DE60216798T2

DE60216798T2 - Azyklische linker enthaltende oligonukleotide und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60216798T2
Application number: DE60216798T
Authority: DE
Inventors: J. Masad St. Hubert DAMHA; Ekaterina Montreal VIAZOVKINA; M. Maria Montreal MANGOS; A. Michael Pittsburgh PARNIAK; Kyung-Lyum Montreal MIN
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2002-10-29
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2022-10-30
Also published as: JP2005508634A; ATE348104T1; US20050233455A1; DE60216798D1; NZ532610A; EP1440079A1; EP1440079B1; WO2003037909A1; MXPA04004056A; CA2465129A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonucleotide und Verwendungen davon und sie betrifft insbesondere modifizierte Oligonucleotide mit einem oder mehreren acyclischen Resten an inneren Positionen und Verwendungen davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Oligonucleotide werden für eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen verwendet, einschließlich Primern, Proben, Linkern, Segmenten, um eine Stelle oder Region von Interesse (z.B. Stellen für eine Spaltung durch Nucleasen; Codierungssegmente) zu übertragen, Mutagenese, oder zum Abzielen auf eine besondere Target-Region oder -Molekül, um einen besonderen Zweck oder Funktion zu erfüllen. Ihr Vermögen, Spezifität durch ihre Sequenzzusammensetzung zu übertragen, resultierte in ihrer Verwendung bei einer Anzahl von Anwendungen in der Biotechnologie, in besonderen Fällen mit verschiedenen Anpassungen und Modifizierungen, um sie für bestimmte Anwendungen zugänglicher zu machen. Solche Modifizierungen können das Anbinden von verschiedenen Gruppen oder Modifizierungen an den einzelnen Nucleosidgruppen oder -anteilen (d.h. den Zucker- und/oder den Baseneinheiten) davon oder an dem Gerüst des Oligonucleotidmoleküls mit sich bringen. Gegeben zum Beispiel, dass ihr Vermögen, welches bestimmt wird, das Zielrichten auf ein Proteinkodierendes Molekül, wie RNA, ist, ist eine besondere Verwendung von Oligonucleotiden in der Antisense-Technologie, um den Level oder die Merkmale eines Proteins zu modulieren und seinerseits die Funktion, welche diesem Protein zugeschrieben wird, zu modulieren.
Antisense-Oligonucleotide (AON)
Antisense-Oligonucleotide (AONs) haben auf dem Biotechnologiesektor beträchtliches Interesse auf sich gezogen und weisen ein außergewöhnliches Potential zur Verwendung bei therapeutischen Strategien gegen einen Bereich von Erkrankungen des Menschen, einschließlich Krebs und infektiöse Erkrankungen, auf (Uhlmann, E. und Peyman, A. Chem. Rev. 1990, 90, 543). Erforderliche Kriterien von AON für eine mögliche klinische Verwendung schließen Stabilität gegen Serum- und zelluläre Nucleasen, Zellmembranpermeabilität und eine stabile und spezifische Bindung des AON an dem zellulären Target (normalerweise Messenger-RNA [mRNA]) ein. Die Bildung eines Duplex zwischen dem AON und seiner komplementären Sequenz an der Target-RNA verhindert die Translation einer solchen RNA, teilweise durch „Translationsstopp" (über Duplexbildung zwischen dem AON und der Target-RNA, wodurch eine vollständige Translation durch physikalisches oder sterisches Blockieren der Translationsmaschinerie inhibiert/verhindert wird), aber wichtiger durch Hervorrufen eines Abbaus der Target-RNA durch die Wirkung von Ribonuclease H (RNase H), ein ubiquitäres und endogenes zelluläres Enzym, welches spezifisch den RNA-Strang in dem AON/RNA-Duplex abbaut (Walder, R.T.; Walder, J.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5011).
Momentane AON-Technologien weisen Defizite bei einem oder mehreren der erforderlichen Kriterien für eine klinische Verwendbarkeit auf. Da das natürliche Substrat von RNase H ein DNA/RNA-Heteroduplex ist, wurde DNA für Antisense-Technologie verwendet. Da jedoch Serum- und intrazelluläre Nucleasen AONs mit Phosphodiester (PDE)-Bindungen schnell abbauen, hatte AON, welches aus PDE-DNA besteht, eine eingeschränkte Verwendung in solchen Systemen. DNA-Stränge mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNA) wurden erfolgreich bei einer großen Anzahl von Experimenten, welche zur Regulierung der Genexpression nach unten designed wurden, verwendet, und sie wurden und/oder werden in mehreren klinischen therapeutischen Studien verwendet (Akhtar, S. und Agrawal, S. Trends Pharmacol. Sci. 1997, 18, 12). PS-DNA induziert RNase H-Abbau der Target-RNA und ist gegenüber einem Abbau durch Serum- und zelluläre Nucleasen resistent, jedoch bildet es schwächere Duplexe mit der Target-RNA, im Vergleich mit PDE-DNA. Darüber hinaus zeigt PS-DNA eine umfangreiche ,nicht spezifische' Bindung an Serum- und zellulären Proteinen (Brach, A.D. TIBS, 1998, 23, 45). Dies kann zu nicht vorteilhafter Toxizität führen, insbesondere gegeben durch die hohen Konzentrationen an PS-DNA, welche zum Ausüben einer in-vivo-Wirkung gebraucht werden. Die Identifizierung von neuen AON-Strukturen, welche eng und spezifisch an Target-RNA binden können und einen wirksamen RNase H-Abbau dieser RNA hervorrufen können, besitzt in der Antisense-Entwicklung hohe Priorität.
Die Struktur des AON bestimmt, ob die RNase H den RNA-Strang von AON/RNA-Duplexen spalten kann. So wurden verschiedene Strategien zur Verbesserung des Bindens an das RNA-Target verwendet, um die Duplexbildung und -stabilität zu verbessern. Zum Beispiel wurden AONs, welche ausschließlich entweder 2'-O-Methylribose- (oder jedwede Substitution an der Ribose2'-Position) oder N3'-P5'-Phosphoramidatbindungen enthielten, und DNA-Moleküle, welche ungeladene Internucleotidbindungen enthielten, welche zum Beispiel aus Methylphosphonat- oder Amidbindungen zusammengesetzt waren, beschrieben, jedoch ruft eine solche AON keine RNase H-Aktivität hervor (für einen Übersichtsartikel siehe Manoharan, M. Biophys. Biochim. Acta, 1999, 1489, 117). Andere Analoga wie Phosphorodiamidatmorpholinonucleinsäuren haben auch einen Mangel an Vermögen, RNase H-Aktivität hervorzurufen (Summerton, J. und Weller, D., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1997, 7, 187). Peptidnucleinsäuren (PNA) zeigen beträchtliche Hybridisierungseigenschaften, Bindung an Einzelstrang-RNA, Einzelstrang-DNA und Duplex-DNA mit hoher Affinität (Egholm, M. et al., Nature, 1993, 365, 566; Knudsen, H. et al., Nucl. Acids Res., 1997, 25, 2167). Jedoch sind PNA:RNA-Hybride keine Substrate für RNase H. Tatsächlich wurde von den mehreren Dutzend an modifizierten AON, welche während der Zeitdauer von 1978 bis 1998 hergestellt wurden, nur von PS-DNA, Phosphorodithioat DNA (PS₂-DNA) und Boranophosphat DNA berichtet, dass sie RNase H-Abbau der Target-RNA hervorrufen (Sanghvi, Y.S. und Cook P.D. „Carbohydrate Modifications in Antisense Research" ACS-Symposiumreihe, Bd. 580 American Chemical Society, Washington DC, 1994). Wie im Falle für PS-DNA zeigen die Analoga PS₂-DNA und Boranophosphat DNA eine schwächere Bindung an Target-RNA, relativ zur nicht modifizierten PDE-DNA. Deshalb, während die vorstehenden Strategien zum Übertragen von erhöhter Bindung auf das Target in der Lage sind, ist ein solches AON nicht in der Lage, RNase H-Aktivität zu induzieren.
Versuche zur Überwindung dieser Einschränkung schließen die Entwicklung von Arabinonucleinsäure (ANA) und 2'-Deoxy-2'-fluorarabinonucleinsäuren (FANA) ein. Diese Verbindungen sind die ersten Zucker-modifizierten Oligonucleotide, von welchen jemals berichtet wurde, dass sie RNase H-Aktivität hervorrufen (Damha, M.J. et al., „Antisense oligonucleotide constructs based on beta-arabinose and its analogues". Internationale PCT- Veröffentlichung Nr. WO 99/67378; Damha, M.J. et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12976; Noronha, A.M. et al. Biochemistry 2000, 39, 7050). Diese Oligonucleotide erhalten einen (3-D-Furanosering und ahmen die Konformation von DNA-Strängen nach (Trempe, J.-F. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 124, 4896). FANA bildet viel stabilere Duplexe mit Target-RNA, als dies PS-DNA tut; wobei die Stabilität des FANA/RNA-Duplexes im Allgemeinen tatsächlich die von RNA/RNA-Duplexen übersteigt (Damha, M.J. et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12976; Wilds, C.J. und Damha, M.J. Nucl. Acids Res. 2000, 28, 3625).
Andere bemerkenswerte Entwicklungen auf dem Antisense-Gebiet schließen Oligonucleotide mit einem gemischtartigen Gerüst (MBO), welche aus PS-DNA-Oligodeoxynucleotidsegmenten, flankiert auf beiden Seiten mit Zucker-modifizierten Oligonucleotidsegmenten, wie PS-[2'-OMe RNA-(DNA)-2'OMe RNA] (siehe zum Beispiel Crooke, S.T. et al., Biochem. J. 1995, 312 (Pt 2), 599), zusammengesetzt sind, ein. Diese MBOs sind auch als „Gapmere" bekannt. Diese flankierenden 2'-O-Methyl RNA-„Flügel" erhöhen die Bindungsaffinität des MBO für die Target-RNA, während das PS-DNA-Segment in der Mitte des AON den RNase H-Abbau der Target-RNA leitet (Zhao, G. et al., Biochem. Pharmacol. 1996, 51, 173; Crooke, S.T. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 277, 923). MBOs haben in vivo eine erhöhte Stabilität (d.h. Beständigkeit gegenüber Nucleaseabbau) und zeigen eine verbesserte biologische Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo, im Vergleich mit allen entsprechenden PS-DNA AON. Beispiele dieser Vorgehensweise, 2'-OMe und andere Alkoxysubstituenten in die flankierenden Regionen eines Oligonucleotids einzubauen, wurden von Monia et al. durch gesteigerte Antitumoraktivität in vivo gezeigt (Monia, P.B. et al., Nature Med. 1996, 2, 668). Mehrere vorklinische Studien mit diesen Analoga werden momentan durchgeführt (Akhtar, S.; Agrawal, S. TiPS 1997, 18, 12).
Antisense-MBO, welches FANA umfasst, das innere DNA-Segmente flankiert, zeigt eine außergewöhnlich wirksame Target-spezifische Inhibierung der Genexpression (EC₅₀ < 5 nM), wenn in Zellkulturtests getestet wird, und im Gegensatz zu 2'-OMe RNA/DNA MBO ist seine biologische Aktivität wesentlich weniger von der Länge der inneren DNA-Lücke abhängig (Damha et al.; Internationale PCT-Veröffentlichung WO 02/20773, veröffentlicht am 14. März 2002).
Hervorrufen von zellulärem RNase H-Abbau der Target-RNA durch AONs
RNase H baut selektiv den RNA-Strang eines DNA/RNA-Heteroduplexes ab (Hausen, P.; Stein, H. Eur. J. Biochem. 1970, 14, 279). Einer der wichtigsten Mechanismen für eine Antisense-Oligonucleotid-geleitete Inhibierung der Genexpression ist das Vermögen dieser Antisense-Oligonucleotide, eine Struktur zu bilden, wenn sie mit der Target-RNA duplexiert sind, welche durch zelluläre RNase H erkannt werden kann. Dies ermöglicht den RNase H-vermittelten Abbau des RNA-Targets innerhalb der Region des Antisense-Oligonucleotid-RNA-Basenpaarduplexes (Walder, R.T.; Walder J.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5011).
RNase H1 aus dem Bakterium Escherichia coli ist das am einfachsten erhältliche und am besten charakterisierte Enzym. Untersuchungen mit eukaryotischen Zellextrakten, welche RNase H enthalten, weisen daraufhin, dass sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Enzyme ähnliche RNA-Spaltungseigenschaften aufweisen (Monia et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Crooke et al. Biochem. J. 1995, 312, 599; Lima, W.F.; Crooke, S.T. Biochemistry 1997, 36, 390). Man nimmt an, dass E. coli-RNase H1 an die Nebenfurche der DNA/RNA-Doppelhelix bindet und die RNA durch sowohl Endonuclease- als auch Verarbeitung durch 3' nach 5'-Exonucleaseaktivitäten spaltet (Nakamura, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 11535; Fedoroff, O.Y. et al., J. Mol. Biol. 1993, 233, 509). Die Wirksamkeit des RNase H-Abbaus zeigt eine minimale Sequenzabhängigkeit und, wie vorstehend erwähnt, ist sie gegenüber chemischen Veränderungen in dem Antisense-Oligonucleotid ziemlich empfindlich.
Da 2'-OMe RNA keine RNase H-Aktivität hervorrufen kann, muss die DNA-Lückengröße der PS-[2'-OMe RNA-DNA-2'OMe RNA]-Chimärenoligonucleotide sorgfältig definiert werden. Während E. coli-RNase H 2'-OMe RNA MBO mit DNA-Lücken von nur 4 DNA-Nucleotiden erkennen und verwenden kann (Shen, L.X. et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1695), erfordert die eukaryotische RNase H (wie humane RNase HII) folglich größere DNA-Lücken (7 DNA-Nucleotide oder mehr) für eine optimale Abbauaktivität (Monia, B.P. et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514). Im Allgemeinen nimmt bei PS-[2'-OMe RNA-DNA-2'OMe RNA]-Chimärenoligonucleotiden die eukaryotische RNase H-vermittelte Target-RNA-Spaltungswirksamkeit mit abnehmender DNA-Lückenlänge ab und wird bei DNA-Lückengrößen von weniger als 6 DNA-Nucleotiden nahezu vernachlässigbar. Folglich ist die Antisense-Aktivität der PS-[2'-OMe RNA-DNA-2'OMe RNA)-Chimärenoligonucleotide stark von der DNA-Lückengröße abhängig (Monia, B.P. et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Agrawal, S. und Kandimalla, E.R. Mol. Med. Today 2000, 6, 72). Dies ist bei PS-[FANA-DNA-FANA]-Chimären, welche eine wesentliche biologische Aktivität bei DNA-Lücken von nur 1 Deoxynucleotidrest zeigen, nicht der Fall (Damha et al.; Internationale PCT-Veröffentlichung WO 02/20773, veröffentlicht am 14. März 2002).
Kürzlich wurden Oligonucleotide, welche vollständig veränderte Gerüste enthalten, synthetisiert. Bemerkenswerte Beispiele sind die Peptidnucleinsäuren („PNA") mit einem acyclischen Gerüst (Nielsen, P.E. in „Perspectives in Drug Discovery and Design", Bd. 4, S. 76, Trainor, G.L. (Herausg.), ESCOM, Leiden, 1996). Diese Verbindungen haben außergewöhnliche Hybridisierungseigenschaften und weisen eine Stabilität gegen Nucleasen und Proteasen auf. Jedoch wurden Bemühungen einer Verwendung von PNA-Oligomeren als Antisense-Konstrukte durch schlechte zelluläre Aufnahme und die Unfähigkeit, RNase H zu aktivieren, behindert. Vor kurzem wurden PNA-[DNA]-PNA-Chimären designed, wobei RNase H-vermittelte Spaltung über den DNA-Anteil der Chimäre erhalten wird (Bergman, F. et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 6823; Van der Laan, A.C. et al. Trav. Chim. Pays-Bas 1995, 114, 295). Die PNA-Segmente, welche an den 5'- und 3'-Termini lokalisiert sind, dienen zur Ermöglichung des Anbindens an die Target-Nucleinsäure (RNA) und zur Steigerung der Beständigkeit gegen einen Abbau durch Exonucleaseenzyme. Jedoch kann, basierend auf der Gegenwart von DNA, ein solches Konstrukt stärker zum Abbau in biologischen Systemen neigen, als vorstehend angegeben.
Es besteht deshalb ein Bedarf für ein verbessertes Oligonucleotid für solche Antisense-Vorgehensweisen, wobei versucht wird, auf die vorstehend angegebenen Einschränkungen (z.B. Bindung, Induktion von RNase H-Aktivität, Beständigkeit gegenüber Abbau) abzuzielen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird durch die Patentansprüche definiert.
Es wird ein Oligonucleotid mit der folgenden Struktur bereitgestellt: [R¹-X]_a-R² Iawobei a größer oder gleich 1 ist; wobei R¹ und R² unabhängig voneinander je wenigstens ein Nucleotid sind; und wobei X ein acyclischer Linker ist.
PDE- oder PS-RNA-Analoga sind aus der Gruppe ausgewählt, welche aus 2'-modifizierter RNA besteht, wobei der 2'-Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Alkyl, Alkoxy, Alkylalkoxy, F und Kombinationen davon besteht.
Der acyclische Linker ist aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einem acyclischen Nucleosid und einem nicht-nucleotidischen Linker besteht. In Ausführungsformen ist das acyclische Nucleosid aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Purin- und Pyrimidin-Seconucleosiden besteht. In Ausführungsformen ist das Purin-Seconucleosid aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Secoadenosin und Secoguanosin besteht. In Ausführungsformen ist das Pyrimidin-Seconucleosid aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Secothymidin, Secocytidin und Secouridin besteht.
In einer Ausführungsform umfasst der nicht-nucleotidische Linker einen Linker, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Aminosäure und einem Aminosäurederivat besteht. In Ausführungsformen ist das Aminosäurederivat aus der Gruppe ausgewählt, welche aus (a) einer N-(2-Aminoethyl)glycineinheit, in der eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyllinker (PNA-Monomer) gebunden ist; und (b) einer O-PNA-Einheit besteht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine AON-Chimäre der folgenden allgemeinen Struktur Ib bereitgestellt:
wobei n größer oder gleich 1 ist. Mit Bezug auf die vorstehende Struktur Ib ist „AON1" eine Oligonucleotidkette, welche in Ausführungsformen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus ANA (z.B. FANA), DNA, PS-DNA, 5'-RNA-DNA-3'-Chimären sowie anderen RNase H-kompetenten Oligonucleotiden, zum Beispiel Arabinonucleinsäuren (2'-OH-substituierte ANA) (Damha, M.J. et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12976), Cyclohexennucleinsäuren (Wang J. et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8595), Boranophosphat-gebundener DNA (Rait, V.K. et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999, 9, 53) und alpha-L-locked Nucleinsäuren (S⌀rensen, M.D. et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 2164) oder Kombinationen davon besteht; und "AON2" ist eine Oligonucleotidkette, welche in Ausführungsformen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus FANA, DNA, PS-DNA, 5'-DNA-RNA-3'-Chimären sowie anderen RNase H-kompetenten Oligonucleotiden, wie jenen, welche vorstehend beschrieben sind, oder Kombinationen davon besteht. Die Internucleotidbindungen von dem AON1 und AON2 schließen Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat (5'N-3'P und 5'P-3'N)-Gruppen ein, sind aber nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt. Der Substituent, welcher direkt an das C2'-Atom des Arabinosezuckers in den ANA-X-ANA-Chimärenkonstrukten gebunden ist, schließt Fluor-, Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Alkyl- (z.B. 2'-Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, usw.) und Alkoxygruppen (z.B. 2'-OMe, 2'-OEt, 2'-OPr, 2'-OBu, 2'-OCH₂CH₂OMe, usw.) ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Beispiele der allgemeinen Strukturen Ia und Ib schließen PDE- und PS-[FANA]-X-[FANA], PDE- und PS-[FANA-DNA-X-DNA-FANA), PS-[DNA-X-DNA], PDE- und PS-[RNA-DNA-X-DNA-RNA], PDE- und PS-[(2'O-Alkyl-RNA)-DNA-X-DNA-(2'O-Alkyl-RNA)] und PDE- und PS-[(2'-OCH₂CH₂OMe-RNA)-DNA-X-DNA-(2'-OCH₂CH₂OMe-RNA)] ein.
In einer Ausführungsform weist ein Oligonucleotid der Erfindung die folgende Struktur auf
wobei m, n, q und a jeweils und unabhängig voneinander ganze Zahlen, größer oder gleich 1 sind; wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens ein Nucleotid sind, wobei Z¹ und Z² unabhängig voneinander je ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom, einer Aminogrupe und einer Alkylaminogruppe; wobei Y¹ und Y² je unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und NH; und wobei R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, einem Purin, einem Pyrimidin und Kombinationen davon.
In Ausführungsformen ist R³ Adenin oder Guanin oder Derivate davon.
In Ausführungsformen ist R³ Thymin, Cytosin, 5-Methylcytosin, Uracil oder Derivate davon.
In Ausführungsformen sind vorstehend angegebene R¹ und R² je unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt, welche aus ANA, PS-ANA, RNA-DNA- und DNA-RNA-Chimären, PS-[RNA-DNA]- und PS-[DNA-RNA]-Chimären, PS-[ANA-DNA]- und PS-[DNA-ANA]-Chimären, alpha-L-LNA, Cyclohexennucleinsäuren, RNA, PS-RNA, PDE- oder PS-RNA-Analoga, locked Nucleinsäuren (LNA), Phosphorodiamidatmorpholinonucleinsäuren, N3'-P5' Phosphoramidat DNA, Methylphosphonat DNA und Kombinationen davon besteht.
In Ausführungsformen können vorstehend angegebene R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens zwei Nucleotide, verbunden über eine Internucleotidbindung, umfassen, wobei die Internucleotidbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat (5'N-3'P und 5'P-3'N)-Gruppen und Kombinationen davon besteht.
In Ausführungsformen umfassen vorstehend angegebene R¹ und R² je unabhängig voneinander ANA.
In Ausführungsformen umfasst die vorstehend angegebene ANA einen 2'-Substituenten, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluor-, Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Alkyl- (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl) und Alkoxy- (z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy und Methoxyethoxy)-Gruppen besteht.
In einer Ausführungsform ist der 2'-Substituent Fluor und die ANA ist FANA.
In Ausführungsformen ist die Alkylgruppe aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylgruppen besteht. In Ausführungsformen ist die Alkoxygruppe aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- und Methoxyethoxygruppen besteht.
In Ausführungsformen ist ein Oligonucleotid der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:
und
wobei R¹, R², n, a, Z¹, Z², Y¹ und Y² wie vorstehend definiert sind und R⁴ und R⁵ je unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Purin (z.B. Adenin und Guanin oder Derivaten davon) und einem Pyrimidin (z.B. Thymin, Cytosin, Uracil oder Derivaten davon).
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PDE-FANA und a = 1.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PS-FANA und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ [FANA-DNA]; R² ist [DNA-FANA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ [FANA-DNA]; R² ist FANA und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ FANA; R² ist [DNA-FANA] und a = 1.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PS-DNA und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ PDE-[RNA-DNA], R² ist PDE-[DNA-RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ RNA; R² ist [DNA-RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkyl)RNA-DNA]; R² ist S-[DNA-(2'O-Alkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkyl)RNA-DNA]; R² ist S-[(2'O-Alkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkyl)RNA]; R² ist S-[DNA-(2'O-Alkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkoxyalkyl)RNA-DNA]; R² ist S-[DNA-(2'O-Alkoxyalkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkoxyalkyl)RNA-DNA]; R² ist S-[(2'O-Alkoxyalkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ S-[(2'O-Alkoxyalkyl)RNA]; R² ist S-[DNA-(2'O-Alkoxyalkyl)RNA] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ PDE-[(2'O-Alkyl-RNA)-DNA]; R² ist PDE-[DNA-(2'O-Alkyl RNA)] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ PS-[(2'O-Alkyl-RNA)-DNA]; R² ist PS-[DNA-(2'O-Alkyl RNA)] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ PDE-[(2'O-Alkoxyalkyl-RNA)-DNA]; R² ist PDE-[DNA-(2'O-Alkoxyalkyl RNA)] und a = 1.
In einer Ausführungsform ist R¹ PS-[(2'O-Alkoxyalkyl-RNA)-DNA]; R² ist PS-[DNA-(2'O-Alkoxyalkyl RNA)] und a = 1.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PDE-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIb, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind und n = 4.
In einer Ausführungsform ist R¹ PS-[FANA]; R² ist PDE-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIb, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind und n = 4.
In einer Ausführungsform ist R¹ FANA; R² ist PS-FANA; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIb, wobei Y¹, Y², Z¹ und Z² Sauerstoff sind und n = 4.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PS-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIb, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind und n = 4.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PDE-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind.
In einer Ausführungsform ist R¹ PS-[FANA]; R² ist POE-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind.
In einer Ausführungsform ist R¹ PDE-[FANA]; R² ist PS-(FANA); a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIb, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind und n = 4.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PS-[FANA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind.
In einer Ausführungsform ist R¹ PS-[DNA]; R² ist PDE-[DNA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind.
In einer Ausführungsform ist R¹ DNA; R² ist PS-DNA; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² PS-[DNA]; a = 1 und das Oligonucleotid hat die Struktur IIc, wobei Y¹, Y² Sauerstoff sind; Z¹, Z² beide Sauerstoff oder Schwefel sind.
In einer Ausführungsform gilt a = 2 und R¹ und R² bestehen je unabhängig voneinander aus wenigstens 3 Nucleotiden, in einer weiteren Ausführungsform aus 3 bis 8 Nucleotiden.
In einer Ausführungsform gilt a = 3 und R¹ und R² bestehen je unabhängig voneinander aus wenigstens 2 Nucleotiden, in einer weiteren Ausführungsform, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander aus 2 bis 6 Nucleotiden bestehen.
In einer Ausführungsform ist das Oligonucleotid antisense zu einer Target-RNA.
Die Erfindung stellt ferner ein in-vitro-Verfahren zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reversen Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System bereit, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der Target-RNA mit einem Oligonucleotid, wie vorstehend definiert, umfasst.
Die Erfindung stellt ferner ein in-vitro-Verfahren zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reversen Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System bereit, wobei das Verfahren umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen der Target-RNA mit einem Oligonucleotid, wie vorstehend definiert; und
b) Geschehenlassen der RNase-Spaltung der Target-RNA.

