JP2000507928A - ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生体可逆性リン酸ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドのためのプロドラッグとして用いることができる。生体可逆性ブロッキング基は、細胞内酵素、特にカルボキシエステラーゼにより除去されて、保護されていないオリゴヌクレオチドを生成することができる。オリゴヌクレオチドは合成後アルキレーション反応を通してまたはアミダイト種の化学を利用することにより製造できるが、その際、生体可逆性保護基はアミダイト試薬の完全な一部として形成される。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法 関連出願に対するクロスリファレンス 本発明は、１９９６年１月７日出願の出願番号第０８／５４５，７８５号およ び１９９４年１１月２３日出願の出願番号第０８／３４３，４３３号の一部継続 出願である１９９６年６月８日出願の出願番号第０８／６５８，５０９号のこれ も係属出願である１９９６年１２月３０日出願の“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏ ａｔｅ Ｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｍｉｄｉｔ ｅｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”という名称の米 国特許出願の一部係属出願である。前記各特許出願は本願出願人の出願になるも ので、参照として本明細書に組み込まれる。 発明の分野 本発明はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ） が細胞内酵素によって除去しうる保護基で保護されている保護形態のオリゴヌク レオチドの合成および使用に関する。さらに本発明はこれらオリゴヌクレオチド を調製するためのアミダイト試薬に関する。さらに本発明には、プロドラッグ形 態からオリゴヌクレオチドを遊離させるために細胞間酵素によって切断すること ができるある官能基で修飾されているプロドラッグ形態のオリゴヌクレオチドお よびキメラオリゴヌクレオチドも包含される。本発明のオリゴヌクレオチドは、 ｍＲＮＡの標的鎖と相補的な公知の配列を有するように調製することができる。 本発明の化合物は治療、診断用および研究用試薬として有用である。 発明の背景 オリゴヌクレオチドが一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子とハイブリッド形成す ることは公知である。ハイブリッド形成は標的ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸塩基に 対するオリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列特異的塩基対水素結合である。この ような核酸塩基対は相互に相補的であるといわれる。 オリゴヌクレオチドの相補性は多くの細胞標的の抑制に用いられている。この ような相補的オリゴヌクレオチドは通常アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ば れる。Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＢｅｎｎ ｅｔｔ，Ｃ．Ｆ.，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ． １９９６，３６，１０７−１２９を含むこれら研究結果を記載する種々の概説が 出版されている。これらオリゴヌクレオチドは非常に強力な研究用ツールであり かつ診断薬剤であることが証明されている。さらに、有効であることが認められ ているあるオリゴヌクレオチドは現在ヒトの臨床試験中である。 アンチセンス治療は標的ＲＮＡまたはＤＮＡに対する相補的配列を有するオリ ゴヌクレオチドの使用を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡま たはＤＮＡと結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡまたは ＤＮＡと結合する際に、これら核酸の遺伝的発現を選択的に阻止するか、または 標的ＲＮＡもしくはＤＮＡの分解または遺伝的発現活性化のような二三の他の事 象を誘発することができる。 標的ＲＮＡの分解はＲＮアーゼＨの活性化によって生じさせることができる。 ＲＮアーゼＨはＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼ である。ＤＮＡの複製において役割を果たすと考えられるこの酵素は、無細胞系 のみならずアフリカツメガエル卵母細胞においてＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ 成分を切断することができることが判明している。 ＲＮアーゼＨはアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造変化に対して極めて敏 感である。ＲＮアーゼＨを活性化するにはＤＮＡ：ＲＮＡ構造を形成させなけれ ばならない。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを活 性化するには少なくとも１部のオリゴヌクレオチドがＤＮＡ様（ＤＮＡ ｌｉｋ ｅ）でなければならない。ＤＮＡ様であるためには、オリゴヌクレオチド中のヌ クレオチドの糖類が２’−デオキシ構造を有し、またオリゴヌクレオチドのホス フェート結合が負電荷を有することが必要である。これら２つの位置のいずれか におけるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分の化学修飾がもはやＲＮアーゼＨの基 質ではないオリゴヌクレオチドをもたらした。 しかし、２’−デオキシヌクレオチドは対応するリボヌクレオチドに対して同 じリボヌクレオチドよりも結合する親和力が弱く、すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ結合 はＤＮＡ：ＲＮＡ結合よりも強く、また負電荷の存在がアンチセンスオリゴヌク レオチドの細胞内取り込みの減少に寄与すると考えられている。したがって、Ｄ ＮＡ様オリゴヌクレオチドの制約を阻止するために、ＤＮＡ様中心部分の両側に 他の種類のヌクレオチドを有する大きなオリゴヌクレオチドの中心として、２’ −デオキシヌクレオチドおよび負電荷ホスフェート結合を有するＤＮＡ様中心部 分が包含されるキメラオリゴヌクレオチドが合成されている。中心部分は、オリ ゴヌクレオチドを標的ＲＮＡに結合する際にＲＮアーゼＨを活性化させるために ある大きさを有しなければならない。 したがって、化合物の安定性や細胞内取込みのような特性を改善するための化 学修飾を取り入れるだけでなくＲＮアーゼＨを含むアンチセンス化合物の作用の それぞれの公知の機構による標的ＲＮＡの調節にも利用できる修飾アンチセンス 化合物に対する永続的な強烈な思いの要望が依然として存在する。このような標 的ＲＮＡの調節は、生体内外いずれの治療目的のみならず診断用試薬ならびに細 胞内及び生体内の事象を研究するための試薬を含む研究用試薬としても有用であ ろう。 発明の要約 本発明は、すぐれた化学的および生物物理学的特性を備えた、生体内で可逆性 の（ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）保護基を有するオリゴヌクレオチドに関する 。生体可逆性保護基はオリゴヌクレオチドに対してさらにヌクレアーゼ耐性を与 える。この生体可逆性保護基は内因性酵素によって細胞内、細胞サイトゾル内、 または生体外のサイトゾル抽出物内で除去される。本発明のある好ましいオリゴ ヌクレオチドにおいては、生体可逆性保護基がカルボキシエステラーゼによる切 断によって無保護のオリゴヌクレオチドを生成するように意図される。 本発明は構造Ｉ： の少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドに関する。 該オリゴヌクレオチドにおいて、Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたはＳとして選ぶ ことができ、Ｒ₁およびＲ₂は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと して選ばれ、ｎは１ないし６であり、ｗはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、 またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）として選ばれ、Ｚはヒドロ カルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、Ｙ₇はＯまたはＳであり、またＲ₅、 Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである。 構造Ｉの好ましいオリゴヌクレオチドでは、ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、また はＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であるように選ばれる。構造Ｉの 他の好ましいオリゴヌクレオチドでは、ｎが２ないし４であるように選ばれ、と くに２が好ましい。 構造Ｉのある好ましいオリゴヌクレオチドでは、ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルであ る。さらに好ましい群では、ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである。Ｚがｔ−ブチルおよ びメチルである化合物がとくに好ましい。Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は好ましくはＣ₁ −Ｃ₂₀アルキル、より好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、さらにより好ましくはメチ ルである。 また本発明は構造II： の上記オリゴヌクレオチド化合物の調製用前駆物質として有用なアミダイト化合 物に関する。該アミダイト化合物では、Ｐｇがヌクレオチド遮断基、Ｂが複素環 式塩基、Ｙ₁がＳでＹ₂がＯもしくはＳであるかまたはＹ₁がＯでＹ₂がＳであり、 Ｒ₃およびＲ₄が独立してヒドロカルビルであるかまたはＲ₃とＲ₄が共に窒素複素 環式環の一部であり、ＱがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキル 、 ｎが１ないし６、ＷがＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇ ）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）、Ｚがヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビ ル、ＸがＯ、Ｓ、またはＣＨ₂、Ｙ₇がＯまたはＳ、またＲ₅、Ｒ₆、およびＲ₇が 独立してヒドロカルビルである。 構造IIの好ましいアミダイト化合物では、ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−ＺまたはＳ −Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であるように選ばれる。構造IIの他 の好ましいオリゴヌクレオチドでは、ｎが２または４であるように選ばれ、とく に２が好ましい。 構造IIのさらに好ましいアミダイト化合物では、ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルであ る。さらに好ましい群ではＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである。Ｚがｔ−ブチルおよ びメチルである化合物がとくに好ましい。Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇が好ましくはＣ₁ −Ｃ₂₀アルキル、より好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、さらにより好ましくはメチ ルである。 構造IIのこれ以外の好ましいアミダイト化合物では、Ｂがアデニン、グアニン 、シトシン、ウラシルもしくはチミンのようなプリンまたはピリミジンであり、 またＰｇはトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメ トキシトリチルから選ばれる。Ｂが環外（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ）窒素原子（たと えばアデニン、グアニン、またはシトシンのような）を含む場合には、Ｂは好ま しくはそれと共役結合し、塩基性条件下で除去可能な保護基をも有する。代表的 な保護基にはペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオキシ カルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタンス ルフェニル基が含まれる。Ｐｇがジメトキシトリチルである化合物がとくに好ま しい。構造IIの他の好ましいアミダイト化合物では、Ｒ₃およびＲ₄がそれぞれ独 立してＣ₁−Ｃ₁₀アルキルであるように選ばれる。構造IIのとくに好ましいアミ ダイト化合物では、Ｒ₃およびＲ₄がそれぞれイソプロピルであるように選ばれる 。 構造IIのアミダイト化合物のさらに好ましい群では、Ｙ₁がＯでＹ₂がＳである ように選ばれる。構造IIの他の好ましいアミダイト化合物では、Ｙ₁がＳでＹ₂が Ｏであるように選ばれる。また構造IIのさらに好ましいアミダイト化合物では、 両方のＹ₁がＳであるように選ばれる。 構造IIの好ましいデオキシアミダイト化合物ではＱがＨである。構造IIのさら に好ましいアミダイト化合物では、ＱがＣ₁−Ｃ₂₀Ｏ−アルキルであるように選 ばれ、構造IIのこれ以外の好ましいアミダイト化合物では、ＱがＦであるように 選ばれる。 本発明のさらに好ましいアミダイト化合物は構造III： の化合物であり、式中、Ｐｇはヌクレオシド遮断基、Ｂは複素環式塩基、Ｙ₁は ＳでＹ₂はＯもしくはＳであるかまたはＹ₁がＯでＹ₂がＳ、ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、 Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキル、Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカ ルビル、ＸはＯ、Ｓ，またはＣＨ₂、Ｙ₇はＯまたはＳ、またＲ₅、Ｒ₆およびＲ₇ は独立してヒドロカルビルである。 また本発明は構造： を有する担体担持シントンを提供し、式中、Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたはＳ 、Ｒ₁はヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド、Ｒ₂はＬ_P−（Ｐ）(式中、Ｌ_P は光に不安定なリンカー、また（Ｐ）は固相担体)、ｎは１ないし６、ＷはＳ− Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（ Ｒ₇）、Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビル、Ｙ₇はＯまたはＳ、また 、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである。好ましい態様ではＬ_P は、 Ｙ₃−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｙ₄−Ｐ（＝Ｙ₅）(Ｙ₆−Ｒ₁₀)−ＮＨ であり、式中、Ｙ₃、Ｙ₄、Ｙ₅、およびＹ₆は独立してＯまたはＳ、Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀ アリール、ｑは１−７、またＲ₁₀はＨまたは非塩基性もしくは非求核性条件下 で除去しうる保護基である。 さらに別の態様では本発明は、本発明の化合物を調製するのに有用な機能的固 相担体を提供する。好ましい態様では、該固相担体は式：Ｒ₁₁−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₉ ）−（ＣＨ₂）_q−Ｏ−Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ−Ｒ₁₀)−ＮＨ−（Ｐ）を有する化合物を 有し、式中Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリール、ｑは１−７、Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性また は非求核性条件下で除去しうる保護基、Ｒ₁₁は酸に不安定な保護基、また（Ｐ） は固相担体である。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の特定の例示的アミダイト化合物の化学的図解により示される 製造法であり； 図２は、本発明の特定の例示的オリゴヌクレオチド化合物の化学的図解により 示される製造法であり； 図３は、本発明の特定のオリゴヌクレオチド化合物を例示する。 図４は、化合物ＩＶ−７の合成ルートを示す。 図５は、化合物ＩＶ−７の使用のための合成ルートを示す。 図６は、本発明によるホスホルアミダイト試薬への合成ルートを示す。 詳細な説明 本発明は、生体内で可逆性の保護基を有する新規なオリゴヌクレオチドに関す る。生体内で可逆性の保護基は、オリゴヌクレオチドの特定の高められた化学特 性および生物物理特性に寄与し、エキソ−およびエンドヌクレアーゼ分解に対す る耐性を含む。 オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、通常は公知のｍＲＮＡ配列であるそれらの 標的とワトソン−クリック塩基対合形成することにより遺伝子発現を特異的に阻 害する新規な群の化合物を代表する。ｍＲＮＡへの結合後、遺伝子産物発現のダ ウン制御が生じる。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈ ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃ ｔ ｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｅｒｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，８ ９(１９９２)。第１に合成されたオリゴヌクレオチド、即ち、ホスホジエステル 結合されたオリゴヌクレオチドの使用は、これらの化合物の欠損ヌクレアーゼ耐 性（lack nuclease resistance）により限定された。ヌクレアーゼ耐性は主に修 飾オリゴの使用により解析された。Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｆ.，ｅｔ ａｌ.， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.，１９９１，３６，１９２３；Ｖａrｍａ，Ｒ．Ｓ.，Ｓ ｙｎｌｅｔｔ，１９９１，６２１；Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ.，ｅｔ ａｌ.，Ｃｈｅ ｍ．Ｒｅｖ.，１９９０，９０，５３４。 ホスホジエステル並びにホスホロチオエートは両者ともポリアニオン性であり 活性なプロセス（吸着エンドサイトーシスおよび／または流体相エンドサイトー シス）により細胞内に入り、そしてこの取り込みは異なる細胞種により変化する ことが報告された。