JPH09506248A - キメラオリゴヌクレオシド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キメラオリゴヌクレオシド化合物およびこの化合物の調製方法および製剤化の方法を開示する。この化合物および組成物は、標的リボ核酸配列のＲＮａｓｅＨが介在する分解の活性化およびこのような配列に関連する病状の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラオリゴヌクレオシド化合物発明の技術分野 本発明は、修飾したヌクレオシド間（internucleoside）結合および任意に他 の構造上の修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオシド化合物に関する。本発 明の化合物は標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、ＲＮアーゼＨによ って媒体された該標的の開裂を活性化することができる。発明の背景 近年、生物体中で内生または外来核酸配列に帰しうる状態の研究、治療および 診断に使用するためのアンチセンス核酸オリゴマーを設計することに対し、多大 の関心が向けられている。たとえば、標的ｍＲＮＡに相補的な適当なアンチセン スを有する核酸オリゴマーが該標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができ、 幾つかの場合に該ｍＲＮＡの翻訳を妨害しうることが今やよく知られている。ア ンチセンス法は、外来（たとえば、ウイルス性）遺伝物質によって、またはミス 機能の（misfunctioning）もしくは変化した内生遺伝物質（たとえば、癌および 遺伝子疾患状態）によって引き起こされた疾患状態の最後の治療として大きな期 待が寄せられている。 しかしながら、アンチセンス法に大きな期待が寄せられているにもかかわらず 、多くの難題が依然として残っている。まず、アンチセンス化合物は一般に、内 生のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼのために細胞環境中で分解に 供される。ヌクレアーゼ分解に対する耐性が改善された多数の修飾アンチセンス 構造物が記載されているが、化合物の有効性および半減期を増大させるためにさ らに改善が望まれている。第二に、アンチセンス化合物は一般に、目的としない 天然の配列の活性が破壊されることを回避するために目的とする標的核酸に対し て高い特異性を有することが必要である。多数の研究者がアンチセンス化合物の 標的配列に対する結合親和性を増大させるべく設計した方法を記載しているが、 標 的配列に対しては最大の有効性を保持しながら目的としない遺伝子配列の活性の 破壊を回避した構造的な洗練に関しては極わずかの結果しか報告されていない。 所望でない標的ｍＲＮＡの発現を破壊することに向けた一つのアプローチには 、標的ｍＲＮＡとアンチセンス鎖との間で二本鎖ハイブリッドを形成させ、つい で該標的ｍＲＮＡを内生のＲＮアーゼＨで開裂することが含まれる。ダッシュ（ Ｄash,Ｐ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８４：７８９６〜７９９０（ １９８７）を参照。しかしながら、ＲＮアーゼＨの作用様式は殆ど特異的でない ので、このアプローチには多数の制約がある。まず、ＲＮアーゼＨ酵素は天然で はオリゴデオキシリボヌクレオチド−オリゴリボヌクレオチド二本鎖のオリゴリ ボ核酸鎖を開裂するように作用するが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ二 本鎖は開裂しない。このことは、少なくとも一部はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド の極性の性質によるものであり、該ハイブリッドはＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ −ＲＮＡハイブリッドとは対照的に一方の鎖に（一方の鎖にのみ）２'−ＯＨ基 を有する。クラウチ（Ｃrouch,Ｒ.Ｊ.）＆ダークセン（Ｄirksen,Ｍ.−Ｌ.）、Ｎucleases （リン（Ｌinn）＆ロバーツ（Ｒoberts）編）（コールドスプリング ハーバーラボラトリー）（１９８２）中の「リボヌクレアーゼＨ（Ｒibonucleas e Ｈ）」、２１２。その結果、アンチセンスＲＮアーゼＨ開裂法の一つの推定さ れる要件は、アンチセンス核酸鎖のヌクレオシドの少なくとも幾つかがデオキシ リボヌクレオチド（リボヌクレオチドではなく）と共通する特性を有すること、 とりわけアンチセンスヌクレオシドの糖の２'一位に極性基が存在しないことで ある。おそらくこれに関連したさらなる要件は、アンチセンス化合物中の糖基の 少なくとも幾つかが、リボヌクレオシドに認められる３'−エンド（α）コンホ メーションではなくデオキシリボヌクレオシドに認められる２'−エンド（β） コンホメーションであることである。クック（Ｃook,Ｐ.Ｄ.）、ＰＣＴ公開第Ｗ Ｏ９３／１３１２１（１９９３）、１８〜１９。 さらに、種々の２'−位の置換基（たとえば、２'−Ｏ−アルキルおよび２'− フルオロ）が、標的核酸に対する結合親和性が増大してもアンチセンス鎖の置換 部分をＲＮアーゼＨに対して作用を受けないようにするであろうことが報告され ている。イノウエ（Ｉnoue,Ｈ.）ら、ＦＥＢＳ Ｌetters ２１５（２）：３２７ 〜３３０（１９８７）；モニア（Ｍonia,Ｂ.Ｐ.）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８（ １９）：１４５１４〜１４５２２（１９９３）。同様に、モニアらの報告は、哺 乳動物の（ＨeＬa）ＲＮアーゼＨの有効な活性化を達成するには最低５つの連続 した２'−デオキシ残基が必要であること、およびこの２'−デオキシセグメント は（同じアンチセンス化合物中に２'−置換残基を伴う場合には）、有効なイン ビトロＲＮアーゼＨ活性化または細胞中での発現抑制を達成するにはオリゴマー 配列中の中心にくる必要があることを示している。 アンチセンスＲＮアーゼＨ開裂法で報告された他の必要な要件は、ＲＮアーゼ Ｈ活性化を達成するため、アンチセンス化合物のヌクレオシド間「骨格」の少な くとも一つの部分に荷電された（アニオン性の）リン含有結合基が含まれている ことである。クック、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１（１９９３）、１８。 メチルホスホネート（非荷電）およびホスホジエステルまたはホスホロチオエー ト（荷電）の両結合を有するキメラアンチセンス化合物の研究において、アグラ ワル（Ａgrawal）らは、哺乳動物ＲＮアーゼＨのインビトロでの有効な活性化に 必要な連続した荷電骨格結合の最小数は５であることを報告している。オリゴマ ーの末端部分かまたは中央部分のいずれかに位置するホスホジエステル結合は、 報告によるとＲＮアーゼＨの活性化においてホスホロチオエート結合よりも有効 であり、一方、メチルホスホネート、ホスホロ−Ｎ−モルホリデートまたはホス ホロ−Ｎ−ブチルアミデート結合のみを含有するオリゴマーは不活性であった。 アグラワルら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８７：１４０１〜１４０５（１ ９９０）。 荷電したホスホジエステル結合はＲＮアーゼＨを活性化させるのに適している が、天然に存在するエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼによ る分解を受けるという欠点を有する。種々の他の結合基が（その幾つかはヌクレ アーゼ耐性である）、アンチセンス化合物に用いるために開発されもしくは提唱 されている。これらにはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロ セレネートおよびホスホロジセレネート結合などの荷電結合基が含まれる。一般 に、これら非天然の結合基を有するデオキシリボヌクレオシドアンチセンスオリ ゴマーは、対応するホスホジエステル結合したアンチセンスオリゴマーに比べて 相補的なＲＮＡ標的に対して低い結合親和性を有する傾向があるが、アンチセン ス鎖が（デオキシリボヌクレオシドよりもむしろ）リボヌクレオシドまたは２' −置換リボヌクレオシドを有する場合には高い親和性を達成することができる。 メテレブ（Ｍetelev,Ｖ.）＆アグラワル、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２４９８（ １９９４）、９参照。報告された非荷電のリン含有結合基には、アルキルホスホ ネート（たとえば、メチルホスホネート）、アリールホスホネート、アルキルお よびアリールホスホルアミデート、アルキルおよびアリールホスホトリエステル 、ハイドロジェンホスホネート、ボラノホスホネート、アルキルおよびアリール ホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、およびホスホロピペラジデート 結合がある。クックら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１（１９９３）、７； ペダーソン（Ｐederson,Ｔ.）ら、ＵＳＰ５,１４９,７９７号および同５,２２０ ,００７号；パドマプリヤ（Ｐadmapriya,Ａ.）＆アグラワル、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／０２４９９（１９９４）参照。リンを含まない結合基も報告されており、 ペプチド、モルホリノ、エチレングリコール、アミドその他の結合が含まれる。 レイノルズ（Ｒeynolds,Ｍ.Ａ.）ら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２５３２（１９ ９２）；クック、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１（１９９３）、７参照。上 記荷電したリン含有リンカーの場合と同様、これら他の非天然結合基の多くも、 少なくとも結合した２'−非置換アンチセンスヌクレオチドの場合、とりわけ塩 イオンの不在下では、相補的なＲＮＡ標的鎖に対して（ホスホジエステル結合に 比べて）低い結合親和性を示す。 色々な研究者が、改善されたＲＮアーゼＨ活性化、結合親和性、ヌクレアーゼ 耐性および／または標的特異性に導くアンチセンスオリゴマーの結合基および／ または構造的修飾の組み合わせを同定するために試みている。それゆえ、コーエ ン（Ｃohen）らは、たとえば化合物のいずれかの末端かまたは化合物のどこかの 位置に少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有するアンチセンスおよび非 アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドについて半減期が改善されること を報告している。すべてのホスホロチオエート結合を有するオリゴマーは抗ウイ ルス（抗−ＨＩＶ）活性を有することが示され、一方、報告によればホスホジエ ステル結合化合物およびメチルホスホネート結合化合物は不活性であった。コー エンら、ＵＳＰ５,２６４,４２３号。ワルダー（Ｗalder）らは、３'−末端の非 ホスホジエステル結合を５'−末端の非ホスホジエステル結合または５'−末端の 「キャップ」基と組み合わせて用い、３'−開始される（場合により５'−開始さ れる）オリゴデオキシリボヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ分解を回避するこ とを提唱している。ＲＮアーゼＨ開裂活性化は、報告によると、アンチセンスオ リゴマー中で少なくとも５つ、および好ましくは少なくとも７つの隣接するホス ホジエステル結合の保持を必要とする。好ましい化合物は少なくとも１０、好ま しくは少なくとも１５のヌクレオチドを含有し、その大部分はホスホジエステル 結合している。ワルダーら、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０５３５８（１９８９）。 パドマプリヤおよびアグラワルは、非イオン性のアルキルまたはアリールホスホ ノチオエート結合を好ましくはオリゴマーの一方または両末端に導入するとヌク レアーゼ耐性が改善されるが、Ｔｍが１〜２℃／ホスホノチオエート結合低下す ることを報告している。ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２４９９（１９９４）。 ペダーソンらは、ＲＮアーゼＨ活性化のためのホスホジエステル結合セグメン トまたはホスホロチオエート結合セグメント、および１または２以上のＲＮアー ゼＨを活性化しない非荷電の結合基セグメントの両者を有する「混合ホスフェー ト骨格」の使用を報告している。標的ＲＮＡ鎖のＲＮアーゼＨ開裂を達成するに は１５−mer 化合物において５または６の連続したホスホジエステル結合のセグ メントで充分であり、一方、ホスホジエステル結合が一層少ないかまたはホスホ ジエステル結合の代わりに６までの連続したホスホロチオエート結合を有する同 様の化合物は低い活性を有することがわかった。ペダーソンら、ＵＳＰ５,１４ ９,７９７号および同５,２２０,００７号。 ガイルズ（Ｇiles）およびティッド（Ｔidd）は、高Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比を有す る中央のＲＮアーゼＨ活性化ホスホジエステル領域によって隔てられた末端のメ チルホスホノジエステル部分を含むキメラ構造を用いることにより、アンチセン スオリゴマーの標的特異性を改善しうることを報告している。観察された非特異 的開裂の減少は、メチルホスホネートセグメントによって低下したＴｍ、小さな Ａ／Ｔに富むホスホジエステル領域の減少したハイブリダイゼーション力、およ び短縮されたＲＮアーゼＨ活性化部位における部分的に相補的なハイブリダイゼ ーションの見込みの減少によるものであった。ガイルズおよびティッド、Ｎucl ．Ａcids Ｒes.２０（４）：７６３〜７７０（１９９２）。 オーツカ（Ｏtsuka）らは、二次構造を有するまたは有しないＲＮＡ標的の部 位特異的ＲＮアーゼＨ開裂のために部分的に２'−置換した（たとえば、２'−低 級アルコキシ置換された）オリゴマーの使用を記載している。ＲＮアーゼＨ開裂 は、報告によると、アンチセンス化合物の非置換（すなわち、デオキシリボヌク レオチド）部分に対応する標的上の部位に局在していた。単一部位開裂は、報告 によると、該化合物の２つの２'−置換末端セグメント間に中央に位置するテト ラデオキシリボヌクレオチドセグメントを使用することにより最適化された。イ ノウエら、ＦＥＢ Ｌetters２１５（２）：３２７〜３３０（１９８７）；シバ ハラ（Ｓhibahara,Ｓ.）ら、Ｎucl．Ａcids Ｒes.１５（１１）：４４０３〜４ ４１５（１９８７）；オーツカら、ＵＳＰ５,０１３,８３０号。さらに１または ２以上の非ホスホジエステル結合を有する部分的に２'−置換されたオリゴマー の使用もまた報告されている。シバハラら、ヨーロッパ特許出願公開第０３３９ ８４２Ａ２（１９８９）（ホスホロチオエートまたは他の結合を有する３'−５' または２'−５'結合したオリゴマーを報告）；クック、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／ １３１２１（１９９３）（２'−置換による増大した結合親和性、およびたとえ ばホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合によるヌクレアーゼ耐性 を報告）；マニアら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８（１９）：１４５１４〜１４５２ ２（１９９３）（ホスホロチオエート結合したオリゴマーにおける２'−置換の 効果を報告）；メテレブおよびアグラワル、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２４９８ （１９９４）（ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合したオリゴ マーにおける２'−置換の使用を報告）；マッギー（ＭcＧee,Ｄ.Ｐ.）ら、ＰＣ Ｔ公開第ＷＯ９４／０２５０１（１９９４）（種々の２'−置換ヌクレオシドお よびホスホルアミダイトの調製を記載）参照。発明の要約 本発明は、選択的に修飾したヌクレオシド間結合、および任意に他の構造的修 飾を有する、改善されたＲＮアーゼＨ活性化アンチセンスオリゴヌクレオシド化 合物に関する。本発明の化合物は、他のＲＮアーゼＨ活性化アンチセンス化合物 に比べて改善された標的特異性および有効性を示す。本発明の化合物は、標的ｍ ＲＮＡ配列、最も好ましくは疾患状態に関連した配列の翻訳を減少または排除す るうえでインビボおよびインビトロの両方で有用である。 一つの側面において、本発明の化合物は、キラル的に純粋な（chirally−pure ）またはキラル性に富む（chirally−enriched）修飾した（非ホスホジエステル ）ヌクレオシド間結合を有する１または２以上のポリヌクレオシドセグメントを 含む。キラル的に選択された結合セグメントは、１または２以上の結合構造の不 斉リン原子においてＲキラリティーを有する（「Ｒ_Pキラリティー」）結合を含 むように選択するのが好ましい。好ましくは、所定のキラル的に選択されたセグ メントにおいて結合の少なくとも約４０％はＲ_P−キラルであろう。１または２ 以上のＳ_P−キラル結合を選択的に有するセグメントもまた含まれる。一つの好 ましい態様において、キラル的に選択されたセグメントは化合物の末端（３'お よび５'）部分に中央のＲＮアーゼＨ活性化領域を囲んで位置する。フランキン グのキラル的に選択されたセグメントは、実質的にＲＮアーゼＨ活性化しないの が好ましい。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、不斉（キラル）結合基に結合している ならば、代わりにまたは追加的にキラル的に選択されてよい。関連する態様にお いて、ＲＮアーゼＨ活性化領域は該化合物の一つの末端またはその近傍に位置し 、該化合物の残りのすべてまたは一部はキラル的に選択され、好ましくはＲＮア ーゼＨを活性化しない。 本発明のキラル的に選択されたＲ_Pに富むセグメントは、ラセミ化合物に比べ て化合物の結合親和性を増大させる。加えて、キラル的に選択された修飾した結 合構造は非修飾ホスホジエステル結合よりもエンドヌクレアーゼおよび／または エキソヌクレアーゼによる分解に対する耐性が大きいので、このキラル的に選択 されたセグメントはインビボ環境において分解から化合物を保護するであろう。 他の態様において、本発明の化合物は、混合修飾（非ホスホジエステル）ヌク レオシド間結合を含む１または２以上のポリヌクレオシドセグメントを含む。該 混合結合セグメント中には２または３以上の異なるヌクレオシド間結合構造が含 まれ、これらのうち１または２以上は修飾された結合構造であってよい。該配列 中の１または２以上の結合構造はキラル的に選択されてよい。好ましくは、混合 結合セグメントには、それぞれ２または３以上の異なるヌクレオシド間結合構造 を有する複数の結合配列ブロック（シントン（synthons））、または混合結合セ グメント中で２回またはそれ以上繰り返される単一のかかるシントンが含まれて いてよい。化合物が２以上の混合結合セグメントを含む場合には、結合配列ブロ ックは各セグメント中で同じであっても異なっていてもよい。一つの好ましい態 様において、混合結合セグメントは化合物の末端（フランキング）部分にＲＮア −ゼＨ活性化領域を囲んで位置する。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、代わりにまた は追加的に混合結合セグメントを含んでいてよい。フランキング混合結合セグメ ントは、ＲＮアーゼＨを活性化しないのが好ましい。関連する態様において、Ｒ ＮアーゼＨ活性化領域は化合物の一つの末端部分に位置し、該化合物の残りのす べてまたは一部が混合結合セグメントを含み、ＲＮアーゼＨを活性化しないのが 好ましい。 本発明の混合結合セグメントはラセミであってもキラル的に選択されてもよい 。いずれの場合においても、ヌクレオシド間構造および／または結合したヌクレ オシド置換基の同定は、標的特異性およびヌクレアーゼ耐性および増大した有効 性を保持しながら化合物に一層大きな結合親和性を付与すべく選択することがで きる。本発明の化合物の混合結合セグメントにはエンドヌクレアーゼおよび／ま たはエキソヌクレアーゼによる分解に耐性の１または２以上の修飾ヌクレオシド 間結合構造を含むので、本発明の化合物はインビボ環境において一層高い有効性 を有するであろう。 他の態様において、本発明は、混合ヌクレオシド間結合を有する結合したヌク レオシドを含む改良されたＲＮアーゼＨ活性化セグメントを包含する。一つの好 ましい態様において、ＲＮアーゼＨ活性化セグメントは、交互の配列中に２また は３以上の異なる荷電（アニオン性）ヌクレオシド間結合構造により連結された 少なくとも５つの連続した２'−置換（すなわち、ＤＮＡ）ヌクレオシド残基を 含む。好ましくは、ＲＮアーゼＨ活性化セグメントは、少なくとも４つのかかる 荷電ヌクレオシド間結合構造を含む。ＲＮアーゼＨ活性化セグメント中の１また は２以上のヌクレオシド間結合構造は、不斉リン原子が該結合構造中に存在する 場合にはキラル的に選択してよい。 他の態様において、本発明は、目的とする標的鎖のＲＮアーゼＨ媒体による選 択的な開裂を行う能力を保持しながら活性を最大にする、アンチセンスオリゴヌ クレオシド化合物のためのキメラ構造を提供する。これら目的は、一方において 制御された結合親和性を、他方において制御されたＲＮアーゼＨ活性化特性を提 供する構造によって達成される。 それゆえ、一つの態様において、化合物の１または２以上の部分にキラル的に 選択されたＲ_P−キラルヌクレオシド間結合を使用することにより結合親和性が 制御される（選択的に増大される）。代わりにまたはそれに加えて、１または２ 以上のＳ_P結合を用いて結合親和性を選択的に減少させることができる。関連す る態様において、化合物の１または２以上の混合結合セグメント中に複数の繰り 返し結合配列ブロック（シントン）を使用することにより結合親和性が制御され る（選択的に増大される）。結合構造はラセミであってもキラル的に選択された ものであってもよい。他の関連する態様において、好ましくは交互の結合セグメ ントおよび／またはキラル的に選択されたヌクレオシド間結合とともに、化合物 中の１または２以上のヌクレオシド糖上の２'−置換基を使用することにより結 合親和性が制御される（選択的に増大される）。２'−置換されたまたは非置換 のヌクレオシド糖を使用することによりおよび／または化合物の所定のセグメン トに対して非荷電または荷電結合構造を選択することにより、化合物のこれらセ グメント中でＲＮアーゼＨ活性化特性も同時に制御することができる（実質的に 排除または選択的に減少させることができる）。 同様に、ＲＮアーゼＨ活性化特性は、化合物のＲＮアーゼＨ活性化領域中の混 合または均一荷電ヌクレオシド間結合の選択により制御される（選択的に増大ま たは減少される）。ＲＮアーゼＨ活性化特性は、とりわけ化合物のＲＮアーゼＨ 活性化領域中において、ＲＮアーゼＨの一層貧しい基質であるホスホロチオエー トやとりわけホスホロジチオエート構造などの結合構造を使用することにより、 選択的に減少させることができる。ＲＮアーゼＨ活性化特性はまた、たとえば結 合構造、２'−置換基および以下に記載する他の特性の適当な選択により、化合 物の一部分のみが標的遺伝子配列の開裂の活性化に有効となるように化合物中に ＲＮアーゼＨ非活性化領域を含めることによっても制御される。 本発明の極めて好ましい化合物としては、化合物の２つの末端（フランキング ）部分に実質的にＲＮアーゼＨを活性化しないキラル的に選択される混合結合セ グメントを有し、これらの間に位置してＲＮアーゼＨ活性化領域を有するものが 挙げられる。化合物の２つの末端（フランキング）部分に実質的にＲＮアーゼＨ を活性化しないラセミ混合結合セグメントを有し、混合結合セグメント中の１ま たは２以上の結合したヌクレオシドが２'−置換されており、ＲＮアーゼＨ活性 化領域が化合物中で混合結合セグメントの間に位置する化合物もまた好ましい。 特に好ましい化合物としては、下記構造から選ばれるものが挙げられる。 略語表：ＭＰ＝ラセミメチルホスホネート結合（結合したヌクレオシド間）；Ｍ Ｐ（Ｒ）＝キラル的に選択されたＲ_P−メチルホスホネート結合；ＤＥ＝ホスホ ジエステル結合；ＰＳ＝ホスホロチオエート結合；ＰＳ２＝ホスホロジチオエー ト結合；ＰＡｍ＝ホスホロアミデート結合；ＴＥ＝ホスホトリエステル結合；Ｍ ＰＳ＝アルキル（特にメチル）ホスホロチオエート結合；ＰＦ＝ホスホロフルオ リデート結合；ＰＢＨ₃＝ボラノホスフェート結合；ＲＳｉ＝シリル（特にアル キルジ置換シリル）結合；ＣＨ₂＝ホルムアセタール結合；２'ＯＭｅ＝２'−メ トキシ−置換（または他の低級アルコキシ、アリルオキシまたはハロ置換）され たヌクレオシド残基、示した結合構造を用いて結合；「に富む」とは、セグメン ト中の結合のうちで好ましくは少なくとも４０％（１００％まで）のＲ_P−選択 された結合を含む結合のセグメントをいい、それゆえ、ラセミおよびキラル的に 選択されたＲヌクレオシド間結合構造の混合配列を含む；スラッシュで分けた結 合構造は、場合によっては一連の複数のまたは繰り返し混合結合配列ブロック中 に、示した結合構造を含む混合結合セグメントを示す。 他の側面において、本発明は、内生または外来の遺伝情報の発現に起因する生 体における疾患または他の状態の治療または診断に有用な改良されたアンチセン スオリゴヌクレオシド組成物を包含する。本発明の化合物および組成物はまた、 かかる状態をインビトロまたは他の仕方で研究するうえでも有用である。他の態 様において、本発明はかかる状態の治療、診断または研究方法を提供する。 本発明の他の側面および目的は、下記の詳細な記載から明らかとなるであろう 。図面の簡単な説明 図１および２は、本発明の種々の化合物およびセグメントのヌクレアーゼ安定 性を他の混合結合化合物と比較して経時的に示すグラフである。 図３および４は、標的タンパク質の合成（図３）および非標的タンパク質の合 成（図４）の抑制における、キラル的に選択された本発明の化合物とキラル的に 選択されない化合物の用量−応答作用を示す棒グラフである。 図５は、本発明のキラル的に選択された化合物とキラル的に選択されない化合 物のＲＮアーゼＨ活性を経時的に示すグラフである。 図６〜１０は、本発明の化合物を構築するうえで有用なシントンおよび中間体 を示す。 図１１は、本発明の種々の２'−糖−置換された化合物および非置換化合物に よるＲＮＡ開裂に関する動力学的データを示すグラフである。詳細な説明 本発明を完全に評価するには、本発明のＲＮアーゼＨ開裂法のもとになってい る競合パラメータを理解する必要がある。第一義的に重要なパラメータとして、 オリゴヌクレオシド−標的結合親和性、ＲＮアーゼＨ開裂速度、特異性／ミスマ ッチ効果、プロセシングリボソームによるオリゴヌクレオシド置換、およびヌク レアーゼ安定性を含む多くのパラメータが存在する。下記記載から明らかとなる であろうように、これら競合パラメータの適当なバランスには、オリゴヌクレオ シド化合物がＲＮアーゼＨ開裂速度に比べて大き過ぎない結合親和性（たとえば 、アフィニティー定数Ｋ_Aによって定量される）を有することが必要である。本 発明は、この条件並びに下記に示す他の条件を満足する構造を提供する。 本発明の標的遺伝子配列のＲＮアーゼＨ開裂法は、オリゴヌクレオシド化合物 が標的配列にハイブリダイズすること、およびオリゴヌクレオシドがＲＮアーゼ Ｈ酵素による標的配列の開裂が行われるに充分長いハイブリダイゼーション占有 時間を有することが必要である。オリゴヌクレオシド−標的ハイブリダイゼーシ ョンの最初の工程は、一次速度論の観点から、Ｋ_Aを定める正の速度定数および 逆の速度定数（ｋ₁およびｋ_-1）（Ｋ_A＝ｋ₁／ｋ_-1）によって支配される。つい で、標的の開裂（本質的に不可逆である）の速度は下記のように速度定数ｋ₂に よって支配される。 オリゴマー ＋ 標的鎖 ｋ₁↓↑ｋ_-1 ハイブリダイズしたオリゴマー／標的鎖 ｋ₂↓［ＲＮアーゼＨ］ 遊離したオリゴマー ＋ 標的開裂断片 他に考慮すべきことは置くとして、標的の開裂はＫ_Aおよびｋ₂の両者を最大に することによって最適化されるであろう。しかしながら、このことには、オリゴ ヌクレオシドと開裂（たとえば、細胞）媒体中に存在する所望でない核酸配列と の間の非特異的な結合（すなわち、ミスマッチ）（所望でない配列の所望でない 開裂という結果となる）の問題は考慮に入れられていない。この単純なアプロー チはまた、宿主のリボソームが標的ｍＲＮＡ配列に沿ってプロセスするたびに、 高い結合親和性を有するオリゴヌクレオシドが一般にそのハイブリダイズした状 態から置換され、それゆえＲＮアーゼＨに媒体された開裂を活性化しえないであ ろう事実をも考慮に入れていない。 まず、アンチセンス開裂化合物との高い標的特異性を達成するという難題を考 察してみよう。哺乳動物の細胞は一般に、約３×１０⁷のリボヌクレオチドを含 むＲＮＡ集団を含む。この集団内で４種の天然に存在するヌクレオチドが統計的 にランダムに分布をしていると想定することにより、正確な塩基−塩基相補性を 有する集団中の「ミスマッチ」配列の全数、および１または２以上の塩基ミスマ ッチを有する「ミスマッチ」配列の数を所定の長さの標的配列について近づける こ とができる。（もちろん、所定の哺乳動物細胞集団中でのリボヌクレオチドの実 際の分布は本当にはランダムではないであろうが、にもかかわらず、かかる統計 的分析は存在するミスマッチ配列の確率の解明に役立つものである。）下記表は 、かかる集団中に存在する標的の数をミスマッチの数（０〜５）および標的配列 の長さ（１２、１５または１８）の関数として表したものである。 ミスマッチ／長さ 標的 ０／１２ １.８ ０／１５ ２.８×１０^-2 １／１５ １.２４ ２／１５ ２６ ３／１５ ３４０ ０／１８ ４.４×１０^-4 １／１８ ２.４×１０^-2 ２／１８ ０.６２ ３／１８ ９.６ ４／１８ １０９ ５／１８ ９３０ 特に単一塩基ミスマッチが増加するにつれ、わずか１２ヌクレオシドの長さの 標的配列についても相当の数の潜在的ミスマッチ配列が存在することがわかるで あろう。