Die Erfindung stellt ferner eine in-vitro-Verwendung eines Oligonucleotids, wie vorstehend definiert, zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reversen Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System bereit.
Die Erfindung stellt ferner eine verkaufsfähige Zusammenstellung, umfassend das vorstehend angegebene Oligonucleotid zusammen mit Gebrauchsanweisungen, zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reversen Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird nun detaillierter mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-FANA und FANA-X-FANA, zeigt. Zeitliche Aliquote wurden bei 0, 5, 10 und 20 Min. von jedem Inkubationsansatz genommen. Die experimentellen Bedingungen sind in Beispiel 4A gegeben.
2 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-FANA und PDE-[FANA-X-FANA], als eine Funktion der Zeit zeigt. Der Abbau der 5'-markierten Target-RNA wurde durch Densitometrie des in 1 gezeigten Gels quantifiziert.
3 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit PDE-FANA und PDE-[FANA-X-FANA] mit gemischtartigen Basen, zeigt. Zeitliche Aliquote wurden bei 0, 5, 10 und 20 Min. von jedem Inkubationsansatz genommen. Die experimentellen Bedingungen sind in Beispiel 4B gegeben.
4 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit PDE-FANA und PDE-[FANA-X-FANA] mit gemischtartigen Basen, als eine Funktion der Zeit zeigt. Der Abbau der 5'-markierten Target-RNA wurde durch Densitometrie des in 3 gezeigten Gels quantifiziert.
5 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-FANA-X-FANA], wobei der Butandiollinker X an den Positionen 5, 10 und 13 enthalten ist, zeigt. Tests (10 μl Endvolumen) umfassten 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8, welche 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 10 mM MgCl₂ enthielt). Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von RNase H gestartet und bei 14 bis 15°C für 20 Minuten durchgeführt. Zeitliche Aliquote wurden bei 0, 5, 10 und 20 Min. von jedem Inkubationsansatz genommen. Die Längen der RNA-Fragmente, welche über Enzymspaltung erzeugt wurden, und die entsprechende Position entlang des AON sind gezeigt.
6 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer FANA-X-FANA (But-5, -10 und -13), als eine Funktion der Zeit zeigt. Der Abbau der 5'-markierten Target-RNA wurde durch Densitometrie des in 5 gezeigten Gels quantifiziert.
7 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-[FANA-X-FANA] und PDE-[FANA-X-X-FANA], wobei innere Secouridinlinker enthalten sind, zeigt. Zeitliche Aliquote wurden bei 0, 5, 10 und 20 Min. von jedem Inkubationsansatz genommen. Die experimentellen Bedingungen sind in Beispiel 6 gegeben.
8 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-[FANA-X-FANA] (SECx1) und PDE-[FANA-X-X-FANA] (SECx2) und PDE-FANA, als eine Funktion der Zeit zeigt. Der Abbau der 5'-markierten Target-RNA wurde durch Densitometrie des in 7 gezeigten Gels quantifiziert.
9 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-DNA und PDE-[DNA-X-DNA] (X = Butandiollinker), zeigt. Zeitliche Aliquote wurden bei 0, 5, 10 und 20 Min. von jedem Inkubationsansatz genommen. Die experimentellen Bedingungen sind in Beispiel 7 gegeben.
10 die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, duplexiert mit homopolymerer PDE-DNA und PDE-(DNA-X-DNA] (X = Butandiollinker), als eine Funktion der Zeit zeigt. Der Abbau der 5'-markierten Target-RNA wurde durch Densitometrie des in 9 gezeigten Gels quantifiziert.
11 die RNase H-vermittelte Spaltung von Ha-Ras RNA, duplexiert mit PDE-FANA, PDE-[FANA-X-FANA], PDE-DNA, PDE-[DNA-X-DNA] und PDE-[Mismatch DNA] mit gemischtartigen Basen, wobei der Butandiollinker X an der Position 10 enthalten ist, zeigt. Die Tests wurden wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Die Längen der RNA-Fragmente, welche über Enzymspaltung erzeugt wurden, und die entsprechende Position entlang des AON sind gezeigt. Kinetische Daten (k) der RNA-Spaltung sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
12 die RNase H-vermittelte Spaltung von Ha-Ras RNA, duplexiert mit PS-FANA, PS-[FANA-X-FANA], PS-DNA und PS-[DNA-X-DNA] mit gemischtartigen Basen, wobei der Butandiollinker X an der Position 10 enthalten ist, zeigt. Die Tests wurden wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt. Kinetische Daten (k) der RNA-Spaltung sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonucleotide, welche in einer Ausführungsform zum selektiven Verhindern von Genexpression in einer Sequenz-spezifischen Weise in der Lage sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die selektive Inhibierung von Proteinbiosynthese über eine Antisense-Strategie unter Verwendung von kurzen Strängen von zum Beispiel modifizierten Nucleotiden, wie modifizierte DNA und modifizierte Arabinonucleinsäuren, welche einen oder mehrere acyclische Reste an inneren Positionen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Oligonucleotid der Erfindung wenigstens ein modifiziertes Nucleosid oder Nucleotid (im Vergleich zu nativer DNA). Beispiele von acyclischen Resten schließen acyclische Nucleoside [z.B. Seconucleoside, PNA-Monomere (N-(2-Aminoethyl)glycineinheit, in welcher eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyllinker gebunden ist), O-PNA-Monomere [-NH-CH(CH₂-CH₂-Base)-CH₂-O-CH₂-CO-] und nicht-nucleotidische Linker (z.B. Alkyldiollinker, Aminosäuren, Dipeptide und Dipeptidderivate) ein. In Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung von modifizierten Oligonucleotiden, welche primär aus modifizierten Deoxyribonucleotid- und modifizierten Arabinonucleotidresten, die einen oder mehrere acyclische Reste enthalten, aufgebaut sind, zur Hybridisierung an komplementärer RNA wie zellulärer Messenger-RNA, viraler RNA, usw. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von modifizierten Oligonucleotiden, welche aus modifizierten DNA- und modifizierten ANA-Resten, die einen oder mehrere acyclische Reste enthalten, aufgebaut sind, zur Hybridisierung an und zur Induktion einer Spaltung von komplementärer RNA über RNase H-Aktivierung.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Antisense-Oligonucleotidchimäre, welche entweder aus modifizierten Deoxyribonucleotid- oder modifizierten Arabinonucleotidresten, die ein Acyclonucleotid oder eine modifizierte Kohlenwasserstoffkette flankieren, aufgebaut sind, welche ein Duplex mit ihrer Target-RNA-Sequenz bilden. Die resultierenden AON/RNA-Duplexe sind ausgezeichnete Substrate für RNase H, ein Enzym, welches diesen Duplex erkennt und den RNA-Target-Anteil abbaut. Man nimmt an, dass die RNase H-vermittelte Spaltung von RNA-Targets ein Hauptmechanismus der Wirkung der Antisense-Oligonucleotide ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die unerwartete und überraschende Entdeckung, dass Antisense-Chimäre, welche aus einem modifizierten Nucleotid (z.B. 2'-Deoxy-2'-fluor-β-D-arabinonucleotiden [FANA]) und einem inneren acyclischen Nucleotidrest (z.B. Seconucleotid) oder einer inneren modifizierten Kohlenwasserstoffkette aufgebaut sind, beim Hervorrufen von eukaryotischer RNase H-Aktivität in vitro hervorragend sind, im Vergleich zu einheitlich modifizierten FANA-Oligomeren. Demgemäß können Antisense-Hybridchimäre, welche ein modifiziertes Nucleotid wie 2'-Deoxy-2'-fluor-β-D-arabinonucleotide (FANA) umfassen, das solche RNase H-induzierende acyclische Reste enthält, als therapeutische Mittel und/oder Werkzeuge für das Studium und die Kontrolle von spezieller Genexpression in Zellen und Organismen nützlich sein. Diese „acyclische Linkerstrategie" kann auch bei anderen modifizierten AONs angewendet werden, um ihre Antisense-Eigenschaften in vivo zu verbessern.
Die hier beschriebenen Ergebnisse sind in der Tat überraschend, bezogen auf das momentane Wissen des Standes der Technik, da ein konsistentes und vorherrschendes Ziel in der Antisense-Technologie immer das Einbringen von Modifizierungen, welche die Duplexstabilität erhöhen, war. Solche Modifizierungen resultieren in vielen Fällen in einem Typ von „Vororganisation" des Antisense-Moleküls, wobei das AON designed ist, der „Bindungs"-Konformation zu ähneln, sogar bevor eine Duplexbildung stattfindet, wodurch die Entropie, welche mit dem Binden in Zusammenhang steht, verringert wird. So nimmt man an, dass das Einbringen eines flexiblen Strukturelements wie eines acyclischen Linkers (welcher frei ist von der Ringspannung einer cyclischen Struktur) nachteilig für die RNase H-Induktion ist, da es die Duplexstabilität erniedrigen würde. Tatsächlich resultiert die Einbringung von solchen acyclischen Elementen in einer niedrigeren Schmelztemperatur, wie in den hier angeführten Ergebnissen dargelegt ist. Im Einklang mit diesem Prinzip wurde beschrieben, dass native DNA-Oligonucleotide, verbrückt durch Oligomethylendiol- oder Oligoethylenglycollinker, eine erhöhte Duplexstabilität und eine beeinträchtigte RNase H-Aktivität aufweisen (Vorobjev et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 2001, 11, 77).
Umgekehrt zeigen hier beschriebene Untersuchungen der Anmelder, dass der Einbau von flexiblen Strukturelementen wie eines acyclischen Linkers in zum Beispiel 2'F-ANA AON in einer wirksamen RNase H-vermittelten Target-Spaltung resultiert. Es wird hier gezeigt, dass die Aktivität des Enzyms leicht durch die systematische Platzierung von flexiblen Einheiten an Schlüsselstellen innerhalb zum Beispiel der 2'F-ANA-Stränge der AON/RNA-Duplexe moduliert wird. Bezogen auf die verbesserte Induktion der RNase H unter Verwendung eines AON, welches modifizierte hier beschriebene Nucleotide umfasst, wird in Betracht gezogen, dass ein bestimmter Umfang an Vororganisation (z.B. übertragen durch das Aufnehmen von einem oder mehreren modifizierten Nucleotiden in das Oligonucleotid) in dem Antisense-Strang beim Erhalten von starker Bindung und/oder hoher Spezifität für komplementäre RNA eine Rolle spielt. Obwohl beide, Vororganisation und Flexibilität, ihrerseits nachteilig für das Hervorrufen bei dem Enzym sind, schlagen die Anmelder hier den überraschenden Befund vor, dass ihre Kombination eine synergistische Inhibierung der Target-RNA ergibt und zielen auf verschiedene Konformationscharakteristika ab, welche diese Verbesserungen steigern. So beschreiben die Anmelder hier, dass sogar Verbindungen, welche frei von DNA sind, RNase H-Aktivität hervorrufen können, mit vergleichbarer Wirksamkeit zu den nativen (DNA) Systemen, durch einen eingebrachten acyclischen Linker. Ferner ist die verbesserte Induktion von RNase H, übertragen durch einen solchen acyclischen Linker, sogar stärker ausgeprägt, wenn auf längere (d.h. physiologisch relevantere) RNAs abgezielt wird, wie hier beschrieben. Deshalb wird in Betracht gezogen, dass eine solche acyclische Linkerstrategie in bekannte Antisense-Methodiken und -strukturen eingebaut werden kann, um die RNase H-Induktion und ihrerseits die Target-Inhibierung zu verbessern.
„Flexibel" oder „Flexibilität", wie hier verwendet, ist ein relativer Begriff, welcher die Freiheitsgrade in Bezug auf die zulässige Bewegung oder Konformationen, welche in einer besonderen Region von Interesse in einem Molekül möglich sind, betrifft, die zur „Flexibilität" des Moleküls insgesamt beitragen. So ist ein flexibles Element ein Element, welches in eine Region eingebracht wird, in welcher vor seinem Einfügen starrere Elemente vorhanden waren. In Ausführungsformen ist ein flexibles Element in einem Oligonucleotid ein acyclischer Linker, welcher flexibler ist als eine cyclische Gerüststruktur aufgrund der Abwesenheit von Ringspannung im Vergleich zur cyclischen Struktur.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Oligonucleotid der folgenden Struktur Ia bereitgestellt: [R¹-X]_a-R² Ia wobei a größer oder gleich 1 ist, R¹ und R² unabhängig voneinander je wenigstens ein Nucleotid sind und X ein acyclischer Linker ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine AON-Chimäre der folgenden allgemeinen Struktur Ib bereitgestellt:
wobei n größer oder gleich 1 ist. Mit Bezug auf die vorstehende Struktur Ib ist „AON1" eine Oligonucleotidkette, welche in Ausführungsformen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus FANA, DNA, S-DNA und 5'-RNA-DNA-3'-Chimären und Kombinationen davon besteht; und "AON2" ist eine Oligonucleotidkette, welche in Ausführungsformen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus FANA, DNA, S-DNA und 5'-DNA-RNA-3'-Chimären und Kombinationen davon besteht. Die Internucleotidbindungen von dem AON1 und AON2 schließen Phosphodiester-, Phosphotiester-, Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat (5'N-3'P und 5'P-3'N)-Gruppen ein, sind aber nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt. Der 2'-Substituent des Arabinosezuckers in den ANA-enthaltenden Konstrukten schließt Fluor-, Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Methyl-, Methoxy- und andere Alkoxygruppen (z.B. Ethoxy, Propoxy, Methoxyethoxy, usw.) ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Beispiele der allgemeinen Strukturen Ia und Ib schließen Phosphodiester-gebundene FANA-X-FANA, RNA-DNA-X-DNA-RNA, (2'O-Alkyl-)RNA-DNA-X-DNA-(2'O-Alkyl)RNA, (2'-Alkylalkoxy)RNA-DNA-X-DNA-(2'O-Alkylalkoxy)RNA und die entsprechenden Phosphorothioat-gebundenen Derivate ein. Jedwede der vorstehenden Strukturen kann DNA umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Oligonucleotid der Erfindung wenigstens ein modifiziertes Nucleotid, in einer Ausführungsform ein modifiziertes Deoxyribonucleotid.
„Acyclisch", wie hier mit Bezug auf die Linker verwendet, betrifft eine verbindende Gerüststruktur, welche keinen cyclischen Anteil aufweist. Dieses Merkmal betrifft nur die Gerüststruktur, d.h. die Gerüststruktur eines acyclischen Linkers kann eine Verzweigung oder einen Substituenten, der sich davon erstreckt, welche eine cyclische Gruppe umfassen, aufweisen. Ein acyclischer Linker, welcher zwei Nucleotide verbindet, betrifft einen Linker mit einer nicht cyclischen Gerüststruktur, welche die beiden Nucleotide verknüpft.
„Modifiziertes Nucleotid/Nucleosid", wie hier verwendet, betrifft ein Nucleotid/Nucleosid, welche sich von der definierten nativen Form unterscheiden und so diese ausschließen. Zum Beispiel ist ein modifiziertes Deoxyribonucleotid ein Molekül, welches sich von einer nativen DNA unterscheidet. Ferner umfasst durch eine solche Definition ein modifiziertes Deoxyribonucleotid native RNA. Modifizierungen können Additionen, Deletionen oder Substitutionen an einem oder mehreren Teilen eines Moleküls, z.B. an den Base-, Zuckerphosphat- und/oder Gerüstanteilen, umfassen.
