PL201637B1 - Ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym, oczyszczony i nie występujący w przyrodzie, kompleks zawierający ligand tenascyny C i sposób wytwarzania kompleksu, oraz zastosowanie liganda tenascyny C - Google Patents

Abstract

Wynalazek obejmuje b ed ace kwasami nukleinowymi specyficzne ligandy tenascyny C. Ponad- to, wynalazek obejmuje kompleks zawieraj acy ligand tenascyny-C i znacznik, a tak ze sposób wytwa- rzania tego kompleksu, który jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce. Wynalazek obejmuje tak ze zastosowanie ligandu tenascyny-C do wytwarzania srodka terapeutycznego do leczenia chorób wybranych z grupy obejmuj acej raka, luszczyc e i mia zd zyc e. PL PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 353357	(11) 201637 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 28.01.2000	(51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.01.2000, PCT/US00/02167	C12P 19/34 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	08.02.2001, WO01/09390 PCT Gazette nr 06/01

Ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym, oczyszczony i nie występujący (54) w przyrodzie, kompleks zawierający ligand tenascyny C i sposób wytwarzania kompleksu, oraz zastosowanie liganda tenascyny C

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	GILEAD SCIENCES , INC.,Foster City,US
29.07.1999,US,09/364,902	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.11.2003 BUP 23/03	Brian Hicke,Boulder,US Stephen Warren,Boulder,US David Parma,Boulder,US Larry Gold,Boulder,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik:
	Jan Surmiak, KULIKOWSKA & KULIKOWSKI

⁽⁵⁷⁾ Wynalazek obejmuje będące kwasami nukleinowymi specyficzne ligandy tenascyny C. Ponadto, wynalazek obejmuje kompleks zawierający ligand tenascyny-C i znacznik, a także sposób wytwarzania tego kompleksu, który jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce. Wynalazek obejmuje także zastosowanie ligandu tenascyny-C do wytwarzania środka terapeutycznego do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej raka, łuszczycę i miażdżycę.

PL 201 637 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym, oczyszczony i nie wystę pują cy w przyrodzie, kompleks zawierają cy ligand tenascyny C i sposób wytwarzania kompleksu, oraz zastosowanie liganda tenascyny C. Wynalazek znajduje zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania kompleksu do stosowania w diagnostyce oraz do wytwarzania środka terapeutycznego do leczenia chorób.

Tenascyna C jest heksameryczną glikoproteiną o masie cząsteczkowej 1,1-1,5 milionów Da, występującą głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej. Ekspresja tenascyny C zachodzi podczas embriogenezy, gojenia się ran i powstawania nowotworów, co sugeruje rolę tego białka w przebudowie tkanek (Erickson i Bourdon (1989) Ann. Rev. Cell. Biol. 5: 71-92). Proces tworzenia nowotworu również obejmuje przebudowę tkanek i tenascyna C ulega nadekspresji w wielu rodzajach nowotworów, włącznie z rakami płuc, sutka, gruczołu krokowego i okrężnicy, gwiaździakami, glejakami, czerniakami i mięsakami (Soini i in. (1993) Am. J. Glin. Pathol. 100 (2): 145-50; Koukoulis i in. (1991) Hum. Pathol. 22 (7): 636-43; Borsi i in.

(1992) Int. J. Cancer 52 (5): 688-92; Koukoulis i in. (1993) J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 25 (2): 285-95; Ibrahim i in. (1993) Hum. Pathol. 24 (9): 982-9; Riedl i in. (1998) Dis. Colon Rectum 41 (1): 86-92; Tuominen i Kallioinen (1994) J. Cutan. Pathol. 21 (5): 424-9; Natali i in. (1990) Int. J. Cancer 46 (4): 586-90; Zagzag i in. (1995) Cancer Res. 55 (4): 907-14; Hasegawa i in. (1997) Acta Neuropathol. (Berl) 93 (5): 431-7; Saxon i in. (1997) Pediatr. Pathol. Lab. Med. 17 (2): 259-66; Hasegawa i in. (1995) Hum. Pathol. 26 (8): 838-45). Ponadto, tenascyna C ulega nadekspresji w hiperproliferacyjnych chorobach skóry, np. w łuszczycy (Schalkwijk i in. (1991) Br. J. Dermatol. 124 (1) : 13-20) i w zmianach miażdżycowych (Fukumoto i in. (1998) J. Atheroscler. Thromb. 5 (1): 29-35; Wallner i in. (1999) Circulation 99 (10): 1284-9). Znakowane promieniotwórcze przeciwciała, które wiążą się z tenascyną C, stosuje się do obrazowania i leczenia nowotworów w warunkach klinicznych (Paganelli i in. (1999) Eur. J. Nucl. Med. 26 (4): 348-57; Paganelli i in. (1994) Eur. J. Nucl. Med. 21 (4): 314-21; Bigner i in. (1998) J. Glin. Oncol. 16 (6): 2202-12; Merlo i in. (1997) Int. J. Canc. 71 (5): 810-6).

Aptamery skierowane przeciw tenascynie C posiadają potencjalną użyteczność w diagnostyce i leczeniu raków, jak również w diagnostyce i leczeniu miażdżycy oraz w terapii łuszczycy. W porównaniu z przeciwciałami, aptamery są małe (7-20 kDa), bardzo szybko usuwane z krwi i syntetyzuje się je chemicznie. Szybkie usuwanie z krwi jest istotne podczas diagnostycznego obrazowania in vivo, gdy poziom we krwi jest główną przyczyną wysokiego tła, które zaciemnia obraz. Szybkie usuwanie z krwi może być też istotne w terapii, gdzie wysokie poziomy mogą przyczyniać się do toksyczności. Technika SELEX pozwala na szybką izolację aptamerów, a chemiczna synteza umożliwia łatwą i specyficzną wobec miejsca koniugację aptamerów z różnymi obojętnymi i biologicznie aktywnymi cząsteczkami. Dlatego też, aptamer skierowany przeciw tenascynie C powinien być użyteczny w terapii przeciwnowotworowej lub w diagnostycznym obrazowaniu in vivo lub ex vivo i/lub dostarczaniu różnych czynników terapeutycznych skompleksowanych z będącym kwasem nukleinowym ligandem tenascyny C do leczenia stanów chorobowych, w których zachodzi ekspresja tenascyny C.

Przez wiele lat obowiązywał dogmat, że kwasy nukleinowe odgrywają przede wszystkim rolę informacyjną. Dzięki metodzie znanej jako systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie, nazywanej procesem SELEX, stało się oczywiste, że kwasy nukleinowe, podobnie jak białka, wykazują zróżnicowanie budowy przestrzennej. Proces SELEX jest sposobem prowadzenia in vitro ewolucji cząsteczek kwasów nukleinowych o wysoce specyficznym wiązaniu z cząsteczkami docelowymi i opisano go w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/536 428, złożonym 11 czerwca 1990 r. i zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, obecnie zaniechanym, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 475 096 zatytułowanym „Nucleic Acid Ligands, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 270 163 (patrz też światowy opis patentowy numer 91/19813) zatytułowanym „Methods for Identyfying Nucleic Acid Ligands, z których każdy w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Każde z tych zgłoszeń, łącznie cytowanych w niniejszym opisie jako zgłoszenia patentowe SELEX, opisuje zasadniczo nowy sposób tworzenia będących kwasami nukleinowych ligandów jakichkolwiek pożądanych cząsteczek docelowych. Proces SELEX zapewnia klasę produktów, które określa się jako ligandy będące kwasami nukleinowymi lub aptamery; każdy z nich posiada unikalną sekwencję i każdy posiada właściwość specyficznego wiązania z pożądanym docelowym związkiem lub cząsteczką. Każdy ligand będący kwasem nukleinowym zidentyfikowany w procesie SELEX jest

PL 201 637 B1 specyficznym ligandem danego związku lub cząsteczki. Proces SELEX opiera się na unikalnym poglądzie, że kwasy nukleinowe posiadają dostateczną zdolność do tworzenia różnych struktur dwuwymiarowych i przestrzennych oraz dostateczny potencjał chemiczny w obrębie monomerów do działania jako ligandy (tworzenia par specyficznego wiązania) z właściwie każdym związkiem chemicznym, niezależnie od tego, czy jest monomeryczny, czy polimeryczny. W metodzie SELEX jako substancja docelowa mogą służyć cząsteczki jakiejkolwiek wielkości i składzie. Metoda SELEX, wykorzystywana w zastosowaniach wią zania z wysokim powinowactwem, obejmuje selekcję z mieszaniny potencjalnych oligonukleotydów oraz etapowe powtórzenia wiązania, rozdziału i amplifikacji, z zastosowaniem tego samego ogólnego schematu selekcji, aż do spełnienia właściwie dowolnego pożądanego kryterium powinowactwa i selektywności wiązania. Wychodząc od mieszaniny kwasów nukleinowych, korzystnie zawierających odcinek o sekwencji losowej, metoda SELEX obejmuje etapy kontaktowania mieszaniny z substancją docelową w warunkach sprzyjających wiązaniu, oddzielenia niezwiązanych kwasów nukleinowych od tych kwasów nukleinowych, które specyficznie związały się z cząsteczkami docelowymi, dysocjacji kompleksów kwas nukleinowy-substancja docelowa, amplifikacji kwasów nukleinowych oddysocjowanych z kompleksu kwas nukleinowy-substancja docelowa, z otrzymaniem mieszaniny kwasów nukleinowych wzbogaconych w ligand, a następnie powtarzania etapów wiązania, oddzielania, dysocjacji i amplifikacji tak wielu cykli, jak jest to konieczne do otrzymania wysoce specyficznych, będących kwasami nukleinowymi ligandów o wysokim powinowactwie do cząsteczki docelowej.

Autorzy niniejszego wynalazku uważają, że metoda SELEX wykazuje, iż kwasy nukleinowe jako związki chemiczne mogą tworzyć szerokie spektrum kształtów, rozmiarów i konformacji oraz są zdolne do tworzenia znacznie liczniejszych rodzajów wiązania i innych funkcji od tych wykazywanych przez kwasy nukleinowe w układach biologicznych.

Podstawową metodę SELEX zmodyfikowano w celu osiągnięcia licznych specyficznych celów. Na przykład, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/960 093, złożone 14 października 1992 r., obecnie zaniechane, oraz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 707 796, oba zatytułowane „Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure, opisują stosowanie procesu SELEX w połączeniu z elektroforezą żelową do selekcji cząsteczek kwasów nukleinowych o specyficznej charakterystyce strukturalnej, takiej jak zgięty DNA. Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/123 935, złożone 17 września 1993 r., zatytułowane „Photoselection of Nucleic Acid Ligands, obecnie zaniechane, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 763 177, zatytułowany „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 09/093 293, złożone 8 czerwca 1998 r., zatytułowane „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX opisują opartą na SELEX metodę selekcji ligandów będących kwasami nukleinowymi, zawierających fotoreaktywne grupy zdolne do wiązania i/lub sieciowania pod wpływem światła z cząsteczką docelową i/lub jej fotoinaktywacji. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 580 737, zatytułowany „High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Teophylline and Caffeine, opisuje metodę identyfikacji wysoce specyficznych będących kwasami nukleinowymi ligandów zdolnych do rozróżniania dwóch bardzo zbliżonych cząsteczek, które mogą nie być peptydami, nazwaną Counter-SELEX. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 567 588, zatytułowany „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX opisuje opartą na SELEX metodę, w której uzyskuje się wysoce wydajny rozdział pomiędzy oligonukleotydami posiadającymi wysokie i niskie powinowactwo do cząsteczki docelowej.

Metoda SELEX obejmuje też identyfikację będących kwasami nukleinowymi ligandów o wysokim powinowactwie, zawierających zmodyfikowane nukleotydy, które nadają Ugandom ulepszone właściwości, takie jak ulepszona stabilność in vivo lub właściwości zapewniające ulepszone dostarczanie. Przykłady takich modyfikacji obejmują chemiczne podstawienia w pozycjach rybozy i/lub grupy fosforanowej i/lub zasady. Zidentyfikowane w procesie SELEX, będące kwasami nukleinowymi ligandy zawierające zmodyfikowane nukleotydy przedstawiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 660 985, zatytułowanym „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, który opisuje oligonukleotydy zawierające pochodne nukleotydów chemicznie modyfikowane w pozycjach 5- i 2' pirymidyn. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 580 737, supra, opisuje wysoce specyficzne, będące kwasami nukleinowymi ligandy zawierające jeden lub więcej nukleotydów zmodyfikowanych w pozycji 2' grupą aminową (2'-NH2), w pozycji 2' atomem fluoru (2'-F) i/lub w pozycji 2' grupą O-metylową (2'-OMe). Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nu4

PL 201 637 B1 mer kolejny 08/264 029, złożone 22 czerwca 1994 r., zatytułowane „Novel Method of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement, obecnie zaniechane, opisuje oligonukleotydy zawierające różne pirymidyny zmodyfikowane w pozycji 2'.

Metoda SELEX obejmuje łączenie wyselekcjonowanych oligonukleotydów z innymi wyselekcjonowanymi oligonukleotydami i nienukleotydowymi jednostkami funkcjonalnymi jak opisano odpowiednio w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 637 459, zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX, i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych numer 5 683 867, zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX. Te zgłoszenia umożliwiają łączenie szerokiego spektrum kształtów i innych właściwości, a takż e właś ciwości wydajnej amplifikacji i replikacji oligonukleotydów z pożądanymi właściwościami innych cząsteczek.

