HRP20020186A2 - Tenascin-c nucleic acid ligands - Google Patents

Tenascin-c nucleic acid ligands Download PDF

Info

Publication number
HRP20020186A2
HRP20020186A2 HR20020186A HRP20020186A HRP20020186A2 HR P20020186 A2 HRP20020186 A2 HR P20020186A2 HR 20020186 A HR20020186 A HR 20020186A HR P20020186 A HRP20020186 A HR P20020186A HR P20020186 A2 HRP20020186 A2 HR P20020186A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
tenascin
nucleic acid
nucleic acids
mixture
complex
Prior art date
Application number
HR20020186A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Hicke
Stephen Warren
David Parma
Larry Gold
Original Assignee
Gilead Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Sciences filed Critical Gilead Sciences
Publication of HRP20020186A2 publication Critical patent/HRP20020186A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/966—Elastase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Polje izuma
Ovdje su opisani nukleinsko kiselinski ligandi visokog afiniteta prema tenascinu-C. Također su ovdje opisane metode identificiranja i priprave nukleinsko kiselinskih liganada visokog afiniteta prema tenascinu-C. Ovdje korištena metoda za identificiranje takvih nukleinsko kiselinskih liganada zove se SELEX, što je skraćenica za “Sistematska evolucija liganada eksponecijalnim obogaćenjem” (engl. “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment”). Dalje su objavljeni nukleinsko kiselinski ligandi visokog afiniteta prema tenascinu-C. Dalje su objavljeni RNA ligandi tenascina-C. Također su uključeni oligonukleotidi koji sadrže derivate nukleotida kemijski modificirane na poziciji 2’ purina i pirimidina. Dodatno su objavljeni RNA ligandi tenascina-C koji sadrže 2’-F i 2’OMe modifikacije. Oligonukleotidi ovog izuma su korisni kao dijagnostička i/ili terapijska sredstva.
Pozadina izuma
Tenascin-C je heksamerni glikoprotein (1.1-1.5 miliona Da), primarno smješten u vanstaničnom matriksu. Do ekspresije tenascina-C dolazi za embriogeneze, zacjeljivanja rana i neoplazije, što sugerira ulogu ovog proteina u preobrazbi tkiva (Erickson and Bourdon (1989) Ann Rev Cell Biol 5:71-92). Neoplastični procesi također uključuju preobrazbu tkiva, a ekspresija tenascina-C je pretjerana kod mnogih tipova tumora uključujući karcinome pluća, dojki, prostate i debelog crijeva, kao i kod astrocitoma, glioblastoma, melanoma i sarkoma (Soini et al. (1993) Am J Clin Pathol 100(2):145-50; Koukoulis et al. (1991) Hum Pathol 22(7):636-43; Borsi et al. (1992) Int J Cancer 52(5):688-92; Koukoulis et al. (1993) J Submicrosc Cytol Pathol 25(2):285-95; Ibrahim et al. (1993) Hum Pathol 24(9):982-9; Riedl et al. (1998) Dis Colon Rectum 41(1):86-92; Tuominen and Kallioinen (1994) J Cutan Pathol 21(5):424-9; Natali et al. (1990) Int J Cancer 46(4):586-90; Zagzag et al. (1995) Cancer Res 55(4):907-14; Hasegawa et al. (1997) Acta Neuropathol (Berl) 93(5):431-7; Saxon et al. (1997) Pediatr Pathol Lab Med 17(2):259-66; Hasegawa et al. (1995) Hum Pathol 26(8):838-45). Dodatno je ekspresija tenascina-C povećana u hiperproliferativnim kožnim oboljenjima, na primjer psorijaza (Schalkwijk et al. (1991) Br J Dermatol 124(1):13-20) i u aterosklerotskim lezijama (Fukumoto et al. (1998) J Atheroscler Thromb 5(1):29-35; Wallner et al. (1999) Circulation 99(10):1284-9). Radiooznačena antitijela koja vežu tenascin-C se koriste za prikazivanje i terapiju tumora u kliničkim okvirima (Paganelli et al. (1994) Eur J Nucl Med 21(4):314-21; Bigner et al. (1998) J Clin Oncol 16(6):2202-12; Merlo et al. (1997) Int J Cancer 71(5):810-6).
Potencijalna upotreba aptamera protiv tenascina-C je za dijagnozu i terapiju raka, kao i za dijagnozu i terapiju ateroskleroze i terapiju psorijaze. Srodni antitijelima, aptameri su mali (7-20 kDa), brzo nestaju iz krvi, a sintetizirani su kemijski. Brzo nestajanje iz krvi je važno za in vivo dijagnostičko prikazivanje, kada su razine u krvi primarna odrednica pozadine koja sliku čini nejasnom. Brzo nestajanje iz krvi može također biti važno u terapiji gdje razine u krvi mogu pridonijeti toksičnosti. SELEX tehnologija dopušta brzu izolaciju aptamera, a kemijska sinteza dopušta jednostavnu i ciljano specifičnu konjugaciju aptamera do raznih inerntnih i bioaktivnih molekula. Aptamer tenascina-C bi stoga bio koristan za terapiju tumora, ili in vivo ili ex vivo dijagnostičko prikazivanje i/ili za isporuku raznih terapeutskih sredstava u kompleksu s nukleinsko kiselinskim ligandom tenascina-C za liječenje oboljenja kod kojih je prisutna ekspresija tenascina-C.
Mnogo godina je bila dogma da nukleinske kiseline imaju prvotno informacijsku ulogu. Kroz metodu poznatu kao “Sistematska evolucija liganada eksponecijalnim obogaćenjem”, nazvanu SELEX postupak, postalo je jasno da nukleinske kiseline imaju trodimenzionalne strukturne različitosti, slično proteinima. SELEX postupak je metoda za in vitro evoluciju molekula nukleinske kiseline s vrlo specifičnim vezanjem za molekule mete, a opisana je u United States Patent Application Serial No. 07/536,428, prijavljena 11. lipnja 1990. pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment,” sada napuštena, United States Patent No. 5,475,096 pod naslovom “Nucleic Acid Ligands,” United States Patent No. 5,270,163 (pogledaj također WO 91/19813) pod naslovom “Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands,” od kojih je svaka posebno ovdje uključena referencom u svojoj cjelokupnosti. Svaka od tih prijava (ovdje se na sve zajedno referira kao na patentnu prijavu SELEX) opisuje u osnovi novu metodu za stvaranje nukleinsko kiselinskih liganada za svaku željenu molekulu metu. SELEX postupak pruža razred proizvoda na koje se referira kao na nukleinsko kiselinske ligande ili aptamere, od kojih svaki ima jedinstvenu sekvencu i čija je značajka specifično vezanje na željeni spoj metu ili molekulu. Svaki SELEX-identificirani nukleinsko kiselinski ligand je specifični ligand za dani spoj metu ili molekulu metu. SELEX postupak je baziran na jedinstvenom uvidu da nukleinske kiseline posjeduju dovoljni kapacitet za formiranje raznih dvo- i trodimenzionalnih struktura te dovoljnu kemijsku svestranost dostupnu unutar njihovih monomera da djeluju kao ligandi (stvaraju specifične parove vezanja) s, prividno, bilo kojim kemijskim spojem, bilo da je on monomer ili polimer. Molekule bilo koje veličine ili sastava mogu služiti kao meta u SELEX metodi. SELEX metoda primijenjena na primjeni vezanja visokog afiniteta uključuje odabir iz mješavine oligonukleotidnih kandidata i ponavljanje, korak po korak, vezanja, odjeljivanja i amplificiranja, uz upotrebu iste općenite sheme odabira, kako bi se dobio prividno bilo koji željeni kriterij afiniteta vezanja i selektivnosti. Počevši od smjese nukleinskih kiselina koje, preferira se, sadrže segment nasumične sekvence, SELEX metoda uključuje korake dovođenja smjese u kontakt s metom pod uvjetima koji su povoljni za vezanje, odvajanje nevezanih nukleinskih kiselina od onih nukleinskih kiselina koje su se specifično vezale na molekule mete, disociranja kompleksa nukleinske kiseline i mete, amplificiranja nukleinskih kiselina disociranih iz kompleksa nukleinske kiseline i mete kako bi se dobila ligandom obogaćena mješavina nukleinskih kiselina, zatim neprestanog ponavljanja koraka vezanja, odjeljivanja, disocijacije i amplificiranja kroz željeni broj ciklusa da bi se dobili visoko specifični nukleinsko kiselinski ligandi visokog afiniteta za molekulu metu.
Od strane ovih izumitelja je prepoznato da SELEX metoda pokazuje da nukleinske kiseline kao kemijski spojevi mogu formirati široku lepezu oblika, veličina i konfiguracija, te da su sposobne za puno širi repertoar vezanja i ostalih funkcija od onih koje pokazuju nukleinske kiseline u biološkim sistemima.
Osnovna SELEX metoda je bila modificirana kako bi se postigli brojni specifični ciljevi. Na primjer, United States Patent Application Serial No. 07/960,093, prijavljena 14. listopada 1992., sada napuštena, i United States Patent No. 5,707,796, oba pod naslovom “Metods for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure,” opisuje upotrebu SELEX postupka združenog s gel elektroforezom za selekcioniranje molekula nukleinske kiseline sa specifičnim strukturalnim karakteristikama, kao što je vezana DNA. United States Patent Application Serial No. 08/123,935, prijavljena 17. rujna 1993., pod naslovom “Photoselection of Nucleic Acid Ligands,” sada napuštena, United States Patent No.5,763,177, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX” i United States Patent Application Serial No. 09/093,293, prijavljena 8. lipnja 1998., pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX” opisuje na SELEX-u bazirane metode za selekcioniranje nukleinsko kiselinskih liganada koji sadrže fotoreaktivnu grupu sposobnu za vezanje i/ili fotokroslink (engl.: photocrosslinking) na molekulu metu, i/ili fotoinaktivaciju molekule mete. United States Patent No. 5,580,737, pod naslovom “High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine,” opisuje metodu za identificiranje visoko specifičnih nukleinsko kiselinskih liganada sposobnih razlikovati blisko srodne molekule, koje mogu biti nepeptidi, pod pojmom Counter-SELEX. United States Patent No. 5,567,588, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX” opisuje na SELEX-u baziranu metodu koja postiže visoko učinkovito odjeljivanje između oligonukleotida koji imaju visoki i niski afinitet za molekulu metu.
SELEX metoda obuhvaća identifikaciju nukleinsko kiselinskih liganada visokog afiniteta koji sadrže modificirane nukleotide koji daju poboljšane karakteristike ligandu, kao što su poboljšana in vivo stabilnost ili poboljšane karakteristike isporuke. Primjeri takvih modifikacija uključuju kemijsku supstituciju na poziciji riboze i/ili fosfata i/ili baze. Nukleinsko kiselinski ligandi identificirani SELEX postupkom koji sadrže modificirane nukleotide se opisani u United States Patent No. 5,660,985, pod naslovom “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides,” koji opisuje oligonukleotide koji sadrže derivate nukleotida kemijski modificirane na pozicijama 5 i 2’ pirimidina. United States Patent No. 5,580,737, naveden gore, opisuje visoko specifične nukleinsko kiselinske ligande koji sadrže jedan ili više nukleotida modificiranih s 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluoro (2’-F), i/ili 2’-O-metilom (2’-OMe). United States Patent Application Serial No. 08/264,029, prijavljena 22. lipnja 1994., pod naslovom “Novel Method of Preparation of Known and Novel 2’ Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement”, sada napuštena, opisuje oligonukleotide koji sadrže razne 2’-modificirane pirimidine.