„Nucleosid" betrifft eine Base (z.B. ein Purin [z.B. A und G] oder Pyrimidin [z.B. C, 5-Methyl-C, T und U]), kombiniert mit einem Zucker (z.B. [Deoxy]ribose, Arabinose und Derivate). „Nucleotid" betrifft ein Nucleosid mit einer Phosphatgruppe, welche an seine Zuckereinheit gebunden ist. In Ausführungsformen können diese Strukturen verschiedene Modifizierungen einschließen, z.B. entweder in den Base-, Zucker- und/oder Phosphateinheiten. „Oligonucleotid", wie hier verwendet, betrifft eine Sequenz, welche eine Vielzahl von Nucleotiden, welche miteinander verknüpft sind, umfasst. Ein Oligonucleotid kann modifizierte Strukturen in seiner Gerüststruktur und/oder in einer oder mehreren seiner Nucleotidkomponenten umfassen. In Ausführungsformen weisen Oligonucleotide der Erfindung eine Länge von ungefähr 1 bis 200 Basen auf, in weiteren Ausführungsformen ungefähr 5 bis ungefähr 50 Basen, ungefähr 8 bis ungefähr 40 Basen, und in noch weiteren Ausführungsformen eine Länge von ungefähr 12 bis ungefähr 25 Basen.
„Alkyl" betrifft geradkettige und verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppen (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, usw.). „Alkenyl" und „Alkynyl" betreffen Kohlenwasserstoffgruppen mit wenigstens einer C-C-Doppel- beziehungsweise einer C-C-Dreifachbindung. „Alkoxy" betrifft eine -O-Alkyl-Struktur. „Alkylamino" betrifft NH(Alkyl)- oder N(Alkyl)₂-Strukturen. „Aryl" betrifft substituierte und nicht substituierte aromatische cyclische Strukturen (z.B. Phenyl-, Naphthyl-, Anthracyl-, Phenanthryl-, Pyrenyl- und Xylylgruppen). „Hetero" betrifft ein Atom, welches verschieden von C ist, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, N, O oder S. In Ausführungsformen können die vorstehend erwähnten Gruppen substituiert sein.
In Ausführungsformen weist ein Oligonucleotid der Erfindung die folgende Struktur II auf:
wobei m, n und q größer oder gleich 1 sind, P¹ und P² Phosphoratome von Phosphatgruppen sind, welche an R¹ beziehungsweise R² gebunden sind, Z¹ und Z² unabhängig voneinander je ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom, einer Aminogrupe und einer Alkylaminogruppe, Y¹ und Y² je unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und NH; und R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, einer „Base" (einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, ein Purin oder ein Pyrimidin) und Kombinationen davon. In Ausführungsformen schließt das vorstehend angegebene Purin Adenin und Guanin ein und das vorstehend angegebene Pyrimidin schließt Thymin, Cytosin und Uracil ein. In Ausführungsformen ist jedes der vorstehend angegebenen R¹ und R² aus der Gruppe ausgewählt, welche aus ANA, DNA, S-DNA und 5'-DNA-RNA-3'-Chimären oder Kombinationen davon besteht. In Ausführungsformen umfasst die vorstehend angegebene ANA einen 2'-Substituenten, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Fluor-, Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Alkyl- (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl), Alkylamino- (z.B. Propylamino), Alkenyl- (z.B. -CH=CH₂), Alkynyl- (z.B. -C=CH) und Alkoxy- (z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy und Methoxyethoxy)-Gruppen besteht. Wenn der 2'-Substituent Fluor ist, ist die ANA FANA. In Ausführungsformen umfassen R¹ und/oder R² wenigstens zwei Nucleotide mit wenigstens einer Internucleotidbindung. In Ausführungsformen ist die Internucleotidbindung aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat(5'N-3'P und 5'P-3'N)-Gruppen und Kombinationen davon besteht.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein Oligonucleotid der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, welche aus den Verbindungen, wie in den nachstehend gegebenen Strukturen IIa, IIb, IIc und IId dargelegt, besteht:
wobei R¹, R², n, a, Z¹, Z², Y¹ und Y² wie vorstehend definiert sind. In Ausführungsformen ist R⁴ und R⁵ je unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einer „Base" besteht, wobei in Ausführungsformen, welche ein Purin oder ein Pyrimidin einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind, Beispiele davon vorstehend angegeben sind.
In Ausführungsformen sind Oligonucleotide der Erfindung jene mit der Struktur FANA-X-FANA, wobei in Ausführungsformen X bei oder nahe der Mitte der Oligonucleotidsequenz platziert ist und das Oligonucleotid die Struktur IIb (Y¹=Y²=Z¹=Z² = Sauerstoff und n = 4) oder die Struktur IIc (Y¹=Y²=Z¹=Z² = Sauerstoff und a = 1) aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Oligonucleotide der folgenden allgemeinen Formel V bereitgestellt:
Mit Bezug auf die vorstehende Struktur III sind y und n je unabhängig voneinander eine ganze Zahl, größer oder gleich 1; wobei der Linker X wie vorstehend beschrieben definiert ist. In Ausführungsformen ist das Oligonucleotidgerüst in der Definition des AON aus der Gruppe ausgewählt, welche aus ANA (z.B. FANA), DNA und PS-DNA und anderen kompetenten RNase H-Gerüsten wie alpha-L-LNA, Cyclohexennucleinsäuren und Kombinationen davon besteht. In Ausführungsformen schließen die Internucleotidbindungen des AON Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphoramidat- (5'N-3'P und 5'P-3'N)-Gruppen ein, sind aber nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt. Der 2'-Substituent des Arabinosezuckers schließt, wenn das AON-Segment ANA ist, Fluor- (d.h. FANA), Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Alkyl- (z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl usw.), Alkylamino- (z.B. Propylamino), Alkenyl- (z.B. -CH=CH₂), Alkynyl- (z.B. -C=CH), Methoxy- und andere Alkoxygruppen (z.B. Ethoxy, Propoxy, Methoxyethoxy, usw.) ein, ist aber nicht darauf eingeschränkt. In Ausführungsformen schließt das AON PS-RNA, PDE- oder PS-RNA-Analoga (z.B. 2'-modifizierte RNA, wobei der 2'-Substituent Alkyl, 2'-Alkoxy, 2'-Alkylalkoxy oder 2'-F umfasst), locked Nucleinsäuren (LNA), Phosphorodiamidatmorpholinonucleinsäuren, N3'-P5' Phosphoramidat DNA, Methylphosphonat DNA und Kombinationen davon ein, ist aber nicht notwendigerweise darauf eingeschränkt. In bestimmten Ausführungsformen schließen Beispiele dieser Oligonucleotide ein:
wobei in einer Ausführungsform AON eine Länge von 3 bis 8 nt aufweist; und
wobei in einer Ausführungsform AON eine Länge von 2 bis 6 nt aufweist.
Es gilt als vereinbart, dass andere Strukturen für die X-Linker in Betracht gezogen werden können, z.B. bioabbaubare acyclische Reste und acyclische Reste, welche zwei Typen von Monomeren enthalten, die zusammen durch zum Beispiel Peptidbindungen verbunden sind. Beispiele schließen das Dipeptid Glycin-Glycin und jedwede Kombination der natürlich vorkommenden Aminosäuren oder Derivate davon ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. In Ausführungsformen ist X eine N-(2-Aminoethyl)glycineinheit, in welcher eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyllinker gebunden ist. Andere verwandte acyclische Peptidmonomere können in Betracht gezogen werden, zum Beispiel die O-PNA-Monomere [-NH-CH(CH₂-CH₂-Base)-CH₂-O-CH₂-CO-], welche von Kuwahara et al., J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 4356 beschrieben werden.
Im Falle eines auf PNA basierenden acyclischen Linkers kann die flankierende 3'-Gruppe eine Aminogruppe an ihrem 5'-Terminus aufweisen, welche an den acyclischen (X) Linker über eine Amidbindung gebunden ist. Andere acyclische Linker wie Spermin und Derivate sowie Ethylenglycole (z.B. Polyethylenglycol oder PEG) und Derivate können in Betracht gezogen werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Oligonucleotid derart designed sein, dass der acyclische Linker „eine Schleife ausbilden" kann oder nicht, wenn das Oligonucleotid mit seinem Target-Molekül einen Duplex bildet. „Eine Schleife ausbilden", wie hier verwendet, betrifft den Fall, wobei der Linker selbst keine Position in dem Oligonucleotid besetzt, welche einer Position in dem Target-Molekül entspricht, wobei wirksam eine Schleife gebildet wird, wenn der Duplex gebildet wurde. Im Falle, wobei der Linker keine „Schleife ausbildet", besetzt er eine Position in dem Duplex, welche einer Position in dem gebundenen Target-Molekül entspricht.
Die AONs dieser Erfindung enthalten eine Sequenz, welche komplementär (in bestimmten Ausführungsformen teilweise komplementär und in anderen Ausführungsformen genau komplementär) zu einer „Target-RNA", bezogen auf Hybridisierung, ist. „Hybridisierung", wie hier verwendet, betrifft Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Nucleotiden. Der Komplementaritätsgrad zwischen einem AON und seiner Target-Sequenz kann variabel sein und in Ausführungsformen ist das AON genau komplementär zu seiner Target-Sequenz, wie vorstehend angegeben. Es gilt als selbstverständlich, dass es nicht wesentlich ist, dass ein AON genau komplementär zu seiner Target-Sequenz ist, um eine ausreichende Spezifität zu erreichen, d.h. um eine nicht-spezifische Bindung des Oligonucleotids an Nicht-Target-Sequenzen unter den besonderen Bindungsbedingungen, welche verwendet werden, zu minimieren (z.B. physiologische in-vivo-Bedingungen oder in-vitro-Testbedingungen). „Target-RNA" betrifft ein RNA-Molekül von Interesse, welches das Target zum Hybridisieren mit einem/Binden an ein Oligonucleotid der Erfindung ist, um zum Beispiel die Translation, Reverse Transkription und/oder Replikation der RNA zu verhindern oder zu vermindern. In Ausführungsformen findet ein solches Verhindern und Inhibieren über eine Induktion von RNase H-vermittelter Spaltung der Target-RNA statt und deshalb stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Spalten einer Target-RNA bereit, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der RNA mit einem Oligonucleotid der Erfindung umfasst. In Ausführungsformen kann eine solche Spaltung ferner durch zusätzliches Bereitstellen von Bedingungen, welche für RNase H-Aktivität förderlich sind, wie Puffermittel (z.B. zur Kontrolle des pH-Werts und der Ionenstärke), Temperaturkontrollmittel und jedwede anderen Komponenten, welche zu einer Induktion der RNase H-Aktivität beitragen können, ermöglicht werden. In bestimmten Ausführungsformen stammt die RNase H-Aktivität von einem RNase H-Enzym oder einem multifunktionellen Enzym, welches RNase H-Aktivität besitzt. In bestimmten Ausführungsformen schließt eine solche RNase H-Aktivität eine RNase H-Aktivität ein, welche mit den reversen Transkriptasen von humanen pathogenen Viren wie HIV (z.B. den Retroviren HIV-1 und HIV-2) und dem Hepadnavirus Hepatitis B-Virus in Zusammenhang steht, ist aber nicht darauf eingeschränkt. In weiteren Ausführungsformen schließt eine solche RNase H-Aktivität eine RNase H-Aktivität ein, welche mit einem RNase H-Enzym mit prokaryotischem oder eukaryotischem Ursprung, in einer Ausführungsform mit Säugerursprung, in einer Ausführungsform mit menschlichem Ursprung, in Zusammenhang steht, ist aber nicht darauf eingeschränkt. In weiteren Ausführungsformen schließt eine solche RNase H-Aktivität eine RNase H-Aktivität ein, welche mit RNase H1 und RNase H2 mit eukaryotischem oder prokaryotischem Ursprung in Zusammenhang steht, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
In Ausführungsformen schließt die vorstehend angegebene RNA Messenger-RNA oder virale Genom-RNA ein, so dass das Oligonucleotid spezifisch die Biosynthese von Proteinen, welche durch die mRNA kodiert werden, beziehungsweise die Virusreplikation inhibieren kann. Partielle Modifizierungen des Oligonucleotids, welche auf den 5'- und/oder 3'-Terminus oder das Phosphatgerüst oder die Zuckerreste ausgerichtet sind, um seine Antisense-Eigenschaften (z.B. Nucleasebeständigkeit) zu steigern, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Wie in dieser Erfindung gezeigt wird (siehe nachstehend), erfüllen diese Oligonucleotide eine der wichtigsten Erfordernisse für Antisense-Medikamente, d.h. sie binden an Target-RNA, wobei ein AON/RNA-Duplex gebildet wird, der von humaner RNase H erkannt und abgebaut wird. Wie nachstehend gezeigt, ist darüber hinaus die Wirksamkeit, mit welcher die AON-X-AON-Chimären die RNA-Spaltung fördern, hervorragend im Vergleich zu der, welche bei AONs ohne die acyclische Modifizierung (X- oder X_nLinker) gesehen wird.
Deshalb etablieren die hier dargelegten Ergebnisse der Anmelder, dass [R¹-X]_a-R²-, AON-X-AON- und AON-Xn AON-Chimäre ausgezeichnete Modelle von Antisense-Wirkstoffen sind und als Medikamente und/oder wertvolle Werkzeuge zum Untersuchen und Kontrollieren der Genexpression in Zellen und Organismen dienen sollten.
So stellt die Erfindung in alternativen Ausführungsformen Antisense-Moleküle bereit, welche binden an, den Abbau induzieren von und/oder die Translation inhibieren von einer Target-RNA (z.B. mRNA). Beispiele von therapeutischen Verwendungen eines Antisense-Oligonucleotids, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen werden, schließen ein: U.S. Pat. Nr. 5,135,917, veröffentlicht am 04. Aug. 1992; U.S. Pat. Nr. 5,098,890, veröffentlicht am 24. März 1992; U.S. Pat. Nr. 5,087,617, veröffentlicht am 11. Feb. 1992; U.S. Pat. Nr. 5,166,195, veröffentlicht am 24. Nov. 1992; U.S. Pat. Nr. 5,004,810, veröffentlicht am 02. Apr. 1991; U.S. Pat. Nr. 5,194,428, veröffentlicht am 16. März 1993; US. Pat. Nr. 4,806,463, veröffentlicht am 21. Feb. 1989; U.S. Pat. Nr. 5,286,717, veröffentlicht am 15. Feb. 1994; U.S. Pat. Nr. 5,276,019 und U.S. Pat. Nr. 5,264,423; BioWorld Today, 29. Apr. 1994, S. 3.
Bevorzugt besteht in Antisense-Molekülen ein ausreichender Komplementaritätsgrad zur Target-RNA, um ein nicht-spezifisches Binden des Antisense-Moleküls an Nicht-Target-Sequenzen unter Bedingungen, bei welchen spezifisches Binden gewünscht ist, wie unter physiologischen Bedingungen im Falle von in-vivo-Tests oder therapeutischer Behandlung oder im Falle von in-vitro-Tests unter Bedingungen, bei welchen die Tests durchgeführt werden, zu vermeiden. Die Target-RNA zum Antisense-Binden kann nicht nur die Information zum Kodieren eines Proteins beinhalten, sondern auch assoziierte Ribonucleotide, welche zum Beispiel die nicht-translatierte 5'-Region, die nicht-translatierte 3'-Region, die 5'-Capregion und Intron/Exon-Verbindungsribonucleotide bilden. Ein Verfahren zum Durchmustern (engl. screening) von Antisense- und Ribozymnucleinsäuren, welche zur Bereitstellung von solchen Molekülen als PLA₂-Inhibitoren der Erfindung verwendet werden können, ist in US. Patent Nr. 5,932,435 offenbart.