Metoda SELEX obejmuje ponadto łączenie wyselekcjonowanych ligandów będących kwasami nukleinowymi ze związkami lipofilowymi oraz nieimmunogennymi związkami o wysokich masach cząsteczkowych w kompleksy diagnostyczne i terapeutyczne, jak opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/434 465, złożonym 4 maja 1995 r., zatytułowanym „Nucleic Acid Ligand Complexes. Każdy z wymienionych powyżej opisów i zgłoszeń patentowych, które opisują modyfikacje podstawowej procedury SELEX, specyficznie włączono w całości do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Niniejszy wynalazek opisuje sposób izolowania ligandów będących kwasami nukleinowych, które z wysoką specyficznością wiążą się z tenascyną C. W niniejszym opisie opisano ponadto będące kwasami nukleinowymi ligandy tenascyny C. Opisano również będące RNA ligandy tenascyny C o wysokim powinowactwie. Opisano ponadto będące RNA ligandy tenascyny C posiadające pirymidyny zmodyfikowane w pozycji 2' atomem fluoru i puryny zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe. Sposób wykorzystywany w niniejszym opisie do identyfikacji takich ligandów będących kwasami nukleinowymi nazwano SELEX, co stanowi akronim od angielskiej nazwy „Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment („systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie). Niniejszy opis obejmuje ligandy, które przedstawiono w tablicy 3 i 4 oraz na figurze 10.

Wynalazek ten obejmuje ponadto kompleks do stosowania w diagnostyce in vivo lub ex vivo. Ponadto, wynalazek ten obejmuje sposób dostarczania czynników terapeutycznych do leczenia lub zapobiegania chorobom dotyczących tkanek, w których zachodzi ekspresja tenascyny C. Ponadto, wynalazek ten obejmuje kompleks stosowany do dostarczania czynników terapeutycznych do leczenia lub zapobiegania chorobom dotyczącym tkanek, w których zachodzi ekspresja tenascyny C.

Ligand tenascyny-C będący kwasem nukleinowym, oczyszczony i nie występujący w przyrodzie, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest to ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

Korzystne jest, gdy ligand według wynalazku jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65, oraz gdy ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

Kompleks do stosowania w diagnostyce in vivo, zawierający ligand tenascyny-C będący kwasem nukleinowym oraz znacznik, charakteryzuje się tym, że będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C jest wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

Dla kompleksu według wynalazku korzystne jest, gdy ligand tenascyny C jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65 oraz gdy ligand tenascyny C ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

W kompleksie według wynalazku korzystne jest, gdy znacznik sprzężonych jest z chelatorem. Korzystnie jest, gdy znacznik wybiera się z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, związków magnetycznych i biotyny, korzystniej, gdy nuklidy promieniotwórcze wybiera się z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹ln, ³²P i ¹⁸⁶Re, a najkorzystniej, gdy znacznikiem jest technet-99m (Tc-99m).

Kompleks według wynalazku charakteryzuje się ponadto tym, że będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C obejmuje również łącznik, którym korzystnie jest grupa heksyloaminowa, a najkorzystniej gdy łącznikiem jest związek o strukturze

PL 201 637 B1

Dla kompleksu według wynalazku najkorzystniej jest, gdy jest nim związek o wzorze łącznik

w którym wszystkie A są 2'-OMe, wszystkie G, o ile nie wskazano inaczej, są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, wszystkie C są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F, wszystkie U są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F.

Sposób wytwarzania kompleksu składającego się z będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C oraz znacznika charakteryzuje się tym, że ligand wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65 oraz że wiąże się go kowalencyjne ze znacznikiem. Do wytwarzania kompleksu stosuje się ligand będący substancją jednorodną i posiadającą taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65, lub ligand posiadający taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

W sposobie według wynalazku korzystne jest, gdy znacznik jest sprzężony z chelatorem. Korzystnie jest, gdy znacznik wybiera się z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, związków magnetycznych i biotyny, korzystniej, gdy nuklidy promieniotwórcze wybiera się z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹I ³²P i ¹⁸⁶Re, a najkorzystniej gdy znacznikiem jest technet-99m (Tc-99m).

Dla sposobu według wynalazku korzystne jest też, gdy stosuje się ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym obejmuje dodatkowo łącznik, korzystnie gdy jest nim łącznik będący grupą heksyloaminową, a najkorzystniej gdy jest nim związek o strukturze /0— ρ-ο

ΗΝ II

Wynalazek obejmuje również zastosowanie będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny-C do wytwarzania środka terapeutycznego do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej raka, łuszczycę i miażdżycę, najkorzystniej do wytwarzania środka terapeutycznego do leczenia raka. Zastosowanie obejmuje środki do leczenia chorób w których zachodzi ekspresja tenascyny C poprzez

PL 201 637 B1 kowalencyjne wiązanie będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C z czynnikiem terapeutycznym w celu utworzenia kompleksu, gdzie będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny-C jest wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

Dla zastosowania według wynalazku korzystne jest, gdy ligand tenascyny C jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65, lub gdy ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.

Dla zastosowania według wynalazku równie korzystne jest, gdy znacznik jest sprzężony z chelatorem oraz gdy znacznik jest wybrany z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, związków magnetycznych i biotyny. Korzystnie gdy nuklid promieniotwórczy jest wybrany z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹ln, ³²P i ¹⁸⁶Re, a najkorzystniej gdy jest nim technet-99m (Tc-99m).

W zastosowaniu według wynalazku ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym obejmuje ponadto łącznik. Korzystne jest, gdy łącznikiem jest grupa heksyloaminowa, a najkorzystniej gdy łącznikiem jest związek o strukturze

ΗΝ οι ο— ρ-ο

II

Dla zastosowania według wynalazku korzystne jest, gdy obejmuje ono dodatkowo przyłączanie do kompleksu czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego.

Wynalazek zostanie bliżej objaśniony w szczegółowym opisie jego korzystnych rozwiązań oraz w przykładach wykonania, w połączeniu z załączonym rysunkiem, na którym fig. 1 przedstawia wiązanie puli RNA w SELEX z komórkami U251, fig. 2 przedstawia proponowaną strukturę drugorzędową aptamerów TTA1 i TTA1.NB, gdzie przedstawiono aptamery skoniugowane z chelatorem Tc-99m, wszystkie reszty A są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, a wszystkie reszty G, z wyjątkiem wskazanych, są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, a wszystkie reszty C i U są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F, fig. 3 przedstawia obrazy heteroprzeszczepów nowotworu U251 myszy, otrzymane przy użyciu TTA1 i TTA1.NB wyznakowanych Tc-99m, trzy godziny po iniekcji, fig. 4 przedstawia mikroskopowy obraz fluorescencyjny skrawka nowotworu, glejaka U251, wykonany trzy godziny po dożylnej iniekcji TTA1 wyznakowanego Rhodamine-Red-X, fig. 5 przedstawia sposób, w jaki Tc-99m i łącznik są przyłączone przez 5'G TTA1, fig. 6 przedstawia pobieranie po 3 godzinach TTA1/GS7641 przez heteroprzeszczepy różnych nowotworów ludzkich u myszy, w porównaniu z pobieraniem niewiążącego aptameru kontrolnego. ID/g = wstrzyknięta dawka/gram, fig. 7 przedstawia biodystrybucję 3 godziny po iniekcji TTA1/GS7641 wyznakowanego In-111 z zastosowaniem albo DOTA, albo DTPA jako chelatorów metali promieniotwórczych,gdzie ID/g = wstrzyknięta dawka/gram, fig. 8 przedstawia aptamer skoniugowany z DTPA, gdzie inln przedstawiono w postaci zchelatowanej przez DTPA, Fig. 9 przedstawia aptamer skoniugowany z DOTA, gdzie ¹¹¹ln przedstawiono w postaci zchelatowanej przez DOTA, natomiast fig. 10 przedstawia proponowaną strukturę drugorzędową aptameru TTA1, gdzie przedstawiono aptamer skoniugowany z chelatorem Tc-99m, w postaci wyznakowanej Tc-99m, a wszystkie reszty A są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, a wszystkie reszty G, z wyją tkiem wskazanych, są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, oraz wszystkie reszty C i U są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F.

Główny sposób wykorzystywany w niniejszym opisie do identyfikacji będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C nazwano procesem SELEX, co stanowi akronim od angielskiej nazwy „Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment („systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie) i obejmuje on (a) kontaktowanie badanej mieszaniny kwasów nukleinowych z tenascyną C (b) rozdział składników rzeczonej badanej mieszaniny na podstawie ich powinowactwa do tenascyny C i (c) amplifikację wyselekcjonowanych cząsteczek w celu otrzymania mieszaniny kwasów nukleinowych wzbogaconej w sekwencje kwasów nukleinowych o stosunkowo wyższym powinowactwie wiązania tenascyny C. Wynalazek ten obejmuje ponadto ligandy tenascyny C będące RNA. Wynalazek ten obejmuje także konkretne będące RNA ligandy tenascyny C przedstawione w tablicach 3 i 4 oraz na fig. 10. Bardziej szczegółowo, wynalazek ten obejmuje sekwencje kwasów nukleinowych, które są zasadniczo homologiczne do konkretnych będących kwasami nuklePL 201 637 B1 inowymi ligandów przedstawionych w tablicach 3 i 4 i na figurze 10 i które posiadają zasadniczo taką samą zdolność wiązania tenascyny C. Przez zasadniczo homologiczne rozumie się stopień homologii sekwencji pierwszorzędowej przekraczający 70%, najkorzystniej przekraczający 80%, a nawet jeszcze korzystniej przekraczający 90%, 95% lub 99%. Procent homologii podawany w niniejszym opisie oblicza się jako procent nukleotydów występujących w krótszej z dwóch sekwencji, którym przyporządkowane są identyczne reszty nukleotydowe w porównywanej sekwencji, kiedy można wprowadzać 1 przerwę na odcinku o długości 10 nukleotydów. Zasadniczo taka sama zdolność wiązania tenascyny C oznacza, że powinowactwo pozostaje w zakresie różniącym się o jeden lub dwa rzędy wielkości od powinowactwa ligandów opisanych w niniejszym opisie. Ustalanie, czy dana sekwencja - zasadniczo homologiczna do sekwencji konkretnie opisanych w niniejszym opisie - posiada taką samą zdolność wiązania tenascyny C, pozostaje w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie.

Przegląd homologii sekwencji będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C przedstawionych w tablicach 3 i 4 i na fig. 10 wykazuje, że sekwencje o niewielkiej lub braku homologii sekwencyjnej mogą posiadać zasadniczo taką samą zdolność wiązania tenascyny C. Z tego powodu, wynalazek ten obejmuje również będące kwasami nukleinowymi ligandy, które posiadają zasadniczo taką samą proponowaną strukturę lub motywy strukturalne i zdolność wiązania tenascyny C, jak będące kwasami nukleinowymi ligandy przedstawione w tablicach 3 i 4 i na fig. 10. Zasadniczo taką samą strukturę lub motywy strukturalne można postulować na podstawie przyporządkowania sekwencji z zastosowaniem programu Zukerfold (patrz Zuker (1989) Science 224: 48-52). Jak wiadomo w tej dziedzinie, do przewidywania struktury drugorzędowej i motywów strukturalnych można stosować inne programy komputerowe. Zasadniczo taką samą strukturę lub motyw strukturalny ligandów będących kwasami nukleinowymi w roztworze lub w postaci związanej można także proponować stosując NMR lub inne techniki znane w tej dziedzinie.

Jednym z celów niniejszego wynalazku jest zapewnienie kompleksu do stosowania w diagnostyce in vivo lub ex vivo, zawierającego jeden lub więcej będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C i jeden lub więcej znaczników. Niniejszy wynalazek obejmuje również sposób dostarczania czynników terapeutycznych do leczenia lub zapobiegania stanowi chorobowemu, w którym zachodzi ekspresja tenascyny C. Wynalazek ten obejmuje ponadto kompleks stosowany do dostarczania czynników terapeutycznych do leczenia lub zapobiegania stanom chorobowym, w których zachodzi ekspresja tenascyny C.

W niniejszym opisie stosuje się róż ne definicje i terminy w odniesieniu do aspektów niniejszego wynalazku. Dla ułatwienia zrozumienia opisu składowych tego wynalazku, wprowadza się następujące definicje:

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „ligand b ę dą cy kwasem nukleinowym oznacza nie występujący w naturze kwas nukleinowy mający pożądane działanie na substancję docelową. Będące kwasami nukleinowymi ligandy często określa się jako „aptamery. Substancją docelową według niniejszego wynalazku jest tenascyna C, stąd termin będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C. Pożądane działanie obejmuje, ale nie ogranicza się do wiązania z substancją docelową, katalitycznego zmieniania substancji docelowej, reagowania z substancją docelową w sposób, który modyfikuje/zmienia tę substancję lub jej aktywność funkcjonalną, kowalencyjnego przyłączania się do substancji docelowej jak w inhibitorze „samobójczym, ułatwiania reakcji między substancją docelową a inną cząsteczką. W korzystnym rozwią zaniu, działaniem jest powinowactwo specyficznego wiązania z cząsteczką docelową, gdzie taka cząsteczka docelowa jest przestrzenną strukturą chemiczną inną niż polinukleotyd wiążący się z ligandem będącym kwasem nukleinowym poprzez mechanizm, który głównie zależy od parowania zasad Watsona/Cricka lub tworzenia potrójnej helisy; przy czym ligand będący kwasem nukleinowym nie jest kwasem nukleinowym posiadającym znaną funkcję fizjologiczną wiązania przez cząsteczkę docelową. Ligandy będące kwasami nukleinowymi identyfikuje się w badanej mieszaninie kwasów nukleinowych, przy czym wymieniony ligand będący kwasem nukleinowym jest ligandem tenascyny C, metodą obejmującą a) kontaktowanie badanej mieszaniny z tenascyną C, gdzie kwasy nukleinowe posiadające zwiększone powinowactwo do tenascyny C w stosunku do badanej mieszaniny można oddzielać od pozostałej części badanej mieszany; b) oddzielanie od pozostałej części badanej mieszaniny kwasów nukleinowych o podwyższonym powinowactwie oraz c) amplifikację kwasów nukleinowych o podwyższonym powinowactwie z uzyskaniem wzbogaconej w ligand mieszaniny kwasów nukleinowych (patrz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 08/434 425, złożone 3 maja 1995 r., obecnie opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 789 157, który tym samym włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy).