SELEX metoda obuhvaća kombiniranje selekcioniranih oligonukleotida s drugim selekcioniranim oligonukleotidima i ne-oligonukleotidnim funkcionalnim jedinicama kao što je opisano u United States Patent No. 5,637,459, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chimeric SELEX,” i u United States Patent No. 5,683,867, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Blended SELEX,”, svakom za sebe. Ove prijave dopuštaju kombinaciju široke lepeze oblika i drugih značajki te učinkovite značajke amplificiranja i replikacije oligonukleotida sa željenim značajkama drugih molekula.
SELEX metoda dalje obuhvaća kombiniranje selekcioniranih nukleinsko kiselinskih liganada s lipofilnim spojevima ili s ne-imunogenim spojevima velike molekularne mase u dijagnostičkom ili terapijskom kompleksu kao što je opisano u United States Patent Application Serial No. 08/434,465, prijavljena 4. svibnja 1995., pod naslovom “Nucleic Acid Ligand Complexes”. Svaki od gore opisanih patenata i prijava koje opisuju modifikacije osnovnog SELEX postupka je ovdje posebno uključen referencom u njihovoj cjelokupnosti.
Sažetak izuma
Ovaj izum opisuje metodu za izoliranje nukleinsko kiselinskih liganada koji se visokom specifičnošću vežu za tenascin-C. Dalje su ovdje opisani nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C. Također su ovdje opisani RNA ligandi tenascina-C visokog afiniteta. Dalje su opisani RNA ligandi tenascina-C i to s 2’fluoro-modificiranim pirimidinom i 2’OMe modificiranim purinom. Metoda koja je ovdje korištena za identficiranje takvih nukleinsko kiselinskih liganada se zove SELEX, što je skraćenica za “Sistematska evolucija liganada eksponecijalnim obogaćenjem” (engl. “Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment”). Ovdje su uključeni ligandi koji su prikazani na Tablicama 3 i 4 te Slici 10.
Dalje je u ovom izumu uključena metoda detektiranja prisutnosti bolesti koja dovodi do eskpresije tenascina-C u biološkom tkivu koje može biti bolesno. Još dalje je u ovom izumu uključena metoda detektiranja prisutnosti tumora koji dovodi do eskpresije tenascina-C u biološkom tkivu koje može sadržavati tumor. Dalje je u ovom izumu uključen kompleks za upotrebu u in vivo ili ex vivo dijagnostici. Još dalje je u ovom izumu uključena metoda isporuke terapeutskih sredstava za liječenje ili profilaksu tkiva zahvaćenog bolešću koja dovodi do ekspresije tenascina-C. Još dalje je u ovom izumu uključen kompleks za upotrebu u isporuci terapeutskih sredstava za liječenje ili profilaksu tkiva zahvaćenog bolešću koja dovodi do ekspresije tenascina-C.
Sažet opis slikovnih prikaza
Slika 1 prikazuje vezanje Cell SELEX RNA pulova (engl. pools) na U251 stanice.
Slika 2 prikazuje predloženu sekundarnu strukturu aptamera TTA1 i TTA1.NB. Na slici je uključeno spajanje aptamera s Tc-99m kelatorom. Svi A su 2’OMe modificirani. Svi G su, osim ako nije drugačije označeno, 2’OMe modificirani. Svi C i U su 2’F modificirani.
Slika 3 prikazuje prikaze U251 tumorskih ksenograftova kod miševa, dobivene upotrebom TTA1 i TTA1.NB označenih s Tc-99m, tri sata nakon injektiranja.
Slika 4 prikazuje fluorescentnu mikroskopiju presjeka U251 glioblastoma tumora, uzetog tri sata nakon i.v. injekcije TTA1 označenog s Rodamin-Red-X.
Slika 5 prikazuje način na koji se Tc-99m i linker vežu preko 5’G TTA1.
Slika 6 opisuje unos TTA1/GS7641 nakon tri sata u raznim humanim tumorskim ksenograftima kod miša, u usporedbi s nevezujućim kontrolnim aptamerom. ID/g = injektirana doza/gram.
Slika 7 pokazuje biodistribuciju TTA1/GS7641 označenih s In-111 uz upotrebu ili DOTA ili DTPA kao radiometalnog kelatora, tri sata nakon injektiranja. ID/g = injektirana doza/gram.
Slika 8 prikazuje konjugaciju aptamera na DTPA. 111In je prikazan kao kelatiran pomoću DTPA.
Slika 9 prikazuje konjugaciju aptamera na DOTA. 111In je prikazan kao kelatiran pomoću DOTA.
Slika 10 prikazuje predloženu sekundarnu strukturu aptamera TTA1. U slici je uključena konjugacija aptamera s Tc-99m kelatorom. Prikazani aptamer je u obliku označenom s Tc-99m. Svi A su 2’OMe modificirani. Svi G su, osim ako nije drugačije označeno, 2’OMe modificirani. Svi C i U su 2’F modificirani.
Detaljni opis preferiranih aspekata
Središnja metoda ovdje korištena za identificiranje nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C se zove SELEX postupak, što je skraćenica za “Sistematska evolucija liganada eksponecijalnim obogaćenjem” (engl. “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment”), a uključuje (a) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C (b) odvajanje između članova navedene mješavine kandidata na principu afiniteta za tenascin-C, te (c) amplificiranja selekcioniranih molekula kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih sekvencama nukleinskih kiselina s relativno većim afinitetom za vezanje tenascina-C. Izum uključuje RNA ligande tenascina-C. Ovaj izum dalje uključuje specifične RNA ligande tenascina-C prikazane u Tablicama 3 i 4 te na Slici 10. Još specifičnije, ovaj izum uključuje sekvence nukleinskih kiselina koje su u osnovi homologne i koje imaju u osnovi istu sposobnost vezanja tenascina-C kao i specifični nukleinsko kiselinski ligandi prikazani u Tablicama 3 i 4 te na Slici 10. Pod “u osnovi homologne” se misli na stupanj homolognosti primarne sekvence veći od 70%, bolje je ako je veći od 80%, a najbolje je ako je veći od 90%, 95% ili 99%. Postotak homologije kako je ovdje opisan je računat kao postotak nukleotida nađen u manjoj od dvije sekvence koji se poklapaju s identičnim nukleotidnim ostacima u sekvenci s kojom su uspoređeni, pri čemu se može uvesti jedna praznina u dužini od 10 nukleotida kako bi pomogla u poklapanju. U osnovi ista sposobnost vezanja tenascina-C znači da je afinitet unutar jednog ili dva reda veličine afiniteta ovdje opisanih liganada. Pravilno je da unutar stručnosti normalno stručna osoba odredi da li dana sekvenca - koja je u osnovi homologna onima ovdje posebno opisanima - ima istu sposobnost vezanja tenascina-C.
Pregled homologija sekvenci nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C prikazan na Tablicama 3 i 4 te Slici 10 pokazuje da sekvence s malo ili bez primarne homologije mogu imati u osnovi istu sposobnost vezanja tenascina-C. Iz tih razloga ovaj izum također uključuje nukleinsko kiselinske ligande koji imaju u osnovi istu pretpostavljenu strukturu ili strukturalne motive te sposobnost vezanja tenascina-C kao i nukleinsko kiselinski ligandi prikazani na Tablicama 3 i 4 te Slici 10. U osnovi istu strukturu ili strukturalne motive može se pretpostaviti poklapanjem sekvenca korištenjem Zukerfold programa (pogledaj Zuker (1989) Science 244:48-52). Kao što bi bilo poznato u struci, mogu se koristiti drugi kompjuterski programi za predviđanje sekundarne strukture i strukturalnih motiva. U osnovi istu strukturu ili strukturalne motive nukleinsko kiselinskih liganada mogu se pretpostaviti u otopini ili kao vezanu strukturu korištenjem NMR ili drugih tehnika kao što bi bilo poznato u struci.
Dalje je u ovom izumu uključena metoda detektiranja prisutnosti bolesti koja dovodi do eskpresije tenascina-C u biološkom tkivu koje može biti bolesno, metodom (a) identificiranja nukleinsko kiselinskog liganda iz mješavine kandidata nukleinskih kiselina, pri čemu je nukleinsko kiselinski ligand ligand tenascina-C, metodom koja se sastoji od (i) dovođenja u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje se nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet prema tenascinu-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu odvojiti iz ostatka mješavine kandidata; (ii) odvajanja nukleinskih kiselina koje imaju povećani afinitet iz ostatka mješavine kandidata; (iii) amplificiranja nukleinskih kiselina koje imaju povećani afinitet kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje tenascina-C, pri čemu se identifcira nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C; (b) vezanja markera, koji se može koristiti u in vivo ili ex vivo dijagnostici, na nukleinsko kiselinski ligand identificiran u koraku (iii) kako bi se formirao kompleks marker-nukleinsko kiselinski ligand; (c) izlaganja tkiva koje može biti bolesno kompleksu marker-nukleinsko kiselinski ligand; i (d) detektiranja prisustva kompleksa marker-nukleinsko kiselinski ligand u tkivu, pri čemu je identificirana bolest koja dovodi do ekspresije tenascina-C.
Dalji je cilj ovog izuma pružiti kompleks za upotrebu u in vivo ili ex vivo dijagnostici koji sadrži jedan ili više nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C te jedan ili više markera. Još dalje je uključena u ovaj izum metoda za isporuku terapeutskih sredstava za liječenje ili profilaksu oboljenja kod kojih je prisutna ekspresija tenascina-C. Još dalje je uključen u ovaj izum kompleks za korištenje pri isporuci terapeutskih sredstava za liječenje ili profilaksu oboljenja kod kojih je prisutna ekspresija tenascina-C.
Definicije
Ovdje su korišteni razni pojmovi koji se odnose na aspekte ovog izuma. Kako bi se pomoglo u razjašnjenju opisa komponenata ovog izuma, dane su slijedeće definicije:
Kao što se ovdje koristi, “nukleinsko kiselinski ligand” je nukleinska kiselina koja se ne pojavljuje u prirodi te koja ima željeno djelovanje na metu. Na nukleinsko kiselinske ligande se često upućuje pojmom “aptameri”. Meta (cilj) ovog izuma je tenascin-C, stoga pojam nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C. Željeno djelovanje uključuje, ali nije time ograničeno, vezanje mete, katalitičko mijenjanje mete, reagiranje s metom na način koji modificira/mijenja metu ili funkcionalno djelovanje mete, vežući se kovalentno na metu kao samoubilački inhibitor, olakšavajući reakciju između mete i druge molekule. U preferiranom aspektu, djelovanje je specifični afinitet vezanja na molekulu metu, pri čemu je takva molekula meta trodimenzionalna kemijska struktura, koja nije polinukleotid, a koja se veže na nukleinsko kiselinski ligand pomoću mehanizma koji uglavnom ovisi o Watson/Crick sparivanju baza ili vezanju trostrukog heliksa, gdje nukleinsko kiselinski ligand nije nukleinska kiselina koja ima poznatu fiziološku funkciju da se veže molekulom metom. Nukleinsko kiselinski ligandi su identificirani iz mješavine kandidata nukleinskih kiselina, pri čemu je nukleinsko kiselinski ligand ligand tenascina-C, metodom koja se sastoji od a) dovođenja u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje se nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet prema tenascinu-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu odvojiti iz ostatka mješavine kandidata; b) odvajanja nukleinskih kiselina koje imaju povećani afinitet iz ostatka mješavine kandidata; i c) amplificiranja nukleinskih kiselina koje imaju povećani afinitet kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćena ligandom (pogledaj U.S.Patent Application No. 08/434,425, prijavljena 3. svibnja 1995., sada United States Patent No. 5,789,157, koji je ovime ovdje uključen referencom).
