BG106361A - Лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин - с - Google Patents

Лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин - с Download PDF

Info

Publication number
BG106361A
BG106361A BG106361A BG10636102A BG106361A BG 106361 A BG106361 A BG 106361A BG 106361 A BG106361 A BG 106361A BG 10636102 A BG10636102 A BG 10636102A BG 106361 A BG106361 A BG 106361A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
tenascin
nucleic acid
nucleic acids
complex
candidate mixture
Prior art date
Application number
BG106361A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Hicke
Stephen Warren
David Parma
Larry Gold
Original Assignee
Gilead Sciences, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Sciences, Inc. filed Critical Gilead Sciences, Inc.
Publication of BG106361A publication Critical patent/BG106361A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/966—Elastase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до методи за идентифициране и получаване на лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин-С, до специфични РНК лиганди за тенасцин-С, идентифицирани по метода SELEX, както и до методи за установяване наличието на болестно състояние в биологична тъкан, в която е експресиран тенасцин-С.

Description

Описани са лиганди на нуклеинови киселини с висок афинитет към тенасцин- С. Описани са също методи за идентифициране и получаване на високо афинитетни лиганди на нуклеиновата киселина за тенасцин-С. Използваният тук метод за идентифициране на такива нуклеиново киселинни лиганди се нарича SELEX, акроним на Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. По- нататък са описани нуклеинови киселини с висок афинитет спрямо тенасцин- С. Описани са също и РНК лиганди за тенасцин- С. Включени са също олигонуклеотиди, съдържащи нуклеотидни производни, химично модифицирани при позиция 2’ от пурините и пиримидините. Допълнително са описани РНК лиганди за тенасцин- С, съдържащи 2’-F и 2’ОМе модификации. Олигонуклеотидите от настоящето изобретение са приложими като диагностици и/или терапевтични средства.
НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Тенасцин- С е 1.1-1.5 милиона Da, хексамерен гликопротеин, който е локализиран първично в екстрацелуларния матрикс. Тенасцин- С се експресира по време на ембриогенезата, заздравяването на рани и неоплазия, предполагайки роля за този протеин в тъканното преобразуване (Erickson and Bourdon (1989) Ann Rev Cell Biol 5:71-92). Процеса на неоплазия включва също тъканно преобразуване и тенасцин- С се свръх- експресира в много туморни типове, включително карциноми на белия дроб, гърдата, простата, правото черво, астроцитоми, глиобластоми, меланоми и саркоми (Soini et al (1993) Am J. Clin Pathol 100(2):145-50; Koukoulis et al. (1991) Hum Pathol 22(7): 636- 43; Borsi et al. 91992) Int J Cancer 52(5): 688- 92; Koukoulis et al. (1993)J Submicrosc Cytol Pathol 25(2): 285- 95; Ibrahim et al. (1993) Hum Pathol 24(9): 982- 9; Riedl et al. (1998) Dis Colon Rectum 41(1): 86- 92; Tuominen and Kallioinen (1994) J Cutan Pathol 21(5): 424- 9; Natali et al. (1990) Int J Cancer 46(4): 586- 90;Zagzag et al. (1995) Cancer Res 55(4): 907- 14; Nasegawa et al. (1997) Acta Neuropathol (Bert) 93(5): 431- 7; Saxon et al. (1997) Pediatr Pathol Lab Med 17(2): 259- 66; Hasegawa et al. (1995) Hum Pathol 26(8): 838- 45). В допълнение, тенасцин- C се свръхекспресира при хиперпролиферативни кожни заболявания, напр. псориазис (Schalkwijk et al. (1991) Br J Dermatol 124(1): 13- 20) и при атеросклерозни лезии (Fukumoto et al (1998) J Atheroscler Thromb 5(1): 29- 35; Wallner et al. (1999) Circulation 99(10): 1284- 9). Радиоактивно белязаните антитела, които свързват тенасцин- С се използвани за изобразяване и терапия на тумори в клинични постановки (Paganelli et al. (1999) Eur J Nucl Med 26(4): 348- 57; Paganelli et al (1994) Eur J Nucl Med 21(4): 314- 21; Bigner et al. (1998) J Clin Oncol 16(6): 2202- 12; Merlo et al. (1997) Int J Cancer 71(5): 810- 6).
Аптамери спрямо тенасцин- C имат потенциална приложимост за ракова диагностика и терапия, а така също и за диагностика и терапия на атеросклироза и терапия на псориазис. Що се отнася до аптамерите, те са малки (7- 20 kDa), освобождавани много бързо от кръвта и химично синтезирани. Бързото освобождаване на кръвта е важно за in vivo диагностично изобразяване, където първично се определят кръвните нива. Бързото освобождаване на кръвта може също да бъде важно в терапията, където кръвните нива могат да допринасят за токсичността. SELEX технологията позволява бързо изолиране на аптамери, а химичната синтеза позволява лесна и сайтспецифична конюгация на аптамери към различни инертни и биологично активни молекули. Един аптамер за тенасцин- С поради това би бил приложим за туморна терапия или in vivo ex vivo диагностично изобразяване и/или доставяне на различни терапевтични средства в комплекс с тенасцин- С нуклеиново киселинни лиганди за лечение на болестни състояния, при които се експресира тенасцин- С.
Догмата в продължение на много години е това, че нуклеиновата киселина има първично информативна роля. Посредством метод, известен като Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, наречен метода SELEX, става ясно, че нуклеинови киселини имат три дименсионално структурно разнообразие, за разлика от протеините. Метода SELEX е метод за in vitro еволюция на молекули нуклеинова киселина с висока специфичност на свързване към мишенни молекули и е описан в US патентно описание No. 07/536 428, заявено на 11. Юни, 1990, озаглавено “Системна еволюция на лиганди чрез експоненциално обогатяване”, понастоящем изоставено, US Patent No. 5 475 096, озаглавен “Нуклеиново киселинни лиганди”, US Patent No. 5 270 163 (виж също WO 91/19813) озаглавен “Методи за идентифициране нуклеиново киселинни лиганди”, всеки от които е специфично включен тук в неговата същност. Всяко от тези описания, заедно отнесени тук като SELEX патентни описания, описва фундаментално нов метод за получаване на нуклеиново киселинни лиганди за която и да е мишенна молекула. Процеса SELEX осигурява клас от продукти, които са отнесени като нуклеиново киселинни лиганди или аптамери, всеки от които притежаващ уникална последователност, и притежаващ свойството да се свързва специфично към желано съединение или молекула. Всеки идентифициран чрез SELEX нуклеиново киселинен лиганд е специфичен лиганд на дадено мишенно съединение или молекула. Метода SELEX се основава на уникалното място, където нуклеиновите киселини имат достатъчна специфичност за формиране на разнообразие от дву- и тридименсионални структури и достатъчна химична гъвкавост в рамките на техните мономери да действат като лиганди (от специфични свързващи двойки) с действително което и да е химично съединение, независимо мономерно или полимерно. Молекули с който и да е размер или състав могат да служат като мишени в метода SELEX. Метода SELEX, приложен за високо афинитетно свързване включва подбор от кандидат олигонуклеотиди и поетапни повторения на свързване, разпределение и амплификация с помощта на същата обща схема на подбор, за достигане на действителен и желан критерий на афинитет на свързване и селективност. Изхождайки от сместа на нуклеинови киселини, за предпочитане включващи сегмент от случайни последователности, SELEX метода включва етапи на контактуване на сместа с мишената при условия, удобни за свързване, отделяне на несвързаните нуклеинови киселини от онези, които са се свързали специфично към мишенните молекули, дисоциация на комплекса от нуклеинови киселини- мишена за получаване на набогатена на лиганд смес от нуклеинови киселини, след това преповтаряне на етапите на свързване, разпределение, дисоцииране и амплифициране чрез много цикли, както се цели високо специфични нуклеиново киселинни лиганди с висок афинитет спрямо мишенната молекула.
От изобретателите е установено, че SELEX метода демонстрира как нуклеиновите киселини като химични съединения
- - -u, . , могат да формират голяма поредица от форми, размери и конфигурации, и са способни на твърде широк репертоар на свързване и други функции в сравнение с тези, показвани от нуклеиновите киселини в биологични системи.
Основния SELEX метод е модифициран за достигане на множество специфични обекти. Например, US патентно описание, No. 07/960 093, заявено 14. 10. 1992, понастоящем оттеглено, US патент No. 5 707 796, и двата озаглавени “Метод за подбор на нуклеинови киселини на базата на структурата”, описват приложение на метода SELEX въввръзка с гел електрофореза за подбор на молекули нуклеинови киселини със специфични структурни характеристики, като свързана ДНК. US патентно описание No. 09/123 935, заявено 17. 09. 1993, озаглавено “Фотоселекция на нуклеиново киселинни лиганди“, понастоящем оттеглено US патент No. 5 763 177, озаглавен “Системна еволюция на лиганди чрез експоненциално обогатяване: Фотоселекция на нуклеиново киселинни лиганди и SELEX в разтвор” и US патентно описание No. 09/093293, заявено на 08. 06. 1998, озаглавено “Системна еволюция на лиганди чрез експоненциално набогатяване: Фотоселекция на нуклеиново киселинни лиганди и SELEX в разтвор”, описват SELEX, основан на метода за подбор на нуклеинови киселини и лиганди, съдържащи фотореактивни групи, способни на свързване и/или фотокръстосано свързване към и/или фотоинактивиране на мишенна молекула. US патент No. 5 580 737, озаглавен “високо фанитетни нуклеиново киселинни лиганди, които отличават теофилин и кафеин”, описва метод за идентифициране на високо специфични нуклеиново киселинни лиганди, способни да отличат тясно родствени молекули, които могат да бъдат непептидни, и който е наречен Counter- SELEX. US патент No. 5 567 588, означен: “Системна еволюция на лиганди чрез експоненциално набогатяване: SELEX в разтвор”, описва основан на SELEX метод, който постига високо ефективно разпределение между олигонукпеотиди, притежаващи висок и нисък афинитет за мишенна молекула.
Метода SELEX обхваща идентифицирането на високо афинитетни нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи модифицирани нуклеотиди, потвърждаващи подобрените характеристики на лиганда като in vivo стабилност или подобрени характеристики на доставяне. Примери за такива модификации включват химични замествания при рибозата и/или фосфата и/или позициите на базата. Идентифицирани с метода SELEX нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи модифицирани нуклеотиди, са описани в US патент No. 5 660 985, озаглавен “Високо афинитетни нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи модифицирани нуклеотиди”, които описват олигонуклеотиди, съдържащи нуклеотидни производни, химично модифицирани при 5- и 2’- позициии на пиримидините. US патент No. 5 580 737, погоре, описва високо специфични нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи един или повече нуклеотида, модифицирани с 2’амино (2’-NH2), 2’- флуоро (2’-F), и/или 2’-О- метил (2’-Ome). US патентно описание No. 08/264 029, заявено на 22 юни, 1994, озаглавено “Нов метод за получаване на известни и нови 2’модифицирани нукпеозиди чрез интрамолекулно нуклеофилно изместване”, понастоящем изоставен, описваолигонуклеотиди, съдържащи различни 2’- модифицирани пиримидини.
Метода SELEX включва комбиниране на подбрани олигонуклеотиди с други подбраниолигонуклеотидни и неолигонуклеотидни функционални единици, както е описано в US патент No. 5 637 459, озаглавен “Системна еволюция на лиганди
Ί чрез експоненциално набогатяване: Химерен SELEX”, съответно. Тези описания позволяват комбинирането на голяма поредица от форми и други свойства, и ефективни свойства на амплифициране и репликация, на олигонуклеотиди с желаните свойства на други молекули.
Метода SELEX по- нататък включва комбиниране на подбрани нуклеиново киселинни лиганди с липофилни съединения или неимуногенни, съединения с високи молекулни тегла в дигностичен или терапевтичен комплекс както е описано в US патентно описание, No. 08/434 465, заявено “Нуклеиново киселинни комплекси”. Всеки от по- горе описаните патенти и описания, които описват модификации на основната процедура SELEX са специфично включени тук чрез литературни източници в тяхната цялост.
ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение описва метод за изолиране на нуклеиново киселинни лиганди, които се свързват към тенасцин-С с висока специфичност. По- нататък тук са описани нуклеиново киселинни лиганди за тенасцин- С. Тук са описани и високо афинитетни РНК лигонди за тенасцин- С. По- нататък са описани 2’флуоро- модифицирани пиримидинови и 2’0те- модифицирани пуринови РНК лиганди за тенасцин-С. Метода, използван тук за идентифициране на такива нуклеиново киселинни лиганди, е наречен SELEX, акроним на Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Тук са включени лигандите, които са показани на Таблици 3 и 4 и Фигура 10.
По- нататък в настоящето изобретение е включен метод за установяване наличието на заболяване, при който тенасцин-С се
експресира в биологична тъкан, която може да съдържа заболяването. В настоящето изобретение е включен също метод за установяване наличието на тумор, при който тенасцин-С се експресира в тъкан, съдържаща тумора. По- нататък включен в това изобретение е метод за доставяне на терапевтични средства за лечение или профилактика на заболели тъкани, които експресират тенасцин- С. По- нататък в това изобретение е включен комплекс за използване при доставяне на терапевтични средства за лечение или профилактика на заболели тъкани, които експресират тенасцин-С.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ
Фигура 1 показва свързването на количества SELEX клетъчна РНК към U251 клетки.
Фигура 2 показва предполагаема вторична структура на аптамерни ТТА1 и ТТА1. NB. Във фигурата е включена конюгацията аптамерите с Тс-99т хелатор. Всички А са 2’0те модифицирани. Всички G’s с изключение на означените, са 2’0те модифицирани.
Фигура 3 показва изображения на U251 туморни ксенотрансплантанти в мишка, получени с помощта на Тс-99тбелязани ТТА1 и TTA1.NB, тре часа след инжектирането.
Фигура 4 показва флуоресцентна микроскопия на U251 глиобластомна туморна секция, взета три часа след i.v. инжектиране на Rhodamine-Red-X-labeled ТТА1.
Фигура 5 показва начина при който Тс-99т и линкер са свързани чрез 5’G на ТТА1.
Фигура 6 описва TTA1/GS7641 усвояване на 3-тия час при различни човешки туморни ксенотрансплантанти в мишка, в сравнение с усвояването на не- свързан контролен аптамер. ID/g = инжетирана доза/грам.
Фигура 7 показва биологичното разпределение на белязан с 1п-111 TTA1/GS7641 с помощта или на DOTA или на DTPA като радиометален хелатор, 3 часа след инжектирането. ID/g= инжектирана доза/грам.
Фигура 8 показва конюгацията на аптамера към DTPA. 111 In е показан като хелатиран с DTPA.
Фигура 9 показва конюгацията на аптамера към DOTA.111 In е показан като хелатиран с DTPA.
Фигура 10 показва предположената вторична структура на аптамер ТТА1. На фигурата е включена конюгацията на аптамера с Тс-99т хелатор. Аптамера е показан в неговата Тс- 99т белязана форма. Всички А са 2’ОМе модифицирани. Всички G, с изключение на означените, са 2’0ме модифицирани. Всички С и U са 2’0ме модифицирани.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕ
Централният метод, използван тук за идентифициране на нуклеиново киселинните лиганди за тенасцин-С е наречен SELEX метод, акроним на Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment и включва а) контакт на кандидат смес от нуклеинови киселини с тенасцин-С, в) разпределяне между членове на посочената кандидат смес на базата на афинитет към тенасцин-С и с) амплифициране на подбраните молекули нуклеинови киселини, наботатени с нуклеиново киселинни последователности с относително висок афинитет за свързване към тенасцин-С. Изобретението включва РНК лиганди за тенасцин-С. Това изобретение по- нататък включва специфичните РНК лиганди за тенасцин-С. Това изобретение по- нататък включва специфичните РНК лиганди за тенасцин-С, показани на Таблици 3 и 4 и Фигура 10. По- специално, това изобретение включва нуклеиново киселинни последователности, които са по същество хомоложни на и които имат по същество същата способност да свързват тенасцин-С като специфичните нуклеиново киселинни лиганди, посочени на Таблици 3 и 4 и на Фигура 10. Под по същество хомоложен се разбира степента на първична секвенционна хомоложност в излишък от 70%, особено предпочитано в излишък от 80%, и дори още повече предпочитано в излишък от 90%, 95% или 99%. Процента на хомоложност както е описано тук е изчислен като процента на нуклеотиди, установени в по- малката от двете последователности, които се деспирализират с идентични нуклеотидни остатъци в последователността, с която е сравнена когато 1 празнина с дължина от 10 нуклеотида бъде въведена да подпомогне това деспирализиране. По същество същата способност за свързване на тенасцин-С означава, че афинитета е в един или два порядъка на значимост от афинитета на лигандите, описани тук. За специалиста в областта е лесно да определи дали дадена последователност- по същество хомоложна на специфично описаната тук- има същата способност да свърже тенасцин-С.
Преглед на секвенционните хомологии на нуклеиново киселинните лиганди на тенасцин-С показани на Таблици 3 и 4 и на Фигура 10, показва, че последователностите с малка или без първична хомоложност може да имат по същество същата способност да свържат тенасцин-С. Поради тези причини, настоящето изобретение включва също нуклеиново киселинни лиганди, които имат по същество същата постулирана структура или структурни мотиви и способност да свързват тенасцин-С както нуклеиново киселинните лиганди, показани на Таблици 3 и 4 и на Фигура 10. По същество същата структура или структурни мотиви може да бъдат постулирани чрез секвенционни подреждания с помощта на програмата на Zukerfold (виж Zuker (1989) Science
244:48- 52). Както е известно на специалистите в областта, могат да бъдат използвани други компютърни програми за предсказване на вторична структура и структурни мотиви. По същество същата структура или структурни мотиви на нуклеиново киселинни лиганди в разтвор или като свързана структура може а бъде постулирана също с използване на NMR или други техники, както е известно на специалистите в областта.
По- нататък в изобретението е включен метод за ф установяване присъствието на заболяване, при което тенасцин-С се експресира в биологична тъкан, която да съдържа заболяването по метода на а) идентифициране на нуклеиново киселинни лиганди от кандидат сместа на нуклеинови киселини, нуклеиново киселинния лиганд е лиганд на тенасцин-С, по метода, включващ (i) контактуване на кандидат сместа от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет към тенасцин-С спрямо кандидат сместа може да бъде отделена от остатъка на кандидат сместа; (ii) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от Ф кандидат сместа;
(iii) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен ефект за получаване на смес от нуклеинови киселини с относително повисок афинитет и специфичност за свързване към тенасцин-С, чрез който е идентифициран нуклеиново киселинния тенасцин-С; (Ь) прикрепване на маркер, който може да бъде използван в in vivo или ex vivo диагностициране към нуклеиново киселинния лиганд идентифициран в етап (iii) за формиране на маркер- нуклеиново киселинен лиганден комплекс; (с) излагане на тъкан, която може да съдържа заболяването на въздействието на маркер- нуклеиново киселинен лиганден комплекс; и (d) откриване наличието на маркер- нуклеиново киселинен лиганд в тъканта, чрез която експресирането на тенасцин-С се идентифицира.
По- нататък обект на настоящето изобретение е осигуряването на комплекс за използване в in vivo или ex vivo диагностика, включваща един или повече нуклеиново киселинни тенасцин- С лиганди и един или повече маркери. По- нататък в настоящето изобпретение е включен метод за доставяне на терапевтични средства за лечение и профилактика на болестно състояние, в което е експресиран тенасцин- С. По- нататък в това изобретение е включен и комплекс за приложение при доставянето на терапевтични средства за лечение или профилактика на болестни състояния, в които е експресиран тенасцин-С.
Дефиниции
Използвани са различни термини, отнасящи се до различните аспекти на изобретението. За достигане изясняване описанието на компонентите от това изобретение, са предложени следните дефиниции:
Както тук се използва, “нуклеиново киселинен лиганд” енуклеинова киселина, коята не се среща в природата и притежава желано действие на мишена. Нуклеиново киселинни лиганди често са отнесени към “аптамери”. Мишената от настоящето изобретение е тенасцин-С, оттук термина тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд. Желаното действие включва, но се ограничава до, всързване на мишената, каталитично изменение на мишената, взаимодействие с мишената по начин, който модифицира/променя мишената или функционалната активност на мишената, ковалентно прикрепване към мишената както в убиващ инхибитор, улеснявайки взаимодействието между мишената и друга молекула. В предпочитания вариант, действието е афинитет за специфично свързване за мишенна молекула, като тази молекула е тридименсионална химична структура, различна от полинуклеотида, който свързва към нуклеиново киселинния лиганд посредством механизъм, който предоминантно зависи от удвояването по Уотсон и Криг или триплетното хеликоидално свързване, където нуклеиново киселинния лиганд не е нуклеинова киселина, притежаваща известната физиологична функция да се свързва от мишенната молекула. Нуклеиново киселинните лиганди се идентифицират от кандидат сместа от нуклеинови киселини, ф който нуклеиново киселинен лиган е лиганд на тенасцин-С, чрез метода включващ: а) взаимодействие на кандидат сместа с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет към тенасцин-С, съответно към кандидат сместа може да бъде отделена от остатъка от кандидат сместа; Ь) отделянето на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от сместа; и с) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен афинитет за получаване на набогатена на лиганд смес от нуклеинови киселини (виж US патентно описание No. 08/434 425, заявено 03. 05.1995, сега US патент No. 5 789 157, който е включен ф в литературната справка).
Както е използвано тук, “кандидат смес” е смес от нуклеинови киселини с различни последователности от които да се подбере желания лиганд. Източника на кандидат- сместа може да бъде от природно срещани нуклеинови киселини или техни фрагменти, химично синтезирани нуклеинови киселини или нуклеинови киселини, създадени чрез комбиниране на предшевстващи техники. В предпочитан вариант на изпълнение, всяк нуклеинова киселина има фиксирани последователности, заобикалящи представителен участък за улесняване процеса на амплификация.
j
Както тук се използва, “нуклеинова киселина” означава както ДНК, така и РНК, едноверижна или двуверижна и които и да са техни химични модификации. Модификациите включват, но не са ограничени до тези, които предлагат други химични групи, които включват допълнително натоварване, полярност, присъединяване на водород, електростатични взаимодействия и приток към нуклеиново киселинните лигандни бази или към нуклеиново киселинния лиганд като цяло. Такива модификации включват, но не се ограничават до, 2’-позиционни захарни модификации, 5позиционни пиримидинови модификации, 8- позиционни пуринови модификации, модификации при екзоцикпени амини, заместване на 4- тиоуридин, заместване на 5- бромо или 5- йодо- урацил; структурни модификации, метилации, необичайни комбинации на удвояване на базите като изобазите изоцитидин и изогуанидин и др. подобни. Модификациите могат да включват също 3’ и 5’ модификации като покриване.
“SELEX” методологията включва комбинацията от подбор на нуклеиново киселинни лиганди, които взаимодействат с мишена по желан начин, например свързване към протеин, с амплификация на такива подбрани нуклеинови киселини. Етапи на незадължително повтарящи се цикли от етапи на подбор/ амплификация позволява избор на една или малък брой нуклеинови киселини, които взаимодействат по- строго с мишената от източника, който съдържа много голям брой нуклеинови киселини. Цикъла от подбор/амплификация продължава докато бъде достигната желаната цел. В настоящето изобретение, метода SELEX се използва за получаване на нуклеиново киселинни лиганди за тенасцин-С.
Методологията SELEX е описана в SELEX патентните описания.