PL 201 637 B1

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „badana mieszanina jest mieszaniną kwasów nukleinowych o różnej sekwencji, spośród których selekcjonuje się pożądany ligand. Źródłem badanej mieszaniny mogą być naturalnie występujące kwasy nukleinowe lub ich fragmenty, chemicznie zsyntetyzowane kwasy nukleinowe, enzymatycznie zsyntetyzowane kwasy nukleinowe lub kwasy nukleinowe przygotowane przez połączenie powyższych technik. W korzystnym rozwiązaniu, każdy kwas nukleinowy ma stałą sekwencję otaczającą losowy region dla ułatwienia procesu amplifikacji.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „kwas nukleinowy oznacza DNA, RNA, jednolub dwuniciowy, i wszelkie ich modyfikacje chemiczne. Modyfikacje obejmują, ale nie ograniczają się tych, które zapewniają inne grupy chemiczne wprowadzające dodatkowy ładunek, polaryzowalność, wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i topliwość zasad liganda będącego kwasem nukleinowym lub liganda będącego kwasem nukleinowym jako całości. Takie modyfikacje obejmują, ale nie ograniczają się do modyfikacji w pozycji 2' grupy cukrowej, modyfikacji w pozycji 5 pirymidyny, modyfikacji w pozycji 8 puryny, modyfikacji zewnątrzpierścieniowych grup aminowych, podstawień 4-tiourydyną, podstawień 5-bromo- lub 5-jodouracylem; modyfikacji szkieletu, metylacji, niezwykłych kombinacji zasad tworzących pary, takich jak izocytydyna i izoguanidyna i podobnych. Modyfikacje mogą też obejmować modyfikacje końców 3' i 5', takich jak tworzenie „czapeczki.

Metodologia z zastosowaniem „SELEX obejmuje kombinację selekcji będących kwasami nukleinowymi ligandów, które oddziałują z substancją docelową w pożądany sposób, na przykład wiążąc się z białkiem, z amplifikacją tych wyselekcjonowanych kwasów nukleinowych. Ewentualne powtarzane cykle etapów selekcji/amplifikacji pozwalają na wyselekcjonowanie jednego lub niewielkiej liczby kwasów nukleinowych, które najsilniej oddziałują z substancją docelową, z puli zawierającej bardzo dużą liczbę kwasów nukleinowych. Cykle procedury selekcji/amplifikacji kontynuuje się do uzyskania wybranego celu. W niniejszym wynalazku metodologię z zastosowaniem SELEK wykorzystuje się do otrzymywania będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C.

Metodologię z zastosowaniem SELEX opisano w zgłoszeniach patentowych SELEX.

„Substancja docelowa SELEX lub „substancja docelowa oznacza jakikolwiek związek lub cząsteczkę, które są przedmiotem zainteresowania, dla których pożądany jest ligand. Substancją docelową może być białko, peptyd, węglowodan, polisacharyd, glikoproteina, hormon, receptor, antygen, przeciwciało, wirus, substrat, metabolit, analog stanu przejściowego, kofaktor, inhibitor, lek, barwnik, składnik odżywczy, czynnik wzrostowy, itp., bez ograniczeń. W tym zgłoszeniu substancją docelową SELEX jest tenascyna C.

„Kompleks w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie oznacza jednostkę molekularną utworzoną przez kowalencyjne związanie jednego lub więcej będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C z jednym lub więcej znacznikami. W niektórych rozwiązaniach niniejszego wynalazku, kompleksy przedstawia się jako A-B-Y, gdzie A jest znacznikiem, B jest dowolny i stanowi łącznik, a Y jest będącym kwasem nukleinowym ligandem tenascyny C.

„Znacznikiem w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie jest jednostka lub jednostki molekularne, które gdy tworzą kompleks z będącym kwasem nukleinowym ligandem tenascyny C, bezpośrednio lub poprzez łącznik(ki) lub odstępnik(ki), umożliwiają wykrywanie kompleksów w układzie in vivo lub ex vivo sposobami wizualnymi lub chemicznymi. Przykłady znaczników obejmują, ale nie ograniczają się do nuklidów promieniotwórczych, włącznie z Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ³²P ¹⁸⁶Re; wszystkich fluoroforów, włącznie z fluresceiną, rodaminą, Texas Red; pochodnych powyższych fluoroforów, obejmujących Rhodamine-Red-X; związków magnetycznych oraz biotyny.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „łącznikiem jest jednostka molekularna, która łączy dwie lub więcej jednostek molekularnych poprzez wiązanie kowalencyjne lub oddziaływania niekowalencyjne i może umożliwić przestrzenne rozdzielenie jednostek molekularnych w sposób, który zachowuje funkcjonalne właściwości jednej lub więcej z jednostek molekularnych. Łącznik może być też znany jako odstępnik. Przykłady łączników obejmują, ale nie ograniczają się do struktur (CH2CH2O)6 i heksyloaminy przedstawionych na figurze 2.

„Terapeutyczny w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie obejmuje leczenie i/lub zapobieganie. Kiedy termin ten jest stosowany, odnosi się do ludzi lub innych zwierząt.

„Wiązanie kowalencyjne jest wiązaniem chemicznym tworzonym przez uwspólnienie elektronów.

„Oddziaływania niekowalencyjne są sposobem, poprzez który jednostki molekularne utrzymywane są ze sobą przez oddziaływania inne niż wiązania kowalencyjne, obejmujące oddziaływania jonowe i wiązania wodorowe.

PL 201 637 B1

W korzystnym rozwią zaniu, bę dące kwasami nukleinowymi ligandy według niniejszego wynalazku otrzymano stosując metodologię z wykorzystaniem SELEX. Proces SELEX opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/536 428, zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, obecnie zaniechanym, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 475 096, zatytułowanym „Nucleic Acid Ligands, oraz opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 270 163 (patrz także światowy opis patentowy numer 91/19813), zatytułowanym „Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands. Zgłoszenia te, z których każde specyficznie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy, łącznie nazywane są zgłoszeniami patentowymi SELEX.

Proces SELEX zapewnia klasę produktów będących cząsteczkami kwasów nukleinowych, z każd ą ma unikalną sekwencję i każda posiada właściwość specyficznego wiązania z pożądanym związkiem lub cząsteczką docelową. Cząsteczkami docelowymi są korzystnie białka, ale mogą nimi być między innymi węglowodany, peptydoglikany i wiele związków niskocząsteczkowych. Metodologię z zastosowaniem SELEX można także stosować w wobec struktur biologicznych, takich jak powierzchnie komórkowe lub wirusy, poprzez specyficzne oddziaływania z cząsteczką, która jest integralną częścią tej struktury.

W najbardziej podstawowej postaci, proces SELEX można zdefiniować jako szereg następujących etapów:

1) Przygotowuje się badaną mieszaninę kwasów nukleinowych o różnych sekwencjach. Badana mieszanina generalnie obejmuje regiony o stałych sekwencjach (tj. każdy ze składników badanej mieszaniny zawiera taką samą sekwencję w tym samym położeniu) i regiony o sekwencji losowej. Regiony sekwencji stałych wybiera się w celu albo (a) ułatwiania opisanych poniżej etapów amplifikacji, (b) naśladowania sekwencji, o której wiadomo, że wiąże się z substancją docelową, albo (c) zwiększania stężenia danego uporządkowania strukturalnego kwasów nukleinowych w badanej mieszaninie. Sekwencje losowe mogą być całkowicie losowe (tj. prawdopodobieństwo wystąpienia zasady w jakiejkolwiek pozycji wynosi jeden do czterech) lub tylko częściowo losowe (np. prawdopodobieństwo wystąpienia zasady w jakiejkolwiek pozycji można wybrać na dowolnym poziomie między 0 a 100 procent).

2) Badaną mieszaninę kwasów nukleinowych kontaktuje się z wybraną substancją docelową w warunkach sprzyjających wiązaniu pomiędzy substancją docelową a składnikami badanej mieszaniny. W tych okolicznościach oddziaływania pomiędzy substancją docelową a kwasami nukleinowymi z badanej mieszaniny moż na uważ a ć za tworzenie par kwas nukleinowy-substancja docelowa pomię dzy substancją docelową a tymi kwasami nukleinowymi, które posiadają najwyższe powinowactwo do substancji docelowej.

3) Kwasy nukleinowe o najwyższym powinowactwie do substancji docelowej oddziela się od tych kwasów nukleinowych, które mają niższe powinowactwo do substancji docelowej. Ponieważ w badanej mieszaninie występuje tylko skrajnie mała liczba sekwencji (a być może tylko jedna cząsteczka kwasu nukleinowego) odpowiadających kwasom nukleinowym o najwyższym powinowactwie, jest generalnie pożądane ustalenie takich kryteriów rozdziału, aby podczas rozdzielania była zachowywana znacząca ilość kwasów nukleinowych w badanej mieszaninie (około 5-50%).

4) Te kwasy nukleinowe, które wyselekcjonowano podczas rozdzielania jako posiadające stosunkowo wyższe powinowactwa do substancji docelowej, amplifikuje się następnie w celu utworzenia nowej badanej mieszaniny, która jest wzbogacona w kwasy nukleinowe posiadające stosunkowo wyższe powinowactwa do substancji docelowej.

5) Dzięki powtarzaniu powyższych etapów rozdzielania i amplifikacji, nowo tworzona badana mieszanina zawiera coraz mniej sekwencji unikalnych, a średni stopień powinowactwa kwasów nukleinowych do substancji docelowej generalnie wzrasta. W skrajnym wypadku, w procesie SELEX wytwarzana będzie badana mieszanina zawierająca jeden lub niewielką liczbę unikalnych kwasów nukleinowych odpowiadających kwasom nukleinowym z wyjściowej badanej mieszaniny posiadającym najwyższe powinowactwo do substancji docelowej.

Podstawową metodę SELEX modyfikowano w celu osiągnięcia licznych specyficznych celów. Na przykład, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/960 093, złożone 14 października 1992 r., obecnie zaniechane, i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 707 796, oba zatytułowane „Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure, opisują stosowanie procesu SELEX w połączeniu z elektroforezą żelową do selekcjonowania cząsteczek kwasów nukleinowych o szczególnych właściwościach strukturalnych, takich jak zgięty DNA. Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/123 935, złożone 17 wrze10

PL 201 637 B1 śnia 1993 r., zatytułowane „Photoselection of Nucleic acid Ligands, obecnie zaniechane, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 763 177, zatytułowany „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 09/093 293, zło żone 8 czerwca 1998 r, zatytułowane „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX, opisują opartą na SELEX metodę selekcjonowania będących kwasami nukleinowymi ligandów zawierających fotoreaktywne grupy zdolne do wiązania i/lub sieciowania pod wpływem światła z cząsteczką docelową i/lub jej fotoinaktywacji. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 580 737, zatytułowany „High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Teophylline and Caffeine, opisuje metodę identyfikowania wysoce specyficznych ligandów będących kwasami nukleinowymi, zdolnych do rozróżnienia bardzo zbliżonych cząsteczek, nazwaną Counter-SELEX. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 567 588, zatytułowany „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX, opisuje opartą na SELEX metodę, w której uzyskuje się wysoce efektywny rozdział pomiędzy oligonukleotydami posiadającymi wysokie i niskie powinowactwo do cząsteczki docelowej. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 496 938, zatytułowany „Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, opisuje metody otrzymywania ulepszonych ligandów będących kwasami nukleinowymi po przeprowadzeniu SELEX. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 705 337, zatytułowany „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX, opisuje metody kowalencyjnego wiązania liganda z jego substancją docelową.

Metoda SELEX obejmuje identyfikowanie będących kwasami nukleinowymi ligandów o wysokim powinowactwie zawierających zmodyfikowane nukleotydy nadających, ligandowi ulepszone właściwości, takie jak ulepszona stabilność in vivo lub właściwości zapewniające ulepszone dostarczanie. Przykłady takich modyfikacji obejmują chemiczne podstawienia w pozycjach rybozy i/lub grupy fosforanowej i/lub zasady. Zidentyfikowane przez SELEX, zawierające zmodyfikowane nukleotydy, ligandy będące kwasami nukleinowymi opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 660 985, zatytuł owanym „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, w którym opisano oligonukleotydy zawierają ce pochodne nukleotydów zmodyfikowane chemicznie w pozycjach 5 i 2' pirymidyn. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 637 459, supra, opisuje wysoce specyficzne ligandy będące kwasami nukleinowymi, zawierające jeden lub więcej nukleotydów zmodyfikowanych w pozycji 2' grupą aminową (2'-NH2), w pozycji 2' atomem fluoru (2' -F) i/lub w pozycji 2' grupą O-metylową (2'-OMe). Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/264 029, złożone 22 czerwca 1994 r., zatytułowane „Novel Method of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement, opisuje oligonukleotydy zawierające różne pirymidyny zmodyfikowane w pozycji 2'.