所定のミスマッチニ本鎖のＫ_Aがミスマッチした標的へのアンチセンス オリゴマーのかなりのハイブリダイゼーションを可能とするほどに充分に高けれ ば、ミスマッチした標的の意図しないおよび所望でない開裂が起こる結果となる 。たとえば、１２〜１８ヌクレオシドアンチセンスオリゴマーと意図しないミス マッチＲＮＡ配列との間の１塩基ミスマッチの場合を考えてみよう。本発明者ら は、正しい「マッチ」ハイブリダイゼーションのＫ_Aは、一般に、正しくない「 ミスマッチ」ハイブリダイゼーションのＫ_Aよりも１００を越えるオーダーで上 回ることはないことを確かめた。さらに、ハイブリダイゼーションの正の速度定 数（ｋ₁）はマッチとミスマッチとでほぼ同じであろう。なぜなら、正のハイブ リダイ ゼーションは一般に、多くは単一塩基ミスマッチの効果を覆い隠そうとする液相 分子間暴露（exposure）の物理学によって支配されるからである。この場合、ハ イブリダイゼーション「オフ速度」（ｋ_-1）は、ミスマッチは正しいマッチより も１００倍以上とはならない。ここで、開裂速度定数ｋ₂がミスマッチについて 逆速度定数ｋ_-1よりも実質的に小さくなければ、意図しないミスマッチ核酸配列 が開裂されるであろう（適切にマッチした標的配列とともに）ことがわかるであ ろう。また、ｋ₂がｋ_-1（マッチ）のオーダーの値を有するがｋ_-1（ミスマッチ ）よりもはるかに小さい場合に、意図した標的配列の特異性が最適となることも わかるであろう。 ｋ_-1（マッチ） ≒ ｋ₂ ＜＜ ｋ_-1（ミスマッチ） 加えて、本発明は、一般にＲＮＡ翻訳の過程で標的ｍＲＮＡのコード領域で起 こる、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオシドのリボソームによる置換をも考慮 に入れている。リボソームによるプロセス速度はＲＮＡにより若干異なるが、一 般にｍＲＮＡ上の単一の地点を各１０〜１５秒毎に通過するものとして計算する 。所定のオリゴヌクレオシドのＫ_A（マッチ）が１０¹⁰Ｍ^-1であり、Ｋ_A（ミスマ ッチ）が１０⁸Ｍ^-1であるならば、ハイブリダイゼーション占有時間の半減期（ ｔ_1/2）はマッチおよびミスマッチについてそれぞれ約２８分および１７秒であ ろう。しかしながら、リボソームのプロセス速度は非常に速いので正しくマッチ したオリゴヌクレオシドはミスマッチしたオリゴマーと全く同じ頻度で標的配列 から置換され、有効な占有時間はほぼ同じであろう。この場合の結果は、特異性 の観点から、正しくマッチしたハイブリダイゼーションの高親和性定数は無用と なり、非特異的な開裂が意図しない配列特異的な開裂と少なくとも同じ頻度で起 こることであろう。実際、「標的」ＲＮＡ集団中に１を越えるミスマッチ配列が 存在する場合には非特異的な開裂は一層高頻度で起こるであろう。 このようなことを考慮に入れたうえで、本発明者らは、本発明のＲＮアーゼＨ 活性化オリゴヌクレオシド化合物の結合親和性定数を、一般に標的ｍＲＮＡのコ ード領域中の標的に対して１０¹⁰Ｍ^-1を越えない値に限定するのが有利であるこ とを見いだした。本発明の化合物の好ましいＫ_A値は、１０⁷〜１０¹⁰Ｍ^-1の範囲 である。そのような場合、「オフ速度」は一層高い結合親和性を有する化合物に 比べると比較的高いであろうから、比較的高い開裂速度を有する化合物を利用す ることが可能であり、また望ましい。それゆえ、本発明者らは、本発明の化合物 の開裂速度定数を１〜１０^-5秒^-1、好ましくは１０^-1〜１０^-4秒^-4、最も好まし くは１０^-2〜１０^-3秒^-1の範囲に制御することが有利であることを見いだした。 開裂速度は、２−ミスマッチ標的に対して完全な「マッチ」の開裂比が少なくと も３：１となるように選択するのが好ましい。 対照的に、標的ｍＲＮＡ部位の非コード領域（たとえば、５'−キャップ領域 、５'−非翻訳領域、開始コドン領域、３'−非翻訳領域、スプライスアクセプタ ーまたはドナー部位、イントロンブランチ部位、ポリアデニル化部位）において は、タンパク質産生の抑制はアンチセンスオリゴヌクレオシドの適当なハイブリ ダイゼーションによる翻訳過程に先立って行うことができ、ハイブリダイズした オリゴマーのリボソームによる置換は一般に起こらない。その結果、コード領域 に関して上記で記載した特異性を損なうことなく、一層高い結合特異性（および 一層高い占有時間の半減期）を有するオリゴヌクレオシドを非コード領域に利用 することができる。この場合、結合親和性の上限は、ミスマッチハイブリッドの 寿命に対するｍＲＮＡプール中のメッセージの寿命によって与えられるであろう 。それゆえ、典型的なｍＲＮＡ分子種の寿命は（転写によるｍＲＮＡプールの補 充を考慮に入れて）５時間のオーダーである。ミスマッチ配列のハイブリッド寿 命が１時間かまたはそれ以上に近づくと、ミスマッチしたメッセージの翻訳はＲ ＮアーゼＨ開裂機構とは別に立体妨害効果により混乱させられるであろう。その 結果、Ｋ_A（マッチ）は一般に１０⁷〜１０¹³Ｍ^-1の範囲でなければならない。さ らに、この場合には（単一のミスマッチオリゴヌクレオシドのミスマッチハイブ リッド寿命に加えて）ミスマッチ占有の経時的な全体レベルが低くなるように、 比較的低濃度のオリゴヌクレオシドを用いるのが好ましい。（もちろん、非特異 的なミスマッチ開裂を回避するため、コード領域標的と全く同様に非コード領域 での標的に対してＲＮアーゼＨ媒体開裂の速度(ｋ₂)はｋ^-1(ミスマッチ)よりも はるかに低くなければならない。） Ｋ_A、ｋ₁、Ｋ_-1およびｋ₂の値は、当該技術分野で知られた方法により確かめ ることができる。平衡結合定数であるＫ_Aの決定には、単一種および多量体種の （絶対的および相対的）濃度の測定および完全な平衡を確実にするに充分な時間 が必要である。オリゴマーの平衡ハイブリダイゼーションは、ゲルシフト（リマ （Ｌima）ら、Ｂiochemistry ３１、１２０５５〜６１（１９９２））、鎖開裂 （ヤング（Ｙoung,Ｓ.）、ワグナー（Ｗagner,Ｒ.Ｗ.）、Ｎucleic Ａcids Ｒes earch １９、２４６３〜７０（１９９１））、フィルター結合（マックグロー（ ＭcＧraw,Ｒ.Ａ.）ら、ＢioＴechniques ８、６７４〜６７８）、または平衡透 析（ベビラッカ（Ｂevilacqua,Ｐ.Ｃ.）およびターナー（Ｔurner,Ｄ.Ｈ.）、Ｂ iochemistry ３０、１０６３２〜４０（１９９１））などのような単一種と多量 体種とを物理的に分離する直接法により検討することができる。間接法は多量体 状態と一本鎖状態の物理化学的特性に基づくものであり、光学的融解（アルバー ゴ（Ａlbergo,Ｄ.Ｄ.）ら、Ｂiochemistry ２０、１４０９〜１３（１９８１） ）および示差走査熱量測定（アルバーゴら、上記文献）などの方法を含む。これ ら刊行物は参照のため本明細書中に引用する。 オン速度（ｋ₁）およびオフ速度（ｋ_-1）の速度論的測定には、平衡結合定数 決定と同じ検出法の多くを用いるが、経時的な種の生成または消失の正確な相関 に依存する。オフ速度は、上記直接法によって検討することができるし、光学的 方法およびプロトンの重水素交換の核磁気共鳴（レロイ（Ｌeroy）ら、Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology ２００、２２３〜３８（１９８８））によって間接的 に検討することもできる。オン速度は、等式ｋ₁＝Ｋ_A×ｋ_-1を用いてＫ_Aおよび ｋ_-1から決定することができる。オリゴマーｋ₁の測定は、温度ジャンプ速度論 （ウイリアムズ（Ｗilliams,Ａ.Ｐ.）ら、Ｂiochemistry ２８、４８３〜４２９ １（１９８９）、およびターナー、Ｉnvestigations of Ｒates and Ｍechanism s of Ｒeactions ６、１４１〜１８９）などの特別の速度論的方法により行うこ とができる。上記刊行物もまた参照のため本明細書中に引用する。 上記結合定数および速度定数の好ましい値は、本明細書の開示に照らして、本 発明のオリゴヌクレオシドを用いる生物学的系に応じて種々変わるであろうこと が理解されるであろう。上記値は、実質的に二次構造をとらない一本鎖標的配列 に本発明のオリゴヌクレオシドがハイブリダイゼーションすることに基づいた好 ましい値を表す。実質的な二次構造を有するｍＲＮＡ分子の領域中に標的配列が 位置する場合には、二次構造をとった標的領域に関するオリゴヌクレオシドの結 合親和性は同じヌクレオシド配列を有する非構造（すなわち、合成）標的配列に 関して測定したものに比べてはるかに低いかもしれない。幾つかの場合には、非 構造鎖のＫ_Aは構造鎖のＫ_Aに比べて１０⁷倍も大きくなる。意図する二次構造を 有する標的に関して得られるＫ_Aが、たとえば非構造のミスマッチ配列に比べて 余りにも低い場合には、特異性の問題が起こる。 この状況に対する一つの好ましいアプローチは、本発明のオリゴヌクレオシド の結合親和性に悪影響を及ぼさないように、充分な二次構造を有しない標的ｍＲ ＮＡ中の領域をＲＮアーゼＨ媒体開裂にターゲティングすることである。核酸の 二次構造は、最近、ヤーガー（Ｊaeger）らによって概説されているように（Ａn nual Ｒeviews in Ｂiochemistry ６２、２５５〜２８７（１９９３））、ヌク レアーゼ、塩基修飾剤、または糖−リン酸骨格修飾試薬を用いて直接決定するこ とができる。他のアプローチは２またはそれ以上のアンチセンス化合物を直列に 用いることであり、これらアンチセンス化合物のうち少なくとも一つは本発明の キメラオリゴヌクレオシドであり、これらアンチセンス化合物は二次構造を有す るｍＲＮＡ標的領域中の隣接する領域にハイブリダイズするように選択したヌク レオシド塩基配列を有する。隣接してハイブリダイズするアンチセンス化合物は ＲＮＡ分子の二次構造を破壊するために用いることができ、それゆえ各化合物の 有効なＫ_Aを高めうることが知られている。この方法を用いることにより、本明 細書に教示する制御された結合親和性を有するオリゴヌクレオシド化合物を用い て二次構造を有する標的ｍＲＮＡ領域の開裂を特異的に行うことができる。 本明細書の発明の背景の項目で説明したように、アンチセンスの分野の多くの 研究者が、アンチセンスオリゴヌクレオシドの結合親和性を増大させ、ＲＮアー ゼＨ活性化を最適化し、ヌクレアーゼ耐性を改善し、および標的特異性を改善す るための種々の努力を報告している。上記詳細な説明に照らして、これらアプロ ーチの多くが競合するまたは矛盾する考察を含んでいることがわかるであろう。 たとえば、上記で論じたように、増大した結合親和性はそれが標的特異性に関し て生み出す問題を考慮すれば必ずしも常に望ましいとは限らない。２'−メトキ シ置換基などのような結合親和性を増大させるある種の構造、あるいはメチルホ スホネートヌクレオシド間結合などのようなヌクレアーゼ耐性を増大させるある 種の構造は、ＲＮアーゼＨ開裂を活性化することができないように思われる。逆 に、ホスホジエステル結合などのような高いＲＮアーゼＨ活性化をもたらすある 種の構造はヌクレアーゼに不安定であり、一方、ホスホロチオエート結合（およ びホスホジエステル結合も）などの他の構造は、とりわけ一層長い配列において ミスマッチ「オフ速度」（ｋ_-1）に近づくまたは越える開裂速度（ｋ₂）という 結果となる。本発明は、これら競合する考察を考慮に入れ、本明細書に記載する 他の目的を達成する改良されたオリゴヌクレオシド構造を提供する。 本発明のオリゴヌクレオシド化合物は、標的核酸配列の標的領域に相補的な塩 基配列を有する連結したヌクレオシドからなり、ＲＮアーゼＨ活性化領域および 少なくとも一つのＲＮアーゼＨを活性化しない領域を含む。哺乳動物のＲＮアー ゼＨとともに用いる場合は（たとえば、哺乳動物細胞系において）、ＲＮアーゼ Ｈ活性化領域は、好ましい態様において、４〜約８の荷電（アニオン性）ヌクレ オシド間結合構造により連結された５〜約９の連続した２'−非置換ヌクレオシ ドのセグメントを含む。細菌のＲＮアーゼＨとともに用いる場合は（たとえば、 細菌細胞系において、または哺乳動物の抗菌療法において）、ＲＮアーゼＨ活性 化領域は、好ましい態様において、２〜約６の荷電ヌクレオシド間結合構造によ り連結された３〜約７の連続した２'−非置換ヌクレオシドを含む。 ＲＮアーゼＨを活性化しない領域は、一つの態様において、１または２以上の キラル的に選択されたＲ_P−結合を含む、少なくとも３の連結したヌクレオシド 、より好ましくは少なくとも５の連結したヌクレオシドの単一のセグメントを含 む。関連する第二の好ましい態様において、ＲＮアーゼＨを活性化しない領域は ２つの隔てられたフランキングセグメントを含み、各セグメントは少なくとも約 ２の連結したヌクレオシド、より好ましくは少なくとも約４の連結したヌクレオ シド （またはこれら２つの隔てられたセグメント中に合計、少なくとも約８の連結し たヌクレオシド）を含み、結合の少なくとも１または２以上はキラル的に選択さ れたＲ_P−結合である。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、かかる２つの隔てられたＲ ＮアーゼＨを活性化しない領域によって化合物中でフランキングされているのが 好ましい。第三の関連する好ましい態様において、ＲＮアーゼＨを活性化しない 領域は、（１）ラセミメチル（または低級アルキル）ホスホネート（ＭＰ）、メ チル（または低級アルキル）ホスホノチオエート（ＭＰＳ）、アミノアルキルホ スホネート（ＡＡＰ）またはアミノアルキルホスホノチオエート（ＡＡＰＳ）結 合と、それと交互の（２）負に荷電したホスフェート、ホスホロチオエートまた はホスホロジチオエート（たとえば、ＤＥ、ＰＳ、またはＰＳ２）結合、からな るラセミ（キラル的に選択されていない）ヌクレオシド間結合の交互配列を含む 。上記態様のいずれの場合も、ＲＮアーゼＨを活性化しない領域中の１または２ 以上のヌクレオシドは、ＲＮアーゼＨ活性化特性を制御（選択的に減少または排 除）しながら、とりわけ結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を増大させるために ２'−置換されていてよい。ホスホジエステル結合（ＲＮアーゼＨを活性化しな い領域中に存在するなら）の１または２以上またはすべてが２'−置換されてい るのが特に好ましいが、他の２'−置換もＲＮアーゼＨを活性化しない領域中で 有用に用いることができる。 一つの例として、本発明のオリゴマーに用いるホスホネートヌクレオシド間結 合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合のリン上の２つの非結合性（または 非架橋性）酸素の一方が低級アルキル基で置換されていてよく、その場合、他方 の非結合性酸素はそのままであるかまたは硫黄で置換される。低級アルキルによ る酸素の置換はリンの周囲にキラルな環境を生成し、これはいずれの非結合性酸 素が低級アルキルで置換されたかに依存してＲ_PかまたはＲ_Sのいずれかで示され る。Ｒ_PおよびＲ_S配置は下記のように示すことができる。 （式中、Ｘは酸素または硫黄であり、Ｒは低級アルキルである） 本発明者らは、キラル的に選択したヌクレオシド間結合構造を含むポリヌクレ オシドセグメントを本発明のＲＮアーゼＨ活性化オリゴヌクレオシド化合物中に 選択的に導入することにより、該化合物の結合親和性を有効に制御しうることを 見いだした。かかるキラル的に選択したＲ_Pに富むセグメントは、対応するラセ ミ配列よりも大きな結合親和性を与える。本発明者らはまた、荷電したヌクレオ シド間結合構造（ホスホジエステルを含む）および荷電していないヌクレオシド 間結合構造（とりわけ、ラセミのまたはキラル的に選択したメチルホスホネート ）の両者を含む複数のまたは繰り返しブロックまたはシントンを用い、キラル的 に富ませまたは富ませることなく、結合親和性を選択的に増大させおよびヌクレ アーゼ耐性を改善することを実際的な仕方で達成しうることをも見いだした。か かるシントンは、とりわけ荷電（アニオン性）結合構造がホスホジエステル結合 である場合、その配列中に１を越える連続した荷電結合構造を含まないのが好ま しい。 これら本発明の制御しうる結合親和性ポリヌクレオシドセグメントは、ヌクレ アーゼ耐性の増大、制御しうるＲＮアーゼＨ活性化特性および容易な合成という 利点を提供する。それゆえ、たとえば、結合構造は、ＲＮアーゼＨを実質的に活 性化せずヌクレアーゼに対しても耐性である１または２以上の非荷電の修飾した （ホスホジエステルでない）結合構造を含むように選択することができる。本明 細書中に記載する２'−置換基の使用もまた、荷電結合構造、とりわけホスホジ エステル結合を含むセグメントのヌクレアーゼ耐性を増大させる。さらに、個々 のシントンを合成ブロックとして前以て組み立て、ついでこれを組和せて、２ま たはそれ以上の異なるブロック構造または単一の繰り返しブロック構造を含む制 御可能な結合親和性セグメントとすることができる。 記載したキラル選択法は本発明の化合物のＲＮアーゼＨ活性化領域およびＲＮ アーゼＨを活性化しない領域の両者に有効に用いることができるが、後者の領域 に用いるのが最も有利である。加えて、キラル選択は、本明細書に記載する複数 のまたは繰り返し混合結合構造ブロックを用いて行うのが好ましい。 本発明のキラル的に選択したポリヌクレオシドセグメントは、Ｒ_Pキラル結合 に関して富むまたは純粋なヌクレオシド間結合構造の配列を含む。かかる配列は 、セグメント中のキラル（不斉）結合構造の少なくとも約７５％、またはセグメ ント中の全結合構造の少なくとも約４０％がＲ_Pキラリティーを有する場合にキ ラル性に富むといわれる。下記に示すように、少なくとも約７５％のキラル性に 富むことは、一連の二量体ヌクレオシドブロック（シントン）をカップリングす ることによって合成的に行うことができ、その際、各シントンの２つのヌクレオ シドを連結する構造は修飾された（ホスホジエステルでない）Ｒ_P−キラルな連 結構造であり、各シントン間の連結構造は不斉である。一連のシントン間のカッ プリング反応は最も簡単な場合はラセミ的に行われる。このことは、シントン間 結合の約半分がＲ_P−キラルであり、得られる混合キラル／ラセミセグメント中 のすべてのヌクレオシド間結合の約７５％がＲ_P−キラルであろうことを意味す る。（「ラセミ」反応は特別の場合には一つのジアステレオマーに一層向けて駆 動されることに注意すべきである。たとえば、本発明に関連した考察は、２'− Ｏ−メチル置換したメチルホスホネートモノマーのカップリングによりＳ_P−キ ラルなヌクレオシド間結合が優先的に導かれることを示した。） ７５％を越える不斉結合においてキラル性に富むことは、たとえば３量体ヌク レオシドシントンを結合させることによって行うことができ、その際、ブロック 内の両ヌクレオシド間結合はＲ_P−キラルであり、各３量体シントンはラセミ的 に（またはアキラルに）結合される。かかる３量体シントンの調製について、下 記に合成反応式を示す。別法として、個々のヌクレオシド間またはシントン間の 結合を不斉結合構造を用いて立体特異的に行うことができ、この場合、セグメン ト中のすべての結合はＲ_P−キラルである。約７５％（または全結合の約４０％ ） を越える不斉結合のキラル性に富むセグメントを得ることは本発明の好ましい実 施にとって必要とは思われないが、かかる高度に富むセグメントは一般に一層高 い結合親和性特性を示すであろう。 上記で考察したように、本発明のキラル的に選択した混合セグメントは、その 中に１または２以上のアキラルな（不斉でない）結合構造を含んでいてよい。そ れゆえ、本発明の一つの好ましい構造において、キラル的に選択した混合セグメ ントは、交互に存在するホスホジエステル（アキラル）結合構造およびＲ_P−メ チルホスホネート（または他のキラルな）結合構造からなる。かかる交互の繰り 返し結合配列セグメントは二量体ヌクレオシドブロックを用いて調製することが でき、その際、ブロックの２つのヌクレオシドを連結する構造はＲ_P−キラルな メチルホスホネート結合構造であり、各ブロックはホスホジエステル（または他 のアキラルな）結合構造を用いてアキラルに結合されている。このようにして調 製したポリヌクレオシドセグメントは、セグメント中のすべてのキラル結合がＲ_P コンホメーションであり、全結合の実質的に５０％がＲ_P−キラルであるのでキ ラル的に純粋であるのがわかるであろう。 本発明者らは、本発明に関連した考察において、メチルホスホネートＲ_P結合 に富むことが、ランダムなラセミコンホメーションに比べてＲ_Pコンホメーショ ンにあるヌクレオシド間結合当たり融点（Ｔｍ）が約０.９〜１.５℃上昇させる ことを確かめた。このことにより、各選択した追加的なＲ_P結合につき約１.８の オーダー（または２'−Ｏ−メチル置換残基の場合は約２.６のオーダー）で結合 親和性（Ｋ_A）が増大することになる。ここで、キラル的に選択された結合構造 セグメントを本発明の化合物中で上手に用いることにより、上記詳細な説明中に 示した目的と一致する仕方で結合親和性を制御しうることが評価されるであろう 。下記実施例は、意図する標的配列に対する特異性は保持しながら、ラセミ化合 物に比べて増加した有効性をかかるキラル的に選択した化合物において達成する ことができることを示している。 上記で説明したように、本発明の他の目的は、制御されたＲＮアーゼＨ活性化 特性を有するオリゴヌクレオシド構造を提供することにある。この目的は、本発 明において、標的核酸鎖のＲＮアーゼＨ媒体開裂を行うに充分なＲＮアーゼＨ活 性化能を有するＲＮアーゼＨ活性化領域とともに、ＲＮアーゼＨを活性化しない ポリヌクレオシド領域またはＲＮアーゼＨを活性化する能力の減少した領域を化 合物中に導入することにより達成される。これら化合物の両セグメントはヌクレ アーゼ耐性となるように構築するのが好ましい。 これも上記で説明したように、哺乳動物ＲＮアーゼＨ活性化の一つの推定要件 は、アンチセンス化合物が少なくとも４または５の連続した荷電（アニオン性） ヌクレオシド間結合構造（または細菌のＲＮアーゼＨの場合は少なくとも２のか かる結合）の配列を有していなければならず、その際、連結したヌクレオシドは ２'−非置換であることである。逆に、本発明の実施において、ＲＮアーゼＨを 活性化しないセグメントは非荷電の結合構造および／または２'−置換基を有効 に含んでいてよい。ＲＮアーゼＨを活性化しない領域において本明細書に記載し たような修飾した（ホスホジエステルでない）非荷電結合構造を用いることによ り、本発明の化合物はヌクレアーゼ耐性が増大している。さらに、本明細書に記 載する２'−置換基を用いることにより、結合親和性の選択的に制御しうる増加 が得られる。それゆえ、本発明者らは、本発明に関連した考察において、メチル ホスホネートにより連結したオリゴマーにおける２'−Ｏ−メチルヌクレオシド の使用が、２'−デオキシの２'−Ｏ−メチルヌクレオシドによる置換当たりＴｍ が約１℃上昇する結果となることを確かめた。さらに、本発明者らはまた、ホス ホジエステル結合により連結されたヌクレオシドに２'−置換基を使用すること によりヌクレアーゼ耐性が増大することも確かめた。 これら目的に適合して、本発明の好ましい２'−置換基としては、低級（１〜 約３の炭素原子）アルコキシ、アリルオキシ、およびハロ（好ましくはフルオロ ）置換基が挙げられる。メトキシ基が特に好ましい。一般に、電子吸引性の２' −置換基が本発明の化合物の結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を増加させるう えで有用である。というのは、かかる置換基は置換された糖基において３'−エ ンドコンホメーションを生成すると考えられるからである。 さらに、とりわけ荷電または非荷電の結合構造の複数または繰り返しブロック を含む結合配列において、ＲＮアーゼＨを活性化しないセグメント中に限られた 割合の荷電結合構造（ホスホジエステル結合を含む）を有効に導入することがで きることも見いだした。かかるセグメントは、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性に おける制御しうる増大、および制御されたＲＮアーゼＨ活性化特性をもたらし、 その結果、意図する標的核酸配列に対する特異性の高められた化合物が得られる 。 本発明のＲＮアーゼＨを活性化しないセグメントに用いる好ましい結合構造お よび２'−置換基としては以下のものが挙げられる。 略語表：ＭＰ＝ラセミメチルホスホネート結合（結合したヌクレオシド間）；Ｍ Ｐ（Ｒ）＝キラル的に選択されたＲ_P−メチルホスホネート結合；ＤＥ＝ホスホ ジエステル結合；ＰＳ＝ホスホロチオエート結合；ＰＳ２＝ホスホロジチオエー ト結合；ＰＡｍ＝ホスホロアミデート結合；ＴＥ＝ホスホトリエステル結合；Ｍ ＰＳ＝アルキル（特にメチル）ホスホロチオエート結合；ＰＦ＝ホスホロフルオ リデート結合；ＰＢＨ₃＝ボラノホスフェート結合；ＲＳｉ＝シリル（特にアル キルジ置換シリル）結合；ＣＨ₂＝ホルムアセタール結合；２'ＯＭｅ＝２'−メ トキシ−置換（または他の低級アルコキシ、アリルオキシまたはハロ置換）され たヌクレオシド残基、示した結合構造を用いて結合；「に富む」とは、セグメン ト中の結合のうちで好ましくは少なくとも４０％（１００％まで）のＲ_P−選択 された結合を含む結合のセグメントをいい、それゆえ、ラセミおよびキラル的に 選択されたＲヌクレオシド間結合構造の混合配列を含む；スラッシュで分けた結 合構造は、場合によっては一連の複数のまたは繰り返し混合結合配列ブロック中 に、示した結合構造を含む混合結合セグメントを示す。 上記から選択されたセグメントを有する化合物であって、１または２以上の（ またはすべての）メチルホスホネート（ＭＰまたはＭＰ（Ｒ））結合が低級アル キル（とりわけメチル）ホスホノチオエート（ＭＰＳまたはＭＰＳ（Ｒ））結合 で、またはアミノアルキルホスホネート（ＡＡＰまたはＡＡＰ（Ｒ））またはア ミノアルキルホスホノチオエート（ＡＡＰＳまたはＡＡＰＳ（Ｒ））結合で置換 されたものもまた好ましい。かかる化合物は、かかる結合を含む２'−置換残基 、並 びにこれらＲ_P−キラル結合に「富む」化合物を包含する。後者の例としては、 ＭＰ（ラセミ）結合とＡＡＰ（Ｒ）結合との交互配列、またはＭＰ（Ｒ）結合と ＡＡＰ（ラセミ）結合との交互配列、またはＡＡＰ（ラセミ）結合とＡＡＰ（Ｒ ）結合との交互配列を有する化合物が挙げられる。上記から選択された化合物で あって、１または２以上の（またはすべての）Ｒ_P−キラルなメチルホスホノチ オエート（ＭＰ（Ｒ））結合がラセミメチルホスホネート（ＭＰ）結合で、好ま しくは交互配列において第二の異なる結合構造で、およびより好ましくは構造ま たは他の混合配列においてホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホ ロジチオエート結合で置換されたものもまた好ましい。 上記混合結合セグメントは、それぞれ、上記各結合構造を少なくとも一つ含む であろう。合成の観点からは、上記結合構造を交互に用いるかまたは両構造を有 する繰り返し配列を用いるのが都合がよいが、このことは必ずしも必要ではない 。上記構造結合セグメントを２またはそれ以上、化合物の所定のＲＮアーゼＨを 活性化しない領域内で連続的に結合させることができる。この場合、合成的な観 点から、各混合結合群から別個のシントンを選択し、これらを単一の領域中で組 み合わせるのが都合がよい。 それゆえ、本発明が、混合ヌクレオシド間結合を含む１または２以上のセグメ ントを有する合成オリゴマー、とりわけ単一の非ホスホネートヌクレオシド間結 合を散在させたキラル的に純粋なまたは富むホスホネートヌクレオシド間結合を 有するオリゴマー、並びにそれらの調製方法を提供することは明らかであろう。 かかるホスホネートヌクレオシド間結合としては、炭素数１〜３の低級アルキル ホスホネートヌクレオシド間結合および炭素数１〜３の低級アルキルホスホノチ オエート（アルキルチオホスホネート）ヌクレオシド間結合が挙げられる。これ ら混合オリゴマーセグメントは、単一の非ホスホネートヌクレオシド間結合の間 に分散してホスホネートヌクレオシド間結合を、ホスホネート１に対して約１か ら約４の比で有するのが好ましい。好ましい態様によれば、かかるオリゴマーは 、非ホスホネートヌクレオシド間結合と交互に存在する交互のキラル的に純粋な ホスホネートヌクレオシド間結合を有する。とりわけ１または２以上のＲＮア ーゼＨを活性化しない領域中にかかるセグメントを含むオリゴマーは、一本鎖Ｒ ＮＡ標的配列の発現または翻訳を防ぎまたは妨害するのに用いることができる。 キメラオリゴヌクレオシドは、ＲＮアーゼＨ活性化領域およびＲＮアーゼＨを活 性化しない領域を含む全体にわたるヌクレオシド塩基配列を有し、これはＲＮＡ 標的配列とハイブリダイズするに充分に相補的である。 好ましいキラル的に純粋なホスホネート結合としては、Ｒ_P低級アルキルホス ホネート結合が挙げられ、さらに好ましくはＲ_Pメチルホスホネートヌクレオシ ド間結合である。好ましい非ホスホネート結合としては、ホスホジエステル、ホ スホロチオエートおよびホスホロジチオエートが挙げられるが、ホスホルアミデ ート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタールおよび シリルヌクレオシド間結合もまた用いることができる。特に好ましい態様によれ ば、化合物のＲＮアーゼＨを活性化しない領域中でホスホジエステル結合と交互 に存在するキラル的に純粋なＲ_P−メチルホスホネート結合を有するＲ_Pに富むオ リゴマーが提供される。これら交互のオリゴマーは、ＲＮＡ標的配列に対して高 い結合親和性を示し、さらに増大したヌクレアーゼ耐性および特異性をも示すこ とがわかった。 本発明は同様に、非ホスホネートヌクレオシド間結合、好ましくはホスホジエ ステルまたはホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合の間に分散し たＲ_P配置について高められたメチルホスホネートヌクレオシド間結合を有する １または２以上のセグメントを含む、遺伝子発現のアンチセンスインヒビターと しての高い有効性を有するキメラアンチセンスオリゴマーを包含する。本発明者 らは、キラル性に富むオリゴマーがＲＮＡ標的配置に一層堅固にハイブリダイズ し、同じ非ホスホネートヌクレオシド間結合とともにラセミＭＰヌクレオシド間 結合を有するオリゴマーと比べてＲＮＡ標的の翻訳を抑制するうえで高い有効性 を示すに違いないことを見いだした。 上記で説明したように、本発明のＲＮアーゼＨ活性化領域は、開裂に利用され るＲＮアーゼＨ酵素の種（哺乳動物または細菌）に依存して種々の最小および最 適の長さを有する。