Antisense-Moleküle (Oligonucleotide) der Erfindung können jene einschließen, welche Interzuckergerüstbindungen wie Phosphotriester, Methylphosponate, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylinterzuckerbindungen oder kurzkettige Heteroatom- oder heterocyclische Interzuckerbindungen, Phosphorothioate und jene mit CH₂-NH-O-CH₂-, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂- (bekannt als Methylen(methylimino)- oder MMI-Gerüst), CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- und O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-Gerüsten (wobei Phosphodiester O-P(O)₂-O-CH₂ ist) enthalten. Oligonucleotide mit Morpholinogerüststrukturen können auch verwendet werden (U.S. Pat. Nr. 5,034,506). In alternativen Ausführungsformen können Antisense-Oligonucleotide ein Peptidnucleinsäure (PNA, manchmal als „Protein"- oder „Peptid"-Nucleinsäure bezeichnet)-Gerüst, bei welchem das Phosphodiestergerüst des Oligonucleotids mit einem Polyamidgerüst ersetzt sein kann, wobei nucleosidische Basen direkt oder indirekt an Azastickstoffatome oder Methylengruppen in dem Polyamidgerüst gebunden sind, aufweisen (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 und U.S. Pat. Nr. 5,539,082). Die Phosphodiesterbindungen können mit Strukturen substituiert sein, welche chiral und enantiomer spezifisch sind. Der Fachmann wird zur Auswahl von anderen Bindungen zur Verwendung in der Praxis der Erfindung in der Lage sein.
Wie vorstehend angegeben, können die Oligonucleotide auch Spezies einschließen, welche wenigstens eine modifizierte Nucleotidbase einschließen. Folglich können Purine und Pyrimidine, welche verschieden von jenen sind, die in der Natur normalerweise gefunden werden, verwendet werden. In ähnlicher Weise können auch Modifizierungen am Pentofuranosylanteil der Nucleotiduntereinheiten durchgeführt werden. Beispiele von solchen Modifizierungen sind 2'-O-Alkyl- und 2'-Halogen-substituierte Nucleotide. Einige spezielle Beispiele von Modifizierungen an der 2'-Position der Zuckereinheiten, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind OH, SH, SCH₃, F, OCN, O(CH₂)_nNH₂ oder O(CH₂)_nCH₃, wobei n 1 bis ungefähr 10 ist; C₁- bis C₁₀-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino; substituiertes Silyl; eine RNA-Spaltungsgruppe; eine Reportergruppe; eine interkalierende Gruppe, eine Gruppe zum Verbessern der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids; oder eine Gruppe zum Verbessern der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine oder mehrere Pentofuranosylgruppen können durch einen anderen Zucker, durch eine Gruppe, welche einen Zucker nachahmt, wie Cyclobutyl, oder durch eine andere Einheit, welche den Platz des Zuckers einnimmt, ersetzt werden.
Demgemäß kann in verschiedenen Ausführungsformen ein modifiziertes Oligonucleotid der Erfindung therapeutisch in Formulierungen oder Medikamenten zur Verhinderung oder Behandlung einer Erkrankung, welche durch die Expression einer besonderen Target-RNA charakterisiert ist, verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen ist eine solche Target-Nucleinsäure enthalten in oder abgeleitet von einem infektiösen Mittel und/oder ist für die Funktion und/oder Lebensfähigkeit und/oder Replikation/Propagation des infektiösen Mittels erforderlich. In bestimmten Ausführungsformen ist ein solches infektiöses Mittel ein Virus, in bestimmten Ausführungsformen ein Retrovirus, in einer weiteren Ausführungsform HIV. In weiteren Ausführungsformen steht die Expression einer solchen Target-Nucleinsäure mit den Erkrankungen, welche entzündliche Erkrankungen, Diabetes, kardiovaskuläre Erkrankung (z.B. Restinose) und Krebs einschließen, aber nicht darauf eingeschränkt sind, in Zusammenhang. Die Erfindung stellt entsprechende Verfahren von medikamentöser Behandlung bereit, bei welchen eine therapeutische Dosis eines modifizierten Oligonucleotids der Erfindung in einer pharmakologisch verträglichen Formulierung verabreicht wird. In Ausführungsformen kann ein Oligonucleotid auch als ein Pro-Pharmakon verabreicht werden, wobei es zu einer aktiveren Form an seiner Wirkstelle modifiziert wird. Demgemäß stellt die Erfindung auch therapeutische Zusammensetzungen bereit, welche ein modifiziertes Oligonucleotid der Erfindung und einen pharmakologisch verträglichen Exzipienten oder Träger umfassen. Das Arzneimittel kann in einer wässrigen Lösung bei einem physiologisch verträglichen pH-Wert löslich sein.
In einer Ausführungsform schließen solche Zusammensetzungen ein Oligonucleotid der Erfindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, welche zum Behandeln oder Verhindern einer Erkrankung, die durch die Expression einer besonderen Target-Nucleinsäure charakterisiert ist, ausreichend ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger ein.
Eine „therapeutisch wirksame Menge" betrifft eine Menge, welche bei Dosierungen und für Zeitdauern wirksam ist, die zum Erreichen des gewünschten therapeutischen Ergebnisses, wie eine Verminderung bei oder eine Verhinderung der Expression einer besonderen Target-Nucleinsäure, notwendig sind. Eine therapeutisch wirksame Menge einer modifizierten Nucleinsäure der Erfindung kann gemäß Faktoren, wie dem Erkrankungsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und dem Vermögen der modifizierten Nucleinsäure, eine gewünschte Antwort in dem Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierungsschemata können angepasst werden, um eine optimale therapeutische Antwort bereit zu stellen. Eine therapeutisch wirksame Menge ist auch eine Menge, bei welcher jedwede toxischen oder nachteiligen Wirkungen der Verbindung durch die therapeutisch vorteilhaften Wirkungen aufgewogen werden. Eine „prophylaktisch wirksame Menge" betrifft eine Menge, welche bei Dosierungen und für Zeitdauern wirksam ist, die zum Erreichen des gewünschten prophylaktischen Ergebnisses, wie Verhindern oder Behandeln einer Erkrankung, welche durch die Expression einer besonderen Target-Nucleinsäure charakterisiert ist, notwendig sind. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann wie vorstehend für die therapeutisch wirksame Menge beschrieben bestimmt werden. Für jedweden besonderen Empfänger können spezielle Dosierungsschemata über die Zeit gemäß dem individuellen Bedarf und der professionellen Einschätzung des Fachmanns für die Verabreichung oder Überwachung der Verabreichung der Zusammensetzungen angepasst werden.
Wie hier verwendet, schließen „pharmazeutisch verträglicher Träger" oder „Exzipient" jedwedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzugsmittel, antibakterielle Mittel und Antifungizide, isotonische und Absorptionsverzögerungsmittel und dergleichen, welche physiologisch kompatibel sind, ein. In einer Ausführungsform ist der Träger für parenterale Verabreichung geeignet. Alternativ kann der Träger für intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, sublinguale oder orale Verabreichung geeignet sein. Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersion ein. Die Verwendung von solchen Medien und Mitteln für pharmazeutische Wirkstoffe ist auf dem Fachgebiet bekannt. Außer insoweit, dass jedwede herkömmlichen Medien oder Mittel mit dem Wirkstoff nicht kompatibel sind, wird eine Verwendung davon in den Arzneimitteln der Erfindung in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Arzneimittel müssen typischerweise steril und stabil unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, Mikroemulsion, Liposom oder andere geordnete Struktur, welche für eine hohe Arzneistoffkonzentration geeignet ist, formuliert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, welche zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon enthalten. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugsmittels wie Lecithin erhalten werden, indem die erforderliche Teilchengröße im Falle einer Dispersion erhalten wird, und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln. In vielen Fällen kann es bevorzugt sein isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie Mannitol, Sorbitol oder Natriumchlorid, in die Zusammensetzung aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Aufnehmen eines Mittels, welches die Absorption verzögert, in die Zusammensetzung, zum Beispiel Monostearatsalze und Gelatine, erreicht werden. Außerdem kann ein Oligonucleotid der Erfindung in einer Formulierung mit zeitlicher Freisetzung verabreicht werden, zum Beispiel in einer Zusammensetzung, welche ein Polymer für langsame Freisetzung einschließt. Das modifizierte Oligonucleotid kann mit Trägern zubereitet werden, welche das modifizierte Oligonucleotid gegen schnelle Freisetzung schützen, wie eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroverkapselte Abgabesysteme. Bioabbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäure und Polymilchsäwe-, Polyglycolsäure-Copolymere (PLG). Viele Verfahren zur Herstellung von solchen Formulierungen sind patentiert oder im Allgemeinen dem Fachmann bekannt.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen eines Wirkstoffes, wie eines Oligonucleotids der Erfindung, in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von vorstehend aufgezählten Bestandteilen, wie erforderlich, gefolgt durch Sterilfiltrieren hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen des Wirkstoffes in ein steriles Vehikel, welches ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von jenen, welche vorstehend aufgezählt sind, enthält, hergestellt. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, was zu einem Pulver des Wirkstoffes plus jedwedem zusätzlichen gewünschten Bestandteil von einer vorher sterilfiltrierten Lösung davon führt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein Oligonucleotid der Erfindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Verbindungen, welche seine Löslichkeit steigern, formuliert werden.
Da die Oligonucleotide der Erfindung zur Induktion der RNase H-vermittelten Spaltung einer Target-RNA in der Lage sind, wodurch die Herstellung des Proteins, welches durch die Target-RNA kodiert wird, vermindert wird, können die modifizierten Oligonucleotide der Erfindung in jedwedem System verwendet werden, worin die selektive Inaktivierung oder Inhibierung einer besonderen Target-RNA wünschenswert ist. Wie vorstehend angegeben, schließen Beispiele von solchen Verwendungen Antisense-Medikamente ein, bei welchen die Expression der Target-RNA mit der Krankheit oder Erkrankung in Zusammenhang steht.
Ein weiteres Beispiel einer solchen Verwendung ist die selektive Depletion eines besonderen Target-Genprodukts in einem System, um die Phenotypwirkung(en) einer solchen Depletion an dem System zu untersuchen. Beobachtungen, welche über solche Depletionsuntersuchungen gemacht wurden, können so die Bestimmung der Funktion des Target-Genprodukts ermöglichen. In bestimmten Ausführungsformen schließen solche Verwendungen eine „Target-Validierung" ein, wobei die vorstehend beschriebene Strategie die Bestätigung ermöglicht, ob eine besondere Target-Nucleinsäure mit einem besonderen Phenotyp oder Aktivität in Zusammenhang steht, und folglich eine „Validierung" des Targets ermöglicht. Das vorstehend angegebene System kann eine Zelle oder zellfrei; in vitro prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Die Erfindung stellt ferner verkaufsfähige Zusammenstellungen, welche ein Oligonucleotid der Erfindung umfassen, bereit. In bestimmten Ausführungsformen umfassen solche verkaufsfähigen Zusammenstellungen ferner wenigstens eine der folgenden Gebrauchsanweisungen für das Oligonucleotid zum (a) Vermindern der Expression einer Target-RNA-Sequenz; (b) Induzieren der RNase H-Spaltung einer Target-RNA-Sequenz; (c) Verhindern oder Behandeln einer Erkrankung, welche durch die Expression eines besonderen RNA-Targets charakterisiert ist, und (d) Validieren eines besonderen Gen-Targets.
Obwohl verschiedene Ausführungsformen der Erfindung hier offenbart werden, können viele Anpassungen und Modifizierungen innerhalb des Umfangs der Erfindung gemäß dem alagemeinen Wissen des Fachmanns durchgeführt werden. Solche Modifizierungen schließen die Substitution von bekannten Äquivalenten für jedwede Ausführungsform der Erfindung ein, um das gleiche Ergebnis in im Wesentlichen der gleichen Weise zu erreichen. Numerische Bereiche schließen die Zahlen, welche den Bereich definieren, ein. In den Patentansprüchen wird das Wort „umfassen" als ein Ausdruck ohne Einschränkung, im Wesentlichen äquivalent zur Umschreibung „einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf" verwendet. Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend für verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und schränken die breiten Ausführungsformen der Erfindung, wie hier offenbart, nicht ein.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Synthese von acyclischen Vorläufern, welche für ihren Einbau in Oligonucleotide geeignet sind
Vorläufer für acyclischen Rest IIb
Dimethoxytrityl-O-CH₂CH₂CH₂CH₂-O-P(Ni-Pr₂)OCH₂CH₂CN (1) wurde von ChemGenes Corp. (Ashland, MA) gekauft und wurde wie erhalten für die Synthese von AON-X-AON-Chimären verwendet (siehe Beispiel 3).
Vorläufer für acyclische Reste IIc und IId
Die acyclischen Nucleosidreste (hier als 2'3'-Seconucleotide bezeichnet) bestehen aus einer 1-[1,5-Dihydroxy-4(S)-hydroxymethyl-3-oxapent-2(R)-yl]-uracileinheit, welche in geeigneter Weise für die Einbringung in Oligonucleotide geschützt und funktionalisiert worden war, wie nachstehend beschrieben.
Schritt A. Synthese von 5'-Monomethogytrityl-2',3' seco-β-D-ribouracil (2).
Zu einer 0,1 M Lösung von 5'-Monomethoxytrityluridin (5'-MMT-rU, 5,16 g, 10 mMol; hergestellt wie in T. Wu, K.K. Ogilvie, R.T. Pon. 1989. „Prevention of Chain Cleavage in the Chemical Synthesis of 2'-Silylated Oligoribonucleotides." Nucleic Acids Res., 3501-17 beschrieben.) in Dioxan wurde eine gesättigte Lösung von NaIO₄ in H₂O (2,26 g, 10,6 mMol, 1,06 Äquiv.) gegeben und man ließ die Umsetzung bei RT für 2 bis 3 Std. fortschreiten, bis die vollständige Umwandlung in den Dialdehyd durch DC-Visualisierung (R_f 0,52 in CH₂Cl₂:MeOH, 9:1) beobachtet wurde. Die Umsetzung wurde mit Dioxan (100 ml) verdünnt, filtriert, um NaIO₃-Salze zu entfernen, und es folgte in-situ-Reduktion des Dialdehyds über Behandlung mit NaBH₄ (0,378 g, 10 mMol, 1,0 Äquiv.) für 10 bis 20 Min. bei RT. Das Reaktionsgemisch wurde mit Aceton abgeschreckt, mit 20 %iger Essigsäure neutralisiert und unter verringertem Druck zu einem Öl konzentriert. Der Rückstand wurde dann mit CH₂Cl₂ (200 ml) verdünnt und mit H₂O (2 × 75 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde zurückextrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden unter Verwendung von wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei das Produkt als ein reiner weißer Schaum in 98 % isolierter Ausbeute (5,08 g; 9,8 mMol) erhalten wurde. R_f (CH₂Cl₂:MeOH, 9:1) 0,18; FAB-MS (NBA): 519,6; Berechn.: 518,57. Schritt B. Synthese von 5'-O-MMT-2'-O-t-butyldimethylsilyl-2',3'-secouridin (3a) und 5'-O-MMT-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2',3' secouridin (3b).