中性のメチルホスホノジエステルオリゴは、エネルギー依存 性でもある異なる機構により細胞内に入ることが報告された。Ｓｐｉｌｌｅｒ， Ｄ．Ｇ.，ｅｔ ａｌ.，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１ ９９１，７，１１５。細胞内へのオリゴヌクレオチドの浸透に関する特定の増加 は、ポリＬ−リジン、コレステロールまたは他の類似の部分（ｍｏｉｅｔｙ）に よりオリゴを誘導するか、またはリポソーム内への封入により達成された。 本発明の一つの側面は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを助けるための更 なるアプローチに向けられる。このアプローチにおいて、プロドラッグ戦略が利 用されたが、但し、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチ オエートオリゴヌクレオチドのリン酸基少なくともいくつかに生体内可逆性基を 導入することによりこれらオリゴマーの陰性電荷を一時的にマスクするプロオリ ゴヌクレオチドを形成する。その結果得られる中性プロオリゴは、ヌクレアーゼ に対して酵素学上安定であることが見いだされた。我々は理論に拘束されたくな いが、我々は、これによりオリゴヌクレオチドがその中に埋まるようになる場合 にエンドソームから逃れさせ、そしてそれらオリゴヌクレオチドの投与ルートに 関して全く異なった生物学上の利用パターンを提示することになると信ずる。こ のアプローチの必要条件は、生体内可逆性基が培養培地中で安定性を有し、且つ 生物の流体中よりもサイトゾル中におけるより大きな酵素活性の存在のために、 取り込み後の選択的細胞内加水分解を有するように選択されなければならないこ とである。 本発明は、細胞膜浸透並びにインビボにおけるエキソ−およびエンドヌクレア ーゼ分解に対しての耐性に関する高められた化学特性並びに生物物理学特性を有 する生体内可逆性保護基を有するオリゴヌクレオチドに向けられる。本発明の特 定の好ましい態様において、生体内可逆性保護基は内在性カルボキシエステラー ゼにより細胞のサイトゾルに除去されることにより、特定の核酸またはペプチド にハイブリダイズするかおよび／または親和性を有し、即ち内在性および／また は病原性の生物分子に相互作用可能な生物学上活性なオリゴヌクレオチド化合物 を生じる。 他に定義されない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語並びに科学用 語は、発明の属する分野の当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する 。本明細書にて言及された全ての出版物および特許は、引用により編入される。 本明細書にて使用されるオリゴヌクレオチドは、リボ（ＲＮＡ）またはデオキ シリボ(ＤＮＡ)、あるいは混合されたリボ−デオキシリボのシリーズ中のＤＮＡ またはＲＮＡポリヌクレオチドを示す。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチ ドは、複数のヌクレオチドの結合により形成される。本発明の好ましいオリゴヌ クレオチドは、少なくとも一つの生体内可逆性保護基を有することにより、ヌク レオチド内部の結合を保護する。本発明に従う好ましいオリゴヌクレオチドは、 好ましくは約５から約５０ヌクレオシドサブユニットからなる。より好ましくは 、本発明のオリゴヌクレオチドは約１５から約２５ヌクレオシドサブユニットか らなる。認識されるとおり、「ヌクレオシドサブユニット」は、オリゴヌクレオ チド中でリンの結合を通して隣接する糖に適切に結合した核酸塩基と糖の組み合 わせである。これに関連して、「ヌクレオシドサブユニット」は、用語「ヌクレ オシドユニット」または「ヌクレオシド」と交換可能なように使用される。ヌク レオシドは、糖部分と複素環式塩基部分から形成される。本明細書において使用 されるとおり、用語ヌクレオシドは、ヌクレオシド成分を記載する際には複素環 式塩基と交換可能なように使用される。ヌクレオチドは、その中に含まれるリン 酸部分を有するヌクレオシドを意味するようにそれらの通常の感覚で使用される 。 本発明の化合物のヌクレオシド構造のサブユニットを製造する用途に関して、 これらのヌクレオシドサブユニットに取り込まれるための適切な核酸塩基は、プ リンおよびピリミジン、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウリジン、およ びチミン、並びに他の合成および天然の核酸塩基、例えばキサンチン、ヒポキサ ンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他の アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘 導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシ ン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル(シュードウラシ ル)、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロ キシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルお よび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンを包含する。さ らに、プリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号に開示され たもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁、Ｋｒｏ ｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ.，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９ ９０に開示されたもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃ ｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０， ６１３に開示されたものを包含する。これらの核酸塩基の特定のものは、本発明 のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらは、 ５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ−６およびＯ−６ 置換プリンを包含し、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルお よび５−プロピニルシトシンを含む。他の修飾ピリミジンおよびプリン塩基も、 オリゴマー化合物の核酸相補鎖への結合親和性を増大させることが期待される。 本発明のヌクレオシドユニットの核酸塩基は、保護基、例えば標準のオリゴヌ クレオチド合成において通常用いられるものにより保護されうる。典型的な核酸 塩基のブロッキング基は、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ.， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１およびＢｅａｕ ｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３ ，４９，６１２３−６１９４において広く論評された。 本発明のヒドロカルボニル基は、脂肪族基、脂環基およびアリール基を含む。 これらは、様々な置換基によりさらに置換されうる。 本発明における使用に適した脂肪族基および脂環状基は、限定されないが、飽 和および未飽和の、直鎖および側鎖の脂環式、置換および未置換のアルキル、ア ルケニルおよびアルキニル基を含み、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン チル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル 、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オ クタデシル、ノナデシル、エイコシルおよび他の高級炭素直鎖アルキル基；２− メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、 ３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６ −プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３ −メチルペンチル、２−エチルヘキシルおよび他の側鎖基；ビニル、アリル、ク ロチル、プロパルギル、２−ペンテニルおよび他の未飽和基；およびシクロヘキ サン、シクロペンタン、アダマンタン並びに他の脂環基を包含する。好ましい化 合物は、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルケンおよびＣ₁−Ｃ₂₀アルキンであ る。最も好ましいのは、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルである。特に好ましいのは、メチルお よびｔ−ブチルである。 本発明の使用のために適しているアリール基は、限定されないが、フェニル、 トリル、ベンジル、ナフチル、アントラシル、フェナントリルおよびキシリルを 包含する。 上記の脂肪族基、脂環式基およびアリール基は、限定されないが、ハロゲン( Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ)、ヒドロキシル(ＯＨ)、チオール(ＳＨ)、ケト(Ｃ＝Ｃ)、カル ボキシル(ＣＯＯＨ)、トリフルオロメチル(ＣＦ₃)、トリフルオロメトキシ(ＯＣ Ｆ₃)、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ−アルキル、Ｎ−ジアルキル、Ｏ−ア ラルキル、Ｓ−アラルキル、ＮＨ−アラルキル、アミノ(ＮＨ₂)、およびニトロ （ＮＯ）を包含する。好ましいヒドロカルボニル置換基は、エーテル置換体、例 えばメトキシ置換体を包含する。 細胞への使用のための特に有用なオリゴヌクレオチドに関して、オリゴヌクレ オチドはヌクレアーゼに対して当然に安定であることにより、細胞の標的核酸と 相互作用するのに十分な時間細胞内で生き残らなければならない。よって、本発 明の特定の態様において、特定のヌクレオシドサブユニットまたはヌクレオシド 間はオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させるために機能させるかま たは選択される。しかしながら、細胞以外の用途、例えば研究試薬としておよび 診断剤としての本発明のオリゴマー化合物の使用に関しては、そのようなヌクレ アーゼ安定性は必要ない。 オリゴヌクレオチドの更なる有用な特性は結合親和性である。第１の核酸の相 補核酸に対する結合親和性の程度を決定する際には、第１核酸の相補核酸への結 合に関する相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を決 定することにより比較してよい。融解温度（Ｔ_m）は二本鎖核酸の物理特性であ り、５０％のらせん（ハイブリダイズした）対コイル（ハイブリダイズしていな い）の形成が存在する温度（摂氏）を示す。ＵＶスペクトルを用いてＴ_mを測定 することにより、ハイブリダイゼーション複合体の形成と分解（融解）を測定す る。ハイブリダイゼーションの間に起こる塩基の堆積は、ＵＶ吸収の低下（浅色 効果）により達成される。結果として、ＵＶ吸収の低下はより高いＴ_mを示す。 Ｔ_mが高ければ高いほど、鎖の間の結合強度は強くなる。 オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改良するための一つの方法は、オリ ゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドを接続するリン酸結合を修飾すること である。そのような修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチ ルホスフェート、アルキルホスフェート、ホスホルアミダイト、ホスホトリエス テルおよび他の類似の修飾を包含する。 ヌクレアーゼ耐性を増大させるための更なる方法は、オリゴヌクレオチドのヌ クレオチドの少なくともいくつかの２’位における置換の含有による。そのよう な２’置換は、いくつかの例においては、標的ＲＮＡのためのオリゴヌクレオチ ドの結合親和性を改良することにも作用する。特に有用な２’−置換体は２’− Ｏ−アルキル置換体である。この群のより小さなメンバーは結合親和性の増大に 貢献するが、より大きなメンバーはヌクレアーゼ安定性の増大に貢献する。結合 親和性の増大のためのさらなる特に有用な２’−置換基は、２’−フルオロ基で あり、公表された研究：(Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ２’−ｄＲＩＢＯ−Ｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ，ＦＬ，１９９１年 １月１３日)において示されたとおりである。 本発明は、細胞膜浸透のための高められた化学特性および生物物理特性並びに エキソ−およびエンドヌクレアーゼ分解に対する耐性に貢献する生体内可逆性保 護基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。 本発明は、さらに、生体内可逆的に保護されたオリゴヌクレオチドの合成のた めのアミダイト試薬を提供する。本発明による合成方法はホスホジトリエステル 基が加水分解する感受性のために塩基性または求核性条件を避けなければならな いので、非塩基性または非求核性条件下で除去可能な保護基を有する核酸塩基を 含むアミダイト試薬を使用するべきである。さらに、これらの保護基は全合成過 程の間安定であるべきである。莫大なそのような保護基が当業者には知られてい る(例えば、ＧｒｅｅｎｅとＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク、１９９１を参照されたい)。代表的なアミン保護 基は、ペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオキシカルボ ニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタンスルフェ ニル基を包含する。 本発明により、固相支持体からのオリゴヌクレオチドの解放を作用させるため の塩基の使用は光不安定性のリンカーを用いることにより回避できることが見い だされた。好ましい態様において、支持体に結合したオリゴヌクレオチドは構造 Ｉを有するが、但しＲ₂はＬ_p−（Ｐ）であり、Ｌ_pは光不安定性リンカーであり 、そして（Ｐ）は固相支持体である。好ましい態様において、Ｌ_pは、構造 Ｙ₃-ＣＨ（Ｒ₉）-（ＣＨ₂）_q−Ｐ（＝Ｙ₅）(Ｙ₆−Ｒ₁₀)−ＮＨ−を有し、構造 ： Ｒ₁₁-Ｏ-ＣＨ（Ｒ₉）-（ＣＨ₂）_q-Ｏ-Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ-Ｒ₁₀)-ＮＨ-（Ｐ） を有する試薬とヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとの反応を通して、本発 明の化合物に導入されるが、式中、Ｙ₃，Ｙ₄，Ｙ₅およびＹ₆は独立に、Ｏまたは Ｓであり、Ｒ₉は光不安定性基、例えばニトロ置換されたＣ₆−Ｃ₂₀アリール基で あり、ｑは１−７であり、Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性または非求核性条件下で除去 可能な保護基、例えばシアノエチル、Ｃ₁−Ｃ₂₀のアルキルまたはＣ₆−Ｃ₂₀のア リールであり、そしてＲ₁₁は酸不安定性保護基、例えばメトキシトリチル、ジメ トキシトリチルまたはピクシルである。本発明による固相支持体は、制御された 穴のガラス(ＣＰＧ)、オキサリル制御されたガラス(例えば、Ａｌｕｌ，ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１，１９，１ ５２７を参照されたい)、テンタゲル（Tentagel）支持体--アミノポリエチレン グリコール誘導支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ.，Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３，３４，３３７３を参照されたい）または ポロス（Poros）--ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを包含する。 結合する部分に関する典型的な合成法並びにそのオリゴヌクレオチド合成にお ける使用を、図４および図５に示す。 生体内可逆性保護基を有する本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書におい てはプロ−オリゴヌクレオチドとも呼ばれる。本発明の好ましい態様において、 本発明のプロ−オリゴヌクレオチドは、インビボにおいて改良された細胞脂質二 重膜浸透の可能性並びにエキソ−およびエンドヌクレアーゼ分解に対する耐性の 見込みがある。細胞内では、生体内可逆性保護基は内在性カルボキシエステラー ゼにより細胞のサイトゾル中へ除去されて、特定の核酸にハイブリダイズするこ とができ、および／または特定の核酸に親和性を有する生物学上活性なオリゴヌ クレオチド化合物を生じる。 本発明は、天然組成物のオリゴヌクレオチド、即ちホスホジエステルオリゴヌ クレオチドの治療における使用においての主要な問題、即ち、１）偏在する傾向 にあるヌクレアーゼによる分解による、それらの極めて短い生物学上の半減期、 および２）オリゴが脂質細胞膜を通過するのを極めて困難にする、それらの固有 の陰性電荷性およびの親水性の性質を和らげる。 本明細書にて実施されるとおり、プロ−オリゴヌクレオチドは、合成ＤＮＡま たはＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドであるか、またはその発現をブロ ックするかまたはダウン制御するように特別にデザインされた遺伝子またはＲＮ Ａメッセンジャーに属する標的配列の相補配列の混合分子であってよい。アンチ センスオリゴヌクレオチドは、標的メッセンジャーＲＮＡ配列あるいは標的ＤＮ Ａ配列に向けられてよく、そして相補な核酸にハイブリダイズする。したがって 、これらの分子は、効果的に遺伝子発現をブロックするかまたはダウン制御する 。 プロ−オリゴヌクレオチドは、特定の二重鎖ＤＮＡ領域（プリン／ピリミジン が豊富な一つまたは複数のホモプリン／ホモピリミジン配列）であってもよく、 即ち三重鎖を形成する。特定の配列における三重鎖の形成は、遺伝子発現を制御 するかまたは調節する蛋白質因子の相互作用をブロックすることができ、および ／または、その結果得られるオリゴヌクレオチドが反応性官能基を有するように 作成される場合には、不可逆性の損傷が特定の核酸部位に導入されるのを助長し てよい。 本発明に関連して、標的核酸は相補性核酸様化合物とハイブリダイズすること ができるあらゆる核酸を意味する。さらに、本発明に関連して、「ハイブリダイ ズ」は、相補核酸塩基間の水素結合を意味し、ワトソン−クリック、フーグステ ィーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）または逆フーグスティーン水素結合であってよい 。本明細書にて用いられる「相補」は、２つの核酸塩基の間の正確な対合のため の能力を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成を通して対 合する相補な核酸塩基である。本明細書にて用いられる「相補な」および「特異 的にハイブリダイズ可能な」は、ヌクレオシドサブユニットを含む第１および第 ２の核酸様オリゴマー間の正確な対合または配列相補性を意味する。