いずれの場合も、ＲＮアーゼＨ活性化領域は、荷電されたヌ クレオシド間結合により連結された連続した２'−非置換ヌクレオシドの配列を 含むのが好ましい。ＲＮアーゼＨ活性化領域の好ましい結合構造および混合結合 構造は、下記のものから選ばれる。 ＤＥ ＰＳ２ ＰＳ ＰＳ２／ＤＥ ＰＳ／ＤＥ ＰＳ／ＰＳ２ 特に好ましい結合構造は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。 関連する態様において、末端に位置するＲＮアーゼＨ活性化領域を有する本発 明の２つのオリゴヌクレオシドは、標的ｍＲＮＡ部位の開裂を行うために直列で 用いられる。各化合物のヌクレオシド塩基配列は、標的ｍＲＮＡ鎖中に隣接領域 に相補的となるように選択する。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、標的ｍＲＮＡ部位 の開裂を行うために直列で用いられる。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、標的中の隣 接領域にともにハイブリダイズしたときにこれら２つのＲＮアーゼＨ活性化領域 が違いに隣接し、ｍＲＮＡ鎖の全体の標的配列中の隣接する標的サブ領域にハイ ブリダイズするように、各化合物の５'−末端および３'−末端に位置する。これ ら２つのＲＮアーゼＨ活性化領域は、標的領域のＲＮアーゼＨに媒体された開裂 に関して互いに補うように作用する。これら２つの化合物には、その他の場合に 要求されるよりも短いＲＮアーゼＨ活性化領域を用いることができ、特異性も、 開裂を行うために相互ハイブリダイゼーションが必要な程度に増加するに違いな い。 前以て決定されたヌクレオシド単位の塩基配列を有し、非ホスホネート結合と ともにキラル的に純粋なホスホネートヌクレオシド間結合を有し、その際、該ホ スホネート結合は単一の非ホスホネート結合の間に分散している本発明のキメラ オリゴマーまたはそのセグメントを調製するには、キメラ的に純粋なまたはラセ ミのホスホネートまたは他のヌクレオシド間結合を有する前以て決定されたヌク レオシド塩基配列の個々のヌクレオシド二量体、三量体または四量体を互いにカ ップリングすることにより行うことができる。 この観点から、下記式： （式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは炭素数１〜３の低級アルキル、Ｂ１は除去し うるブロッキング基、Ｚは水素、炭素数１〜１０のアルコキシ、ハロゲンまたは 炭素数３〜６のアルケニルオキシ、Ｂは任意に保護されたプリンまたはピリミジ ン塩基、ｎは１、２または３、Ｃｐはカップリング基である）のキメラ的に純粋 なまたはラセミのシントンを用いることができる。カップリング基Ｃｐは、他の シントンにカップリングさせたときに所望の非ホスホネートヌクレオシド間結合 を与えるように都合よく選択される。 一つの好ましいキラル的に選択された合成法によれば、２つのヌクレオシド単 位を連結するホスホネート結合を有するヌクレオシド二量体を調製し、Ｒ_P異性 体およびＳ_P異性体に分離する。ついで、その結果得られるホスホネート結合に おいて定められたキラリティーを有する二量体を、自動ＤＮＡ合成機を用いて一 緒にカップリングできるように誘導体化する。これら二量体は、二量体間で種々 のヌクレオシド間結合のいずれかを与えるカップリング基を有していてよい。１ ６の二量体のストックから、適当な二量体を結合させることによりいかなるヌク レオシド塩基配列のオリゴマーセグメントも合成することができる。所望の数の ヌクレオシドを有するオリゴマーセグメントが得られるまで、大きくなりつつあ るオリゴマー鎖に二量体を加える。得られるオリゴマーセグメントは、すべての 他のヌクレオシド間結合（すなわち、カップリングした二量体単位に本来由来す る結合）に定められたキラリティーを有する。残りのヌクレオシド間結合は、ホ スホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、モルホリノ、ホ スホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセ タール、シリルまたは他の非ホスホネートヌクレオシド間結合などの非ホスホネ ートヌクレオシド間結合を含む。 別法として、三量体や四量体などの一層大きなブロックのヌクレオシドをカッ プリングさせてキラル性に富むオリゴマーを生成させることができる。２つのキ ラル的に純粋なヌクレオシド間結合を有する三量体は、適当なキラル的に純粋な 二量体シントンを他のヌクレオシドにカップリングし、ついでたとえばＲ_Pキラ リティーを選択する場合には、得られたＲ_P−Ｒ_PおよびＲ_P−Ｓ_P三量体を分離す ることにより都合よく調製することができる。得られる三量体は、両ヌクレオシ ド間結合において定められたキラリティーを有する（すなわち、キラル的に純粋 である）。ついで、自動ＤＮＡ合成機を用いてカップリングできるように、三量 体を誘導体化して三量体シントンを得る。三量体シントンは、カップリングして キラル性に富むホスホネートオリゴマーセグメントを与えることのできるカップ リング基を有する。６４の三量体のストックから、適当な三量体を連結させるこ とによりいかなる塩基配列のオリゴマーも合成することができる。所望の数のヌ クレオシドを有するセグメントが得られるまで、三量体を大きくなりつつあるオ リゴマー鎖に連続して加えるか、またはヌクレオシド単量体、二量体および／ま たは四量体とカップリングさせることができる。得られるキメラオリゴマーは、 カップリングしたキラル的に選択した二量体、三量体または四量体のヌクレオシ ド間結合に由来するキラル的に選択したセグメント中のヌクレオシド間結合に定 められたキラリティーを有する。それゆえ、これら三量体を使用することにより 、３つのヌクレオシド間結合当たり約２つに定められたキラリティーのホスホネ ート結合を有するオリゴマーセグメントが得られる。同様の方法に従い、３つの キ ラル的に純粋なヌクレオシド間結合を有する四量体を調製することができ、これ を互いにまたは他のシントン（単量体を含む）とカップリングさせて他のキラル 的に選択したセグメントまたはその部分が得られる。別法として、定められたキ ラリティー（純粋なＲ_Pなど）のヌクレオシド間結合を有する二量体、三量体お よび他の短いオリゴマーを互いにまたは適当な配列で他のシントンとカップリン グさせて、特定の所望の配列および長さのオリゴマーセグメントまたはその部分 を得る。かかるキラル的に選択したセグメントは、さらに化合物の別のセグメン ト、とりわけＲＮアーゼＨ活性化領域を生成する荷電結合構造により連結された 連続した２'−非置換ヌクレオシドのセグメントを生成するヌクレオシドとカッ プリングさせることができる。 別の合成法に従えば、所望のキラル配置を高収率で与えるようにカップリング を指向させるカップリング条件をヌクレオシドシントン（または二量体）に用い る。この方法は、個々のヌクレオシドシントンまたはキラル的に純粋な二量体を カップリングするのに用いることができ、それゆえ、各ホスホネートヌクレオシ ド間結合において所望のキラル配置に富むオリゴマーセグメント、とりわけＲＮ アーゼＨ活性化セグメントが得られる。 本明細書の実施例および詳細な説明に記載するキラル的に選択したメチルホス ホネートおよび他の単量体、二量体、三量体などは、種々の異なる方法によりカ ップリングさせて下記の非限定タイプのヌクレオシド間結合とすることができる ：ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチ オエート、ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート 、ホルムアセタール、およびシリル。 ヌクレオシド間ホスホジエステル結合は、キラル的に選択したまたはラセミの 合成単位（単量体、二量体、三量体、ポリヌクレオシドなど）の３'−ＯＨを、 ホスホトリエステルシントン（リース（Ｒeese,Ｃ.Ｂ.）、（１９７８）Ｔetrah edron ３４、３１４２〜３１７９）、ホスホルアミダイトシントン（ボケージ（ Ｂeaucage,Ｓ.Ｌ.）およびライアー（Ｌyer,Ｒ.Ｐ.）（１９９２）Ｔetrahedron ４８、２２２３〜２３１１）、Ｈ−ホスホネートシントン（フローラー（Ｆroe h ler,Ｂ.Ｃ.）、アグラワル編、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalog s,Ｓynthesis and Ｐroperties,Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology Ｖol.２０、 フマナプレス、トトワ、ニュージャージー、１９９３、６３〜８０頁）、または ホスホロモノクロリダイト試薬（ホグリーフ（Ｈogrefe,Ｒ.Ｉ.）（１９８７） 学位論文、ノースウエスタンユニバーシティー、エバンストン、イリノイ）のい ずれかに変換させることにより得ることができる。 ヌクレオシド間ホスホロチオエート結合は、シントン単位の３'−ＯＨを、ホ スホトリエステルシントン（ステック（Ｓtec,Ｗ.Ｊ.）ら、（１９９１）Ｎucl ．Ａcids Ｒes.１９、５８８３〜５８８８）、ホスホルアミダイトシントン（ラ イアーら（１９９０）ＪＡＣＳ １１２、１２５４〜１２５５）、Ｈ−ホスホネ ートシントン（シーラ（Ｓeela,Ｆ.）およびクレッチマー（Ｋretschmer,Ｕ.） （１９９１）Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.５６、３８６１〜３８６９）、またはホスホロモノ クロリダイト試薬（ホグリーフ（１９８７）学位論文、ノースウエスタンユニバ ーシティー、エバンストン、イリノイ）のいずれかに変換させることにより得る ことができる。 ヌクレオシド間ホスホロジチオエート結合の調製は、本明細書の開示により、 およびゴレンスタイン（Ｇorenstein）らの米国特許第５,２１８,０８８号によ り行うことができる。ヌクレオシド間ホスホトリエステル結合は、合成単位の３ '−ＯＨを、ホスホトリエステルシントン（リース（１９７８）Ｔetrahedron ３ ４、３１４２〜３１７９）、ホスホルアミダイトシントン（ボケージおよびライ アー（１９９２）Ｔetrahedron ４８、２２２３〜２３１１）、Ｈ−ホスホネー トシントン（フローラー、アグラワル編、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides a nd Ａnalogs,Ｓynthesis and Ｐroperties,Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology Ｖol.２０、フマナプレス、トトワ、ニュージャージー、１９９３、６３〜８０ 頁）、またはホスホロモノクロリダイト試薬（ホグリーフ（１９８７）学位論文 、ノースウエスタンユニバーシティー、エバンストン、イリノイ）のいずれかに 変換させることにより、または合成後に（ツリス（Ｔullis）の米国特許第５,０ ２３,２４３号参照）得ることができる。 ヌクレオシド間ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフ ェート、ホルムアセタール、およびシリル結合は、合成単位の３'−ＯＨを適当 なシントンに変換させることにより得ることができる。（上記のそれぞれのシン トンを得るための合成プロトコールについては、アグラワル編、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs,Ｓynthesis and Ｐroperties,Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology Ｖol.２０、フマナプレス、トトワ、ニュージャージー、 １９９３を参照のこと。） 本発明に有用なシントンおよび反応性中間体の化学構造は図６〜１０に示して あり、米国特許出願第０８／１５４,０１３号および０８／１５４,０１４号に一 層詳細に記載されている。 下記の実施例は本発明の種々の重要な側面を示すものであるが、あくまでも例 示にすぎず、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。実施例 実施例１ ＭＰ（Ｒ_P）／ＤＥおよびＭＰ（Ｒ_P）／ＭＰ二量体シントンの調製 Ａ．液相化学を用いたキラル的に純粋なメチルホスホネートヌクレオシド間結合 を有する（ＣＴ）二量体の調製 ２Ｌ容のロト−エバポレーターフラスコ中に、１０.０ｇ（２８ｍＭ）の３'− tert−ブチルジメチルシリルチミジンおよび２６.１ｇ（３５ｍＭ）の５'−ジメ トキシトリチル−Ｎ⁴−イソブチリル−３'−メチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルア ミノホスホルアミダイト−２'−デオキシシチジンを入れた。これら固形分を５ ００ｍｌのアセトニトリル中に溶解し、真空下で蒸発乾固させた。この工程を他 の５００ｍｌのアセトニトリルでも繰り返し、ついでフラスコをアルゴン下に放 置し、ゴム栓で封をした。 ついで、この乾燥固形泡を５００ｍｌのアセトニトリル（「ＡＣＮ」）中に溶 解し、手で撹拌しながら一度に４０４ｍｌのテトラゾール（ＴＨＦ中に１８０ｍ Ｍ、０.４５Ｍテトラゾール）で処理した。手での撹拌を３０秒続け、ついでフ ラスコをさらに２.５分間放置し、その後、反応混合物を２７５ｍｌの酸化剤溶 液（Ｉ₂／Ｈ₂Ｏ／ルチジン／ＴＨＦ；２５ｇ／２.５ｍｌ／１００ｍｌ／９００ ｍｌ）で一度に処理する。この溶液を手で撹拌し、室温で１５分間放置した。つ いで、得られた暗琥珀色の溶液を重亜硫酸塩（２ｇ／２５ｍｌ Ｈ₂Ｏ）で処理 した。この添加により溶液が過剰のヨウ化物と反応して薄琥珀色になった。つい で、この反応混合物を濃厚な油状物に濃縮し、酢酸エチル（「ＥｔＯＡｃ」）（ ５００ｍｌ）中に取り、飽和重炭酸ナトリウム（２×２５０ｍｌ）およびＨ₂Ｏ （２×２５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、薄い 色の固形泡に濃縮し、これをさらに乾燥して粗製の二量体（３５ｇ）を得た。 この粗製の二量体を、５０％アセトニトリルおよび０.１Ｍトリエチルアンモ ニウムアセテート（ＴＥＡＡ、ｐＨ〜７.０）から開始し、２０分かけて１００ ％アセトニトリルまで直線勾配で増加させるプログラム（ＡＣＮＭＥＴＨ）を用 いたＨＰＬＣ（逆相、ウオーターズＣ１８ボンダパック）にかけた。２つの主要 なピークを分離した。４.５分での一方のピークは残留するルチジンのものであ り、１４.５分での他方のピークはＲ_PおよびＳ_Pジアステレオマーの混合物のも のである。粗製の生成物の５ｍｇのアリコートを取り、これを０.５ｍｌのテト ラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ、ＴＨＦ中の１Ｍ溶液）とともに １.５ｍｌのアセトニトリル中に溶解することにより、Ｒ_PとＳ_Pとの比率を定量 的に決定した。室温で１０分間放置した後、試料をＨＰＬＣにかけた。６.５分 と７.１分に２つの新たなピークが観察され、後で溶出したピークは消えた。最 初の新たなピークはＳ_Pジアステレオマーのものと思われたが、２つのピークの 正規値の６６％（２／１）を示した。粗製のピークはまた、５％メタノールを加 えた７５／２５ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（「７５／２５」）中の（順相シリカ プレート）によっても分析した。ＴＬＣは、それぞれ０.４５および０.６４のＲ ｆを有する２つのスポットを示した。速く移動した生成物（Ｒ_P形であると思わ れた）は遅く移動した生成物よりも強度が低かった。 ７５／２５ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中のメタノール段階勾配を用いた順相シ リカ上でＲ_Pジアステレオマーを分離させた。７.５ｃｍ×６０ｃｍのカラムに７ ００ｇのシリカ（最初に２.５Ｌの正味の７５／２５ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中 にスラリー化）を負荷した。ついで、粗製の二量体を７５ｍｌの７５／２５ Ｅ ｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、カラムに負荷した。カラムの溶出を１％メタ ノールから開始し、２％に増加し、最後に３％に増加するとＲ_P二量体の溶出が 始まった。Ｒ_P二量体は、溶出液中で３％メタノールを維持しながら幾つかのベ ッド容量で明瞭に溶出した。Ｓ_P二量体は、後に３０％メタノールで溶出した。 Ｒ_P二量体の収量は１１.０ｇであり、一方、Ｓ_Pの収量は１７.８ｇであった。Ｈ ＰＬＣ分析（ＡＣＮＭＥＴＨ）をＲ_P二量体について行い、１４.５分で一つのピ ークが観察された。この生成物のＴＬＣ（７５／２５ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ 、５％メタノール）により、Ｒｆが０.５５の単一のスポット生成物が明らかと なり、このものはエタノール中の１０％硫酸および熱で処理するとトリチルおよ び糖の両者について陽性であった。 新たに分離したＲ_P二量体（１１.０ｇ、０.０１１Ｍ）を１１０ｍｌのＡＣＮ 中に溶解し、２２ｍｌのＴＢＡＦ（０.０２２Ｍ、ＴＨＦ中に１Ｍ）で室温にて 一度に処理した。この反応混合物を周囲温度にて一夜放置した。翌日の朝、ＴＬ Ｃ（７５／２５、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂、１０％メタノール含有）により反応 が完了していることが決定された。出発物質は検出されなかったが、少量の５' −ＤＭＴ−ｄＴが観察され、このものは二量体の３'−ＯＨに比べて順相シリカ 上で相当速く移動する。この反応混合物をロータリーエバポレーター上で濃厚な 油状物となるまで濃縮し、ついでこれをＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）中に溶解し、 飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍｌ）およびＨ₂Ｏ（２×１００ｍｌ）で洗 浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、薄黄色の固形泡に濃縮し、こ れを１００ｇのシリカ（７５／２５、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂、５％メタノール 含有）上で精製した。５'−ＤＭＴ−ｄＴを除去したが、１３.５分で不純物（Ｈ ＰＬＣ、ＡＣＮＭＥＴＨ）が検出され、このものは最初未反応の出発物質（ｔ− ＢＤＭＳ付加）であると思われたが、ＴＢＡＦでさらに処理したところそうでは ないことがわかった。１００ｇのシリカおよび同じ溶出液を用いた第二のカラム を行い、一層小さなフラクションを得た。このカラムは２つのスポットを分離す ることができた。純粋なＣＴ−Ｒ_P二量体フラクションをプールし、濃縮して、 ほぼ白色の固形泡（５.５ｇ）を得た。 Ｂ．キラル的に純粋な（ＣＴ）ＭＰ（Ｒ_P）／ＤＥ二量体シントンの調製 １００ｍｌ容の丸底フラスコ中に０.５ｇ（０.５５ｍＭ）のＣＴ−３'−ＯＨ 二量体（実施例１Ａの生成物）を入れ、これをピリジンとともに共蒸発（３×２ ０ｍｌ）させることにより無水とした。フラスコを真空系からアルゴンガス下に 移し、ゴム栓で封をした。化合物を１０ｍｌのアセトニトリル中に再溶解し、２ ００μｌ（１.４ｍＭ、２.５当量）のＴＥＡを加えた。得られた混合物に室温に て手で撹拌しながら、２'−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホ ルアミダイト（２００μｌ、０.９０ミリモル、１.６当量）を一度に加えた。こ の反応混合物を室温で放置し、ついで逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ（ ベックマンシステムゴールド、Ｃ１８ボンダパック、ＡＣＮ法；溶液Ａは水中の ５０／５０ ＡＣＮ／０.１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７であり、溶液ＢはＡＣＮであっ た。０〜１００％の溶液Ｂの勾配を２５分にわたって１ｍｌ／分の速度で行った ）は、出発物質の完全な変換および９０％以上の粗製の純度を示した。ホスホル アミダイトのジアステレオマーは分離しなかった。反応混合物を真空下で濃縮し て薄黄色の固形泡とした。この泡を２％ＴＥＡを加えた５／１／５ 酢酸エチル ／アセトニトリル／メチレンクロライドで平衡化した２０ｇのノーマルフラッシ ュグレードシリカ上のクロマトグラフィーにより直ちに精製して、上記生成物（ ０.５ｇ、８２％収率）をＨＰＬＣによって決定されるように９９.３％の純度を 有するオフホワイトの固形泡を得た。 Ｃ．キラル的に純粋な（ＣＴ）ＭＰ（Ｒ_P）／ＭＰ二量体シントンの調製 上記工程Ａの記載に従って調製したＣＴ−３'−ＯＨ二量体（５.５ｇ、６ｍＭ ）を、ピリジンとともに２回蒸発させることにより無水とした。得られた固形泡 をロータリーエバポレーターからアルゴン下に移し、ゴム栓で封をした。固形泡 を１００ｍｌの９／１、ＡＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、ついで１.７ｍｌのト リエチルアミン（ＴＥＡ、１２ｍＭ）で処理した。マグネチックスターラーで撹 拌しながら、反応混合物を１.５ｍｌのクロロメチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルア ミノホスフィン（Ｃｌ−ＭＡＰ、８ｍＭ）で室温にて滴下処理した。反応をＨＰ Ｌ Ｃ（ＡＣＮＭＥＴＨ）上でモニターしたところ、１.５時間後に反応が完了し、 ２つの主要な生成物を示した。３.５分における一つの生成物はピリジンであり 、１４.３分における第二の生成物は所望のアミダイトであった。 この反応混合物を部分真空を用いてロータリーエバポレーター上で濃縮した。 得られた薄琥珀色のスラッジを入れたフラスコをアルゴン下に移し、蓋をした。 粗製の生成物を直ちに６０ｇのシリカを含むフラッシュカラム（最初に３％ＴＥ Ａを含有する１／１／１ ＡＣＮ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中で平衡化）に通し た。この溶出液で生成物は速やかに溶出し、すべてのＵＶ陽性のフラクションを プールし、濃縮した。得られた固形泡をＡＣＮとともに共蒸発させて残留するＴ ＥＡを除去し、ついで完全真空下で一夜乾燥させた。最終生成物であるオフホワ イトの固形泡は５.０ｇの重量であった。実施例２ （ＣＵ）２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチルＤＥおよび２'−Ｏ−メ チルＭＰ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチルＭＰ二量体シントンの調製 Ａ．２'−Ｏ−メチルＣ単量体の調製 ２'−Ｏ−メチルシチジンの５.０ｇ（８ミリモル）部分をピリジンとともに共 蒸発（３×２５ｍｌ）させて無水とし、ついで５０ｍｌのアセトニトリル中に溶 解した。この溶液を１.６５ｍｌのトリエチルアミン（「ＴＥＡ」）（１２ミリ モル、１.５当量）で処理し、氷浴中で冷却した。ついで、この溶液を１.６５ｍ ｌのクロロメチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（「Ｃｌ−ＭＡＰ 」）を２分間かけて滴下して処理した。氷浴を除き、反応混合物を２時間撹拌し た。反応混合物（ＨＰＬＣにより反応は完了していると決定された）を濃縮乾固 した。得られた残渣を４％ＴＥＡを含有する酢酸エチル／ヘプタン（１：１）（ ２０ｍｌ）中に溶解し、ついで同じ溶出系で平衡化した４０ｇシリカゲル上に負 荷した。ＵＶを吸収する溶出液をすべてカラムから回収およびプールし、ついで 濃縮して５.５ｇの上記生成物（収率約９０％）を得た。 Ｂ．シリル保護した２'−Ｏ−メチルウリジンの調製 ２５０ｍｌ容の丸底フラスコ中に５.０ｇ（９.０ミリモル）の５'−ＤＭＴ， ２'−Ｏ−メチルウリジンを入れ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で共蒸発（ ３×２５ｍｌ）することにより無水とした。得られた乾燥泡を５０ｍｌのＤＭＦ 中に取り、ついで２.４ｇ（３５ミリモル、３.９当量）のイミダゾールで一度に 処理し、ついで３.０ｍｌ（１２ミリモル、１.３当量）のｔ−ブチルジフェニル シリルクロライドを滴下した。この反応混合物を室温にて一夜撹拌した。 反応の進行をＨＰＬＣ（ＡＣＮ法（溶液Ａは、水中の５０／５０ ＡＣＮ／０. １Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７であり、溶液ＢはＡＣＮであった；０〜１００％溶液Ｂ の勾配を１ｍｌ／分の速度で２５分間かけて行った））およびメチレンクロライ ド中の５％メタノールを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりチェッ クし、完了したと決定された（出発物質は認められなかった）。ついで、反応混 合物を氷水中に注ぎ、メチレンクロライド中に取り、ついで重炭酸ナトリウム水 溶液および水で数回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、 ついで濃縮して７.２ｇの固形泡を得た（ＴＬＣ上で単一のスポットを与えた） 。ついで、この固形泡を７０ｍｌのメチレンクロライド中に溶解し、（マグネチ ックスターラーで素早く撹拌しながら）７０ｍｌのベンゼンスルホン酸（２：１ メチレンクロライド／メタノール中に２重量％）で一度に処理した。室温で１５ 分間撹拌した後、反応混合物の反応を１０ｍｌのＴＥＡで停止させた。得られた 脱トリチル化した化合物を濃厚な琥珀色の油状物にストリッピングし、ついでこ れを熱メチレンクロライド中で平衡化した１５０ｇのシリカゲル上に負荷した。 ２％メタノール（メチレンクロライド中）を用いて生成物をカラムから溶出した 。乾燥後、３.５１ｇの上記生成物を得た（収率約８０％）。 Ｃ．（ＣＵ）２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_P）二量体の調製 シリル保護した２'−Ｏ−メチルウリジン単量体（実施例２Ｂの生成物）（３. ０ｇ、６ミリモル）を３０ｍｌの無水ＡＣＮ中に取った。これとは別に２'−Ｏ −メチルシチジンアミダイト単量体（実施例２Ａの生成物）（５.５ｇ、７ミリ モル、１.２当量）を５５ｍｌのＡＣＮ中に取った。両溶液を室温にて３Åのモ レキュラーシーブ上で一夜静置した。 上記２つの溶液を単一のフラスコ中にデカントし、９４ｍｌ（ＡＣＮ中に０. ４５Ｍ、４２ミリモル、７当量）のテトラゾールで処理した。得られた混合物を ４分間撹拌し、ついで１.５ｍｌ（１.２当量）のクメンヒドロペルオキシドを加 えることにより酸化した。反応混合物を濃縮乾固し、ついでメチレンクロライド 中に取り、重炭酸ナトリウム水溶液および水で洗浄した。有機相を硫酸マグネシ ウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して７.５ｇの固形泡を得た。ピーク下の面積を 比較することによりＨＰＬＣによって決定されるジアステレオマー比は、５７／ ４３ Ｓ_P／Ｒ_Pであった。 Ｒ_Pジアステレオマーを２つのシリカカラムを用いたカラムクロマトグラフィ ー（粗製の生成物に対するシリカの比が１００：１、メタノールを１〜５％の勾 配で増加させながら３：１酢酸エチル／メチルクロライド中で平衡化）により単 離した。全量１.０７ｇの純粋なＲ_P二量体を単離した。 Ｄ．（ＣＵ）２'−Ｏ−メチル二量体の調製 ２'−Ｏ−メチルＣＵ二量体（実施例２Ｃの生成物）の１.０７ｇ（０.９０ミ リモル）部分を１０ｍｌのＴＨＦ中に溶解し、１.５ｍｌ（ＴＨＦ中に１ｍｌ、 １.５当量）のテトラブチルアンモニウムフルオライド（「ＴＢＡＦ」）で一度 に処理した。反応混合物を室温にて３０分間撹拌し、その後、ＨＰＬＣによりシ リル基の完全な脱保護が達成されたことが明らかとなった。反応混合物を濃縮し 、濃縮物を５％メタノールを含有する３：１酢酸エチル／メチレンクロライドで 溶出して１０ｇのシリカゲル上で精製した。清浄なフラクションを濃縮して５５ ０ｍｇの上記純粋な５'−ＯＨ二量体を得た。 Ｅ．キラル的に純粋な（ＣＵ）２'−Ｏ−メチル（ＭＰ／ＤＥ）二量体シントン の調製 ２'−Ｏ−メチルＣＵ３'−ＯＨ二量体（実施例２Ｄの生成物）の２３０ｍｇ部 分を、ＡＣＮ中で共蒸発（２×５ｍｌ）させることにより無水とした。得られた 乾燥固形泡を２.５ｍｌのＡＣＮ中に溶解し、ついで７３μｌ（２.５当量）のト リエチルアミン（「ＴＥＡ」）および９４μｌ（２.０当量）の２'−シアノエチ ル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（βＣＮＥ）を加えた。 反応混合物を室温にて２時間撹拌すると、この時点でＨＰＬＣ分析は反応が完了 したことを決定した。反応混合物を溶出液（３／１／１ 酢酸エチル／アセトニ トリル／メチレンクロライド、４％ＴＥＡ含有）中に溶解し、４％ＴＥＡを含有 する３／１／１ 酢酸エチル／アセトニトリル／メチレンクロライドで平衡化し た２ｇのシリカゲル上に負荷した。このカラムを１％ＴＥＡを含有する３／１／ １酢酸エチル／アセトニトリル／メチレンクロライドを用いて溶出した。清浄な フラクション、３〜２５を濃縮し、アセトニトリル中に再溶解し、再び濃縮して 固形泡とした。この泡を完全な真空下で一夜乾燥させて２００ｍｇの上記生成物 を得た。 Ｆ．キラル的に純粋な（ＣＵ）２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_P）／ＭＰ二量体シント ンの調製 １００ｍｌ容の丸底フラスコに４００ｍｇ（０.３７２ミリモル）の２'−Ｏ− メチルＣＵ二量体（実施例２Ｄの生成物）を入れた。これをアセトニトリルとと もに共蒸発（１×５ｍｌ）させることにより無水とした。ついで、乾燥した泡を 真空系からアルゴンガス下に置き、４ｍｌのＡＣＮ中に溶解し、ゴム栓で封をし た。この溶液を２当量のＴＥＡ（１０３μｌ、０.７４４ミリモル）で処理し、 ついで１.７５当量のクロロ−メチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフィン（「Ｃ ｌ−ＭＡＰ」）（１１８μｌ、０.６５１ミリモル）で処理した。