Metoda SELEX obejmuje łączenie wyselekcjonowanych oligonukleotydów z innymi wyselekcjonowanymi oligonukleotydami oraz nieoligonukleotydowymi jednostkami funkcjonalnymi, jak opisano odpowiednio w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerze 5 637 459, zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 683 867, zatytułowanym „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX. Zgłoszenia te umożliwiają łączenie szerokiego spektrum kształtów i innych właściwości oraz właściwości wydajnej amplifikacji i replikacji oligonukleotydów z pożądanymi właściwościami innych cząsteczek.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 496 938 opisano metody otrzymywania ulepszonych ligandów będących kwasami nukleinowymi po przeprowadzeniu procesu SELEX. Ten opis patentowy, zatytułowany „Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, specyficznie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 08/434 425, zatytułowane „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX, złożone 3 maja 1995 r, obecnie opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 789 157, opisuje metody identyfikacji będących kwasami nukleinowymi ligandów makrocząsteczkowych składników tkanek, włącznie z komórkami rakowymi, oraz zidentyfikowane w ten sposób ligandy bę d ą ce kwasami nukleinowymi. Ten opis patentowy specyficznie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Jednym z potencjalnych problemów napotykanych w diagnostycznym lub terapeutycznym stosowaniu kwasów nukleinowych jest to, że oligonukleotydy w swojej postaci fosfodiestrowej mogą być szybko degradowane w płynach organizmu przez wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe enzymy,

PL 201 637 B1 takie jak endonukleazy i egzonukleazy, zanim wystąpi pożądany wpływ. W celu zwiększenia stabilności in vivo liganda będącego kwasem nukleinowym lub zwiększenia bądź pośredniczenia w dostarczaniu liganda będącego kwasem nukleinowym, można dokonywać pewnych modyfikacji chemicznych ligandów będących kwasami nukleinowymi. Patrz np. zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/117 991, złożone 8 września 1993 r., obecnie zaniechane, i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,660,985, oba zatytułowane „High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, który specyficznie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Rozważane w tym wynalazku modyfikacje ligandów będących kwasami nukleinowymi obejmują, ale nie ograniczają się do tych, które zapewniają inne grupy chemiczne wprowadzające dodatkowy ładunek, polaryzowalność, hydrofobowość, wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i topliwość zasad liganda będącego kwasem nukleinowym lub liganda będącego kwasem nukleinowym jako całości. Takie modyfikacje obejmują, ale nie ograniczają się do modyfikacji w pozycji 2' grupy cukrowej, modyfikacji w pozycji 5 pirymidyn, modyfikacji w pozycji 8 puryn, modyfikacji amin zewnątrzpierścieniowych, podstawień 4-tiourydyną, podstawień 5-bromo lub 5-jodouracylem; modyfikacji szkieletu, modyfikacji tiofosforanowej lub alkilofosforanowej, metylacji, niezwykłych kombinacji zasad tworzących pary, takich jak izozasady izocytydyna i izoguanidyna i podobnych. Modyfikacje mogą również obejmować modyfikacje na końcach 3' 15', takie jak tworzenie „czapeczki. W korzystnych rozwiązaniach niniejszego wynalazku, ligandami będ ącymi kwasami nukleinowymi są cząsteczki RNA, które zmodyfikowano atomem fluoru (2'-F) w pozycji 2' grupy cukrowej reszt pirymidynowych.

Modyfikacje mogą być modyfikacjami wprowadzanymi przed lub po procesie SELEX. Modyfikacje przeprowadzane przed SELEX dają ligandy będące kwasami nukleinowymi zarówno o specyficzności wobec substancji docelowej w SELEX, jak i ulepszonej stabilności in vivo. Wynikiem modyfikacji po procesie SELEX, dokonanych w pozycji 2' w grupie OH liganda będącego kwasem nukleinowym, może być ulepszona stabilność in vivo bez niekorzystnego wpływu na zdolność wiązania liganda będącego kwasem nukleinowym.

Specjaliście w tej dziedzinie znane są inne modyfikacje. Takich modyfikacji można dokonywać po procesie SELEX (modyfikacje wcześniej zidentyfikowanych niezmodyfikowanych ligandów), lub można je wprowadzać w procesie SELEX.

Będące kwasami nukleinowymi ligandy według niniejszego wynalazku przygotowuje się z zastosowaniem metodologii SELEX, którą przedstawiono w ogólnym zarysie powyżej i dokładnie w zgłoszeniach SELEX, włączonych w całości do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Aptamery tenascyny C według niniejszego wynalazku wiążą się w miejscu wiązania heparyny na końcu COOH tenascyny C.

W niektórych rozwią zaniach niniejszego wynalazku, b ę d ą ce kwasami nukleinowymi ligandy tenascyny C według niniejszego wynalazku są użyteczne do celów diagnostycznych i można je stosować do obrazowania stanów patologicznych (tak jak obrazowanie nowotworów u człowieka). Poza diagnozowaniem, będące kwasami nukleinowymi ligandy tenascyny C są użyteczne w prognozowaniu i monitorowaniu stanów chorobowych, w których zachodzi ekspresja tenascyny C.

Czynniki diagnostyczne muszą jedynie być zdolne do umożliwiania identyfikacji obecności danej substancji docelowej w określonym miejscu lub stężeniu. Zwykła zdolność do tworzenia par wiązania z substancją docelową może być wystarczająca do wywołania dodatniego sygnału do celów diagnostycznych. Specjaliści w tej dziedzinie powinni potrafić, stosując procedury znane w tej dziedzinie, przystosować dowolny będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C do wprowadzenia znacznika w celu śledzenia obecności liganda będącego kwasem nukleinowym. Takie znaczniki można stosować w wielu procedurach diagnostycznych, takich jak wykrywanie guzów pierwotnych i przerzutów oraz zmian miażdżycowych. Znacznikami przykładowo podawanymi tutaj są technet-99m i ¹¹¹ln, jednakż e inne znaczniki, takie jak inne nuklidy promieniotwórcze, zwią zki magnetyczne, fluorofory, biotyna i podobne, można łączyć z będącymi kwasami nukleinowymi ligandami tenascyny C w celu obrazowania, w układach in vivo lub ex vivo, stanów chorobowych, w których zachodzi ekspresja tenascyny C (np. rak, miażdżyca i łuszczyca). Znacznik może być kowalencyjne związany w róż nych pozycjach bę dącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C, takich jak zewną trzpierścieniowa grupa aminowa zasady, pozycja 5 nukleotydu pirymidynowego, pozycja 8 nukleotydu purynowego, grupa hydroksylowa grupy fosforanowej lub grupa hydroksylowa bądź inna grupa na końcu 5' lub 3' będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C. W rozwiązaniach, w których znacznikiem jest technet-99m lub ¹¹¹ln, korzystnie jest on związany z grupą hydroksylową w pozycji 5' lub 3' grupy

PL 201 637 B1 fosforanowej lub w pozycji 5 zmodyfikowanej pirymidyny. W najkorzystniejszym rozwiązaniu, znacznik jest związany z grupą hydroksylową w pozycji 5' grupy fosforanowej liganda będącego kwasem nukleinowym, z łącznikiem lub bez niego. W innym rozwiązaniu, znacznik skoniugowany jest z ligandem będącym kwasem nukleinowym przez włączenie pirymidyny zawierającej w pozycji 5 pierwszorzędową grupę aminową i wykorzystanie grupy aminowej do koniugacji znacznika. Przyłączenia znacznika można dokonać bezpośrednio lub z wykorzystaniem łącznika. W rozwiązaniu, w którym jako znacznik stosuje się technet-99m lub ¹¹¹In, korzystnym łącznikiem jest łącznik heksyloaminowy, jak przedstawiono na figurze 10.

W innych rozwiązaniach, będące kwasami nukleinowymi ligandy tenascyny C są użyteczne do dostarczania związków terapeutycznych (obejmujących, ale nie ograniczających się do związków cytotoksycznych, substancji wzmacniających odporność i terapeutycznych nuklidów promieniotwórczych) do tkanek lub narządów, w których zachodzi ekspresja tenascyny C. Stany chorobowe, w których zachodzi ekspresja tenascyny C obejmują, ale nie ograniczają się do raka, miażdżycy i łuszczycy. Specjaliści w tej dziedzinie powinni potrafić, stosując procedury znane w tej dziedzinie, przystosować dowolny będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C do wprowadzenia związku terapeutycznego do kompleksu. Związek terapeutyczny może być kowalencyjne związany w różnych pozycjach będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C, takich jak zewnątrzpierścieniowa grupa aminowa zasady, pozycja 5 nukleotydu pirymidynowego, pozycja 8 nukleotydu purynowego, grupa hydroksylowa grupy fosforanowej lub grupa hydroksylowa bądź inna grupa na końcu 5' lub 3' będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik terapeutyczny jest związany z grupą aminową w pozycji 5' liganda będącego kwasem nukleinowym. Przyłączenia czynnika terapeutycznego można dokonać bezpośrednio lub z wykorzystaniem łącznika. W rozwiązaniach, w których chorobą docelową jest rak, wewnątrz cząsteczki w miejsce istniejących reszt U w będą cym kwasem nukleinowym ligandzie tenascyny C, można wprowadzać, bądź koniugować z dowolnym końcem, albo bezpośrednio, albo poprzez łącznik, 5-fluorodeoksyuracyl lub inne analogi nukleotydowe, o których wiadomo, że są aktywne wobec nowotworów. Ponadto, można wprowadzać zarówno analogi pirymidynowe, 2'2'-difluorocytydynę, jak i analogi purynowe (deoksykoformycynę). Ponadto, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/993 765, złożone 18 grudnia 1997 r., włączone w całości do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy, opisuje, między innymi, oparte na nukleotydach proleki zawierające będące kwasami nukleinowymi ligandy skierowane przeciw nowotworowi, na przykład przeciw tenascynie C, do precyzyjnego dostarczania do nowotworu czynników uwrażliwiających na chemio- i radioterapię, czynników uwrażliwiających na radioterapię, nuklidów promieniotwórczych i innych promieniotwórczych czynników terapeutycznych.

Bierze się również pod uwagę, że z będącym kwasem nukleinowym ligandem tenascyny C mogą być związane zarówno znacznik, jak i czynnik terapeutyczny, tak że wykrywanie stanu chorobowego i dostarczanie czynnika terapeutycznego prowadzi się łącznie przy użyciu jednego aptameru lub mieszaniny dwóch lub więcej różnych zmodyfikowanych wersji tego samego aptameru. Bierze się również pod uwagę, że znacznik i/lub czynnik terapeutyczny, bądź oba, mogą związane z nieimmunogennym związkiem o wysokiej masie cząsteczkowej lub związkiem lipofilowym, takim jak liposom. Metody koniugowania ligandów będących kwasami nukleinowymi ze związkami lipofilowymi lub nieimmunogennymi związkami o wysokiej masie cząsteczkowej w kompleksy diagnostyczne lub terapeutyczne opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/434 465, złożonym 4 maja 1995 r., zatytułowanym „Nucleic Acid Ligand Complexes, które włączono w całości do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Opisane w niniejszym opisie kompozycje terapeutyczne lub diagnostyczne można podawać pozajelitowo przez iniekcję (np. dożylną, podskórną, śródskórną, do zmiany chorobowej), chociaż możliwe są również inne skuteczne sposoby podawania, takie jak iniekcja dostawowa, inhalacje, postacie aktywne po podawaniu doustnym, jontoforeza przezskórna lub czopki. Można je również stosować miejscowo przez bezpośrednią iniekcję, mogą one być uwalniane z urządzeń, np. wszczepianych rurek lub cewników, bądź dostarczane bezpośrednio do miejsca pompami infuzyjnymi. Jednym z korzystnych nośników jest roztwór soli fizjologicznej, ale uważa się, że można stosować również inne nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. W jednym rozwiązaniu wykazano, że nośnik i będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C skompleksowany ze związkiem terapeutycznym stanowią fizjologicznie kompatybilną postać o przedłużonym uwalnianiu. Główny rozpuszczalnik w takim nośniku może mieć charakter wodny lub bezwodny. Ponadto, nośnik może zawierać inne farmakologicznie dopuszczalne zaróbki do modyfikowania lub utrzymywania pH, osmolalności, lepkości, klarowności, barwy,

PL 201 637 B1 jałowości, stabilności, szybkości rozpuszczania lub zapachu postaci. Podobnie, nośnik może zawierać jeszcze inne zaróbki dopuszczalne farmakologicznie do modyfikowania lub utrzymywania stabilności, szybkości rozpuszczania, uwalniania lub absorpcji będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C. Takimi zaróbkami są te substancje, które zwykle i zwyczajowo wykorzystuje się do nadawania postaci dawkom do podawania pozajelitowego w preparaty jedno- lub wielodawkowe.

Po nadaniu postaci kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej, można ją przechowywać w jałowych fiolkach jako roztwór, zawiesinę, żel, emulsję, substancję stałą lub odwodniony bądź zliofilizowany proszek. Takie postacie można przechowywać albo w formie gotowej do użycia, albo wymagającej rekonstytucji bezpośrednio przed podaniem. Sposób podawania postaci zawierających będące kwasami nukleinowymi ligandy tenascyny C przeznaczonych do podawania ogólnoustrojowego może być podawaniem podskórnym, domięśniowym, dożylnym, dotętniczym, donosowym lub w postaci czopków dopochwowych lub doodbytniczych.

Poniższe przykłady podano w celu wyjaśnienia i zilustrowania niniejszego wynalazku i nie należy ich uważać za ograniczające wynalazek. Przykład 1 opisuje materiały i procedury doświadczalne zastosowane w przykładzie 2 do tworzenia będącego RNA liganda tenascyny C. Przykład 2 opisuje będące RNA ligandy tenascyny C i przewidywaną strukturę drugorzędową wyselekcjonowanego liganda będącego kwasem nukleinowym. Przykład 3 opisuje wyznaczanie minimalnej wielkości koniecznej dla wysokiego powinowactwa wiązania wybranego liganda będącego kwasem nukleinowym i podstawianie puryn posiadają cych w pozycji 2' grupę OH zmodyfikowanymi purynami posiadają cymi w pozycji 2' grupę OMe. Przykł ad 4 opisuje biodystrybucję wyznakowanych Tc-99m, bę d ą cych kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C u myszy z nowotworem. Przykład 5 opisuje stosowanie wyznakowanego fluorescencyjnie będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C do lokalizowania tenascyny C w tkance nowotworowej. Przykład 6 opisuje wykrywanie nowotworów in vivo przy użyciu aptameru TTA1 (znanego również jako GS7641). Przykład 7 opisuje alternatywne znakowanie z zastosowaniem ¹¹¹ln.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1. Stosowanie metody SELEX do otrzymywania będących kwasami nukleinowymi ligandów tenascyny C i to komórek glejaka U251

Materiały i metody

Tenascynę-C zakupiono w Chemicon (Temecula, CA). Jednoniciowe startery DNA i matryce syntetyzowano w Operon Technologies INC. (Alameda, CA).