“SELEX мишена” или “мишена” означава което и да е съединение или молекула, за което се желае лиганд. Мишена може да бъде протеин, пептид, въглехидрат, полизахарид, гликопротеин, хормон, рецептор, антиген, антитяло, вирус, субстрат, метаболит, аналог на преходно състояние, кофактор, инхибитор, лекарство, багрило, хранително вещество, растежен фактор и др. без ограничение. В това описание SELEX мишената е тенасцин-С.
“Комплекс”, както е използвано тук, означава молекула изцяло формирана от ковалентно свързване на един или повече тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди с един или повече маркери. В определени варианти на изпълнение от настоящето изобретение, комплекса е означен като A-B-Y, където А е маркер; В е незадължителен и включва линкер; Y е тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд.
“Маркер” както е използван тук е молекула или молекули, които в комплекс с тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд, както директно, така и чрез линкер(и) или спейсер(и), позволява установяването на комплекса в in vivo или ex vivo постановки чрез визуални или химични средства. Примерите на маркери включват, но не се ограничават до радионуклиди, включително Tc-99m, Re188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125l, 131l, 'in, 32P, 186Re; всички флуорофлори, включително флуоросцеин, родамин, Texas Red; производни на горните флуорофлори, включително RhodamineRed-X; магнитни съединения; и биотин.
Както е използван тук, “линкер” е молекула, която свързва две или повече молекули посредством ковалентна връзка или не ковалентни взаимодействия, и може да позволи пространствено разделяне на молекулите по начн, който запазва функционалните свойства на една или повече от молекулите. Линкера може да бъде известен също като спейсер. Примерите за линкер включват, но не се ограничават до, (СН2СН2О) и хексиламинови структури, показани на Фигура 2.
“Терапевтично” както се използва тук, включва лечение и/или профилактика. Когато се използват, терапевтиците се отнасят до хора и други животни.
“Ковалентна връзка” е химична връзка, формирана от споделянето на електрони.
“Не- ковалентни взаимодействия” са средства, чрез които молекулите се държат заедно чрез взаимодействия различни от Ковалентните връзки, включително йонни взаимодействия и водородни връзки.
В предпочитаният вариант на изпълнение, нуклеиново киселинните лиганди от настоящето изобретение са получени от SELEX методологията. SELEX метода е описан в US патентно описание No. 07/536 428, озаглавено “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment” понастоящем изоставено, US патент No 5 475 096, озаглавено “Нуклеиново киселинни лиганди” и US патент No. 5 270 163, (виж също WO 91/19813), озаглавен “Методи за идентифициране на нуклеиново киселинни лиганди”. Тези описания, всеки специфично включен тук в литературната справка, са общо наречени SELEX патентни описания.
SELEX метода предлага клас от продукти, които са молекули нуклеинови киселини, всяка от които притежава уникална последователност, и всяка от които има свойството да се свърже специфично към желано мишенно съединение или молекула. Мишенните молекули са за предпочитане протеини, но могат да включват също и други въглехидрати, пептидогликани и различни малки молекули. SELEX методологията може да бъде използвана също да атакува биологични структури, като клетачни повърхности или вируси, посредством специфични взаимодействия с молекула, която е интегрална част от тази биологична структура.
В неговата най- основна форма, SELEX метода може да бъде дефиниран чрез следните серии от етапи:
1) Изготвя се кандидат смес от нуклеинови киселини. Кандидат сместа обикновено включва участъци от фиксирани последователности (т.е. всеки от членовете на кандидат сместа съдържа същите последователности в еднаква локализация) и участъци от представителни последователности. Фиксираните секвенционни последователности са подбрани както: а) да подпомогнат етапите на амплификация, описани по- долу, Ь) да имитират последователност, известна да се свърже към мишената, или с) да повиши концентрацията на дадена структурна конфигурация от нуклеиновите киселини в кандидат сместа. Представителните последователности могат да бъдат тотално случайни (напр., вероятността на свързване на база в което и да е място може да бъде избрано в което и да е ниво между 0 и 100 процента).
2) Кандидат сместа взаимодейства с избраната мишена в условия, благоприятни за свързване между мишената и членовете на кандидат сместа. При тези обстоятелства, взаимодействието между мишената и нуклеиновите киселини на кандидат сместа може да бъде считано като формиране на двойка нуклеинова киселина- мишена между мишената и онези нуклеинови киселини, които притежават по- силен афинитет за мишената.
3) Нуклеинови киселини с най- висок афинитет за мишената се отделят от онези нуклеинови киселини с по- малък афинитет за мишената. Тъй като в кандидат сместа съществува само изключително малък брой последователности (възможно е и само една молекула нуклеинова киселина) кореспондиращи на нуклеинови киселини с най- високия афинитет, най- общо е желателно да се установят критериите за отделяне, така че по време на отделянето да бъде получено значително количество нуклеинови киселини (приблизително 5-50%).
4) Нуклеиновите киселини, подбрани по време на отделянето като притежаващи относително висок афинитет за мишената, след това се амплифицират за създаване на нова кандидат смес, която е богата на нуклеинови киселини притежаващи относително по- висок афинитет за мишената.
5) Чрез повторение на етапите на отделяне и амплификация, както е описано по- горе, новоформираната кандидат смес съдържа по- малко уникални последователности, и средната степен на афинитет на нуклеиновите киселини за мишената генерално ще се повиши. Взет в неговия краен вариант, метода SELEX ще доведе до кандидат смес, съдържаща една или повече нуклеинови киселини, представляващи онези нуклеинови киселини от оригиналната кандидат смес, които притежават найвисокия афинитет за мишенната молекула.
Базисния SELEX метод е модифициран за достигане на множество специфични задачи. US патентно описание No. 07/960 093, заявено на 14 октомври, 1992, понастоящем оттеглено, и US патен No. 5 707 796, и двата озаглавени “Метод за подбор на нуклеинови киселини на базата на структурата им”, описват приложението на метода SELEX в съчетание с гел електрофореза за подбор на молекули нуклеинови киселини със специфични структурни характеристики, като свързана ДНК. US патентно описание No. 08/123 935, заявено на 17. септември, 1993, озаглавено “Фотоселекция на нуклеиново киселинни лиганди”, понатоящем оттеглено, US патент No. 5 763 177, озаглавен “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX” и US патентно описание No. 09/093 293, заявено на 08. юни 1998, озаглавено “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”, всички описват метода SELEX, основан на метод за подбор на нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи фотореактивни групи, способни да свържат и/или фотокръстосано свързване към и/или фотоинактивиране на мишенна молекула. US патент No. 5 580 737, озаглавен “Високо афинитетни нуклеиново киселинни лиганди, които могат да различат теофилин и кафеин”, описва метод за идентифициране на високо специфични нуклеиново киселинни лиганди, способни да отличат тясно родствени молекули, наречен Counter- SELEX. US патент No. 5 567 588, озаглавен “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment: Solution SELEX”, описва основан на SELEX метод, който достига високо ефективно разделение между олигонукпеотиди, притежаващи висок и нисък афинитет спрямо мишенна молекула. US патент No. 5 496 938, озаглавен “Nucleic
Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, описва методи за получаване на подобрени нуклеиново киселинни лиганди след провеждане на SELEX. US патент No. 5 705 337 озаглавен “Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment: ChemiSELEX, описва методи за ковалентно свързване на лиганд към неговата мишена.
Метода SELEX обхваща идентифицирането на високоафинитетни нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи модифицирани нуклеотиди, придаващи подобрените характеристики на лиганда, като подобрена in vivo стабилност или подобрени характеристики на доставяне. Примери на такива модификации включват химични замествания при рибозата и/или фосфата и/или в мястото на базата. Идентифицираните чрез SELEX нуклеиново киселинни лиганди съдържащи модифицирани нуклеотиди, са описани в US патент No. 5 660 985, озаглавен “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides’” който описва олигонуклеотиди, съдържащи нуклеотидни производни, химично модифицирани при 5- и 2’- позиции на пиримидините. US патент No. 5 637 459, по- горе, описва високо специфични нуклеиново киселинни лиганди, съдържащи един или повече нуклеотида, модифицирани с 2’-амино (2’-NH2 ), 2’-флуоро (2’-F), и/или 2’-О-метил (2’-Ome). US патентно описание No. 08/264 029, заявено 22 юни 1994, озаглавено “Novel Method of Preparation of Known and Novel 2’Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement”, описва олигонуклеотиди съдържащи различни 2’- модифицирани пиримидини.
Метода SELEX обхваща комбиниране на подбрани олигонуклеотиди с други подбрани олигонуклеотиди и неолигонуклеотидни функционални единици както е описано в US патент No. 5 637 459, озаглавен ““Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX”, и US патент No. 5 683 867, озаглавен “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX”, съответно. Тези описания позволяват комбинирането на голяма поредица от форми и други свойства, и свойствата на ефективна амплификация и репликация на олигонуклеотиди с желаните свойства на други молекули.
В US патент No. 5 496 938 са описани методи за получаване на подобрени нуклеиново киселинни лиганди след провеждането на метода SELEX. Този патент, озаглавен “Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev”, е специфично включен в литературната справка.
US патентно описание No. 08/434 425, озаглавено “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX” заявено на 3. май. 1995, понастоящем US патент No. 5 789 157, описва методи за идентифициране на нуклеиново киселинни лиганди за макромолекулна компонента на тъкан, включително ракови клетки, и нуклеиново киселинните лиганди, идентифицирани по този начин. Този патент е специфично включен тук в литературната справка.
Един потенциален проблем за диагностичното или терапевтично приложение на нуклеинови киселини е, че олигонуклеотидите в тяхната фосфодиестерна форма могат бързо да бъдат разградени в телесните течности чрез интрацелуларни и екстрацелуларни ензими като ендонуклеази и екзонуклеази преди да бъде проявен желания ефект. Определени химични модификации на нуклеиново киселинен лиганд могат да доведат до повишаване на in vivo стабилността на нуклеиново киселинния лиганд или да засили или медиира доставянето на нуклеиново киселинния лиганд. Виж, напр. US патентно описание No. 08/117 991, заявено на 8. септември 1993, понастоящем изоставено и US патент No. 5 660 985, и двата озаглавени “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”, които са специфично включени като литературна справка. Модификациите на нуклеиново киселинни лиганди, обсъдени в настоящето изобретение включват, но не се ограничават до такива, които предоставят различни химични групи, които включват допълнително натоварване, полярност, хидрофобност, свързване на водород, електростатично взаимодействие и разместване при базите на нуклеиново киселинните лиганди или при нуклеиново киселинните лиганди като цяло. Такива модификации включват, но не се ограничават до, 2’- позициионни захарни модификации, 5позиционни пиримидинови модификации, 8- позиционни пуринови модификации, модификации при екзоциклинови амини, заместване на 4- тиоуридин, заместване на 5- бромо или 5- йодо-урацил; структурни модификации, фосфоротиоат или алкил фосфатни модификации, метилации, необичайни комбинации при образуване на двойки бази като изобазите изоцитидин и др. Модификациите могат също да включват 3’ и 5’ модификации като припокриване. В предпочитани варианти на настоящето изобретение, нуклеиново киселинните лиганди са РНК молекули, които са 2’- флуоро (2’-F) модифицирани при захарното количество от пиримидиновите остатъци.
Модификациите могат да бъдат модификации преди- или след- провеждане на SELEX. Модификациите преди SELEX водят до получаване на нуклеиново киселинни лиганди както със специфичност за тяхната SELEX мишена, така и с подобрена стабилност in vivo. Модификациите след провеждане на
MeTOflaSELEX осъществени в 2’-ОН нуклеиново киселинни лиганди могат да доведат до подобрена in vivo стабилност без неблагоприятно повлияване на свързващия капацитет на нуклеиново киселинния лиганд.
На специалистите в областта са известни и други модификации, коието могат да са осъществени след провеждане на SELEX (модификация на предварително идентифицирани немодифицирани лиганди) или чрез включване в метода SELEX.