Si = t-Butyldimethylsilyl

Monoschützen von jeder der freien Hydroxylfunktionen von 2 wurde nicht-selektiv durch Zugeben von t-Butyldimethylsilylchlorid (0,81 g, 5,4 mMol, 1,1 Äquiv.) zu einer gerührten 0,1 M Lösung von 2 (2,55 g, 4,9 mMol) in trockenem THF bei 0°C, welche eine Suspension von AgNO₃ (0,92 g, 5,39 mMol, 1,1 Äquiv.) enthielt, erreicht. Die Reaktionstemperatur wurde nach 20 Min. auf RT zurückgeführt und so für 24 Std. aufrecht erhalten. Die Aufarbeitung wurde durch Filtrieren des Gemisches direkt in eine wässrige Lösung von 5 % NaHCO₃ (50 ml) initiiert, gefolgt von einer zweifachen Extraktion der wässrigen Schicht mit CH₂Cl₂. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (wasserfreies Na₂SO₄), filtriert und unter verringertem Druck eingedampft, wobei das Rohprodukt als ein gelbes Öl erhalten wurde. Der Rückstand wurde durch Flash-Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 0 nach 25 % Aceton in CH₂Cl₂ gereinigt, wobei beide Monosilylisomere als reine weiße Schäume gewonnen wurden. Isolierte Ausbeuten für 3a und 3b waren 22 % beziehungsweise 14 %. R_f (CH₂Cl₂:Et₂O, 3:1) 3a, 0,18; 3b, 0,05. FAB-MS (NBA): 633,4; Berechn.: 632,83.
Die Regioisomere werden auf der Basis von COSY-NMR-Kreuzpeakkorrelationen, welche verwendet werden, um die Konnektivität der Protonen in dem Acyclozucker zu zeigen, unterschieden. In beiden Spektren sind die H1'-Protonen durch die nicht äquivalenten H2'- und H2''-Protonen in ein Duplett von Dupletts aufgespalten, was auf einen bestimmten Grad an Strukturstarrheit um die C1'-C2'-Bindung hinweist. Wesentlicher wird ein einzelner gut aufgelöster Hydroxylpeak für sowohl 3a als auch 3b in DMSO-d₆ beobachtet, was einen schnellen chemischen Austausch dieser Einheiten verneint. Als ein Ergebnis wird die Wirkung der Protonen bei C2' von 3b auf das 2'-Hydroxylproton übertragen, welches selbst als ein überlappendes Duplett von Dupletts erscheint. Bei 3a wird auch ein Aufspalten des Hydroxylpeaks beobachtet, jedoch zeigt er Korrelationen mit H4' und H4" und schließt deshalb die Gegenwart einer Silylgruppe an der 3'-Position aus. Zusammengenommen bestätigen diese Daten die Stellung von 3a und 3b als die 2'- beziehungsweise 3'-monosilylierten Isomere. Schritt C. (a) Synthese von 5'-O-MMT-2'-O-t-butyldimethylsilyl]2',3'-secouridin-3'-O-[N,N-diisopropylamino-(2-cyanoethyl)]phosphoramidit (4a).