例えば、第 １の核酸の特定の位置の核酸塩基が第２の核酸の同じ位置の核酸塩基と水素結合 可能であるなら、そのときは、第１核酸と第２核酸はその位置において互いに相 補であると考えられる。各々の分子中の十分な数の対応位置が互いに水素結合可 能な核酸塩基により占められている場合、第１核酸と第２核酸は互いに相補であ る。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補な」は、本発明の化合物と 標的ＲＮＡ分子の間に安定且つ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性 を示すために用いられる用語である。本発明のオリゴマー化合物は、特異的にハ イブリダイズ可能となるその標的ＲＮＡ配列に１００％相補である必要はない。 標的ＲＮＡ分子に対するオリゴマー化合物の結合が標的ＲＮＡの通常の機能を干 渉することにより有用性の損失を引き起こす場合には、オリゴマー化合物は特異 的に ハイブリダイズ可能であり、そして特定の結合が望まれるような条件下、即ちイ ンビボアッセイまたは治療処置の場合の生理学条件、またはインビトロアッセイ の場合、アッセイが実施されるような条件下においては、オリゴマー化合物の非 標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある。 本発明の化合物は、診断用、治療用並びに研究用試薬およびキットとして利用 可能である。それらは、効果的な量の本発明化合物を適当な薬学上受容可能な希 釈剤または担体に添加して薬剤組成物として利用できる。さらに、それらは、蛋 白質の不所望な生産により特徴付けられる疾患を有する生物を治療するために使 用できる。生物は、不所望な蛋白質をコードする標的核酸の鎖に特異的にハイブ リダイズすることができる配列を有する本発明化合物に接触させることができる 。 治療用組成物の製剤化並びにそれらの引き続く投与は、当業者の範囲内である と信じられる。一般に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者は、 本発明により化合物を投与され、通常は薬学上受容可能な担体中で、患者の年齢 及び処置される疾患の重病度に依存して、患者の体重ｋｇあたり０．０１μｇか ら１００ｇの投薬量にて投与される。さらに、処置による養生は、特定の疾患の 性質、その重病度および患者の全体的な状態に依存して変更される期間続けてよ く、そして毎日１回から２０年に１回の範囲に及んでよい。処置後、患者は彼／ 彼女の状態に関しておよび疾患状態の兆候の軽減に関して監視される。化合物の 投薬量は、患者が現在の投薬量レベルに顕著に応答しない場合において増加させ るか、または疾患状態の兆候の軽減が観察されるかまたは疾患状態が除去された ならば投薬量を低下させてよい。 いくつかの場合において、他の伝統的な治療形態と共に本発明の化合物で患者 を処置することはより効果的であるかもしれない。例えば、ウイルス疾患に関し て処置された患者には公知の抗ウイルス剤と共に本発明の化合物を投与してよく 、あるいはアテローム性動脈硬化症の患者には血管形成術後に本発明の化合物で 処置することにより処置された動脈の再閉塞を予防してよい。 処置がうまくいったら、患者にメンテナンス治療を受けさせて疾患状態の再発 を予防することが望ましいかもしれず、その際、本発明の化合物は、メンテナン ス投薬量において、体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲で１日１回 またはそれ以上から２０年毎に１回投与する。 本発明の薬剤組成物は、局所または全身の何れが望まれるかに依存して、およ び処置される領域に依存して、多くの方法により投与してよい。投与は、局所( 眼内、窒内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む)、経口または非経口であってよい。 非経口投与は、静脈内ドリップ、皮下、腹腔内または筋肉内注射、または鞘内ま たは心室内投与を含む。 局所投与のための製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、 ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末を含んでよい。慣用的な薬剤担体、 水溶液、粉末または油性基材、濃縮機等も必要かまたは望ましいかもしれない。 コートされたコンドーム、手袋等も有用かもしれない。 経口投与用組成物には粉末または顆粒、懸濁液または水溶液もしくは非水媒質 、カプセル、サッシェまたは錠剤がある。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分 散助剤または結合剤が望ましいであろう。 脊髄内または脳室内投与用組成物は緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤を含 有することもできる無菌水溶液を含むことができる。 非経口投与用配合物は緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤を含有すること もできる無菌水溶液を含むことができる。 数日から数カ月、または治癒もしくは疾患状態の軽減が得られるまで続く治療 期間の間、投与は治療する疾患状態の激しさや敏感さによる。最適な投与計画は 患者体内の薬剤の蓄積量の測定から計算することができる。熟練者は最適投与量 、投与方法および反復頻度を容易に求めることができる。最適投与量は個々の化 合物の相対効果によって変わることがあり、また通常生体外及び生体内動物モデ ルで有効と認められるＥＣ₅₀ｓに基づいて推定することができる。一般に投与量 は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇないし１００μｇであり、また毎日、毎週、毎 月または毎年１回以上、または２ないし２０年毎に１回でさえも投与することが できる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの予め設定されたヌクレ オチド配列に対して相補的になるように周知の固相合成法によって好適かつ日常 的に合成することができる。核酸合成機は市販されており、その使用は概して、 望ましいと思われる妥当の長さのオリゴヌクレオチドをほぼ正確に生成させるの に有効であると当業者には理解されている。 オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒ ｐｏｒａｔｅｄ ３８０ＢまたはＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ７５ ００もしくは８８００のような標準固相自動核酸合成機によって合成される。た とえば、Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔ ｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ .，ｐｐ．７−２４，Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，ｅｄ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ ｃ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８９）またはＯｌｉｇｏｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏ ａｃｈ ，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；“Ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ，１９９１に記載されているトリエステル、ホスホルアミダイト、またはホスホ ン酸カップリング化学をこれら合成機で用いて所望のオリゴヌクレオチドがもた らされる。たとえば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｓｏｃｉｅｔ ，１９９０，１１２，１２５３−１２５５に記載されている ようなＢｅａｕｃａｇｅ試薬またはＢｅａｕｃａｇｅらがＴｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８１，２２，１８５９−１８６２に記載しているよう な元素硫黄を用い、ホスホルアミダイトまたはホスホン酸化学によって置換ホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドがもたらされる。 ホスホルアミダイト化学を用いるために、２’−デオキシアミダイト、２’− Ｏ−メチルアミダイトおよび２’−Ｏ−ヒドロキシルアミダイトを含む種々のア ミダイト試薬が市販されている。このような合成の他の手段を用いることもでき る。オリゴヌクレオチドの実際の合成は当業者の手腕の及ぶ限りで十分である。 ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアルキル化誘導体のような他の オリゴヌクレオチドを調製するのに同様の方法を用いることも周知である。蛍光 で標識したビオチニル化または他の共役オリゴヌクレオチドを合成するために、 類似の方法ならびに市販の修飾アミダイトおよび多孔質ガラスピース固相担体 （ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ(ＣＰＧ)）製品、たとえばビオ チン、フルオレセイン、アクリジンまたはプソラレン修飾アミダイトおよび／ま たはＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから市販さ れている）を用いることも周知である。 オリゴヌクレオチドを調製するためにホスホルアミダイト化学を実施する際に 、多くの反応条件、担体及び試薬が前記のＭ．ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＳ．Ｂ ｅａｕｃａｇｅや他の文献のみならず下記の４，４５８，０６６，４，５００， ７０７，５，１３２，４１８，４，４１５，７３２，４，６６８，７７７，４， ９７３，６７９，５，２７８，３０２，５，１５３，３１９，５，２１８，１０ ３，５，２６８，４６４，５，０００，３０７，５，３１９，０７９，４，６５ ９，７７４，４，６７２，１１０，４，５１７，３３８，４，７２５，６７７及 び再３４，０６９を含む米国特許から公知であり、これらはいずれも本明細書に 参照として組み込まれている。さらに、ホスホルアミダイト化学の実施は、Ｂｅ ａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．のＴｅｔｒａｈｅｄｒｎ，１ ９９２，４８，２２２３−２３１１ならびにＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．および Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６ １９４におけるＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒにより、ならびにそれらを引用 する文献によって体系的に検討されており、それらはすべて本明細書に参照とし て組み込まれる。 ホスホルアミダイト化学を実施する際に、とくに有用な糖遮断基、すなわちＰ ｇ基はトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、およびトリメト キシトリチル、とくにジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）である。ホスホルアミダ イト化学を実施する際に、とくに有用なホスフィット活性基、すなわちＮＲ₃Ｒ₄ 基は、前記の関連Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ特許に記載されているようなジアルキル置 換窒素基および窒素複素環式基である。ジイソプロピルアミノ活性基がとくに有 用である。 種々のヌクレオチド単位を本発明のアミダイトとして活性化させて本発明のオ リゴヌクレオチドに組み入れることができる。これらの中には、デオキシヌクレ オチド、すなわち上記構造中のＱがＨであるもの、リボヌクレオチド、すなわち 上記構造中のＱがＯＨであるもの、または置換２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド 、すなわち上記構造中のＱが置換−Ｏ−アルキルであるものがある。２’−Ｏ− アルキルヌクレオチドは米国特許第５，４６６，７８６号に記載されており、本 明細書に参照として取り入れてある。とくに有用な置換２’−Ｏ−アルキル基で あるメトキシエトキシ基をＭａｒｔｉｎ，Ｐ．がＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ， １９９５，７８，４８６−５０４に述べており、これも参照として本明細書に 組み込まれている。 ５’−モノヌクレオチドの細胞間供給のために、我々はメチルＳ−アシルチオ エチル（本明細書ではＭｅ−ＳＡＴＥとも呼ぶ）生体可逆性保護基を使用した。 モノヌクレオシドホスフェートを保護するために使用するときに、我々はカルボ キシエステラーゼが仲介する分解プロセスによってヌクレオシドモノホスフェー トの選択的回収が可能であることを実証した。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｉ．ら、Ｊ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.(１９９５)。 下記の実施例において、我々は２種類のジチミジンモデル（すなわち、ホスフ ェートおよびホスホロチオネートトリエステル、ホスホトリエステルダイマー（ 化合物１、図１）ならびにホスホチオノトリエステルダイマー(化合物２、図３) ）の使用を述べる。ジチミジンホスフェートおよびホスホロチオネートをｔｅｒ ｔ−ブチル−Ｓ−アシル−チオエチル（ｔＢｕ−ＳＡＴＥ）生体可逆性保護基を 有するトリエステル、すなわち化合物１および２として調製した。培養液（ＣＭ ）および全ＣＥＭ細胞抽出液（ＴＣＥ）中におけるその安定性を評価した。 これらのダイマーはＣＭ中では優れた安定性を有することが認められ、また 対応する親（ｐａｒｅｎｔ）ダイマーに対するカルボキシエステラーゼの活性に よってＴＣＭ中では選択的に加水分解される。加温条件において培養液中および 全ＣＥＭ細胞抽出液中の安定度をＨＰＬＣモニタリングによって評価した。ｔ− ブチル−Ｓ−アシルチオエチル保護基（ｔＢｕ−ＳＡＴＥ）を薬動力学パラメー タに基づき生体可逆性基として選択した。化合物１のカルボキシエステラーゼの 攻撃による加水分解は対応するホスホジエステルダイマーを生成したが、化合物 ２はホスホロチオエート類似体を生成した。 本発明のプロオリゴヌクレオチドは、カルボキシエステラーゼに対する基質の 親和力、試薬の求核性、および脱離基の性質によるＰ−Ｘ（リン原子に対する求 核攻撃）またはＣ−Ｘ（カルボキシエステラーゼが仲介するカルボニル機能に対 する求核攻撃）結合切断プロセスを含む２つの機構によって加水分解させること ができる。 非イオン性オリゴヌクレオチドメチルホスホネート、または類似のアルキルも しくはアリールホスホネートは、生体細胞膜を容易に通過することができ、また 分解またはヌクレアーゼによる加水分解に対して抵抗性がある一方、生体内で比 較的長い生物学的半減期を有する化学的に合成された核酸類似体として用いるた めに当業者には周知である。米国特許第４，５１１，７１３号参照(参照として 本明細書に組み込まれている)。メチルホスホネートオリゴは標的ＲＮＡに対す る結合能力が小さい傾向があるが、本発明のホスホジエステルまたはホスホロチ オネートインターヌクレオシド結合プロオリゴヌクレオチドと組み合わせて用い るように意図される。 単純な反応計画に従ってジチミジン化合物１−２の合成を行った。アセトニト リル中にテトラゾールを存在させてジチミジンホスホルアミダイトをｔｅｒｔ− ブチル−Ｓ−アシル−チオエタノールと縮合させ、得られたホスフィットトリエ ステルを最後にｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは元素硫黄により酸化 させて、それぞれ５’および３’−ヒドロキシルの脱保護後、それぞれのダイマ ーを得た。 オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８１Ａまた は３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により合成した。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０（２５ ０ＭＨＺ）分光光度計により¹Ｈおよび³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを記録した。¹Ｈ 及び³¹ＰのＮＭＲ化学シフトは内部標準として採用したＣＤＣｌ₃、ＣＤ₃ＣＯＣ Ｄ₃またはＣＤ₃ＣＮに対して測定した。高速原子衝撃質量スペクトル（ＭＳ）は Ｊｅｏｌ Ｄｘ３００質量分光光度計により正または負のイオンモードでチオグ リセロール（ＧＴ）またはニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）マトリックスを 用いて記録した。薄層クロマトグラフィーはキーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ）６０Ｆ₂₅₄プレート（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）を用いて行い、紫外線および硫酸噴霧 によって検出した。カラムクロマトグラフィーにはシリカゲル６０を使用した。 トリエステルの安定性はオンライン清浄化法（ｏｎ−ｌｉｎｅ ｃｌｅａｎｉｎ ｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるＨＰＬＣにより、逆相Ｃ₁₈カラム（３μｍ，ハイパ ージル(Ｈｙｐｅｒｓｉｌ)，１５０×４，６ｍｍ）を用い、１００％Ａから１０ ０％Ｂまでの４０分間の勾配（Ａ：０．０５Ｍ ＴＥＡＡｃ；ｐＨ＝７．０；Ｂ ：５０：５０ ＣＨ₃ＣＮ：０．０５Ｍ ＴＥＡＡｃ；流速：１ｍｌ／分）によ って測定した。各タイムポイントごとに注入前に０．５％ＤＭＳＯとともにダイ マーホスホトリエステル（５×１０^-5Ｍ）またはプロオリゴヌクレオチド（１０^-5 Ｍ）を含有する１００μｌの培地（培養液＝ＲＰＭＩ１６４０＋１０％子ウシ 胎児血清または全細胞抽出物）を３７℃に加温した。 下記の実施例及び方法は本発明を説明するためのものであって本発明を限定す るためのものではない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成 ヨウ素による酸化を含む標準のホスホルアミダイト化学を用いて無置換および 置換ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを合成する。 ホスフィット結合の段階的チエーション（ｔｈｉａｔｉｏｎ）のために標準の 酸化ボトルの代わりに３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジ オキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液を用いる以外はホスホジエステルオリゴ ヌクレオチドに従ってホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成する。チエ ーションの待ち工程（ｗａｉｔ ｓｔｅｐ）を６８秒に延長し、ついでキャッピ ング工程（ｃａｐｐｉｎｇ ｓｔｅｐ）を行った。 ＣＰＧカラムによる切断および５５℃の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッ ク（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）(１８時間)後、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２．