•
Нуклеиново киселинните лиганди от изобретението са изготвени посредством методологията, която е очертана по- горе и дава пълно основание за SELEX приложенията, включени тук като справка в тяхната пълнота.
Тенасцин- С аптамерите от изобретението се свързват към мястото за свързване на хепарина от тенасцин-С СООН края.
J
В определени варианти на изпълнение от настоящето ® изобретение, нуклеиново киселинните лиганди за тенасцин-С описани тук, са приложими за диагностични цели и може да бъде използван за изобразяване патологични условия (като туморни визуализации при хора). В допълнение кам диагнозата, тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди са приложими за прогнозата и наблюдаване на болестни състояния, при които е експресиран ) тенасцин-С.
j ί
Диагностичните средства са необходими само за да позволят използването за идентифициране наличието на дадена мишена в определно място или концентрация. Просто способността да ) формира свързващи двойки с мишената може да бъде достатъчно да отключи позитивен сигнал за диагностични цели. Специалиста в областта би бил способен да адаптира тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди чрез процедури, известни в областта за включване на маркер за проследяване наличието на нуклеиново киселинния лиганд. Такъв маркер миже да бъде използван в множество диагностични процедури, като откриване на първични или метастазни тумори и атеросклерозни лезии. Бележещите маркери посочени тук като примерни са технециум-99т и 1111п. Към тенасцин- С нуклеиново киселинния лиганд могат да бъдат конюгирани и други маркери като допълнителни радиоизотопи, магнитни съединения, флуорофори, биотин и др. в in vivo и ex vivo болестни състояния, където се експресира тенасцин-С (напр. рак, атеросклероза и псориазис). Маркера може да бъде ковалентно свързан в различни позиции на тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд, като напр. в екзоциклиновата амино група от базата, при 5позицията на пиримидиновия нуклеотид, 8-позиция на пуриновия нуклеотид, хидроксилната група на фосфата или хидроксилната група при 5’ или 3’ края на тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд. Във вариантите на изпълнение, където маркера е технециум-99т от 1111п, за предпочитане е свързан към 5’ или 3’ хидроксил от фосфатната група или към позиция 5 от модифицирания пиримидин. В най- предпочитания вариант на изпълнение, маркера е свързан към 5’ хидроксила от фосфатната група на нуклеиново киселинния лиганд с или без линкер. В друг вариант на изпълнение, маркера е конюгиран към нуклеиново киселинния лиганд чрез включване на пиримидин, съдържащ първичен амин в позиция 5, и използване на амина за конюгация към маркера. Прикрепването на маркера може да стане директно или с използване на линкер. Във варианта на изпълнение, където като маркер са използвани технециум-99т или 111 In, предпочитаният линкер е хексиламинов линкер, както е показано на Фигура 10.
В други варианти на изпълнение, тенасцин- С нуклеиново киселинните лиганди са приложими за доставяне на терапевтични съединения (включително, но без да се ограничават до, цитотоксинови съединения, имуно подсилващи вещества и терапувтични радиоизотопи) до тъкани или органи, експресиращи тенасцин-С. Състояния на заболяване, при които тенасцин-С може да бъде експресиран включват, но не се ограничават до рак, атеросклероза и псориазис. Специалиста в областта би бил в състояние да адаптира който и да е тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд чрез процедури, известни в областта за включване на терапевтично съединение в комплекс. Терапевтичното съединение може да бъде ковалентно свързано към различни места в тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд, като напр. към екзоциклена амино група от базата, 5- позицията от пиримидиновия нуклеотид, 8-позицията от пуриновия нуклеотид, хидроксилната група от фосфата, или хидроксилната група или друга група при 5’ или 3’ края на тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд. В предпочитан вариант на изпълнение, терапевтичното средство е свързано към 5’ амина от нуклеиново киселинния лиганд. Прикрепване на терапевтичното средство може да се осъщстви директно или с използването на линкер. Във варианти в които мишенното заболяване е рак, 5флуородезоксиурацил или други нуклеотидни аналози, известни с това че са активни спрямо тумори, може да бъдат включени вътре в съществуващите U’s в рамките на тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд или може да бъдат добавени интернално или конюгирани към който и да е край както директно, така и посредством линкер. В допълнение, могат да бъдат включени и двата пиримидинови аналога 2’2’- дифлуороцитидин и пуриновите аналози (дезоксикоформицин). В допълнение, US патентно описание No. 08/993 765, заявен на 18. декември, 1997, включен тук в литературната справка, описва inter alia, основани на нуклеотиди лекарствени предшевственици, включващи нуклеиново киселинни лиганди, насочени към тумор, например тенасцин-С, за прецизно локализиране на чувствителни на хеморадио средства и други радиотерапевтични средства в тумора.
Обсъдено е също, че както маркера, така и терапевтичното средство могат да бъдат свързани с тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд, така че установяването на болестното състояние и доставянето на терапевтичното средство се осъществяват заедно в един аптамер или като смес от две или повече различно модифицирани версии на същия аптамер. Счета се също, че всеки или и двата маркера и/или терапувтичното средство могат да бъдат свързани с неимуногенно, високо молекулно съединение или липофилно съединение, като липозома. Методи за конюгиране на нуклеиново киселинни лиганди с липофилни съединения или неимуногенни съединения в диагностичен или терапевтичен комплекс са описани в US патентно описание No. 08/434 465, заявено на 4. май, 1995, озаглавено “Комплекси на нуклеиново киселинен лиганд”, изцяло включен в справката.
Терапевтичните или диагностични състави, описани тук могат да бъдат прилагани парентерално чрез инжектиране (напр. интравенозно, субкутанно, интрадермално, интралезионно), макар други ефективни форми на прилагане, като интраартикуларно инжектиране, инхалационни пари, орално активни форми, трансдермална йонофореза или супозиториуми, също са предвидени. Те могат да бъдат прилагани също локално чрез директно инжектиране, могат да бъдат освободени от съоръжения като имплантирани стентове или катетри, или доставяни директно до мястото с инжекционна помпа. Един предпочитан носител е физиологичен разтвор на соли, но се счита, че могат да бъдат използвани и други фармацевтично приемливи носители. В един вариант на изпълнение, се предвижда носителя и тенасцин- С нуклеиново киселинните комплекси с терапевтично съединение определят физиологично- конкурентна, бавно освобождаваща се форма. Първичния разтворител в такъв носител може да бъде както воден, така и не- воден по природа. В допълнение, носителя може да съдържа други фармакологично приемливи ексципиенти за модифициране или поддържане на pH, осмотичност, вискозитет, чистота, цвят, стерилност, стабилност, скорост на разтваряне или аромат на формата. Аналогично, носителя може да съдържа и други фармакологично- приемливи ексципиенти за модифициране или поддържане на стабилността, скоростта на разторимост, освобождаване или абсорбция на тенасцин-С нуклеиново киселинния лиганд. Такива ексципиенти са онези вещества, които са обичайни използвани за формиране на дозите за парентално приложение във всяка единица доза или мулти- дозова форма.
След като терапевтичния или диагностичен състав бъде формиран, той може да бъде съхранен в стерилни епруветки като разтвор, суспенсия, гел, емулсия, твърдо вещество или дехидратиран или лиофилизиран прах. Такива форми могат да бъдат съхранявани както във форми за незабавно приложение, така и във форми изискващи възстановяване непосредствено преди употреба. Начина на прилагане на формите, съдържащи тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди за системно доставяне, може да бъде чрез субкутанно, интрамускулно, интравенозно, интраартериално, интраназално или вагинални или ректални супозиториуми.
За обяснение и илюстриране на настоящето изобретение са представени следните примери, които не бива да бъдат възприемани като ограничаващи изобретението. Пример 1 описва материалите и експерименталните процедури, използвани в Пример 2 за генериране на РНК лиганди за тенасцин-С. Пример 2 описва РНК лиганди за тенасцин-С и предсказаната вторична структура на избран нуклеиново киселинен лиганд. Пример 3 описва определянето на минималния размер, необходим за високо афинитетно свързване на избран нуклеиново киселинен лиганд, и заместване на 2’-ОН пурини с 2’-ОМе пурини. Пример 4 описва биологичното разпределение на белязани с Тс-99т тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди в носеща тумор мишка. Пример 5 описва приложението на флуоресцентно белязан тенасцин-С нуклеиново киселинен лиганд за локализиране на тенасцин-С в туморна тъкан. Пример 6 описва откриването на тумори in vivo с Аптамер ТТА1 (също известен като GS7641). Пример 7 описва алтернативно маркиране с помощта на 111 In.
ПРИМЕРИ
Пример 1. Приложение на SELEX за получаване на нуклеиново киселинни лиганди за тенасцин-С и за U251 глиобластомни клетки.
Материали и методи
Тенасцин-С е закупен от Chemicon (Temecula, СА). Едноверижни ДНК праймери и матрици са синтезирани от Орегоп Technologies Inc. (Alameda, СА).
Метода SELEX е описан в подробности в SELEX патентни описания. Накратко, двойно верижни транскрибционни матрици се изготвят с Klenow фрагмент с екстензия от 40N7a ssDNA:
5’- TCGCGCGAGTCGTCTG [4 ON] CCGCATCGTCCTCCC 3’ (SEQ ID NO: 1) c помощта на праймера 5N7:
5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG- 3’ (SEQ ID NO: 2) ft който съдържа T7 полимеразен промотор (подчертан). РНК се изготвя с Т7 РНК полимераза както е описано по- рано в Fitzwater and Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275- 301, включен изцяло в литературната справка. Всички транскрибционни реакции се осъществяват в присъствието на пиримидинови нуклеотиди, които са 2’- флуоро (2’-F) модифицирани в захарното количество. Това заместване потвърждава повишена резистентност спрямо рибонуклеази, които използват 2’- хидрокси количеството за разграждане на фосфодиестерната връзка. Специфично, всяка транскрибционна смес съдържа 3.3 mM 2-F ft UTP и 3.3 mM 2’-F СТР заедно с 1 mM GTP и АТР. Така получената изходна извадка от РНК библиотека включва 3 х 1014 молекули. Афинитетите на отделните лиганди за тенасцин-С се определят по стандартни методи с помощта на нитроцелулозно филтърно отделяне (Tuerk and Gold (1990) Science 249(4968):505-10).
За всеки цикъл SELEX, Lumino (Labsystems, Needham Heights, МА) панички се покриват за два часа при стайна температура с 200 μΙ Dulbecco’s PBS съдържащ тенасцин- С концентрации както е показано на Таблица 1. След покриването, ямките се блокират с помощта на буфер HBSMC+ [20 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 mM СаС12, 1 тМ
CaCI2, 1 mM MgCI2 и 1 g/liter човешки серумен албумин (Sigma, fraction V) за цикли 1 до 6, докато за цикъл 7 и 8 ямките се блокират с HBSMC+ буфер, съдържащ 1 g/liter казеин (l-block; Tropix). Буфера за свързване и промиване се състои от HBSMC+ буфер, съдържащ 0.05% Tween 20. За всеки цикъл SELEX РНК се разрежда в 100 μΙ от буфера за свързване и се оставя да инкубира за 2 часа при 37°С в покрити с протеин ямки, които предварително са промити с буфер за свързване. След свързването, се осъществяват шест промивания от 200 μΙ всеки. След етапа на промиване, сухиата ямка се помества на повърхността на нагревателния блок при 95°С за 5 минути. Стандартните AMV обратно транскрибтазни реакции (50 μΙ) се провеждат при 48°С директно в ямката и реакционните продукти се използват за стандартни PCR и трансрибционни реакции. За тези етапи на матрични амплификация и обратна транскрибиране се използват два синтетични праймера 5Ν7 (веж по- горе) и 3N7a:
5’-TCGCGCGAGTCGTCTG-3’ (SEQ ID NO: 3).