Si = t-Butyldimethylsilyl; P = N,N-Diisopropylamino-O-(2-cyanoethyl)phosphoramidit

Zu einer mit Stickstoff gespülten Lösung von 4-Dimethylaminopyridin (DMAP; 12 mg, 0,10 mMol, 0,1 Äquiv.), N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA; 0,68 ml, 3,9 mMol, 4 Äquiv.) und 3a (620 mg, 0,98 mMol) in THF (0,2 M) bei 0°C wurde N,N-Diisopropylamino-β-cyanoethylphosphonamidchlorid (0,24 ml, 1,1 mMol, 1,1 Äquiv.) tropfenweise über 5 Min. gegeben. Das sofortige Auftauchen eines weißen Niederschlags aufgrund der schnellen Bildung von Diisopropylethylammonium-Hydrochlorid zeigte ausreichend wasserfreie Bedingungen und man ließ die Umsetzung auf RT erwärmen, worauf sie vor der Aufarbeitung der Umsetzung für 2,5 Std. gerührt wurde. Kurz wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (50 ml, vorgewaschen mit 5 % NaHCO₃) verdünnt und mit gesättigter Salzlösung (2 × 20 ml) gewaschen. Die gewonnene organische Schicht wurde getrocknet (wasserfreies Na₂SO₄), filtriert und das Lösungsmittel wurde über verringerten Druck entfernt, wobei ein rohes gelbes Öl erhalten wurde. Eine Coabdampfung des rohen Produkts mit Et₂O lieferte einen blass-gelben Schaum. Eine Reinigung des Produkts durch Flash-Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines CH₂Cl₂:Hexane:TEA-Gradientensystems (25:74:1, angepasst nach 50:49:1) lieferte einen weißen Schaum in 97 % isolierter Ausbeute. R_f(EtOAc:Tol., 4:1) 0,86, 0,72. FAB-MS (NBA): 833,4; Berechn.: 833,05. (b) Synthese von 5'-O-MMT-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2',3'-secouridin-2'-O-[N,N-diisopropylamino-(2-cyanoethyl)]phosphoramidit (4b).

Alle Bedingungen, welche bei der Herstellung des 3'-Phosphoramidits (4b) verwendet wurden, waren identisch zu jenen, welche bei ihrem regioisomeren Gegenstück 4a verwendet worden waren (siehe Schritt B). Eine Flash-Säulenreinigung dieses Isomers lieferte einen weißen Schaum in 99 % isolierter Ausbeute. R_f (EtOAc:Tol., 4:1) 0,77, 0,65. FAB-MS (NBA): 833,3; Berechn.: 833,05.
BEISPIEL 2
Herstellung von AONs, aufgebaut aus 2'-Deoxy-2'-fluor-β-D-arabinonucleotiden (FANA), welche ein acyclisches Butandiol oder Secouridinreste flankieren
1. Synthese von FANA-X-FANA-Chimären, wobei X = Butandiollinker = IIb (Y=Z = Sauerstoff; n = 4)
Die Synthese der PDE-FANA-Oligomere wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Damha et al. T. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12976; Wilds, C.J. und Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 3625). Ihre Struktur wurde über Maldi-TOF-Massenspektrometrie bestätigt.
Eine Synthese von PDA-(FANA-But-FANA)-Chimären wurde in einem 1 Mikromol-Maßstab unter Verwendung einer Expedite 8909-DNA-Synthesevorrichtung durchgeführt. Langkettiges Alkylamin-kontrolliertes Porenglas (LCAA-CPG) wurde als der feste Träger verwendet. Der Synthesecyclus bestand aus den folgenden-Schritten:

1) Detritylierung von Nucleosid/Tide, gebunden an CPG (3 % Trichloressigsäure/Dichlorethan): 150 Sek. für MMT-; 60 Sek. für DMT-Entfernung.
2) Kuppeln der 2'-F-Arabinonucleosid- oder Dimethoxytritylbutandiolphosphoramiditmonomere: 15 Min. Die Konzentration der verwendeten Monomere war 50 mg/ml für araF-T, araF-C und 60 mg/ml für araF-A und Butandiolmonomere (Acetonitril als Lösungsmittel).
3) Acetylierung unter Verwendung des Standardcappingschritts: 20 Sek. Die Cappinglösung bestand aus 1:1 (v/v) der „CapA"- und „CapB"-Reagenzien. CapA: Essigsäureanhydrid/Collidin/THF (1:1:8 ml); CapB: N-Methylimidazol/THF (4:21 ml).
4) Umfangreiches Waschen mit Acetonitril (50 Pulse).
5) Oxidation mit einer frischen Lösung von I₂:Collidin:THF: 5 Sek.
6) Waschen mit Acetonitril: 20 Pulse.
7) Trocknen des festen Trägers durch Zugabe des Cappingreagenzes (siehe Schritt 3): 5 Sek.
8) Waschen mit Acetonitril (20 Pulse).

Nach dem Kettenzusammenbau wurden Oligonucleotide von dem festen Träger abgespalten und wie früher beschrieben entschützt (Noronha, A.M. et al. Biochemistry 2000, 39, 7050). Die rohen Oligomere wurden durch Anionenaustausch-HPLC, gefolgt von Entsalzen (Sephadex G-25- oder SepPak-Kartuschen) gereinigt. Ausbeuten: 10 bis 15 A₂₆₀-Einheiten.
Bedingungen für HPLC-Reinigung:

Säule: Protein Pak DEAE-SPW (7,5 mm × 7,5 cm, Waters),
Lösungsmittel: Puffer A: H₂O; Puffer B: 1 M LiClO₄ (oder NaClO₄),
Gradient: 0 bis 20 % B, linear über 60 Min.

Die Beladung war 0,5 bis 1 A₂₆₀-Einheiten für Analyse und 50 bis 80 A₂₆₀-Einheiten für präparative Trennung. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 1 ml/Min. gesetzt, die Temperatur wurde bei 50°C eingestellt. Der Detektor wurde auf 260 nm für analytische und 290 nm für präparative Chromatographie gesetzt. Unter diesen Bedingungen eluierte das gewünschte Oligomer mit voller Länge zuletzt.
Die Basensequenz und Hybridisierungseigenschaften der synthetisierten Oligonucleotide sind in Tabelle 1 gegeben.
2. Synthese von FANA-X-FANA-Chimären, wobei X ein Secouridin (SEC)-Linker IIc ist.
Phosphodiester FANA-SEC-FANA- und FANA-SEC-SEC-FANA-Chimäre wurden analog den chimären Butandiolkonstrukten (siehe vorstehend unter Verwendung einer Konzentration von 50 mg/ml von 2',3'-Secouridinmonomeren für den Kupplungsschritt synthetisiert. Die Ausbeuten der Oligonucleotide nach ihrer Abspaltung von dem festen Träger, Entschützung, Reinigung (HPLC) und Entsalzung (SepPak-Kartuschen), wie vorstehend beschrieben, waren 10 A₂₆₀-Einheiten. Ihre Struktur wurde über Maldi-TOF-Massenspektrometrie bestätigt.
Die Basensequenz und Hybridisierungseigenschaften der synthetisierten Oligonucleotide sind in Tabelle 1 gegeben.
3. Synthese von DNA-X-DNA-Chimären, wobei X = Butandiollinker = IIb (Y=Z = Sauerstoff und n = 4)
Die Synthese und Reinigung der Phosphodiester DNA-But-DNA-Chimäre wurden mit wenigen kleinen Ausnahmen in der gleichen Weise wie vorstehend für die Phosphodiester FANA-But-FANA-Oligomere beschrieben durchgeführt. Die verwendete Konzentration der 2'-Deoxyribonucleosidmonomere und von Butandiolphosphoramidit war 50 beziehungsweise 60 mg/ml, jeweils zusammen mit einer kürzeren Kupplungszeit (2 Min.) pro Zugabe von jedem Monomertyp. Ausbeuten nach Reinigung (HPLC) und Entsalzung (Sephadex G-25): 22 A₂₆₀-Einheiten. Ihre Struktur wurde durch Maldi-TOF-Massenspektrometrie bestätigt.
Die Basensequenz und Hybridisierungseigenschaften der synthetisierten Oligonucleotide sind in Tabelle 1 gegeben.
4. Synthese der Phosphorothioat FANA-X-FANA- und Phosphorothioat DNA-X-DNA-Chimäre, wobei X = Butandiollinker = IIb (Y = Sauerstoff, Z = Schwefel und n = 4)
Die Synthese der Phosphorothioat FANA-But-FANA- und Phosphorothioat DNA-But-DNA-Oligomere wurde wie für die Phosphodiester (PDE)-Oligonucleotide vorstehend beschrieben durchgeführt. Der Hauptunterschied war der Ersatz des Iod/Wasser-Oxidationsreagenzes mit einer 0,1 M Lösung von 3-Amino-1,2,4-dithiazolin-5-thion (ADTT) in Pyridin/Acetonitril (1/1, v/v). Speziell wurden die Phosphorothioatverbindungen in einem 1 Mikromol-Maßstab unter Verwendung einer Expedite 8909 DNA-Synthesevorrichtung synthetisiert. Langkettiges Alkylamin-kontrolliertes Porenglas (LCAA-CPG) wurde als der feste Träger verwendet. Der Synthesecyclus bestand aus den folgenden Schritten: (a) Detritylierung von Nucleosid/Tide, gebunden an CPG (3 % Trichloressigsäure/Dichlormethan): 150 Sek.; (b) Kuppeln der 2'-F-Arabinonucleosid- oder 2'-Deoxyribonucleosid-3'-phosphoramiditmonomere: 15 Min. beziehungsweise 1,5 Min. Die Konzentration der verwendeten Monomere war 50 mg/ml für araF-T, araF-C, DNA und Butandiollinkermonomere und 60 mg/ml für araA und araF-G (Acetonitril als Lösungsmittel); (c) Acetylierung unter Verwendung des Standardcappingschritts: 20 Sek. Die Cappinglösung bestand aus 1:1 (v/v) der „CapA"- und „CapB"-Reagenzien. CapA: Essigsäureanhydrid/Collidin/THF (1:1:8 ml); CapB: N-Methylimidazol/THF (4:21 ml); (d) Umfangreiches Waschen mit Acetonitril (50 Pulse); (e) Sulfurierung mit einer Lösung von 0,1 M 3-Amino-1,2,4-dithiazolin-5-thion (ADTT) in Pyridin/Acetonitril (1/1, v/v), 10 Min.; (f) Waschen mit Acetonitril: 20 Pulse; (g) Trocknen des festen Trägers durch Zugabe des Cappingreagenzes (siehe Schritt 3): 5 Sek.; (h) Waschen mit Acetonitril (20 Pulse).
Nach dem Kettenzusammenbau wurden die Oligonucleotide von dem festen Träger abgespalten und durch Behandlung mit konz. wässrigem Ammoniak (RT, 16 Std.) entschützt. Die rohen Oligomere wurden entweder durch (a) präparative Gelelektrophorese (24 % Acrylamid, 7 M Harnstoff), gefolgt von Entsalzen (Sephadex G-25) oder (b) Anionenaustausch-HPLC, gefolgt von Entsalzen (SepPak-Kartuschen) gereinigt. Ausbeuten: 30 bis 70 A₂₆₀-Einheiten. Bedingungen für HPLC-Reinigung: Säule: Protein Pak DEAE-SPW (7,5 mm × 7,5 cm, Waters), Lösungsmittel: Puffer A: H₂O; Puffer B: 1 M NaClO₄, Gradient: 100 % Puffer A, isokratisch für 12 Min., 100 % A – 15 % B, linear (über 5 Min.), 15 % B – 55 % B, linear (über 60 Min.); die Fließgeschwindigkeit wurde auf 1 ml/Min. gesetzt, die Temperatur wurde bei 50°C eingestellt. Der Detektor wurde auf 260 nm für analytische und 290 nm für präparative Chromatographie gesetzt. Unter diesen Bedingungen eluierte das gewünschte Oligomer mit voller Länge zuletzt. Die Struktur der Oligonucleotide wurde über Maldi-TOF-Massenspektrometrie bestätigt.
Tabelle 1. Schmelztemperaturen (T_m) und RNase H-vermittelte Hydrolyseprofile für die AON/RNA-Heteroduplexe^a

^a Wässrige Lösungen von 2,8 × 10^–6 M von jedem Oligonucleotid, 140 mM KCl, 1 M MgCl₂, 5 mM Na₂HPO₄-Puffer (pH-Wert 7,2); Unsicherheit in T_m ist ± 0,5°C. ^b Target-RNA-Sequenzen entsprechen rA₁₈ (SEQ ID Nr.: 27) oder 5'-r(GGGAAAGAAAAAAUAUAA)-3' (SEQ ID Nr.: 28). ^c Großbuchstaben, 2'F-ANA-Nucleotide; Kleinbuchstaben, Deoxynucleotide; C, Mismatch Arabinofluor- oder Deoxycytidinrest; B, Butandiollinker; S, 2'-Secouridineinsatz. ^d Humanes Enzym; die gezeigten Geschwindigkeiten wurden bei 22°C erhalten und sind gemäß dem Elternstrang von jeder Reihe normalisiert, außer bei den Ha-ras-Sequenzen, bei welchen die Daten auf alle FANA-AON (Eintrag XXI) normalisiert sind, ^e⨍ Target-RNA (40-mer)-Sequenz: 5'-r(CGCAGGCCCCUGAGGAGCGAUGACGGAAUAUAAGCUGGUG)-3' (SEQ ID Nr.: 29); ^e unterstrichene und ^⨍ fettgedruckte Reste zeigen die Region in der RNA, an welcher das AON bindet.