反応液を室温 にて１時間撹拌し、その後、ＨＰＬＣは約５０／５０出発物質／生成物を示した 。ついで、さらに５０μｌのＴＥＡおよび７０μのＣｌ−ＭＡＰを加え、混合物 を１時間撹拌した。ＨＰＬＣが８０％の変換を示したときにさらに３０μｌのＴ ＥＡおよび３０μｌのＣｌ−ＭＡＰを加え、得られた混合物をさらに１時間撹拌 した。この時点でＨＰＬＣは６％の出発物質を示した。この反応混合物を濃縮乾 固した。得られた残渣を４％ＴＥＡを含む５００ｍｌの３／１／３酢酸エチル／ アセトニトリル／メチレンクロライド中に溶解し、同溶媒系で平衡化した５ｇの シリカに負荷した。フラクションを回収した。早く溶出するフラクションは黄色 の不純物で汚染されていたので、別にプールし濃縮した。ついで、これらフラク ションからの生成物を同じ条件のクロマトグラフィーにより再精製し、最初のカ ラムから単離した清浄な生成物とともにプールした。コンバインした生成 物をＡＣＮ（３×５ｍｌ）とともに共蒸発させ、完全真空下で一夜乾燥させて３ ５０ｍｇ（７７％収率）の上記生成物を得、このものはＨＰＬＣにより９５.５ ％の純度であることが示された。実施例３ ２'−Ｏ−メチルＭＰＳ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチル−ＤＥおよび２'−Ｏ−メチル ＭＰＳ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチル−ＭＰ二量体シントンの調製 これら二量体シントンの調製は、パラグラフＣにおいてクメンヒドロペルオキ シドの代わりに等価量の３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン,１,１−ジ オキシド（ボケージ（Ｂeaucage）試薬）を用いる他は実施例２の記載の手順に 従って行う。パラグラフ２Ｅおよび２Ｆの手順により、それぞれホスホジエステ ルおよびメチルホスホチオエート結合の組み合わせが得られる。実施例４ ＭＰＳ（Ｒ_P）／ＤＥ二量体シントンの調製 これら二量体シントンの調製は、パラグラフＡにおいて酸化剤溶液（Ｉ₂／Ｈ₂ Ｏ／ルチジン／ＴＨＦ）の代わりに等価量の３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール− ３−オン,１,１−ジオキシド（ボケージ試薬）を用いる他は実施例１の記載の手 順に従って行う。実施例５ ＭＰ（Ｒ_P）／ＰＳ２二量体シントンの調製 ＭＰ（Ｒ_P）／ＰＳ２二量体シントンの調製を以下のようにして行う。遊離の ３'−ＯＨを有するイソメトリックに純粋な（isometrically pure）Ｒ_Pジヌクレ オシドを実施例１Ａに記載の方法に従って調製する。このジヌクレオシドを、プ ロット（Ｐlotto）ら（プロットら、Ｔetrahedron ４７：２４４９〜６１（１９ ９１））やゴレンスタイン（Ｇorenstein）ら（米国特許第５,２１８,０８８号 ）の方法を用いて対応するチオホスホルアミダイトに変換する。このジヌクレオ シドを無水ピリジンとともに３回共蒸発させ、ついでトルエンで３回共蒸発させ る。ジヌクレオシドの一部（１０ミリモル）を２００ｍｌの無水ジクロロメタン 中に溶解し、ついで３当量の無水ジイソプロピルエチルアミン、さらに１.５当 量の クロロ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノチオメトキシホスフィンを０℃にて撹拌 しながら加える。反応が完了したと決定されるまでＴＬＣにより反応をモニター する。 この生成物を、ＭＰ（Ｒ_P）／ＤＥホスホルアミダイトの単離についての実施 例１Ｂの手順を用いて処理および精製する。実施例６ ＭＰＳ（Ｒ_P）／ＰＳ２二量体シントンの調製 ＭＰＳ（Ｒ_P）／ＰＳ２二量体シントンの調製を以下のようにして行う。遊離 の３'−ＯＨを有するイソメトリックに純粋なＲ_Pジヌクレオシドを実施例４の方 法に従って調製する。このジヌクレオシドを用い、上記二量体シントンを実施例 ５の方法により調製する。実施例７ ＭＰＳ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンの調製 ＭＰＳ（Ｒ_P）／２'−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンの調製を、実施例１およ び３と同様の方法だが適当に保護した２'−デオキシヌクレオシドおよび保護し た２'−Ｏ−メチルヌクレオシドを用いて行う。実施例８ 交互のＭＰ（Ｒ_P）／ＤＥヌクレオシド間結合を有するポリＣＴオリゴマーの調 製 ５'−（Ｃ*Ｔ）−（Ｃ*Ｔ）−（Ｃ*Ｔ）−（Ｃ*Ｔ）−（Ｃ*Ｔ）−（Ｃ*Ｔ） −（Ｃ*Ｔ）−Ａ−３'の配列を有するオリゴマーを、実施例１に従って調製した Ｃ*ＴＭＰ（Ｒ_P）／ＤＥ二量体シントンを用いて調製した。グループ分けしたジ ヌクレオシドは、シリカゲル上で早く溶出する異性体として立体化学（推定Ｒ_P ）が固定されている場所を示し、星印はキラル的に純粋な結合を示す。 自動化ＤＮＡ合成機でも手順を行うことができるが、試薬を保存するため手動 のカップリングを用いてオリゴマーを合成した。メタクリレート支持体に結合し たデオキシアデノシンから出発して３'−末端から配列を合成した。 ピリジンおよびトルエンとともに新たに共蒸発させて乾燥させた保護ジヌクレ オシドメチルホスホンアミダイト（必要なカップリング当たり各２２ｍｇ）を、 乾燥させた１ｍｌ容のガラスオートサンプラーバイアルに入れ、無水アセトニト リル中に０.１Ｍ（カップリング当たり２００μｌ）の濃度に溶解した。容器に アルゴンを通し、テフロン栓を有するねじキャップで密に封をした。 １μモルスケールＤＮＡ合成カラム（ミリゲン（Ｍilligen））に１μモルの メタクリレート支持体結合したデオキシアデノシンを充填させた。このカラムを リングスタンドに垂直方向にて設置した。流出液を制御するため、メール−メー ルルアフィッティング（male−male luer fitting）を１８ゲージの針とともに 底部に設置した。カラムを注射器を用いて１０ｍｌのアセトニトリルで洗浄した 。カラムにジクロロメタン中の２％ジクロロ酢酸（３ｍｌ）を１.５分間かけて 通すことにより、支持体に結合したヌクレオシドを脱トリチル化した。オレンジ 色のジメトキシトリチルカチオンを有する溶液を保存した。カラムを各１０ｍｌ の無水アセトニトリルで２回洗浄した。 第一のカップリングを以下のようにして行った。さらに１０ｍｌの無水アセト ニトリルをカラムに通した。ついで、２００μｌのＣＴメチルホスホンアミダイ トを１ｍｌ容注射器に注入した。ついで、無水アセトニトリル中の０.４５Ｍテ トラゾール（２００μｌ）を同様に上記メチルホスホンアミダイトを入れた注射 器に注入した。これら試薬を注射器中で素早く混合し、ついで３分間かけてカラ ムにゆっくりと滴下して通し、プランジャーを上下に手早く引いて支持体と適切 に混合させた。３分後に１ｍｌの酸化剤（７３％テトラヒドロフラン、２５％２ ,６−ルチジンおよび２％水中の０.１Ｍ Ｉ₂）を１分間かけてカラムに通した。 カラムを２０ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、ついで２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸 、３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、５０％（ｖ／ｖ）ピリジンおよび０.３１ ２％（ｖ／ｖ）ジメチルアミノピリジンを含有する溶液（６００μｌ）で処理し た。ついで、カラムを２０ｍｌのアセトニトリルで洗浄した。 上記合成サイクルを合成が完了するまで繰り返した。ジメトキシトリチル吸光 度に基づく全体のカップリング効率は９５.７％であり、カップリング当たり平 均９９.３％であった。 ついで、オリゴマーを支持体から開裂し、脱保護した。支持体に結合したオリ ゴマーを合成カートリッジから外し、ねじトップを有するガラスの１ドラムバイ アルに入れた。支持体をアセトニトリル／エタノール／ＮＨ₄ＯＨ（９／９／１ ）の溶液（１ｍｌ）で室温にて３０分間処理した。ついで、１ｍｌのエチレンジ アミンを反応容器に加え、反応を完了させるために反応液を室温にて６時間放置 した。ついで、オリゴマーを含有する上澄み液を支持体から除去し、支持体を２ ｍｌの１／１ アセトニトリル／水で２回濯いだ。この洗浄液を上澄み液とコン バインした。コンバインした溶液を水で３０ｍｌの全量に希釈し、約４ｍｌの６ Ｎ ＨＣｌで中和した。ついで、中和した溶液を、１０ｍｌのアセトニトリル、 １０ｍｌの５０％アセトニトリル／１００ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩 、および１０ｍｌの２５ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩で順番に前以て平 衡化したウオーターズ（Ｗaters）Ｃ−１８セパック（Ｓep−Ｐak）カートリッ ジを用いて脱塩した。反応溶液をカラムに通した後、３０ｍｌの水で洗浄した。 ついで、生成物を５ｍｌの１／１アセトニトリル／水で溶出した。 上記オリゴマーを、０.５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中のアセトニ トリルの増加勾配（４０分間で１％から４０％）のベックマンウルトラスフィア 逆相４.５×２５０ｍｍカラムを用いたＨＰＬＣにより精製した。単離収率は、 ４１ ＯＤ₂₆₀単位（３５％）であった。得られた化合物を電子スプレー質量分析 法により特徴付けた（計算値４３９１／実測値４３９１）。 別法として、上記で同定したオリゴマーは自動ＤＮＡ合成機で合成することが できる。この場合は適当な二量体シントン（上記手動合成で用いたのと同様）を アセトニトリル中に上記０.１Ｍの濃度に溶解する。アミダイト溶液をミリポア エクスペダイト（Ｍillipore Ｅxpedite）ＤＮＡシンセサイザー上の円錐容器中 に入れる。他のすべての試薬（酸化剤、脱保護剤、キャッピング試薬および、活 性化剤）を上記手動合成と同様にして調製し、手動の場合に指示された装置上の 適当な位置に適用する。一つの合成サイクルのプログラミングパラメーターは米 国特許出願第０８／１５８,０１４号の表Ｉに示す通りである。オリゴマーの脱 保護および精製は、手動合成したオリゴマーについての記載と同様にして行う。 実施例９ 交互する２'−Ｏ−メチル ＭＰ(Ｒp)／２'−Ｏ−メチル ＤＥおよび２'−Ｏ −メチル ＭＰ(Ｒp)／２'−Ｏ−メチル ＭＰ インターヌクレオシジル連結を 有するポリ−ＣＵオリゴマーの製造：− 上記実施例２に従って製造した２'−Ｏ−メチル ＭＰ(Ｒp)／２'−Ｏ−メチ ル ＤＥダイマーシンソン（dimer synthon）を用い、５'−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ) −(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−Ａ−３'配列を有する オリゴマーを製造する。 適当なダイマーシンソンをアセトニトリルに、０.１Ｍ濃度で溶解する。なお 、用いた他の全ての試薬は、実施例８に記載のものである。 １μモルスケールのＤＮＡ合成カラム（ミリポア）に、１μモルのメタクリレ ート支持結合デオキシアデノシンを充填する。ダイマーシンソンを、カップリン グ時間を２分まで延長する以外は、実施例８の記載と同様に、３'−末端から連 続的にカップリングさせる。ジメトキシトリチル吸光度に基づく全カップリング 効率は５０％である（平均９１％／カップリングの場合）。合成の終りにオリゴ マーからジメトキシトリチル基を脱離する。 実施例８の記載と同様に、脱保護を行う。粗収量は１０３ＯＤ₂₆₀ユニットで ある。オリゴマーをＨＰＬＣにて、０.５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート 中のアセトニトリルの勾配を上昇せしめて（３０分にわたり１０％から３０％へ ）、ベックマン・ウルトラスフェアーＲpで精製する。単離収量は３９ＯＤ₂₆₀ユ ニット（３８％）である。化合物を電子スプレーマススペクトロメトリーで特性 決定する（計算値４７１３／実測値４７１２）。 またこのオリゴマーは、自動式ＤＮＡシンセサイザーにて以下の手順で合成す ることもできる。マニュアル合成で使用した適当なダイマーシンソンを実施例８ の記載と同様に、アセトニトリルに溶解する。ミリポア・エクスピダイト（Ｍil lipore Ｅxpedite）ＤＮＡシンセサイザーの円錐容器に、アミダイト溶液を入 れる。他の全ての試薬（酸化剤、脱ブロック、キャッピング試薬および賦活物質 ）を実施例８の記載と同様に製造し、これらをマニュアルの指示通り、器具の適 当 な位置に適用する。実施例８に記載と同じカップリングプログラムを用いるが、 カップリング時間を２分まで延長する。 実施例８の記載と同様に、脱保護を行う。オリゴマーをＨＰＬＣにて、上述の マニュアル合成の場合と同様にして精製することができる。 Ｕ.Ｓ.特許出願Ｎo.０８／１５４０１３の実施例８に詳記される同じ手順を用 いて、２'−Ｏ−メチル ＭＰ(Ｒp)／２'−Ｏ−メチル ＭＰ（ラセミ体）混合 連結を有する５'−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−(Ｃ＊ Ｕ)−(Ｃ＊Ｕ)−Ａ−３'オリゴマーを製造する。またこの生成物も、電子スプレ ーマススペクトロスコピーで特性決定する（計算値４６９９.５／実測値４７０ １）。上記説明の如く、自動式合成も使用しうる。 実施例１０ 繰返しＭＰ(Ｒp)／ＭＰ連結構造を有する５'−(Ｔ＊Ａ)−(Ｇ＊Ｃ)−(Ｔ＊Ｔ) −(Ｃ＊Ｃ)−(Ｔ＊Ｔ)−(Ａ＊Ｇ)−(Ｃ＊Ｔ)−(Ｃ＊Ｃ)−(Ｔ＊Ｇ)−Ｃ−３'の 製造：− グループに入れたジヌクレオシドは、カップリングしたダイマーを示し、星印 はシリカゲル上の速溶離異性体として立体化学が固定する場合（キラル表示また はキラル純粋）を示す（Ｒpで同定）。 この配列を有するオリゴマーは、上記実施例１Ａおよび１Ｃに記載されるよう な方法で製造した適当な保護ジヌクレオチドメチルホスホンアミダイトを用いて 合成する。試薬を保存するため、マニュアルカップリングを用いてオリゴマーを 合成するが、この方法は、出発物質として支持体結合シチジンを用い、３'末端 から自動式ＤＮＡシンセサイザーで行うことができる。 乾燥度を確保するためピリジンおよびトルエンと新たに共蒸発した、所定の保 護ジヌクレオチドメチルホスホンアミダイト（必要カップリング当り各２２mg） 、Ｔ＊Ａ，Ｇ＊Ｃ，Ｔ＊Ｔ（２回）、Ｃ＊Ｃ（２回）、Ａ＊Ｇ，Ｃ＊Ｔ，および Ｔ＊Ｇのそれぞれを、乾燥した１mlガラス自動サンプラーバイアルに入れ、無水 アセトニトリルで溶解して、０.１Ｍ濃度を得る（１カップリング当り２００μl を使用）。バイアルをアルゴンでパージし、テフロン隔膜を持つねじ蓋でしっか り とシールする。 １μモルスケールのミリゲン（Ｍilligen）ＤＮＡ合成カラムに、１μモルの 支持体結合シチジンを充填する。カラムを、垂直方向のリングスタントに取付け る。流出液をコントロールするため、底部に雄−雄ルアー（leur）付属品を１８ ゲージ指針と共に取付ける。注射器を用い、１０mlのＡＣＮでカラムを洗う。次 いで、３mlの２％ジクロロ酢酸／ジクロロメタンをカラムに１.５分にわたって 通すことにより、支持体結合ヌクレオシドを脱トリチル化する。オレンジ色のジ メトキシトリチルカチオン含有溶液を取っておく。カラムを各１０mlのＡＣＮ（ 無水物）で２回洗う。 １０ml以上のＡＣＮ（無水物）をカラムに通して、最初のカップリングを行う 。次いで、２００μlのＴＧメチルホスホンアミダイトを１ml注射器に吸込む。 次に、該メチルホスホンアミダイトを有する注射器へ、２００μlの０.４５Ｍテ トラゾール／無水ＡＣＮを同様にして吸込む。各試薬を注射器内で迅速に混和し 、次いで３分にわたり滴下させながらカラムへゆっくりと通し、この場合、支持 体との適切な混和を確保するため、必ずプランジャーの吸込み作動をそっと行う 。３分後、１mlの酸化試薬（０.１Ｍ Ｉ₂／ＴＨＦ７４.２５％、２,６−ルチジ ン ２５％および水０.２５％）を１分にわたりカラムに通す。次いでカラムを２ ０mlのＡＣＮで洗う。次にカラムを、無水酢酸２０％（Ｖ／Ｖ）、ＡＣＮ３０％ （Ｖ／Ｖ）、ピリジン５０％（Ｖ／Ｖ）およびジメチルアミノピリジン０.３１ ２％(Ｗ／Ｖ)含有溶液６００μlで１分間処理する。カラムを２０mlのＡＣＮで 洗う。 次いで、それぞれジヌクレオチドメチルホスホンアミダイトを用い、合成が完 了するまで、合成サイクルを繰返す。初めのＴ＊Ｇカップリング後のダイマーの 添加順序は、Ｃ＊Ｃ、Ｃ＊Ｔ、Ａ＊Ｇ、Ｔ＊Ｔ、Ｃ＊Ｃ、Ｔ＊Ｔ、Ｇ＊Ｃおよび Ｔ＊Ａである。 合成の終りに、オリゴマーからジメトキシトリチル基を脱離する。 次いで支持体からオリゴマーを開裂し、脱保護する。合成カートリッジから支 持体結合オリゴマーを取出し、ねじ上蓋を持つガラス製の１ドラムバイアルに入 れる。支持体を室温にて、１mlのアセトニトリル／エタノール／ＮＨ₄ＯＨ（９ ／９／１）溶液で３０分間処理する。次いで、反応容器に１mlのエチレンジアミ ンを加え、反応を完了に至らせるため、反応混合物を周囲温度で６時間放置せし める。次いで、オリゴマー含有の上層液を支持体から除去し、支持体を１mlのア セトニトリル／水（１／１）で２回リンスし、洗液を上層液とコンバインする。 コンバインした溶液を、水でトータル容量５０mlに希釈し、約１.７mlの氷酢酸 で中和する。中和した溶液を、５mlのアセトニトリル、５mlの５０％アセトニト リル／水、および５mlの水で連続して予め平衡状態にしたウォーターズ（Ｗater s）Ｃ−１８セプ−パク（Ｓep−Ｐak）カートリッジを用いて脱塩する。反応溶 液をカラムに通した後、５０mlの水で洗う。次いで生成物を２mlのアセトニトリ ル／水（１／１）で溶離する。 オリゴマーを逆相カラム（ポロス（Ｐoros）II Ｒ／Ｈ、４.６×１００mm） にて、アセトニトリル／水勾配を用いるＨＰＬＣで精製する。 カップリング効率を下記表に示す。 実施例１１ 繰返しＭＰ(Ｒp)／ＭＰ連結構造を有する５'−(Ｇ＊Ｔ)−(Ｃ＊Ｔ)−(Ｔ＊Ｃ) −(Ｃ＊Ａ)−(Ｔ＊Ｃ)−(Ｃ＊Ａ)−(Ｔ＊Ｇ)−(Ｔ＊Ｔ)−(Ｇ＊Ｔ)−Ｃ−３'の 製造：− グループに入れたジヌクレオチドは、カップリングしたダイマーを示し、星印 は立体化学が固定する場合を示す。 この配列は、上記実施例１Ａおよび１Ｃに記載されるような手順で製造および 単離した適当な保護Ｒpジヌクレオチドメチルホスホンアミダイトを用いて合成 する。試薬を保存するため、マニュアルカップリングを用いてオリゴマーを合成 する。しかしながら、所望ならば、この方法は、出発物質としてメタクリレート 支持結合２'−デオキシシチジンを用い、３'末端から自動式ＤＮＡシンセサイザ ーで行うことができる。 所定の保護ジヌクレオチドメチルホスホンアミダイト（１００mg）、Ｇ＊Ｔ， Ｔ＊Ｔ，Ｔ＊Ｇ，Ｃ＊Ａ，Ｔ＊Ｇ，Ｃ＊Ａ，Ｔ＊Ｃ，Ｃ＊Ｔ，およびＧ＊Ｔのそ れぞれを、乾燥した３mlガラス円錐バイアルに入れ、無水アセトニトリルで溶解 して０.１Ｍ濃度とする。各容器にモレキュラーシーブス（３Å）（０.５ml容量 ）を加え、容器をアルゴンでパージし、テフロン隔膜を持つねじ蓋でしっかりと シールする。各試薬は使用前に、一夜静置せしめる。 １μモルスケールのミリゲンＤＮＡ合成カラムに、１μモルのメタクリレート 支持結合２'−デオキシシチジンを充填する。カラムを、垂直方向のリングスタ ンドに取付ける。流出液をコントロールするため、底部に雄−雄ルアー付属品を １８ゲージ指針と共に取付ける。注射器を用い、１０mlのＡＣＮでカラムを洗う 。次いで、３mlの２.５％ジクロロ酢酸／ジクロロメタンをカラムに３.０分にわ たって通すことにより、支持体結合ヌクレオシドを脱トリチル化する。オレンジ 色のジメトキシトリチルカチオン含有溶液を取っておく。カラムを各１０mlのＡ ＣＮ（無水物）で２回洗う。 １０ml以上のＡＣＮ（無水物）をカラムに通して、最初のカップリングを行う 。次いで、２００μlのＧ＊Ｔメチルホスホンアミダイトを１ml注射器に吸込む 。次に、該メチルホスホンアミダイトを有する注射器へ、２００μlの０.４５Ｍ テトラゾール／無水ＡＣＮを同様にして吸込む。各試薬を注射器内で迅速に混和 し、次いで１分にわたり滴下させながらカラムへゆっくりと通し、この場合、支 持体 との適切な混和を確保するため、必ずプランジャーの吸込み作動をそっと行う。 ３分後、１mlの酸化試薬（０.１Ｍ Ｉ₂／ＴＨＦ７４.２５％、２,６−ルチジン ２５％および水０.２５％）を１分にわたりカラムに通す。次いでカラムを２０m lのＡＣＮで洗う。次にカラムを、無水酢酸２０％（Ｖ／Ｖ）、ＡＣＮ３０％（ Ｖ／Ｖ）、ピリジン５０％（Ｖ／Ｖ）およびジメチルアミノピリジン０.３１２ ％(Ｗ／Ｖ)含有溶液６００μlで１分間処理する。カラムを２０mlのＡＣＮで洗 う。 次いで、それぞれジヌクレオチドメチルホスホンアミダイトを用い、合成が完 了するまで、合成サイクルを繰返す。初めのＧ＊Ｔカップリング後のダイマーの 添加順序は、Ｔ＊Ｔ、Ｔ＊Ｇ、Ｃ＊Ａ、Ｔ＊Ｇ、Ｃ＊Ａ、Ｔ＊Ｃ、Ｃ＊Ｔおよび Ｇ＊Ｔである。 合成の終りに、オリゴマーからジメトキシトリチル基を脱離する。 次いで支持体からオリゴマーを開裂し、脱保護する。合成カートリッジから支 持体結合オリゴマーを取出し、ねじ上蓋を持つガラス製の１ドラムバイアルに入 れる。支持体を室温にて、１mlのアセトニトリル／エタノール／ＮＨ₄ＯＨ（９ ／９／１）溶液で３０分間処理する。次いで、反応容器に１mlのエチレンジアミ ンを加え、反応を完了に至らせるため、反応液を６時間放置せしめる。次いで、 オリゴマー含有の上層液を支持体から除去し、支持体を１mlのアセトニトリル／ 水（１／１）で２回リンスし、洗液を上層液とコンバインする。コンバインした 溶液を、水でトータル容量３０mlに希釈し、約１.７mlの氷酢酸で中和する。中 和した溶液を、５mlのアセトニトリル、５mlの５０％アセトニトリル／水、およ び５mlの水で連続して予め平衡状態にしたＷaters Ｃ−１８ Ｓep−Ｐak カ ートリッジを用いて脱塩する。反応溶液をカラムに通した後、５mlの水で洗う。 次いで生成物を２mlのアセトニトリル／水（１／１）で溶離する。 オリゴマーを逆相カラム（Ｐoros II Ｒ／Ｈ、４.６×１００mm）にて、アセ トニトリル／水勾配を用いるＨＰＬＣで精製する。 実施例１２ 繰返しＭＰ(Ｒp)／ＭＰ連結構造を有する５'−(Ｇ＊Ａ)−(Ｇ＊Ｇ)−(Ａ＊Ｇ) −(Ｇ＊Ａ)−(Ｇ＊Ｇ)−(Ａ＊Ｇ)−(Ｇ＊Ａ)−(Ａ＊Ｇ)−Ｇ−３’の製造:− グループに入れたジヌクレオシドは、カップリングしたダイマーを示し、星印 はシリカゲル上の速溶離異性体として立体化学が固定する場合（キラル表示また はキラル純粋）を示す（Ｒpで同定）。 このオリゴマーは、上記実施例１Ａおよび１Ｃの手順に従って製造した自動式 合成カップリングのＧ＊Ａ，Ｇ＊ＧおよびＡ＊Ｇ ＭＰ(Ｒp)／ＭＰダイマーシ ンソンを用いて製造する。 ある量のＧ＊Ａ，Ｇ＊ＧおよびＡ＊Ｇダイマーシンソンをアセトニトリルに溶 解して、０.１Ｍ濃度を得、３Åモレキュラーシーブス（マサチューセッツ州ミ ルホードのミリポア）上で一夜貯蔵する。 溶解したダイマーをモレキュラーシーブスと共に、エンドラインのフィルター を備えたミリポア・エクスピダイトＤＮＡシンセサイザーの円錐容器に入れ、粒 子を除去する。他の全ての試薬（酸化剤、脱ブロック、キャッピング試薬および 賦活物質）を製造し、これらをマニュアルの指示通り、器具の適当な位置に適用 する。カップリングプログラムは、酸化前の主鎖開裂を減少するため、カップリ ング工程の直後に酸化工程を配置するよう改変する。〔ホグレフ（Ｈogrefe）， Ｒ.Ｉ.の「Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs」（アグラウ ォル（Ａgrawal Ｓ．編），１４３〜１６４頁、ヒュマナ・プレス，トトワＮ. Ｙ.,１９８３年），分子生物学の方法（Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology） ，vo１.２０の“メチルホスホネートオリゴヌクレオチドの合成および脱保護の 改良方法”参照〕。１つの合成サイクルのプログラミング・パラメーター（“Ｓ yn ４ オール−１μモル”）は、Ｕ.Ｓ.特許出願Ｎo.０８／１５４０１３の表I Iに記載されている。 １μモルスケールのＤＮＡ合成カラム（ミリポア）に、１μモルのメタクリレ ート支持結合デオキシグアノシンを充填し、ＤＮＡシンセサイザーに設置する。 ダイマーを３'末端から連続的にカップリングする。合成の終りに、オリゴマー からジメトキシトリチル保護基を脱離する。 次いで支持体からオリゴマーを開裂し、脱保護する。合成カートリッジから支 持体結合オリゴマーを取出し、ねじ上蓋を持つガラス製の１ドラムバイアルに入 れる。支持体を室温にて、１mlのアセトニトリル／エタノール／ＮＨ₄ＯＨ（９ ／９／１）溶液で３０分間処理する。次いで、反応容器に１mlのエチレンジアミ ンを加え、反応を完了に至らせるため、反応液を６時間放置せしめる。次いで、 オリゴマー含有の上層液を支持体から除去し、支持体を１mlのアセトニトリル／ 水（１／１）で２回リンスし、その時上層液とコンバインする。コンバインした 溶液を、水でトータル容量５０mlに希釈し、約１.７mlの氷酢酸で中和する。中 和した溶液を、５mlのアセトニトリル、５mlの５０％アセトニトリル／水、およ び５mlの水で連続して予め平衡状態にしたＷaters Ｃ−１８ Ｓep−Ｐak カ ートリッジを用いて脱塩する。反応溶液をカラムに通した後、５mlの水で洗う。 次いで生成物を１.８mnのアセトニトリル／水（１／１）で溶離する。 粗収量は８７０Ｄ₂₆₀ユニットである。オリゴマーをＨＰＬＣにて、β−シク ロボンド標準相４.５×２５０mmカラム（ＮＪウィッパニーのアゼテック・Ｉnc. ）を用い、０.０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（pＨ７）中のアセトニ トリルの勾配を減少せしめて（８０％から４０％へ）精製する。単離収量は２２ ０Ｄ₂₆₀ユニット（２５％）である。生成物を電子スプレーマススペクトロメト リーで特性決定する（計算値５４０７／実測値５４０１）。 実施例１３ 交互するＭＰ(Ｒp)／ＰＳインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマーの 製造：− ダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰ(Ｒp)／ＰＳインターヌクレオシジ ル連結を有するオリゴマーを製造する。合成、脱保護および精製の全てのパラメ ーターは実施例８の記載の通りであるが、酸化試薬を３Ｈ−１,２−ベンゾジチ オール−３−オン・１,１−ジオキシドの０.１Ｍ溶液または二硫化炭素／ジイソ プロピルエチルアミン（１／１）中の硫黄の０.１Ｍ溶液と交換する。 実施例１４ 交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＤＥインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− 実施例４のダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＤＥインター ヌクレオシジル連結を有するオリゴマーを製造する。合成、脱保護および精製の 他の全てのパラメーターは、実施例８の記載の通りである。 実施例１５ 交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＰＳインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− 実施例４のダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＰＳインター ヌクレオシジル連結を有するオリゴマーを製造する。合成、脱保護および精製の 全てのパラメーターは実施例８の記載の通りであるが、酸化試薬を３Ｈ−１,２ −ベンゾジチオール−３−オン・１,１−ジオキシドの０.１Ｍ溶液または二硫化 炭素／ジイソプロピルエチルアミン（１／１）中の硫黄の０.１Ｍ溶液と交換す る。 実施例１６ 交互するＭＰ(Ｒｐ)／ＰＳ２インターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− 実施例５のダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰ(Ｒp)／ＰＳ２インター ヌクレオシジル連結を有するオリゴマーを製造する。合成、脱保護および精製の 全てのパラメーターは、実施例１５の記載の通りである。 実施例１７ 交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＰＳ２インターヌクレオシジル連結を有するオリゴマ ーの製造：− 実施例６のダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＰＳ２インタ ーヌクレオシジル連結を有するオリゴマーを製造する。合成、脱保護および精製 の全てのパラメーターは実施例１６の記載の通りである。 実施例１７Ａ 交互するＭＰ(Ｒp)／２'−Ｏ−メチルＤＥインターヌクレオシジル連結を有す るオリゴマーの製造：− 実施例７のそれらに類するダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰ(Ｒp)／ ２'−Ｏ−メチルＤＥインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマーを製造す る。合成、脱保護および精製の他の全てのパラメーターは、実施例９の記載の通 りである。 実施例１８ 交互するＭＰ(Ｒp)／ＭＰＳインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− 実施例１Ａおよび１Ｃに従って製造し、次いで溶解およびモレキュラーシーブ ス上で貯蔵したダイマーシンソンを用いて、交互するＭＰ(Ｒp)／ＭＰＳインタ ーヌクレオシジル連結を有するオリゴマーの製造を行う。酸化試薬は、３Ｈ−１ ,２−ベンゾジチオール−３−オン・１,１−ジオキシドの０.１Ｍ溶液〔アイヤ ー（Ｉyer），Ｒ.Ｐ．らの「ＪＡＣＳ」（１１２，１２５４−１２５５、１９９ ０年），“ビュウケージ（Ｂeaucage）試薬”参照〕または二硫化炭素／ジイソ プロピルエチルアミン（１／１）中の硫黄の０.１Ｍ溶液であり、合成は一般に 実施例１２の記載と同様に進行する。 