌクレオシドがＤＮＡおよび／またはアルファ−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５１．領域Ｇが少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施態様４９または５０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５２．領域Ｇの全てのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、実施態様４９−５１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５３．アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が、ＧｇａｔｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｇＡＣ（化合物９＿１）；ＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇＧＡＣ（化合物１０＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔＧＴ（化合物１１＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃＧＧＴ（化合物１２＿１）からなる群から選択され、ここで大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡ Ｃは全て５−メチルシトシンであってもよく、少なくとも１つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様１−５２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５４．化合物番号９＿１；１０＿１；１１＿１；１２＿１から選択される、実施態様５３に記載のオリゴヌクレオチド。
５５．実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
５６．コンジュゲート部分が炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルス性タンパク質、またはこれらの組み合わせから選択される、実施態様５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
５７．コンジュゲート部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、実施態様５５または５６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５８．アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含む、実施態様５５−５７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
５９．リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、実施態様５８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６０．生理学的に不安定なリンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施態様５９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６１．式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’またはＦ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’（式中、Ｆ、Ｆ’およびＧは実施態様３５−５２に定義されている通りであり、Ｄ’またはＤ’’はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を持つ１、２または３つのＤＮＡヌクレオシドを含む）を有する、実施態様５５−６０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６２．実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、または実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６３．実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施態様６２に記載の薬学的に許容される塩、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／もしくはアジュバントを含む薬学的組成物。
６４．ヌクレオチド単位を反応させ、それによりオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合された連続するヌクレオチド単位を形成することを含む、実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための方法。
６５．連続するヌクレオチド配列を非ヌクレオチドコンジュゲーション部分と反応させることをさらに含む、実施態様６４に記載の方法。
６６．オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、実施態様６３に記載の組成物を製造するための方法。
６７．哺乳類ＰＩＡＳ４を発現している標的細胞におけるＰＩＡＳ４発現を減少させるためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲートまたは実施態様６２に記載の薬学的塩または実施態様６３に記載の薬学的組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
６８．治療的または予防的有効量の、実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲートまたは実施態様６２に記載の薬学的塩または実施態様６３に記載の薬学的組成物を、疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象へ投与することを含む、疾患を治療、緩和または予防するための方法。
６９．対象における疾患の治療、緩和または予防のための医薬としての使用のための、実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施態様６２に記載の薬学的塩、または実施態様６３に記載の薬学的組成物。
７０．対象における疾患の治療または予防のための医薬の調製のための、実施態様１−５４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの、または実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲートの使用。
７１．疾患がＰＩＡＳ４のｉｎ ｖｉｖｏ活性に関連する、実施態様６７−７０のいずれか１つに記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７２．疾患がＰＩＡＳ４遺伝子の過剰発現および／またはＰＩＡＳ４タンパク質の異常なレベルに関連する、実施態様６７−７１のいずれか１つに記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７３．ＰＩＡＳ４が、実施態様１−５４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施態様５５−６１のいずれか１つに記載のコンジュゲートまたは実施態様６２に記載の薬学的塩または実施態様６３に記載の薬学的組成物なしでの発現と比較して、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少する、実施態様７２に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７４．疾患が膵臓がんまたは乳がんなどのがんである、実施態様６７−７１のいずれか１つに記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７５．疾患が肝線維症である、実施態様６７−７１のいずれか１つに記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７６．肝線維症が非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連する、実施態様７５に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７７．対象が哺乳動物である、実施態様６７−７６のいずれか１つに記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。
７８．哺乳動物がヒトである、実施態様７７に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは使用。

材料および方法

モチーフ配列は、オリゴヌクレオチド中に存在する核酸塩基の連続した配列を表す。

設計は、ギャップマー設計であるＦ−Ｇ−Ｆ’を参照し、ここで、各番号は、連続する修飾ヌクレオシドの数を表し、例えば２’修飾ヌクレオシド（最初の番号＝５’フランク）の後にＤＮＡヌクレオシドの数（２番目の番号＝ギャップ領域）が続き、その後に修飾ヌクレオシドの数、例えば２’修飾ヌクレオシド（３番目の数ｒ＝３’フランク）が続き、任意選択的に、標的核酸に相補的である連続する配列の一部であるとは限らないＤＮＡおよびＬＮＡのさらなる反復領域がそれに先行するかまたは続く。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡシトシンは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野において一般的に既知である。以下は、適用可能なプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体および濃度の点でわずかに異なる方法によって生成された場合がある。