За клетъчен SELEX метод, се култивират U251 човешки глиобластомни клетки (Hum. Hered. (1971) 21:238) за сливане в модифицирана среда на Dulbecco- Eagle, заместена с 10% фетален телешки серум (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD) върху шест- кладенчови тъканно културални пластинки (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) и се промиват три пъти с помощта на Dulbecco’s PBS заместена с CaCI2 (DPBS, GIBCO BRL) буфер. РНК, белязана вътрешно чрез транскрибция (Fitzwater (1996) supra) се инкубира с клетките при 37°С за един час. Белязаната РНК след това се отстранява и клетките се промиват шест пъти за десет минути всеки при 37°С с DPBS. DPBS съдържащ 5 mM EDTA след това се добавя и инкубира с клетките за 30 минути за елуиране на свързаната РНК, която остава след етаппите на промиване. Тази РНК след това се определя количествено чрез стандартно сцинтилационно броене и се амплифицира с помощта на RT- PCR.
Изпитване за свързване за клетки U251. Интернално белязана РНК се инкубира при повишаващи се концентрации със сляти U251 клетки в шест- кладенчови тъканно културални пластинки {Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) при 37°C за 60 мин. Несвързаната РНК се промива с помощта на 10 минутни промивания с DPBS+ CaCI, и свързаната РНК се събира чрез разрушаване на клетките с помощта на Trizol {Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Свързаната РНК се определя количествено чрез сцинтилационно броене в течност.
Клониране и секвениране. Амплифицирани афинитетно обогатени олигонуклеотидни пулове се пречистват върху 8% полиакриламиден гел, обратно транскрибиран в ssflHK и амплифицираната ДНК чрез полимеразна верижна реакция (PCR) с помощта на праймери, съдържащи BamHI и Hindlll места за рестрикционните ендонуклеази. PCR фрагменти се клонират, приготвят се плазмиди и се провеждат секвенционни анализи съгласно стандартни техники {Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Rd. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
Пример 2. РНК лиганди за тенасцин-С
Нуклеиново киселинни лиганди за U251 клетки са получени чрез метода SELEX и са описани в US патентно описание No. 08/434 425, озаглавено “Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment: Tissue SELEX”, заявен на 3. май, 1995, понастоящем US патент No. 5 789 157. Съответно определено е, че така получените лиганди са тенасцин-С нуклеиново киселинни лиганди.
За получаване на олигонуклеотидни лиганди срещу човешки тенасцин-С, са проведени осем кръга SELEX с помощта на извадка нуклеотидна библиотека, както е описано по- горе в Materials and Methods. Въвеждането на РНК и протеин във всеки кръг е показано на Таблица 1. След 8 кръга SELEX, афинитета на олигонуклеотидния пул за тенасцин-С е 10 пМ и този афинитет не се повишава с допълнителни кръгове SELEX.
За получаване на лиганди за U251 глиобластомни клетки, са проведени девет кръга SELEX с помощта на извадка от нуклеотидна библиотека. След девет кръга на свързване на U251 клетки и EDTA елуация, кръгове 3,5 и 9 се тестват за способността им да се свържат към U251 клетки. Фигура 1 показва, че броя на SELEX кръговете се повишава, количеството на свързана РНК също се повишава при определена концентрация. Поради комплексността на мишенната тъкан, не е възможна оценката на афинитета на олигонуклеотидните пулове за неизвестна мишенна молекула(и) при тези клетки.
Е9 пула (девет кръга на свързване и EDTA елуация от клетки U251) след това се използват като изходна точка за SELEX срещу пречистен тенасцин-С. Два кръга от SELEX с участието на пречистен тенасцин-С се провеждат както е описано по-горе. Включените протеин и РНК концентрации за два кръга SELEX (Е9Р1 и Е9Р2) са описани на Таблица 2.
В обобщение, проведени са три разрични SELEX експеримента: един с помощта на пречистен тенасцин-С като мишена, един експеримент с участието на U251 глиобластомни клетки като мишена, и един експеримент при който SELEX пула от U251 глиобластомните клетки се използва за иницииране на SELEX експеримента с помощта на пречистен тенасцин-С като мишена.
Всички три SELEX експеримента се анализират чрез кпониращи и секвениращи лиганди от кръг 8 от пречистения тенасцин-С SELEX (“TN” последователности), от кръг 9 от U251 клетките SELEX (“Е9”последователности) и от кръг 2 от U251/тенасцин-С хибриден SELEX (”Е9Р2”последователности). Последователностите от 34 уникални клона са показани на Таблица 3, и са разделени на две големи групи: тенасцин-С лиганди (“TN” и “Е9Р2” последователности) и U251 клетъчни лиганди (“Е9” лиганди). Средлигандите за тенасцин-С, повечето от клоновете (общо 65) представят един от двата отличими секвенционни класове, означени Семейство I и II (Фигура 1). Изпитването на вариабилния участък от 12-те клона в семейство I изяви 7 уникални последователности, които са близки до консенсусната последователност GACNYUUCCNGCYAC (SEQ ID N0:12).
Изпитването на вариабилния участък от 18-те клона в Семейство II изяви последователности, които споделят консенсусната последователност CGUCGCC (Таблица 3). Последователностите Е9 могат да бъдат групирани в сроден комплекс последством съхранени GAY и CAU последователности в рамките на вариабилните участъци. Останалите участъци не се явяват сродни на други последователности и са класифицирани като орфани. Три последователности предоминират, с Е9Р2-1,
Е9Р2-2 и TN9 представя 14, 16 и 10 пъти съответно. В категорията “Орфан”, една последователност, TN18, е представена два пъти. Общо, тези данни представят силно набогатен секвенционен пул.
Повечето индивиди представят ниско наномолярни константи на дисоциация, с трите най- превалентни последователности, TN9 и Е9Р-2-1 и -2, притежаващи най- високите афинитети при 5 пМ, 2пМ и 8 пМ (Таблица 3). Тези резултати показват, че U251 клетъчния SELEX е като склад за аптамери срещу тенасцин-С, и че само два кръга от SELEX са необходими за изолиране на тенасцин- специфични лиганди от клетъчния SELEX пул. Олигонуклеотидни лиганди срещу други протеини могат да бъдат изолирани по аналогичен начин от Е9 пула с помощта на пречистени протеинови мишени.
Пример 3. Определяне на минималния размер на TN9 и заместване на 2’-ОН пурини с 2’-ОМе пурини: синтезиране на аптамер ТТА1.
Олигонуклеотидните процедури за синтез са стандартни за специалистите в областта (Green et al. (1995) Chem Biol. 2(10):68395). 2’-флуоро пиримидинови фосфороамидитни мономери са получени от JBL Scientific (San Luis Obispo, СА); 2’-OH пурин, хексиламин и (СН2СН2О)6 мономери, заедно с dT полиестерна твърда повърхност, са получени от Glen Research (Sterling, VA). Аптамерните афинитети се определят с помощта на отделяне с нитроцелулозен филтър (Green et al., supra).
TN9 е избран за по- нататъшен анализ на базата на неговия висок афинитет за тенасцен-С. Ние най- напред изследвахме за минималната последователност, необходима зо високо афинитетно свързване. С помощта на стандартни техники (Green et al, supra) е установено, че нуклеотиди 3’ от нуклеотид 55 се изисква за свързване към тенасцин-С, докато нуклеотиди не могат да бъдат отстранени от 5’ края без загуба на афинитет. За по- нататъшно намаляване дължината на TN9’ от 55 нуклеотиди и да постигне високо афинитетно свързване, ние след това опитахме да дефинираме вътрешни делеции от TN9. Първите 55 нуклеотида от TN9, заедно с първите 55 нуклеотида от сродно семейство II от лиганди TN7, TN21 и TN41, са включени в компютърен алгоритъм за определяне възможните огъвания от РНК вторичната структура (mfold 3.0, с достъп в http://www.ibc.wust.edu/~zuker/. М. Zuker, D.H. Matheus& D.H. Turner, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In: RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C. Clark eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999). Сред многото потенциални огъвания на РНК, предсказани с алгоритъма, бе установена структура, обща за всеки олигонуклеотид. Тази структура, преставена от олигонуклеотид ТТА1 на Фигура 2, съдържа три ствола, които се срещат при една точка на съчленение, така наречената 3- стволово съчленение. Тази гънка помества високо консервативни нуклеотиди от олигонуклеотидното семейство II в областта на съчленението. При сравняване на TN9, TN7, TN21 и TN41, вторият ствол е с вариабилна дължина и последователност, предполагайки че размера на втория створ не се изисква да се свързва към тенасцин-С. Изпитвайки тази хипотеза върху TN9, ние установихме че нуклеотиди 10- 26 биха могли да бъдат заместени с един етилен гликолов линкер, (СН2СН2О)б . Линкера служи като заместваща бримка и понижава размера на аптамера. В допълнение, четири- нуклеотидни бримки (CACU или GAGA), които заместват нуклеотиди 10- 26 продуцират последователности с висок афинитет за тенасцин-С. Би било добре за специалиста в областта да определи други нуклеотидни бримки или други спейсери, които биха заместили нуклеотиди 1026 за продуциране на последователности с висок афинитет за тенасцин-С.
За повишаване защитата срещу нуклеотидната активност, са локализирани чисти позиции, които биха могли да бъдат заместени със съответните 2’- ОМе пурини. Олигонуклеотида бе произволно разделен на пет сектора и всички пурини в рамките на всеки сектор са заместени със съответния 2’- ОМе пуринов нуклеотид, общо пет олигонуклеотида (Таблица 4, Фаза I от синтезата). Определя се афинитета на всеки олигонуклеотид за тенасцин-С и е установено, че всички пурини в рамките на сектори 1,3 и 5 биха могли да бъдат заместени без чувствителна загуба на афинитет. В рамките на сектори 2 и 4, отделните пурини след това са заместени с 2’ОМе пурини и ефекта от афитнитета се измерва (Таблица 4, Фаза III от синтезата). От тези експерименти е направен извода, че заместването на нуклеотиди G9, G28, G31 и G34, с 2’-ОМе G причинява загуба на тенасцин-С. Поради това тези нуклеотиди остават като 2’-ОН пурини в аптамера ТТА1.
Аптамера ТТА1 (Таблица 4) след това се синтезира с (СН2СН2О)б (Спейсер 18) линкер, 3’- 3’ dT покриване за защита от ендонуклеази, 5’ хексиламин (таблица 4), и всички пурини като 2’ОМе с изключение на 5 Gs означени на Таблица 4. Контролен, несвързващ аптамер, ТТА1. NB, е генериран чрез делеция на 5 нуклеотида при 3’ края за получаване на TTA.NB. ТТА1 се свързва към тенасцин-С с еквилибрационна константа на дисоцииране (Ка) от 5 пМ, докато ТТА1. NB има Ка > 5 μΜ за тенасцин-С.
Нуклеотиди 10- 26 може да бъде заместен чрез ненуклеотиден етилен гликолов линкер. Поради това вероятно ТТА1 може да бъде синтезиран в две отделни части, където е въведено прекъсване в пзицията на етилен гликоловия линкер и се въвеждат нови 5’ и 3’ края. Непосредствено след синтезата, двете молекули се инкубират заедно за да се позволи формирането на хибрида. Този метод позволява въвеждане на допълнителни амино групи както и нуклеотиди в новите 5’ и 3’ краища. Новите функционалности могат да бъдат използвани за биологично свързване. В допълнение, синтезата в две отделни части води до повишен добив от химичната синтеза, който се дължи на съкращаване на дължината на молекулите.