実施例１９ ２'−Ｏ−メチルヌクレオシジルユニットおよび交互するＭＰ(Ｒp)／ＭＰＳイ ンターヌクレオシジル連結を有するオリゴマーの製造：− 実施例２Ａ〜２Ｄおよび２Ｆに記載のダイマーシンソンを用い、かつ酸化試薬 が３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン・１,１−ジオキシドの０.１Ｍ溶 液または二硫化炭素／ジイソプロピルアミン（１／１）の０.１Ｍ溶液である以 外は、Ｕ.Ｓ.特許出願Ｎo.０８／１５４０１３の実施例８の一般的合成手順と同 様にして、このオリゴマーを製造する。 実施例２０ ２'−Ｏ−メチルヌクレオシジルユニットおよび交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＭＰイ ンターヌクレオシジル連結を有するオリゴマーの製造：− 上記実施例３に記載のダイマーシンソンを用い、かつ実施例１９の合成、脱保 護および精製のパラメーターと同様にして、このオリゴマーを製造する。 実施例２１ 交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＭＰインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− 実施例１Ａの酸化剤の代わりにビュウケージ試薬を用い実施例１Ａおよび１Ｃ に従って製造したダイマーシンソンを用い、かつ実施例１２に記載の合成、脱保 護および精製のパラメーターと同様にして、このオリゴマーを製造する。 実施例２２ 交互するＭＰＳ(Ｒp)／ＭＰＳインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマ ーの製造：− 実施例２１に記載のダイマーシンソンを用い、かつ酸化試薬を３Ｈ−１,２− ベンゾジチオール・１,１−ジオキシドの０.１Ｍ溶液または二硫化炭素／ジイソ プロピルエチルアミン（１／１）中の硫黄の０.１Ｍ溶液と交換する以外は、実 施例１２に記載の合成、脱保護および精製のパラメーターと同様にして、このオ リゴマーを製造する。 実施例２３ ２'−Ｆダイマーシンソンの製造：− ２'−フルオロヌクレオシドを用いて、本発明オリゴマーの製造に有用なダイ マーシンソンを製造しうる。２'−フルオロヌクレオシドの製造法は、既に報告 されており、当業者にとって公知である。〔たとえば、コディングトン（Ｃodin gton）の「ＪＯＣ」，（Ｖol.２９、１９６４年）（２'−Ｆ Ｕ）；マンゲル（ Ｍangel）の「Ａngew．Ｃhem.」（９６、５５７〜５５８、１９７８年）および ドーエン（Ｄoen）の「ＪＯＣ」（３２、１４６２〜１４７１、１９６７年）(２ '−Ｆ Ｃ)；イケハラの「Ｃhem．Ｐharm．Ｂull.」（２９、１０３４〜１０３ ８、１９８１年）(２'−Ｆ Ｇ)；イケハラの「Ｊ．Ｃarbohydrates，Ｎucleosi des，Ｎucleotides」(７、１３１〜１４０、１９８０年)（２'−Ｆ Ａ）および クルグ（Ｋrug），Ａの「Ｎucleosides ＆ Ｎucleotides」（８、１４７３〜１ ４８３、１９８９年）参照〕。 ２'−フルオロヌクレオシドを用いるダイマーシンソンの製造は、２'−Ｏ−メ チルダイマーシンソンの場合に記載したもの（たとえば実施例２、３および７参 照）に類する手順を用いて行うことができる。得られるダイマーシンソンを用い て、実施例９などの２'−Ｏ−メチルダイマーシンソンの場合に用いた方法に類 する方法でオリゴマーを製造しうる。 実施例２４ ＭＰ(Ｒp)／ＭＰ(Ｒp)／ＤＥおよびＭＰ(Ｒp)／ＭＰ(Ｒp)／ＭＰトリマーシン ソンの製造：− 実施例１ＣのＭＰ(Ｒp)／ＭＰダイマーシンソンを用いて、上記のトリマーシ ンソンを製造する。３'−ヌクレオシドのモノマーホスホルアミダイトへのカッ プリングの場合の実施例１Ａの方法に従って、該ダイマーシンソンを５'−ヒド ロキシ，３'−シリル化ヌクレオシドにカップリングする。 選定した５'−ヒドロキシ，３'−シリル化ヌクレオシド（１当量）および異性 体的に純粋なＲpダイマーメチルホスホンアミド（１.２５当量）を、丸底フラス コ内で計量し、アセトニトリルとの共蒸発で乾燥する。得られる泡状物をアセト ニトリルに溶解し、０.４５Ｍテトラゾール／アセトニトリル溶液（４.５当量） で処理する。３分後、反応混合物を酸化し、反応生成物を実施例１Ａの記載に準 じワークアップする。３'−シリル化トリマーのジアステレオマーを、ダイマー 異性体の分割の場合の実施例１Ａの記載に準じ、シリカゲルカラム上で分割する 。分離したジアステレオマーの立体配置を２−Ｄnmr（ＲＯＳＥＹ）で判定する 。２つのインターヌクレオシジル連結の所望のキラル配置（Ｒp／Ｒp）を有する トリマーを、実施例１Ｂに記載の方法で、クロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ,Ｎ −ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトと反応させることにより、トリマー シンソンに交換する。トリマーシンソンをワークアップし、実施例１Ｂに記載の 方法で精製して、ＭＰ(Ｒp)／ＭＰ(Ｒp)／ＤＥトリマーを得る。 同様な操作を用いて、ＭＰ（Ｒp）／ＭＰ（Ｒp）／ＭＰホスホルアミダイトシ ンソンを得ることができる。すなわち、対応するダイマーシンソンの場合の実施 例１Ｃに記載の最終反応で、クロロメチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノホス フィンを用いることによる。ワークアップと精製は、実施例１Ｃの記載の通りで ある。 実施例２５ ２'−Ｏ−アリルダイマーおよびトリマーシンソンの製造とそれらのオリゴマ ー合成での用途：− ２'−Ｏ−アリルヌクレオシドを用いて、たとえば実施例１および２４に記載 のダイマーおよびトリマーシンソンを製造することができる。２'−Ｏ−アリル ヌクレオシドの製造およびそれらのオリゴマー製造での用途については、既に報 告されており〔たとえば、イリバレン（Ｉribarren）らの「Ｐroc．Ｎatl．Ａca d．Ｓci．(ＵＳＡ)」(８７、７７４７〜７７５１、１９９０年)；およびレスニ ク（Ｌesnik）らの「Ｂiochemistry」(３２、７８３２〜７８３８、１９８３年) 参照〕、このような置換ヌクレオシドは商業上入手可能である。かかるヌクレオ シドを用い、上述の操作によりダイマーおよびトリマーシンソンを製造する。こ れらのシンソンを用い、上記実施例１０、１１、１２、１３等に記載されるよう な方法でオリゴマーを製造する。 実施例２６ ＭＰ(Ｒp)／ＭＰ／ＤＥインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマーの製 造：− 実施例２４のトリマーシンソンを用いるか、あるいはＵ.Ｓ.特許出願Ｎo.０８ ／１５４０１４の実施例２０に記載のものにより、かつダイマーシンソンの代わ りにトリマーシンソンを用い実施例８に記載の方法と同様にして、上記オリゴマ ーを製造する。合成、脱保護および精製の他の全てのパラメーターは、実施例８ の記載の通りである。 実施例２７ ＭＰ(Ｒp)／ＭＰ(Ｒp)／ＭＰインターヌクレオシジル連結を有するオリゴマー の製造：− Ｕ.Ｓ.特許出願Ｎo.０８／１５４０１３の実施例１４に記載の操作を用いて、 上記のオリゴマーを製造する。 実施例２８ オリゴリボヌクレオシドの製造：− 本実施例で用いるオリゴリボヌクレオチドは、以下に記載のような一般操作を 用いて合成しうる。 合成のため、適当な５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−t−ブチルジメ チルシリル−３'−Ｏ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミ ダイトヌクレオシド（マサチューセッツ州ヒルホールドのミリポア）を用いる。 合成は１μモルスケールにて、標準ミリゲン・ホスホルアミダイト操作を用い、 ミリゲン８７５０自動式ＤＮＡシンセサイザーで行うが、例外として、カップリ ング時間を１２分まで延長することにより、より立体障害を受ける２'−Ｏ−t− ブチルジメチルシリルＲＮＡモノマーが反応するのに十分な時間を付与する。他 のオリゴヌクレオチド合成試薬の全ては、ミリポアの標準記録に記載される通り である。 合成後、無菌でＲＮaseの無い条件下で、オリゴヌクレオチドを取扱う。水は ０.５％ジエチルピロカーボネートで一夜処理した後、オートクレーブ処理に付 して殺菌する。全てのガラス器具は、３００℃で少なくとも４時間のベーキング に付す。 先ず、支持体結合オリゴマーを５５℃にて水酸化アンモニウム／エタノール（ ３／１）で１５時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを脱保護し、支持 体から開裂する。次いで、オリゴヌクレオチドを含有する上層液をデカントし、 蒸発乾固する。得られる残渣を室温にて、０.６mlの１Ｍテトラブチルアンモニ ウムフルオライド／テトラヒドロフラン（５％以下の水を含有）で２４時間処理 する。０.６mlの水性２Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（pＨ７）の添加で 、反応を抑える。無菌水を用い、溶液をビオ−ラッド（Ｂio−Ｒad）１０ＤＧカ ラムに通すことにより、反応混合物の脱塩を行う。次いで脱塩したオリゴヌクレ オチドを乾燥する。 標準操作を用い、ポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミド（１９／１）１ ５％および７Ｍウレアを含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） により、オリゴリボヌクレオチドの精製を行う〔マニアチス（Ｍaniatis）Ｔ． らの「Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual(分子クローニング： 実験マニュアル)」(１８４〜１８５頁、コールド・スプリング・ハーバー、１９ ８２年)参照〕。ゲルは２０cm幅×４０cm長さおよび６mm厚である。オリゴリボ ヌクレオチド（６００Ｄユニット）を、１.２５％ブロモフェノール・ブルー含 有の２００μlの水に溶解し、ゲル上に装填する。ゲルを３００Ｖで一夜走行さ せる。生成物バンドをＵＶ裏面増影法で目視し、切除し、生成物を０.５Ｍ酢酸 ナトリウムで一夜溶離する。製造業者提供の記録を用い、Ｗaters Ｃ１８ Ｓe p−Ｐak カートリッジで生成物を脱塩する。生成物をキネージング（kinasing ）で³²Ｐ標識し、ＰＡＧＥで分析する。 実施例２９ ラセミ体のメチルホスホネート・オリゴヌクレオチドの製造：− ５'−(ジメトキシトリチル)・デオキシヌクレオシド−３'−〔(Ｎ,Ｎ−ジイソ プロピルアミノ)メチル〕ホスホノアミダイトモノマーを用いて、種々のラセミ 体オリゴマーを合成する。メタクリレートポリマー支持体にて、ビオサーチ・モ デル（Ｂiosearch Ｍodel）８７５０ ＤＮＡシンセサイザーを用い、以下に示 す改変以外は、製造業者の規格に従って固相合成を行う。すなわち、モノマーを アセトニトリルに１００mＭ濃度で溶解し、dＧを除き、アセトニトリル／ジクロ ロメタン（１／１）に１００mＭで溶解する。脱ブロック試薬＝２.５％ジクロロ 酢酸／ジクロロメタン。酸化剤試薬＝２５g／ｌ沃素／０．２５％水，２５％２, ６−ルチジン，７２.５％テトラヒドロフラン。ＣＡＰ Ａ＝１０％無水酢酸／ アセトニトリル。ＣＡＰ Ｂ＝０.６２５％Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン／ピ リジン。 合成の終りに、オリゴヌクレオチドからジメトキシトリチル基を脱離する。 次いで支持体からオリゴヌクレオチドを開裂し、脱保護する。合成カートリッ ジから支持体結合オリゴヌクレオチドを取出し、ねじ上蓋を持つガラス製の１ド ラムバイアルに入れる。支持体を室温にて、１mlのアセトニトリル／エタノール ／ＮＨ₄ＯＨ（９／９／１）溶液で３０分間処理する。次いで、反応容器に１ml のエチレンジアミンを加え、反応を完了に至らせるため、反応液を６時間放置せ しめる。次いで、オリゴヌクレオチド含有の上層液を支持体から除去し、支持体 を２mlのアセトニトリル／水（１／１）で２回リンスし、その時上層液とコンバ インする。コンバインした溶液を、水でトータル容量３０mlに希釈し、約４mlの ６Ｎ−ＨＣｌで中和する。中和した溶液を、１０mlのアセトニトリル、１０mlの ５０％アセトニトリル／１００mＭトリエチルアンモニウムビカーボネート、お よび１０mlの２５mＭトリエチルアンモニウムビカーボネートで連続して予め平 衡状態にしたＷaters Ｃ−１８ Ｓep−Ｐak カートリッジを用いて脱塩する 。反応溶液をカラムに通した後、３０mlの水で洗う。次いで生成物を５mlのアセ トニトリル／水（１／１）で溶離する。 オリゴヌクレオチドを逆相カラム（ウオットマン（Ｗhatman）ＲＡＣII）にて 、アセトニトリル／５０mＭトリエチルアンモニウムアセテート勾配を用いるＨ ＰＬＣで精製する。 実施例３０ ＭＰ(Ｒp)／ＭＰおよびＭＰ(Ｒp)／ＤＥダイマーシンソンとホスホルアミダイ トおよびメチルホスホンアミダイトモノマーシンソンからのキメラのオリゴヌク レオチド・アセンブリー ＭＰ(Ｒp)／ＭＰダイマーシンソンは、３'末端にメチルホスホルアミダイト・ カップリング基を含有する。これらのシンソンは、共にカップリングしてオリゴ マーを形成するとき、他のどの位置にも、ラセミ体のメチルホスホネート連結を 付与する。ＭＰ(Ｒp)／ＤＥダイマーシンソンは、３'末端にβ−シアノエチルホ スホルアミダイト・カップリング基を含有する。両種のダイマーシンソンを、実 施例１の記載に準じ合成する。メチルホスホンアミダイト・モノマーシンソンを 、ＪＢＬサイエンティフィック（ＣＡのサン・ルイス・オビスポ）で合成する。 ベータシアノエチルホスホルアミダイト・モノマーシンソンは、ミリゲン／ビオ サーチから購入する。 ミリゲン・エクスピダイト（登録商標）自動式ＤＮＡシンセサイザーを用いて 、全てのシンソンをカップリングする。各シンソンのカップリングプログラムを 、以下の如く表にする。なお、カップリング工程中にホスホロチオエート結合を 生じさせるために、β−シアノエチルホスホルアミダイト・カップリング基を含 有するダイマーまたはモノマーシンソンのいずれかといっしょに、プログラム“ チ オエート−５μＭ”を用いた。 当業者であれば、適当なダイマーまたはモノマーシンソンを用い、これらのカ ップリング常套手段の少なくとも１つを適用することにより、後記実施例に記載 のキメラオリゴマーのそれぞれが合成しうることを認識することができる。 各キメラオリゴマーの脱保護および精製は、実質的に実施例８〜１２の記載に 従って行った。 本実施例に従って製造した一定のキメラオリゴマー、並びに他の化合物の素生 は、下記表に示す電子スプレーマススペクトロメトリーで確認した。 １．（ ）はＲＮaseＨを賦活する部分を示し、表示ヌクレオシドの５'−側鎖 の連結はチャージされている。 実施例３１ 種々のバックボーン修飾(非キメラ)オリゴマーのヌクレアーゼ安定性の実験 この実施例に記載された各実験においては、次の配列：５'−ＣＴＣＴＣＴＣ ＴＣＴＣＴＣＴＡ−３'（２'−デオキシ糖質の場合）；または５'−ＣＵＣＵＣ ＵＣＵＣＵＣＵＣＵＡ−３'（２'−Ｏ−メチル糖質の場合）を有する種々のバッ クボーン修飾オリゴマーを評価した。全ジエステル（ＤＥ）バックボーンオリゴ マーは、オリゴス・エトセトラから購入した。他のバックボーンオリゴマーは、 先の実施例の記載と同様にして合成した。 （ａ）精製ヘビ毒ホスホジエステラーゼの存在下における安定性の実験 ガラガラヘビ（crotalus adamanteus）由来のヘビ毒ホスホジエステラーゼＩ （ＰＤＥ−Ｉ）は、ユーエス・バイオケミカルズ・インコーポレイテッドから購 入した。各オリゴマーのアリコート（０．０７５Ａ₂₆₀ユニット）をピペットで ポリプロピレンのマイクロ遠心管に入れ、スピード-バク（登録商標）真空遠心 分離機（サヴァント・インコーポレイテッド）で乾燥した。次いで、該遠心管を 氷上に置き、各遠心管にＰＤＥ−Ｉのアリコートを加えた（９５μＬの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ中に０．１ユニット／ｍＬ、ｐＨ８．８、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、 ０．４％グリセロール）。ゼロ時点のサンプルをアセトニトリル（３５μＬ）で すばやく希釈し、ドライアイス／イソプロパノール浴中で凍結し、分析に供する まで−２０℃で貯蔵した。次いで、残りのサンプルを３７℃にて水浴上に置く。 次いで、各特定の時点のサンプルを水浴から外し、アセトニトリルで希釈し、ゼ ロ時点サンプルと同様にして凍結する。 ヌクレアーゼ分解実験の最終段階として、サンプルを個々に融解し、モデル１ ２６二元勾配ポンプモジュールおよびモデル１６８ダイオードアレイ検出器を具 備したベックマン・システム・ゴールド装置を用いて逆相ＨＰＬＣで迅速に分析 した。サンプルは、２００μＬのサンプルループを持つマニュアルインジェクタ ーを用いてカラムに注入した。これらの実験にはビダックＣ４プロテインカラム （ビダックカタログ番号９０１０１９、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を用 いた。溶離は、２溶媒系を用いて行った：緩衝液Ａ＝１％アセトニトリル／５０ ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）；緩衝液Ｂ＝５０％ アセトニトリル／５０ｍＭ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）。最初の１分間は溶媒の流 速を０．０５から１．０ｍＬ／分に増加しながらＨＰＬＣを行い、その後は１． ０ｍＬ／分で行った。各バックボーンに対する勾配条件は次のとおりであった： 全ＤＥバックボーン−５〜２５％緩衝液Ｂ（２．５〜９分），２５〜４５％緩衝 液B（９．０〜２２．５分），４５〜１００％緩衝液Ｂ（２２．５〜２８．０分 ）；２'−デオキシＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥバックボーン−５〜３５％緩衝液Ｂ（２ ．５〜１２．５分），３５〜５０％緩衝液Ｂ（１２．５〜２２．５分），５０〜 １００％緩衝液Ｂ（２２．５〜２７．５分）；２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／ ＤＥバックボーン−５〜５０％緩衝液Ｂ（２．５〜１７．５分），５０〜６５％ 緩衝液Ｂ（１７．５〜２７．５分），６５〜１００％緩衝液Ｂ（２７．５〜３１ ． ０分）。各バックボーンオリゴマー(分解されなかったもの)の平均の保持時間は 次の通りである： 全ＤＥ： １５．７分 ２'−デオキシＭＰ（Ｒp）／ＤＥ： １８．５分 ２'−Ｏ−メチルＭＰ(Ｒp)/２'−Ｏ−メチルＤＥ： １８．６分。 早期溶出ピークの出現および全長オリゴマーに対応するピークの領域の減少（ま たは完全損失）によって分解を決定した。 （ｂ）ヒーラ細胞溶菌液における安定性の実験 ヒーラ細胞細胞質溶菌液は、エンドトロニクス・インコーポレイテッド（ミネ アポリス，ＭＮ）から購入した。この調製物は充填細胞の５倍容の低張ドウンス （dounce）細胞溶解物である。氷上の３．６ｍＬの細胞溶菌液に、０．４ｍＬの ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホネート（ＭＥＳ，０．５Ｍ溶液，ｐＨ６． ０）を加えてｐＨ６．０に緩衝し、緩やかに撹拌混合した。先の実施例と同様に して、オリゴマーのアリコートを乾燥し、次いで、ヒーラ細胞溶菌液（９５μＬ ）で希釈した。次いで先の実施例と同様にして、サンプルを３７℃でインキュベ ートし、逆相ＨＰＬＣによって正確に分析した。 （ｃ）アフリカミドリザルの腎臓ＣＯＳ−７細胞の細胞溶菌液における安定性 の実験 この実験で用いるＣＯＳ−７細胞溶菌液は、次のようにして調製した。ＣＯＳ −７細胞を９０％の集密度まで成長させ、次いで０．２５％トリプシンの存在下 で採集した。細胞ペレットを、リン酸緩衝生理的食塩水で２回洗浄し、次いで− ２０℃で一夜凍結させた。次いで、ペレットをおよそ等体積の細胞溶解緩衝液（ ２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２，２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．１％ＮＰ− ４０）に再懸濁し、１ｍＬの滅菌したポリプロピレンピペットで１０回吸い出し 、次いで１００００×Ｇで５分間遠心分離した。次いで得られる上清の約４０％ を用いて２０ストロークのドウンスホモジナイザー（Ａ型乳棒）で細胞ペレット を溶解した。次いで、この懸濁液を上記と同様に遠心分離し、上清を最初の再懸 濁液からの上清の残りと合わせた。得られる溶液は、どのような核破片をも含ま な い細胞質ゾルが優勢の溶菌液であり、もとの充填細胞ペレットの約１．５倍の体 積である。得られる細胞溶菌液のアリコートは、オリゴマーとインキュベートす る前に、２５ｍＭトリス−アセテート（最終ｐＨ７．４）または２５ｍＭ ＭＥ Ｓ（最終ｐＨ６．０）のいずれかで緩衝した。各オリゴマーのアリコート（０． ０７５Ａ₂₆₀ユニット）を滅菌ポリプロピレンマイクロ遠心管中で乾燥し、次い で、氷上で１０μＬのＣＯＳ−７細胞溶菌液中に再懸濁した。ゼロ時点サンプル に水（９０μＬ）およびアセトニトリル（３５μＬ）を迅速に加え、ドライアイ ス／エタノール浴中で凍結させ、分析に用いるまで−２０℃で貯蔵した。次いで 、残りのサンプルを水浴上で３７℃にてインキュベートした。ゼロ時点対照と同 様にして、正確に特定の時点においてサンプルを水浴から外し、水およびアセト ニトリルで希釈し、凍結する。前記と同様に、細胞溶菌液とともにインキュベー トした後、サンプルを個々に融解し、水（５３５μＬ）で希釈し、逆相ＨＰＬＣ によって迅速に分析した。 （ｄ）大腸菌の細胞溶菌液における安定性の実験 大腸菌細胞溶菌液は、次のようにして調製した。およそ２×１０¹¹個の細胞を 遠心分離によってペレット化し、１０ｍＬのトリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７ ．５）に再懸濁し、室温にて５分間インキュベートした。次いで、ジチオスレイ トールおよびリゾチームを最終濃度がそれぞれ２ｍＭおよび１ｍｇ／ｍＬとなる ように加え、得られる懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、 混合物を氷上で短く１０回音波処理し、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した 。視覚的判断に基づいて、この操作が十分に細胞を溶解したかどうかを評価し、 次いで上清（５ｍＬ）を集め、４℃で貯蔵し、細胞ペレットを１ｍＬのトリス− ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に再懸濁した。染色体ＤＮＡを破壊するために 、再懸濁した細胞ペレットの凍結／融解を５回繰り返し、短く音波処理し、次い で８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、得られる上清（約７００μＬ ）を前段階の上清（約５ｍＬ）と合わせ、６０００×Ｇで５分間遠心分離し、残 留破片をペレット化した。最終上清は、もとの細胞ペレットの約５７倍の体積（ １００μＬ）中に約５０％の溶解細胞を含んでいることがわかった。オリゴマー の アリコート（０．０５０Ａ₂₆₀ユニット）を滅菌ポリプロピレンマイクロ遠心管 中で乾燥し、氷上で９５μＬの細胞溶菌液に懸濁した。前記と同様にして正確に 、３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣ分析を行い、次いでオリゴマーの分解の 定量を行った。 （ｅ）スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）の細胞溶菌液にお ける安定性の実験 Ｓ．アウレウス細胞溶菌液は、次の変更を行った以外は前記大腸菌で行った方 法と同様にして調製した：（ｉ）約４×１０¹⁰個の細胞を含む細胞ペレットで細 胞溶解を行った；（ｉｉ）リゾチームの代わりにリゾスタフィン（lysostaphin ）を用いた（５００ユニット，シグマ・インコーポレイテッド製）；および（ｉ ｉｉ）凍結／融解サイクルを５回ではなく合計１０回行った。前記大腸菌を用い た実験で行った操作と同様にして正確に、３７℃にてオリゴマーとインキュベー トし、ＨＰＬＣ分析を行い、該クロマトグラムからオリゴマーの分解を定量した 。 結果： 分解％は、各実験における各時点のピーク高さおよびピーク領域をゼロ時点対 照と比較することによって決定した。次いで、log（全長％）vs時間をプロット し、Iog（５０％）＝１.６９９に対応する値をみつけることによってＰＤＥ−Ｉ の存在下における各オリゴマーの半減期を決定した。上記実験から得られた結果 を下記表にまとめた。 生物学的システムにおけるバックボーン類縁体の代謝分解速度 実施例３２ ＲＮＡ標的とキラル性付与オリゴマーおよび非キラルオリゴマーとのハイブリ ッド形成 Ｒｐ−またはＳｐ−ダイマーユニットのいずれかを用いて、キラル性付与全ピ リミジン（Ｃ＊Ｔ）₇Ａおよび全プリン（Ａ＊Ｇ）₇Ｔ ＭＰ−オリゴマーを調製 した。個々のモノマーユニットを用いて、対照オリゴマーも調製した。星印は明 らかにされたキラル性の位置を示す。 各オリゴマーを相補的合成ＲＮＡ標的にアニーリングし、次いで温度の関数と して２６０ｎｍにおける吸光度をモニターした。ハイブリッド形成複合体の熱変 性に対応するＳ字形遷移が観察された。各Ｓ字形遷移の中央点においてＴｍ値を 決定した。先に、我々は（ＣＴ）₈オリゴマーは中性ｐＨにおいてＲＮＡと二本 鎖複合体を形成するが、（ＡＧ）₈オリゴマーは三本鎖複合体を形成することを 明らかにしている。したがって、我々は、各キラル性付与シリーズのデータがそ れぞれ二本鎖および三本鎖ＭＰ／ＲＮＡヘリックスに適用しうることを予想した 。Ｔｍデータを下記にまとめた。交互（ＣＴ）₇ （Ａ） （Ｂ） 交互（ＡＧ）₇ （Ａ） （Ｂ） 上記表に示されるように、Ｒｐ−付与オリゴマーはＲＮＡ標的とのＴｍは比較的 高い。一方Ｓｐ−付与オリゴマーはＲＮＡ標的どのＴｍは比較的低い。 別の実験において、我々は、キラル性付与（Ｃ＊Ｔ）₇Ａおよび（Ａ＊Ｇ）₇Ｔ ＭＰ−オリゴマーが中性においてＲＮＡとそれぞれ二本鎖および三本鎖複合体を 形成することを確認した。 これらの実験は、キラル性の付与が、二本鎖および三本鎖の両方の形態におい てＭＰ−オリゴマーの結合親和性を劇的にもたらしうることを説明している。 実施例３３ Ｒｐ−付与またはラセミバックボーンのいずれかを有するメチルホスホネート オリゴマーにおける比較 ラセミメチルホスホネートオリゴマーおよび相補的ＲＮＡ標的は、実施例２８ および２９の記載と同様にして合成した。ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰオリゴマーは、本 明細書中に記載したＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰダイマーをカップリングする方法にした がって合成した。各カップリングしたＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰダイマーは、下記表に おいて丸括弧で示し、星印はキラル性が純粋な結合を示す。 アニーリングした反応混合物は、等モル量のメチルホスホネートオリゴマーお よびＲＮＡ標的（全鎖濃度２．４μＭ）、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７． ２）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０３％の サルコシル酸カリウムを含有していた。反応混合物を８０℃に加熱し、次いで、 およそ４〜６時間かけてゆっくりと４℃まで冷却した。次いで、アニーリングし たサンプルを１ｃｍの石英キュベットに移し、温度の関数として２６０ｎｍにお ける吸光度を、６×６温度制御サンプルホルダーを具備したバリアン・キャリー ・モデル３Ｅ分光光度計を用いてモニターし、データをＩＢＭコンパチブルＰＣ コンピューターにて分析した。温度は、昇温率１℃／分で５℃から８０℃まで変 化させた。それぞれ解離プロフィールにおけるＴｍは、（Ａ₂₆₀−温度関数の） 最初の導函数に対応する温度として定義した。下記の表は、幾つかのラセミペア vs Ｒｐ−付与メチルホスホネートオリゴマーに対して得られたデータまとめた ものである。Ｔｍの増加が観察されたことに基づいて、本明細書において記載し たＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰダイマーカップリング法を用いるＲｐ−付与によって、メ チルホスホネートオリゴマーとそのＲＮＡ標的の間の結合エネルギーが有意に増 強されるという結論が導かれる。 ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰ付与およびラセミメチルホスホネート オリゴマーにおけるＴｍの比較 実施例３４ 相補的合成ＲＮＡ標的に対する（ＣＴ）₇Ａモデル配列を有する種々のバック ボーン修飾オリゴマーの結合安定性 ラセミメチルホスホネートオリゴマーおよび相補的ＲＮＡ標的オリゴマーは、 前の出願の記載と同様にして合成した。同じ配列を有するが、バックボーンの異 なる一連のオリゴマーは、この出願の他所に記載した方法で調製した。Ｒｐ−（ ＣＴ）ダイマーを用いて、７５％Ｒｐ−付与全メチルホスホネートおよび２'− デオキシＭＰ（Ｒｐ）／２'−デオキシＤＥオリゴマーを作成した。Ｒｐ−（Ｃ Ｕ）ダイマーを用いて、２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／２'−Ｏ−メチルＤＥオ リゴマーを作成した。他の結合と混合してホスホロチオエート結合を有するオリ ゴマーは、実施例３０および他の上記実施例に記載した一般的操作にしたがって 合成した。正常ホスホジエステル（２'−デオキシ全ＤＥ）バックボーンまたは ２'−Ｏ−メチルホスホジエステル（２'−Ｏ−メチルＤＥ）バックボーンのいず れかを有する対照オリゴマーおよび全ホスホロチオエートオリゴマーは、オリゴ ス・エトセトラから購入した。