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８でのホスホラミダイトアプローチを用いて、１μｍｏｌスケールでウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、６０℃で５−１６時間、アンモニア水を使用してオリゴヌクレオチドを固体支持体から切断する。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量はさらにＥＳＩ−ＭＳによって確認される。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチル−ホスホルアミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）またはＬＮＡ−Ｔ）のカップリングは、０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ−保護アミダイトのアセトニトリル溶液と活性剤としてのＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）のアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ）を使用して実施される。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えば、コンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカーまたはコンジュゲート基自体を使用することができる。ホスホロチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中、０．０１Ｍ）を使用して実行される。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用されるものである。

固相合成後のコンジュゲーションでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護および固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが分離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用する官能基の活性化によって導入される。

ＲＰ−ＨＰＬＣ：による精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍアラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを５ｍＬ／ｍｉｎの流速でバッファーとして使用する。回収した画分を凍結乾燥し、精製された化合物が典型的には白色の固体として得られる。

略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー

Ｔ_ｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）の二本鎖を５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２ｘＴ_ｍ−バッファー（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｎａｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．０）と混合する。その溶液を３分間、９５℃まで加熱し、その後室温で３０分間アニーリングさせる。二本鎖融解温度（Ｔ_ｍ）を、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度プログラマーＰＴＰ６を装備したＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定する。温度を２０℃から９５℃まで上げ、その後２５℃に下げ、２６０ｎｍでの吸収を記録した。一次導関数と、融解とアニーリングの両方の極大値を使用して、二本鎖Ｔ_ｍを評価する。

実施例１−ｉｎ ｖｉｔｒｏでの最大効果および用量効果の試験
１つの領域を標的とするオリゴヌクレオチドと、ＰＩＡＳ４上の少なくとも３つの独立した領域を標的とするオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で試験した。オリゴヌクレオチドのＥＣ５０（用量効果）および最大ｋｄ（最大効果）を評価した。

細胞株
ＨｅＬａ細胞株はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から購入し、５％ＣＯ_２を含む３７℃の加湿インキュベーターで供給業者が推奨するとおりに維持した。アッセイのために、２５００細胞／ウェルを、供給業者が推奨する１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４６５５）の９６マルチウェルプレートに播種した。

オリゴヌクレオチドの用量効果および最大効果
オリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドをＰＢＳに溶解し、最終濃度が０．０１、０．０３１、０．１、０．３１、１、３．２１、１０、および３２．１μＭのオリゴヌクレオチドを細胞に添加し、最終培養量は１００μｌ／ウェルとした。オリゴヌクレオチド化合物を添加してから３日後に細胞を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造元の指示に従って全ＲＮＡを抽出した。標的転写物レベルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎアッセイを用い、テクニカルデュプレックスおよびバイオロジカルトリプレックス（technical duplex and biological triplex）セットアップでのＶＩＣ標識ＧＡＰＤＨ対照プローブとのマルチプレックス反応で定量した。目的の標的転写物ＰＩＡＳ４（Ｈｓ０１０７１９４８＿ｍ１）とハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（４３２６３１７Ｅ ＶＩＣ（登録商標）／ＭＧＢプローブ）のＴａｑＭａｎプライマーアッセイ。オリゴヌクレオチドのＥＣ５０および最大効果を対照試料の％として表６に示す。

ＥＣ５０の計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で行った。最大ＰＩＡＳ４ノックダウンレベルを対照の％として表５に示した。

Claims (24)