５ 容量のエタノールで２回沈殿させてオリゴヌクレオチドを精製した。２０％アク リルアミド、８Ｍ 尿素、４５４ｍＭ トリスホウ酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０） の中で分析的ゲル電気泳動を行った。オリゴヌクレオチドとホスホロチオエート はポリアクリルアミドのゲル電気泳動に基づいて標準長さの物質の８０％よりも 大きいと判断された。 米国特許第４，４６９，８６３号（参照として本明細書に組み込む）に記載さ れているようにアルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを調製する。 実施例２ ホスホトリエステルダイマー １の合成 ビスチミジンジイソプロピルアミノホスフィン ５（図２）(０．１ｍｍｏｌ ，１２２ｍｇ)およびｔｅｒｔ−ブチル−Ｓ−アシルーチオエタノール（０．１ ２ｍｍｏｌ，１，９ｍｇ）を３ｍｌの乾燥ＣＨ₃ＣＮ中でモレキュラーシーブを 用いて２時間一緒に撹拌した後昇華テトラゾール（０．３ｍｍｏｌ，２１ｍｇ） を加える。室温下で４時間後に、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．２ ４ｍｍｏｌ，８２μｌ）を添加する。混合物を室温で１．５時間撹拌した後、Ｎ ａ₂Ｓ₂Ｏ₃飽和水溶液とＣＨ₂Ｃｌ₂のいずれかで抽出する。蒸発後残留物をシリ カゲルカラムを用いるクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂＋１％ＴＥＡ）により精 製して６（図２）(９０．６ｍｇ，７０％)を得る。３．５時間の８０％ＡｃＯＨ ／Ｈ₂Ｏ（１ｍｌ）を用いる処理によってジメトキシトリチル基を切断する。Ｈ ＰＬＣによりダイマーホスホトリエステル １を精製して特性を完全に決定した 。¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）:δ（ｐｐｍ）:６．３（２Ｈ，ｍ，２×Ｈ₁’）;４． １５（２Ｈｑ，ＣＨ₂ＯＨ）;３．１５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂Ｓ）;１．８５（６Ｈ， ｍ，２×ＣＨ₃ｄＴ）;１．２（９Ｈ，ｍ，Ｃ（ＣＨ₃）₃）;残留物５’ＯＨ−ｄ Ｔ−３’ＯＰ：４．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’）;４．３５(２Ｈ，ｍ，Ｈ₅’，Ｈ₅ ”)，４．２（１Ｈ，ｍ，Ｈ₄’）;２．２５（２Ｈ，ｔ，Ｈ₂’，Ｈ₂”）;残留物 ３’ＯＨ−ｄＴ−５’ＯＰ：５．１５（１Ｈ，ｍ，Ｈ₃’）;４．０５（１Ｈ， ｍ，Ｈ₄’）;３．７５（２Ｈ，ｍ，Ｈ₅’，Ｈ₅”）;２．３−２．６(２Ｈ，ｍ， Ｈ₂’,Ｈ₂”)．³¹Ｐ−ＮＭＲ:（ＣＤ₃ＯＤ）−２．２８および-２．３５ｐｐｍ ，ＭＳ ＦＡＢ ｐｏｓ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］⁺:６９１． 実施例３ ホスホチオノトリエステルダイマー ２の合成 酸化反応をＣＨ₃ＣＮ中で元素硫黄（０．５ｍｍｏｌ，１６ｍｇ）を用いて２ 時間行う以外は実施例１と同様の方法によってダイマーホスホチオノトリエステ ル ２を合成する。仕上げはＨ₂ＯおよびＣＨ₂Ｃｌ₂のどちらかによる抽出を含 む。残留物はシリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂の１０ ない し１００％シクロヘキサン溶液＋１％ＮＥｔ₃）によって精製する。最後に脱ト リチル化後７０％の収率でダイマーホスホチオノトリエステル ２（０．０７ｍ ｍｏｌ，９２ｍｇ）が得られる。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）:δ（ｐｐｍ）:６． ３（２Ｈ，ｍ，２×Ｈ₁’）;３．１５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２Ｓ）;１．８５（６Ｈ ，ｍ，２×ＣＨ₃ｄＴ）;１．２０（９Ｈｍ，Ｃ（ＣＨ₃）₃）;５．１０（１Ｈ， ｍ，Ｈ₃’_OH）;４．００−４．４０（７Ｈ，ｍ，Ｈ₃’_OP，Ｈ₅’Ｈ₅”_OH，２× ４’，ＣＨ₂ＯＨ）３．７５（２Ｈ，ｓ，Ｈ₅’Ｈ₅”_OP）;２．１−２．６（４Ｈ ｍ，２Ｈ₂’，２×Ｈ₂”）４．１５(２Ｈ，ｑ，ＣＨ₂ＯＨ)．³¹ Ｐ−ＮＭＲ:（ＣＤ₃ＯＤ）６７．４０および６７．４３ｐｐｍ，ＭＳ ＦＡＢ ｐｏｓ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］⁺:７０７； 実施例４ キメラオリゴヌクレオチドの合成 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの方法に従って５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−チミジン−３’−イ ル−Ｓ−（ｐ−チオベンゾイルエチル）ピロリジノホスホロチオアミダイトを合 成した(³¹Ｐ ＮＭＲによる純度９４％、１６６．７１および１６３．０４ｐｐ ｍ)。Ｗｉｅｓｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．ら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ ＤＮＡ ，Ｈｕ ｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９１(１９９３)。ＤＮＡ合成機 によりメチルメチルホスホンアミダイト、β−シアノエチルホスホルアミダイト 、またはチオホスホルアミダイトシントンを用いてキメラメチルホスホノジエス テル／ホスホロジチオエートおよびメチルホスホノジエステル／ホスホロジチオ エートオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。酸化剤としてはヨウ素−水−ピ リジン−ＴＨＦ（０．１Ｍ：１：１０：４０）溶液であり硫化剤としてはＢｅａ ｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキ シド）の溶液である。メチルホスホネート主鎖を分解させる濃水酸化アンモニウ ム処理を避けるために最終的に迅速に除去するようにＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担体 とオリゴマーの間にオキサリルリンカー（Ａｌｕｌ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ .，１９９１，１９，１５２７）を用いて合成を達成させた。 Ｂａｒｂｅｒ，Ｉ．らのＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ.，１９９ ５， ５，１４４１も参照されたい。該オリゴヌクレオチドはＣ−１８逆相カラムを使 用するＨＰＬＣにより、溶離剤として増加的量のアセトニトリルのトリエチルア ンモニウムアセテート溶液（０．０５Ｍ，ｐＨ７．０）を用いて精製した。 実施例５ オリゴデオキシヌクレオチド合成後のアルキル化 ６０当量のＭｅＳＡＴＥヨウ化物（１２．５μｌ，アセトニトリル中９４０ｍ Ｍ）および２，６−ルチジン（６０μｕｌ，アセトニトリル中１００ｍＭ）のア セトニトリル（５７μｌ）溶液を用いて、オリゴヌクレオチド（１３０μｌ，水 中１．５ｍＭ）のＳＡＴＥアルキル化を行う。反応はＨＰＬＣによりモニターし 、モノおよびジアルキル化生成物の一時的生成が認められた後、完全アルキル化 プロオリゴ（ｐｒｏｏｌｉｇｏ）がほぼ定量的収率で生成し、ＨＰＬＣによる精 製及びＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ１８による脱塩後純粋な形で得られる。 室温において（３時間）において４８当量のＰＯＭヨウ化物誘導体（１５μｌ ，アセトニトリル中６９０ｍＭ）およびルチジン（１５μｌ，アセトニトリル中 ６９０ｍＭ）のアセトニトリル／水（２４０μｌ，１：１，ｖ／ｖ）溶液を用い てオリゴヌクレオチド（３０μｌ，水中７．２ｍＭ）のＰＯＭアルキル化を行う 。ＨＰＬＣによる精製およびＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ１８による脱塩後、予想される ビオチン共役プロオリゴが単離される。 実施例６ Ｓ−ピバロイルチオエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト エーテル（３００ｍＬ）を含有する乾燥フラスコにアルゴン雰囲気中で外部冷 却しながら五塩化リン（１８．５４ｇ，１３５ｍｍｏｌ）を滴下した。アルコー ル（Ｓ−ピバロイルチオエチルアルコール(ｔＢｕＣＯＳ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ) ）１００ｍｍｏｌをエーテル溶液（１００ｍＬ）として１時間にわたり滴下した 。添加後、反応フラスコを室温にもたらし、反応混合物を４時間撹拌した。反応 混合物からエーテルを一部蒸発させ、該アルコールのこの二塩化リン誘導体のエ ーテル（２００ｍＬ）溶液にアルゴン雰囲気中で０℃においてジイソプロピルア ミン１１６ｍｍｏｌを加えた。添加完了後(１時間)、反応混合物を一夜間撹拌す る。エーテル溶液の濃度が該アルコール誘導体のホスホルアミダイトを生成さ せた。³¹Ｐ ＮＭＲ：１２３ｐｐｍ。 実施例７ ５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）チミジン−３’−Ｏ−（Ｓ−ピバロイルチオ エチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト Ｂ＝Ｔ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン（３．８１ｇ，７ｍｍｏｌ）を含有するオーブン 乾燥したフラスコに１００ｍＬの無水アセトニトリルを加え、続いて６ｍｍｏｌ のテトラゾールを添加する。溶液を撹拌し、これにピバロイルチオエチルＮ，Ｎ −ジイソプロピルホスホルアミダイト（１１ｍｍｏｌ）を加える。４時間撹拌後 反応物の³¹Ｐ ＮＭＲは、１２３ｐｐｍのピークの一部消失と約１５０ｐｐｍの 誘導アミダイトの出現を示した。ＴＬＣはヌクレオシドの完全な消費と所望アミ ダイトの生成を示した。反応混合物を濃縮し、直接シリカゲルカラムにかけて酢 酸エチル：トルエン（５０：５０）で溶離させると微量のトリエチルアミンを得 た。生成物はカラム画分からプールした。 実施例８ Ｎ２−イソブチリル−５−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノ シン−３’−Ｏ−（Ｓ−ピバロイルチオエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホ ルアミダイト Ｂ＝ｄＧ チミジン誘導体の代わりにＮ²−イソブチリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−２’−デオキシグアノシンを用い、実施例７の方法を繰り返して所望のアミ ダイトを得る。 実施例９ Ｎ６−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル-２’−デオキシアデノシン −３’−Ｏ−（Ｓ−ピバロイル−Ｓ−エチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルア ミダイト）Ｂ＝ｄＡ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジンの代わりにＮ⁶−ベンゾイル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシンヌクレオシドを用い、実 施例７の方法を繰り返して所望のアミダイトを得る。 実施例１０ Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン− ３−Ｏ−（Ｓ−ピバロイル−Ｓ−エチルＮ．Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミ ダイト Ｂ＝ｄＣ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジンの代わりにＮ⁴−ベンゾイル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジンを用い、実施例７の方法を 繰り返して所望のアミダイトを得る。 実施例１１ カルボキシエステラーゼの活性 本実施例では２種類のジチミジンモデル（すなわちホスフェートおよびホスホ ロチオネートトリエステル、ホスホトリエステルダイマー（化合物１、図３）な らびにホスホチオノトリエステルダイマー(化合物２、図３)）を比較する。ジチ ミジンホスフェートおよびホスホロチオネートはｔｅｒｔ−ブチル−Ｓ−アシル −チオエチル（ｔＢｕ−ＳＡＴＥ）生体可逆性保護基を有するトリエステル（す なわち、化合物１および２）として調製した。培養液（ＣＭ）および全ＣＥＭ細 胞抽出液（ＴＣＥ）中のその安定性を評価した。これらダイマーは対応する親ダ イマーに対してＣＭ中ではすぐれた安定性を示し、ＴＣＥ中ではカルボキシエス テラーゼの活性により選択的に加水分解されることが認められた。安定性は加温 条件で培養液（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％熱失活ウシ胎児血清）中および全Ｃ ＥＭＳＳ細胞抽出液中でＨＰＬＣモニタリングにより評価した。化合物１のカル ボキシエステラーゼ攻撃による加水分解は対応するホスホジエステルダイマーを 生成し、一方化合物２はホスホロチオエート類似体を生成した。 各ダイマーの培養液中および全細胞抽出液（細胞内媒質のモデルとして）中の 安定性を、ＨＰＬＣ清浄化法（ＨＰＬＣ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）( Ｐｏｍｐｏｎ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.，１９９２，４ ３，１７６９(本明細書に参照として組み込まれている)）を用いて評価した。そ の半減期は、対応する加水分解生成物の同定を含めて表Ｉにまとめた。それぞれ の場合にダイマーの各ジアステレオ異性体の半減期に相当する２つの半減期の値 を示す。このような鏡像異性的依存性はアセチルコリンエステラーゼにより仲介 されるＲ_PおよびＳ_Pメチロホスホノチオエートの加水分解の場合に報告されてい る。Ｚｈａｏ，Ｑ.，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，８１２ ８。 表Ｉダイマー化合物 １ ２ 培養液 ３２時間／３４時間 １１４時間／１６９時間 ＰＯＯ^- ＰＯＳ^- 全ＣＥＭ細胞抽出液 １５．４±６．０時間 ７．６±０．３時間 ／１５．４±２．２時間 ／６．９±１．９時間 ＰＯＯ^- ＰＯＳ^- この２つのトリエステルダイマーは、培養液中ですぐれた安定性を示す(ｔ１ ／２ ３２ないし１６９時間)。したがって全ＣＥＭ細胞抽出液中における化合 物２からジチミジンホスホロチオエートの選択的生成が認められるのはリン原子 に対する求核攻撃ではなくてカルボキシエステラーゼが仲介する分解プロセスに よるものと説明することができる。培養液中に残留カルボキシエステラーゼ活性 があることはすでに認められている。オキソトリエステル（化合物１）は、対応 するチオノトリエステル（化合物２）よりもリン原子に対して求核攻撃しやすく 、したがって半減期はさらに短くなる。実際に培養液中では化合物２は先行技術 の供試化合物３および４よりも安定である。培養液中で観察される安定度の順序 は２＞４＞１＞３である。 全ＣＥＭ細胞抽出液中では分解プロセスはカルボキシエステラーゼによって仲 介される。この状態は化合物３からのホスホロチオエートダイマーの唯一の生成 によって確証される。認められる安定性のデータ（１＞２＞３＞４）は酵素に対 するホスホトリエステルの親和力を反映し、より親油性のダイマーがすぐれた基 質である。 実施例１２ 生体可逆性遮断基を有するキメラオリゴヌクレオチド ２つのキメラオリゴヌクレオチドを合成してＨＰＬＣによって安定性を評価し た。第１のオリゴヌクレオチドはＭｅ−ＳＡＴＥ保護基を有する１２量体のホス ホロジチオエートオリヌクレオチドであった。３つのホスホロジチオエート結合 の中心間隙および２つの中性メチルホスホネートフランク（ｆｌａｎｋｓ）を有 するオリゴヌクレオチドを合成した。塩基性条件下のホスホトリエステルの不安 定性を避けるためのオリゴヌクレオチドを合成するために合成後の手段を用いた 。オリゴヌクレオチドは、各ホスホロジチオエートにＭｅ−ＳＡＴＥヨウ化物で 選択的にアルキル化され、得られた中性のキメラオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ により逆相Ｃ₁₈カラムを用いて精製した。培養液および全ＣＥＭ細胞抽出液中で オリゴヌクレオチドの安定性を評価した。それぞれの場合に、培養液中では加水 分解によって良好な安定性を有する親オリゴヌクレオチド（Ｍｅ−ＳＡＴＥ遮断 基を有しないオリゴヌクレオチド）を選択的に生成した(ｔ_1/2＝３２時間)。細 胞抽出液中では、半減期が１５分の第１生体可逆性基の加水分解が生じて、半減 期が８０分の完全脱保護オリゴヌクレオチドが得られた。第２及び第３Ｍｅ−Ｓ ＡＴＥ基の脱保護速度の差は認められなかった。 比較のために、ピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）生体可逆性保護基でアルキ ル化された３つのホスホロチオエート結合の中心間隙および２つのメチルホスホ ネートフランクを有する第２キメラオリゴヌクレオチドを調製した。さらにまた ホスフェート遮断基を導入するために合成後の手段を用いた。この場合には、後 で蛍光分光光度測定により細胞中のオリゴヌクレオチドの定位を確かめるために 、リポーターグループとしてビオチンでオリゴヌクレオチドを標識化した。第１ のオリゴヌクレオチドに対して、第２のオリゴヌクレオチドの安定性を培養液及 び全ＣＥＭ細胞抽出液中で評価した。培養液中では半減期が４．５時間であるこ とが判明した。本発明のオリゴヌクレオチドを、第１のオリゴヌクレオチドと比 べると、この場合にはリン原子に対する競合的求核攻撃による親オリゴの選択的 生成は認められなかった。全細胞抽出液中では、ＰＯＭ基の連続的除去をＨＰＬ Ｃによってモニターした。第１保護基は極めて迅速（ｔ_1/2＜２分）に除去され るが、残りのＰＯＭ基の脱保護ははるかに遅く進行し、すなわち完全脱保護キメ ラオリゴが完全に出現するための半減期は２．４時間であることが認められた。 ＰＯＭおよびＭｅ−ＳＡＴＥ脱保護速度の認められる差は、哺乳類エステラー ゼの活性を含む２つの主な構造上の特徴、すなわち基質の官能性の性質および分 子の親油性に関連して試案として説明することができる。この点に関し、極性ま たは帯電化合物はこれら酵素に対する好ましい基質ではない。従って累進的カル ボキシエステラーゼの仲介による間隙の脱保護は負電荷の逐次的増大によって酵 素基質としてのキメラオリゴの親和力を低下させると仮定することができる。ホ スホロジチオエートオリゴはホスホロチオエートオリゴよりも親油性であり、さ らにまたＰＯＭ基はＭｅ−ＳＡＴＥ基よりも親油性であるのでＭｅ−ＳＡＴＥ基 が除去された後の第１オリゴヌクレオチドの親油性の変化はエステラーゼにとっ て重要ではないとみなすことができる。さらに全ＣＯＭ細胞抽出液中におけるＰ ＯＭジチミジンホスホロチオエートトリエステル［Ｔ_P（ＰＯＭ）Ｔ］の両方の ジアステレオ異性体の加水分解速度と中心的ＰＯＭホスホロチオエートトリエス テル［Ｔ_P（ＰＯＭ）Ｔ_P（Ｏ^-）ｔ］を有するテトラチミジンの両方のジアステ レオ異性体の加水分解速度との差が認められなかったので、一方のリン構造（Ｒ_P またはＳ_P）が他方よりもすぐれた基質であるという可能性を排除することがで きる。第２のオリゴヌクレオチドの場合には、培地中に存在する化学的求核試薬 による付随的求核攻撃が可能になる程半減期が長い。