２'−デオキシまたは２'−Ｏ−メチル置換は下記 のとおりであり、このような構造は、交互配列または繰り返し配列中のすべての 残基において発生する。 アニーリングした反応物は、等モル量のバックボーン修飾オリゴマーおよびＲ ＮＡ標的（全鎖濃度２．４μＭ）、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．２）、 １００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０３％のサルコ シル酸カリウムを含有していた。これらの反応混合物を８０℃に加熱し、次いで 、およそ４〜６時間かけてゆっくりと４℃まで冷却した。次いで、アニーリング したサンプルを１ｃｍの石英キュベットに移し、温度の関数として２６０ｎｍに おける吸光度を、６×６温度制御サンプルホルダーを具備したバリアン・キャリ ー・モデル３Ｅ分光光度計を用いてモニターし、データをＩＢＭコンパチブルＰ Ｃコンピューターにて分析した。温度は、昇温率１℃／分で５℃から８０℃まで 変化させた。Ｔｍは、熱分解プロフィールの最初の導函数の最大値に対応する点 として定義した。３７℃における結合定数（Ｋ_A（３７℃））は、変性プロセス の２ 状態モデルを仮定して熱的解離データの非直線最小二乗法によって決定した。下 記の表は結果をまとめたものである。 配列＝５’−ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡ−３’ このデータから、もとのラセミ全ＭＰオリゴマーに種々のバックボーン修飾を 行うことによってＲＮＡ標的に対する結合安定性が劇的に改良されることがわか る。 実施例３５ 相補的ＲＮＡ標的に対する種々のキメラバックボーンオリゴマーの結合親和性 相補的合成ＲＮＡ標的に対するハイブリッド形成能力を下記のオリゴヌクレオ チドについて試験を行った。 マル括弧中に示される塩基は、それぞれの修飾の説明において中央のカギ括弧の セット中に示されるバックボーン修飾を含んでおり、同様にオリゴマーの端の部 分は、カギ括弧の端のセット中に示される結合構造を含んでいる。ＰＳ／ＤＥと は、ホスホロチオエート結合で開始する交互に繰り返される修飾を意味する。た とえば、ＰＳ／ＤＥで示される配列において５個の塩基が存在するならば、それ らは３個のホスホロチオエート（ＰＳ）と２個のホスホロジエステル（ＤＥ）結 合を含んでいる。 ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０ ．０３％サルコシル酸カリウムおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡからなる緩衝系中で 、各オリゴマーをその相補的合成ＲＮＡ標的と１：１のモル比で混合した（全鎖 濃度＝２．４μＭ）。得られる溶液を７０℃に加熱し、次いで、およそ４〜６時 間かけてゆっくりと４℃まで冷却した。次いで、サーモスタットマルチセルホル ダー、温度コントローラーおよび温度表示アクセサリーを具備したバリアン・キ ャリー・モデル３Ｅ ＵＶ／視覚化分光光度計を用い、２６０ｎｍにおいて、１ ℃／分で昇温しながらアニーリングしたオリゴマーをモニターする。データを記 録し、ＰＣコンピューターを用いて解析した。Ｔｍは、熱融解プロフィールの最 初の導函数から決定した。３７℃における結合定数（Ｋ_A（３７℃））は、変性 プロセスの２状態モデルを仮定して熱的解離データの非直線最小二乗法によって 決定した。これらの値を下記表に示す。 さらに、他のキメラバックボーンオリゴマーの実験から、Ｒｐ−キラルメチル ホスホネート結合を含む化合物は、同じ組成であるがラセミのメチルホスホネー ト結合であるオリゴマーと比べて、ＲＮＡ標的との正味の結合安定性がより高い ことが示された。Ｔｍ値の決定は、通常上述したやり方で行った。ＲＮアーゼＨ 活性化領域におけるサイズの変化や、選択された２'−糖質置換などを有するな どの配列のデータは、下記のようにして得た。（スラッシュで分割された結合構 造は、挙げられた結合が交互に配列することを意味する；したがって、化合物２ ６８１−１の５塩基ＰＳ／ＤＥコアの場合、−ＰＳ−ＤＥ−ＰＳ−ＤＥ−ＰＳ− という結合配列を意味する。下記の２'−Ｏ−メチル置換を有する化合物のカギ 括弧内では、ウリジン残基がチミジン残基と置換されている。ダイマーシンソン 付加前に固相に別に結合している３'末端残基以外は、これらの化合物（番号３ ３４１、３３３６、３３３９、３３３７、３３８２および３３８６）の端部の非 ＲＮアーゼＨ活性化領域のメチルホスホネート−およびホスホジエステル−結合 ヌクレオシド糖質のそれぞれに、２'−Ｏ−メチル糖質置換基を結合させた（後 記実施例４４を参照）。） 配列型１ ５塩基コア：５'［ＧＴＣＴＴＣＣＡ］（ＴＧＣＡＴ）［ＧＴＴＧＴＣＣ］３'７ 塩基コア：５'［ＧＴＣＴＴＣ］（ＣＡＴＧＣＡＴ）［ＧＴＴＧＴＣＣ］３' 配列型２ ５塩基コア：５'[GCTTGGCTA](TTGCT)[TCCATCTTCC]３' ７塩基コア：５'[GCTTGGCTA](TTGCTTC)[CATCTTCC]３' 配列型３ ５塩基コア：５'[GGTATATC](CAGTG)[ATCTUCUTCTC]３' これらのデータは、ラセミメチルホスホネート結合がＲｐ−キラルメチルホス ホネートと置換される場合に、結合親和性が有意に増強されることが示している 。この観察結果は、２'−デオキシリボフラノース糖質を含むヌクレオシドなら びに２'−Ｏ−メチルリボフラノース糖質を含む塩基にも見られた。交互ＭＰ（ Ｒｐ）／ＤＥ結合領域を含むオリゴマーは、交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰ（ラセミ） 結合を有するオリゴマーよりも結合親和性が高い。２'−Ｏ−メチルリボフラノ ース糖質が２'−デオキシ糖質と置換される場合に、さらに結合は強化される。 上記データに基づくと、Ｔｍは、約０.５〜０.６℃／置換の割合で上昇すること になる。 実施例３６ ヒーラ細胞核抽出物からのＲＮアーゼＨを活性化する種々のキメラオリゴマー の能力の説明 ヒーラ細胞核抽出物からの真菌ＲＮアーゼＨを活性化する能力を下記のオリゴ マーについて試験を行った。 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＫＣｌ、９ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、２５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンおよ び２５〜１００ユニット／ｍＬのＲＮasin（プロメガ・コーポレイション製，マ ディソン，ＷＩ）を含有する緩衝系中で、これらの各オリゴマー（１０μＭ）を その相補的合成ＲＮＡ標的（１μＭ）にアニーリングした。［γ−³²Ｐ］−ＡＴ Ｐ（ニューイングランド・ヌクリア／デュポン製，ボストン，ＭＡ）およびＴ４ −ポリヌクレオチドキナーゼ（ストラティジーン製，サンディエゴ，ＣＡ）を用 い、標準的操作にしたがって、５'末端に³²Ｐをもつ放射標識したＲＮＡを調製 した。各反応物中には、およそ２０００，００００dpmsの³²Ｐ標識ＲＮＡが放射 トレーサーとして含まれた。これらのサンプルを６５℃まで加熱し、約４〜６時 間かけてゆっくりと冷却してアニーリングした。 ヒーラ細胞核抽出物を含む貯蔵溶液は、次のようにして調製した。ヒーラ細胞 核抽出物（プロメガ・コーポレイション，マディソン，ＷＩ，カタログナンバー Ｅ3521，５ｍｇ／ｍＬタンパク質）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、 ２０％グリセロール、０．１Ｍ ＫＣｌ、０．２ｍＭパラメチルフェニルスルホ ニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および０．５ｍＭジチオスレイトールを含有する緩 衝液で２５０倍に希釈した。 各アニーリングしたオリゴマーサンプル（１０μＬ）に、希釈したヒーラ細胞 核抽出物（５μＬ）を添加することによって、ＲＮアーゼＨ切断反応を開始し、 次いでサンプルを３７℃で１５分間または２時間インキュベートした。それぞれ のインキュベーション時間の終了時に、１．５μＬのＥＤＴＡ（１２５ｍＭ，ｐ Ｈ８）を加え、次いで、ドライアイス中で迅速に凍結させ、−２０℃で貯蔵して 反応を停止した。すべての切断反応が停止した後、反応物を冷凍庫から取り出し てポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。各反応物からアリコート（５μ Ｌ）を吸い出し、ゲルローディング緩衝液（５μＬ、９０％ホルマリン／１ｘＴ ＢＥ緩衝液／０．１％ブロモフェノールブルー／０．１％キシレンシアノールブ ルー）で希釈した。得られるサンプルを、１ｘＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．２）中で 調製した１５％ポリアクリルアミド／７Ｍウレアゲル（２０ｃｍ×３０ｃｍ× ０．５ｍｍ厚）に載せた。ゲルを１２００ボルトで１．５時間電気泳動した。全 長および切断ＲＮＡ産物に対応するゲル上のバンドを、バイオーラド・モデルＧ Ｓ−２５０モレキュラー・イメージャー（バイオーラド・ラボラトリーズ製，ハ ークレス，ＣＡ）を用いるリン造影分析によって検出した。各反応物中に生じた 切断物の量は、レーンごとの合計カウント数を、全長バンドのリン造影カウント と比較することによって定量した。まとめた結果は下記のとおりである。 各切断フラグメントの長さを、その放射活性バンドの電気泳動移動度から決定し た。この分析から、切断はキメラオリゴマー由来のヘテロ２重体の中央で選択的 に起こることが判った。予想どおり、より多くの切断産物が、全ホスホジエステ ル（ＤＥ）および全ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマーにおいて観察された 。このデータは、ＤＥ結合をＰＳ結合と置換することによって、ＲＮアーゼＨ仲 介切断の割合が減少することを示している。交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥバックボー ンを有するサンプルにおいては切断は観察されなかった。 実施例３７ Ｓ１−エンドヌクレアーゼの存在下におけるヌレアーゼ分解に対する種々のキ メラオリゴマーの安定性 Ｓ１−エンドヌクレアーゼの存在下におけるヌレアーゼ安定性を下記のオリゴ マーについて試験を行った。 Ｓ１−エンドヌクレアーゼは、プロメガ・コーポレイションから購入した（カ タログ番号Ｅ５７６Ｂ，マディソン，ＷＩ）。各キメラオリゴマーのアリコート （０．０５〜０．０７５ ＯＤ₂₆₀ユニット）を、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ５．０）中のＳ１−エンドヌクレアーゼ（０．５ユニット／ｍＬ）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ酢酸亜鉛および５％グリセロールを入れたポリプロピレン マイクロ遠心管に個々に加えた（反応物の総体積＝１０μＬ）。これらの遠心管 を３７℃にて特定の時間インキュベートし、ドライアイス中で迅速に凍結させ、 次いで冷凍庫で−２０℃にて貯蔵した。次いで、モデル１２６溶媒モジュールお よびモデル１６８ダイオードアレイ検出器を具備したベックマン・システム・ゴ ールド・クロマトグラフィーシステムを用いる逆相ＨＰＬＣによってサンプルを 分析した。カラム＝ビダック・プロテインＣ４（カタログ番号２１４ＴＰ５４， 内径４.９ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモ ニウム（ｐＨ７）／１％アセトニトリル；緩衝液Ｂ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルア ンモニウム（ｐＨ７）／５０％アセトニトリル。溶離プロフィールは、５〜３５ ％緩衝液Ｂ（２．５〜１２．５分）；３５〜５０％緩衝液Ｂ（１２．５〜２２． ５分）；５０〜１００％緩衝液Ｂ（２２．５〜２７．５分）；流速＝１．５ｍＬ ／分。サンプルを水（５０μＬ）で希釈し、１００μＬサンプルループを用いて カラムに注入した。２６０ｎｍでモニターすることによって、全長オリゴマーお よびその分解産物に対応するピークを検出した。反応物中に生じた分解の量は、 全長オリゴマーに対するピーク領域の減少を測定することによって定量した（外 部対照との比較および／または分解されなかったオリゴマーを内部対照として共 注入することによって同定）。データを表形式で下記に示し、またグラフ形式で 図１に示す。 オリゴマー配列番号 分解の半減期＊ ２５６７−１ １．７時間 ２６８１−１ １２．２時間 ３１６９−１ ０．９時間 ３２１４−１ ５．０時間 ３２５６−１ １２．５時間 ＊）最小二乗法で処理したデータに基づいて５０％の全長オリゴマーが分解さ れた時点として決定した。 このデータは、ホスホジエステル（ＤＥ）結合をホスホロチオエート（ＰＳ） 結合で置換することによって、Ｓ１−エンドヌクレアーゼが触媒するヌクレアー ゼ分解に対する耐性が付与されることを示している。 実施例３８ １０％ウシ胎児血清の存在下におけるヌレアーゼ分解に対する種々のキメラオ リゴマーの安定性 氷上の１．５ｍＬのポリプロピレンマイクロ遠心管中に各キメラオリゴマーの 複数のサンプルを調製した。各サンプルは、オリゴマー（０．１ ＯＤ₂₆₀ユニ ット）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ジェミニ・バイオプロダクツ製，カラバ サス，ＣＡ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．２％パラメチルスル ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１７５ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭジチオスレイ トール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂および４％グリセロール（総 体積＝１００μＬ）。これらのサンプルを３７℃にて特定の時間インキュベート し、次いで、０．４％ＮＰ−４０／アセトニトリル（３５μＬ）で希釈し、ドラ イアイス中で迅速に凍結させ、−２０℃にて貯蔵した。次いで、サンプルを個々 に融解し、水（６３５μＬ）で希釈し、先の実施例で用いた方法にしたがって、 逆相ＨＰＬＣによって迅速に分析した（ただし、カラムに注入する際に２ｍＬサ ンプルループを用いた）。データを表形式で下記に示し、またグラフ形式で図２ に示す。 オリゴマー配列番号 分解の半減期＊ ２５６７−１ ５．８時間 ２６８１−１ ８．１時間 ３１６９−１ ３．４時間 ３２１４−１ ４．３時間 ３２５６−１ １６．２時間 ＊）各データセットにおいて最初の３時点を最小二乗法で処理したものに基づ き、５０％の全長オリゴマーが分解された時点として決定した。 このデータは、ＤＥ結合の代わりにＰＳ結合を用いると、ヌクレアーゼ分解対 する安定性が同様に強化されることを示している。 実施例３９ 標的ｍＲＮＡの無細胞翻訳における[ＭＰ][ＤＥ][ＭＰ]オリゴマー２５６７− １および[ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ][ＤＥ][ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ]オリゴマー３１６９−１ の活性 Ｔ７ポリメラーゼによって触媒される逆転写を用いる標準的クローニング技術 によって、これらのオリゴマーに対して開始コドン領域において相補性をもつ標 的ｍＲＮＡを、使用説明書に従って調製した（非キャッピングＲＮＡ用のプロメ ガ・メガスクリプトキット）。特異性検定用の対照としてギブコから対照ＣＡＴ ｍＲＮＡを得た。 ウサギ網状赤血球溶菌液（プロメガ製）を用い、³⁵［Ｓ］−Ｃｙｓ（ＮＥＮ／ デュポン製）の存在下、標的ｍＲＮＡおよび対照ＣＡＴｍＲＮＡを無細胞翻訳ア ッセイにおいて、使用説明書に従って翻訳した。オリゴマー２５６７−１および ３１６９−１を、０，０.２または１.０Ｍの最終濃度で個々の翻訳反応物に加え た。ＲＮアーゼＨ（プロメガ製）を、０．０４ユニット／μＬで、すべての翻訳 反応物に加えた。各段階は３回行った。翻訳反応物を３７℃で１時間インキュベ ートした。翻訳反応の終了時に、レムリサンプル緩衝液（ノベックス製）を用い てタンパク質を変性させ、各ケースにおいて合成された標的タンパク質の量を、 高度免疫抗体血清による免疫沈降、次いでタンパク質産物のゲル分画(１０〜２ ０％ 勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル，ノベックス製)およびリン造影分析を行って、評価 した。 図３および４に示されるように、オリゴマー３１６９−１は、０．２または１ μＭ存在する場合、標的ｍＲＮＡの翻訳を、それぞれ約５０％および９０％阻害 した。オリゴマー２５６７−１は、０．２または１μＭ存在する場合、標的ｍＲ ＮＡの翻訳を、それぞれ約０％および５０％阻害した。両方のオリゴマーが、良 好な特異性を示しながら、対照ＣＡＴｍＲＮＡの翻訳を僅かに阻害した。この結 果から、ラセミＭＰ末端の代わりに、キラル性付与ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ結合セグ メントで置換することによって、標的ｍＲＮＡの無細胞翻訳をブロックするオリ ゴマーの能力が有意に増強されることが示される。 実施例４０ [ＭＰ][ＤＥ][ＭＰ]オリゴマー２５６７−１および[ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ][ＤＥ] [ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ]オリゴマー３１６９−１による、ＲＮアーゼＨの存在下にお ける標的ｍＲＮＡの切断 Ｔ７ポリメラーゼ無細胞アッセイを用いる標準的クローニング技術によって、 これらのオリゴマーに対して開始コドン領域において相補性をもつ標的ｍＲＮＡ を、使用説明書に従って調製した（非キャッピングＲＮＡ用のプロメガ・メガス クリプトキット）。ＲＮアーゼＨおよび得られるｍＲＮＡ転写翻訳物は長さが約 ３４０ntである。 [ＭＰ][ＤＥ][ＭＰ]オリゴマー２５６７−１および[ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ][ＤＥ] [ＭＰ(Ｒｐ)／ＤＥ]オリゴマー３１６９−１による、ＲＮアーゼＨの存在下にお けるこの標的ｍＲＮＡを切断する能力を、次のようにして測定した。 無細胞翻訳緩衝液（３．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５ｍＭ ＫＣｌ、７０ｍＭ Ｎａ Ｃｌおよび２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有）中で、０．０４ユニット／μＬのＲ ＮアーゼＨ（プロメガ製）および０，０．１，１または１０μＭのオリゴマー２ ５６７−１または３１６９−１のいずれかの存在下、無細胞転写ｍＲＮＡ（１０ ０ｎＭ）を３７℃でインキュベートした。３０分後、ＲＮＡを抽出し、変性ゲル 中で変性し、変性ゲル中で展開した。展開後、ＲＮＡを臭化エチジウムで着色し 、 その完全性をゲル中に存在するＲＮＡバンドの視覚的観察によって測定した。 下記の表に示されるように、試験した濃度において両方のオリゴマーに良好な 用量−応答効果が得られた。オリゴマー３１６９−１は、オリゴマー２５６７− １よりも活性が高かった（１μＭの３１６９−１は反応物中の〜９８％の標的ｍ ＲＮＡを切断したが、同濃度の２５６７−１は５０％しか切断しなかった）。両 方のオリゴマーが良好な特異性が示し、ひとつの位置で標的ｍＲＮＡを切断した 。 実施例４１ 非真核レポーター遺伝子に対して標的化されたキメラアンチセンスオリゴマー による細胞培養におけるタンパク質合成の阻害、クロラムフェニコールトランス フェラーゼ 次の実施例は、キメラアンチセンスオリゴマーの、真核細胞培養系においてタ ンパク質合成を選択的に阻害する能力を示す。ＣＯＳ−７細胞を標的レポーター 遺伝子または対照非標的レポーター遺伝子をコードするプラスミドで短期的にト ランスフェクトさせた。次いで、これらの細胞を種々のキメラアンチセンスまた は対照オリゴマーで処理し、レポーター遺伝子の発現をアッセイした。 プラスミド： この実施例では次のプラスミドを用いた。 ｐＧ１０３５：スプライサーＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入された ｐＧ１０３６：野生型ＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入された ｐＧ１０４０：ＵＣＡＴ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入された ｐＧＬ２：ルシフェラーゼ発現プラスミド（プログマ製） ｐＳＶβ：β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（クローンテック製） プラスミドｐＧ１０３５、ｐＧ１０３６およびｐＧ１０４０の説明は下記のとお りである。 １．ｐＧ１０３５（スプライサーＣＡＴ）およびｐＧ１０３６（野生型ＣＡＴ ）および合成スプライス部位配列： Ａ．プラスミドｐＧ１０３６の作成に用いた野生型ＣＡＴ遺伝子の配列： Ｂ．スプライサーＣＡＴおよびプラスミドｐＧ１０３５の作成に用いたＣＡ Ｔコーデイング配列内に挿入されたイントロンの全配列： イントロンが挿入されるＣＡＴ遺伝子の領域を上記配列Ａに示す。野生型ＣＡ ＴＤＮＡ（ファルマシア製）をｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン製）に挿入して プラスミドｐＧ１０３６を作成した。該配列をｍＲＮＡとして示す。ｐＧ１０３ ５と比較するために、４０９塩基と４１０塩基をラベルする。上記配列Ｂで示さ れる合成イントロンをＣＡＴＤＮＡに挿入してプラスミドｐＧ１０３５を作成し た。成熟ｍＲＮＡ配列は上段のものであり、イントロン配列は下段のものである 。スプライスドナーの規範グアノシンを、ＣＡＴの転写解読枠の４０９塩基に対 応する＋４０９とラベルする。イントロンの最初の塩基を１とラベルする。 規範分枝アデノシンは３９塩基であり、規範イントロンスプライスアクセプター グアノシンはイントロンの８７塩基である。４１０塩基はＣＡＴの転写解読枠の 再開を示す。オリゴマーが標的化される配列は、下線部である。共通スプライス 部位の塩基は太字のイタリック体で示す（スミスら（１９８９年）；グリーン（ １９８６年））。 転写解読枠の最初の２／３および合成イントロンの半分を含むＨindＩＩＩ− ＳpeＩ ５'フラグメントならびにイントロンの残りの半分および転写解読枠の残 りの１／３を含むＳpeＩ−ＮotＩフラグメントを作成するために、合成ＤＮＡＰ ＣＲプライマーを用いてｐＧ１０３５のクローンを作成した。３ウエイ連結にお いてこれらをＨindＩＩＩ−ＮotＩ切断ｐＲｃＣＭＶと結合し、最終的プラスミ ドを得た。該イントロンを含む人工的なＣＡＴ遺伝子をスプライサーＣＡＴと名 付ける。これまでの記載の参考文献として、スミスＣＷＧ、パットンＪＧおよび ナーダル−ギナードＢの（１９８９年）“遺伝子発現のコントロールにおける交 互スプライシング”「Annual Reviews in Genetics」２３：５２２〜７７；グリ ーンＭＲの（１９８６年）“プレｍＲＮＡスプライシング”「Annual Reviews i n Genetics」２０：６７１〜７０８が挙げられる。 ２．ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）５'非翻訳領域およびアミノ末端： 野生型ＣＡＴ： ｐＧ１０４０，ＵＣＡＴ： 野生型の配列および開始コドンＡＵＧの周囲のｐＧ１０４０ＵＣＡＴを示す。 オリゴマーに対する標的部位を下線で示され、幾つかの各標的部位に対するキメ ラオリゴマーを下に記載する。 ＵＣＡＴは、合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを用いて野生型ＣＡＴＤＮＡ（ファ ルマシア製）から作成した。得られるフラグメントをＨindＩＩＩ（５'末端）， ＮotＩ（３'末端）フラグメントとしてベクターｐＲｃ／ＣＭＶ内でクローン化 した。転写解読枠の最初のアデノシンを＋１と記した。野生型とｐＧ１０４０の 間のアミノ酸の変化は保存性である。 キメラオリゴヌクレオチドは、下記の通りであった。 ５'ＡＵＧオリゴマー（位置−２１〜＋３）： ３'ＡＵＧオリゴマー（位置＋４〜＋２７）： スプライスドナーオリゴマー： スプライス分岐点オリゴマー： スプライスアクセプター部位オリゴマー： 細胞の調製および処理 ＣＯＳ−７細胞を１２ウェルのプレートフォーマットに１.５×１０⁵細胞／ウ エルにてトランスフェクションを開始する前日に入れた。すべての培養細胞を３ ７℃に維持した。次の日に、トランスフェクション混合物を調製した。１２ウェ ルプレートの各ウェルにつき、１.０μＭのオリゴマーをＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉ ｂｃｏ／ＢＲＬ）０.５ｍL中の１μgのｐＧＬ２またはｐＳＶβ＋１μgの標的Ｃ ＡＴプラスミドおよび同じくＯｐｔｉｍｅｍ ０.５ｍL中の１８.７５μg Ｔｒａ ｎｓｆｅｃｔａｍ（キメラオリゴマー用，Ｐｒｏｇｅｍａ）またはＬｉｐｏｆｅ ｃｔａｍｉｎｅ（全てＰＳのオリゴマー用，Ｐｒｏｇｅｍａ）１８.７５μgと混 合した。これらの量は、カチオン脂質対オリゴマープラスＤＮＡの比が合計１ｍ L中で、それぞれ６.９または４.５または２.０対１となる。ｐＧＬ２およびｐＳ Ｖβをトランスフェクションおよびオリゴマー選択性の対照として用いた。 培地を吸引し細胞をウェル毎にＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）１ｍL で２回洗浄した後、トランスフェクション混合物１ｍLを各ウェルに加えた。細 胞をトランスフェクション混合物中で１６時間培養した。この混合物を除き、完 全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清，ペニシリン／ストレプトマイシン保存 液の１／１００希釈溶液，すべてＧｉｂｃｏ／ＢＲＬより入手）１ｍLで置換し 、細胞をさらに５時間インキュベートした。 細胞リゼイトをＰＢＳ中で２回洗浄することにより調製した後、１Ｘ Ｒｅｐ ｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０.５ｍLで処理した 。遊離し溶解した細胞を１.５ｍLのチューブにピペットで入れ、ＣＯ₂／ＥtＯＨ 中で１回凍結させて解凍した。次いで、粗製のリゼイトを１０分間遠心分離し、 細胞片をペレットとし、上清を回収して直接分析するかまたは−２０℃で凍結し た。 次に、細胞リゼイトをＣＡＴ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトース活性に ついて分析し、総タンパク濃度を以下に記載する通りに測定した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）分析プロトコール この分析は、一般に以下のように行った。まず、次の反応混合物を各試料につ いて調製した： ６５ｍL，０.２５mＭ Tris，pＨ８／０.５％ ＢＳＡ ４μL，¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール，５０ｎＣi／μL（Ｄｕｐｏｎｔ），およ び５ｍL，５ｍg／ｍL ｎ-Ｂｕｔｙｒｙｌ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）ＣＡＴ保存液（Ｐｒｏｍａｇｅ）を０.２５Ｍ Tris，pＨ８／０.５％ ＢＳＡ中で１：１０００，１：１０,０００および１：９０：０００に連続希釈 することによりＣＡＴ標準曲線を作成した。元のＣＡＴ保存液は７０００units ／ｍLであった。次いで、ＣＡＴリゼイトを標識したチューブにTris／ＢＳＡ緩 衝液と共に加え、最終の体積を５０ｍLとした。 次いで、反応混合物７４ｍLを各チューブに加えた後、典型的には３７℃のオ ーブン中で約１時間インキュベートした。Ｐｒｉｓｔａｎｅ／Ｍｉｘｅｄ Ｘｙ ｌｅｎｅｓ（２：１）（Ｓｉｇｍａ）５００μLを各チューブ加えることにより 反応を停止した。次に、チューブを２分間撹拌し、５分間遠心分離した。上相４ ００ｍLをＳｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ（Ｆｉｓｈｅｒ）５ｍLと共にシンチレーショ ンバイアルに移した。Ｐａｃｋａｒｄシンチレーションカウンターで試料を計測 した。ルシフェラーゼ分析プロトコール 標準的な手順に従い、一般にこの分析を以下のように行った。リゼイト２０μ Lをルシフェラーゼ分析試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μLと混合し、（Ｐｒｏｍ ｅｇａが推奨するように）２０秒以内にシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋ ａｒｄ）で計測した。β−ガラクトシダーゼ分析プロトコール 一般にこの分析は、以下のように行った。０.２５Ｍ Tris−ＨＣl，pＨ８.０ ／０.５％ＢＳＡ中で１：１,０００および１：９,０００に連続希釈することに より、β−ｇａｌ標準曲線を作成した。β−ｇａｌ保存液は、１,０００units／ ｍL（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。したがって、１：１，０００希釈については 、ストックβ−ｇａｌ酵素 １μLをTris／ＢＳＡ緩衝液１０００μL中に希釈し 、１：９,０００希釈については、１：１,０００希釈液 １００μLをさらにTris ／ＢＳＡ緩衝液１０００μL中に希釈した。 次いで、ウェル（未処理のミクロ滴定プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ）毎にリゼイ ト ７５μLを加えた。２Ｘ β−ｇａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒ ｏｍｅｇａ）を各チューブに加えた。インキュベーションは、典型的には３７℃ のオーブン中で約１〜１時間半行った。