Kao što se ovdje koristi, “mješavina kandidata” je mješavina nukleinskih kiselina različitih sekvenca iz kojih se treba odabrati željeni ligand. Izvor mješavine kandidata može biti iz nukleinskih kiselina koje se pojavljuju u prirodi ili njihovih fragmenata, iz kemijski sintetiziranih nukleinskih kiselina, iz enzimatski sintetiziranih nukleinskih kiselina ili iz nukleinskih kiselina pripremljenih kombinacijom prethodnih tehnika. U preferiranom aspektu, svaka nukleinska kiselina ima fiksirane sekvence koje okružuju nasumičnu regiju kako bi se olakšao postupak amplificiranja.
Kao što se ovdje koristi, “nukleinska kiselina” znači ili DNA, RNA, jednolančana ili dvolančana, ili bilo koja njihova kemijska modifikacija. Modifikacije uključuju, ali nisu time ograničene, one koje pružaju druge kemijske grupe koje uključuju dodatni naboj, polarizabilnost, vezanje vodika, elektrostatske interakcije, te promjenjivost bazama nukleinsko kiselinskog liganda ili nukleinsko kiselinskim ligandima kao cjelini. Takve modifikacije uključuju, ali nisu time ograničene, modifikacije na poziciji 2’ šećera, modifikacije na poziciji 5 pirimidina, modifikacije na poziciji 8 purina, modifikacije na egzocikličnim aminima, supstitucije 4-tiouridina, supstitucije 5-bromo ili 5-jodo uracila; modifikacije glavne osi, metilacije, neuobičajene kombinacije sparivanja baza kao što su izobaze izocitidin i izogvanidin i slične. Modifikacije mogu također uključivati 3’ i 5’ modifikacije kao što je zaštićivanje kapicom (engl. capping).
“SELEX” metodologija obuhvaća kombinaciju odabira nukleinsko kiselinskih liganada koji međudjeluju s metom na željeni način, na primjer vezanjem za protein, s amplificiranjem tih odabranih nukleinskih kiselina. Opcionalno cikličko ponavljanje koraka odabira/amplificiranja omogućuje odabir jednog ili malog broja nukleinskih kiselina koje najjače međudjeluju s metom iz pula koji sadrži vrlo velik broj nukleinskih kiselina. Ponavljanje postupka odabira/amplificiranja se nastavlja dok se ne postigne odabrani cilj. U ovom se izumu koristi “SELEX” metodologija za dobivanje nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C.
“SELEX” metodologija je opisana u SELEX Patentnim Prijavama.
“SELEX meta” ili “meta” označuje bilo koji spoj ili molekulu od interesa za koju se želi ligand. Meta može biti protein, peptid, ugljikovodik, polisaharid, glikoprotein, hormon, receptor, antigen, antitijelo, virus, supstrat, metabolit, analog prijelaznog stanja, kofaktor, inhibitor, lijek, boja, nutrient, faktor rasta itd., bez ograničenja. U ovoj prijavi SELEX meta je tenascin-C.
“Kompleks” kao što se ovdje koristi označuje molekularnu jedinicu formiranu kovalentnim vezanjem jednog ili više nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C, s jednim ili više markera. U određenim aspektima ovog izuma, kompleks je prikazan kao A-B-Z, gdje je A marker; B je opcionalan, a uključuje linker; a Z je nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C.
“Marker” kao što se ovdje koristi je molekularna jedinica ili jedinice koje, kada su u povezane u kompleks s nukleinsko kiselinskim ligandom tenascina-C, bilo neposredno bilo preko linkera (jednog ili više njih) ili preko spejsera, omogućuju detekciju kompleksa in vivo ili ex vivo na vizualan ili kemijski način. Primjeri markera uključuju, ali nisu time ograničeni, radionuklide, uključujući Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111In, 32P, 186Re; sve fluorofore, uključujući fluorescein, rodamin, Texas Red; derivate gornjih fluorofora, uključujući Rodamin-Red-X; magnetske spojeve; i biotin.
Kao što se ovdje koristi “linker” je molekularna jedinica koja spaja dvije ili više molekularnih jedinica kovalentnom vezom ili nekovalentnim međudjelovanjima, te može dopustiti prostorno odvajanje molekularnih jedinica na način koji zadržava funkcionalne značajke jedne ili više molekularnih jedinica. Linker može biti također poznat kao spejser. Primjeri linkera uključuju, ali nisu time ograničeni, (CH2CH2O)6 i heksilamin strukture prikazane na Slici 2.
“Terapeutski” kao što se ovdje koristi uključuje liječenje i/ili profilaksu. Kada se upotrijebi, terapeutski se odnosi na ljude i ostale životinje.
“Kovalentna veza” je kemijska veza formirana dijeljenjem elektrona.
“Nekovalentno međudjelovanje” je način na koji se molekularne jedinice drže zajedno međudjelovanjem koje nije kovalentna veza, a koje uključuje ionsko međudjelovanje i vodikove veze.
U preferiranom aspektu, nukleinsko kiselinski ligandi ovog izuma su izvedeni iz SELEX metodologije. SELEX postupak je opisan u United States Patent Application Serial No. 07/536,428, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,” sada napuštena, United States Patent No. 5,475,096 pod naslovom “Nucleic Acid Ligands,” and United States Patent No. 5,270,163 (pogledaj također WO 91/19813) pod naslovom “Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands.” Ove prijave, svaka posebno ovdje uključena referencom, se zajedno zovu patentna prijava SELEX.
SELEX postupak pruža razred proizvoda koje su molekule nukleinske kiseline od kojih svaka ima jedinstvenu sekvencu te od kojih svaka ima značajku specifičnog vezanja za željeni spoj ili molekulu metu. Preferira se da su molekule mete proteini, ali mogu uključivati također ostale ugljikovodike, peptidoglikane i razne male molekule. SELEX metodologija se može također upotrijebiti za mete koje su biološke strukture, kao što su površine stanica ili virusi, kroz specifično međudjelovanje s molekulom koja je sastavni dio te biološke strukture.
U svojoj najosnovnijoj formi, SELEX postupak se može definirati slijedećim nizom koraka:
1) Pripremljena je mješavina kandidata nukleinskih kiselina različitih sekvenca. Mješavina kandidata općenito uključuje regije fiksiranih sekvenca (i.e., svaki član mješavine kandidata sadrži istu sekvencu na istom mjestu) i regije nasumičnih sekvenca. Regije fiksirane sekvence su odabrane ili: (a) da bi pomogle u koracima amplificiranja opisanima dolje, (b) da bi imitirale sekvence za koje se zna da se vežu za metu, ili (c) da bi povećale koncentraciju danih strukturalnih uređenja nukleinskih kiselina u mješavini kandidata. Nasumične sekvence mogu biti potpuno nasumične (i.e., vjerojatnost da se baza nalazi na bilo kojoj poziciji je jedan naprema četiri) ili samo djelomično nasumične (e.g., može se odabrati bilo koja vjerojatnost između 0 i 100% da se baza nalazi na bilo kojoj poziciji).
2) Mješavina kandidata se dovodi u kontakt s odabranom metom pod uvjetima povoljnima za vezanje između mete i članova mješavine kandidata. Pod tim okolnostima se može smatrati da međudjelovanje između mete i nukleinskih kiselina iz mješavine kandidata formira parove nukleinska kiselina-meta između mete i onih nukleinskih kiselina koje imaju najjači afinitet za metu.
3) Nukleinske kiseline s najvišim afinitetom za metu se odvajaju od onih nukleinskih kiselina s manjim afinitetom za metu. Zbog toga što u mješavini kandidata postoji samo krajnje mali broj sekvenca (a moguće samo jedna molekula nukleinske kiseline) koje odgovaraju nukleinskim kiselinama s najvišim afinitetom, općenito je poželjno postaviti kriterij odvajanja na taj način da se značajna količina nukleinskih kiselina u mješavini kandidata (približno 5-50%) zadržava za vrijeme odvajanja.
4) One nukleinske kiseline odabrane za vrijeme odvajanja kao one koje imaju relativno viši afinitet za metu su tada amplificirane kako bi se stvorila nova mješavina kandidata koja je obogaćena nukleinskim kiselinama koje imaju relativno veći afinitet za metu.
5) Ponavljanjem gornjih koraka odvajanja i amplificiranja, novostvorena mješavina kandidata sadržava sve manje i manje jedinstvenih sekvenca, a prosječni stupanja afiniteta nukleinskih kiselina za metu će se općenito povećati. Doveden do krajnosti, SELEX postupak će dati mješavinu kandidata koja sadrži jednu ili mali broj jedinstvenih nukleinskih kiselina koje predstavljaju one nukleinske kiseline iz početne mješavine kandidata koje imaju najviši afinitet za molekulu metu.
Osnovna SELEX metoda je bila modificirana kako bi se postigli brojni specifični ciljevi. Na primjer, United States Patent Application Serial No. 07/960,093, prijavljena 14. listopada 1992., sada napuštena, i United States Patent No. 5,707,796, oba pod naslovom “Metods for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure,” opisuju upotrebu SELEX postupka združenog s gel elektroforezom za selekcioniranje molekula nukleinske kiseline sa specifičnim strukturalnim karakteristikama, kao što je vezana DNA. United States Patent Application Serial No. 08/123,935, prijavljena 17. rujna 1993., pod naslovom “Photoselection of Nucleic Acid Ligands,” sada napuštena, United States Patent No.5,763,177, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX” i United States Patent Application Serial No. 09/093,293, prijavljena 8. lipnja 1998., pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”, svi opisuju na SELEX-u bazirane metode za selekcioniranje nukleinsko kiselinskih liganada koji sadrže fotoreaktivnu grupu sposobnu za vezanje i/ili fotokroslinking na molekulu metu, i/ili fotoinaktivaciju molekule mete. United States Patent No. 5,580,737, pod naslovom “High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine,” opisuje metodu za identificiranje visoko specifičnih nukleinsko kiselinskih liganada sposobnih razlikovati blisko srodne molekule, pod pojmom Counter-SELEX. United States Patent No. 5,567,588, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX” opisuje na SELEX-u baziranu metodu koja postiže visoko učinkovito odjeljivanje između oligonukleotida koji imaju visoki i niski afinitet za molekulu metu. United States Patent No. 5,496,938 pod naslovom “Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev,” opisuje metode dobivanja poboljšanih nukleinsko kiselinskih liganada nakon što je proveden SELEX. United States Patent No. 5,705,337 pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX,” opisuje metode za kovalentno vezanje liganda na njegovu metu.