しかしＨＰＬＣ曲線上には ＰＯ結合組成の生成が認められなかったので、このような求核攻撃は、もしあっ たにしても、リン原子に対してではなくて主としてカルボニル組成に対して起こ るはずである。 実施例１３ 混合配列およびＳ−ピバロイルチオエチル遮断基を有するオリゴヌクレオチドの 合成 実施例７ないし１０のヌクレオチドアミダイトを用い、実施例１の方法によっ てオリゴヌクレオチドを合成する。沈殿工程後、本発明の遮断基を有する混合配 列オリゴヌクレオチドは通常のように生体内で使用することができる。 実施例１４ １−ｏ−ニトロフェニル−３−ブテノール，IV−２ ２−ニトロベンズアルデヒド（１）(５５０．４ｍｇ，３．６ｍｍｏｌ)の乾燥 ジクロロメタン溶液に四塩化チタン（１．０Ｍ，８．７ｍｌ）の塩化メチレン溶 液を加え、続いてアリルトリメチルシラン（２．１ｍｌ，１３ｍｍｏｌ）を加え て、ＯｒｄｏｕｋｈａｕｎｉａｎらがＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５， １１７，９５７０−９５７１に記載したように８３％の収率で標記化合物を得た 。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）δ７．９２（ｄｄ，１Ｈ） ， ７．８２(ｄｄ，１Ｈ)，７．６４(ｔｄ，１Ｈ)，７．４１(ｔｄ，１Ｈ)，７．２ ４(ｓ，ＣＤＣｌ₃)，５．８８(ｍ，１Ｈ)，５．３１(ｄｄ，１Ｈ)，５．２０(ｍ ，２Ｈ)，２．７(ｍ，１Ｈ)，２．４１(ｍ，２Ｈ)． 実施例１５ １−ｏ−ニトロフェニル−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−エン−１−ブテノ ール，IV-３ 撹拌しつつあるアルコール ２（５６４．２ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）の乾燥 ピリジン（３０ｍｌ）溶液に０℃においてトリエチルアミン（５９０μｌ，４． ２３ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１５．８ｍｇ，０．１ ３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌後４，４’−ジメトキシトリチル クロリド（３．５ｇ，１０．３８ｍｍｏｌ）を加えた。さらに混合物を２日間撹 拌してプロセス中に室温まで暖めた。溶剤を減圧除去し、得られた残留物を酢酸 エチルに溶解して重炭酸ナトリウム飽和溶液で抽出した。水層をさらに酢酸エチ ルで抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を減圧除去した。 得られた残留物をシリカゲルカラムを用いるクロマトグラフにかけて(２％酢酸 エチル／２％トリエチルアミン／ヘキサン)、所望のジメトキシトリチルアルコ ール（１．１ｇ，２．２２ｍｍｏｌ）を橙黄色油状物として６５％の収率で得た 。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）δ７．６５(ｍ，２Ｈ)，７ ．５１(ｍ，２Ｈ)，７．３８−７．０９(ｍ，９Ｈ)，６．６６(ｍ，４Ｈ)，５． ９５(ｍ，１Ｈ)，５．４２(ｄｄ，１Ｈ)，５．００(ｍ，２Ｈ)，３．７７(ｄ， ６Ｈ)，２．７９(ｍ，１Ｈ)，２．６１(ｍ，１Ｈ)． 実施例１６ １−ｏ−ニトロフェニル−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−１，３−プロパンジオ ール，IV−６ 四酸化オスミウム（１４３μｌ，水中５５ｍＭ）をジメトキシトリチルアルコ ール ３（７８８．１ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）のジオキサン／水（１８ｍｌ， ５：１ ｖ：ｖ）溶液に加え、続いて過ヨウ素酸ナトリウム（８５５．４ｍｇ， ３．９８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で９時間撹拌した。混合物を０℃に 冷却して水素化ホウ素ナトリウム（１５０．６ｍｇ，３．９８ｍｍｏｌ）を混合 物に加えた。次いで混合物を室温に暖めてさらに４０分間撹拌した。混合物を０ ℃に冷却し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムをアセトン（４ｍｌ）で急冷した。 ジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出後、有機層を重炭酸ナトリウム飽和溶液（５ ０ｍｌ）で洗った。水層をジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機層を合わ せて無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧除去し、得られた残留物をシリ カゲルカラムを用いるクロマトグラフにかけた(３０％ジクロロメタン／１％ト リエチルアミン／ヘキサン)。得られた黄色の油状物（３７２．１ｍｇ，０．７ ４ｍｍｏｌ）は４７％収率の所望の化合物IV−６であった。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５ ０ＭＨＺ，ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）δ７．７３(ｍ，２Ｈ)，７．４４(ｍ，２Ｈ)， ７．３２−７．１３(ｍ，９Ｈ)，６．６９(Ｍ，４Ｈ)，５．５２(ｄｄ，１Ｈ)， ３．７５(ｍ，８Ｈ)，２．３７(ｍ，１Ｈ)，１．６５(ｂｓ，１Ｈ)． 実施例１７ １−ｏ−ニトロフェニル−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジ イソプロピルアミン−Ｏ−シアノエチルホスフィン］−１．３−プロパンジオー ル，IV−７ 撹拌しつつあるジオール IV−６（１．４ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）の乾燥ジク ロロメタン（１２ｍｌ）溶液にジイソプロピルアンモニウムのテトラゾルア（ｔ ｅｔｒａｚｏｌｕｒｅ）(２４２．３ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ)を加え、続いてビス （ジイソプロピルアミノ）−Ｏ−シアノエチルホスフィン（９９８μｌ，３．３ ６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン雰囲気中、室温で３時間撹拌した。次 いで混合物を重炭酸ナトリウム飽和溶液および塩水（５０ｍｌ）で洗った。水層 をジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウム で乾燥した。溶剤を減圧除去した。残留物を最低量のトルエンに溶解し、７８℃ でヘキサン（３００ｍｌ）中に沈殿させて、所望の生成物IV−７を７５％の収率 で単離させた。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨＺ，ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）δ７．６２( ｍ，２Ｈ)，７．４５(ｍ，２Ｈ)，７．３６−７．０８(ｍ，９Ｈ)，６．６３(ｍ ，４Ｈ)，５．３６(ｍ，１Ｈ)，３．７５(ｍ，１０Ｈ)，３．５３(ｍ，２Ｈ)， ２．５６(ｔ，２Ｈ)，２．３４(ｍ，２Ｈ)，１．３０−１．０５(ｍ，１２Ｈ)．³¹ Ｐ−ＮＭＲ（２５０ＭＨＺ，ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）δ１４７．５６， １４７．４５． 実施例１８ スペーサー取り込み（ｓｐａｃｅｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）(ホスホル アミダイト結合形成による） ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.，３８１Ａ） を用い１０μｍｏｌのスケールで市販長鎖アルキルアミン多孔質ガラスピース固 相担体（Ａｌｄｒｉｃｈ製５００Ａ，３９２ｍｇ）にスペーサー取り込みを行っ た。カップリング反応は０．２Ｍホスホルアミダイト IV−７および０．０５Ｍ テトラゾールのアセトニトリル溶液により３分間かけて行った。キャッピング反 応は通常の市販試薬を用い５分間かけて行った。酸化反応は市販のヨウ素／水／ ピリジン混合物により１分間行った。ジメトキシトリチルカチオンの吸収によっ て調べると、スペーサーのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）は平均約７０μｍｏ ｌ／ｇであった。 実施例１９ 光分解脱保護 パイレックスフィルターをつけた高圧水銀灯を用いて光分解を行った。担体を 含有するキューブ（ｃｕｖｅ）(石英)はサーモスタットで調節した(室温)。アセ トニトリル／水（９：１）中に懸濁させた担体に２８０ｎｍを超える紫外線を照 射した。照射１０−２０分後、光に不安定なリンカーが切断されて、トリエステ ルオリゴヌクレオチドが遊離された。光分解反応の収率は７０−８０％であった 。 実施例２０ ホスホルアミダイトおよびホスホルアミダイト試薬を調製するための一般的方法 。 Ａ． ホスホルアミダイト（方法Ａ） 図６について説明すると、ＣｈａｔｔｏｐａｄｈａｙａがＡｃｔａ Ｃ ｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ Ｂ １９８３，３７，８５７−８６ ４に述べたように５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）Ｎ−ニトロフェ ニルスルフェニル保護ヌクレオシドが得られた。５’−Ｏ−（４，４’−ジメト キシトリチル）−２’−デオキシヌクレオシド（１５．６ｍｍｏｌ）およびジイ ソプロピルエチルアミン（３．３ｍＬ，２０．３ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタ ン（１００ｍＬ）溶液（氷浴冷却）に、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）クロ ロホスフィン（５ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（１８ｍＬ）溶 液を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。Ｓ−（２−ヒドロキシ エチル）チオアセテート（１８．７ｍｍｏｌ）またはＳ−（２−ヒドロキシエチ ル）チオピバロエート（１０．２ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（５４６．４ｍ ｇ，７．８ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を滴下して撹拌を １５時間持続した。ジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈後、混合物を重炭酸ナ トリウム飽和溶液（３００ｍＬ）および塩水（２×３００ｍＬ）で洗い、硫酸ナ トリウムで乾燥して減圧蒸発させた。残留物をシリカゲルフラッシュカラムクロ マトグラフィーにより精製し、酢酸エチル（１０−４０％シクロヘキサン溶液） の段階的勾配による溶離を行った。所望画分の蒸発後残留物をベンゼンに再溶解 し、減圧凍結乾燥して対応するホスホルアミダイトを粉末として得た。 Ｂ＝Ｔ，Ｒ＝Ｍｅ 収率６８％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）;δ（ｐｐｍ）;９．２３（１ ａｒｇｅ ｓ，１Ｈ，ＮＨ塩基），７．２−７．５(ｍ，１０Ｈ，芳香族Ｈ ＋ Ｈ６)，６．８５(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．２４(ｍ，１Ｈ，ＨＩ’)，４．６( ｍ，１Ｈ，Ｈ３’)，４．０７(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．７４(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃ )，３．５５(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．３１(Ｍ，２Ｈ，Ｈ５’お よびＨ５”)，３．０１(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．３１(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’ およびＨ２”)，１．４８(ｍ，３Ｈ，ＣＨ₃ｄＴ)，１．１３(４ｄ，１２Ｈ，Ｃ Ｈ（Ｍｅ）₂)，１．０５（ｍ，３Ｈ，ＭｅＣＯ）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ ＰＯ₄）;δ（ｐｐｍ）;１４８．９３，１４８．５４；ＦＡＢ ＭＳ（＜Ｏ，Ｎ ＯＢＡ）ｍ／ｚ；７９４［Ｍ＋Ｈ］＋. Ｂ＝Ｔ，Ｒ＝ｔＢｕ 収率５５％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）;δ（ｐｐｍ）;９．３７（１ ａｒｇｅ ｓ，１Ｈ，ＮＨ塩基)，７．２−７．６(ｍ，１０Ｈ，芳香族Ｈ ＋Ｈ ６)，６．８２(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．２３(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，４．６(ｍ ，１Ｈ，Ｈ３’)，４．０７(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．７５(ｓ，６Ｈ，Ｏ ＣＨ₃)，３．５６(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．３１(ｍ，２Ｈ ，Ｈ５’およびＨ５”)，２．９７(ｍ，２H，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．３６(ｍ，２ Ｈ，Ｈ２’およびＨ２”)，１．４８(ｍ，３Ｈ，ＣＨ₃ｄＴ)，１．３(４ｄ，１ ２Ｈ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，１．１７（３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃ＣＣＯ）;³¹Ｐ−ＮＭ Ｒ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）;δ（ｐｐｍ）;１４９．２２，１４８．８５；ＦＡ ＢＭＳ（＞Ｏ，ＧＴ）ｍ／ｚ；８３４［Ｍ＋Ｈ］⁺． Ｂ＝Ａ^NPS，Ｒ＝Ｍｅ 収率６０％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＣＮ／ＴＭＳ）;δ（ｐｐｍ）;８．２８(ｓ ，１Ｈ，Ｈ２)，８．１９(ｓ，１Ｈ，Ｈ８)，７．９６(ｌａｒｇｅ ｓ，１Ｈ， ＮＨ塩基)，７．４２−７．３３(ｍ，３Ｈ，Ｎｐｓ保護による芳香族Ｈ)，７． ２３−７．２１(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．７６(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．３ ９(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，４．８８(ｍ，１Ｈ，Ｈ３’)，４．１９(ｍ，１Ｈ，Ｈ ４’)，３．７１(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．５５(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およ びＣＨＮ)，３．２８(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’およびＨ５”)，３．０１(ｍ，２Ｈ，Ｃ Ｈ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．５８(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’およびＨ２”)，１．１２(４ｄ，１２ Ｈ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，１．Ｏ５（ｍ，３Ｈ，ＭｅＣＯ）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃Ｃ Ｎ／Ｈ₃ＰＯ₄）;δ（ｐｐｍ）;１４９．４４，１４９．２９；ＦＡＢ ＭＳ（＞ Ｏ Ｇ−Ｔ）ｍ／ｚ；９５６［Ｍ＋Ｈ］＋． Ｂ＝Ａ^Nps，Ｒ＝ｔＢｕ 収率５９％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）:δ（ｐｐｍ）:８．２７(ｓ ，１Ｈ，Ｈ２)，８．１９(ｓ，１Ｈ，Ｈ８)，７．９７(ｌａｒｇｅ ｓ，１Ｈ， ＮＨ塩基)，７．４３−７．３３(ｍ，３Ｈ，Ｎｐｓ保護による芳香族Ｈ)，７． ２６−７．２２(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．８２(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．３ ６(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，４．９０(ｍ，Ｈ３’)，４．２０(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)， ３．７２(ｓ，６Ｈ ＯＣＨ₃)，３．５３(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ )，３．２７(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’および５”)，３．０３(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ )，２．５６(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’及び２”)，１．１６(３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃Ｃ ＣＯ)，１．１３（４ｄ，１２Ｈ，ＣＨ （Ｍｅ）₂；３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃Ｃ Ｎ／Ｈ₃ＰＯ₄）:δ（ｐｐｍ）:１４９．３５；ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，Ｇ− Ｔ）ｍ／ｚ：９９８［Ｍ＋Ｈ］⁺． Ｂ＝Ｃ^NPS，Ｒ＝Ｍｅ 収率６７％;¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ／ＴＭＳ）:δ（ｐｐｍ）:８．３１(ｄ ，１Ｈ，Ｈ６)，７．８８−７．６１(ｍ，３Ｈ，Ｎｐｓ保護による芳香族Ｈ)， ７．４８−７．２５(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．７６(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６ ．１３(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，５．９５(ｄ，１Ｈ，Ｈ５)，４．５７(ｍ，１Ｈ， Ｈ３’)，４．０６(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．７１(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．５ ９(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．３６(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’および Ｈ５”)，３．０３(ｍ，２Ｈ，ＣH₂ＣH₂Ｓ)，２．