Proces SELEX opisano szczegółowo w zgłoszenia patentowych SELEX. Krótko, dwuniciowe matryce do transkrypcji przygotowywano przez wydłużenie, przy użyciu fragmentu Klenowa, jednoniciowego DNA 40N7a:

5'-TCGCGCGAGTCGTCTG[40N]CCGCATCGTCCTCCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) stosując starter 5N7:

5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2), który zawiera promotor polimerazy T7 (podkreślono). RNA przygotowano przy użyciu polimerazy RNA T7 w sposób opisany uprzednio w Fitzwater i Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275-301, włączonym w całości do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Wszystkie reakcje transkrypcji prowadzono w obecności nukleotydów pirymidynowych, które zmodyfikowano przez przyłączenie atomu fluoru w pozycji 2' reszty cukrowej (2'-F). Podstawienie to nadaje zwiększoną odporność na rybonukleazy, które wykorzystują grupę 2'-hydroksylową do rozszczepiania wiązania fosfodiestrowego. Szczegółowo, każda mieszanina transkrypcyjna zawierała 3,3 mM 2'-F UTP i 3,3 mM 2'-F CTP oraz 1 mM GTP i ATP. Tak utworzona wyjściowa biblioteka losowych RNA zawierała 3 x 10¹⁴ cząsteczek. Powinowactwa poszczególnych ligandów wobec tenascyny C określano standardowymi metodami stosując rozdział na sączku nitrocelulozowym (Tuerk i Gold (1990) Science 249 (4968): 505-10).

Do każdej tury SELEX, płytki Lumino (Labsystems, Needham Heights, MA) powlekano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej 200 μl PBS Dulbecco, zawierającgo tenascynę C w stężeniach przedstawionych w tablicy 1. Po powleczeniu studzienki blokowano stosując bufor HBSMC+ [20 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 1 g/litr albuminy surowicy ludzkiej (Sigma, frakcja V) dla tur od 1 do 6, podczas gdy w turach 7 i 8 studzienki blokowano buforem HBSMC+ zawierającym 1 g/litr kazeiny (I-block; Tropix). Bufor do wiązania i przemywania składał się z buforu HBSMC+ zawierającego 0,05% Tween 20. Dla każdej tury SELEX RNA rozcieńczano 100 μl buforu do wiązania i umożliwiano inkubację w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C w studzienkach powleczonych białkiem, które wstępnie przemywano buforem do wiązania. Po wiązaniu prowadzono sześć

PL 201 637 B1 przemywań po 200 μ|. Po etapie przemywania suchą studzienkę umieszczane na bloku grzejnym o temperaturze 95°C na 5 minut. Standardowe reakcje odwrotnej transkryptazy AMV (50 μ!) prowadzono w temperaturze 48°C bezpośrednio w studzienkach i produkty reakcji wykorzystano do standardowych reakcji PCR i transkrypcji. Do tych etapów reakcji amplifikacji matrycy i odwrotnej transkrypcji stosowano dwa syntetyczne startery 5N7 (patrz powyżej) i 3N7a:

5'-TCGCGCGAGTCGTCTG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3).

Do SELEX z zastosowaniem komórek, ludzkie komórki glejaka U251 (Hum. Hered. (1971) 21: 238) hodowano do uzyskania zwartej warstwy w Dulbecco's Modified Eagle's Medium uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) w sześciostudzienkowych płytach do hodowli tkankowych (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) i trzy razy przemywano stosując bufor PBS Dulbecco uzupełniony CaCl2 (DPBS, GIBCO BRL). RNA znakowany wewnątrz sekwencji podczas transkrypcji (Fitzwater (1996), supra) inkubowano z komórkami w temperaturze 37°C w ciągu jednej godziny. Następnie usuwano wyznakowany RNA, a komórki sześć razy po dziesięć minut w temperaturze 37°C przemywano DPBS. Następnie dodawano DPBS zawierającą 5 mM EDTA i inkubowano z komórkami w ciągu 30 minut w celu wymycia związanego RNA, który pozostawał po etapach przemywania. RNA ten oznaczano ilościowo stosując standardowy protokół pomiaru przez scyntylację cieczową i amplifikację z zastosowaniem RT-PCR.

Oznaczenia wiązania z komórkami U251. Wewnętrznie znakowany RNA inkubowano w rosnących stężeniach ze zwartą warstwą komórek U251 w sześciostudzienkowych płytkach do hodowli tkankowych (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) w temperaturze 37°C w ciągu 60 minut. Niezwiązany RNA odmywano stosując trzy 10-minutowe przemywania buforem DPBS + CaCl2 w temperaturze 37°C, a związany RNA zbierano przez rozbicie komórek z zastosowaniem Trizol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Związany RNA mierzono ilościowo przez scyntylację cieczową.

Klonowanie i sekwencjonowanie. Zamplifikowane pule wzbogacone w oligonukleotydy o wysokim powinowactwie oczyszczano w 8% żelu poliakrylamidowym, poddano odwrotnej transkrypcji do jednoniciowego DNA i DNA amplifikowano przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) z zastosowaniem starterów zawierających miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne BamHI i Hind III. Fragmenty otrzymane przez PCR sklonowano, przygotowano plazmidy i przeprowadzono analizy sekwencji zgodnie ze standardowymi technikami (Sambrook i in. (1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, tom 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

P r z y k ł a d 2. Będące RNA ligandy tenascyny C.

Będące kwasami nukleinowymi ligandy komórek U251 otrzymano przez proces SELEX i opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/434 425, zatytułowanym Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX, złożonym 3 maja 1995 r., obecnie opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 789 157. Następnie wykazano, że otrzymane ligandy były będącymi kwasami nukleinowymi ligandami tenascyny C.

W celu otrzymania oligonukleotydowych ligandów ludzkiej tenascyny C, przeprowadzono osiem tur SELEX stosując losową bibliotekę nukleotydową, jak opisano powyżej w części Materiały i metody. Wejściowe RNA i białka do każdej tury przedstawiono w tablicy 1. Po ośmiu turach SELEX, powinowactwo puli oligonukleotydów do tenascyny C wynosiło 10 nM i nie wzrastało po dodatkowych turach SELEX.

W celu otrzymania ligandów komórek glejaka U251, przeprowadzono dziewięć tur SELEX stosując losową bibliotekę nukleotydową. Po dziewięciu turach wiązania z komórkami U251 i elucji EDTA, tury 3, 5 i 9 testowano pod kątem zdolności wiązania komórek U251. Figura 1 wykazuje, że ze wzrostem liczby tur SELEX wzrasta również ilość związanego RNA dla określonego stężenia. Z powodu złożoności tkanki docelowej, nie było możliwe oszacowanie powinowactwa puli oligonukleotydów do nieznanej(ych) cząsteczki docelowej na tych komórkach.

Pulę E9 (dziewięć tur wiązania i elucji EDTA z komórek U251) zastosowano następnie jako materiał wyjściowy do SELEX skierowanej wobec oczyszczonej tenascyny C. W sposób opisany powyżej przeprowadzono dwie tury SELEX z zastosowaniem oczyszczonej tenascyny C. Wejściowe stężenia białka i RNA dla dwóch tur SELEX (E9P1 i E9P2) opisano w tablicy 2.

Podsumowując, przeprowadzono trzy różne doświadczenia SELEX: doświadczenie z zastosowaniem oczyszczonej tenascyny C jako substancji docelowej, doświadczenie z zastosowaniem komórek glejaka U251 jako komórek docelowych oraz doświadczenie, w którym pulę produktów SELEX dla

PL 201 637 B1 komórek glejaka U251 zastosowano jako materiał wyjściowy do inicjacji doświadczenia SELEX z zastosowaniem oczyszczonej tenascyny C jako substancji docelowej.

Wszystkie trzy doświadczenia SELEX analizowano poprzez sklonowanie i zsekwencjonowanie ligandów z 8 tury SELEX z zastosowaniem oczyszczonej tenascyny C (sekwencje „TN), z 9 tury SELEX z zastosowaniem komórek U251 (sekwencje „E9) oraz z 2 tury hybrydowej SELEX z zastosowaniem U251/tenascyny C (sekwencje „E9P2). Sekwencje 34 unikalnych klonów przedstawiono w tablicy 3 i podzielono je na dwie gł ówne grupy: ligandy tenascyny C (sekwencje „TN i „E9P2) i ligandy komórek U251 (sekwencje „E9). Wśród ligandów tenascyny C, wię kszość klonów (łącznie 65) reprezentowała jedną z dwóch odrębnych klas sekwencji, oznaczonych jako rodzina I i rodzina II (Figura 1). Analiza zmiennego regionu w 12 klonach z rodziny I ujawniła 7 unikalnych sekwencji, które łączy sekwencja konsensu GACNYUUCCNGCYAC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12). Analiza regionu zmiennego w 18 klonach z rodziny II ujawniła sekwencje, które dzielą sekwencję konsensu CGUCGCC (tablica 3). Sekwencje E9 można zgrupować w pokrewne klasy na podstawie występowania konserwatywnych sekwencji GAY lub CAU w regionach zmiennych. Pozostałe sekwencje wydają się nie być ze sobą spokrewnione i sklasyfikowano je jako „sieroce. Dominowały trzy sekwencje, E9P2-1, E9P2-2 i TN9, występując odpowiednio 14, 16 i 10 razy. W kategorii sekwencji „sierocych, jedna sekwencja, TN18, była reprezentowana dwukrotnie. Podsumowując, dane te przedstawiają wysoce wzbogaconą pulę sekwencji.

Większość cząsteczek wykazywała niską, nanomolową stałą dysocjacji, z wyjątkiem trzech dominujących sekwencji, TN9 i E9P2-1 i -2, posiadających najwyższe powinowactwa 5 nM, 2 nM i 8 nM (tablica 3). Wyniki te wskazują, że SELEX z zastosowaniem komórek U251 jest źródłem aptamerów skierowanych przeciw tenascynie C, i że tylko dwie tury SELEX były wymagane do wyizolowania specyficznych wobec tenascyny ligandów z puli otrzymanej w SELEX z zastosowaniem komórek. Z puli E9 moż na podobnie wyizolować oligonukleotydowe ligandy skierowane przeciw innym białkom stosując oczyszczone białka docelowe.

P r z y k ł a d 3. Wyznaczanie minimalnej wielkości TN9 i podstawianie puryn posiadających w pozycji 2' grupę OH purynami posiadają cymi w pozycji 2' grupę OMe: synteza aptameru TTA1.

Procedury syntezy oligonukleotydów były standardowe dla specjalistów w tej dziedzinie (Green i in. (1995) Chem. Biol. 2 (10): 683-95). Monomery fosforynoamidów 2'-fluoropirymidyny otrzymano z JBL Scientific (San Luis Obispo, CA); 2'-OMe-puryny, 2'-OH-puryny, heksyloaminę i monomery (CH2CH2O)6, włącznie ze stałym nośnikiem polistyrenowym dT, otrzymano z Glen Research (Sterling, VA). Powinowactwa aptamerów określano stosując rozdział na sączkach nitrocelulozowych (Green i in., supra).

TN9 wybrano do dalszej analizy ze względu na jej duże powinowactwo do tenascyny C. Najpierw dokonano przeszukania pod względem minimalnej sekwencji koniecznej do wysokiego powinowactwa wiązania. Stosując standardowe techniki (Green i in., supra) odkryto, że nukleotydy po stronie 3' nukleotydu 55 były wymagane do wiązania z tenascyną C, podczas gdy żadnego z nukleotydów po stronie 5' nie można usunąć bez zmniejszenia powinowactwa. W celu dalszego zmniejszenie długości TN9 poniżej 55 nukleotydów i zachowania wysokiego powinowactwa wiązania, podjęto następnie próbę zdefiniowania wewnętrznych delecji w TN9. Pierwszych 55 nukleotydów TN9, wraz z pierwszymi 55 nukleotydami pokrewnych ligandów TN7, TN21 i TN41 z rodziny II, wprowadzono do algorytmu komputerowego dla określenia możliwej drugorzędowej struktury RNA (program mfold 3.0, dostępny na stronie http://www.ibc.wustl.edu/~zuker/. M. Zuker, D. H. Mathew i D. H. Turner. Algoritms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide, w: RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski i B. F. C. Clark, red., NATO Asi Series, Kluwer Academic Publishers, (1999)). Spośród wielu potencjalnych struktur drugorzędowych RNA przewidzianych przez algorytm stwierdzono strukturę wspólną dla wszystkich oligonukleotydów. Struktura ta, przedstawiona na figurze 2 dla oligonukleotydu TTA1, zawiera trzy ramiona spotykające się w jednym punkcie, tak zwanym połączeniem 3 ramion. W strukturze tej najbardziej konserwatywne nukleotydy oligonukleotydów z rodziny II wystę pują w rejonie połączenia. Porównanie TN9, TN7, TN21 i TN41 wykazał o dużą zmienność w długości i sekwencji drugiego ramienia, co sugeruje, że wydłużenie tego członu nie jest wymagane dla wiązania liganda z tenascyną C. Testując tę hipotezę wobec TN9 stwierdzono, że nukleotydy 10-26 można zastąpić łącznikiem, glikolem etylenowym (CH2CH2O)6. Łącznik zastępuje pętlę tworzoną przez nukleotydy i zmniejsza wielkość aptameru. Dodatkowo, czteronukleotydowe pętle (CACU lub GAGA), które zastępują nukleotydy 10-26 dają w efekcie sekwencje o wysokim powinowactwie wobec tenascyn C. W zakresie wiedzy specjalisty w tej dziedzinie pozostaje określanie innych

PL 201 637 B1 pętli nukleotydowych, bądź innych rozpierających elementów przestrzennych, które mogą zastępować nukleotydy 10-26, z otrzymaniem sekwencji wysokim powinowactwie do tenascyny C.

W celu zwię kszenia ochrony przed aktywnoś cią nukleaz, ustalono pozycje puryn, które moż na podstawiać odpowiadającymi 2'-OMe-purynami. Oligonukleotydy arbitralnie podzielono na pięć odcinków i wszystkie reszty purynowe w każdym odcinku podstawiono odpowiadającym nukleotydem 2'-OMe-purynowym, łącznie otrzymując pięć oligonukleotydow (tablica 4, syntezy fazy I). Określono powinowactwo każdego oligonukleotydu do tenascyny C i stwierdzono, że wszystkie puryny w odcinkach 1, 3 i 5 można podstawiać bez znaczącej utraty powinowactwa. Następnie poszczególne reszty purynowe w odcinkach 2 i 4 podstawiono 2'-OMe-purynami i zmierzono wpływ na powinowactwo (tablica 4, syntezy fazy III). Na podstawie tych doświadczeń wywnioskowano, że podstawienie nukleotydów G9, G28, G31 i G34 zmodyfikowanymi 2'-OMe-G powoduje utratę powinowactwa do tenascyny C. Dlatego też, nukleotydy te pozostają jako 2'-OH-puryny w aptamerze TTA1.