SELEX metoda uključuje identifikaciju nukleinsko kiselinskih liganada visokog afiniteta koji sadrže modificirane nukleotide koji prenose poboljšane karakteristike na ligand, kao što je poboljšana in vivo stabilnost ili poboljšane karakteristike isporuke. Primjeri takvih modifikacija uključuju kemijske supstitucije na pozicijama riboze i/ili fosfata i/ili baze. Nukleinsko kiselinski ligandi identificirani SELEX postupkom koji sadrže modificirane nukleotide su opisani u United States Patent No. 5,660,958, pod naslovom “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides,” koji opisuje oligonukleotide koji sadrže derivate nukleotida kemijski modificirane na pozicijama 5 i 2’ pirimidina. United States Patent No. 5,637,459, naveden gore, opisuje visoko specifične nukleinsko kiselinske ligande koji sadrže jedan ili više nukleotida modificiranih s 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluoro (2’-F), i/ili 2’-O-metilom (2’-OMe). United States Patent Application Serial No. 08/264,029, prijavljena 22. lipnja 1994., pod naslovom “Novel Method of Preparation of Known and Novel 2’ Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement”, sada napuštena, opisuje oligonukleotide koji sadrže razne 2’-modificirane pirimidine.
SELEX metoda obuhvaća kombiniranje selekcioniranih oligonukleotida s drugim selekcioniranim oligonukleotidima i ne-oligonukleotidnim funkcionalnim jedinicama kao što je opisano u United States Patent No. 5,637,459, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chimeric SELEX,” i u United States Patent No. 5,683,867, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Blended SELEX,”, svakom za sebe. Ove prijave dopuštaju kombinaciju široke lepeze oblika i drugih značajki te učinkovite značajke amplificiranja i replikacije oligonukleotida sa željenim značajkama drugih molekula.
U United States Patent No. 5,496,938 opisane su metode dobivanja poboljšanih nukleinsko kiselinskih liganada nakon što je proveden SELEX postupak. Ovaj patent pod naslovom “Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev,” je ovdje posebno uključen referencom.
United States Patent Application No. 08/434,425, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX,” prijavljena 3. svibnja 1995., sada United States Patent No. 5,789,157, opisuje metode za identificiranje nukleinsko kiselinskih liganada za makromolekularnu komponentu tkiva, uključujući stanice raka, te nukleinsko kiselinske ligande tako identificirane. Ovaj je patent ovdje posebno uključen referencom.
Jedan potencijalni problem s kojim se sreće u dijagnostičkoj i terapeutskoj upotrebi nukleinskih kiselina je taj da oligonukleotidi u njihovoj fosfodiesterskoj formi mogu biti brzo degradirani u tjelesnim tekućinama intracelularnim i ekstracelularnim enzimima kao što su endonukleaze i egzonukleaze, prije nego se očituje željeni učinak. Određene kemijske modifikacije nukleinsko kiselinskih liganada mogu se učiniti kako bi povećale in vivo stabilnost nukleinsko kiselinskog liganda ili kako bi poboljšale ili posredovale isporuku nukleinsko kiselinskog liganda. Pogledaj, e.g, U.S. Patent Aplication Serial No. 08/117,991, prijavljena 8. rujna 1993., sada napuštena, i United States Patent No. 5,660,985, oba pod naslovom “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides,” koji je posebno ovdje uključen referencom. Modifikacije nukleinsko kiselinskih liganada razmatrane u ovom izumu uključuju, ali nisu time ograničene, one koje pružaju druge kemijske grupe koje uključuju dodatni naboj, polarizabilnost, hidrofobnost, vezanje vodika, elektrostatske interakcije, te promjenjivost bazama nukleinsko kiselinskog liganda ili ligandima nukleinske kiseline kao cjelini. Takve modifikacije uključuju, ali nisu time ograničene, modifikacije na poziciji 2’ šećera, modifikacije na poziciji 5 pirimidina, modifikacije na poziciji 8 purina, modifikacije na egzocikličnim aminima, supstitucije 4-tiouridina, supstitucije 5-bromo ili 5-jodo uracila; modifikacije glavne osi, modifikacije fosforotioata ili alkil fosfata, metilacije, neuobičajene kombinacije sparivanja baza kao što su izobaze izocitidin i izogvanidin i slične. Modifikacije mogu također uključivati 3’ i 5’ modifikacije kao što je zaštićivanje kapicom (engl. capping). U preferiranom aspektu trenutnog izuma, nukleinsko kiselinski ligandi su RNA molekule koje su 2’-fluoro (2’-F) modificirane na polovici šećera pirimidinskih ostataka.
Modifikacije se mogu učiniti prije SELEX postupka (pred-SELEX modifikacije) ili nakon njega (post-SELEX modifikacije). Pred-SELEX modifikacije daju nukleinsko kiselinske ligande s i specifičnošću za njihovu SELEX metu i poboljšanom in vivo stabilnošću. Post-SELEX modifikacije učinjene na 2’-OH ligandima nukleinske kiseline mogu rezultirati poboljšanom in vivo stabilnošću bez suprotnog učinka na kapacitet vezanja nukleinsko kiselinskog liganda.
Ostale su modifikacije poznate uobičajeno stručnoj osobi. Takve se modifikacije mogu izvesti kao post-SELEX (modifikacije ranije identificiranih nemodificiranih liganada) ili uključivanjem u SELEX postupak.
Nukleinsko kiselinski ligandi izuma su pripremljeni kroz SELEX metodologiju čije su glavne crte dane gore, te potpuno ovlašteni u SELEX prijavama koje su ovdje uključene referencom u njihovoj cjelokupnosti.
Aptameri tenascina-C izuma se vežu za mjesto vezanja heparina na COOH kraju tenascina-C.
U određenim aspektima ovog izuma, ovdje opisani nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C su korisni za svrhe dijagnostike te se mogu koristiti za prikaz patološkog stanja (kao što je prikaz ljudskog tumora). Kao dodatak dijagnostici, nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C su korisni u prognozi i praćenju oboljenja koja dovode do ekspresije tenascina-C.
Sredstva za dijagnostiku trebaju samo biti u mogućnosti dopustiti korisniku da identificira prisustvo dane mete na određenom mjestu ili u određenoj koncentraciji. Jednostavno sposobnost formiranja parova vezanja s metom može biti dovoljna da se dobije pozitivni signal za dijagnostičke svrhe. Stručne osobe bi trebali biti u mogućnosti prilagoditi bilo koji nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C postupcima koji su poznati u struci kako bi uključili marker s ciljem detekcije prisustva nukleinsko kiselinskog liganda. Takav se marker može koristiti u brojnim dijagnostičkim postupcima, kao što je detekcija primarnih i metastazirajućih tumora te aterosklerotskih lezija. Označavajući markeri dani ovdje kao primjer su tehnecij-99m i 111In; ipak drugi markeri kao što su dodatni radionuklidi, magnetski spojevi, fluorofori, biotin i slični se mogu pripojiti na nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C za prikaz in vivo ili ex vivo postavljenih oboljenja koja dovode do ekspresije tenascina-C (e.g., rak, ateroskleroza, i psorijaza). Marker se može kovalentno vezati na razne pozicije na nukleinsko kiselinskom ligandu tenascina-C, kao na egzocikličku amino grupu na poziciju 5 primidinskog nukleotida, poziciju 8 purinskog nukleotida, hidroksilnu grupu fosfata ili na hidroksilnu grupu drugih grupa na 5’ ili 3’ kraju nukleinsko kiselinskog liganda za tenascin-C. U aspektima gdje je marker tehnecij-99m od (op.prev.: engl. of, vjerojatno treba stajati engl. or = ili) 111In, preferira se da je vezan za 5’ ili 3’ hidroksil njihove fosfatne grupe ili na poziciju 5 modificiranog pirimidina. U najboljem aspektu marker je vezan na 5’ hidroksil fosfatne grupe nukleinsko kiselinskog liganda sa ili bez linkera. U drugom aspektu, marker je vezan na nukleinsko kiselinski ligand uključivanjem pirimidina s primarnim aminom na poziciji 5, i korištenjem amina za vezanje na marker. Pripojenje markera može biti izvedeno neposredno ili upotrebom linkera. U aspektu gdje se tehnecij-99m ili 111In koriste kao markeri, preferirani je linker heksilamin linker kao što je prikazano na Slici 10.
U drugim aspektima, nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C su korisni za isporuku terapeutskih spojeva (uključujući, ali ne i time ograničeni, citotoksične spojeve, tvari koje potiču imunitet te terapeutske radionuklide) do tkiva ili organa kod kojih dolazi do ekspresije tenascina-C. Oboljenja kod kojih može doći do ekspresije tenascina-C uključuju, ali nisu time ograničeni, rak, aterosklerozu i psorijazu. Stručne osobe bi bile sposobne prilagoditi bilo koji nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C postupcima poznatima u struci kako bi uključili terapeutski spoj u kompleks. Terapeutski spoj se može kovalentno vezati na razne pozicije na nukleinsko kiselinskom ligandu tenascina-C, kao na egzocikličku amino grupu na bazi, na poziciju 5 primidinskog nukleotida, poziciju 8 purinskog nukleotida, hidroksilnu grupu fosfata ili na hidroksilnu grupu drugih grupa na 5’ ili 3’ kraju nukleinsko kiselinskog liganda tenascina-C. U preferiranom aspektu, terapeutsko sredstvo je vezano na 5’ amin nukleinsko kiselinskog liganda. Pripojenje terapeutskog sredstva može biti izvedeno neposredno ili upotrebom linkera. U aspektima u kojima je meta rak, 5-fluorodeoksiuracil ili drugi analogi nukleotida za koje se zna da su djelatni protiv tumora se mogu interno uključiti u postojeće U unutar nukleinsko kiselinskog liganda tenascina-C ili mogu biti interno dodani ili konjugirani ili na kraj ili neposredno ili preko linkera. Dodatno oba, analozi pirimidina 2’2’-difluorocitidin i analozi purina (deoksikoformicin) se mogu uključiti. Dodatno, United States Application Serial No. 08/993,765, prijavljena 18. prosinca 1997., koja je ovdje uključena referencom u svojoj cjelokupnosti, opisuje, inter alia, preteče lijekova na bazi nukleotida koji sadrže nukleinsko kiselinske ligande usmjerene na tumor, na primjer tenascin-C, za precizno lokaliziranje kemoradiosenzitera, i radiosenzitera i radionuklida i ostalih radioterapeutskih sredstava u tumoru.
Također se razmatra da oba, marker i terapeutsko sredstvo mogu biti udruženi s nukleinsko kiselinskim ligandom tenascina-C, čime se detekcija oboljenja i isporuka terapeutskog sredstva postiže zajedno u jednom aptameru ili mješavinom dva ili više različitih modificiranih inačica istog aptamera. Razmatra se također da se marker i/ili terapeutsko sredstvo mogu udružiti s neimunogeničnim spojem velike molekularne mase ili lipofilnim spojem kao što je liposom. Metode povezivanja nukleinsko kiselinskih liganada s lipofilnim spojevima ili neimunogeničnim spojevima u dijagnostičkom ili terapeutskom kompleksu su opisane u United States Application Serial No. 08/434,465, prijavljena 4. svibnja 1995., pod naslovom “Nucleic Acid Ligand Complexes,” koji je ovdje uključen u svojoj cjelokupnosti.