９８(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’および Ｈ２”)，１．１８(４ｄ，１２Ｈ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，１．０７（ｍ，３Ｈ，Ｍｅ ＣＯ）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）:δ（ｐｐｍ）:１４９．３８；Ｆ ＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，Ｇ−Ｔ）ｍ／ｚ：９３２［Ｍ＋Ｈ］⁺． Ｂ＝Ｃ^NPS，Ｒ＝ｔＢｕ 収率６４％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）;δ（ｐｐｍ）:８．３０(ｄ ，１Ｈ，Ｈ６)，７．８８−７．６２(ｍ，３Ｈ，Ｎｐｓ保護による芳香族Ｈ)， ７．４９−７．２５(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．７５(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６ ．１４(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，５．９６(ｄ，１Ｈ，Ｈ５)，４．５８(ｍ，１Ｈ， Ｈ３’)，４．０６(ｍ，１Ｈ，II４’)，３．７０(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．６ ０(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．３５(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’および Ｈ５”)，３．０１(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．９７(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’およ びＨ２”)，１．１９(３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃ＣＣＯ)，１．１６（４ｄ，１２Ｈ ，ＣＨ（Ｍｅ）₂）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）;δ（ｐｐｍ）:１４ ９．４１；ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，Ｇ−Ｔ）ｍ／ｚ：９７４［Ｍ＋Ｈ］⁺． Ｂ＝Ｇ^NPS，Ｒ＝Ｍｅ 収率４７％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ）:δ（ｐｐｍ）:７．６５(ｓ ，１Ｈ，Ｈ８)，８．１９(ｓ，１Ｈ，Ｈ８)，７．４５−７．３９(ｍ，３Ｈ，Ｎ ｐｓ保護による芳香族Ｈ)，７．３５−７．２７(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．７ ５(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．０９(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，４．４７(ｍ，１Ｈ， Ｈ３’)，４．１１(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．６９(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３． ５６(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．４５(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’およ びＨ５”)，３．０５(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．４８(Ｍ，２Ｈ，Ｈ２’お よびＨ２”)，１．１６(４ｄ，１２Ｈ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，１．０３（ｍ，３Ｈ， ＭｅＣＯ）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）:δ（ｐｐｍ）:１４９．８， １４９．４；ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，Ｇ−Ｔ）ｍ／ｚ：９７２［Ｍ＋Ｈ］⁺． Ｂ＝Ｇ^Nps，Ｒ＝ｔＢｕ 収率５１％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／ＴＭＳ):δ（ｐｐｍ）:７．６４(ｓ， １Ｈ，Ｈ８)，８．１７(ｓ，１Ｈ，Ｈ８)，７．４４−７．３８(ｍ，３Ｈ，Ｎｐ ｓ保護による芳香族Ｈ)，７．３５−７．２６(ｍ，９II，芳香族Ｈ)，６．７４( ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．０９(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，４．４５(ｍ，１Ｈ，Ｈ３ ’)，４．１０(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．６８(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．５６( ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．４６(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’およびＨ５ ”)，３．０６(ｍ，２II，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．４７(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’およびＨ ２”)，１．１７(３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃ＣＣＯ)，１．１３（４ｄ，１２Ｈ，Ｃ Ｈ（Ｍｅ）₂）;³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＣＮ／Ｈ₃ＰＯ₄）:σ（ｐｐｍ）:１４９． ５６，１４９．３７；ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，Ｇ−Ｔ）ｍ／ｚ：Ｉ０１４［Ｍ＋Ｈ ］⁺． Ｂ． ホスホルアミダイトおよびホスホルアミダイト試薬（方法Ｂ） １．ホスホルアミダイト試薬 図６について説明すると、アルゴン雰囲気中で０℃において、Ｓ−（２−ヒド ロキシエチル）チオアセテート（１０ｍｍｏｌ）またはＳ−（２−ヒドロキシエ チル）チオピバロエート（１０ｍｍｏｌ）およびチオエチルアミン（１１ｍｍｏ ｌ）のジエチルエーテル（２５ｍＬ）溶液を、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ ）クロロホスフィン（１０ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（２５ｍＬ）溶液中に 滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌した後生成したトリエチルアンモニウ ム塩酸塩を濾別した。シクロヘキサン（５０ｍＬ）を加え、混合物を減圧蒸発さ せて淡黄色油状物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して 標記化合物１および２を無色の油状物として得た。 （Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ビス［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルア ミダイト］(１)：フラッシュカラムクロマトグラフィー［１％トリエチルアミン 含有酢酸エチル（０−１０％）シクロヘキサン溶液の段階的勾配による溶離］後 の収率７０％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ ３．６(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂ Ｏ)，３．４７(ｍ，４Ｈ，Ｍｅ₂ＣＨＮ)，３．０４(ｔ，２Ｈ，ＳＣＨ₂ＣＨ₂) ，２．３４(ｓ，３Ｈ，ＭｅＣＯ)，１．１０（ｍ，２４Ｈ，Ｍｅ₂ＣＨＮ）;³¹Ｐ −ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ １２５．３（ｓ）;ＦＡＢ ＭＳ（＞０，Ｇ−Ｔ ）ｍ／ｅ：３５１［Ｍ＋Ｈ］⁺． （Ｓ−ピバロイル−２−チオエチル）ビス［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホル アミダイト］(２)：フラッシュカラムクロマトグラフィー［１％トリエチルアミ ン含有酢酸エチル（０−５％）シクロヘキサン溶液の段階的勾配による溶離］後 の収率９０％；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＭＳＯ−ｄ₆）δ ３．５６(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂ Ｏ)，３．４７(ｍ，４Ｈ，Ｍｅ₂ＣＨＮ)，３．０１(ｔ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂)， １．１６(ｓ，９Ｈ，ｔＢｕＣＯ)，１．１０（ｍ，２４Ｈ，Ｍｅ₂ＣＨＮ）;³¹Ｐ −ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ １２４．６（ｓ）;ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，ＮＢＡ ）ｍ／ｃ：４１１［Ｍ＋Ｏ＋Ｈ］⁺，ＦＡＢ ＭＳ（＞０，Ｇ−Ｔ）ｍ／ｅ：３ ９３［Ｍ＋Ｈ］⁺． ２．ホスホルアミダイト（ＮＰＳまたはＰＮＴ実験記録） ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシヌクレオシド （１ｍｍｏｌ；Ｂ＝Ｔ，Ａ^NPS，Ｃ^nPS，Ｇ^nPS）を乾燥アセトニトリル（５ｍＬ ）に溶解し、蒸発乾固後、乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に再溶解した。この溶 液にジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．５ｍｍｏｌ）およびホスホ ルアミダイト １または２（１．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で４時 間撹拌した。酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解した後，混合物を重炭酸ナトリウム 飽和溶液（４０ｍＬ）および塩水（４０ｍＬ）で洗った。有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥して真空濃縮した。粗製物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー ［酢酸エチルのシクロヘキサン溶液の段階的勾配による溶離］によって精製した 。収率５５ないし７０％。¹Ｈ−³¹Ｐ−ＮＭＲのデータは上記に示す。 Ｓ ＡｇｒａｗａｌがＪｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ（１９９５）に記載したように５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチ ル）Ｎ−ペント−４−エノイル保護ヌクレオシドを得た。 Ｂ＝Ａ^PNT，Ｒ＝ｔＢｕ 収率５９％、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）:δ（ｐｐｍ）:８．６４(ｓ ，１Ｈ，Ｈ₂)，８．５２(ｌａｒｇｅ ｓ，１Ｈ，ＮＨ塩基)，８．１８(ｓ，１ Ｈ，Ｈ８)，７．４３−７．２３(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，６．８(ｍ，４Ｈ，芳香 族Ｈ)，６．４９(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，５．９４(ｍ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ₂−ＰＮ Ｔ)，５．２１(ｍ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ₂−ＰＮＴ)，４．７８(ｍ，１Ｈ，Ｈ３’) ，４．３５(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．８１(ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．６２(ｍ， ４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．４(ｍ，２Ｈ，Ｈ５’およびＨ５”)， ３．０５(ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂ＳおよびＣＯＣＨ₂ＣＨ₂−ＰＮＴ)，２．９８− ２．７２(ｍ，２Ｈ，Ｈ２’およびＨ２”)，２．５６(ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ −ＰＮＴ)，１．２７(３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃ＣＣＯ)，１．２１(４ｄ，１２Ｈ ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣ₃／Ｈ₃／ＰＯ₄）:δ（ｐｐｍ）:１４ ９．０６−１４８．９９，ＦＡＢ ＭＳ（＞Ｏ，ＮＢＡ）ｍ／ｚ：９２７［Ｍ＋ Ｈ］⁺． Ｂ＝Ｃ^PNT，Ｒ＝ｔＢｕ 収率６４％、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃／ＴＭＳ）:δ（ｐｐｍ）:８．２４(ｄ ，１Ｈ，Ｈ６)，７．３８−７．２０(ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ)，７．０５(ｄ，１Ｈ ，Ｈ５)，６．８(ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ)，６．２２(ｍ，１Ｈ，Ｈ１’)，５．７ ８(ｍ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ₂−ＰＮＴ)，５．０４(ｍ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ₂−ＰＮ Ｔ)，４．５６(ｍ，１Ｈ，Ｈ３’)，４．１７(ｍ，１Ｈ，Ｈ４’)，３．７６(ｓ ，６Ｈ，ＯＣＨ₃)，３．５５(ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂およびＣＨＮ)，３．３７ (ｍ，２Ｈ，Ｈ５’およびＨ５”)，２．９６(ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ)，２．７ ０(ｍ，１Ｈ，Ｈ２’及びＨ２”)，２．５０−２．３６(ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ₂Ｃ Ｈ₂−ＰＮＴ)，２．２２(ｍ，１Ｈ，Ｈ２”)，１．１４ ３ｓ，９Ｈ，（Ｍｅ）₃ ＣＣＯ）１．０６(４ｄ，１２Ｈ，ＣＨ（Ｍｅ）₂)，³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ／Ｈ₃／ＰＯ₄）:δ（ｐｐｍ）:１４８．９−１４８．３，ＦＡＢ ＭＳ（＞０， ＮＢＡ）ｍ／ｚ：９０３［Ｍ＋Ｈ］⁺． 実施例２１ ドデカチミジンＳＡＴＥ（Ｒ＝Ｍｅ）およびｔＢｕＳＡＴＥ（Ｒ＝ｔＢｕ）ホス ホジエステル（Ｘ＝０）ならびにホスホロチオノトリエステル（Ｘ＝Ｓ）の合成 ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.，３８１Ａ ）によりホスホルアミダイト化学を用い１０μｍｏｌのスケールで修飾オリゴヌ クレオチドの自動固相合成を行った。ホスホルアミダイト（Ｒ＝ＭｅまたはｔＢ ｕ）の０．１Ｍ溶液および０．５Ｍテトラゾールにより４分間かけて第１、第２ 、および第３カップリング反応を行い、さらに１．５分間かけて次のカップリン グ工程を行った。オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホトリエステル（Ｘ＝Ｏ ）の調製に必要な酸化反応は、ｔｅｒ−ブチルヒドロペルオキシドの１．１Ｍト ルエン／ジクロロメタン（３．６／６．４，ｖ／ｖ）溶液により１．８分間を要 して行った。オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオノトリエステル（Ｘ ＝Ｓ）の調製に要する酸化的硫化反応は結晶性３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール −３−オン−１，１−ジオキシド（“Ｂｅａｕｃａｇｅ"試薬）の０．０５Ｍア セトニトリル溶液により行った。硫化反応は１．４分間を要して行った。オリゴ ヌクレオチドの５’−末端にホスホロチオエートトリエステル結合を得るために (最後の取り込み)、酸化的硫化を前記Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を用いるかまたは元 素硫黄の５％二硫化炭素／ピリジン（１／１，ｖ／ｖ）溶液で８分間処理して行 った。 １０μｍｏｌ合成に続いて第３の多孔質ガラスピース固相担体にアルゴンをフ ラッシュした後室温下で２０分間紫外線（＞２８０ｎｍ，パイレックスフィルタ ー）を照射した。懸濁液を濾過し、得られた溶液を蒸発させた。残留物をジオキ サン／水（５／３、ｖ／ｖ）溶液に再溶解し、減圧凍結乾燥してオリゴヌクレオ チドを白色粉末として得た。他の２つの第３の固相担体は第１の担体と同様に処 理した。 Ｘ＝０，Ｒ−Ｍｅ 収量 ２６．７ｍｇ， ³¹Ｐ ＮＭＲ（ジオキサン／Ｄ₂Ｏ：δ（ｐｐｍ）６８(１Ｐ)，０．３(１Ｐ) ，−１．０９（１０Ｐ） ＭＳ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：質量 計算値４９１０．３２，実験値４９０７． １， Ｘ＝Ｓ，Ｒ＝Ｍｅ 収量 ２７．５ｍｇ， ³¹Ｐ ＮＭＲ（ジオキサン／Ｄ₂Ｏ）:δ（ｐｐｍ）６８(１１)，５７．３（１ Ｐ） ＭＳ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：質量 計算値５０８７．０３，実験値５０９０ ．７ Ｘ＝Ｏ，Ｒ＝ｔＢｕ 収量 ４３ｍｇ， ³¹Ｐ ＮＭＲ（ジオキサン／Ｄ₂Ｏ）:δ（ｐｐｍ）６８．２(１Ｐ)，０．１ ４(１Ｐ)，−０．７８（１０Ｐ） ＭＳ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：質量 計算値５４１５．２９，実験値５４１７ ．８ Ｘ＝０，Ｒ＝ｔＢｕ 収量 ３５．１ｍｇ， ³¹Ｐ ＮＭＲ（ジオキサン／Ｄ₂Ｏ）:δ（ｐｐｍ）６８．４(１１Ｐ)，５７ ．５（１Ｐ） ＭＳ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：質量 計算値５５９２，実験値５５８７．３ 本発明の範囲及び精神から逸脱することのない本発明の前記の方法およびシス テムの種々の修正及び変更は当業者には明らかであろう。特定の好ましい態様に 関連させて本発明を説明したけれども、クレームする本発明をこのような特定態 様に不当に限定すべきでないことを理解する必要がある。実際に、生化学または 関連分野の専門家にとっては明白な、本発明を実施するための前記態様の種々の 修正は下記クレームの範囲内にあるというつもりである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年６月１１日（１９９８．