プレートをミクロプレート読み取り器（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、Ａ₄₀₅（４０５ｎｍ）で測定し た。タンパク質分析プロトコール 試料を未処理のミクロ滴定プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で調製した。次の通 りに、一連のタンパク質標準を２つ一組で調製した。 ウェル毎にリゼイト６μLを加え、次いでＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）３００μLをウェル毎に加え た。それぞれの試料プレートをミクロプレート読み取り器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、Ａ₅₇₀で読み取った。ＣＡＴ活性の値をリゼイトの タンパク質量および与えられた他のパラメーターに対して標準化した。 これら実験の結果は以下の通りである。アンチ−スプライス部位オリゴマー対ｐＧ１０３５およびｐＧ１０３６ （アンチセンスオリゴマーによるスプライシング阻害）： オリゴマーをＣＯＳ−７細胞中へトランスフェクトし、リゼイトを調製し、前 記の通りに分析した。すべてのオリゴマーを培地中で終濃度１.０μＭにした。 結果は阻害±標準誤差のパーセントで表した。Ｎ.Ｄ.＝検出されず。すべての試 料について３回一組で行った。キメラオリゴマー（ＰＳ／ＤＥ中心およびＰＳ中 心）の場合、非処理の細胞に対しオリゴマー処理細胞において、非スプライシン グｐＧ１０３６ ＣＡＴの発現が僅かに高まった。したがってｐＧ１０３５発現 はｐＧ１０３６発現に対し、正常化された。結果は、すべて総タンパク量とルシ フェラーゼカウントについて標準化した。 結果は、スプライス部位配列をキメラオリゴマーを使用して標的とした場合の ＣＡＴ発現の特異的阻害を示している。すべてホスホロチオエートオリゴマーの 場合、ｐＧ１０３５とほぼ同様にｐＧ１０３６発現を阻害し、遺伝子発現におけ る強い非選択的作用が明らかとなった。さらに、オリゴマー３３８７−１のスプ ライス部位受容フランキング末端部分における２'−Ｏ−メチル基の組み込みお よびＰＳ中心の連続するホスホロチオエート骨格連鎖の５から７への伸長によっ てスプライス受容部位標的に対するアンチセンス活性が著しく増加するが、対照 標的に対しては非選択的活性は増加しない。ＣＡＴのＡＵＧを標的とするキメラオリゴマーの発現阻害 オリゴマーをＣＯＳ−７細胞中へトランスフェクトし、リゼイトを調製し、前 記の通りに分析した。すべてのオリゴマーを培地中で終濃度１.０μＭにした。 このＣＡＴ遺伝子はスプライス部位を含まないからである。オリゴマー３２６９ −１はｐＧ１０４０中に標的部位を有しない対照であった。何故ならばこのＣＡ Ｔ遺伝子はスプライス部位を含まないからである。結果は阻害±誤差のパーセン トで表した。各オリゴマーを３回一組で試験した。 ５'ＡＵＧ部位を標的とするキメラオリゴマー（３２５８−１,３２６０−１） は、ＣＡＴ ｍＲＮＡ発現の阻害に効果的であった（それぞれ、４３〜７２％阻 害）。３'ＡＵＧ部位を標的とするキメラオリゴマー（３２６１−１,３２６２− １）は、さらに効果的であって、それそれ９６、９７％の阻害をもたらした。対 照オリゴマー（３２６９−１）については阻害はみられず、ｐＧ１０４０ ｍＲ ＮＡと対合するキメラについて観察された阻害は選択的であったことを示した。 結論として、これらの結果は、カチオン脂質により培養ＣＯＳ−７細胞中に導 入されたキメラオリゴマーを使用してＣＡＴ活性を抑制調節できることを示して いる。 標的はＡＵＧ部位（ｐｒｅ−ｍＲＮＡと成熟ｍＲＮＡの両方に存在する）およ びイントロン部位（いずれかの細胞の核のｐｒｅ−ｍＲＮＡにのみ存在する）で あった。ＰＳ／ＤＥおよびＰＳ中心の両方を有するキメラオリゴマーはすべてＰ Ｓのオリゴマーおよび対照のキメラよりもさらに選択的であることが明らかにさ れた。標的に特異的およびオリゴマーに特異的な対照がいずれも含まれており、 この結果は配列に特異的なアンチセンス効果に基づくものであることを示してい る。実施例４２ 特異性の測定 一重および多重に誤対合のある相補遺伝子標的およびオリゴマーは、不完全で 非特異的な標的と完全対合標的オリゴマーとの識別を評価する交差実験を可能に する。本実施例は実施例４１で使用したオリゴマーに関してＯ−または４−塩基 の誤対合を持つＣＡＴ・ｍＲＮＡ標的の調製ならびに本発明オリゴマーの特異性 および活性に及ぼす種々な誤対合の効果を示す。 ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ・４ｍｍ）− ５'−非翻訳領域およびアミノ末端およびオリゴマー： 野生型 ＣＡＴ： ｐＧ１０４２、４−誤対合ＵＣＡＴ： ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ）４ｍｍの間の誤対 合を星印（＊）で示す。これらプラスミドにより製造されるｍＲＮＡの他の塩基 全ては同一である。野生型ＣＡＴ遺伝子の配列を比較のために提示する。オープ ン読み枠の第一アデノシンを＋１として指定する。オリゴマー標的部位には下線 を引いた。 プラスミドｐＧ１０４０およびｐＧ１０４２は正確に変異したＤＮＡ断片を増 幅するための合成ＤＮＡ−ＰＣＲプライマーを使用して構築した。これら断片を 次にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−末端）、ＮｏｔＩ（３’末端）断片としてベクター ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、陽性のクローンを 認定した。 これら標的遺伝子のいずれかに対するオリゴマーが決まると、確実に決定して いる誤対合の度合を持つ対照標的が決まることに注目すべきである。これで次に 例示するように、完全な対合に対するオリゴマーおよび確実に決定している誤対 合標的のテストが可能になる。 ｐＧ１０４２、４−誤対合ＵＣＡＴ： この場合、オリゴマーＸＶ−２はｐＧ１０４０に完全対合であるが、ｐＧ１０４ ２は誤対合４個を持つ。決まった誤対合塩基４個以外は一致している標的ｍＲＮ Ａ２個に対するこのオリゴマー１個の相対的効果をこうして決定することができ る。 これに加えて、標的遺伝子中の誤対合は増幅操作に使用するＰＣＲプライマー の配列によって正確に制御することができ、確実な誤対合の決定された配列を、 たとえばＡＵＧコドンの直５’領域における系列のように、構築することができ る。これを下記実施例に示す。 ここに、研究すべき標的配列は−１８から＋３まで延びている。最も上の配列と 比較した変異ｍＲＮＡ中の誤対合は肉太活字の大文字で示す。この実施例のオリ ゴマー、２１量体、の配列を各ｍＲＮＡの下に示すが、これは非変換型である。 この各後続ｍＲＮＡに対するオリゴマー中の不適正対合は大文字で示す。 他は同一な標的であるが、決まっている確実に知られた数の誤対合を増加して 行く方法を使用して、種々のオリゴマー化学（例えば、ホスホロチオエート対キ メラ）および作用機序（たとえば、立体障害剤対リボヌクレアーゼＨ切断剤）の 特異性を正確に決定することができる。 キメラ体オリゴヌクレオシド内のＲＮａｓｅＨ−活性化領域の荷電した骨格の 位置における変化におよびオリゴヌクレオシドの塩基配列および／または標的ｍ ＲＮＡに導入された種々の誤対合に、起因する活性および特異性に対する効果を 研究するテストを行った。以下（実施例４１も参照）に列挙するキメラ化合物を ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）標的およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ）４−塩基誤対合 対照との双方に対するアンチセンス活性を検定した。これらオリゴマー配列は次 の通り。 ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）標的ｍＲＮＡおよびアンチセンスオリゴマー： これらキメラオリゴマーのホスホロチオエート結合は下線を付した塩基の直５’ 位にある。ホスホロチオエートコアの位置が、標的ｍＲＮＡに照らして順次移動 していることが判る。 ０．５μＭ−オリゴマーを使用した以外は実施例４１に一般的に記載した操作 を使用して、アンチセンス活性をｐＧ１０４１（ＵＣＡＴ）とｐＧ１０４２（Ｕ ＣＡＴ）との双方について検定した。ホスホロチオエートコア中の誤対合および キメラオリゴマー中のコアの位置はアンチセンス活性に大きく影響することが証 明された。次表は検定した各被検査リゴマーの遺伝子発現百分率（±誤差）を与 える。 この結果はオリゴマー中でのＲＮａｓｅＨ−活性化ホスホロチオエートコアの 移動による効果を示す。３６３７−１、３６３８−１、３２６２−５および３６ ３６−１の比較により判るように、ホスホロチオエートコアの位置および／また はホスホロチオエートコアの塩基成分はアンチセンス活性に大きな効果を示す。 キメラ内でより中央寄りの位置は最も活性であるが、コアがキメラの末端に近い 時にさえ若干の活性が検出される。 このキメラオリゴマーのＲＮａｓｅＨホスホロチオエートコア配列内における 塩基１個の誤対合（前記配列上、「ｘ」で示した）で、３６３９−１および３６ ４０−１と３２６２−５との比較に見られるように、この真核細胞培養検定法で のアンチセンス活性を失う。同一検定システムを使用する別の実験で、全ホスホ ロチオエート２４量体であるＸＶ−２はｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）発現の９０％ 阻害およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ）に対する約５０％阻害を示し、後者標的の 場合には誤対合４個が存在するにも関わらずこの結果を示した。キメラオリゴマ ー３６３９および３６４０とｐＧ１０４０標的との間の誤対合１個でさえ活性を 完全に破壊したが、一方ではＸＶ−２およびｐＧ１０４２の場合の誤対合４個で は５０％以下の活性減だったのだから、これは全ホスホロチオエートオリゴマー はホスホロチオエート結合の短かな領域を含むキメラオリゴマーよりもはるかに 特異性が低いことを指摘するものである。実施例４３ キラルリッチ化オリゴヌクレオシドであるメチルホスホネート末端保護を含むキ メラでのＲＮａｓｅＨ切断速度増加 本実施例は高結合親和性を持つキメラオリゴマーは同じ塩基配列を持つ低親和 性オリゴマーよりもＲＮＡ標的鎖のＲＮａｓｅＨ切断を高速度で促進することを 証明する。ラセミ的にまたはキラル的に純粋な（Ｒ_p）メチルホスホネートを含 むキメラオリゴヌクレオシドをＲＮａｓｅＨを活性化する性能について試験した 。この実験では次のキメラオリゴマーを使用した。 これらキメラオリゴマーの各々は実施例３０に記載した方法に従って合成した 。相補合成ＲＮＡ標的は実施例２８に記載した方法に従って調製した。このオリ ゴマーは次の配列を有する： 当業界で普通に公知の操作に従い、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼを使用して³²Ｐ標識をこのオリゴマーの５’−末端に結合した。 大腸菌からのＲＮａｓｅＨはＰｒｏｍｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から 購入した。ＲＮａｓｅＨ反応に使用する緩衝液Ａは２０ｍＭ−ＫＣｌ、９ｍＭ− ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社） ２５０μｇ／ｍＬ、およびＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１００ｕ／ｍＬを 含有していた。 ５'−³²Ｐ−標識ＲＮＡ標的（約８００００ｄｐｍ、５×１０^-10Ｍ）の混合物 をいずれかのキメラオリゴマー１モル当量の反応緩衝液Ａ溶液（全容積＝９８マ イクロリットル）と混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベーション した。次に、ＲＮａｓｅＨ（１．１マイクロリットル、３０単位／ｍＬ、最終濃 度＝２×１０^-9Ｍ）を添加し、得られる混合物を３７℃でインキュベーションし た。適量（１５マイクロリットル）を所定の時間間隔で取出し、ＥＤＴＡ（０． ５Ｍ、３マイクロリットル）で希釈し、ドライアイス上で凍結し、−２０℃で貯 蔵した。ＲＮＡ切断生成物を１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．２）と平衡化した１５ ％ポリアクリルアミド／７Ｍ−尿素ゲル（２０ｃｍ×３０ｃｍｘ０．５ｍｍ、ｉ ．ｄ．）を使用するゲル電気泳動術により分析した。ゲルを１２００ボルトで約 ３時間電気泳動した。湿潤ゲル上のバンドをＢｉｏ−Ｒａｄ社ＧＳ−２５０型分 子 画像器（Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）を使用するりん光分析によって可視化した 。 部位特異的なＲＮａｓｅＨ−媒介切断をキメラオリゴマー双方について観察し た。断片の長さはその電気泳動的易動度に従って推測した。この分析に従って、 切断はＲＮＡ標的配列の中央部に限定されていたことが確認された。すなわち、 切断は各キメラオリゴマーのマイナス荷電部分に相補的なＲＮＡ鎖の位置に限定 されていた。図５に示すようにこの異なるキメラオリゴマー２種について、ＲＮ ａｓｅＨ媒介切断の速度に差が検出された。 キメラオリゴマー、３１２４−１（３’および５’−末端において様々なＭＰ （Ｒ_p）／ＤＥの骨格断片を含む）存在下のＲＮＡ加水分解速度はもう一つのキ メラオリゴマー２６８１−１（ラセミＭＰ骨格断片を含む）のものよりも約１０ 倍速いことが明らかである。実施例４４ キメラオリゴマー切断活性に対する２’−糖置換部位の効果 本発明オリゴマーのＲＮａｓｅＨ活性化領域に関する２’−糖置換部位の効果 を、標的ＲＮＡ配列に対する様々に置換したキメラオリゴマーの切断活性を測定 することによって研究した。標的とする切断部位の近くにＡＵＧ配列を含み、次 の配列を持つ、３５９３と命名した合成２０量体ＲＮＡ分子を調製した： キメラ２０量体ＲＮａｓｅＨ活性化オリゴヌクレオシド３４６３、３４６５およ び３４６６を一般的に前記した適切な二量体シントン法を用いて合成した。これ ら化合物は様々なＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ結合が連結した非−ＲＮａｓｅＨ活性化領 域に連接する５個連続するホスホロチオエート−結合デオキシリボヌクレオシド （下記括弧内に示す）を含む中央のＲＮａｓｅＨ活性化領域を含んでいた。キメ ラ３４６３および３４６５の連接領域における選択したヌクレオシド糖は下記の 大文字ヌクレオシド略号文字に下線で示した２’−Ｏ−メチル置換を含む（標的 相補性を示すために標的３５９３配列も併載する）： ここに開示する他種キメラオリゴマー化合物についてと同様に、ＲＮａｓｅＨ −活性化領域に関連する荷電した結合（ここではホスホロチオエート）は括弧内 に示す各ヌクレオシドの５’に存在する。そこで前記各化合物３４６３、３４６ ５および３４６６はキラル選択されたＲ_p−メチルホスホネート（｛ＭＰ（Ｒ_p） ｝）連結が両端に連接する中央ホスホロチオエート（｛ＰＳ｝）５個の連続的な 連結を下記のように含有する（３’から５’向けに記載）： 前記の下線を付したホスホロチオエート結合［断片...ｕ{ＭＰ(Ｒ_p)}(ｃ{ＰＳ }ｔ...中で］は、例えば前記実施例１３に、記載したような二量体シントン法を 使用して化合物に導入することができる。キメラ化合物の残りの非ＲＮａｓｅＨ 活性化部分には、例えば化合物の３’−末端での担体結合「ｕｃ」ジヌクレオチ ド配列に続く適当な二量体の連続的付加（たとえば、前記実施例８、９および１ ７Ａ参照）によって、導入された種々のＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ連結部分を含む。そ こで、前述の化合物３４６３および３４６５の２’−糖置換体は適当な２’ＯＭ ｅＵ｛ＭＰ（Ｒ_p）｝ｃ｛ＤＥ｝または２’ＯＭｅＵ｛ＭＰ（Ｒ_p）｝２’ＯＭｅＣ ｛ＤＥ｝二量体を各オリゴマーに順次に導入することで達成される。前記キメ ラオリゴマーのＲＮａｓｅＨ切断活性を評価するために、５’−³²Ｐ標識ＲＮＡ 標的化合物３５９３（１６０ｄｐｍ）と選択した被検オリゴマー（１：１モル比 ；濃度０．５ｎＭ）との混合物３２０μＬを緩衝液Ａ中で３７℃で１時間インキ ュベーションして相補複合体形成および平衡化を達成する。（緩衝液Ａ：２０ｍ Ｍ−ＫＣｌ、９ｍＭ−ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ＢＳＡ ［Ｐｒｏｍｅｇａ社］２５０μｇ／ｍＬ、およびＲＮａｓｉｎ［Ｐｒｏｍｅｇａ 社］１００ｕ／ｍＬ）。時間ゼロサンプルとして２０μＬを取出し、２ｎＭ− 菌（大腸菌）ＲＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の緩衝液Ａ溶液３．３μＬを添 加した（溶液中、酵素の最終濃度は０．０２２ｎＭ）。反応混合物は３７℃に保 った。適当な時間間隔で２０マイクロリットル量を混合物から取出し、０．５Ｍ −ＥＤＴＡナトリウム溶液２μＬを添加して反応を止め、次にドライアイスで凍 結した。ＲＮＡ切断生成物を７Ｍ−尿素および１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．１） を含有する１５％ＰＡＧＥ（２０ｃｍ×３０ｃｍ×０．５ｍｍ）で分析した。ゲ ルを１２００Ｖで２時間展開した。定量的な動力学的データはりん光分析による 各バンドの容積との積分によって得られた。 この実施例の動力学的曲線を図１１に示す。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの 単位が中央のホスホロチオエートＲＮａｓｅＨ活性化領域の隣に位置する時には （化合物３４６３、三角データ点）、全部が２’−Ｈのヌクレオシドを含有する キメラ化合物（化合物３４６６、円）と比較してＲＮＡ切断の全体的速度の明瞭 な低下（約１０倍）が見出された。初期の切断生成物数は化合物３４６６と比較 して３４６３では減少（３の代わりに２）していた。２’−Ｏ−メチルヌクレオ シドの代わりに、２’−Ｈヌクレオシドを様々なメチルホスホネート／ホスホジ エステルの５’−末端部分およびホスホロチオエート領域の境界に導入した時に は（化合物３４６５、菱形）、化合物３４６３で得られたものと比較して切断速 度の顕著な低下は見当らず、切断生成物数も変化がなかった。 この実施例はＲＮａｓｅＨ切断部位に隣接する非ヒドロキシ２’−糖置換基の 存在はＲＮａｓｅＨ切断活性に顕著な縮小効果を及ぼすこと、および僅か１個の ２’−Ｏ−メチル置換でさえ切断活性の低下を招来しうることを証明する。これ と対照的に、ＲＮａｓｅＨ活性化領域からヌクレオシド単位１個または２個だけ 離れた２’−置換の使用ではＲＮａｓｅＨ結合および／または切断活性化には極 く僅かな効果を及ぼすに過ぎない。実施例４５ キメラオリゴヌクレオシド化合物のＨＰＶ標的に対する活性 この実施例はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）遺伝子配列を標的とする本発明の 種々のキメラオリゴヌクレオシドを使用する実験を記載する。Ａ．ポリシストロン性Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡを発現するプラスミドの調製 ＨＰＶ１１・Ｅ６／Ｅ７をコードする挿入体を持つ発現ベクターを発現ベクタ ーｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して調製した。プラスミド ｐＲｃ／ＣＭＶをＨｉｎｄＩＩＩでリネアライズした。陥凹−３’−末端をＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ポリメラーゼ作用により充填した。ＢａｍＨＩ 部位でｐＢＲ３２２にクローニングしたＨＰＶ−１１の完全長クローンを制限酵 素ＢｓｔＩＩおよびＨｉｎｆＩで消化した。Ｅ６およびＥ７読み取りフレームを 含む８７３塩基対断片をアガロースゲル上で精製した。この断片の制限末端をＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼで陥凹３’−末端において充填して修正した。 ベクターと挿入物をＴ₄ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換 した。組換え体を適切な挿入体および方向ならびにＥ６／Ｅ７転写活性と翻訳活 性とについてスクリーニングした。 このプラスミド（ｐＲｃ／ＣＭＶＩＩ−Ｅ６／Ｅ７）を下記の無細胞翻訳系で 使用した。Ｂ．Ｅ２挿入体を持つプラスミドの調製 ＨＰＶ−１１・Ｅ２挿入物を持つ発現ベクターをｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ社）を使用して調製した。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩでリネアライ ズし、続いてウシ胸腺アルカリホスファターゼで処理した。Ｅ２オープン読み枠 を分離するために、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にクローニングしたＨＰＶ− １１の完全長クローンを制限酵素ＸｍｍＩおよびＳｓｐＩで消化した。陥凹３’ 末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｖ断片にある５’−３’ポリメラーゼ 作用で充填した。次にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを付加した。完全Ｅ２・ＯＲＦを 含む１３０９塩基対断片をアガロースゲルで精製した。修正ベクターおよびＥ２ 挿入体をＴ₄ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。組換え 体を適切な挿入体、転写および翻訳についてスクリーニングした。 このプラスミド（ｐＲｃ／ＣＭＶＩＩ−Ｅ２）を下記の無細胞翻訳系で使用し た。Ｃ．モノシストロン性Ｅ７挿入体を持つプラスミドの調製 ＨＰＶ−１１・Ｅ７挿入物を持つ発現ベクターをｐｃＤＮＡ−１（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ社）を使用して調製した。プラスミドｐｃＤＮＡをＢａｍＨＩおよび ＸｂａＩで消化した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位が隣接するＨＰＶ−１ １の完全長オープン読み枠を含む断片（−３０から終結コドンまで）は標準的実 験計画を使用するＰＣＲによって調製した。消化したベクターおよび断片をＴ₄ ＤＮＡリガーゼで連結し、ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換した。組換え体は 適切な挿入体、転写および翻訳についてスクリーニングした。 このプラスミド（ｐｃＤＮＡ・Ｅ７）を下記の無細胞翻訳系および下記の一過 性発現検定で使用した。Ｄ．無細胞翻訳系抽出物中のＨＰＶ−１１・Ｅ７を標的とするアンチセンスキメ ラオリゴマー活性の証明 モノシストロン性（１００ｎＭ）ＨＰＶ−１１・Ｅ７またはポリシストロン性 （５０ｎＭ）ＨＰＶ−１１・Ｅ６／Ｅ７ＲＮＡを無細胞ウサギ網状赤血球抽出物 （Ｐｒｏｍｅｇａ社）中でクロラムフェニコールアセチル転位酵素（ＣＡＴ）Ｒ ＮＡ（２から１０ｎＭ）と共翻訳した。各検定系の成分は次の通りであった。 無細胞翻訳系は３７℃で６０分間行い、ＳＤＳゲル負荷緩衝液の添加と９５℃ ３分間インキュベーションで停止した。Ｅ７の翻訳はαＥ７ヤギ抗血清とプロテ インＡセファロースとによる免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびりん 光分析により評価した。このプロトコールは以下に記載する無細胞翻訳系でも使 用した。Ｅ．無細胞系ＲＮａｓｅＨ切断検定法におけるアンチセンスオリゴマーの活性の 証明 試験管内転写、非キャップ構造モノシストロン性ＲＮＡを転写プラスミドｐｃ ＤＮＡ１１・Ｅ７によりＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ・ＭｅｇａＳｃｒｉ ｐｔ）で調製した。このＥ７ＲＮＡを１００ｎＭ濃度で０．０４単位の大腸菌Ｒ ＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１μＬ、３．５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂，２５ｍＭ− ＫＣｌ、７０ｍＭ−ＮａＣｌおよび２０ｍＭ−酢酸カリウムの存在下に３７℃で ３０分間インキュベーションした。ホルムアミドゲル負荷緩衝液の添加に続いて １００℃に５分間加熱により反応を停止させた。 標本を４％尿素−ＰＡＧＥ分析とそれに続くエチジウムブロミド染色とで分析 した。ＲＮａｓｅＨ存在下におけるメチルホスホネートキメラオリゴマー２６５ ７−１、３１６９−１、３２１４−１、３２５７−１、３２４１−１および３２ ３６−１のＥ７ｍＲＮＡの切断の百分率を次表に示す。検査した濃度では全オリ ゴマーで良好な用量作用効果が得られた。力価の順序は３１６９−１＝３２５７ −１＞３２１４−１＝２６５７−１＞３２３６−１＞３２４１−１であった。全 オリゴマーはＥ７ｍＲＮＡを１個所で切断する良好な特異性を示した。 結果はＥ７ｍＲＮＡの切断百分率で示す。推定値はゲルの目視検査で得た。Ｆ．一過性に形質転換したＣＯＳ−７細胞におけるアンチセンスオリゴマーの活 性の証明 ２４ウエル板にＣＯＳ−７細胞を１×１０⁵細胞／ウエルで接種し、次に細胞 培養培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血漿およびペニシリン５０国際単位 、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍＬとアンホテリシンＢ０.２５μｇ／ｍＬ） 中で一夜培養した。２４時間後、細胞は約８０〜９０％全面生長した。２.５μ ｇ／ｍＬのｐｃＤＮＡ１−Ｅ７、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社） ５０μｇ／ｍＬ、および種々の濃度のオリゴマーからなる形質転換カクテルを調 製し、２秒間ふりまぜ混合した後、室温で１５分間インキュベーションした。 プレート上で、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１ｍＬ／ウエルで細胞 を２回洗浄した。次に、ウエル当り形質転換カクテル０.５ｍＬを複製ウエルに 追加した。プレートを５％ＣＯ₂中で４時間３７℃でインキュベーションした。 インキュベーション後、細胞を細胞培養培地１ｍＬ／ウエルで２回洗浄し、一夜 培養した。次に細胞をシステイン不足ＤＭＥＭ１ｍＬ／ウエルで２回洗浄し、次 にシステイン不足ＤＭＥＭ中で細胞培養条件下に３０９分間インキュベーション した。細胞を³⁵Ｓ−システイン２５０μＣｉ／ウエルの血漿不含システイン不足 ＤＭＥＭ５００μＬ溶液中で５時間インキュベーションして標識した。次に１× 燐酸緩衝液食塩水１ｍＬ／ウエルで２回洗浄、次にＳＤＳサンプル緩衝液（５０ ｍＭ−トリス−Ｃｌ［ｐＨ６.８］、１００ｎＭ−ジチオスレイトール、２％ド デシル硫酸ナトリウム、０.１％ブロムフェノールブルー、１０％グリセリン） １００μＬで細胞を溶解した。各ウエルをＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ−トリス− Ｃｌ［ｐＨ７.４］、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０.１％ ドデシル硫酸ナトリウム、０.５％デオキシコール酸ナトリウム）１００μＬで 洗浄し、細胞溶解物のサンプル緩衝液と混合した。 Ｅ７合成はヤギ抗ＨＰＶ−１１・Ｅ７血漿およびＡ蛋白質セファロースビーズ （Ｓｉｇｍａ社）とＥ７蛋白質との免疫沈降反応により評価した。免疫沈降した Ｅ７蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびりん光分析により定量化した。免疫沈降前 の形質転換細胞溶解物画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびりん光分析によって蛋白質 合成全体を評価した。 代表的な実験は次のように実施した。Ｅ７発現プラスミドｐｃＤＮＡ１１Ｅ７ （５μｇ／ｍＬ）および種々の量のアンチセンスオリゴヌクレオチドをＴｒａｎ ｓｆｅｃｔａｍ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）の存在下にＣＯＳ−７細胞に形質 転換した。細胞を形質転換混合物と４時間インキュベーションし、培地プラス血 漿中で一夜放置して回復させ、そして³⁵Ｓ−システインで５時間標識した後に収 穫した。細胞を溶解し、αＥ７血漿との免疫沈降と、これに続く蛋白質生成物の ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分画およびりん光分析とによりＥ７蛋白質合成を評価した 。蛋白質全体の合成は細胞抽出物適量のＳＤＳ分離、各レーンに存在する蛋白質 全体のオートラジオグラフィーおよびりん光定量化により分析した。次表はキメ ラオリゴマー３１６９−１、３２１４−１、３２５６−１、３２５７−１および ３３３６−１で得られたＩＣ５０値およびＩＣ９０値を要約する。 細胞系検定によるＨＰＶ−１１・Ｅ７を標的とするオリゴマー力価 この実施例で、中央にホスホロチオエート（［ＰＳ］）または種々のホスホロ チオエート／ホスホジエステル（［ＰＳ／ＤＥ］）連結を含み、末端ブロックと してホスホジエステル連結（［ＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ］）が連結するキラルメチル ホスホロチオエート／メチルホスホネート二量体を含むキメラオリゴヌクレオチ ド３２１４−１、３２５７−１および３２５６−１はＣＯＳ−７細胞ではＨＰＶ ・Ｅ７蛋白質の一過性発現の強力な阻害剤であることが明らかである。 たとえば３１６９−１のようにホスホジエステル連結が中央にあるキメラオリ ゴヌクレオチドは無細胞系の検定では非常に強力であることが証明されているけ れども、細胞含有検定では強力ではない。この相違はホスホジエステル連結部の 細胞内での不安定性に起因するものでありうる。