Terapeutske ili dijagnostičke smjese ovdje opisane mogu se davati parenteralno injektiranjem (e.g., intravenozno, subkutano, intradermalno, intralezijski), premda su razmatrani i drugi učinkoviti načini davanja kao što je intraartikularno injektiranje, inhalacijske maglice, oralno aktivne formulacije, transdermalne iontoforeze ili supozitoriji. Također se mogu primjeniti lokalno neposrednim injektiranjem, mogu se ispuštati iz naprava kao što su implantirani stentovi ili kateteteri, ili isporučiti neposredno na mjesto infuzijskom pumpom. Jedan preferirani nosač je fiziološka slana otopina, ali se razmatra da ostali farmaceuski prihvatljivi nosači mogu također biti upotrijebljeni. U jednom se aspektu razmatra da nosač i nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C u kompleksu s terapeutskim spojem tvore fiziološki kompatibilnu formulaciju koja se polagano otpušta. Primarno otapalo u takvim nosačima može u prirodi biti ili vodeno ili ne-vodeno. Dodatno, nosač može sadržavati druge farmakološki prihvatljive ekscipiente za modificiranje ili održavanje pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, sterilnosti, stabilnosti, brzine otapanja ili mirisa formulacije. Slično, nosač može sadržavati i druge farmakološki prihvatljive ekscipiente za modificiranje ili održavanje stabilnosti, brzine otapanja, otpuštanja ili apsorpcije nukleinsko kiselinskog liganda tenascina-C. Takvi ekscipienti su one tvari obično i uobičajeno upotrebljene za formuliranje doza za parentalno davanje ili u obliku jedinične doze ili više doza.
Jednom kada je terapeutska ili dijagnostička smjesa formulirana, može se pohraniti u sterilnim posudama kao otopina, suspenzija, gel, emulzija, krutina te dehidrirani ili lipofilizirani prah. Takve formulacije mogu biti pohranjene ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku koji zahtjeva rekonstrukciju neposredno prije davanja. Način davanja formulacija koje sadrže nukleinsko kiselinske ligande tenascina-C za sistemsku isporuku mogu biti pomoću subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraarterijalnog, intranazalnog te vaginalnog ili rektalnog supozitorija.
Slijedeći su primjeri pruženi kako bi objasnili i razjasnili ovaj izum te se ne trebaju uzimati kao ograničavanje izuma. Primjer 1 opisuje materijale i eksperimentalne postupke korištene u primjeru 2 za stvaranje RNA liganada tenascina-C. Primjer 2 opisuje RNA ligande tenascina-C i pretpostavljenu sekundarnu strukturu odabranog nukleinsko kiselinskog liganda. Primjer 3 opisuje određivanje najmanje potrebne veličine za visoki afinitet vezanja odabranog nukleinsko kiselinskog liganda, i supstituciju 2’OH purina 2’-OMe purinima. Primjer 4 opisuje biodistribuciju Tc-99m označenih nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C u mišu koji nosi tumor. Primjer 5 opisuje upotrebu fluorescento označenog nukleinsko kiselinskog liganda tenascina-C za lokaliziranje tenascina-C unutar tumorskog tkiva. Primjer 6 opisuje in vivo detekciju tumora Aptamerom TTA1 (poznatim također kao GS7641). Primjer 7 opisuje alternativno označavanje upotrebom 111In.
PRIMJERI
Primjer 1.
Upotreba SELEX-a za dobivanje nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C i za U251 glioblastoma stanice.
Materijali i metode
Tenascin-C je nabavljen od Chemicon (Temecula, CA). Jednolančani DNA primeri i kalupi su sintetizirani kod Operon Technologies Inc. (Alameda, CA).
SELEX postupak je opisan detaljno u SELEX Patentnoj prijavi. Ukratko, dvolančani trankripcioni kalupi su pripremljeni Klenowim ekstenzijama fragmenata od 40N7a ssDNA:
5’-TCGCGCGAGTCGTCTG [4ON] CCGCATCGTCCTCCC 3’ (SEQ ID NO:1)
upotrebom 5N7 primera:
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3’ (SEQ ID NO:2)
koja sadrži promotor T7 polimeraze (podvučeno). RNA je pripremljena s T7RNA polimerazom kako je ranije opisano kod Fitzwater and Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275-301, što je ovdje uključeno referencom u svojoj cjelokupnosti. Sve transkripcijske reakcije su izvedene u prisustvu pirimidinskih nukleotida koji su 2’-fluoro (2’-F) modificirani na polovici šećera. Ova supstitucija daje poboljšanu otpornost na ribonukleaze koje koriste 2’hidroksi polovice za stvaranje fosfodiesterske veze. Posebno, svaka mješavina transkripata je sadržavala 3.3 mM 2’-F UTP i 3.3 mM 2’-F CTP uz 1 mM GTP i ATP. Tako proizvedeni inicijalni nasumični sastav RNA je stoga sadržavao 3 x 1014 molekula. Afiniteti individualnih liganada tenascina-C su određeni standardnim metodama uz upotrebu odjeljivanja na nitroceluloznom filteru (Tuerk and Gold (1990) Science 249(4968):505-10).
Za svaki ciklus SELEX-a su Lumino posude (Labsystem, Needham Heights, MA) presvlačene dva sata pri sobnoj temperaturi s 20μl Dulbecco-ve PBS koja sadrži koncentracije tenascina-C kao što je prikazano na Tablici 1. Nakon presvlačenja su bazeni blokirani upotrebom HBSMC+ pufera [20mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 1 g po litri čovječjeg seruma albumina (Sigma, frakcija V) za cikluse 1 do 6 dok su za cikluse 7 i 8 bazeni bili blokirani HBSMC+ puferom koji sadrži 1 g po litri kazeina (I-blok; Tropix). Pufer za vezanje i pranje sadržavao je HBSMC+ pufer koji sadrži 0.05% Tween 20. Za svaki SELEX ciklus, RNA je razrijeđena u 100 μl pufera za vezanje te je puštena da se inkubira dva sata na 37°C u bazenima presvučenim proteinima koji su pretrpani puferom za vezanje. Nakon vezanja je izvedeno šest pranja sa 200 μl svako. Nakon koraka pranja, suhi je bazen postavljen na vrh bloka zagrijanog na 95°C, kroz 5 minuta. Standarnda reakcija AMV reverzne transkriptaze (50 μl) je izvedena pri 48°C neposredno u bazenu, a proizvodi reakcije su korišteni za standardne PCR i transkripcijske reakcije. Dva sintetska primera 5N7 (pogledaj gore) i 3N7a:
5’-TCGCGCGAGTCGTCTG-3’ (SEQ ID NO:3)
su upotrijebljeni za umnožavanje tih kalupa i korake reverzne transkripcije.
Za stanični SELEX su do sjedinjenja uzgajanje U251 čovječje glioblastoma stanice (Hum. Hered. (1971) 21:238) u Dulbecco Modified Eagle’s Medium-U kojem je dodano 10% fetalnog seruma teleta (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD) u posudama za kulturu tkiva sa šest bazena (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) te oprane tri puta Dulbecco PBS puferom kojem je dodano CaCl2 (DPBS, GIBCO BRL). Interno transkripcijom označena RNA (Fitzwater (1969), navedeno gore) je inkubirana sa stanicama jedan sat pri 37°C. Označena RNA je tada uklonjena, a stanice su oprane šest puta po deset minuta svaka pri 37°C s DPBS. Tada je dodana DPBS koja sadrži 5mM EDTA i inkubirana sa stanicama 30 minuta kako bi dala vezane RNA koje su ostale nakon koraka pranja. Toj RNA je određena količina standardnim protokolom brojanja tekućom scintilacijom te je umnožena pomoću RT-PCR.
Analize vezanja kod U251 stanica. Interno označena RNA je inkubirana pri rastućim koncentracijama sa sjedinjenim U251 stanicama u posudama za kulturu tkiva sa šest bazena (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) pri 37°C 60 minuta. Nevezana RNA je isprana pomoću tri 10-minutna pranja s DPBS+CaCl2 pri 37°C, a vezana RNA je sakupljena razbijanjem stanica pomoću Trizola (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Vezanoj RNA je određena količina brojanjem tekućom scintilacijom.
Kloniranje i sekvencioniranje. Pulovi nukleotida poboljšani pojačanim afinitetom su pročišćeni na 8%-tnom poliakrilamidnom gelu, reverzno transkribirani u ssDNA, a DNA je umnožena lančanom reakcijom polimeraze (PCR) pomoću primera koji sadrže BamH1 i HindIII lokuse restrikcijske endonukleaze. PCR fragmenti su klonirani, plazmidi pripremljeni a analize sekvenca izvedene u skladu sa standardnim tehnikama (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
Primjer 2.
RNA ligandi tenascina-C.
Nukleinsko kiselinski ligandi U251 stanica su dobiveni SELEX postupkom te su opisani u United States Patent Application No. 08/434,425, pod naslovom “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX,” prijavljena 3. svibnja 1995., sada United States Patent No. 5,789,157. Nakon toga je određeno da su ligandi koji su dobiveni nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C.
Kako bi se dobili oligonukleotidni ligandi protiv čovječjeg tenascina-C, izvedeno je osam ciklusa SELEX-a korištenjem nasumičnog sastava RNA kako je opisano gore u materijalima i metodama. Unos RNA i proteina u svakom ciklusu je prikazan na Tablici 1. Nakon osam ciklusa SELEX-a, afinitet oligonukleotidnog pula za tenascin-C je bio 10 mM te se taj afinitet nije povećao dodatnim SELEX ciklusima.
Kako bi se dobili ligandi U251 glioblastoma stanica izvedeno je devet ciklusa SELEX-a korištenjem nasumičnog sastava nukleotida. Nakon devet ciklusa vezanja na U251 stanice i EDTA elucije, ciklusi 3, 5 i 9 su testirani na njihovu sposobnost vezanja na U251 stanice. Slika 1 prikazuje da kako raste broj SELEX ciklusa tako također raste i količina vezane RNA pri određenim koncentracijama. Zbog kompleksnosti tkiva mete, nije bilo moguće procijeniti afinitet oligonukleotinih pulova za nepoznatu molekulu (molekule) mete na tim stanicama.
E9 pul (devet ciklusa vezanja i EDTA elucije iz U251 stanica) je tada korišten kao početna točka za SELEX protiv pročišćenog tenascina-C. Dva ciklusa SELEX-a korištenjem pročišćenog tenascina-C su izvedena kao što je gore opisano. U Tablici 2 su opisane koncentracije unosa proteina i RNA za dva ciklusa SELEX-a (E9P1 i E9P2).
Sveukupno su izvedena tri različita SELEX eksperimenta: eksperiment u kojem se koristi pročišćeni tenascin-C kao meta, eksperiment u kojem se koriste U251 glioblastoma stanice kao meta, te eksperiment u kojem se SELEX pul iz U251 glioblastoma stanica koristio za započinjanje SELEX eksperimenta korištenjem pročišćenog tenascina-C kao mete.