1. 配列番号１および３からなる群から選択される哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸またはその天然に存在する変異体に対して、少なくとも９０％の相補的、例えば完全に相補的である、１０−３０ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む、１０−５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞内の哺乳類ＰＩＡＳ４標的核酸の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 連続するヌクレオチド配列が、配列番号１のＰＩＡＳ４標的核酸に存在するイントロン領域に対し、少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 連続するヌクレオチド配列が、配列番号１の１４３−５２７７位；配列番号１の５７０５−１６３９０位；配列番号１の１６４７６−２０５００位；配列番号１の２０５４３−２０８６４位；配列番号１の２０９５６-２１０７４位；配列番号１の２１２０４−２１２８５位；配列番号１の２１３９０−２５４５４位；配列番号１の２５５２９−２５７７４位；配列番号１の２５９３６−２９７２８位または配列番号１の２９８６０−２９９７０位から選択されるイントロン領域ＰＩＡＳ４に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 連続するヌクレオチド配列が配列番号１の２５９３６−２９７２８位に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、請求項１−３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 連続するヌクレオチド配列が配列番号４または配列番号１３に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、請求項１−４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 連続するヌクレオチド配列が、配列番号１の２８４７８−２８４９７、２８５４０−２８５５９、２８８１６−２８８３５、２８９１０−２８９２９、２９０２４−２９０４３；２８４７８−２８４９５、２８５４０−２８５５７、２８６９６−２８７１３、２８８１６−２８８３３、２８９１０−２８９２７、２９０２４−２９０４１；２８４８２−２８４９７、２８５４４−２８５５９、２８８２０−２８８３５、２８９１４−２８９２９、２９０２８−２９０４３；２８４８４−２８４９７、２８５４６−２８５５９、２８８２２−２８８３５、２８９１６−２８９２９、２９０３０−２９０４３；２８１４２−２８１６１、２８１４４−２８１６１、２８１４５−２８１６０、２８１４７−２８１６０位からなる群から選択される配列番号１の標的領域に少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、請求項１−５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7. 連続するヌクレオチド配列が配列番号１の標的核酸のうちの１０−２２、例えば１４−２０ヌクレオチド長の標的領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的であり、標的領域が標的核酸にわたって少なくとも５回反復される、請求項１−６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8. 連続するヌクレオチド配列が、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一、例えば１００％同一である、請求項１−７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9. 連続するヌクレオチド配列が、配列番号９、１０、１１および１２からなる群から選択される配列からなるか、またはそれを含む、請求項１−８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
10. 連続するヌクレオチド配列が、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１−９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11. １つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アルビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立に選択される、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
12. １つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項１０または１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
13. 連続するヌクレオチド配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１−１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
14. 連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％、例えば全てがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
15. 連続するオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる、請求項１−１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
16. アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’（式中、領域ＦおよびＦ’は独立に、１−８ヌクレオシドを含み、そのうち１−４つは２’糖修飾されており、かつ、ＦおよびＦ’領域の５’および３’末端を画定し、ＧはＲＮａｓｅＨを動員することができる６から１６の間のヌクレオシド領域、例えば６−１６ＤＮＡヌクレオシド領域を含む領域である）のギャップマーからなるか、またはそれを含む、請求項１−１５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
17. アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列が、ＧｇａｔｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｇＡＣ（化合物９＿１）；ＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｇＧＡＣ（化合物１０＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃｇｇｔＧＴ（化合物１１＿１）；ＧＧＡＴｇｔｇｔｇａｃＧＧＴ（化合物１２＿１）からなる群から選択され、ここで大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡ Ｃはすべて５−メチルシトシンであってもよく、少なくとも１つ、好ましくは全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１−１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
18. 請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
19. 請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項１８に記載のコンジュゲートの薬学的に許容される塩。
20. 請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１８に記載のコンジュゲート、または請求項１９に記載の薬学的に許容される塩、ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／もしくはアジュバントを含む薬学的組成物。
21. 哺乳類ＰＩＡＳ４を発現している標的細胞における哺乳類ＰＩＡＳ４発現を阻害するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１８に記載のコンジュゲート、請求項１９に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２０に記載の薬学的組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
22. 医薬における使用のための、請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１８に記載のコンジュゲート、請求項１９に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２０に記載の薬学的組成物。
23. 肝線維症または膵臓がんおよび乳がんなどのがんの治療または予防における使用のための、請求項１−１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１８に記載のコンジュゲート、請求項１９に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２０に記載の薬学的組成物。
24. 肝線維症または膵臓がんおよび乳がんなどのがんの治療または予防のための医薬の調製のための、請求項のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１８に記載のコンジュゲート、請求項１９に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２０に記載の薬学的組成物の使用。