BEISPIEL 3
Expression und Reinigung von humaner RNase HII
Expression von humaner RNase HII
Ein hrnh-Genfragment von pcDNA/GS/hrnh (Invitrogen) wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer erhalten: AGC TAT CTC GAG ATG AGC TGG CTT CTG TTC CTG GCC (Xhol) (SEQ ID Nr.: 30) und GGC CGC AAG CTT TCA GTC TTC CGA TTG TTT AGC TCC (HindIII) (SEQ ID Nr.: 31). Dieses Fragment wurde in die XhoI/HindIII-Stellen des bakteriellen Expressionsvektors pBAD/His (Invitrogen) kloniert. Rekombinante humane RNase HII aus dem pBAD/His/hrnh-Expressionsplasmid wurde wie folgt gereinigt. Um die Codonneigung in E. coli zu überwinden, transformierten wir den Expressionsvektor in E. coli BL21 Codonplus (Stratagene) und kultivierten in LB-Nährflüssigkeit, welche 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C, bis die OD₆₀₀ 0,5 bis 0,6 erreicht hatte. Dann wurde das rekombinante Protein mit 0,002 % Arabinose für 4 h induziert.
Reinigung von humaner RNase HII
Nach der Induktion wurden E. coli-Zellen durch Zentrifugation geerntet, in gekühltem Waschpuffer (100 mM Phosphat, pH-Wert 8,0, 300 mM NaCl) gewaschen, in gekühltem Lysepuffer (100 mM Phosphat, pH-Wert 8,0, 10 Einheiten/ml DNase, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 300 mM NaCl, 200 μg/ml Lysozym) wieder suspendiert und mit 0,5 % NP-40 lysiert. Der Überstand wurde auf eine Ni²⁺-Nitrilotriacetat-Agarose-Säule, nachdem zentrifugiert worden war, aufgebracht und das Protein wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagen) gereinigt. Das Eluat wurde mit 2 mM EDTA behandelt, um jedwede restlichen Ni²⁺-Ionen in Chelate zu überführen, gegen 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, dialysiert und dann durch Ultrafiltration konzentriert. Das Protein wurde mit Enterokinase (1 Einheit/20 Mikrogramm Protein) in 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,1 % Tween-20 über Nacht bei 37°C behandelt. Dann wurde die verdaute Probe auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Amersham-Pharmacia) geladen, welche mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 8,0) voräquilibriert worden war. Nach der Elution mit einem Gradienten von 0,1 bis 0,5 M NaCl wurde der gewünschte Peak vereinigt, dialysiert und konzentriert.
BEISPIEL 4
Induktion von humaner Ribonuclease H (RNase HII)-Aktivität durch AON-X-AON-Oligonucleotide
PDE-FANA gegen PDE-[FANA-X-FANA], wobei x = Butandiollinker = IIb (Y=Z = Sauerstoff und n = 4)
A. Homopolymersequenzen.
Oligonucleotide mit definierter Sequenz mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war Octadecariboadenylat (rA₁₈), komplementär zu der Sequenz der vorstehenden Oligonucleotide. Das Vermögen der vorstehenden Oligonucleotide zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, 22°C) enthielt, umfassten. Vor der Zugabe des Enzyms wurde das Gemisch bei 75°C für 2 Minuten erwärmt und dann langsam auf Raumtemperatur gekühlt, um eine Duplexbildung geschehen zu lassen. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von humaner RNase HII bei Raumtemperatur gestartet. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von 10 μl Beladungspuffer (98 % deionisiertes Formamid, welches 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylolcyanol enthielt) und Erwärmen bei 100°C für 5 Minuten abgeschreckt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese unter Verwendung eines 16 % Polyacrylamidsequenziergels, welches 7 M Harnstoff enthielt, aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 1 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl „FANA"- als auch „FANA-BUT"-Oligomere (T-Reihe) in der Lage sind, Duplexe mit Target-RNA zu bilden, welche als Substrate für die Aktivität von humaner RNase HII dienen, wie durch die Abbauprodukte der Target-RNA in 1 gezeigt wird. Im Falle von FANA wurde dieser RNase H-Abbau durch das Auftauchen einer sich schnell bewegenden Bande bemerkt, welche durch die Endonucleaseaktivität von RNase HII gebildet wurde. Im Falle des „FANA-BUT"-Oligomers resultiert der Abbau aus sowohl der Endo- als auch der Exonucleaseaktivität des Enzyms, wie durch das Auftauchen von zahlreichen RNA-Abbauprodukten mit kleineren Größen nachgewiesen wird. Eine Quantifizierung von rA₁₈, welches als eine Funktion der Zeit verbleibt, zeigt, dass die Spaltungsgeschwindigkeit mit „FANA-But" 8-fach schneller ist als mit „FANA" (TABELLE 1 und 2).
Der gleiche Trend wurde beobachtet, als mit Phosphodiesteroligonucleotiden mit gemischtartigen Basen auf komplementäre RNA-Sequenzen abgezielt wurde (Beispiele 4B und 8). In Beispiel 8 wurden die Oligonucleotide, welche die vier natürlich vorkommenden heterocyclischen Basen (A, G, C und T) enthielten, designed, um auf 40- und 50-nt lange RNA-Targets abzuzielen. In diesen Fällen war die beobachtete Geschwindigkeitssteigerung der RNase H-vermittelten RNA-Spaltung sogar noch stärker, wobei 23-fach zugunsten der FANA-But-FANA- gegenüber den FANA-Verbindungen erreicht wurde.
B. Sequenz mit gemischtartigen Basen
Oligonucleotide mit definierter Sequenz mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war r(GGGAAAGAAAAAAUAUAA) (SEQ ID Nr.: 28), genau komplementär zu der Sequenz der ersten beiden Oligonucleotide. Das dritte Oligonucleotid CAT „FANA-Mismatch" enthält ein araF-C Mismatch an der Position 10. Dieses Oligomer weist die gleiche Bindungsaffinität wie die „FANA-But"-Sequenz auf und wurde getestet, um die Wirkung eines Butandiol-„Linkers" gegen einen araF-C Mismatch-„Linker" abzuschätzen. Deshalb wurde das Vermögen von „FANA", „FANA-But" und „FANA-Mismatch" (CAT-Reihe) zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, 22°C) enthielt, umfassten. Die Tests wurden wie vorstehend für die Homopolymersequenzen beschrieben (Beispiel 4A) durchgeführt. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 3 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl „FANA"- als auch „FANA-BUT" (CAT-Reihe) in der Lage sind, Duplexe mit Target-RNA zu bilden, welche als Substrate für die Aktivität von humaner RNase HII dienen, wie durch das Auftauchen von zahlreichen Abbauprodukten mit kleinen Größen gezeigt wird. Eine Quantifizierung des RNA-Targets, welches als eine Funktion der Zeit verbleibt, zeigt, dass die Spaltungsgeschwindigkeit mit „FANA-But" wesentlich (3,5-fach) schneller ist als mit „FANA" (4).
Die Daten zeigen auch, dass die RNase H-Aktivität bei dem FANA-Mismatch-Oligomer verringert ist, wobei der starrere araF-C-„Linker" den flexibleren Butandiollinker ersetzt (TABELLE 1). Da das araF-C Mismatch auch einen äquivalenten Abfall bei der Duplexwärmestabilität induziert, relativ zur Butandioleinbringung (ΔTm = –9°C, TABELLE 1), kann gefolgert werden, dass ein erhöhter Umsatz (d.h. eine gesteigerte Dissoziationsgeschwindigkeit von der Target-RNA) nicht die alleinige Grundlage für eine bevorzugte Enzymbenachteiligung gegenüber dem flexibleren Butlinker ist.
BEISPIEL 5
Humane Ribonuclease H (RNAse HII)-Aktivität als eine Funktion der Position des Butandiollinkers IIb (Y=Z = Sauerstoff und n = 4)
Die folgenden Oligonucleotide mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Die X-Linker sind bei unterschiedlichen Positionen platziert, um zu bestimmen, ob eine optimale Aktivität vom Ort des Linkers abhängt. X entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (Butandiollinker). Es war auch wünschenswert, das genaue Muster und die Spaltungsgeschwindigkeit zu bestimmen, welche die Wanderung des Linkers entlang des FANA-Gerüsts begleiten. Der genaue Ort von primären Schnitten ist unter Umgebungstemperatur für die Homopolymere, von welchen bekannt ist, dass sie gute Substrate für das Enzym sind, schwierig zu messen. Da es von Interesse war, zu sehen, wo die ersten Schnitte auftreten, wurde diese Information aus Tests, welche bei der niedrigeren Temperatur durchgeführt wurden, bei welcher die Enzymaktivität gerade ausreichend verzögert war, um einen qualitativen Vergleich der bevorzugten Spaltungsarten bei jedem Substrat zu ermöglichen (5), anstelle erhalten. Bei höheren Temperaturen wurden die Muster schlechter interpretierbar, wie es aus der Überlagerung von mehrfachen Spaltungen an einem einzelnen Target durch das Enzym resultiert.
Die verwendete Target-RNA war rA₁₈, komplementär zu den vorstehenden Oligonucleotiden. Tests (10 μl Endvolumen) umfassten 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8), welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 10 mM MgCl₂ enthielt. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von RNase H gestartet und bei 14 bis 15°C für 20 Minuten durchgeführt. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 5 gezeigt.
Die relativen Geschwindigkeiten folgen der Reihenfolge: BUT-10 > BUT-13 > BUT-5 (TABELLE 1 und 6). Darüber hinaus induzieren alle Linker-enthaltenden Oligonucleotide zusätzliche primäre Schnitte am 3'-Ende der RNA, außer für FANA-BUT5, welches zusammenfallend das einzige Oligonucleotid ist, welches in der Geschwindigkeit durch das FANA-Oligomer, das keinen Linker aufweist, gehemmt ist. So zeigen die FANA-BUTS- und FANA-BUT13-Substrate große Unterschiede beim Aktivierungsvermögen, trotz der Tatsache, dass ihre Sequenzen praktisch identisch und gleich wärmestabil sind (TABELLE 1), jedoch mit gegenteiligen Richtungen in Bezug auf die Butylstelle in dem Oligonucleotid. In der Tat weisen die unterschiedlichen Aktivitäten dieser zwei Oligomere auf eine geringe – wenn nicht nicht vorhandene – Rolle für die Umsatzwirkung hin. Alternativ kann die verringerte Geschwindigkeitssteigerung, welche für FANA-BUT5 gesehen wird, die verschobene Positionierung der RNase H entlang des Substrats zeigen, wobei bekannt ist, dass sie nahe dem 3'-Ende des Antisense-Oligonucleotids in dem Hybridduplex bindet und es so sein kann, dass sie durch die Linkereinbringung nicht beeinflusst wird.
BEISPIEL 6
PDE-FANA gegen PDE-[FANA-X-FANA] und PDE-[FANA-X-X-FANA] (X = Seconucleotid IIc)
Oligonucleotide mit definierter Sequenz mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIc (Secouridin). Die verwendete Target-RNA war Octadecariboadenylat (rA₁₈), komplementär zu der Sequenz der vorstehenden Oligonucleotide. Das Vermögen der vorstehenden Oligonucleotide zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, –15°C) enthielt, umfassten. Vor der Zugabe des Enzyms wurde das Gemisch bei 75°C für 2 Minuten erwärmt und dann langsam auf Raumtemperatur gekühlt, um eine Duplexbildung geschehen zu lassen. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von humaner RNase HII bei Raumtemperatur gestartet. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von 10 μl Beladungspuffer (98 % deionisiertes Formamid, welches 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylolcyanol enthielt) und Erwärmen bei 100°C für 5 Minuten abgeschreckt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese unter Verwendung eines 16 % Polyacrylamidsequenziergels, welches 7 M Harnstoff enthielt, aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 7 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass alle, „FANA", „SECx1" und „SECx2", in der Lage sind, Duplexe mit Target-RNA zu bilden, welche als Substrate für die Aktivität von humaner RNase HII dienen, wie durch das Verschwinden (Abbau) der Bande, welche der Target-RNA mit voller Länge entspricht, gezeigt wird (7). Eine Quantifizierung von rA₁₈, welches als eine Funktion der Zeit verbleibt, zeigt, dass die Geschwindigkeit der RNA-Spaltung größer ist, wenn das hybridisierte AON „SECx2" ist (8). Die beobachtete Reihenfolge ist „FANA-SECx2" > „FANA-SECx1" > „FANA", was zeigt, dass eine beispiellose Steigerung bei der zielgerichteten RNA-Spaltung auf den Eltern-FANA-Strang durch die Seconucleotidlinker (IIc) übertragen wird. Für die Butandioleinbringungen (Beispiel 5) wird der gleiche Trend beobachtet – d.h. eine verringerte Wärmestabilität, relativ zu allen FANA-Gegenstücken, jedoch eine gesteigerte RNase H-Aktivität. Folglich wird der Abfall bei der Schmelztemperatur, welcher durch die Linkereinbringungen verursacht wird, durch die beobachtete Geschwindigkeitssteigerung der Target-RNA, relativ zu allen FANA-Konstrukten, aufgewogen.
BEISPIEL 7
PDE-DNA gegen PDE-[DNA-X-DNA] (X = Butandiollinker = IIb, Y=Z = Sauerstoff und n = 4)
A. Homopolymersequenzen.
Oligonucleotide mit definierter Sequenz mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff, n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war Octadecariboadenylat (rA₁₈), komplementär zu der Sequenz der vorstehenden Oligonucleotide. Das Vermögen der vorstehenden Oligonucleotide zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, 15°C) enthielt, umfassten. Die Tests wurden wie vorstehend für Beispiel 4A beschrieben durchgeführt. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 9 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl „DNA"- als auch „DNA-BUT"-Oligomere in der Lage sind, Duplexe mit Target-RNA zu bilden, welche als Substrate für die Aktivität von humaner RNase HII dienen, wie durch die Abbauprodukte der Target-RNA in 9 gezeigt wird. Eine Quantifizierung von rA₁₈, welches als eine Funktion der Zeit verbleibt, zeigt, dass die Spaltungsgeschwindigkeit mit „DNA-BUT" wesentlich schneller (ca. 3-fach) ist als mit „DNA" (10).
B. Sequenz mit gemischtartigen Basen
Oligonucleotide mit definierter Sequenz mit 18 Einheiten in der Länge wurden in diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war r/GGGAAAGAAAAAAUAUAA) (SEQ ID Nr.: 28), genau komplementär zu der Sequenz der ersten zwei DNA-Oligonucleotide. Das dritte Oligonucleotid, CAT „DNA-Mismatch" enthält ein dC Mismatch an der Position 10. Das Vermögen von „DNA", „DNA-But" und „DNA-Mismatch" (CAT-Reihe) zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, 15°C) enthielt, umfassten. Die Tests wurden wie für Beispiel 4A vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die in TABELLE 1 gegebenen kinetischen Daten zeigen, dass alle DNA-Oligomere in der Lage sind, Duplexe mit Target-RNA zu bilden, welche als Substrate für die Aktivität von humaner RNase HII dienen. Eine Quantifizierung des RNA-Targets, welches als eine Funktion der Zeit verbleibt, zeigt, dass die Spaltungsgeschwindigkeit mit „DNA-BUT" wesentlich schneller ist als mit „DNA" oder „DNA-Mismatch" (3- beziehungsweise 4-fach; TABELLE 1).
BEISPIEL 8
Abzielen auf eine RNA mit höherem Molekulargewicht. Vergleich zwischen Phosphodiester FANA, FANA-X-FANA, DNA, Mismatch DNA und DNA-X-DNA (X = Butandiollinker = IIb, Y=Z = Sauerstoff und n = 4).
Die folgenden Phosphodiesteroligonucleotide mit 18 Einheiten in der Länge wurden bei diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war ein Polyribonucleotid mit 40 Nucleotideinheiten in der Länge. Ihre Basensequenzen sind von der natürlich vorkommenden Ha-Ras mRNA-Sequenz (abgeleitet von dem c-ras-Protoonkogen) abgeleitet. Das Vermögen von jedem der vorstehenden Oligonucleotide zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8) enthielt, umfassten. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von RNase H gestartet und bei 37°C durchgeführt. Zeitliche Aliquote wurden bei verschiedenen Zeitintervallen von jedem Inkubationsansatz genommen.
Für diese besondere Sequenz ist ein Anstieg beim Target-Abbau über Austauschen eines Deoxynucleotidrests in der DNA für einen Butandiollinker nicht ersichtlich (Oligomere XVIII und XIX, TABELLE 1 und 11). Dies ist jedoch nicht für die FANA-Konstrukte der Fall. Wie in allen vorstehenden Beispielen gezeigt, erhöht eine Substitution des Arabinofluornucleosidrests in Phosphodiester FANA mit einem flexibleren Butandiollinker die Aktivität von RNase HII. Tatsächlich schließt eine solche Substitution die Wirksamkeitslücke zwischen von FANA (k_rel 23,3) und DNA abgeleiteten (k_rel 33,8) Antisense-Verbindungen in bemerkenswerter Weise (TABELLE 1).
BEISPIEL 9
Abzielen auf RNA mit höherem Molekulargewicht. Vergleich zwischen PS-FANA, PS-[FANA-X-FANA], PS-DNA und PS-[DNA-X-DNA] (X = Butandiollinker = IIb, Y = Sauerstoff, Z = Schwefel und n = 4).
Die folgenden Phosphorothioatoligonucleotide mit 18 Einheiten in der Länge wurden bei diesen Experimenten verwendet:
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y = Sauerstoff, Z = Schwefel, n = 4 (Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war ein Polyribonucleotid mit 40 Nucleotideinheiten in der Länge. Ihre Basensequenzen sind von der natürlich vorkommenden Ha-Ras mRNA-Sequenz (abgeleitet von dem c-ras-Protoonkogen) abgeleitet. Das Vermögen von jedem der vorstehenden Oligonucleotide zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8) enthielt, umfassten. Die Umsetzungen wurden durch die Zugabe von RNase H gestartet und bei 37°C durchgeführt. Zeitliche Aliquote wurden bei verschiedenen Zeitintervallen von jedem Inkubationsansatz genommen.
Für diese besondere Sequenz ist ein Abfall beim Target-Abbau über Austauschen eines Deoxynucleotidrests in der DNA für einen Butandiollinker ersichtlich (TABELLE 1 und 12). Dies steht im Gegensatz zu dem, was für die auf FANA basierenden Konstrukte beobachtet wurde. In diesem Fall erhöht eine Substitution des Arabinofluornucleosidrests in PS-FANA mit einem flexibleren Butandiollinker die Aktivität der RNase HII (TABELLE 1).
BEISPIEL 10 Oligonucleotidkonstrukte, welche „schleifenbildende" acyclische Linker enthalten.
Der Rest X in den vorstehenden Sequenzen entspricht dem acyclischen Rest IIb, wobei Y=Z = Sauerstoff und n = 4 (oder Butandiollinker). Die verwendete Target-RNA war r(GGGAAAGAAAAAAUAUAA) (SEQ ID Nr.: 28), genau komplementär zu jeder der vorstehenden Sequenzen. Das Vermögen der Phosphodiester-gebundenen „FANA", „FANA-But" und „FANA-But-Schleife" (CAT-Reihe) zum Hervorrufen von RNase H-Abbau der Target-RNA wurde in Tests (10 μl Endvolumen) bestimmt, welche 1 pMol 5'-[³²P]-Target-RNA und 3 pMol Testoligonucleotid in 60 mM Tris-HCl, welches 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ (pH-Wert 7,8, 15°C) enthielt, umfassten. Die Tests wurden wie für Beispiel 4A vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die „FANA-But-Schleife"-Sequenz enthält vereinheitlichende Elemente von sowohl den „FANA"- als auch „FANA-But"-Oligonucleotiden. Diese bestehen aus einer lokalisierten flexiblen Stelle im Zentrum der Sequenz (ähnlich zu „FANA-But") sowie dem Vermögen dieses Oligonucleotids, vollständig mit der Target-RNA zu hybridisieren (ähnlich zu „FANA"). Als ein Ergebnis erstreckt sich der Schleifenlinker wahrscheinlich weg vom Duplexkern, um die Anzahl der Reste zu maximieren, welche Basenpaare zwischen dieser besonderen Sequenz und der RNA bilden. Durch das Hinauszwingen des Linkers aus der Helix in dieser Weise können einige der Wechselwirkungen zwischen der RNase H und den zwei Strängen durch Verringern der Anzahl an stabilen Kontakten zwischen dem Enzym und der Nebenfurche des Duplex zerstört werden. Überraschenderweise steigert diese Sequenz noch beträchtlich den RNA-Abbau (vergleichen sie die Oligomere XIII und XVII, TABELLE 1), was darauf hinweist, dass eine Flexibilität in dem Antisense-Strang für eine wirksame RNase H-Induktion wichtig ist, unabhängig davon, ob der flexible Linker direkt in oder entfernt von der Helixachse angeordnet ist.
Abkürzungen