Sva tri SELEX eksperimenta su analizirana kloniranjem i sekvencioniranjem liganada iz ciklusa osam SELEX-a pročišćenog tenascina-C (“TN” sekvence), iz ciklusa devet SELEX-a U251 stanica (“E9” sekvence), te iz ciklusa dva SELEX-a U251/tenascin-C hibrida (“E9P2” sekvence). Sekvence 34 jedinstvena klona su prikazane u Tablici 3, te su podijeljene u dvije glavne grupe: ligandi za tenascin-C (“TN” i “E9P2” sekvence) i ligandi za U251 stanice (“E9” ligandi). Među ligandima za tenascin-C, većina klonova (ukupno 65) predstavlja jedan od dva odvojena razreda sekvenca koje su označene kao Porodica I i Porodica II (Slika 1). Ispitivanje varijabilne regije 12 klonova u Porodici I otkrilo je sedam jedinstvenih sekvenca koje su povezane kroz konsenzus sekvencu GACNYUUCCNGCYAC (SEQ ID NO:12). Ispitivanje varijabilne regije 18 klonova u Porodici II otkrilo je sekvence koje dijele konsenzus sekvencu CGUCGCC (Tablica 3). E9 sekvence se mogu grupirati u srodni skup na temelju sačuvanih GAY i CAU sekvenca unutar varijabilnih regija. Preostale sekvence se nisu činile srodne ostalim sekvencama te su klasificirane kao orfani (engl. orphans = siročad). Tri sekvence prevladavaju, s E9P2-1, E9P2-2 i TN9 zastupljenima 14, 16 i 10 puta tim redom. U kategoriji orfana je jedna sekvenca, TN18 zastupljena dva puta. Sve u svemu, ovi podaci predstavljaju visoko obogaćen pul sekvenci.
Većina individua je pokazala niske nanomolarne konstante disocijacije, pri čemu tri najzastupljenije sekvence, TN9 te E9P2-1 i -2 imaju najjače afinitete pri 5nM, 2nM i 8nM. (Tablica 3). Ovi rezultati pokazuju da je SELEX U251 stanica skladište aptamera protiv tenascina-C, te da su bila potrebna samo dva ciklusa SELEX-a da bi se izoliralo ligande specifične za tenascin iz pula staničnog SELEX-a. Oligonukleotidni ligandi protiv drugih proteina mogu biti slično izolirani iz E9 pula korištenjem pročišćenih proteina meta.
Primjer 3.
Određivanje minimalne veličine TN9 i supstitucije 2’-OH purina 2’-OMe purinima: sintetiziranje aptamera TTA1.
Postupci sintetiziranja oligonukleotida su bile standardne za stručne osobe (Green et al. (1995) Chem Biol 2(10): 683-95). 2’-Fluoro pirimidin fosforamidit monomeri su dobiveni iz JBL Scientific (San Luis Obispo, CA); 2’-OMe purini, 2’-OH purini, heksilamin i (CH2CH2O) monomeri uz dT kruti polistirenski nosač, su dobiveni od Glen Research (Sterling, VA). Afiniteti aptamera su određeni pomoću odjeljivanja na nitroceluloznom filteru (Green et al., navedeno gore).
TN9 je odabran za daljnje analize na osnovu njegovog visokog afiniteta za tenascin-C. Prvo smo tražili najmanju sekvencu potrebnu za visoki afinitet vezanja. Korištenjem standardnih tehnika (Green et al., navedeno gore), otkriveno je da su 3’ nukleotidi nukleotida 55 bili potrebni za vezanje na tenascin-C, dok se niti jedan nukleotid nije mogao ukloniti sa 5’ kraja bez gubitka afiniteta. Kako bi dalje smanjili dužinu TN9 sa 55 nukleotida te zadržali visoki afinitet vezanja, tada smo pokušali definirati interne delecije TN9. Prvih 55 nukleotida TN9, uz prvih 55 nukleotida srodne Porodice II liganada TN7, TN21 i TN41 su unesene u kompjutorski algoritam kako bi se odredila moguća nabiranja sekundarne strukture RNA (mfold 3.0, kojem je pristupljeno na http://www.ibc.wustl.edu/~zuker/. M. Zuker, D.H. Mathews & D.H. Turner. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In: RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999)). Među mnogim, algoritmom predviđenim, potencijalnim nabiranjima RNA, pronađena je struktura uobičajena za svaki nukleotid. Ta struktura, predstavljena oligonukleotidom TTA1 na Slici 2, sadrži tri grane koje se sastaju u jednom spoju, takozvanom trogranom spoju. To nabiranje postavlja najsačuvanije nukleotide Porodice II oligonukleotida na područje spoja. U usporedbi TN9, TN7, TN21 i TN41, druga grana je bila varijabilne dužine i sekvence, sugeriraući da ekstenzija druge grane nije potrebna za vezanje na tenascin-C. Ispitujući tu hipotezu na TN9, našli smo da se nukleotidi 10-26 mogu zamijeniti etilen glikol linkerom, (CH2CH2O)6. Linker služi kao zamjenska petlja te smanjuje veličinu aptamera. Dodatno, četveronukleotidne petlje (CACU ili GAGA) koje zamjenjuju nukleotide 10-26 stvaraju sekvence s visokim afinitetom za tenascin-C. Bilo bi dobro da stručna osoba odredi druge nukleotidne petlje ili druge spejsere koji bi mogli zamijeniti nukleotide 10-26 kako bi stvorili sekvence s visokim afinitetom za tenascin-C.
Za povećanje zaštite protiv djelovanja nukleaze, locirane su purinske pozicije koje bi mogle biti suptituirane odgovarajućim 2’-OMe purinima. Nukleotidi su arbitrarno podijeljeni u pet sektora te su svi purini unutar svakog sektora supstituirani odgovarajućim 2’-OMe purinskim nukleotidom, ukupno pet oligonukleotida (Tablica 4, sinteze faze I). Određen je afinitet svakog oligonukleotida za tenascin-C, te je nađeno da svi purini unutar sektora 1.3 i 5 mogu biti zamijenjeni bez znatnog gubitka afiniteta. Unutar sektora 2 i 4 su tada supstituirani individualni purini s 2’-OMe purinima, a efekt afiniteta je izmjeren (Tablica 4, sinteze faze III). Iz tih eksperimenata je zaključeno da supstitucija nukleotida G9, G28, G31 i G34 s 2’-OMe G uzrokuje gubitak afiniteta za tenascin-C. Zbog toga ti nukleotidi ostaju 2’-OH purini u aptameru TTA1.
Aptamer TTA1 (Tablica 4) je tada bio sintetiziran s (CH2CH2O)6 (Spejser 18) linkerom, 3’-3’ dT kapom za zaštitu od egzonukleaze, 5’ heksilaminom (Tablica 4) i svim purinima kao 2’-OMe osim pet G pokazanih u Tablici 4). Nevezujući aptamer, TTA1.NB, je bio stvoren brisanjem pet nukleotida na 3’ kraju kako bi se dobio TTA1.NB. TTA1 se veže na tenascin-C disocijacijskom konstantom ravnoteže (Kd) od 5mM, dok TTA1.NB ima Kd >5mM za tenascin-C.
Nukleotidi 10-26 se mogu zamijeniti nenukleotidnim etilen glikol linkerom. Stoga izgleda da se TTA1 može sintetizirati u dva odvojena dijela, pri čemu se prekid uvodi na poziciju etilen glikol linkera te se uvode novi 5’ i 3’ krajevi. Nakon sinteze će dvije molekule biti inkubirane zajedno kako bi se omogućilo formiranje hibrida. Ova metoda omogućuje uvođenje dodatne amino grupe kao i nukleotida na novim 5’ i 3’ krajevima. Nove funkcionalnosti se mogu upotrijebiti za biokonjugaciju. Dodatno, dvodjelna sinteza rezultira povećanim prinosom kemijske sinteze zbog skraćivanja dužine molekula.
Primjer 4.
Biodistribucija aptamera označenih s Tc-99m u miševima koji nose tumor.
Biodistribucija aptamera je testirana konjugacijom Tc-99m kelatora (Hi15; Hilger et al. (1998) Tet Lett 39:9403-9406) na 5’ kraj oligonukleotida kao što je prikazano na Slici 2, te radiooznačivanjem aptamera pomoću Tc-99m. Aptamer označen s Tc-99m je prikazan na Slici 10. TTA1 i TTA1.NB su bili konjugirani na Hi15 pri 50 mg/ml aptamera u 30%-tnom dimetilformamidu s 5 molarnih ekvivalenata Hi15-N-hidoksisukcinimida, puferiranog u 100 mM Na borata pH 9.3, 30 minuta pri sobnoj temperaturi. Aptamer označen s Tc-99m je prikazan na Slici 10. HPLC pročišćavanje reverzne faze dalo je Hi15-TTA1 i Hi15-TTA1.NB. Nukleotidi su tada označeni pomoću Tc-99m na slijedeći način: jednom nmol Hi15-aptamera je dodano 200 μl 100mM natrijevog fosfatnog pufera, pH 8.5, 23 mg/mL Na tartrata, i 50 μL Tc-99m pertehnetata (5.0 mCi) eluiranog iz Mo-99 stupca (Syncor, Denver) unutar 12 sati upotrebe. Reakcija označavanja je bila inicirana dodavanjem 10 μL SnCl2. Reakcijska mješavina je inkubirana 15 minuta pri 90°C. Reakcija je bila odvojena od nereagiranog Tc-99m spin dijalizom kroz 30,000 MW odrezanu (cut-off) membranu (Centrex, Schleicher & Scheull) pomoću dva pranja od 300 μL. Ovaj protokol za označavanje rezultira uključivanjem 30-50% dodanog Tc-99m posebnim djelovanjem 2-3 mCi/nmol RNA. Tc-99m je vezan preko 5’G kako je prikazano na Slici 5.
Za eksperimente biodistribucije su preparirani U251 ksenograft tumori kako slijedi: U251 stanice su kultivirane u Dulbeccos Modified Eagle’s Medium-u kojem je dodano 10% v/v fetalnog seruma teleta (Gibco BRL, Gaithesburg, MD). Atimični miševi (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) su bili subkutano injektirani s 1x106 U251 stanica. Kada su tumori dostigli veličinu od 200-300 mg (jedan do dva tjedna), aptameri označeni pomoću Tc-99m su bili injektirani intravenozno u količini od 3.25 mg/kg. Nakon naznačenih vremena, životinje su bile anestezirane upotrebom izoflurana (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA), krv je bila sakupljena srčanom punkcijom, životinja je bila žrtvovana, a tkiva su bila sakupljena. Razine Tc-99m su bile izbrojane pomoću gamma brojača (Wallac Oy, Turku, Finland). Unos aptamera u tkiva je mjereno kao % injektirane doze po gramu tkiva (%ID/g).
Prikaz miševa je bio dobiven upotrebom gamma kamere. Miševi su bili postavljeni na kameru (Siemens, LEM+) pod anestezijom (izofluran). Podaci su sakupljeni (30 sek do 10 minuta) te analizirani upotrebom Nuclear MAC sofvera verzije 3.22.2 (Scientific Imaging, CA) na Power MAC G3 (Apple Computer, CA).
Eksperimenti biodistribucije, Tablica 5, indiciraju brzi i specifični unos aptamera u tumorsko tkivo; nevezujući aptameri se ne zadržavaju u tumoru. Brzo dolazi do klirensa razine Tc-99m u krvi. Nakon tri sata su razine Tc-99m dovedenog u tumor pomoću Hi15-TTA1 imale vrlo dugi poluživot (> 18 sati). To pokazuje da jednom kada aptameri prodru u tumor, radiooznaka koju nose ostaje u tumoru dugo vremena. Takvi podaci pokazuju da će citotoksična sredstva, uključujući radionuklide i neradioaktivna sredstva, konjugirana na aptamer također ostati u tumoru s dugim poluživotima.