Następnie aptamer TTA1 (tablica 4) zsyntetyzowano z łącznikiem (CH2CH2O)6 (odstępnik 18), „czapeczką 3'-3' dT dla ochrony przed egzonukleazami, 5' heksyloaminą (tablica 4) oraz wszystkimi purynami w postaci zmodyfikowanej w pozycji 2' grupą OMe, z wyjątkiem 5 reszt G wskazanych w tablicy 4. Niewiążący aptamer kontrolny, TTA1.NB, utworzono przez delecję 5 nukleotydów na koń cu 3'. TTA1 wiąże się z teansyną C z równowagową stałą dysocjacji (Kd) wynoszącą 5 nM, podczas gdy Kd dla wiązania TTA1.NB z tenascyną C jest wyższa niż 5 μΜ.

Nukleotydy 10-26 można zastąpić łącznikiem nienukleotydowym, glikolem etylenowym. Dlatego też, jest prawdopodobne, że TTA1 można syntetyzować w dwóch niezależnych fragmentach, gdzie przerwę wprowadza się w pozycji łącznika z glikolu etylenowego i powstają dwa nowe końce 5' i 3'. Po syntezie dwie cząsteczki będzie się wspólnie inkubować dla umożliwienia tworzenia hybrydy. Metoda ta pozwala na wprowadzanie dodatkowych grup aminowych, jak również nukleotydów na nowych końcach 5' i 3'. Nowe grupy funkcyjne można stosować do tworzenia biokoniugatów. Ponadto, synteza w dwóch fragmentach powoduje zwiększenie wydajności reakcji syntezy w wyniku skrócenia długości cząsteczek.

P r z y k ł a d 4. Biodystrybucja aptamerów znakowanych Tc-99m u myszy z nowotworami.

Biodystrbucję aptamerów testowano przez skoniugowanie chelatora Tc-99m (Hi15; Hilger i in. (1998) Tet Lett. 39: 9403-9406) z końcem 5' oligonukleotydu, jak przedstawiono na figurze 2, i promieniotwórcze znakowanie aptameru Tc-99m. Aptamer i jego postać wyznakowaną Tc-99m przedstawiono na figurze 10. TTA1 i TTA.NB koniugowano z Hi15 przy stężeniu 50 mg/ml aptameru w 30% dimetyloformamidzie z 5 równoważnikami molowymi Hiis-N-hydroksysukcynimidu, zbuforowanym 100 mM boranem sodowym o pH 9,3, w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Aptamer w postaci wyznakowanej Tc-99m przedstawiono na figurze 10. Hi15-TTA1 oraz Hi15-TTA1.NB otrzymano przez oczyszczanie metodą HPLC z odwróconymi fazami. Następnie oligonukleotydy wyznakowano Tc-99m w następujący sposób: do 1 nmola Hi₁₅-aptameru dodawano 200 μΐ 100 mM buforu fosforanów sodowych o pH 8,5, 23 mg/ml winianu sodowego i 50 μl Tc-99m w postaci nadtechnetenianu (5,0 mCi) eluowanego z kolumny Mo-99 (Syncor, Denver) w ciągu 12 godzin przed użyciem. Reakcję znakowania rozpoczynano przez dodanie 10 μl SnCl₂ o stężeniu 5 mg/ml. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze 90°C. Produkty reakcji oddzielono od nieprzereagowanego Tc-99m przez dializę podczas wirowania przez membranę o granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej 30 000 (Centrex, Schleicher & Scheull) z dwoma przemywaniami po 300 gl. W wyniku tego protokołu znakowania uzyskiwano wbudowanie 30-50% dodawanego 99mTc, z aktywnością właściwą 2-3 mCi/nmol RNA. Tc-99m wiąże się z 5'G, jak przedstawiono na figurze 5.

Do doświadczeń biodystrybucji, heteroprzeszczepy nowotworów U251 przygotowano w następujący sposób: komórki U251 hodowano w Dulbeccos' Modified Eagle's Medium uzupełnionym 10% v/v płodową surowicą bydlęcą (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Pozbawionym grasicy myszom (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wstrzykiwano podskórnie 1 x 106 komórek U251. Gdy nowotwory osiągały wielkość 200-300 mg (po 1-2 tygodniach), dożylnie wstrzykiwano wyznakowany Tc-99m aptamer w ilości 3,25 mg/kg. We wskazanych czasach zwierzęta usypiano stosując izofluran (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA), pobierano krew poprzez nakłucie serca, zwierzęta zabijano i pobierano tkanki. Poziomy Tc-99m mierzono stosując licznik promieniowania gamma (Wallac Oy, Turku, Finlandia). Pobieranie aptameru przez tkanki mierzono jako % wstrzykiwanej dawki per gram tkanki (%ID/g).

Obrazowanie myszy prowadzono przy użyciu kamery promieni gamma. Myszy, po uśpieniu izofluranem, umieszczano na kamerze (Siemens, LEM+). Zbierano dane (od 30 sekund do 10 minut)

PL 201 637 B1 i analizowano stosują c oprogramowanie Nuclear MAC, wersja 3.22.2 (Scientific Imaging, Ca) i komputer Power MAC G3 (Apple Computer, CA).

Badania biodystrybucji (tablica 5) wykazały szybkie i specyficzne pobieranie aptameru przez tkankę nowotworową; niewiążący aptamer nie pozostawał w nowotworze. Również poziom Tc-99m we krwi obniża się gwałtownie. Po trzech godzinach poziomy Tc-99m wprowadzonego do guza przy pomocy Hi15-TTA1 wykazywał bardzo długi okres półtrwania (> 18 godzin). Wskazuje to, że po przeniknięciu aptameru do nowotworu wraz z przenoszoną promieniotwórczością, pozostaje on w nowotworze w ciągu długiego czasu. Takie dane wskazują, że skoniugowane z aptamerem czynniki cytotoksyczne, włącznie z nuklidami promieniotwórczymi i czynnikami niepromieniotwórczymi, również będą pozostawały w nowotworze z długim okresem półtrwania.

Promieniotwórczość Tc-99m pojawia się także w innych tkankach, szczególnie jelicie cienkim i grubym. Specjalista w tej dziedzinie moż e ł atwo zmieni ć obserwowany w tych badaniach wzór klirensu wątrobowo-żółciowego, na przykład przez zmianę hydrofilowości chelatora Tc-99m, zmianę chelatora lub równoczesną zmianę pary metalu promieniotworczego/chelator.

Obrazy całych zwierząt otrzymywano stosując Hi15-TTAl wyznakowany Tc-99m po trzech godzinach od iniekcji. Obrazy otrzymane dla myszy, którym wstrzykiwano Hi15-TTA1, ale nie myszy, którym wstrzykiwano Hi15-TTA1.NB, wyraźnie wskazywały nowotwór (figura 3). Dodatkowa promieniotwórczość wyraźnie występuje w przewodzie pokarmowym, co potwierdza wyniki wcześniejszych doświadczeń biodystrybucji.

P r z y k ł a d 5. Stosowanie wyznakowanego fluorescencyjnie TTA1 do lokalizacji tenascyny C w tkance nowotworowej.

Materiały i metody.

TTA1 i TTA1.NB zsyntetyzowano w sposób opisany powyżej. Sukcynimidylo-Rhodamine-Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) koniugowano z grupami 5' aminowymi aptamerów jak opisano powyżej dla koniugacji Hi15-NHS. Koniugaty aptamerów i Rhodamine-Red-X, TTA1-Red i TTA1.NB-Red, oczyszczono przez HPLC z odwróconymi fazami. Hodowlę komórek U251 i wzrost nowotworów u nagich myszy prowadzono w sposób opisany powyż ej. Pięć nmoli TTA1-Red lub TTA1.NB-Red wstrzykiwano dożylnie nagim myszom i po pożądanym czasie zwierzę usypiano, perfundowano 0,9%

NaCl i zabijano. Nowotwór wycinano i umieszczano w formalinie. Po 24 godzinach w formalinie nowotwór cięto na skrawki o grubości 10 μΜ i Rhodamine-Red-X wykrywano stosując mikroskop fluorescencyjny (Eclipse E800, Nikon, Japonia).

Wyniki: TTA1-Red posiada identyczne powinowactwo do tenascyny C jak nie skoniugowany aptamer macierzysty, TTA1, na poziomie 5 nM. Porównano poziomy fluorescencji TTA1-Red i TTA1.NBRed w nowotworze po 10 minutach od iniekcji. Aptamer wiążący, TTA1-Red, silnie wybarwia nowotwór, ale nie sąsiednie tkanki (figura 4). W przeciwieństwie, w przypadku TTA1.NB-Red wykrywa się tylko autofluorescencję tkanek. Wyniki te wykazują użyteczność aptameru we fluorescencyjnym wykrywaniu tenascyny C in vivo i aptamer podobnie można stosować do wybarwiania skrawków tkankowych ex vivo.

P r z y k ł a d 6. Wykrywanie nowotworów in vivo przy pomocy aptameru TTA1 (znanego również jako GS7641): dodatkowe rodzaje nowotworów.

Znakowanie aptameru, biodystrybucję i heteroprzeszczepy nowotworu u nagiej myszy były takie jak opisano w przykładzie 4.

O wielu rodzajach nowotworów ludzkich wiadomo, że zachodzi w nich ekspresja tenascyny C. W celu oceny zdolności TTA1/GS7641 do rozpoznawania nowotworów innych niż glejaki jako miejsc docelowych, komórki ludzkich linii nowotworowych hodowano jako nowotwory u nagiej myszy. Tkanki nowotworowe testowano pod kątem ekspresji ludzkiej tenascyny C i te nowotwory, dla których obserwowano ekspresję tenascyny C, testowano pod kątem pobierania aptamerów. Figura 6 wykazuje pobieranie aptamerów w kilku rodzajach nowotworów, obejmujących glejaka, raka sutka, raka okrężnicy i odbytnicy oraz mięśniako-mięsaka prążkowanego. Specyficzne pobieranie do nowotworów wykazano przez porównanie pomiędzy aptamerem wiążącym (TTA1/GS7641) i niewiążącym (TTA1.NB). Należy zwrócić uwagę, że KB, heteroprzeszczep, w którym zachodzi ekspresja mysiej, ale nie ludzkiej TN-C, nie wykazuje pobierania przez nowotwory. To doświadczenie rozszerza obserwację pobierania aptamerów przez glejaka na dodatkowe raki i mięsaki i dalej wskazuje, że wszystkie nowotwory, w których zachodzi ekspresja ludzkiej tenascyny C, wykazują pobieranie TTA1/GS7641.

PL 201 637 B1

P r z y k ł a d 7. Alternatywne znakowanie z zastosowaniem In-111.

Badania heteroprzeszczepów nowotworów i biodystrybucji prowadzono w sposób opisany w przykładzie 4. W celu sprzęgnięcia DTPA i DOTA z TTA1/GS7641, cykliczny bezwodnik każdego z nich inkubowano z zawierającym grupę aminową TTA1/GS7641 w warunkach obojętnego pH stosując standardowe metody. Struktury DTPA i koniugatów są przedstawione odpowiednio na figurze 8 i figurze 9; gdzie każdy nich wyznakowano In-111. Koniugat DOTA posiada identyczne łączniki jak koniugat DTPA. Koniugaty DOTA i DTPA wyznakowano In-111 przez inkubację w 0,5 M NaOAc o pH 5,5 w temperaturze 95°C w ciągu 30 minut. Po usunięciu niewbudowanego znacznika promieniotórczego przez dializę podczas wirowania przez membranę o granicy przepuszczalności mas cząsteczkowych 30 000, wyznakowany promieniotwórczo aptamer przenoszono do zbuforowanej fosforanami soli fizjologicznej w celu iniekcji myszom z nowotworami.

Biodystrybucja aptameru wyznakowanego In-111 znacznie różni się tej dla postaci wyznakowanej Te, opisanej w przykładzie 4. Figura 7 przedstawia, że w stosunku do TTA1/GS7641 wyznakowanego Tc-99m, promieniotwórczość TTA1/GS7642 wyznakowanego In-111 w jest znacznie obniżona w jelitach, z jednoczesnym wzrostem pobierania w wątrobie i nerkach. To doświadczenie wskazuje, że właściwości chemiczne chelatora mają duży wpływ na dystrybucję znakowanego izotopem promieniotwórczym TTA1/GS7641 w żywym zwierzęciu. Wzory biodystrybucji, które różnią się od tych dla Hi15-TTA1/GS7641, mogą być użyteczne do kierowania do nowotworu w pewnych określonych stanach klinicznych, gdy klirens wątrobowo-żółciowy jest niepożądany. Takie stany obejmują, ale nie ograniczają się do zastosowań w radioterapii, jak również w obrazowaniu jelit, gruczołu krokowego i innych regionach jamy brzusznej.

T a b l i c a 1

Wejściowe stężenia ilości RNA i białka w SELEX wobec tenascyny C.