Пример 4. Биологично разпределение на белязани Тс-99т аптамери в тумори и мишки
Биологичното разпределение на аптамери се тества чрез конюгация на Тс-99т хелатор (Hi15: Higler et al. (1998) Tet Lett 39: 9403-9406) в 5’ края на олигонуклеотида както е показано на Фигура 2 и радиомаркиране на аптамера с Тс-99т. Аптамера в неговата Тс-99т белязана форма е показано на Фигура 10. ТТА1 и TTA1.NB конюгират към Hi15 при 50 mg/ml аптамер в 30% диметилформамид с 5 моларни еквиваленти на Hi15-Nхидроксисукцинимид, в буфер от 100 mM Na борат с pH 9.3, за 30 минути при стайна температура. Аптамера в неговата Тс-99т белязана форма е показана на Фигура 10. Пречистване с обратно фазова HPLC води до получаване на Hi15- ТТА1 и Hi15- TTA1.NB. Олигонуклеотидите след това се маркират с Тс-99т по следния начин: към 1 nmole Hi15- аптамер се добавят 200 μΙ от 100 mM натриев фосфат, pH 8.5, 23 mg/ml Na тартарат и 50 μΙ Tc-99m пертехнетат (5.0 mCi) елуиран от Мо-99 колона (Syncor, Denver) в рамките на 12 часа. Реакцията на маркиране се инициира чрез добавянето на 10 μΙ 5 mg/mL SnCI2. реакционната смес се подлага на инкубиране за 15 минути при 90°С. Реакцията се разделя от невзаимодействалия Tc-99m чрез диализа през 30 000 MW мембрана (Centrex, Schleicher & Scheull) с две промивания. Този протокол на маркиране води до включване на 30-50% от добавения Тс-99т със специфична активност от 2-3 mCi/nmole РНК. Тс-99т се свързва посредством 5’G както е показано на Фигура 5.
За експериментите на биологично разпределение, U251 ксенотрансплантирани тумори се предоставят както следва: U251 клетки се култивират в модифицирана от Dulbecco Среда на Eagle, заместена с 10% v/v фетален телешки серум (Gibco BRL, Gaidersburg, MD). Мишка с отстранена тимусна жлеза (Harlan Sprague Dawley, Indianopolis, IN) се инжектира субкутанно с 1х 106 U251 клетки. Когато тумора достигне размер от 200- 300 mg (1-2 седмици), белязан с Тс-99т аптамер се инжектира интравенозно при 3.25 mg/kg. В определено време, животните се анестезират с помощта на изофуран (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA), кръвта се събира чрез кардиална пунктура, животните се умъртвяват и тъканите се събират. Нивата на Тс-99т се изброяват с помощта на гама брояч (Wallac Оу, Turku, Finland). Усвоеният от тъканите аптамер се измерва като процента инжектирана доза за грам от тъканта (%ID/g).
Изображенията на мишката са получени с помощта на гама камера. Мишките се поставят в камера (Siemens, LEM+) под анестезия (изофуран). Данните се събират (30 сек до 10 минути) и се анализират с помощта на версия на ядрен МАС софтуер 3.22.2 (Scientific Imaging, СА) on a Power MAC G3 (Apple Computer, CA).
Експерименти за биологично разпределение, Таблица 5, показват остро и специфично усвояване на аптамера в туморна тъкан; не- свързания аптамер не остава в тумора. Кръвните нива на Тс-99т също се изчистват бързо. След три часа, Тс-99т нива, внесени в тумора с помощта на Hi15- ТТА1 има много висока степен на полу- живот (>18). Това показва, че след като веднъж аптамера навлезе в тумора, маркера носен от него остава в тумора за дълъг период от време. Такива данни показват, че цитотоксичните средства, включително радоизотопи и не- радиоактивни средства, конюгирани към аптамера също ще остане в тумора с висока степен на полу- живот.
Тс-99т радиоактивността се проявява също и в други тъкани, особено в тънките и дебели черва. Образците на пречистване от жлъчка, установени тук може да бъде променено от специалиста в областта, например чрез изменение на хидрофилността на Тс-99т хелатора, променяйки хелатора, или едновременното изменение на радиометал/хелаторната двойка.
Пълни изображения на животните са получени с помощта на белязан с Tc-99m Hi15-TTA1 и 3 часа пост- инжекционно. Изображенията, получени от мишки инжектирани с Hi15-TTA1, но не от мишка инфектирана с Hi15-TTA1.NB, ясно показва тумора (Фигура 3). Допълнителна радиоактивност е очевидна в гастроинтестиналния тракт, както е предсказано от експериментите за биологично разпределение.
Пример 5. Приложение на флуоресцентно белязан ТТА1 за локализиране на тенасцин-С в туморна тъкан.
Материали и методи.
ТТА1 и TTA1.NB се синтезират както е описано по- горе. Сукцинимидилово Родамин- Червено-Х (Molecular Probes, Eugene,
OR) конюгира към 5’ амин от аптамерите както е описано по- горе за Hi15-NHS конюгация. Конюгираните с Родаминово червено-Х аптамери, ТТА1-Червено и TTAI.NB-Червено, се пречистват чрез обратно фазова HPLC. U251 клетъчната култура и туморния растеж в гола мишка са такива, каквито са описани по- горе. Пет наномола ТТА1-Червено или TTAI.NB-Червено се инжектират интравенозно в гола мишка и в желаното време животните се поставят под наркоза, потапят се в 0.9% NaCl и се умъртвяват. Тумора се изрязва и се постав във формалин. След 24 часа във формалин, сектори от по 10 μΜ се изрязват и багрилото РодаминЧервено-Х се открива с флуоресцентен микроскоп (Eclipse Е800, Nicon, Japan).
Резултати: ТТА1-Червено има идентичен афинитет за тенасцин-С като неконюгиран родителски аптамер, ТТА1, при 5 пМ. Сравнени са нивата на туморна флуоресценция на ТТА1-Червено и TTAI.NB-Червено 10 минути след инжектирането. Свързващия аптамер, ТТА1-Червено, силно оцветява тумора, но не и съседната тъкан (Фигура 4). В противоположност на това, се установява само тъканна авто- флуоресценция с TTAI-NB-червено. Тези резултати показват приложимостта на аптамера при флуоресцентното откриване на тенасцин-С in vivo и аптамера може да бъде аналогично използван за оцветяване на тъканни сектори ex vivo.
Пример 6. Установяване на тумори in vivo чрез аптамер ТТА1) сега известен като GS7641): допълнителни туморни типове.
Маркирането на аптамера, биологичното разпределение и трансплантация на тумор в голи мишки се провежда както в Пример 4.
Известни са много туморни типове, експресиращи тенасцинС. За достигане способността на TTA1/GS7641 да достигне туморните типове в допълнение към глиобластомите, човешки туморни клетъчни линии се култивират като тумори в голи мишки. Туморна тъкан се тества за експресия на човешки тенасцин-С и онези тумори, експресиращи мовешки тенасцин-С се тестват за усвояване на аптамера. Фигура 6 демонстрира усвояването на аптамер в различни тумори, включително глиобластома, гърда, колоректум и рабдомиосаркома. Специфично усвояване в тумора е показано чрез сравняване между свързващия (TTA1/GS7641) и несвързващ аптамер (TTA1.NB). Отбелязва се, че КВ, ксенотрансплантант който експресира миши, но не и човешки TN-C, не показва туморно усвояване. Този експеримент разширява наблюдението на глиобластомно усвояване в допълнителни карциноми и саркоми, и по-нататък показва, че всички тумори експресиращи човешки тенасцин-С показват усвояване на TTA1/GS7641.
Пример 7. Алтернативно маркиране с помощта на 1п-111.
Провежда се изследване на туморни ксенотрансплантанти и биологично разпределение, както е описано в Пример 4. За куплиране на DTPA и DOTA към TTA1/GS7641, цикло анхидрида от всеки се инкубира със съдържащия амин TTA1/GS7641 в условия на неутрално pH с помощта на стандартни методи. Структурите на DTPA и конюгати са показани на Фигура 8 и Фигура 9, съответно, където всеки е маркиран с 1п-111. DOTA конюгата има идентични линкери както за DTPA. DOTA- и DTPA- конюгатите се маркират с ln-111 чрез инкубиране при 95°С в 0.5 М NaOAc, pH 5.5 за 30 минути. След отстраняването на включения радиоизотоп чрез диализа върху ЗОК мембрана, маркирания аптамер се прехвърля във фосфатно- буферен разтвор за инжектиране в тумор- носеща мишка.
Биологичното разпределение на белязания с 1п-111 аптамер е значително различен от Тс- белязаната форма, описана в Пример 4. Фигура 7 показва, че в сравнение с белязания с Тс-99т TTA1/GS7641, радиоактивността на белязаният с 1п-111 TTA1/GS7641 в тънките черва е силно редуцирана, със съпътстващо повишение на усвояване в черен дроб и бъбреци. Този експеримент показва, че химичните свойства на хелатора имат висок ефект на разпределение на маркера TTA1/GS7641 при живи животни. Образците на биологично разпределение, които са различни от тези на Hi15-TTA1/GS7641 могат да бъдат приложими за тумори при определени клинични условия, където отстраняването на жлъчка е нежелателно. Такива състояния включват, но не са ограничени до радиотерапевтични приложения, а така също и визуализиране на тънки черва, простата и други абдоминални участъци.
Таблица 1
Тенасцин-С SELEX РНК и включване на протеин
Тенасцин-С РНК
Кръг (pMol/ямка) (pMol/ямка)
1 12 200
2 12 200
3 12 200
4 12 200
5 2 33
6 2 33
7 2 33
8 0.2 3.3
Таблица 2.