ANA, Arabinonucleinsäurederivat (mit einem variablen 2'-Substituenten)
AON, Antisense-Oligonucleotid
BUT, 1,4-Butandioleinheit
DMSO, Dimethylsulfoxid
DNA, Deoxyribonucleinsäure
EC₅₀, wirksame Konzentration
EDTA, Ethylendiamintetraacetat
Et₂O, Diethylether
EtOAc, Ethylacetat
FAB-MS, Massenspektrometrie mit Ionisierung durch Atombeschuss
FANA, 2'-Deoxy-2'-fluorarabinonucleinsäure
HPLC, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
LCAA-CPG, langkettiges Alkylamin-kontrolliertes Porenglas
MBO, Oligonucleotid mit gemischtartigem Gerüst
MeOH, Methanol
NBA, p-Nitrobenzylalkohol-O-PNA-Monomer, NH₂-CH(CH₂-CH₂-Base)-CH₂-O-CH₂-CO₂H
PDE-DNA, Phosphodiester-gebundene DNA
PNA, Peptidnucleinsäure
PNA-Monomer, N-(2-Aminoethyl)glycineinheit, in welcher eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyllinker gebunden ist.
PS-DNA, Phosphorothioat-gebundene DNA
R_f, Retentionsfaktor
RNA, Ribonucleinsäure
RNase H, Ribonuclease H
SEC, Seconucleotideinheit
TEA, Triethylamin
THF, Tetrahydrofuran
T_m, Schmelztemperatur
DC, Dünnschichtchromatographie
Tol., Toluol

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Oligonucleotid der Struktur: [R¹-X]_a-R² Iawobei a eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist; R¹ oder R² unabhängig voneinander je wenigstens ein Nucleotid umfassen; X ein acyclischer Linker ist; und das Oligonucleotid wenigstens eines umfasst aus (i) wenigstens einem modifizierten Nucleotid und (ii) einer Chimäre; und worin das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ANA, PS-ANA, und die Chimäre ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PS-[ANA-DNA] und PS-[DNA-ANA] Chimären; und wobei ANA ist FANA.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei FANA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PDE-FANA und PS-FANA.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei der acyclische Linker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem acyclischen Nucleosid und einem nicht-nucleotidischen Linker.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 3, wobei das acyclische Nucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Purin- und Pyrimidin-Seconucleosiden.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 4, wobei das Purinseconucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Secoadenosine und Secoguanosin.
Oligonucleotid nach Anspruch 4, wobei das Pyrimidinseconucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Secothymidin, Secocytidin und Secouridin.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei der nicht-nucleotidische Linker einen Linker umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure und einem Aminosäurederivat.
Oligonucleotid nach Anspruch 7, wobei das Aminosäurederivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einem N-(2-Aminoethyl)-Glycineinheit in der eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyl-Linker (PNA-Monomer) gebunden ist; und (b) einer O-PNA-Einheit.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid die folgende Struktur aufweist:
, wobei m, n, q und a jeweils und unabhängig ganze Zahlen, größer oder gleich 1 sind; wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens ein Nucleotid sind; wobei Z¹ und Z² unabhängig voneinander je ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom, einer Aminogruppe und einer Alkylaminogruppe; wobei Y¹ und Y² je unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und NH; und wobei R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, einem Purin, einem Pyrimidin und Kombinationen davon.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 9, wobei das Purin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und Derivaten davon.
Oligonucleotid nach Anspruch 9, wobei das Pyrimidin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thymin, Cytosin, 5-Methylcytosin, Uracil und Derivaten davon.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens zwei Nucleotide umfassen, die eine Internucleotidbindung aufweisen, wobei die Internucleotid-Bindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat (5'N-3'P und 5'P-3'N) und Kombinationen davon.
Oligonucleotid nach Anspruch 9, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander FANA umfassen.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 9, wobei das Oligonucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

wobei n, a, R¹, R², Z¹, Z², Y¹ und Y² definiert sind wie in Anspruch 9 und wobei R⁴ und R⁵ je unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Purin und Pyrimidin.
Oligonucleotid nach Anspruch 14, wobei das Purin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und Derivaten davon.
Oligonucleotid nach Anspruch 14, wobei das Pyrimidin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thymin, Cytosin, Uracil und Derivaten davon.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei R¹ und R² FANA sind und wobei a = 1 ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei R¹ [FANA-DNA] ist, wobei R² [DNA-FANA] ist und wobei a = 1 ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei R¹ [FANA-DNA] ist, R² FANA ist und wobei a = 1 ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei R¹ FANA ist, wobei R² [DNA-FANA] ist und wobei a = 1 ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 14, wobei R¹ FANA ist; wobei R² PS-FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur Π b aufweist, in der Y¹, Y², Z¹ und Z² Sauerstoff sind und n = 4 ist.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 14, wobei R¹ PS-FANA ist; wobei R² FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur Π b aufweist, in der Y¹, Y², Z² Sauerstoff und Z¹ Schwefel sind und n = 4 ist.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 14, wobei R¹ PS-FANA ist; wobei R² FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIc aufweist.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 14, wobei R¹ FANA ist, wobei R² PS-FANA ist; wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIc aufweist.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei a = 2 ist und R¹ und R² je unabhängig voneinander aus mindestens drei Nucleotiden bestehen.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 25, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander aus 3 bis 8 Nucleotiden bestehen.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei a = 3 ist, und R¹ und R² je unabhängig voneinander aus wenigstens zwei Nucleotiden bestehen.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 27, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander aus 2 bis 6 Nucleotiden bestehen.
Oligonucleotid gemäß einem der Anspruch 1 bis 28, wobei das Oligonucleotid antisense zu einer Target-RNA ist.
In-vitro-Verfahren zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reverse Transkription oder Replikation einer Target-RNA in einem System, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Target-RNA mit dem Oligonucleotid gemäß Anspruch 29.
In-vitro-Verfahren zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reverse Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System, umfassend: a) Inverbindungbringen der Target RNA mit dem Oligonucleotid nach Anspruch 29; und b) Geschehexilassen der RNA-Spaltung der Target RNA.
In-vitro-Verwendung eines Oligonucleotids gemäß Anspruch 29 zur Verhinderung oder Vermeindung der Translation, Reverse Transkription und/oder Replikation einer Target-RNA in einem System.
Verkaufsfähige Zusammenstellung umfassend das Oligonucleotid gemäß Anspruch 29 zusammen mit Gebrauchsanweisungen zur Verhinderung oder Verminderung der Translation, Reverse Transkription und/oder Replication einer Target-RNA in einem System
Das Oligonucleotid gemäß Anspruch 29 zur Verwendung als antisense-Medikament.
Verfahren zur Steigerung der RNase H-Induktionsaktivität eines Oligonukleotids umfassend Einbau eines acyclischen Linkers in das Oligonucleotid, wodurch ein Oligonucleotid erhalten wird der Struktur: [R¹-X]_a-R² Iawobei a eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist; wobei R¹ oder R² unabhängig voneinander wenigstens 1 Nucleotid umfassen; wobei X ein acyclischer Linker ist; und das Oligonucleotid wenigstens eines umfasst aus (i) wenigstens einem modifizierten Nucleotid und (ii) einer Chimäre; und worin das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ANA, PS-ANA, RNA, PS-RNA, PDE- oder PS-RNA-Analoga, locked Nucleinsäuren (LNA), Phosphorodiamidatmorpholinonucleinsäuren, N3'-P5'-Phosphoroamidat DNA, Cyclohexennukleinsäuren, alpha-L-LNA, Boranophosphat-DNA, Methylphosphonat-DNA und Kombinationen daraus, und wobei die Chimäre ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA-DNA- und DNA-RNA-Chimären, PS-[RNA-DNA]- und PS-[DNA-RNA]-Chimären, PS-[ANA-RNA]- und PS-[DNA-ANA]-Chimären.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 35, worin ANA ist FANA.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 36, wobei FANA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PDE-FANA und PS-FANA.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 35, wobei die PDE- oder PS-RNA Analoga ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2'-modifizierter RNA, wobei der 2'-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Alkylalkoxy, F und Kombinationen daraus.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der acyclische Linker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem acyclischen Nucleosid- und einem nicht-nucleotidischen Linker.
Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei das acyclische Nucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Purin und Pyrimidinseconucleodide.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei das Purinseconucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Secoadenosin und Secoguanosin.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei das Pyrimidinseconucleosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Secothymidine, Secocytidine und Secouridine.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der Nicht-nucleotidische Linker einen Linker umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure und einem Aminosäurederivat.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei das Aminosäurederivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer N-(2-Aminoethyl)glycineinheit, in der eine heterocyclische Base über einen Methylencarbonyllinker (PNA Monomer) angebunden ist; und (b) einer O-PNA-Einheit.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Oligonucleotid die folgende Struktur aufweist:
, wobei m, n, q und a jeweils und unabhängig ganze Zahlen sind, größer oder gleich 1; wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens ein Nucleotid sind; wobei Z¹ und Z² unabhängig voneinander je ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom, einer Aminogruppe und einer Alkylaminogruppe; wobei Y¹ und Y² je unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel und NH; und wobei R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxy, einem Purin, einem Pyrimidin und Kombinationen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei das Purin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und Derivaten davon.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Pyrimidin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thymin, Cytosin, 5-Methylcytosin, Uracil und Derivaten davon.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander wenigstens zwei Nucleotide umfassen, die eine Internucleotidbindung aufweisen, wobei die Internucleotid-Bindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat (5'N-3'P und 5'P 3'-N) und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander ANA umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 49, wobei ANA einen 2'-Substiuenten umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluor-, Hydroxyl-, Amino-, Azido-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl- und Alkoxygruppen.
Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei der 2'-Substituent Fluor ist und ANA ist FANA.
Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei die Alkylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylgruppen.
Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei die Alkoxygruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- und Methoxyethoxygruppen.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei das Oligonucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

wobei n, a, R¹, R², Z¹, Z², Y¹ und Y² definiert sind wie in Anspruch 45 und wobei R⁴ und R⁵ je unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Purin und Pyrimidin.
Verfahren nach Anspruch 54, wobei das Purin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und Derivaten davon.
Verfahren nach Anspruch 54, wobei das Pyrimidin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thymin, Cytosin, Uracil und Derivaten davon.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei R¹ und R² FANA sind und wobei a = 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei R¹ [FANA-DNA] ist, wobei R² [DNA-FANA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei R¹ [FANA-DNA] ist, R² FANA ist, und wobei a = 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei R¹ FANA ist, wobei R² [DNA-FANA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei R¹ [RNA-DNA] ist; R² [DNA-RNA] und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ [RNA-DNA] ist, wobei R² RNA ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ RNA ist, R² [DNA-RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-[(2'O-Alkyl)RNA-DNA] ist, wobei R² S-[DNA-(2'O-alkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-[(2'-O-Alkyl)RNA-DNA] ist, wobei R² S [(2'O-Alkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-[2'O-Alkyl)RNA ist, ist R² S-[DNA-(2'-O-Alkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-[(2'-O-Alkoxyalkyl)RNA-DNA] ist, wobei R² S-[DNA-(2'O-Alkoxyalkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-[(2'O-Alkoxyalkyl)RNA-DNA] ist, wobei R² S-[(2'-O-Alkoxyalkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei R¹ S-((2'-O-Alkoxyalkyl)RNA] ist, wobei R² S-[DNA-(2'-O-Aikoxyalkyl)RNA] ist und wobei a = 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei R¹ FANA ist, wobei R² PS-FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIb hat, in der Y¹, Y², Z¹ und Z² Sauerstoff sind und n = 4 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei R¹ PS-FANA ist; wobei R² FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIb aufweist, in der Y¹, Y², Z² Sauerstoff und Z¹ Schwefel sind und n = 4 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei R¹ PS-FANA ist; wobei R² FANA ist, wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIc aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei R¹ FANA ist, wobei R² PS-FANA ist; wobei a = 1 ist und wobei das Oligonucleotid die Struktur IIc aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei a = 2 ist und R¹ und R² je unabhängig voneinander aus mindestens drei Nucleotiden bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 74, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander aus 3 bis 8 Nucleotiden bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei a = 3 ist, und R¹ und R² je unabhängig voneinander aus wenigstens zwei Nucleotiden bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 76, wobei R¹ und R² je unabhängig voneinander aus 2 bis 6 Nucleotiden bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei das Oligonucleotid antisense zu einer Target-RNA ist.