６．１１） 【補正内容】 条約３４条に基づく補正書の翻訳文 （１）差し替え用紙第４−５頁の翻訳文：原翻訳文第３頁第15行目〜第５頁第14 行目を次のとおり補正する。 『発明の要約 本発明は、すぐれた化学的および生物物理学的特性を備えた、生体内で可逆性 の（ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）保護基を有するオリゴヌクレオチドに関する 。生体可逆性保護基はオリゴヌクレオチドに対してさらにヌクレアーゼ耐性を与 える。この生体可逆性保護基は内因性酵素によって細胞内、細胞サイトゾル内、 または生体外のサイトゾル抽出物内で除去される。本発明のある好ましいオリゴ ヌクレオチドにおいては、生体可逆性保護基がカルボキシエステラーゼによる切 断によって無保護のオリゴヌクレオチドを生成するように意図される。 本発明は構造Ｉ： の少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドに関する。 該オリゴヌクレオチドにおいて、ＹａおよびＹｂは独立してＯまたはＳとして選 ぶことができ、Ｒ₁およびＲ₂は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド として選ばれ、ｎは１ないし６であり、ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ 、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ⁺（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）として選ばれ、Ｚはヒ ドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、Ｙ₇はＯまたはＳであり、また Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである。 構造Ｉの好ましいオリゴヌクレオチドでは、ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、また はＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であるように選ばれる。構造Ｉの 他の好ましいオリゴヌクレオチドでは、ｎが２ないし４であるように選ばれ、と くに２が好ましい。 構造Ｉのある好ましいオリゴヌクレオチドでは、ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルであ る。さらに好ましい群では、ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである。Ｚがｔ−ブチルおよ びメチルである化合物がとくに好ましい。Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は好ましくはＣ₁ −Ｃ₂₀アルキル、より好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、さらにより好ましくはメチ ルである。 また本発明は構造II： の上記オリゴヌクレオチド化合物の調製用前駆物質として有用なアミダイト化合 物に関する。該アミダイト化合物では、Ｐｇがヌクレオチド遮断基、Ｂが複素環 式塩基、Ｙ₁がＳでＹ₂がＯもしくはＳであるかまたはＹ₁がＯでＹ₂がＳであり、 Ｒ₃およびＲ₄が独立してヒドロカルビルであるかまたはＲ₃とＲ₄が共に窒素複素 環式環の一部であり、ＱがＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキル 、ｎが１ないし６、ＷがＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝ Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ⁺（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）、Ｚがヒドロカルビルまたは置換ヒドロカ ルビル、ＸがＯ、Ｓ、またはＣＨ₂、Ｙ₇がＯまたはＳ、またＲ₅、Ｒ₆、およびＲ₇ が独立してヒドロカルビルである。 構造IIの好ましいアミダイト化合物では、ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−ＺまたはＳ −Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であるように選ばれる。構造IIの他 の好ましいオリゴヌクレオチドでは、ｎが２または４であるように選ばれ、とく に２が好ましい。 構造IIのさらに好ましいアミダイト化合物では、ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルであ る。さらに好ましい群ではＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである。Ｚがｔ−ブチルおよ びメチルである化合物がとくに好ましい。Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇が好ましくはＣ₁ −Ｃ₂₀ アルキル、より好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、さらにより好ましくはメチルであ る。 構造IIのこれ以外の好ましいアミダイト化合物では、Ｂがアデニン、グアニン 、』 （２）差し替え用紙第７頁の翻訳文：原翻訳文第６頁下から第６行目〜第７頁第 10行目を次のとおり補正する。 「を有する担体担持シントンを提供し、式中、Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたは Ｓ、Ｒ₁はヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド、Ｒ₂はＬ_p−（Ｐ）(式中、Ｌ_P は光に不安定なリンカー、また（Ｐ）は固相担体)、ｎは１ないし６、ＷはＳ− Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ⁺（Ｒ₅）(Ｒ₆)( Ｒ₇)、Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビル、Ｙ₇はＯまたはＳ、また 、Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである。好ましい態様ではＬ_p は、 Ｙ₃−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｙ₄−Ｐ（＝Ｙ₅）(Ｙ₆−Ｒ₁₀)−ＮＨ であり、式中、Ｙ₃、Ｙ₄、Ｙ₅、およびＹ₆は独立してＯまたはＳ、Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀ アリール、ｑは１−７、またＲ₁₀はＨまたは非塩基性もしくは非求核性条件下 で除去しうる保護基である。 さらに別の態様では本発明は、本発明の化合物を調製するのに有用な機能的固 相担体を提供する。好ましい態様では、該固相担体は式：Ｒ₁₁−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₉ ）−（ＣＨ₂）_q−Ｏ−Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ−Ｒ₁₀)−ＮＨ−（Ｐ）を有する化合物を 有し、式中Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリール、ｑは１−７、Ｙ₇はＯまたはＳであり、Ｒ_{1 0} はＨまたは非塩基性または非求核性条件下で除去しうる保護基、Ｒ₁₁は酸に不 安定な保護基、また（Ｐ）は固相担体である。」 （３）差し替え用紙第23頁の翻訳文：原翻訳文第21頁第14行目〜第22頁第９行目 を次のとおり補正する。 「単純な反応計画に従ってジチミジン化合物１−２の合成を行った。アセトニト リル中にテトラゾールを存在させてジチミジンホスホルアミダイトをｔｅｒｔ− ブチル−Ｓ−アシル−チオエタノールと縮合させ、得られたホスフィットトリエ ステルを最後にｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは元素硫黄により酸化 させて、それぞれ５’および３’−ヒドロキシルの脱保護後、それぞれのダイマ ーを得た。 オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８１Ａまた は３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により合成した。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０（２５ ０ＭＨＺ）分光光度計により¹Ｈおよび³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを記録した。¹Ｈ 及び³¹ＰのＮＭＲ化学シフトは内部標準として採用したＣＤＣｌ₃、ＣＤ₃ＣＯＣ Ｄ₃またはＣＤ₃ＣＮに対して測定した。高速原子衝撃質量スペクトル（ＭＳ）は Ｊｅｏｌ Ｄｘ３００質量分光光度計により正または負のイオンモードでチオグ リセロール（ＧＴ）またはニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）マトリックスを 用いて記録した。薄層クロマトグラフィーはキーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ^R ）６０Ｆ₂₅₄プレート（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）を用いて行い、紫外線および硫酸噴霧 によって検出した。カラムクロマトグラフィーにはシリカゲル６０を使用した。 トリエステルの安定性はオンライン清浄化法（ｏｎ−ｌｉｎｅ ｃｌｅａｎｉｎ ｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるＨＰＬＣにより、逆相Ｃ₁₈カラム（３μｍ，ハイパ ージル(Ｈｙｐｅｒｓｉｌ)，１５０×４，６ｍｍ）を用い、１００％Ａから１０ ０％Ｂまでの４０分間の勾配（Ａ：０．０５Ｍ ＴＥＡＡｃ；ｐＨ＝７．０；Ｂ ：５０：５０ ＣＨ₃ＣＮ：０．０５Ｍ ＴＥＡＡｃ；流速：１ｍｌ／分）によ って測定した。各タイムポイントごとに注入前に０．５％ＤＭＳＯとともにダイ マーホスホトリエステル（５×１０^-5Ｍ）またはプロオリゴヌクレオチド（１０^-5 Ｍ）を含有する１００μｌの培地（培養液＝ＲＰＭＩ１６４０^R＋１０％子ウ シ胎児血清または全細胞抽出物）を３７℃に加温した。」 （４）差し替え用紙第26頁の翻訳文：原翻訳文第24頁第18行目〜第25頁第18行目 を次のとおり補正する。 「ａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９１(１９９３)。ＤＮＡ合成機 によりメチルメチルホスホンアミダイト、β−シアノエチルホスホルアミダイト 、またはチオホスホルアミダイトシントンを用いてキメラメチルホスホノジエス テル／ホスホロジチオエートおよびメチルホスホノジエステル／ホスホロジチオ エ ートオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。酸化剤としてはヨウ素−水−ピリ ジン−ＴＨＦ（０．１Ｍ：１：１０：４０）溶液であり硫化剤としてはＢｅａｕ ｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシ ド）の溶液である。メチルホスホネート主鎖を分解させる濃水酸化アンモニウム 処理を避けるために最終的に迅速に除去するようにＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担体と オリゴマーの間にオキサリルリンカー（Ａｌｕｌ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ .，１９９１，１９，１５２７）を用いて合成を達成させた。Ｂ ａｒｂｅｒ， Ｉ．らのＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ.，１９９ ５，５，１４４１も参照されたい。該オリゴヌクレオチドはＣ−１８逆相カラム を使用するＨＰＬＣにより、溶離剤として増加的量のアセトニトリルのトリエチ ルアンモニウムアセテート溶液（０．０５Ｍ，ｐＨ７．０）を用いて精製した。 実施例５ オリゴデオキシヌクレオチド合成後のアルキル化 ６０当量のＭｅＳＡＴＥヨウ化物（１２．５μｌ，アセトニトリル中９４０ｍ Ｍ）および２，６−ルチジン（６０μｕｌ，アセトニトリル中１００ｍＭ）のア セトニトリル（５７μｌ）溶液を用いて、オリゴヌクレオチド（１３０μｌ，水 中１．５ｍＭ）のＳＡＴＥアルキル化を行う。反応はＨＰＬＣによりモニターし 、モノおよびジアルキル化生成物の一時的生成が認められた後、完全アルキル化 プロオリゴ（ｐｒｏｏｌｉｇｏ）がほぼ定量的収率で生成し、ＨＰＬＣによる精 製及びＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ１８^Rによる脱塩後純粋な形で得られる。 室温において（３時間）において４８当量のＰＯＭヨウ化物誘導体（１５μｌ ，アセトニトリル中６９０ｍＭ）およびルチジン（１５μｌ，アセトニトリル中 ６９０ｍＭ）のアセトニトリル／水（２４０μｌ，１：１，ｖ／ｖ）溶液を用い てオリゴヌクレオチド（３０μｌ，水中７．２ｍＭ）のＰＯＭアルキル化を行う 。ＨＰＬＣによる精製およびＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ１８^Rによる脱塩後、予想され るビオチン共役プロオリゴが単離される。」 （５）差し替え用紙第43−49頁の翻訳文：原翻訳文第42頁〜第47頁を次のとおり 補正する。 「 請求の範囲 １．構造： （式中、 Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁およびＲ₂は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり； Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり；そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） のヌクレオチド間結合少なくとも一つを有するオリゴヌクレオチド。 ２．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ３．ＷがＳ−Ｓ−Ｚである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ４．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ⁺（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）である、請求項１記 載のオリゴヌクレオチド。 ５．ｎが２である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ６．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ７．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 ８．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ９．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 １０．Ｚがプロピルまたはｔ−ブチルである、請求項２記載のオリゴヌクレオ チド。 １１．Ｚがメチルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 １２．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項４記載 のオリゴヌクレオチド。 １３．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４記載 のオリゴヌクレオチド。 １４．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項４記載のオリゴヌクレオ チド。 １５．構造 （式中、 Ｐｇはヌクレオチド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁はＯでありＹ₂はＳであ り、 Ｒ₃およびＲ₄は独立してヒドロカルビルであるかまたはＲ₃とＲ₄が共に窒素複 素環式環の一部であり、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ、またはＣＨ₂であり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 １６．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚである、請求項１５記載の化合物。 １７．ＷがＳ−Ｓ−Ｚである、請求項１５記載の化合物。 １８．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇)である、請求項１５ 記載の化合物。 １９．ｎが２である、請求項１５記載の化合物。 ２０．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ２１．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１６記載の化合物。 ２２．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ２３．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１６記載の化合物。 ２４．Ｚがｉ−プロピルまたはｔ−ブチルである、請求項１６記載の化合物。 ２５．Ｚがメチルである、請求項１６記載の化合物。 ２６．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１８記 載の化合物。 ２７．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１８記 載の化合物。 ２８．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項１８記載の化合物。 ２９．Ｂがプリンまたはピリミジンである、請求項１５記載の化合物。 ３０．プリンまたはピリミジンが塩基安定性保護基生じる環外アミンを含む、 請求項２９記載の化合物。 ３１．プリンまたはピリミジンがアデニン、グアニンまたはシトシンである、 請求項３０記載の化合物。 ３２．保護基がペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオ キシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタ ンスルフェニルからなる群から選択される基である、請求項３０記載の化合物。 ３３．Ｐｇがトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピ クシルである、請求項１５記載の化合物。 ３４．Ｐｇがジメトキシトリチルである、請求項３３記載の化合物。 ３５．Ｒ₃およびＲ₄の各々がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである、請求項１５記載の化 合物。 ３６．Ｒ₃およびＲ₄の各々がイソ−プロピルである、請求項１５記載の化合物 。 ３７．Ｙ₁がＯであり、そしてＹ₂がＳである、請求項１５記載の化合物。 ３８．Ｙ₁がＳであり、そしてＹ₂がＯである、請求項１５記載の化合物。 ３９．Ｙ₁がＳであり、そしてＹ₂がＳである、請求項１５記載の化合物。 ４０．ＱがＨである、請求項１５記載の化合物。 ４１．ＱがＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ４２．ＱがＦである、請求項１５記載の化合物。 ４３．構造 （式中、 Ｐｇはヌクレオシド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁がＯでありＹ₂がＳであ り、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ，またはＣＨ₂、あり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである）を有する化合物。 ４４．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４３記載の化合物。 ４５．Ｚがｔ−ブチルである、請求項４３記載の化合物。 ４６．Ｚがメチルである、請求項４３記載の化合物。 ４７．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項４３記 載の化合物。 ４８．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４３記 載の化合物。 ４９．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項４３記載の化合物。 ５０．Ｂがプリンまたはピリミジンである、請求項４３記載の化合物。 ５１．プリンまたはピリミジンが塩基安定性保護基生じる環外アミンを含む、 請求項５０記載の化合物。 ５２．プリンまたはピリミジンがアデニン、グアニンまたはシトシンである、 請求項５１記載の化合物。 ５３．保護基がペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオ キシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタ ンスルフェニルからなる群から選択される基である、請求項５１記載の化合物。 ５４．Ｐｇがトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピ クシルである、請求項４３記載の化合物。 ５５．Ｐｇがジメトキシトリチルである、請求項４３記載の化合物。 ５６．Ｙ₂がＳである、請求項４３記載の化合物。 ５７．構造（式中、 Ｙは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 Ｒ₂はＬ_p−（Ｐ）(式中、Ｌ_pは光に不安定なリンカーであり、そして（Ｐ）は 固相担体である)、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 ５８．Ｌ_pは、 Ｙ₃−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｙ₄−Ｐ（＝Ｙ₅）(Ｙ₆−Ｒ₁₀)−ＮＨ （式中、 Ｙ₃、Ｙ₄、Ｙ₅、およびＹ₆は独立してＯまたはＳであり； Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリールであり； ｑは１−７であり；そして Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性もしくは非求核性条件下で除去しうる保護基である） である、請求項５７記載の化合物。 ５９．Ｙ₄，Ｙ₅およびＹ₆がＯである、請求項５８記載の化合物。 ６０．Ｒ₉がニトロフェニルである、請求項５８記載の化合物。 ６１．ｑが１また２である、請求項５８記載の化合物。 ６２．Ｒ₁₀がシアノエチル、Ｃ₁−₂₀アルキルまたはＣ₆−Ｃ₂₀アルキルである 、請求項５８記載の化合物。 ６３．(Ｐ)が孔ガラスにより制御される、請求項５７記載の化合物。 ６４．式： Ｒ₁₁−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｏ−Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ−Ｒ₁₀)−ＮＨ−（ Ｐ） （式中、 Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリールであり； ｑは１−７であり； ＹはＯまたはＳであり； Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性または非求核性条件下で除去しうる保護基であり；」 【手続補正書】 【提出日】１９９９年９月１日（１９９９．９．１） 【補正内容】 請求の範囲を次のとおり補正する。 『１．構造： （式中、 Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁およびＲ₂は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり； Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり；そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） のヌクレオチド間結合少なくとも一つを有するオリゴヌクレオチド。 ２．構造 （式中、 Ｐｇはヌクレオチド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁はＯでありＹ₂はＳであ り、 Ｒ₃およびＲ₄は独立してヒドロカルビルであるかまたはＲ₃とＲ₄が共に窒素複 素環式環の一部であり、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ、またはＣＨ₂であり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 ３．構造（式中、 Ｐｇはヌクレオシド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁がＯでありＹ₂がＳであ り、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ，またはＣＨ₂、あり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである）を有する化合物。 ４．構造 （式中、 Ｙは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 Ｒ₂はＬ_p−（Ｐ）(式中、Ｌ_pは光に不安定なリンカーであり、そして（Ｐ）は 固相担体である)、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 ５.式： Ｒ₁₁−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｏ−Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ−Ｒ₁₀)−ＮＨ−（ Ｐ） （式中、 Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリールであり； ｑは１−７であり； ＹはＯまたはＳであり； Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性または非求核性条件下で除去しうる保護基であり； Ｒ₁₁は酸に不安定な保護基であり、そして （Ｐ）は固体である） を有する化合物。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 49/00 49/00 Ｚ (31)優先権主張番号 ０８／８１６，５７０ (32)優先日 平成９年３月13日(1997．3．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ゴセリン，ジル フランス共和国エフ―34080 モンペリエ ー，アヴニュー・ポル・ランボー 400, リュー・カルヴァン 83，レズィダーン ス・“パルク・デ・アルソー" (72)発明者 レイナー，ベルナール フランス共和国エフ―34730 サンヴァン サン・ド・バルベーラルゲ，アンパッス・ デュ・ヴァロン・デ・ラン 112 (72)発明者 モルヴァン，フランソワ フランス共和国エフ―34170 カステルノ ー―ル―レ，リュー・ド・ロパル 17，ク ロ・デ・ガリゲ (72)発明者 ヴァスー，ジャン―ジャック フランス共和国エフ―34980 コンバイロ ー，シュマン・デ・ペイリディッセ 610

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．構造： （式中、 Ｙ_aおよびＹ_bは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁およびＲ₂は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり； Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり；そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） のヌクレオチド間結合少なくとも一つを有するオリゴヌクレオチド。 ２．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ３．ＷがＳ−Ｓ−Ｚである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ４．ＷがＳ−Ｓ−Ｚ.（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）である、請求項 １記載のオリゴヌクレオチド。 ５．ｎが２である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ６．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ７．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 ８．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ９．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 １０．Ｚがプロピルまたはｔ−ブチルである、請求項２記載のオリゴヌクレオ チド。 １１．Ｚがメチルである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 １２．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項４記載 のオリゴヌクレオチド。 １３．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４記載 のオリゴヌクレオチド。 １４．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項４記載のオリゴヌクレオ チド。 １５．構造 （式中、 Ｐｇはヌクレオチド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁はＯでありＹ₂はＳであ り、 Ｒ₃およびＲ₄は独立してヒドロカルビルであるかまたはＲ₃とＲ₄が共に窒素複 素環式環の一部であり、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ、またはＣＨ₂であり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 １６．ＷがＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚである、請求項１５記載の化合物。 １７．ＷがＳ−Ｓ−Ｚである、請求項１５記載の化合物。 １８．ＷがＳ−Ｓ−Ｚ.（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅）(Ｒ₆)（Ｒ₇）である、請求 項１記載のオリゴヌクレオチド。 １９．ｎが２である、請求項１５記載の化合物。 ２０．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ２１．ＺがＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１６記載の化合物。 ２２．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ２３．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１６記載の化合物。 ２４．Ｚがｉ−プロピルまたはｔ−ブチルである、請求項１６記載の化合物。 ２５．Ｚがメチルである、請求項１６記載の化合物。 ２６．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項１８記 載のオリゴヌクレオチド。 ２７．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１８記 載のオリゴヌクレオチド。 ２８．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項１８記載のオリゴヌクレ オチド。 ２９．Ｂがプリンまたはピリミジンである、請求項１５記載のオリゴヌクレオ チド。 ３０．プリンまたはピリミジンが塩基安定性保護基生じる環外アミンを含む、 請求項２９記載のオリゴヌクレオチド。 ３１．プリンまたはピリミジンがアデニン、グアニンまたはシトシンである、 請求項３０記載の化合物。 ３２．保護基がペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオ キシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタ ンスルフェニルからなる群から選択される基である、請求項３０記載のオリゴヌ クレオチド。 ３３．Ｐｇがトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピ クシルである、請求項１５記載の化合物。 ３４．Ｐｇがジメトキシトリチルである、請求項３３記載の化合物。 ３５．Ｒ₃およびＲ₄の各々がＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである、請求項１５記載の化 合物。 ３６．Ｒ₃およびＲ₄の各々がイソ−プロピルである、請求項１５記載の化合物 。 ３７．Ｙ₁がＯであり、そしてＹ₂がＳである、請求項１５記載の化合物。 ３８．Ｙ₁がＳであり、そしてＹ₂がＯである、請求項１５記載の化合物。 ３９．Ｙ₁がＳであり、そしてＹ₂がＳである、請求項１５記載の化合物。 ４０．ＱがＨである、請求項１５記載の化合物。 ４１．ＱがＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである、請求項１５記載の化合物。 ４２．ＱがＦである、請求項１５記載の化合物。 ４３．構造 （式中、 Ｐｇはヌクレオシド遮断基であり、 Ｂは複素環式塩基であり、 Ｙ₁はＳでありＹ₂はＯもしくはＳであるか、またはＹ₁がＯでありＹ₂がＳであ り、 ＱはＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−置換アルキルであり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 ＸはＯ、Ｓ，またはＣＨ₂、あり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである）を有する化合物。 ４４．ＺがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４３記載の化合物。 ４５．Ｚがｔ−ブチルである、請求項４３記載の化合物。 ４６．Ｚがメチルである、請求項４３記載の化合物。 ４７．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₂₀アルキルである、請求項４３記 載のオリゴヌクレオチド。 ４８．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇が独立にＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項４３記 載のオリゴヌクレオチド。 ４９．Ｒ₅，Ｒ₆，およびＲ₇がメチルである、請求項４３記載のオリゴヌクレ オチド。 ５０．Ｂがプリンまたはピリミジンである、請求項４３記載のオリゴヌクレオ チド。 ５１．プリンまたはピリミジンが塩基安定性保護基生じる環外アミンを含む、 請求項５０記載のオリゴヌクレオチド。 ５２．プリンまたはピリミジンがアデニン、グアニンまたはシトシンである、 請求項５１記載の化合物。 ５３．保護基がペント−４−エノイル、４−メチルスルフィニル−ベンジルオ キシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル、およびトリフェニル−メタ ンスルフェニルからなる群から選択される基である、請求項５１記載のオリゴヌ クレオチド。 ５４．Ｐｇがトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはピ クシルである、請求項４３記載の化合物。 ５５．Ｐｇがジメトキシトリチルである、請求項４３記載の化合物。 ５６．Ｙ₂がＳである、請求項４３記載の化合物。 ５７．構造（式中、 Ｙは独立してＯまたはＳであり、 Ｒ₁は独立してヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり、 Ｒ₂はＬ_P−（Ｐ）(式中、Ｌ_Pは光に不安定なリンカーであり、そして（Ｐ）は 固相担体である)、 ｎは１ないし６であり、 ＷはＳ−Ｓ−Ｚ、Ｓ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ、またはＳ−Ｃ（＝Ｙ₇）−Ｚ−Ｎ（Ｒ₅ ）(Ｒ₆)（Ｒ₇）であり、 Ｚはヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Ｙ₇はＯまたはＳであり、そして Ｒ₅、Ｒ₆、およびＲ₇は独立してヒドロカルビルである） を有する化合物。 ５８． Ｌ_Pは、 Ｙ₃−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｙ₄−Ｐ（＝Ｙ₅）(Ｙ₆−Ｒ₁₀)−ＮＨ （式中、 Ｙ₃、Ｙ₄、Ｙ₅、およびＹ₆は独立してＯまたはＳであり； Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリールであり； ｑは１−７であり；そして Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性もしくは非求核性条件下で除去しうる保護基である） である、請求項５７記載の化合物。 ５９．Ｙ₄，Ｙ₅およびＹ₆がＯである、請求項５８記載の化合物。 ６０．Ｒ₉がニトロフェニルである、請求項５８記載の化合物。 ６１．ｑが１また２である、請求項５８記載の化合物。 ６２．Ｒ₁₀がシアノエチル、Ｃ₁−₂₀アルキルまたはＣ₆−Ｃ₂₀アルキルである 、請求項５８記載の化合物。 ６３．(Ｐ)が孔ガラスにより制御される、請求項５７記載の化合物。 ６４．式： Ｒ₁₁−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₉）−（ＣＨ₂）_q−Ｏ−Ｐ（＝Ｙ₇）(Ｏ−Ｒ₁₀)−ＮＨ−（ Ｐ） （式中、 Ｒ₉はＣ₆−Ｃ₂₀アリールであり； ｑは１−７であり； Ｒ₁₀はＨまたは非塩基性または非求核性条件下で除去しうる保護基であり； Ｒ₁₁は酸に不安定な保護基であり；そして （Ｐ）は固相担体である） を有する化合物。 ６５．Ｒ₉がニトロフェニルである、請求項６４記載の化合物。 ６６．ｑが１また２である、請求項６４記載の化合物。 ６７．Ｒ₁₀がシアノエチル、Ｃ₁−₂₀アルキルまたはＣ₆−Ｃ₂₀アルキルである 、請求項６４記載の化合物。 ６８．Ｒ₁₁がジメトキシトリチルである、請求項６４記載の化合物。 ６９．(Ｐ)が孔ガラスにより制御される、請求項６４記載の化合物。