Включване на SELEX/Тенасцин-С SELEX РНК и протеин
Тенасцин-С РНК
Кръг (pMol/ямка) (pMol/ямка)
Е9Р1 2 33
Е9Р1 2 33
I
з з & и υ и υ 4 <0 to <0 to Ο» <0 « to
ο и ϋ 3 3 3 3 ο» ο» θ' 0» υ ο» θ' θ'
я 3 3 ο и υ υ υ υ υ υ 3 υ υ ο
υ и Ο 0 10 <0 to υ υ υ υ υ υ υ υ
<0 0 <0 θ' ο» ο* θ' υ υ υ υ « υ υ υ
O' Ο» Ο» υ υ υ ο θ' θ' σ> ο» θ' ο» σ< θ'
υ Ο υ <0 <0 <0 <0 υ и υ υ υ и υ υ
υ ο 5 3 3
з <
3 ω Ο е 0
3 ο 0 0
и ’ 0 0 0 0
0 0 и и 0 010
и и ю и 0 010
и υ 0 0 0 010
0 0 и 0 0 υ
3 3 3 5 3
в 3 0 0 0 а 0
0 0 и 0 о 2 0
υ и 0 0 3 0 0
0 0 3 0 3
Οι Οι Οι Ο* Ο* Οι
3 Οι Ο> Οι Οι ο» 3 3 3 3 3 3 3
υ ο υ ο ο ο 3 3 3 3 3 3 3
з 3 0 3 3 3 υ υ υ υ υ υ υ
3 3 3 5 3 5 3 3 3 3 3 3 3
« <ο α 0 0 0 3 3 3 3 3 3 9
з 30 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0
υ υ ο ο υ υ 3 3 3 3 3 3 3
<π <0 < 0 0 0 υ υ υ υ υ υ υ
Οι 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0
θ' 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
<0 0 < 0 0 0 - 3 3 3 3 3 3 3
3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
3 3 3 3 3 3 3
VO ο гЧ СЧ <η ЧГ «η CO Γ- 00 σ>
t co 3 гЧ Г1 гЧ «4 τ4 гЧ гЧ гЧ гЧ
θ' θ' Οι ο* ο*
3 3 3 3 3
υ Ο υ υ υ
3 3 3 3 3
9 3 3 3 3
0 0 0 0 0
υ υ ο υ ο υ ο ο
0 0 0 0 0 0 0 0
Ο гН Λ
£ С
« 4 β 01 01 01 οι
O' Ο» σ» θ' σ» σ» θ'
и υ Ρ υ υ υ υ
υ υ υ υ υ υ υ
ο υ υ υ υ υ υ
ο» ο» ο» θ' ο» σ< θ'
υ υ υ υ υ υ υ
ο 3 3 3 3 3 3
υ υ υ υ υ υ υ
<0 <0 <0 01 οι 01 οι
θ' ο» σ» σ> σ» ο> θ'
υ и υ υ υ υ υ
« <0 «0 οι οι οι οι
θ' θ' θ' 0» θ' θ' θ'
<0 <0 <0 οι 0! οι οι
υ υ υ υ υ υ υ
ο ο
ο 19 0 и υ 0 и
υ υ ο υ υ υ 0
и υ ο 3 < ο
3 3 <9 υ <9
3 ο и υ 3 0
0 υ ο 2 е υ 3
ο υ υ 2 υ ο 0
ο S 3 <9 3 Ο
«С < 2 2
0 υ 0
5 3 и 3
υ < 3
2 υ ο 0
0 3 < ο
0 «С ο υ
3 υ υ
υ 3 3 3
υ и 3 υ
α ft ω
0 2 2
υ ο 3 2
3 2 «С 4ο
OS to σ» υ V ο» υ υ
<υ O' οι u υ
σ> σ σ» u σ»
υ u υ σ»
υ 01 υ υ υ 3
υ σ· σ· υ 9 υ
σ» υ υ σ» υ 01
υ υ 3 υ οι σ»
3 υ υ 3 σι υ
υ σ· 01 υ υ 01
οι υ σ» 0S οι σ»
θ' 3 υ θ' σ» ΟΙ
υ υ οι υ <0 и
οι οι σ» 0S υ
σ» σ> οι σ»
οι υ υ 0S 0
υ ΟΙ υ ο ο
σ» 0 0
01 0 0 0
и υ 0 0 0 3
υ 0 0 3 0
ω 0 0 ο ft
υ 0 3 ο 0 0
< 0 0 3 2 0
и 0 3 0 2 3
< 0 3 3 2 0
5 3 0 0 2 ο
0 и 3 0 2 3
U 3 0 3 0 3
3 3 0 0 ft
3 3 3 ft ο 0
0 0 3 0 0
0 0 < 0 3 0
3 3 0 ft 3 3
3 3 3 0 0 3
0 ft ft 3 ft
0 0 0 0 2 0
3 3 3 3 0 0
3 3 3 <t 3 и
3 3 3 3 5 3
0 ft ft ft ft 2
0 0 0 0 0
3 3 ft
0 3 2
5 0 0 0
0 < 3 3 0
0 ο 3 0 0 •t
3 0 0 ft 3 0
3 ft 0 0 0 0
< 0 3 0 ft 3
0 3 5 3 0 ft
3 3 0 0 0
3 0 0 0 0
0 0 0 0 0
3 в 3 0 0 0
ft rt ft <
0 0 0 0 0
ft 0 0 o <
0 3 ft ft 3
0 0 0
3 3 ft
ft
Ch σ* σ» σ» Ο» σΐ0 σι σ» σ» σ» σ σι Oh
О» σ> σ» σ* σ» σ· οι σι σ> σ» σ» σ» σι σι Ch
υ υ и υ υ υ υ υ UJ υ υ υ υ υ υ
σ σ» σ» σ» σ* σ» ο» θ' σ» σ» σ> σ» Οι οι
3 3 3 3 3 3 3 3 κ 3 3 3 3 3 3
οι οι οι 0! 03 οι οι οι S -τ οι οι οι οι 01 0!
υ υ υ υ υ υ υ υ >» υ υ υ υ υ υ
οι οι οι .01 οι 0! 01 <σ 0! οι οι οι οι οι
οι ο Ш (Ο ·· « ιΛ
VO Ο Ο Ή ’Γ- α>|«Η
<η Ю «Η «4 «Μ ·—< Ю • 1 1
2 X ΖΖΖΖ ΟΙ σιίσι
Ь Ρ f Ь -□ ω|ω
ОС|100Г-Д«0 *} сч с н Λ
Ш Ci Г- Г— М 1Л t-Ul . · · · m int« N H > rl <N<Hc in
Таблица 4: 2’-0Ме замествания, интернални делеции, ТТА1 и ТТА1. NB
r4 Ci CO ЧГ tn Ш
s £ £ £ £ £
m T* тг ЧГ C
ID io IO IO IO IO ID ID Ю
P P P P P P P P P
Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ-
ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ
IO ID ID ID ID IO IO IO IO
P P P P P P P P P
t- r- r- r- Γ— r- r- r- t-
r- r~ r- t- !— r- r- r- r-
P P P P P
u U U u u
r- r- c- Γ* Γ-
u U U u u
IO IO IO 10 io
P P P P P
r- Γ- Γ- Γ- Γ-
I— Γ- ρ- Γ- Ι-
u Ο υ Ο Ο
r- r- Γ- t- Γ-
Γ- r- Γ- γ- Γ-
10 IO ΙΟ ιο ΙΟ
Γ- 4 < !? <
ΙΟ ο 8 8 8* 8 88 Ο υ
Γ- гЧ «С «С <
ΙΟ «И Ο Ο 0 © © σ Ο
10 10 ΙΟ Ю 10 10 ΙΟ ΙΟ 10
Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ- Γ-
ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ ιο ιο ΙΟ
ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ Ю ΙΟ 10 10 ΙΟ
Ю 10 ΙΟ ΙΟ Μ> 10 ΙΟ 10 ΙΟ
Η Η Η гЧ Η гЧ гЧ гЧ гЧ
in IO Г- CO ci ο •Η Ci m
in in in in in so so SO IO
5Г
гЧ
Ο
o Cl co гЧ
IO f* Cl r4 гЧ Ci η m
in o 0 < σ σ 0 ©
m tn in tn m in in in in
Ci M n m rn <η си CH Cl
r4 ri rt H гЧ pH rH гЧ
£ £ £ £ £ £ £ £ £
4« 4* * V ЧГ *
Cl ci Cl Cl σι σι σι Cl Cl
§ egg 2 Η 2 Еч g 2 Еч
M*
IO
ΤΤΑΪ.ΝΒ: 65 5'-1G667667CG-(CHaCHaO) t-CGUCGCCGU77U667U6UUUU6CU5 >5 UM
Таблица 5: Биологично разпределение на Тс-99гп -ТТА1 и -TTA1.NB mln ТТА1 TTA1.NB min ТТА1 TTA1.NB tumor 2 4.470 ± 0.410 4.510 1 0.300 kidney 2 44.430 ± 4.280 54.470 ± 1.210
5.940 * 0.590 3.020 ± 0.210 10 18.810 1 0.940 14.320 1 2.080
о CD о CO о о 0> CD b- o o co CM
t*· <О 5Г V ХГ 5 co CO O CD CO o> Q o
о о ь- см см о co CO N τ- o O o
о см о о о d d ιο Ν·' o d ο o o o
н •н -н н +1 44 4» 44 44 44 44 +4 44 44 44
о CD а> σ> о о о σ> CM CO CO O o CD
т— ν- co ХГ о> σ> CO CD a N- N. τ-
о ь- ХГ см см co co Ν T- CM CM CM CO o Ο
N ю Τ- о о см о d CD τ- d 'T- o o o
*“ CM
о о Ο о о см о ο o Ο o СМ o o O
т- co CO N. см CD co b- CM (0 CO
Ю о to o X“
44 44 41 44 44 44
O O CO CO CM O
o CD xt s a> 8 CO o
IO CM d o d o
CM o o o o o
X— CD co CM
▼- IO o

Claims (43)

1. Лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин-С, идентифицирани съгласно метода, включващ:
а) взаимодействие на кандидат смес от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет към тенасцин-С спрямо кандидат сместа могат да бъдат отделени от остатъка на кандидат места;
в) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от кандидат сместа;
с) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен афинитет за добиване на смес от нуклеинови киселини, богати на нуклеинови киселини с относително по- висок афинитет и специфичност за свързване към тенасцин-С, където могат да бъдат идентифицирани нуклеиново киселинни лиганди за тенасцин-С.
2. Нуклеиново киселинен лиганд съгласно претенция 1, където кандидат сместа от нуклеинови киселини обхваща едноверижни нуклеинови киселини.
3. Нуклеиново киселинен лиганд съгласно претенция 2, където посочените едноверижни нуклеинови киселини са рибонуклеинови киселини.
4. Нуклеиново киселинен лиганд съгласно претенция 3, където посочената кандидат смес от нуклеинови киселини включва 2’-F (2’-флуоро) модифицирани рибонуклеинови киселини.
5. Пречистен и изолиран несрещащ се в природата нуклеиново киселинен лиганд за тенасцин-С.
6. Пречистен и изолиран несрещащ се в природата нуклеиново киселинен лиганд съгласно претенция 5, където посоченият нуклеиново киселинен лиганд е едноверижен.
7. Пречистен и изолиран несрещащ се в природата нуклеиново киселинен лиганд съгласно претенция 6, където посоченият нуклеиново киселинен лиганд е РНК.
8. Пречистен и изолиран несрещащ се в природата РНК лиганд съгласно претенция 7, където посочения лиганд е включен в 2’-F (2’-флуоро) модифицирани нуклеотиди.
9. Пречистен и изолиран несрещащ се в природата РНК лиганд съгласно претенция 8, където посочения лиганд е избран от групата, състояща се от последователностите, посочени на Таблици 3 и 4 и Фигура 2.
10. Метод за идентифициране на нулеиново киселинни лиганди за тенасцин-С, включващ:
а) взаимодействие на кандидат смес от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет за тенасцин-С спрямо кандидат сместа, може да бъдат отделени от остатъка от кандидат сместа;
в) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от кандидат сместа;
c) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен афинитет за получаване на смес от нуклеинови киселини, богата на нуклеинови киселини с относително по- висок афинитет и специфичност на свързване за тенасцин-С, където нуклеиново киселинния лиганд на тенасцин-С може да бъде идентифициран.
11. Метод съгласно претенция 10, включващ още:
d) повторение на етапите а), в) и с).
12. Метод съгласно претенция 10, където посочената кандидат смес от нуклеинови киселини включва едноверижни нуклеинови киселини.
13. Метод съгласно претенция 12, където посочените едноверижни нуклеинови киселини са рибонуклеинови киселини.
14. Метод съгласно претенция 13, където посочените нуклеинови киселини са 2-F (2’-флуоро) модифицирани рибонуклеинови киселини.
15. Комплекс за приложение в in vivo диагностика, включващ нуклеиново киселинен лиганд за тенасцин-С и маркер.
16. Комплекс съгласно претенция 15, където посоченият енасцин-С нуклеиново киселинен лиганд е идентифициран по метода, включващ:
а) взаимодействие на кандидат смес от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет за тенасцин-С спрямо кандидат сместа, може да бъдат отделени от остатъка от кандидат сместа;
в) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от кандидат сместа;
с) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен афинитет за получаване на смес от нуклеинови киселини, богата на нуклеинови киселини с относително по- висок афинитет и специфичност на свързване за тенасцин-С, където нуклеиново киселинния лиганд на тенасцин-С може да бъде идентифициран.
17. Комплекс съгласно претенция 16, където посочената кандидат смес от нуклеинови киселини включва едноверижни нуклеинови киселини.
18. Комплекс съгласно претенция 17, където посочените едноверижни нуклеинови киселини са рибонуклеинови киселини.
19. Комплекс съгласно претенция 18, където посочената смес от нуклеинови киселини включва 2-F (2’-флуоро) модифицирани рибонуклеинови киселини.
20. Комплекс съгласно претенция 15, където посоченият маркер е избран от групата, състояща се от радиоизотопи, флуорофори, магнитни съединения и биотин.
21. Комплекс съгласно претенция 20, където посочените радиоизотопи са избрани от групата, състояща се от технециум99m (Тс-99т), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125l, 131l,111 In, 32P и 186Re.
22. Комплекс съгласно претенция 21, където посоченият маркер е технециум- 99т.
23. Комплекс съгласно претенция 22 съдържащ още и линкер.