最後に末端に存在するヌクレオ シドの糖内にある２’−ＯＭｅ修飾を含むオリゴヌクレオチド（３３３６−１参 照）は［ＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ］末端を持つ対応するキメラよりも力価が低い。Ｇ．ＶＥＲＯ細胞における微量注射によるオリゴマー活性の証明 （ｉ）微量注射 下記の操作に従って、オリゴマーをＥ２（ｐＲｃ／ＣＭＶ１１−Ｅ２）または Ｅ７（ｐｃＤＮＡＥ７）発現プラスミドと共に５０μｇ／μＬでＶＥＲＯ細胞の 原形質に微量注射した。注射の１日前に、ＶＥＲＯ細胞（約２×１０⁵細胞／ｍ Ｌ）をカバーグラスに塗布した。プラスミドＤＮＡをエッペンドルフチューブ中 ＰＢＳで２０ｎｇ／μＬ（Ｅ７）または５０ｎｇ／μＬ（Ｅ２）の濃度まで希釈 した。プラスミドＤＮＡを含む管を１４００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。微 量注射の前に管を氷上に置いた。プラスミドＤＮＡ溶液の２μＬ量をフェムに上 部まで載せた。先端をカバーグラスに４５°で設定した。微量注射器の圧力を８ ０に設定して注射した。注入後、カバーグラスを３７℃で一夜インキュベーショ ンした。注射の１６時間後、細胞を固定し、下記に説明するようにヤギ抗Ｅ７ポ リクローナル抗体で免疫染色した。 （ｉｉ）間接螢光免疫検定 この検定に使用する前に、ヤギ抗−ＨＰＶ−１１・Ｅ７またはＨＰＶ−１１・ Ｅ２血漿を下記のようにＶＥＲＯ細胞で前吸着した。Ｔ−１５０フラスコ２個か ら全面生長ＶＥＲＯ細胞を掻取り、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットに次に 血漿２００μＬを添加し、一夜４０℃で混合した。混合物を遠心分離し、上清液 を新しいチューブに移した。前吸着した血漿は５０％グリセリン中、−２０℃で 保存した。 Ｅ２またはＥ７の発現水準を螢光抗体検定を使用して評価した。カバーグラス を室温で２０分間ＰＢＳ中で１０％ホルムアルデヒドで固定し、次にＰＢＳで２ 回洗浄し、続いてＰＢＳで１：１０００希釈下に前述のように前吸着したヤギ抗 −ＨＰＶ−１１・Ｅ７またはＨＰＶ−１１・Ｅ２蛋白質血漿と室温で２時間イン キュベーションした。カバーグラスを次にＰＢＳで各５分づつ３回洗浄し、ＰＢ Ｓに１：２００希釈したＦＩＴＣ−複合ロバ抗−ヤギＩｇＧＡｂ（Ｊａｃｋｓｏ ｎ・ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃７０５−０９５−１４７）とイ ンキュベーションした。カバーグラスを次にＰＢＳで３回洗浄し、風乾し、５０ ％グリセリンでスライドグラス上に装着した。検査はＵＶ光線下に行った。結果 を次表に表示する。 ＨＰＶ−１１・Ｅ７を標的とするオリゴマーの力価 Ｈ．無細胞翻訳系抽出物中のＥ２を標的とするアンチセンスオリゴマーの活性の 証明 Ａｍｂｉｏｎ・ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキットを製造元の指示に従って使用し、 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−１１Ｅ２を転写してＥ２ ＲＮＡを調製した。 試験管内転写Ｅ２ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中 で無細胞系で翻訳した。この検定系の各成分の最終濃度は次の通りであった： 無細胞系翻訳を３７℃で１時間行い、ＳＤＳゲル充填緩衝液の添加および９５ ℃で３分間インキュベーションで停止させた。Ｅ２の転写は翻訳混合物の分離後 にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびりん光分析により評価した。Ｅ２の翻訳開始コド ンを標的とするオリゴマーの効果を測定するため、試験管内転写Ｅ２ｍＲＮＡを ＲＮａｓｅＨ０.０２または０.０４単位／μＬの存在下に０.０１から１０μＭ 濃度範囲のオリゴヌクレオチドを用いて翻訳した。対照としてＣＡＴｍＲＮＡを 共翻訳するか、または独立の翻訳反応物中で翻訳した。 次表に示すように、Ｅ２の無細胞翻訳系阻害の測定およびＣＡＴ対照ｍＲＮＡ に関する特異性の測定は、オリゴマー３１７０、３２３３および３２３４につい て行った。並行研究では、これら末端保護キメラオリゴマーは全ホスホジエステ ル・オリゴマーより特異的であることを示した。 無細胞系検定法によるＨＰＶ−１１を標的とするオリゴマーの力価 Ｉ．無細胞翻訳系抽出物中のＥ６を標的とするアンチセンスオリゴマーの活性の 証明 Ａｍｂｉｏｎ・ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキットを製造元の指示に従って使用して 、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ１１−Ｅ６／Ｅ７を転写 してポリシストロン性Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡを調製した。前記Ｄの部に記載したよ うに、試験管内転写Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ（５０ｎＭ）をウサギ網状赤血球溶解物 （Ｐｒｏｍｅｇａ社）中で無細胞系で翻訳した。無細胞系翻訳を３７℃で１時間 行い、ＳＤＳゲル充填緩衝液の添加および９５℃で３分間インキュベーションで 停止した。Ｅ６の転写は翻訳混合物の分離およびそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析およびりん光分析により評価した。 Ｅ６の翻訳開始コドンを標的とするオリゴマーの効果を測定するため、試験管 内転写Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡを下記オリゴヌクレオチドの存在または不在下に翻訳 した。翻訳はＲＮａｓｅＨ０.０２または０.０４単位／μＬの存在下に、濃度０ .０１から１０μＭの範囲のオリゴマーを用いて行った。ＣＡＴｍＲＮＡを、対 照として共翻訳した。次表に示すように、最善の結果はＡＵＧ−１０を標的とす る２０量体キメラメチルホスホネートオリゴマーであるオリゴマー３２１５−１ で得られた。 化合物３２５５および３２１５は次の通り： 以下はキラル的に純粋な２’−Ｏ−メチル二量体の合成に有用な化学物質に関 連する一群の実施例である。二量体２種の調製は実施例４６および４７に記載し 、５’または３’−ホスホロアミダイト単量体いずれかによるＰ（ＩＩＩ）結合 剤化学物質の有用性をさらに例示する。これら２つの実施例は所望のメチルホス ホネート結合を得るためにクメンハイドロペルオキシドまたはカンファースルホ ニルオキサジリジンのいずれかを使用してヌクレオシド間メチルホスホロアミダ イト連結を（保持しつつ）酸化する性能をも証明する。どちらかまたは両方の試 薬を使用してもよいけれども、クメンハイドロペルオキシドに関連する危険がな いので、われわれはカンファースルホニルオキサジリジンの使用を優先する。実 施例４８は２’−Ｏ−Ｍｅ−グアノシン−５’−ＯＨの合成を記載するが、これ は他種５’−ＯＨヌクレオシドの調製に適用することのできる一般的方式である 。実施例４９はβ−シアノエチル（「ＣＥ」）ホスホロアミダイトを持つ２'− Ｏ−Ｍｅ−ＵＣ二量体のホスフィチル化を記載する。実施例４６ ５’−メチルホスホンアミダイト一量体を経由する２’−Ｏ−Ｍｅ，ＧＧ（５’ Ｏ−ＤＭＴ，３’Ｏ−βＣＥ，Ｎ₂ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒ_p）二量体の製造 ５００ｍＬＲＢＦに２’−Ｏ−Ｍｅ，Ｇ（３’Ｏ−ｔＢＤＰＳ，５’Ｏ−ＯＨ ， Ｎ²ＩＢＵ）３０.５ｇ（０.０５Ｍ）を入れ、これをピリジン１×１００ｍＬお よびアセトニトリル（ＡＣＮ）２×１００ｍＬで乾燥した。得られた乾燥泡状物 をアルゴンでロータリーエバポレーターから取り出し、無水ＡＣＮ３００ｍＬ、 トリエチルアミン１０.５ｍＬ（０.０７５Ｍ）１.５当量）で処理した。フラス コをゴム製隔壁で閉じ、クロロ，メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフ ィン１０.９ｍＬ（０.０６Ｍ、１.２当量）で処理（滴加）した。反応物を一夜 室温で撹拌した。 翌朝にＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ・Ｇｏｌｄ・ＲＰ、Ｗａｔｅｒｓ・Ｃ１８・ ｂｏｎｄａｐａｋ；λ２５４ｎｍ，２０分、プログラム５０／５０ＡＣＮ／０． １Ｍ−ＴＥＡＡから１００％ＡＣＮまで）を測定すると反応物は出発物質不含で あった。反応混合物を濃縮し、次にシリカ２２５ｇ上２％ＴＥＡ含有酢酸エチル ／ヘプタン３：１で精製した。生成物を集め、濃縮して泡状固体２５ｇ（６７％ ）を得たが、これはＨＰＬＣによれば純度８６％であった。この生成物をＡＣＮ に取り、所期アミダイトの１０％溶液とし、これをモレキュラーシーブ（分子篩 ）上に貯蔵した。 アルゴンバルーンを頂部に取付けた火炎乾燥５００ｍＬＲＢＦにガラス繊維を 入れた滴加濾斗を経由して２’−Ｏ−Ｍｅ，Ｇ（５’−アミダイト，３’−ｔＢ ＤＰＳ，Ｎ²ＩＢＵ）の保存溶液１００ｍＬ（１０ｇ、０.０１３Ｍ、１.２５当 量）と共に２’−Ｏ−Ｍｅ，Ｇ（５’ＤＭＴ，３’ＯＨ，Ｎ²ＩＢＵ）の保存溶 液７１.１ｍＬ（７.１ｇ、０.０１１Ｍ、１.０当量）を投入した。反応混合物を 次にエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）３０.９ｍＬ（ＡＣＮ中２５％重溶液、 ５.０当量）で一度に処理し、室温で５分間撹拌し、その後にクメンハイドロペ ルオキシド（２.１ｍＬ、工業用、８０％）を一度に添加した。５分後に反応を 飽和亜硫酸水素ナトリウム２０ｍＬで停止させた。反応混合物をＨＰＬＣにより 分析すると１.２／１.０（Ｓ_p／Ｒ_p）比の二量体８６％であった。反応混合物を 次にロータリーエバポレーターに注入し、ＡＣＮを除去した。得られた濃縮物を 次にジクロロメタン（ＤＣＭ）１５０ｍＬに取り、飽和のＮａＨＣＯ₃２×７５ ｍＬおよび水１×７５ｍＬを使用して洗浄した。水性洗浄液を集め、次にＤＣＭ １×７５ｍＬで抽出し、元の有機相と混合し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃 縮して薄コハク色の泡状固体とした。 この泡状固体２’−Ｏ−Ｍｅ，ＧＧ（５’ＤＭＴ，３’ｔＢＤＰＳ，Ｎ²−ｉ Ｂｕ）ＭＰ（Ｒ_p／Ｓ_p）生成物１２.６ｇ（０．００９４Ｍ、１.０当量）をＴＨ Ｆ１２０ｍＬに取り、ＴＢＡＦ１４.２ｍＬ（ＴＨＦ中１Ｍ、０.０１４Ｍ、１. ５当量）で一度に処理し、室温に一夜放置した。翌朝脱シリル化の完了と純度８ ４％（４４％Ｓ_pおよび４０％Ｒ_p）とをＨＰＬＣで確認した。反応混合物にシリ カゲル少量を添加し、１０分間撹拌後、反応混合物をシリカゲル濾床を入れた溶 融ガラス濾斗を通した。生成物を１０％メタノール含有ＤＣＭ５００ｍＬで床か ら溶離した。濾液を濃縮し、ＤＣＭに取り、飽和ＮａＨＣＯ₃２×７５ｍＬおよ び食塩水１×７５ｍＬを使用して洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濾 過し、濃縮して粘稠な油としたが、これは強いクメンハイドロパーオキシド臭を 有し、１４ｇ重量であった。 この油をＡＣＮに取って２３％重溶液とし、２インチの分取ＨＰＬＣカラム上 （Ｂｅｃｋｍａｎ・Ｇｏｌｄ、ＲＰ、Ｋｒｏｍａｓｉｌ・Ｃ１８、１０ｕ、λ２ ９５ｎｍ、６０ｍＬ／分、等勾配４５％ＡＣＮおよび５５％Ｈ₂Ｏ）で精製した 。３回実験して純粋なＲ_p画分を集め、濃縮して１００％純粋なＧＧ（３’−Ｏ Ｈ）ＭＰ（Ｒ_p）二量体３.３ｇを得た。実施例４７ ３’−メチルホスホンアミダイト一量体を経由する２’−Ｏ−Ｍｅ，ＣＵ（５’ −ＤＭＴ，３’ＯＨ，Ｎ⁴ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒ_p）二量体の製造 ２’−Ｏ−Ｍｅ，ＤＭＴ保護シチジン５０ｇ（０.０８２Ｍ、１.０当量）をピ リジン３×１００ｍＬとＡＣＮ１×１００ｍＬとの共蒸発により無水とした。フ ラスコをアルゴンで置換し、これに撹拌棒、ＡＣＮ５００ｍＬ、ＴＥＡ２２.７ ｍＬ（０.１６３Ｍ、２当量）を入れ、アルゴンバルーンを頂につけた隔壁を装 着した。溶液を２０ｍＬプラスチック注射筒を経るＣｌ−ＭＡＰ１９.２ｍＬ（ ０.１１Ｍ、１.３当量）で滴加処理し、一夜室温で撹拌した。翌朝反応物をＨＰ ＬＣで検査したが、出発物質は不在であった。反応混合物を濃縮し、シリカゲル ３ ００ｇ上２％ＴＥＡ含有５０／５０ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで精製した。溶離液４ Ｌをカラムに通し、ＵＶ陽性物質全部を集め、濃縮して泡状固体（５２ｇ、純度 ９５％（ＨＰＬＣ）、回収８４％）とした。この生成物をＡＣＮに取って所期の ３’−メチルホスホノアミダイトの１０％重溶液とし、この溶液に分子篩を添加 した。 分子篩上で一夜放置後、この保存液１００ｍＬ（１０ｇ、０.０１３Ｍ、１.２ ５当量）をＵ，５’−ＯＨ５１ｍＬ（５.１ｇ、０.０１Ｍ、１.０当量）の保存 液と共に火炎乾燥５００ｍＬＲＢＦ中に添加した。滴加濾斗を経由してＥＴＴ（ ６７ｍＬ、分子篩上ＡＣＮ中１０％溶液、６.７ｇ、０.０５２Ｍ、５.０当量） で一度に処理し、反応物を室温で５分間撹拌した。このホスファイト中間体を次 にカンファースルホニルオキサジリジン（ＣＳＯ）溶液（分子篩上のＡＣＮ中１ ０％）３６ｍＬで５分間酸化した。反応混合物をＨＰＬＣで検査すると１.２／ １.０（Ｓ_p／Ｒ_p）比の二量体７９％であった。反応混合物を濃縮して泡状固体 とし、ＤＣＭ１５０ｍＬに取り、実施例４６記載のように後処理した。得られた 泡状固体はＨＰＬＣによれば二量体８９％であって、それ以上の精製なしに脱シ リル化されていた（下記参照）。 泡状固体２’−Ｏ−Ｍｅ，ＣＵ（５’ＯＤＭＴ，３’−ＯｔＢＤＰＳ，Ｎ⁴− ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒ_p／Ｓ_p）二量体をＴＨＦ１００ｍＬに取り、次にテトラブチル アンモニウムフルオリド１２.３ｍＬ（ＴＨＦ中１Ｍ、０.０１２Ｍ、１.５当量 ）で一度に処理した。１時間後、反応をＨＰＬＣで検査し、出発物質の消失によ り完了と認めた。反応混合物を濃縮し、シリカゲル（１０：１）上、１０％メタ ノールを含む３：１ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭで精製した。精製した二量体（８ｇ、１ .５／１．０、Ｒ_p／Ｓ_p）を次に分取ＨＰＬＣで精製し、後続２回の実験により 純Ｒ_p二量体、３’−ＯＨを３.３ｇ得た。実施例４８ ＤＭＴ保護３’−ＯＨを経由する２’−Ｏ−Ｍｅ，Ｇ（５’−ＯＨ，３’ＯｔＢ ＤＰＳ，Ｎ²ＩＢＵ）の製造 ＤＭＴ保護２’−Ｏ−Ｍｅ−グアノシンを３×１００ｍＬＤＭＦとの共蒸発で 無水にした。泡状固体をロータリーエバポレーターからアルゴンで取り出し、無 水ＤＭＦ２５０ｍＬに溶解した。溶液を次にｔ−ブチルジフェニルシリルクロリ ド１５.３ｇ（０.０５６Ｍ、１.５当量）およびイミダゾール１０.１ｇ（０.１ ５Ｍ、４.０当量）で処理し、次に溶液が均質になるまで手動撹拌し、室温に一 夜放置した。翌朝反応をＨＰＬＣで検査して出発物質の不在を確認した。反応混 合物を手動で撹拌しながら次に氷水３００ｍＬ中に注入した。固体をブフナー濾 斗で集め、冷水で洗浄し、次にＤＣＭ２５０ｍＬに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃３ ×２００ｍＬ、水１×１００ｍＬを使用して洗浄した。水層を集め、ＤＣＭ２× １００ｍＬで抽出した。有機層を集め、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、濾過し、濃縮し て泡状固体として、新規にシリル化した生成物３５ｇ（理論収率より僅かに多い ）を得た。この泡状固体２’−Ｏ−Ｍｅ，Ｇ（５’−ＯＤＭＴ，３’ＯｔＢＤＰ Ｓ，Ｎ²ＩＢＵ）をＤＣＭ１５０ｍＬに溶解し、磁気撹拌しつつベンゼンスルホ ン酸２６０ｍＬ（７５／２５・ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中０.１Ｍ溶液、０.０２６Ｍ、 ０.６７当量）で一度に処理した。反応が１０分間進行した後、５％ＭｅＯＨの ＤＣＭ溶液によるＴＬＣは完全な脱シリル化が起きたことを示した。ＴＥＡ２０ ｍＬで反応を直ちに停止させると溶液は濃透明コハク色から透明な薄黄色に変化 した。溶液を濃縮して粘性油とし、次に０.５％ＭｅＯＨ含有ＤＣＭと平衡化さ せたシリカゲル２５０g上に負荷した。遊離のトリチルを同じ溶離液で除去し、 生成物を次に６％ＭｅＯＨ含有ＤＣＭで溶離した。生成物含有画分を集め、濃縮 して表記化合物２１.８ｇ（ＨＰＬＣで９８.５％純、全収率９１％）を得た。実施例４９ ＵＣ，３’−ＯＨを経由する２’−Ｏ−Ｍｅ，ＵＣ（５’−ＯＤＭＴ，Ｎ⁴ＩＢ Ｕ）−３’ＣＥホスホロアミダイトの製造 ２’−Ｏ−Ｍｅ，ＵＣ（５’ＤＭＴ，３’ＯＨ，Ｎ⁴ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒ_p）二量 体９８０ｍｇをＡＣＮ３×１０ｍＬとの共蒸発で無水にした。得られた乾燥泡状 物を次に無水ＡＣＮ１０ｍＬに取り、続いてこれにＴＥＡ３２５μＬ（２.３２ ミリモル、２.２５当量）を添加し、続いて２’−シアノメチル−Ｎ，Ｎ−ジイ ソプロピルクロロホスホロアミダイト４６０μＬ（２.０６ミリモル、２.０当量 ） を滴加（１ｍＬガラス注射筒を経て）した。反応物を一夜撹拌し、そこでＴＬＣ とＨＰＬＣとで反応完了を確認した。反応混合物を濃縮し、１％ＴＥＡを含有す る３：１：１のＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＡＣＮと平衡させたシリカ３０ｇを含む１ .５×２０ｃｍカラムに充填した。生成物を同一物で溶出し、純生成物を含む画 分を集め、濃縮して純アミダイト６００ｍｇを得た。 本発明の化合物を利用する医薬的組成物、およびその製剤化方法は当業界で公 知であり、適切な組成物の製剤化技術はさらに米国特許出願０８／１５４０１３ 号および０８／１５４０１４号に記載されている。同様に本発明の化合物および 組成物を使用する、例えば哺乳類疾患の処置においてなど、適用可能な方法はこ れら出願に開示されており、これらを参考のためにここに引用する。 前掲の実施例および記載には本発明を達成する好適な態様および種々の方法を 記述するが、それらは後記請求項に記述する本発明の範囲についての限定を意図 されているものではない。さらにその上に、前記開示に照らせば本発明はここに 記載したものの合法的均等物である態様および構造の選択肢を複数包含すること が認識されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／２３３，７７８ (32)優先日 1994年４月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／２３８，１７７ (32)優先日 1994年５月４日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，Ｎ Ｚ，ＵＳ (72)発明者 ギアチェッティ，クリスティーナ アメリカ合衆国92075カリフォルニア、ソ ラナ・ビーチ、サンタ・エステラ946番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的リボ核酸配列のＲＮaseＨを介する開裂を達成するためのオリゴヌクレ オシド化合物であって、ＲＮaseＨ−活性化領域と非−ＲＮaseＨ−活性化領域と を含有し、ここに、 ＲＮaseＨ−活性化領域は電荷を有するヌクオシド間結合構造によって結合さ れた、少なくとも３つの連続的な２'−非置換ヌクオシドのセグメントを含有し 、 非−ＲＮaseＨ−活性化領域は少なくとも２つの結合したヌクオシドのセグメ ントを含有し、該非−ＲＮaseＨ−活性化領域内の結合のうち、少なくとも１つ はキラル的に選択されており、 ここに、オリゴヌクレオシド化合物の塩基配列は標的リボ核酸配列の標的領域 と相補的である。 ２．該ＲＮaseＨ−活性化領域が５〜約９個の連続的に結合したヌクオシドを含 有している、請求項１記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３．該ＲＮaseＨ−活性化領域内の荷電結合構造がホスホジエステル結合、ホス ホロジチオエート結合及びホスホロチオエート結合からなる群から選択されるも のである請求項２記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ４．該ＲＮaseＨ−活性化領域内の荷電結合構造のセグメントが少なくとも２つ の異なる荷電結合構造を含む、混合荷電結合配列を含有するものである請求項２ 記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ５．該混合荷電結合配列が、ＲＮaseＨ−活性化配列内で少なくとも２回繰り返 されている請求項４記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ６．該ＲＮaseＨ−活性化領域が複数のホスホロチオエート結合を含有するもの である請求項３記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ７．非−ＲＮaseＨ−活性化領域内のキラル的に選択されたヌクレオシドの該セ グメントが、少なくとも４個の結合ヌクレオシドを含有し、さらに複数のＲ_P− 選択された結合構造をも含むものである請求項２記載のオリゴヌクレオシド化合 物。 ８．該キラル的に選択されたヌクオシドセグメント中の結合構造の総数の少なく とも約４０％がＲ_P結合構造である請求項７記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ９．該キラル的に選択されたヌクオシドセグメント中の不斉結合構造の少なくと も約７５％がＲ_P結合構造である請求項７記載のオリゴヌクレオシド化合物。 １０．該キラル的に選択されたヌクオシドセグメント中の不斉結合構造の実質上 全てが、Ｒ_P結合構造である請求項７記載のオリゴヌクレオシド化合物。 １１．該非−ＲＮaseＨ−活性化領域内のキラル的に選択された結合構造のセグ メントが、少なくとも２つの異なる結合構造であって、少なくとも１つは不斉な 結合構造を含む、混合キラル結合配列を含有するものである請求項７記載のオリ ゴヌクレオシド化合物。 １２．該混合キラル結合配列が非−ＲＮaseＨ−活性化領域内で少なくとも２回 繰り返されている請求項１１記載のオリゴヌクレオシド化合物。 １３．混合型キラル結合配列中の該異なる結合構造が下記の群： Ｒ_P−メチルホスホネート結合及びホスホジエステル結合； Ｒ_P−メチルホスホネート結合及びラセミ形メチルホスホネート結合； Ｒ_P−メチルホスホネート結合及びホスホロチオエート結合； Ｒ_P−メチルホスホネート結合及びホスホロジチオエート結合；及び Ｒ_P−メチルホスホネート結合及びアルキルホスホノチオエート結合 からなる群から選択されるものである請求項１１記載のオリゴヌクレオシド化合 物。 １４．混合キラル結合配列中の該異なる結合構造が下記の群： 又は上記の混合結合構造において、少なくとも１個のＭＰ又はＭＰ（Ｒ）結合構 造が、それぞれＭＰＳ又はＭＰＳ（Ｒ）結合構造、ＡＡＰ又はＡＡＰ（Ｒ）結合 構造、又はＡＡＰＳ又はＡＡＰＳ（Ｒ）結合構造で置換されている混合結合構造 の組合せ からなる群から選択されるものである請求項１１記載のオリゴヌクレオシド化合 物。 １５．混合キラル結合配列中の該異なる結合構造によって結合しているヌクオシ ドの１方又は両方が２'−置換ヌクオシドである請求項１１、１３又は１４に記 載のオリゴヌクレオシド化合物。 １６．混合キラル結合配列中の該異なる結合構造によって結合しているヌクオシ ドの両方が２'−置換ヌクオシドである請求項１５記載のオリゴヌクレオシド化 合物。 １７．該２'−置換基がアルコキシ、アリルオキシ、ハロ置換基からなる群から 選択されるものである請求項１５記載のオリゴヌクレオシド化合物。 １８．該２'−置換基がメトキシ置換基である請求項１７記載のオリゴヌクレオ シド化合物。 １９．該ＲＮaseＨ活性化領域が化合物の１つの末端部分にあり、該非−ＲＮase Ｈ−活性化領域が他の末端部分にある請求項１、７、１１、１３又は１４に記載 のオリゴヌクレオシド化合物。 ２０．第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域を含有し、化合物中で該ＲＮaseＨ−活 性化領域が第１及び第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域と側面を接している請求 項１、７、１１、１３又は１４に記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２１．該第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域が、少なくとも４つの結合したヌク レオシドを含有し、さらに複数のＲ_P−選択された結合構造を含有するものであ る請求項２０記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２２．該第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域内のヌクオシド間結合構造及び所望 の２'−置換基が、該第１の非−ＲＮaseＨ−活性化領域について定義されたもの から選択される、請求項２１記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２３．ＲＮaseＨ−活性化領域と非−ＲＮaseＨ−活性化領域とを含有する、標的 リボ核酸配列のＲＮaseＨを介する開裂を達成するためのオリゴヌクレオシド化 合物であって、ここに、 ＲＮaseＨ−活性化領域は電荷を有するヌクオシド間結合構造によって結合さ れた、少なくとも３個の連続的な２'−非置換ヌクオシドのセグメントを含有し 、 非−ＲＮaseＨ−活性化領域は、（ａ）ラセミ形の低級アルキルホスホネート 、低級アルキルホスホノチオエート又はアミノ−（低級アルキレン）−ホスホネ ート結合構造及びそれと交互の（ｂ）負の電荷を有するホスフェートエステル、 ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート結合構造を含む交互配列を含有す るラセミ形ヌクオシド間結合のセグメントを含有し、 オリゴヌクレオシド化合物の塩基配列は標的リボ核酸配列の標的領域と相補的 である。 ２４．該ＲＮaseＨ−活性化領域が５〜約９個の連続的に結合したヌクオシドを 含有するものである請求項２３記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２５．該ＲＮaseＨ−活性化領域内の電荷を有する結合構造が、ホスホジエステ ル結合、ホスホロジチオエート結合及びホスホロチオエート結合からなる群から 選択されるものである請求項２４記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２６．該ＲＮaseＨ−活性化領域が複数のホスホロチオエート結合を含有するも のである請求項２５記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２７．該低級アルキル又は低級アルキレン部分がメチル及びメチレンから選択さ れるものである請求項２４記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２８．該負の電荷を有する結合構造がホスホジエステル結合構造である請求項２ ４又は２７記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ２９．該交互結合構造中に結合した１又はそれ以上のヌクオシドが２'−置換ヌ クオシド残基である請求項２４又は２７記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３０．該交互結合配列が２'−置換ホスホジエステルと結合したヌクオシド残基 を含有している請求項２９記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３１．該２'−置換基がアルコキシ、アリルオキシ及びハロ置換基からなる群か ら選択されるものである請求項２９記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３２．該２'−置換基がメトキシ置換基である請求項３１記載のオリゴヌクレオ シド化合物。 ３３．該ＲＮaseＨ活性化領域が化合物の１つの末端部分にあり、該非−ＲＮase Ｈ−活性化領域が化合物の他の末端部分にある請求項２３記載のオリゴヌクレオ シド化合物。 ３４．第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域を含有し、化合物中で該ＲＮaseＨ−活 性化領域が第１及び第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域と側面を接している請求 項２３記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３５．該第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域内のヌクオシド間結合構造及び所望 の２'−置換基が、該第１の非−ＲＮaseＨ−活性化領域について定義されたもの から選択される、請求項２９記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３６．該第２の非−ＲＮaseＨ−活性化領域内のヌクオシド間結合構造が、該第 １の非−ＲＮaseＨ−活性化領域について定義されたものから選択される、請求 項３４記載のオリゴヌクレオシド化合物。 ３７．該１又はそれ以上の交互結合構造中に結合した１又はそれ以上のヌクオシ ドが２'−置換ヌクオシド残基である請求項３６記載のオリゴヌクレオシド化合 物。 ３８．請求項１又は２３に記載のオリゴヌクレオシド化合物の有効量と薬学的に 許容し得る担体とを含有する医薬組成物。 ３９．細胞又は多細胞生物に請求項１又は２３記載のオリゴヌクレオシド化合物 を投与することを含む、該細胞又は多細胞生物おける標的リボ核酸配列の翻訳を 阻害する方法。