Tc-99m radioaktivnost se također pojavljuje u ostalim tkivima, značajno u tankom i debelom crijevu. Uzorak hepatobilijarnog klirensa viđen ovdje mogu lako zamijeniti stručne osobe, na primjer zamjenjujući hidrofilnost Tc-99m kelatora, mijenjajući kelator ili mjenjajući zajedno par radiometal/kelator.
Cjeloviti prikazi životinja bili su dobiveni pomoću Hi15-TTA1 označenog pomoću Tc-99m, tri sata nakon injektiranja. Prikazi dobiveni od miševa injektiranih s Hi15-TTA1, ali ne i oni od miševa injektiranih s Hi15-TTA1.NB, jasno pokazuju tumor (Slika 3). Dodatna radioaktivnost je evidentna u gastrointestinalnom traktu, kao što je predviđeno eksperimentima biodistribucije.
Primjer 5.
Upotreba fluorescentno označenog TTA1 za lokaliziranje tenascina-C unutar tkiva tumora.
Materijali i metode.
TTA1 i TTA1.NB su bili sintetizirani kao što je gore opisano. Succinimdyl Rhodamine-Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) je bio konjugiran na 5’ amin aptamera kao što je opisano gore za Hi15-NHS konjugaciju. Rhodamine-Red-X-konjugirani aptameri, TTA1-Red i TTA1.NB-Red, su pročišćeni pomoću HPLC reverzne faze. Kultura U251 stanica i rast tumora u golih miševa je bio kao što je gore opisano. Pet nmola TTA1-Red ili TTA1.NB-Red je bilo injektirano intravenozno u gole miševe, a u željenom trenutku životinje su bile stavljene pod anesteziju, perfuzirane s 0.9% NaCl, te žrtvovane. Tumor je izrezan i stavljen u formalin. Nakon 24 sata u formalinu, odrezani su 10 μM presjeci, a Rhodamine-Red-X je bio detektiran pomoću fluorescentnog mikroskopa (Eclipse E800, Nikon, Japan).
Rezultati: TTA1-Red ima identični afinitet za tenascin-C kao i nekonjugirani aptamer-roditelj, TTA1, pri 5 nM. Usporedili smo razine fluorescencije za TTA1-Red i TTA1.NB-Red tumore 10 minuta nakon injektiranja. Vezujući aptamer, TTA1-Red, snažno boja tumor ali ne i susjedno tkivo (Slika 4). Nasuprot tome, s TTA1.NB-Red je detektirana samo autofluorescencija tkiva. Ovi rezultati pokazuju korist aptamera u fluorescentnoj detekciji tenascina-C in vivo, a aptameri mogu biti slično upotrijebljeni za bojanje presjeka tkiva ex vivo.
Primjer 6.
Detekcija tumora in vivo aptamerom TTA1 (sada također poznatim kao GS7641): dodatni tipovi tumora.
Označavanje aptamera, biodistribucija i ksenografti tumora golog miša bili su izvedeni kao što je opisano u Primjeru 4.
Za mnoge tipove tumora u čovjeka se zna da dovode do ekspresije tenascina-C. Kako bi se odredila sposobnost TTA1/GS7641 da ciljaju tipove tumora pored glioblastoma, linije stanica ljudskih tumora bile su uzgajane kao tumori u golim miševima. Tumorsko je tkivo bilo testirano na ekspresiju čovječjeg tenascina-C, a oni tumori koji pokazuju ekspresiju čovječjeg tenascina-C su bili testirani na unos aptamera. Slika 6 pokazuje unos aptamera u nekoliko tumora, uključujući glioblastom, sarkom dojke, kolorektalni sarkom i rabdomiosarkom. Specifični unos u tumor je pokazan usporedbom između vezujućeg (TTA1/GS7641) i nevezujućeg aptamera (TTA1.NB). Primijetite da KB, ksenograft s ekpresijom mišjeg ali ne i čovječjeg TN-C, ne pokazuje unos tumora. Ovaj eksperiment proširuje opažanje unosa glioblastoma u dodatne karcinome i sarkome, te dalje pokazuje da svi tumori koji dovode do ekspresije čovječjeg tenascina-C pokazuju unos TTA1/GS7641.
Primjer 7.
Alternativno označavanje pomoću In111
Studije ksenografta tumora i biodistribucije su bile izvedene kao što je opisano u Primjeru 4. Kako bi sparili DTPA i DOTA s TTA1/GS7641, inkubiran je ciklički anhidrid svakoga s TTA1/GS7641 koji sadrži amin pod neutralnim pH uvjetima upotrebom standardnih metoda. Strukture DTPA i kojugata su prikazane na Slici 8 i Slici 9, tim redom, pri čemu je svaki označen pomoću In111. DOTA konjugati imaju identičnmi linker kao za DTPA. DOTA- i DTPA-konjugati su bili označeni s In111 inkubacijom pri 95°C u 0.5 M NaOAc, pH 5.5, 30 minuta. Nakon uklanjanja neugrađenih radiooznaka pomoću spin dijalize preko 30K odrezane (cut-off) membrane, radiooznačeni aptamer je bio prebačen u slanu otopinu puferiranu s fosfatom za injektiranje u miševe koji nose tumor.
Biodistribucija aptamera označenih s In-11 je značajno različita od formulacije označene s tenascinom-C opisane u Primjeru 4. Slika 7 prikazuje da je, u odnosu na TTA1/GS7641 označen s Tc-99m, kod TTA1/GS7641 označenog s In-111, znatno smanjena radioaktivnost u crijevima, s popratnim pojačanjem unosa u jetru i bubreg. Ovaj eksperiment pokazuje da kemijske značajke kelatora imaju veliki učinak na distribuciju radiooznake aptamera TTA1/GS7641 unutar žive životinje. Uzorci biodistribucije koji se razlikuju od onih kod Hi15- TTA1/GS7641 mogu biti korisne za ciljanje tumora pod određenim kliničkim uvjetima kada je hepatobilijarni klirens neželjen. Takvi uvjeti uključuju, ali nisu time ograničeni, radioterapijske primjene kao i prikaz crijeva, prostate i drugih abdominalnih regija.
Tablica 1. Tenascin-C SELEX RNA i unos proteina.
[image]
Tablica 2. Stanični SELEX/tenascin-C SELEX RNA i unos proteina
[image]
Tablica 3
Tenascin-C sekvence: pročišćeni protein SELEX (tenascin sekvence) i U251 stanični SELEX + pročišćeni protein SELEX (E9P2 sekvence)
[image]
[image]
Tablica 4
2'-OMe supstitucije, interne delecije, TTA1 i TTA1.NB
[image]
Tablica 5:
Biodistribucija Tc-99m-TTA1 i TTA1.NB
[image]
Podnosi se zahtjev za:

Claims (43)

1. Nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C, koji je naznačen time da je identificiran u skladu s metodom koja uključuje: a) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet za tenascin-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu biti odvojene od ostatka mješavine kandidata; b) odvajanje nukleinskih kiselina povećanog afiniteta od ostatka mješavine kandidata; c) amplificiranja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih nukleinskim kiselinama s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje na tenascin-C, pri čemu se mogu identificirati nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C.
2. Nukleinsko kiselinski ligand zahtjeva 1, koji je naznačen time da navedena mješavina kandidata nukleinskih kiselina sadrži jednolančane nukleinske kiseline.
3. Nukleinsko kiselinski ligand zahtjeva 2, koji je naznačen time da su navedene jednolančane nukleinske kiseline ribonukleinske kiseline.
4. Nukleinsko kiselinski ligand zahtjeva 3, koji je naznačen time da navedena mješavina kandidata nukleinskih kiselina sadrži 2’-F (2’-fluoro) modificirane ribonukleinske kiseline.
5. Nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C, koji je naznačen time da je pročišćen i izoliran te da se ne pojavljuje u prirodi.
6. Pročišćeni i izolirani nukleinsko kiselinski ligand koji se ne pojavljuje u prirodi, zahtjeva 5, a koji je naznačen time da je navedeni nukleinsko kiselinski ligand jednolančan.
7. Pročišćeni i izolirani nukleinsko kiselinski ligand koji se ne pojavljuje u prirodi, zahtjeva 6, a koji je naznačen time da je navedeni nukleinsko kiselinski ligand RNA.
8. Pročišćeni i izolirani RNA ligand koji se ne pojavljuje u prirodi, zahtjeva 7, a koji je naznačen time da navedeni ligand sadrži 2’-F (2’-fluoro) modificirane nukleotide.
9. Pročišćeni RNA ligand koji se ne pojavljuje u prirodi, zahtjeva 8, a koji je naznačen time da je navedeni ligand odabran iz grupe koja se sastoji od sekvenca kao što je pokazano u Tablicama 3 i 4 te Slici 2.
10. Metodu identificiranja nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C, koja je naznačena time da uključuje: a) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet za tenascin-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu biti odvojene od ostatka mješavine kandidata; b) odvajanje nukleinskih kiselina povećanog afiniteta od ostatka mješavine kandidata; c) amplificiranja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih nukleinskim kiselinama s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje na tenascin-C, pri čemu se mogu identificirati nukleinsko kiselinski ligandi tenascina-C.
11. Metodu zahtjeva 10 koja je naznačena time da dalje uključuje: d) ponavljanje koraka a), b) i c).
12. Metodu zahtjeva 10, koja je naznačena time da navedena mješavina kandidata nukleinskih kiselina sadrži jednolančane nukleinske kiseline.
13. Metodu zahtjeva 12, koja je naznačena time da su navedene jednolančane nukleinske kiseline ribonukleinske kiseline.
14. Metodu zahtjeva 13, koja je naznačena time da su navedene nukleinske kiseline 2’-F (2’-fluoro) modificirane ribonukleinske kiseline.
15. Kompleks za upotrebu u in vivo dijagnostikama, a koji je naznačen time da sadrži nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C i marker.
16. Kompleks zahtjeva 15, koji je naznačen time da je navedeni nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C identificiran metodom koja uključuje: a) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet za tenascin-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu biti odvojene od ostatka mješavine kandidata; b) odvajanje nukleinskih kiselina povećanog afiniteta od ostatka mješavine kandidata; c) amplificiranja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih nukleinskim kiselinama s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje na tenascin-C, pri čemu se može identificirati nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C.
17. Kompleks zahtjeva 16, koji je naznačen time da navedena mješavina kandidata nukleinskih kiselina sadrži jednolančane nukleinske kiseline.
18. Kompleks zahtjeva 17, koji je naznačen time da su navedene jednolančane nukleinske kiseline ribonukleinske kiseline.
19. Kompleks zahtjeva 18, koji je naznačen time da navedena mješavina nukleinskih kiselina sadrži 2’-F (2’-fluoro) modificirane ribonukleinske kiseline.
20. Kompleks zahtjeva 15, koji je naznačen time da je navedeni marker odabran iz grupe koja se sastoji od radionuklida, fluorofora, magnetskih spojeva i biotina.
21. Kompleks zahtjeva 20, koji je naznačen time da su navedeni radionuklidi odabrani iz grupe koja se sastoji od tehnecija-99m (Tc-99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111In, 32P i 186Re.