24. Комплекс съгласно претенция 23, където посоченият линкер има структурата
-о
I о _ Р_о μ
о
25. Комплекс съласно претенция 24, където посоченият комплекс е (СН2СН2О)б linker
Всички A’s = 2’- ОМе
Всички Gs, с изключение на означените, са 2’- Оте модифицирани
Всички Gs са 2’- F модифицирани
Всички Us са 2’- F модифицирани
26. Метод за получаване на комплекс, включващ нуклеиново киселинен лиганд за тенасцин-С и маркер, който метод включва:
а) взаимодействие на кандидат смес от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет за тенасцин-С спрямо кандидат сместа, може да бъдат отделени от остатъка от кандидат сместа;
в) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от кандидат сместа;
c) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен афинитет за получаване на смес от нуклеинови киселини, богата на нуклеинови киселини с относително по- висок афинитет и специфичност на свързване за тенасцин-С и
d) ковалентно свързване на посочения идентифициран нуклеиново киселинен лиганд за тенасцин-С с маркер.
27. Метод съгласно претенция 26, където посочения маркер е избран от групата, състояща се от радиоизотопи, флуорофори, магнитни съединения и биотин.
28. Метод съгласно претенция 27, където посочените радиоизотопи са избрани от групата, състояща се от технециум99m (Тс-99т), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18,12Ί, 13Ί,11 Ίη, 32Ρ и 186Re.
29. Метод съгласно претенция 28, където посоченият маркер е Тс-99т.
30. Метод съгласно претенция 29, включващ още и линкер.
31. Комплекс съгласно претенция 30, където посоченият линкер има структурата о
32. Комплекс съгласно претенция 31, където посоченият комплекс е (ΟΗ,ΟΗ,Ο). linker JQ-C ·=2*0Ηθ ’? GTC ο-ρ-ο~·ογΌ δ U-G-3’-3’-T t
. I
Хексиламинов линкер
Всички A’s = 2’- ОМе
Всички Gs, c изключение на означените, са 2’- ОМе модифицирани
Всички Cs са 2’- F модифицирани
Всички Us са 2’- F модифицирани
33. Метод за определяне наличието на заболяване с експресиране на тенасцин-С в биологична тъкан, която може да Ф съдържа това заболяване, включващ:
а) идентифициране на нуклеиново киселинни лиганди от кандидат сместа на нуклеинови киселини, нуклеиново киселинния лиганд е лиганд на тенасцин-С, по метода, включващ (i) контактуване на кандидат сместа от нуклеинови киселини с тенасцин-С, където нуклеинови киселини притежаващи повишен афинитет към тенасцин-С спрямо кандидат сместа може да бъде отделена от остатъка на кандидат сместа;
(ii) отделяне на нуклеиновите киселини с повишен афинитет от остатъка от кандидат сместа;
(iii) амплифициране на нуклеиновите киселини с повишен ефект за получаване на смес от нуклеинови киселини с относително по- висок афинитет и специфичност за свързване към тенасцин-С, чрез който е идентифициран нуклеиново киселинния тенасцин-С;
(b) прикрепване на маркер, който може да бъде използван в in vivo или ex vivo диагностициране към нуклеиново киселинния лиганд идентифициран в етап (iii) за формиране на маркернуклеиново киселинен лиганден комплекс;
(c) излагане на тъкан, която може да съдържа заболяването на въздействието на маркер- нуклеиново киселинен лиганден комплекс; и (d) откриване наличието на маркер- нуклеиново киселинен лиганд в тъканта, чрез която заболяването експресиращо тенасцин-С се идентифицира.
34. Метод съгласно претенция 33, където посоченият маркернулеиново киселинен лиганд съдържа и линкер.
35. Метод съгласно претенция 34, където посоченият маркер е избран от групата, състояща се от радиоизотопи, флуорофои, магнитни съединеия и биотин.
36. Метод съгласно претенция 35, където посочените радиоизотопи са избрани от групата, състояща се от технециум99m (Тс-99т), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18,125l, 131l,111 In, 32P и 186Re.
37. Метод съгласно претенция 36, където посоченият маркер е технециум-99т.
38. Метод съгласно претенция 37, където посоченият линкер е
39. Метод съгласно претенция 38, където посоченият маркер нуклеиново киселинен лиганд е (CHjCHjO), linker
Хексиламинов линкер
Всички A’s = 2’- OMe
Всички Gs, с изключение на означените, са 2’- Оте модифицирани
Всички Gs са 2’- F модифицирани
Всички Us са 2’- F модифицирани
40. Метод съгласно претенция 33, включващ още и присъединяване на терапевтично или диагностично средство към посочения комплекс.
41. Метод съгласно претенция 33, където посоченото заболяване е избрано от групата, състояща се от рак, псориазис и атеросклероза.
42. Метод съгласно претенция 41, където посоченото заболяване е рак.
43. Метод за доставяне на терапевтично средство до заболяването, което се експресира с тенасцин-С, включващ:
ковалентно свързване на нуклеиново киселинен лиганд за тенасцин-С с терапевтично средство за формиране на комплекс, и прилагане на този комплекс на пациент.
BG106361A 1999-07-29 2002-01-29 Лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин - с BG106361A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/364,902 US6232071B1 (en) 1990-06-11 1999-07-29 Tenascin-C nucleic acid ligands
PCT/US2000/002167 WO2001009390A1 (en) 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin-c nucleic acid ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG106361A true BG106361A (bg) 2002-10-31

Family

ID=23436596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106361A BG106361A (bg) 1999-07-29 2002-01-29 Лиганди на нуклеинови киселини за тенасцин - с

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6232071B1 (bg)
EP (1) EP1198589B9 (bg)
JP (1) JP2003505111A (bg)
KR (1) KR100605072B1 (bg)
CN (2) CN1164760C (bg)
AT (1) ATE405675T1 (bg)
AU (1) AU767501C (bg)
BG (1) BG106361A (bg)
BR (1) BR0013170A (bg)
CA (1) CA2380473A1 (bg)
CZ (1) CZ2002365A3 (bg)
DE (1) DE60039986D1 (bg)
DK (1) DK1198589T3 (bg)
EA (1) EA004795B1 (bg)
EE (1) EE200200051A (bg)
ES (1) ES2310989T3 (bg)
HK (1) HK1048499B (bg)
HR (1) HRP20020186A2 (bg)
HU (1) HUP0202221A3 (bg)
IL (2) IL147872A0 (bg)
MX (1) MXPA02000819A (bg)
NO (1) NO20020424L (bg)
NZ (2) NZ516907A (bg)
PL (1) PL201637B1 (bg)
RS (1) RS50426B (bg)
SK (1) SK1222002A3 (bg)
UA (1) UA75578C2 (bg)
WO (1) WO2001009390A1 (bg)
ZA (1) ZA200200747B (bg)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7005260B1 (en) * 2000-01-28 2006-02-28 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
CA2328356A1 (en) 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
DK1401853T3 (da) 2001-05-25 2010-11-01 Univ Duke Modulatorer af farmakologiske midler
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
AU2003247576A1 (en) * 2002-06-18 2003-12-31 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US10100316B2 (en) 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
WO2006093932A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Use of eotaxin as a diagnostic indicator for atherosclerosis and vascular inflammation
UY29460A1 (es) * 2005-04-08 2006-11-30 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
EP1897562A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-12 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labelled with Gallium-68
US8557776B2 (en) 2006-09-08 2013-10-15 Bayer Pharma AG Compounds and methods for 18F labeled agents
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
CN101809167B (zh) * 2007-07-17 2015-04-01 私募蛋白质体公司 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
EP2036981A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labeled with 18F
BRPI1011269A2 (pt) 2009-05-05 2016-09-27 Altermune Technologies Llc imunidade quimicamente programável
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
BR112014014295A2 (pt) * 2011-12-12 2017-06-13 Isis Innovation método para determinar um estado de artrite reumatoide, kit para a determinação o estado de artrite reumatoide erosiva de um indivíduo, usos de tenancina-c, e de uma determinação do nível de tenascina-c, e, métodos para tratar uma condição inflamatória, e uma artrite reumatoide
CN102533772B (zh) * 2011-12-12 2013-10-09 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US6127119A (en) * 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
ATE318832T1 (de) * 1990-06-11 2006-03-15 Gilead Sciences Inc Verfahren zur vervendung von nukleinsäureliganden
US6610841B1 (en) * 1997-12-18 2003-08-26 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide-based prodrugs
EP0572529A4 (en) 1991-02-21 1994-11-02 Gilead Sciences Inc SPECIFIC APTAMER OF BIOMOLECULES AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME.
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5436132A (en) * 1993-02-13 1995-07-25 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Quantitative determination of tenascin as glioma marker
US5859228A (en) * 1995-05-04 1999-01-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
CA2269072C (en) * 1996-10-25 2006-02-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (vegf) nucleic acid ligand complexes
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
IL147872A (en) 2008-06-05
US20030104377A1 (en) 2003-06-05
EP1198589A4 (en) 2003-02-19
DK1198589T3 (da) 2008-11-17
YU6402A (sh) 2005-03-15
AU767501B2 (en) 2003-11-13
NZ528077A (en) 2005-04-29
CN1164760C (zh) 2004-09-01
NO20020424L (no) 2002-03-27
UA75578C2 (en) 2006-05-15
US20060105378A1 (en) 2006-05-18
CN1365395A (zh) 2002-08-21
WO2001009390A1 (en) 2001-02-08
IL147872A0 (en) 2002-08-14
ATE405675T1 (de) 2008-09-15
RS50426B (sr) 2009-12-31
KR100605072B1 (ko) 2006-07-26
MXPA02000819A (es) 2003-07-14
EP1198589B9 (en) 2009-08-12
CA2380473A1 (en) 2001-02-08
HUP0202221A1 (en) 2002-10-28
HUP0202221A3 (en) 2010-01-28
HRP20020186A2 (en) 2004-02-29
EP1198589B1 (en) 2008-08-20
JP2003505111A (ja) 2003-02-12
HK1048499B (zh) 2005-05-13
CZ2002365A3 (cs) 2002-06-12
SK1222002A3 (en) 2002-09-10
BR0013170A (pt) 2002-04-02
AU3351900A (en) 2001-02-19
EA004795B1 (ru) 2004-08-26
AU767501C (en) 2004-06-17
ZA200200747B (en) 2004-01-28
US20040058884A1 (en) 2004-03-25
CN1589908A (zh) 2005-03-09
PL201637B1 (pl) 2009-04-30
NZ516907A (en) 2003-10-31
PL353357A1 (en) 2003-11-17
NO20020424D0 (no) 2002-01-28
CN100558411C (zh) 2009-11-11
KR20020092897A (ko) 2002-12-12
ES2310989T3 (es) 2009-02-01
HK1048499A1 (en) 2003-04-04
EA200200094A1 (ru) 2002-08-29
EP1198589A1 (en) 2002-04-24
DE60039986D1 (de) 2008-10-02
US6232071B1 (en) 2001-05-15
US6596491B2 (en) 2003-07-22
EE200200051A (et) 2003-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU767501C (en) Tenascin-C nucleic acid ligands
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
JP4176466B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド
AU777043B2 (en) Nucleic acid ligands to CD40ligand
US6127119A (en) Nucleic acid ligands of tissue target
ES2426160T3 (es) Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
AU2002224401A1 (en) Nucleic acid ligands to the prostate specific membrane antigen
KR20120028973A (ko) 키마아제에 대한 압타머 및 그 사용
EP2063917A1 (en) Aptamers labelled with gallium-68
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
US7005260B1 (en) Tenascin-C nucleic acid ligands
NO318585B1 (no) Oligonukleotider bestaende av et oligonukleotidradikal og substituenter, fremgangsmate for pavisning av malstrukturer ved hjelp av dem, anvendelse av dem til produksjon av medikamenter og diagnosesett inneholdende dem for pavisning av malstrukturer.
WO2019107532A1 (ja) キマーゼに対するアプタマー及びその使用