	Tenascyna C	RNA
Tura	(pmole /studzienkę)	(pmole /studzienkę)
1	12	200
2	12	200
3	12	200
4	12	200
5	2	33
6	2	33
7	2	33
8	0,2	3,3

T a b l i c a 2

Wejściowe ilości RNA i białka w SELEX wobec komórek/SELEX wobec tenascyny C

	Tenascyna C	RNA
Tura	(pmole /studzienkę)	(pmole /studzienkę)
E9P1	2	33
E9P2	2	33

PL 201 637 B1

Tablica 3.Sekwencje dla tenascyny C: SELEX wobec oczyszczonego białka (sekwencja dla tenascyny) i SELEX wobec komórek U251 + SELEX wobec oczyszczonego białka (sekwencje E9P2) (0 c

H N o

.u §

Φ co

XXX ccc o o in

N Η M fi

Q> fi fi fi fi fi θ' θ' O* θ' u o υ o σ' q u σ> m u Cn « fi tP

X X X X X X c c c c c c

OJ CO O O ul o es τ-i cs

		fi	fi	fi	fi
fi	<q	o	o	θ'	0»
o	Ol	υ	u	υ	υ
υ	υ	u	u	o	υ
υ	o	υ	υ	0	υ
0	υ	o	0*	o	ο»
o	o	υ	υ	υ	υ
u	υ	3	3	3	3
3	3	υ	υ	0	O
υ	υ	fi	fi	fi	fi
fi	fi	θ'	o*	O	Ο»
σ	o	u	u	u	u
u	u	fi	fi	fi	fi
m	fi	en	o	θ'	Ol
o	o	fi	fi	fi	fi
fi	<o	0	a	u	o

fi Ο» U o u . _ . , 3 o oi o· o o> o o

....... <o □ σι u u m fi σ» σι υ fi φ u o u u u u o* u u σ\

Ο»	Ol	Ο»	O
υ	u	υ	0
3	9	9	9
U	U	0	υ
fi	fi	fi	fi

σι

υ	u	o	υ
«	a	fi	«
o	σ»	o	Ol
10	«ο	fi	o

□ o o υ

u	G	G	G
G	G	G	G
U	G	G	G
G	G	U	U
P	P		P
G	G		G

4 g r? £□ a G o o p _ u υ u u u u u u p o G 4 G 4 G P u u u u u u o o o g g

U o 4 P P

O U Zł u u o u u o o □ PPPP (j fj IJ □ o

G U G 4 P u

o

P u

u ω U G P 4 G G O P P G P u P G P G

P o

P

G

G

<£

P

G

s

P

G

G

4

e£

G

U

G

P

P

4

U

P

a

G

G

G

P

3

P

P

P

G

G

3

o

P

2

U

4

P

4

fC

4

4

u

4

4

P

P

4

o

G

4

P

G

O

G

G

G

U

G

G

u

P

O Q

P

P

P

G

CS

G

4

υσ υυυ u o u u u O G G U U P P P O P P P P P P

G P P P 4 P O 3 Λ P GlGIGtG P 4|4|4f fi O GlGIGtG

υ o υ u i J P D P P < O U O U O I P D G O U i

S3SS5

U O O U u

U 4 G G U G G

G			G	G	G G
G	G	U	G	G	GIG
G	G	U	U	G	G Ig
G	G	o	G	G	g|g
G	G	u	U	G	G
		P	P	P	P P
P	P	o	G	G	4 G
G	G	G	G	G	4 G
G	G	G	O	P	G G
G	G	P		G	P

! 4 G

		G	G	u	CS
G		G	U	3	υ
4	P	P	4		3
p	G	P	G	a	υ

4 4 P G O P O O G U P 4 G u V G 4 U 4 4 U V G U 4 4

G	G 4	P
P	P 4	P

<0

O

U

U υ

fi	<ο	fi	fi	ο	fi	«
o»	ο»	σ»	θ'	u	o	o	θ'
υ	υ	υ	u	□	υ	υ	υ
u	u	u	υ	u	υ	υ	u
u	u	a	υ	fi	o	u	u
θ'	θ'	o	o	o	ο»	0*	o
υ	υ	υ	υ	υ	υ	u	u

□ σ u u fi < υ ο» <ο «

o	θ'	O»	O<	U	o	O»	Ol
o	O	O	υ		u	□	υ
fi	fi	fi	fi		fi	fi	fi
Ol	Ol	o	συ	Ol	Ο»	Ο»
fi	fi	«	fi	G	fi	fi	to
o	u	o	u	U	□	U	u
				U
				P
G	G	G	G	u	G	4	G

Φ

U

O

Φ

Ή

ŁQ

G

C!

Φ

Φ co

G G P U O G G U J G G G OOP U P P P G G G P P GGG GGG G G P .

G 4 G G .

O 4 P G G G

P 4 P G O G

P O G G P P

P

P

P

G

J

P

J

P ¹

G

225

G	4 e	ę o	P	p	P	4
υ	G c	2 G	P	G	P	p
4	G t	0 4	G	G	4	U
G	P *	ί G	4	P	P	G
G	P fi	S G	4	P	G	4

GGG _ _ 4 G P

G G 4 G P

P P G P 4

P P 4 G

O G G U G P

U G G G P G

G G 4 G U

P 4 4 4 P

O G G G G P

G P G U U

G G . P U G P P - Gl 4 G PI

G P

...

P	υ	P P	cna	G	G
G	P	θ' G	a 4	P	U
4	P	G 4	G 4	G	P
4	P	U 4	4 G	G	G

G P G G

GGG 4 G 4

P G U 4 4 4

G	4 G	G	P	G	G	G
P	2 G	P	G	4	U	O
4	G O	4	4	G	4	P

O 0»

θ' Οι θ' o

Ol

Ol

o o

θ' O P θ'

Ol

Ο»

0»

σι

Οι

ο·

ο*

ο»

θ'

θ'

Ο θ'

θ'

ο

ο

θ'

ο»

υ o

O u u u

<J

υ

Ol

θ'

θ'

ο·

θ'

ο»

θ’

θ'

θ' θ’

θ'

θ'

θ'

0»

0ι

G Oi

O* Ol G θ'

OI

Ol

υ

υ

0

υ

υ

υ

u

υ

u ο

υ

υ

υ

υ

u

9 3

3 3 3 3

3

3

θ' Ol

ο

ο

ο

θ'

θ'

0»

θ' θ'

ο

0«

θ'

θ'

0»

fi fi

fi fi fi fi

fi

fi

3

3

3

3

3

3

3

3

□ 3

3

3

3

3

3

G tn

Ο» 0» G θ'

o

θ'

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi fi

fi

fi

fi

fi

fi

u a

υ υ o u

0

υ

θ'

Ol

θ'

ο*

Ο

5>

Ο·

θ'

θ' θ'

θ'

Ο

σ»

θ'

θ'

4 fi

fi fi 4 fi

fi

fi

υ

υ

υ

0

υ

0

0

υ

ο ο

υ

υ

υ

0

υ

Ol o·

0» 0* Ol Ol

o

o·

«

fi

4

«β

«»

fi

«α

fi fi

fi

«

fi

«0

Ol θ'

0» 0* O Ol

θ'

θ'

0>

0*

θ'

θ'

ο

σ*

Οι

θ'

θ' θ'

θ'

θ'

θ'

ο·

ο

4 fi

fi fi 4 fi

fi

fi

0»

Οι

θ'

0»

σ>

ο·

ο

θ'

σι θ'

θ'

θ'

θ'

ο»

ο

G O·

O1 O> O* O

θ'

θ'

fi

4

fi

fi

«

fi

fi

fi

fi fi

«

<α

«

«

fi

οι oi

Οι θ' O* θ'

o·

O*

Ol

θ'

ο

θ'

θ' ο»

θ'

θ'

θ' θ'

θ'

θ'

ο»

ο

ο

ο o*

θ' Oi Ol θ'

Ο»

o*

θ'

θ'

θ'

Οι

θ'

θ’

Οι

θ'

σ» σι

θ'

θ'

ο»

ο

θ'

θ'

θ'

ο

θ'

ΟΙ

θ'

θ'

θ'

θ' 0»

θ'

θ'

θ'

θ'

ο

Oiirsm^rmsorCSCSISCS<N<S<SCS

O rt (\ νΐηΦΓ’ΠΟϊΗΗΗ

CO -vr if) l£> r- oo σι «

_ <n cs en cs C ** — — Φ «-< ΜΊ cs cs sr <n tt fi

2ZŻZZZZZ 0

« 3 . —, — n i esico o C | ||«-* ~ n φ r-l ’ »M W r- cs o, C

Z Z Z Z o ih 6- ¢- H 0

PL 201 637 B1 θ'

ο α ο ο ν υ σι σ> υ □ cn ϋ ο σι Ο ο u 3 ο « υ ο □ ο» ο σι « ο υ υ ο « 4 σ» □ υ σ> σ* υ ο «ο □ ιβ υ

Ο - υ ο ο ο < u ο Ζ>

η ζι -ł rn

3 5 5 ο ο α ο ο υ ο ο U D Ο Ο Λ 3 Ο U

Ο Ο Ο =>

u ο < υ ' ο ο υ < 3 Ξ> 3 U Ο < < Ο , Ο Ο Ο L> 3 3 3 3 3 =ι ο < 3 ο 3 3 Ł3 < Λ »ΐ < ο υ ο σ ο ο

·«*» ω

υ

U 3 ου υ < ο ο ο ο ο ο α ο *t ο ο ο < ο Ο Ο < Ο 15 □ U < Ο 3 U 44 Ο υ ο ο ο ο << λ 3 ο u u υ 2 υ ο «£ ϋ ο

υ < u o	u	3				W W V U	d	3 Ο	3	U	υ ο
a υ ο|λ		O	3	o &	3	< < υ	ΓΊ	«X Λ	<		<
<J 3 3 2	2	<	υ	u υ	u	ο ϋ <	υ	Ο Ο	ο	3	<5
y y 3 μ	o	2		< *ę		Ο Λ 2	2j	< U	ο	υ	<
	u	U	3	2 2	2	3 ο 3	ι—* I	ι3 ο	<	<	Ο
u 2 2 rt	o	U	o	u o		υυ υ	Ι“Π ιΊ 1	υ			Ο
o u 3 a		<C	o	o o	o	rf ΟΙ Ο	(D	3		ο»	<
&«:«:«!	2	omo;	< <	<	2 < <		<
u* o* o* o*	o*	Ο»	Ol	OI Ol	Ol	ΟΙ Ο 0*		σι σι	σ	σι	& Οι
Οι σ> θ' O>	Ol	o*	Ol	Ol o*	OI	ΟΙ οι ΟΙ	, η	Οι Οι	θ’	σι	σι σι
o U O O	o	t>	υ	o o	υ	ϋ ο ο	1—1	ο ο	u	ο	υ ο
ο» o> σ' w	σ*	Oi	Ol	θ' οι	σ»	Οι ΟΙ ο»	W	σι οι	σ	σ»	σι σι
3 3 3 3	9	3	3	3 3	3	3 3 3	W	3 3	3	3	3 3
β β O 5	40	40	aj	aj 4	β	4 4 4		40 (0	<0	10	4 4
o> o< en w	Ol	On	o*	Ο» θ'	σι	ο* οι σ*	ο	Ο» Οι	ΟΙ	θ'	σ* σι
u u u u	Ό	O	υ	O L>	ο	ο ο ο	π.	υ α	V	ο	σ α
<o a e <e	4	40	40	<0 10	4	aj « «	Μ	(0 40	4	4	4 4
Di θ' θ' θ'	σ»	Ol	θ’	Ο» Ol	σι	θ' θ' ο		σι σ»	ΟΙ	ΟΙ	ο» σ»
θ' θ' θ' θ'	Oi	o*	Ο»	Ol Ol	ο	όι σι ο	τ—1	οι οι	ΟΙ	σ	ο» θ'
nt nt ni nt	o	40	40	10 40	ισ	10 40 40	LD	10 40	40	10	4 4
D* Ol Di Dl	o*	Ol	Ol	Dl Di	οι	οι ο* σι	CN	σ σ·	σι	σ	οι σι
Oi Dl O> Di	Ol	en	Ol	Ο» Ol	ΟΙ	Ο» 01 θ'		οι ο»	θ'	Οι	CF Οι
θ' Ol Ol Ol	Ο»	Ol	Ol	Ol Ol	σι	θ' θ' θ'	t—>	Οι θ'	σι	οι	Οι Οι
							□ Φ	γη CM	ο	•β·	ιη so

ffla\OHfMm^lTkC>Q30)0

Nnnnmmnnmmminłr

Λ

OJu)o5N(ncjtn(nu>nHrłH

---- Z Z Z Z Z Z

H t-· H Η Η H gggggg »O

U|M

οι	*-*
kOJuTł	<η
1 i 1 ΟΙΙΟί	Οι
calca	ω

tal

PL 201 637 B1

5* -1G667667CG- (CHjCHjO) «-CGUCGCCGU77U667U6UUUU6CU5

Tablica 4. Podstawienia 2'-OMe, wewnętrzne delecje, TTA1 i TTA1.NB

PL 201 637 B1

180 0.198 i 0.028 0.038 i 0 005

570 0.062 t 0 004 0.020 ± 0.001

1020 0.030 ± 0.003 NfA

Tablica 5. Biodystrybucja Tc-99m-TTAl i -TTA1.NB

PL 201 637 B1

Lista sekwencji <110> Gilead Sciences, Inc.

<120> Ligandy tenascyny C będące kwasami nukleinow <130> ΝΕΧ 86/PCT <140>

<141>

<150> 09/364,902 <151> 1999-07-29 ' <160> 65 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(56) <223> N w pozycjach 17-56 is A, C, T, lub G <400> 1 tcgcgcgagt cgtctgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnccg c 60 atcgtcctcc c 71 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <91 ępliwpriH a £ 71-π n 7 η λ <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <400> 2 taatacgact cactataggg aggacgatgc gg 32 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna

PL 201 637 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <400> 3 tcgcgcgagt cgtctg 16 <210> 4 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 4 gggaggacga ugcggcaauc aaaacucacg uuauucccuc aucuauuagc uuccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 5 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 5 gggaggacga ugcggcaauc uccgaaaaag acucuuccug cauccucuca ccccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 6 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy

PL 201 637 B1 <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 6 gggaggacga ugcggcaacc ucgaaagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 7 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 7 gggaggacga ugcggcaacc ucgauagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 8 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 8 gggaggacga ugcggcaacc ucaaucuuga cauuucccgc accuaaauuu gcccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 9 <211> 71

PL 201 637 B1 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 9 gggaggacga ugcggcaaac gaucacuuac cuuuccugca ucugcuagcc ucccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 10 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 10 gggaggacga ugcggacgcc agccauugac ccucgcuucc acuauuccau ccccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 11 <211> 70 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1).. (70) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 11 gggaggacga ugcggccaac cucauuuuga cacuucgccg caccuaauug cccccagac g 60 acucgcccga

PL 201 637 B1 <210> 12 <211> 15 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(15) <223> Wszystkie pirymidyny są 2^łF.