22. Kompleks zahtjeva 21 koji je naznačen time da je navedeni marker tehnecij-99m.
23. Kompleks zahtjeva 22 koji je naznačen time da dalje sadrži linker.
24. Kompleks zahtjeva 23 koji je naznačen time da navedeni linker ima strukturu [image]
25. Kompleks zahtjeva 24 koji je naznačen time da je navedeni kompleks [image] Svi A = 2’-OMe Svi G su, osim ako je drugačije naznačeno, 2’-OMe modificirani Svi C su 2’-F modificirani Svi U su 2’-F modificirani
26. Metodu za pripremu kompleksa koji se sastoji od nukleinsko kiselinskog liganda za tenascin-C i markera, a koja je naznačena time da uključuje: a) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet za tenascin-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu biti odvojene od ostatka mješavine kandidata; b) odvajanje nukleinskih kiselina povećanog afiniteta od ostatka mješavine kandidata; c) amplificiranja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih nukleinskim kiselinama s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje na tenascin-C; i d) kovalentno vezanje navedenih identificiranih nukleinsko kiselinskih liganada tenascina-C sa markerom.
27. Metodu zahtjeva 26 koja je naznačena time da je navedeni marker odabran iz grupe koja se sastoji od radionuklida, fluorofora, magnetskih spojeva i biotina.
28. Metodu zahtjeva 27 koja je naznačena time da su navedeni radionuklidi odabrani iz grupe koja se sastoji od Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111In, 32P i 186Re.
29. Metodu zahtjeva 28 koja je naznačena time da je navedeni marker Tc-99m.
30. Metodu zahtjeva 29 koja je naznačena time da dalje sadrži linker.
31. Kompleks zahtjeva 30 koji je naznačen time da navedeni linker ima strukturu [image]
32. Kompleks zahtjeva 31 koji je naznačen time da je navedeni kompleks [image] Svi A = 2’-OMe Svi G su, osim ako je drugačije naznačeno, 2’-OMe modificirani Svi C su 2’-F modificirani Svi U su 2’-F modificirani
33. Metodu za detektiranje prisustva bolesti koja dovodi do ekspresije tenascina-C u biološkom tkivu koje može biti zahvaćeno navedenom bolešću, a koja je naznačena time da uključuje: a) identificiranje nukleinsko kiselinskog liganda iz mješavine kandidata nukleinskih kiselina, pri čemu je navedeni nukleinsko kiselinski ligand ligand za tenascin-C, metodom koja uključuje i) dovođenje u kontakt mješavine kandidata nukleinskih kiselina s tenascinom-C, gdje nukleinske kiseline koje imaju relativno povećani afinitet za tenascin-C u odnosu na mješavinu kandidata mogu biti odvojene od ostatka mješavine kandidata; ii) odvajanje nukleinskih kiselina povećanog afiniteta od ostatka mješavine kandidata; iii) amplificiranja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta kako bi se dobila mješavina nukleinskih kiselina obogaćenih nukleinskim kiselinama s relativno većim afinitetom i specifičnošću za vezanje na tenascin-C, pri čemu se identificira nukleinsko kiselinski ligand tenascina-C. b) vezanje markera, koji se može koristiti u in vivo dijagnostici, na navedeni nukleinsko kiselinski ligand identificiran u koraku iii) kako bi se formirao kompleks marker-ligand nukleinske kiseline c) izlaganja tkiva koje može biti bolesno, navedenom kompleksu marker-ligand nukleinske kiseline; i d) detektiranja prisustva navedenog kompleksa marker-nukleinsko kiselinski ligand u navedenom tkivu, pri čemu je identificirana bolest koja dovodi do ekspresije tenascina-C.
34. Metodu zahtjeva 33 koja je naznačena time da navedeni ligand nukleinske kiseline-marker dalje sadrži linker.
35. Metodu zahtjeva 34 koja je naznačena time da je navedeni marker odabran iz grupe koja se sastoji od radionuklida, fluorofora, magnetskih spojeva i biotina.
36. Metodu zahtjeva 35 koja je naznačena time da su navedeni radionuklidi odabrani iz grupe koja se sastoji od Tc-99m, Re-188, Cu64, Cu67, F-18, 125I, 131I, 111In, 32P i 186Re.
37. Metodu zahtjeva 36 koja je naznačena time da je navedeni marker tehnecij-99m.
38. Metodu zahtjeva 37 koja je naznačena time da navedeni linker [image]
39. Metodu zahtjeva 38 koja je naznačena time da je navedeni marker-nukleinsko kiselinski ligand [image] Svi A = 2’-OMe Svi G su, osim ako je drugačije naznačeno, 2’-OMe modificirani Svi C su 2’-F modificirani Svi U su 2’-F modificirani
40. Metodu zahtjeva 33 koja je naznačena time da dalje sadrži pripojenje terapeutskog ili dijagnostičkog sredstva na navedeni kompleks.
41. Metodu zahtjeva 33 koja je naznačena time da je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži rak, psorijazu i aterosklerozu.
42. Metodu zahtjeva 41 koja je naznačena time da je navedena bolest rak.
43. Metodu isporuke terapeutskog sredstva do bolesti koja dovodi do ekspresije tenascina-C, a koja je naznačena time da sadrži: kovalentno vezanje nukleinsko kiselinskog liganda tenascina-C s terapeutskim sredstvom kako bi se formirao kompleks, te davanje navedenog kompleksa pacijentu.
HR20020186A 1999-07-29 2002-02-28 Tenascin-c nucleic acid ligands HRP20020186A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/364,902 US6232071B1 (en) 1990-06-11 1999-07-29 Tenascin-C nucleic acid ligands
PCT/US2000/002167 WO2001009390A1 (en) 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin-c nucleic acid ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20020186A2 true HRP20020186A2 (en) 2004-02-29

Family

ID=23436596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20020186A HRP20020186A2 (en) 1999-07-29 2002-02-28 Tenascin-c nucleic acid ligands

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6232071B1 (hr)
EP (1) EP1198589B9 (hr)
JP (1) JP2003505111A (hr)
KR (1) KR100605072B1 (hr)
CN (2) CN100558411C (hr)
AT (1) ATE405675T1 (hr)
AU (1) AU767501C (hr)
BG (1) BG106361A (hr)
BR (1) BR0013170A (hr)
CA (1) CA2380473A1 (hr)
CZ (1) CZ2002365A3 (hr)
DE (1) DE60039986D1 (hr)
DK (1) DK1198589T3 (hr)
EA (1) EA004795B1 (hr)
EE (1) EE200200051A (hr)
ES (1) ES2310989T3 (hr)
HK (1) HK1048499B (hr)
HR (1) HRP20020186A2 (hr)
HU (1) HUP0202221A3 (hr)
IL (2) IL147872A0 (hr)
MX (1) MXPA02000819A (hr)
NO (1) NO20020424L (hr)
NZ (2) NZ516907A (hr)
PL (1) PL201637B1 (hr)
RS (1) RS50426B (hr)
SK (1) SK1222002A3 (hr)
UA (1) UA75578C2 (hr)
WO (1) WO2001009390A1 (hr)
ZA (1) ZA200200747B (hr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7005260B1 (en) * 2000-01-28 2006-02-28 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
CA2328356A1 (en) 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
DK2070939T3 (da) 2001-05-25 2014-06-23 Univ Duke Modulatorer af farmakologiske midler
WO2003106659A2 (en) * 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US10100316B2 (en) 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
WO2006093932A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Use of eotaxin as a diagnostic indicator for atherosclerosis and vascular inflammation
AR052741A1 (es) * 2005-04-08 2007-03-28 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
WO2008028688A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Compounds and methods for 18f labeled agents
EP1897562A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-12 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labelled with Gallium-68
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
JP5404620B2 (ja) * 2007-07-17 2014-02-05 ソマロジック・インコーポレーテッド 試験試料の多重化分析
EP2036981A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labeled with 18F
WO2010129666A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Altermune Technologies, Llc Chemically programmable immunity
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
BR112014014295A2 (pt) * 2011-12-12 2017-06-13 Isis Innovation método para determinar um estado de artrite reumatoide, kit para a determinação o estado de artrite reumatoide erosiva de um indivíduo, usos de tenancina-c, e de uma determinação do nível de tenascina-c, e, métodos para tratar uma condição inflamatória, e uma artrite reumatoide
CN102533772B (zh) * 2011-12-12 2013-10-09 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
WO2014012081A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Ontorii, Inc. Chiral control
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3590766T (hr) 1985-03-30 1987-04-23
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
EP1493825A3 (en) * 1990-06-11 2005-02-09 Gilead Sciences, Inc. Method for producing nucleic acid ligands
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6127119A (en) * 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US6610841B1 (en) * 1997-12-18 2003-08-26 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide-based prodrugs
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5436132A (en) * 1993-02-13 1995-07-25 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Quantitative determination of tenascin as glioma marker
US5859228A (en) * 1995-05-04 1999-01-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
AU733674B2 (en) * 1996-10-25 2001-05-24 Gilead Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
NO20020424L (no) 2002-03-27
RS50426B (sr) 2009-12-31
HUP0202221A3 (en) 2010-01-28
JP2003505111A (ja) 2003-02-12
US6596491B2 (en) 2003-07-22
IL147872A0 (en) 2002-08-14
EA004795B1 (ru) 2004-08-26
YU6402A (sh) 2005-03-15
ZA200200747B (en) 2004-01-28
DK1198589T3 (da) 2008-11-17
EP1198589B9 (en) 2009-08-12
DE60039986D1 (de) 2008-10-02
ATE405675T1 (de) 2008-09-15
EP1198589A4 (en) 2003-02-19
BG106361A (bg) 2002-10-31
CN100558411C (zh) 2009-11-11
NO20020424D0 (no) 2002-01-28
CA2380473A1 (en) 2001-02-08
UA75578C2 (en) 2006-05-15
NZ528077A (en) 2005-04-29
AU767501C (en) 2004-06-17
WO2001009390A1 (en) 2001-02-08
HK1048499B (zh) 2005-05-13
MXPA02000819A (es) 2003-07-14
ES2310989T3 (es) 2009-02-01
BR0013170A (pt) 2002-04-02
PL201637B1 (pl) 2009-04-30
AU3351900A (en) 2001-02-19
EE200200051A (et) 2003-04-15
EP1198589A1 (en) 2002-04-24
US6232071B1 (en) 2001-05-15
HUP0202221A1 (en) 2002-10-28
CZ2002365A3 (cs) 2002-06-12
CN1164760C (zh) 2004-09-01
AU767501B2 (en) 2003-11-13
CN1365395A (zh) 2002-08-21
PL353357A1 (en) 2003-11-17
IL147872A (en) 2008-06-05
US20060105378A1 (en) 2006-05-18
EA200200094A1 (ru) 2002-08-29
CN1589908A (zh) 2005-03-09
US20030104377A1 (en) 2003-06-05
KR100605072B1 (ko) 2006-07-26
KR20020092897A (ko) 2002-12-12
NZ516907A (en) 2003-10-31
US20040058884A1 (en) 2004-03-25
SK1222002A3 (en) 2002-09-10
EP1198589B1 (en) 2008-08-20
HK1048499A1 (en) 2003-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20020186A2 (en) Tenascin-c nucleic acid ligands
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
AU777043B2 (en) Nucleic acid ligands to CD40ligand
JP4176466B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド
US6013443A (en) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
AU749273B2 (en) Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
ES2663404T3 (es) Ácidos nucleicos de unión a SDF-1
AU2002224401A1 (en) Nucleic acid ligands to the prostate specific membrane antigen
Perkins et al. Radiolabelled aptamers for tumour imaging and therapy
US20050124565A1 (en) Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
AU2004232848A1 (en) Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7005260B1 (en) Tenascin-C nucleic acid ligands
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
ODBI Application refused