<220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(15) <223> N w pozycjach 4 i 10 jest A, G, 2'-F-U lub 2’-F-C <400> 12 gacnyuuccn gcayc 15 <210> 13 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 13 gggaggacga ugcggaaccc auaacgcgaa ccgaccaaca ugccucccgu gcccccaga c 60 gacucgcccg a <210> 14 <211> 70 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

PL 201 637 B1 <221> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (70) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 14 gggaggacga ugcggugccc auagaagcgu gccgcuaaug cuaacgcccu cccccagac g 60 acucgcccga <210> 15 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 15 gggaggacga ugcggugccc acuaugcgug ccgaaaaaca uuucccccuc uaccccaga c 60 gacucgcccg a <210> 16 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 16 gggaggacga ugcggaacac uuucccaugc gucgccauac cggauauauu gcucccaga c 60 gacucgcccg a

71
<210>	17
<211>	71
<212>	RNA
<213>	Sekwencja Sztuczna

PL 201 637 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 17 gggaggacga ugcggacugg accaaaccgu cgccgauacc cggauacuuu gcucccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 18 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220> ' <223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 18 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccugcaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 19 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 19 gggaggacga ugcgguuaag ucucgguuga augcccaucc cagauccccc ugacccaga c 60 gacucgcccg a 71

PL 201 637 B1 <210> 20 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 20 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 21 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 21 gggaggacga ugcgggaagu uuucucugcc uugguuucga uuggcgccuc ccccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 22 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

PL 201 637 B1 <400> 22 gggaggacga ugcggucgag cggucgaccg ucaacaagaa uaaagcgugu cccugcaga c 60 gacucgcccg a <210> 23 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2’F.

<400> 23 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 24 <211> 76 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(76) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 24 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaaa aaaccuccc c 60 cagacgacuc gcccga 76 <210> 25 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy

PL 201 637 B1 <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) ' <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 25 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 26 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 26 gggaggacga ugcggacgag cgucucauga ucacacuauu ucgucucagu gugcacaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 27 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 27 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacaucc ccccccaga c 60 gacucgcccg a

71
<210> <211> <212>	28 71 RNA

PL 201 637 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 28 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacagcc uuccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 29 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 29 gggaggacga ugcggagaac ucauccuaac cgcucuaaca aaucuugucc gaccgcaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 30 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 30 gggaggacga ugcggauaau ucgacaccaa ccaggucccg gaaaucaucc cucugcaga c 60 gacucgcccg a 71

PL 201 637 B1 <210> 31 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 31 gggaggacga ugcggaaacc aaccguugac caccuuuucg uuuccggaaa guccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 32, <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 32 gggaggacga ugcggaagcc aacccucuag ucagccuuuc guuucccacg ccacccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 33 <211> 72 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(72) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 33

PL 201 637 B1 gggaggacga ugcgggacca acuaaacugu ucgaaagcug gaacaugucc ugacgccag a 60 cgacucgccc ga 72 <210> 34 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2’F.

<400> 34 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguccu gacgccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 35 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 35 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcuag aacacgucca gacgccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 36 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

PL 201 637 B1 <221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 36 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguucu gacgccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 37 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 37 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aauacguccu gacgccaga _ / Π

U ou gacucgcccg a 71 <210> 38 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 38 gggaggacga ugcggaaguu uagugcucca guuccgacac uccucuacuc agccccaga c 60 gacucgcccg a

71
<210>	39
<211>	71
<212>	RNA
<213>	Sekwencja sztuczna

PL 201 637 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 39 gggaggacga ugcggagcca gagccucucu caguucuaca gaacuuaccc acuggcaga c 60 gacucgcccg a

Ί Ί i X <210> 40 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 40 gggaggacga ugcggaccua acucaaucag gaaccaaacc uagcacucuc auggccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 41 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1j..(71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 41 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccaga c 60 gacucgcccg a 71

PL 201 637 B1 <210> 42 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 42 gggaggacga ugcggaucuc gauccuucag cacuucauuu cauuccuuuc ugccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 43 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2’F.

<400> 43 gggaggacga ugcggacgau ccuuuccuua acauuucauc auuucucuug ugccccaga c 60 gacucgcccg a 71 <210> 44 <211> 71 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (71) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 44

PL 201 637 B1 gggaggacga ugcggugacg acaacucgac ugcauaucuc acaacuccug ugccccaga c 60 gacucgcccg a <210> 45 <211> 72 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(72) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 45 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaac cucccccag a 60 cgacucgccc ga <210> 46 '<211> 70 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(70) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F.

<400> 46 gggaggacga ugcgggcgca ucgagcaaca uccgauucgg auuccuccac ucccccaga c 60 gacugcccga <210> 47 <211> 50 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

PL 201 637 B1 <221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(50) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; połączenie w pozycjach 50 i 51 jest 3'-3 ' .

<400> 47 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu 50 <210> 48 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1).. (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 48 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 49 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 1-3, 5 i 55 są 2'OMe; a w pozycji 4 jest 2'OMe; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3’-3'.

<400> 49 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug

55
<210>	50
<211>	55
<212>	RNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

PL 201 637 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 6, 9, 12 i 14 są 2'0Me; a w pozycjach 7 i 10 są 2'0Me; połączenie w pozycjach jest 3'-3'.

<400> 50 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 51 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 15 i 22 są 2'OMe; a w pozycjach 16-17, 19-20 i 24 są 2'OMe; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3'-3' .

<400> 51 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 52 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2’F; g w pozycjach 38, 41 i 44 są 2'0Me; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3¹-3'.

<400> 52 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55

PL 201 637 B1 <210> 53 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2’F; g w pozycjach 39-40, i 48 są 2'0Me; a w pozycjach 36-37 i 41 są 2'OMe; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest

3’-3’.

<400> 53 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 54 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 1-3,

5-6, 9, 12, 14-15, 22, 28, 31, 34, 39-40, 43, 48 i 55 są 2’OMe.

<220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (55) <223> A w pozycjach 7, 10, 16-17, 19-20, 24, 36-37, i 41 są 2'0Me; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 54 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug

55
<210>	55
<211>	55
<212>	RNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

PL 201 637 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 1-3,

5-6, 9, 12, 14-15, 22, 39-40, 43, 48 i 55 są 2'OMe; a w pozycjach 4,7, 10, 16-17,19-20,

24-36-37, 40 są 2'OMe.

<220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (55) <223> Połączenie w pozycjach 55 i 56 is 3'-3'.

<400> 55 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 56 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1). . (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 1-3,

5-6, 15, 22, 39-40, 43, 48 i 55 są 2'0Me; a w pozycjach 4, 16-17,19-20, 24 36-37 i 40 są 2'0Me; połączenie w pozycjach 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 56 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 57 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 15, 22,

39-40, 43, 48, 55 są 2'OMe; a w 4, 7, 16-17,

PL 201 637 B1

19-20, 24, 36-37, 40 są 2'OMe; połączenie w 55, 56 jest 3 ’-3'.

<400> 57 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 58 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1).. (55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 9, 15, 22, 39-40, 43, 48, 55 są 2'OMe; a w 4, 16-17,

19-20, 24, 36-37, 41 są 2'OMe; połączenie w 55, 56 j est 3'-3'.

<400> 58 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 59 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 15, 22,

39-40, 43, 48 i 55 są 2'OMe; a w 4, 10,

16-17, 19-20, 24, 36-37, i 41 są 2'OMe; połączenie w 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 59 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug

55
<210>	60
<211>	55
<212>	RNA
<213>	Sekwencja sztuczna

PL 201 637 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 12, 14-15,

22, 39-40, 43, 48 i 55 są 2'OMe; a w 4,

16-17, 19-20, 24, 36-37 i 41 są 2'OMe; połączenie w 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 60 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 61 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 6, 15, 22,

28, 39-40, 43, 48, i 55 są 2'OMe; a w 4,

16-17, 19-20, 24, 36-37 i 40 są 2'0Me; połączenie w 55 i 56 jest 3 ' -3'.

<400> 61 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 62 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 15, 22,

39-40, 43, 48 i 55 są 2'OMe; a w 4, 16-17,

19-20, 27, 36-37 i 40 są 2'OMe; połączenie w 55 i 56 jest 3'-3'.

<400> 62

PL 201 637 B1 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 63 <211> 55 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(55) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w 1-3, 5, 15, 22,

39-40, 43, 48 i 55 są 2'OMe; a w 4, 16-17,

19-20, 24, 36-37, i 40 są 2'OMe; połączenie w 55 i 56 jest 3'-3' .

<400> 63 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 64 <211> 39 <212> RNA <213>’ Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (39) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 2-3,

5-6, 23-24, 27, 32, i 39 są 2'OMe; a w pozycjach 4, 7, 20-21, i 25 są 2'OMe;.

<220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (39) <223> Połączenie w pozycji 39 i 40 jest 3'-3'.

<220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1)..(39) <223> N w pozycji 10 jest (CH2CH20)6 <400> 64 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcucccug 39

PL 201 637 B1 <210> 65 <211> 34 <212> RNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Kwas nukleinowy <220>

<22i> zmodyfikowana zasada <222> (1) . . (34) <223> Wszystkie pirymidyny są 2'F; g w pozycjach 2-3, 5-6, 23-24, 27 i 32 są 2'OMe; a w pozycjach 4, 7, 20-21, i 25 są 2'OMe <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (34) <223> N w pozycji 10 jest (CH2CH2O)6 <220>

<221> zmodyfikowana zasada <222> (1) .. (34) <223> połączenie w pozycjach 34 i 35 jest 3' - 3' <400> 65 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcu 34

Claims (35)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Ligand tenascyny-C będący kwasem nukleinowym, oczyszczony i nie występujący w przyrodzie, znamienny tym, że jest to ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
2. 2. Ligand według zastrz. 1, znamienny tym, że jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
3. 3. Ligand według zastrz. 1, znamienny tym, że ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
4. 4. Kompleks do stosowania w diagnostyce in vivo, zawierający ligand tenascyny-C będący kwasem nukleinowym oraz znacznik, znamienny tym, że będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C jest wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
5. 5. Kompleks według zastrz. 4, znamienny tym, że ligand tenascyny C jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
6. 6. Kompleks według zastrz. 4, znamienny tym, że ligand tenascyny C ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
7. 7. Kompleks według zastrz. 4, znamienny tym, że znacznik wybiera się z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, związków magnetycznych i biotyny.
8. 8. Kompleks według zastrz. 7, znamienny tym, że nuklidy promieniotwórcze wybiera się z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹ln, ³²P i ¹⁸⁶Re.
9. 9. Kompleks według zastrz. 8, znamienny tym, że znacznikiem jest technet-99m (Tc-99m).

   PL 201 637 B1
10. 10. Kompleks według zastrz. 7, znamienny tym, że nuklidy promieniotwórcze oraz związki magnetyczne są sprzężone z chelatorem.
11. 11. Kompleks według zastrz. 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny C obejmuje ponadto łącznik.
12. 12. Kompleks według zastrz. 11, znamienny tym, że łącznikiem jest grupa heksyloaminowa.
13. 13. Kompleks według zastrz. 12, znamienny tym, że łącznikiem jest związek o strukturze /0— ρ-ο

    ΗΝ II wszystkie A są 2'-OMe, wszystkie G, o ile nie wskazano inaczej, są zmodyfikowane w pozycji 2' grupą OMe, wszystkie C są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F, wszystkie U są zmodyfikowane w pozycji 2' atomem F.
14. 15. Sposób wytwarzania kompleksu składającego się z liganda tenascyny C będącego kwasem nukleinowym oraz znacznika, znamienny tym, że ligand wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65 oraz że wiąże się go kowalencyjnie ze znacznikiem.
15. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się ligand będący substancją jednorodną i posiadającą taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
16. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się ligand posiadający taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
17. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że znacznik wybiera się z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, zwią zków magnetycznych i biotyny.
18. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że nuklidy promieniotwórcze wybiera się z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹ln, ³²P i ¹⁸⁶Re.
19. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się znacznik którym jest technet-99m (Tc-99m).

    PL 201 637 B1
20. 21. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się znacznik sprzężony z chelatorem.
21. 22. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym który obejmuje dodatkowo łącznik.
22. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się łącznik będący grupą heksyloaminową.
23. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się łącznik posiadający strukturę /0— ρ-ο

    ΗΝ II
24. 25. Zastosowanie będącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny-C do wytwarzania środka terapeutycznego do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej raka, łuszczycę i miażdżycę, w których zachodzi ekspresja tenascyny C poprzez kowalencyjne wią zanie bę d ącego kwasem nukleinowym liganda tenascyny C z czynnikiem terapeutycznym w celu utworzenia kompleksu, gdzie będący kwasem nukleinowym ligand tenascyny-C jest wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
25. 26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamiene tym, że chorobą jest rak.
26. 27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamiene tym, że ligand tenascyny C jest substancją jednorodną i posiada taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
27. 28. Zastosowanie według zastrz. 25, znamiene tym, że ligand tenascyny C ma taką samą budowę i taką samą zdolność do wiązania tenascyny-C jak ligand wybrany z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NOS: 4-65.
28. 29. Zastosowanie według zastrz. 25, znamiene tym, że znacznik jest wybrany z grupy składającej się z nuklidów promieniotwórczych, fluoroforów, związków magnetycznych i biotyny.
29. 30. Zastosowanie według zastrz. 25, znamiene tym, że znacznikiem jest nuklid promieniotwórczy wybrany z grupy składającej się z technetu-99m (Tc99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹ln, ³²P i ¹⁸⁶Re.
30. 31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamiene tym, że znacznikiem jest technet-99m (Tc-99m).
31. 32. Zastosowanie według zastrz. 29, znamiene tym, że znacznik jest sprzężony z chelatorem.
32. 33. Zastosowanie według zastrz. 37 znamiene tym, że ligand tenascyny C będący kwasem nukleinowym obejmuje ponadto łącznik.
33. 34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamiene tym, że łącznikiem jest grupa heksyloaminowa.
34. 35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamiene tym, że łącznikiem jest związek o strukturze /0— Ρ-0

    ΗΝ II

    Ο
35. 36. Zastosowanie według zastrz. 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 34, albo 35, znamiene tym, że obejmuje ponadto przyłączanie do kompleksu czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego.