CN112105748B

CN112105748B - 测序和生产核酸序列的方法

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Publication number: CN112105748B
Application number: CN201980024852.5A
Authority: CN
Inventors: 朱听; 刘先宇; 姜文君; 王敏
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN112105748A; EP3775264A1; CA3094598A1; EP3775264A4; WO2019193526A1; US20210010078A1

Abstract

提供了测序和生产核酸序列的方法。因此，提供了测序包含L‑核苷酸的核酸序列的方法，包括使所述包含L‑核苷酸的核酸序列经历化学测序方法。也提供了将核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列的方法，包括用硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV（Dpo4）催化所述核糖核酸序列的逆转录。

Description

测序和生产核酸序列的方法

相关申请

本申请要求2018年4月5日提交的美国临时专利申请No. 62/652,915的优先权利益，其内容整体引入本文作为参考。

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及测序和生产核酸序列的方法。

核酸用于各种技术中，作为在细胞内或细胞外发生的生物化学反应的催化剂、抑制剂或刺激物。天然形式的核酸分别包含D-核糖或D-脱氧核糖作为RNA或DNA的糖主链。天然存在的核酸易受降解酶活性的影响，所述降解酶活性显著缩短这些分子在天然环境中的作用。因此，镜像生物学系统为在包含这些酶的生物学环境中发生的许多应用带来了希望，如在医学、药物诊断学、生物技术和农业中。例如，核酸酶-抗性L-DNA适配体被归类为血浆稳定的L-适配体药物^1,2。

然而，这种镜像核酸分子的生产、开发和使用要求灵敏、准确且可重复的方法以验证L-核酸序列的质量、长度和序列。

尽管在DNA测序技术中存在引人注目的进步，但尚未报道用于测序L-DNA的实用方法。大多数常用的通过合成进行测序（sequencing-by-synthesis）的方法是不能利用的，这是因为它们要求能够掺入标记的L-双-脱氧核苷酸三磷酸（L-ddNTPs）或L-脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）的聚合酶。尽管已经开发了一对镜像聚合酶系统，其基于足够小以用于总化学合成的酶，如非洲猪热病病毒聚合酶X（ASFV pol X)⁵和硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）P2 DNA聚合酶IV (Dpo4)^3,4,6，但它们仍然遭受差的保真性和不能掺入标记的ddNTPs或 dNTPs的困扰。下一代纳米孔（nanopore）DNA测序方法原则上可应用于测序镜像DNA，然而，其也要求尚不可获得的特定D-核酸聚合酶或解旋酶以帮助减慢DNA通过孔的运动⁷。

另外的背景技术包括美国专利No: US6605713；加拿大专利No. CA2045891和国际专利申请公开No: WO2010049156。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使所述包含L-核苷酸的核酸序列经历使用选自下述的化学药品的化学测序方法：硫酸二甲酯、甲胺、焦碳酸二乙酯、亚甲蓝、氯钯酸钾、氢氧化钠、四氧化锇、精胺、高锰酸钾、肼、水合肼、盐酸羟胺、焦碳酸二乙酯、甲酸和柠檬酸盐缓冲液。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使包含L-核苷酸的核酸序列经历化学测序方法，其中所述核酸序列长度包含超过120个核苷酸。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使包含L-核苷酸的核酸序列经历化学测序方法，其中所述化学测序方法包括凝胶-电泳以测定核酸序列。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括：

(a) 用5-碘乙酰氨基荧光素在所述包含L-核苷酸的核酸序列的5’末端或3’末端进行标记，从而获得标记的包含L-核苷酸的核酸序列；和

(b) 使所述标记的包含L-核苷酸的核酸序列经历化学测序方法。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了标记包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使用多核苷酸激酶在5’末端标记所述包含L-核苷酸的核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括：

(a) 根据本发明的方法使用多核苷酸激酶标记所述包含L-核苷酸的核酸序列，从而获得标记的包含L-核苷酸的核酸序列；和

根据本发明的一些实施方案，所述化学测序方法包括使用选自硫酸二甲酯、甲胺、焦碳酸二乙酯、亚甲蓝、氯钯酸钾、氢氧化钠、四氧化锇、精胺、高锰酸钾、肼、水合肼、盐酸羟胺、焦碳酸二乙酯、甲酸和柠檬酸盐缓冲液的化学药品。

根据本发明的一些实施方案，所述化学药品选自亚甲蓝、氢氧化钠、盐酸羟胺、甲酸和水合肼。

根据本发明的一些实施方案，所述核酸序列长度包含超过120个核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述核酸序列长度包含超过150个核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述方法包括用荧光素酰胺（fluoresceinamidite）（FAM）、5-碘乙酰氨基荧光素或生物素在5’末端或3’末端标记所述核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述方法包括用荧光素酰胺（FAM）或5-碘乙酰氨基荧光素在5’末端或3’末端标记所述核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述标记在5’末端。

根据本发明的一些实施方案，所述方法包括用多核苷酸激酶在5’末端标记所述核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述标记包括用放射性同位素进行标记。

根据本发明的一些实施方案，所述方法不包括质谱分析法（MS）。

根据本发明的一些实施方案，所述核酸序列包含脱氧核糖核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述核酸序列包含核糖核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述化学测序方法包括：

(a)用标记在多个所述核酸序列分子的5’末端或3’末端标记所述多个分子；

(b)在所述(a)之后使用核碱基（nucleobase）特异性化学试剂部分修饰所述多个分子，从而使得在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子时获得包含所述标记的所述核酸序列的多个片段；

(c)在所述(b)之后在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子；和

(d)根据由所述切割产生且包含所述标记的片段的长度、质量和/或电荷确定所述核酸序列中所述修饰的核碱基位置。

根据本发明的一些实施方案，(b)在至少3个分开的反应混合物中实现，以便生成一组长度相差单个核苷酸的包含所述标记的片段。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了试剂盒，其包括用于包含L-核苷酸的核酸序列的化学测序的化学药品和阳性对照模板，所述阳性对照模板包含包含L-核苷酸的核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，本发明的试剂盒包括用于在所述包含L-核苷酸的核酸序列的5’末端或3’末端标记所述核酸序列的标记。

根据本发明的一些实施方案，本发明的试剂盒包括多核苷酸激酶。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了将核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列的方法，所述方法包括用硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV (Dpo4)催化所述核糖核酸序列的逆转录。

根据本发明的一些实施方案，所述逆转录在有dNTPs的情况下实现。

根据本发明的一些实施方案，所述逆转录在有与所述核糖核酸序列的3’末端杂交的引物的情况下实现。

根据本发明的一些实施方案，所述催化在允许所述核糖核酸序列逆转录的条件下实现。

根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了试剂盒，其包括硫磺矿硫化叶菌P2DNA聚合酶IV (Dpo4) 和阳性对照模板序列，所述阳性对照模板序列包含核糖核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，本发明的试剂盒包括dNTPs。

根据本发明的一些实施方案，本发明的试剂盒包括与包含所述核糖核酸序列的阳性对照模板序列的3’末端杂交的引物。

根据本发明的一些实施方案，所述核糖核酸序列是D-核糖核酸序列且所述Dpo4是L-Dpo4。

根据本发明的一些实施方案，所述核糖核酸序列是L-核糖核酸序列且所述Dpo4是D-Dpo4。

根据本发明的一些实施方案，提供了扩增核糖核酸序列的方法，所述方法包括根据本发明的方法将所述核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，并扩增所述脱氧核糖核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，提供了测序核糖核酸序列的方法，所述方法包括根据本发明的方法将所述核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，并测序所述脱氧核糖核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，测序所述脱氧核糖核酸序列由化学测序方法实现。

根据本发明的一些实施方案，测序根据本发明的方法实现。

根据本发明的一些实施方案，提供了测序包含L-核糖核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括根据本发明的方法将所述包含L-核糖核苷酸的核酸序列逆转录为包含L-脱氧核糖核苷酸的核酸序列，其中所述Dpo4是D-Dpo4，并使所述包含L-脱氧核糖核苷酸的核酸序列经历化学测序方法。

根据本发明的一些实施方案，提供了克隆感兴趣的表达产物的方法，所述方法包括根据本发明的方法将编码所述感兴趣的表达产物的核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，并在宿主细胞中克隆所述脱氧核糖核酸。

根据本发明的一些实施方案，提供了测定细胞的转录物组的方法，所述方法包括根据本发明的方法将在所述细胞中表达的核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，方法包括在逆转录后扩增脱氧核糖核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，通过Dpo4实现扩增。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域中技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明实施方案的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和/或实施例仅仅是举例说明性的，且不意图必定是限制性的。

若干附图图像的简述

在本文中仅仅作为实例参考附图描述了本发明的一些实施方案。现在具体在细节上关于附图，要强调的是所示细节仅仅作为实例，且是为了举例说明性地讨论本发明的实施方案。在这点上，带有附图的说明书使得可以如何实施本发明的实施方案对于本领域技术人员而言显而易见。

在所述附图中：

图1A-D显示了5'-荧光素酰胺（FAM）标记的12-核苷酸（nt）L-DNA寡核苷酸（oligo）（SEQ ID NO: 1）的化学测序。图1A显示了所述12-nt L-DNA寡核苷酸的序列和预测的化学降解模式，切割的核碱基在括号中突出显示，以及对应于图1B中所示的那些的位置的通过PAGE分离的片段。星号表示所述5'-FAM标记。C+T反应通过用50%肼于45℃处理18分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于室温（RT）处理20分钟进行；A+G反应用80%甲酸于室温处理40分钟进行；且G-特异性反应用0.1%（m/v）亚甲蓝于紫外线（UV）下处理2分钟进行。产物通过在FAM模式下扫描的在8 M尿素中的20% PAGE进行分析。图1B是显示化学降解后所述12-nt L-DNA寡核苷酸的变性PAGE分析的FAM模式照片。图1C是所述12-nt L-DNA寡核苷酸的测序层析谱。图1D是显示相同序列（SEQ ID NO: 1）的12-nt D-DNA和L-DNA寡核苷酸的CD谱的图。

图2是显示FAM和亚甲蓝的吸收谱的图。吸收数据通过UV-VIS分光光度计测量。

图3A-C显示了5'-FAM标记的12-nt D-DNA寡核苷酸（SEQ ID NO: 1）的化学测序。图3A显示了所述12-nt D-DNA寡核苷酸的序列和预测的化学降解模式，切割的核碱基在括号中突出显示，以及对应于图3B中所示的那些的位置的通过PAGE分离的片段。星号表示所述5'-FAM标记。C+T反应通过用50%肼于45℃处理18分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于室温处理20分钟进行；A+G反应用80%甲酸于室温处理40分钟进行；G-特异性反应用亚甲蓝于紫外线下于室温处理2分钟进行。产物通过在FAM模式下扫描的在8 M尿素中的20% PAGE进行分析。图3B是显示化学降解后所述12-nt D-DNA寡核苷酸的变性PAGE分析的FAM模式照片。图3C是所述12-nt D-DNA寡核苷酸的测序层析谱。

图4A-D显示了5'-FAM标记的11-nt L-DNA寡核苷酸（SEQ ID NO: 2）的化学测序。图4A 显示了所述11-nt L-DNA寡核苷酸的序列和预测的化学降解模式，切割的核碱基在括号中突出显示，以及对应于图4B中所示的那些的位置的通过PAGE分离的片段。星号表示所述5'-FAM标记。C+T反应通过用50%肼于45℃处理18分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于室温处理20分钟进行；A+G反应用80%甲酸于室温处理40分钟进行；G-特异性反应用0.1%（m/v）亚甲蓝于紫外线下于室温处理2分钟进行。产物通过在FAM模式下的在8M尿素中的20% PAGE进行分析。图4B是显示化学降解后所述11-nt L-DNA寡核苷酸的变性PAGE分析的FAM模式照片。图4C是所述11-nt L-DNA寡核苷酸的测序层析谱。图4D是显示相同序列（SEQ ID NO: 2）的11-nt D-DNA和L-DNA寡核苷酸的CD谱的图。

图5A-C显示了5'-FAM标记的25-核苷酸（nt）L-DNA寡核苷酸（oligo）（SEQ ID NO:3）的化学测序。图5A 是显示化学降解后所述25-nt L-DNA寡核苷酸的变性PAGE分析的FAM模式照片。C+T反应通过用50%肼于45℃处理10分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl(pH 6.0)于室温处理10分钟进行；A+G反应用66%甲酸于室温处理10分钟进行；G-特异性反应用0.1%（m/v）亚甲蓝于紫外线下于室温处理4分钟进行。产物通过在FAM模式下扫描的在8M尿素中的20% PAGE进行分析。图5B是所述25-nt L-DNA寡核苷酸的测序层析谱。图5C是显示相同序列（SEQ ID NO: 3）的25-nt D-DNA和L-DNA寡核苷酸的CD谱的图。

图6A-C显示了5'-FAM标记的55-nt L-DNA适配体（SEQ ID NO: 4）的化学测序。图6A 是所述55-nt L-DNA适配体的Mfold-预测的二级结构²⁰。星号表示5'-FAM标记。图6B是显示相同序列（SEQ ID NO: 4）的55-nt D-DNA和L-DNA适配体的CD谱的图。图6C显示了通过对应于测定的序列的那些的4种不同颜色显示的用于在4部分中测序L-DNA的多重加载策略。C+T反应通过用50%肼于45℃处理5分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于90℃处理1分钟进行；A+G反应用66%甲酸于室温处理3分钟进行；A>C反应用NaOH于90℃处理12分钟进行。产物通过在FAM模式下扫描的在8 M尿素中的10%或20% PAGE进行分析。

图7A-D显示了在通过天然Dpo4-5m及其突变体（Dpo4-6m-Y12A、Dpo4-6m-Y12G、Dpo4-6m-Y12S）的引物延伸反应中的D-引物、模板和dNTPs或NTPs的组合。图7A是显示利用DNA引物、DNA模板和dNTPs的依赖于DNA的DNA聚合酶活性测定的结果的PAGE照片。图7B是显示利用RNA引物、DNA模板和NTPs的依赖于DNA的RNA聚合酶活性测定的PAGE照片。图7C是显示利用DNA引物、RNA模板和dNTPs的依赖于RNA的DNA聚合酶活性测定的结果的PAGE照片。图7D是显示利用RNA引物、RNA模板和NTPs的依赖于RNA的RNA聚合酶活性测定的结果的PAGE照片。所有引物反应都于65℃进行1小时实现。NC表示没有酶的阴性对照。

图8显示了通过d-Dpo4-5m对FAM-标记的46-nt L-核酶RNA（SEQ ID NO: 5）的逆转录。所示的是PAGE照片，其显示通过在有L-dNTPs的情况下用合成的D-Dpo4-5m于65℃催化与L-核酶RNA模板退火的L-DNA引物12和24小时获得的5'-FAM标记的L-DNA的全长延伸。NC表示没有d-酶的阴性对照。

图9A-B显示了5’FAM标记的120-nt L-5S DNA（SEQ ID NO: 25）的化学测序。图9A是显示由d-Dpo4-5m PCR扩增所述120-nt L-5S DNA的琼脂糖凝胶照片。图9B显示了通过对应于测定的序列的那些的4种不同颜色显示的用于在4部分中测序L-DNA的多重加载策略。C+T反应通过用50%肼于45℃处理2.5分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于90℃处理25秒进行；A+G反应用66%甲酸于室温处理2分钟进行；A>C反应用NaOH于90℃处理5分钟进行。产物通过在FAM模式下扫描的在8 M尿素中的8%、10%或20% PAGE进行分析。

图10显示了由d-Dpo4-5m对120-nt L-核酶RNA（SEQ ID NO：26）的逆转录。显示的是PAGE照片，其显示了通过在有L-dNTPs的情况下用合成的D- Dpo4-5m于65℃催化退火至5'-FAM-标记的L-核酶RNA模板（SEQ ID NO：26）的5'-Cy5标记的L-DNA引物（SEQ ID NO：27）36小时而获得的5'-Cy5-标记的L-DNA的全长延伸。在所示的场合，逆转录产物用天然DNA酶I或RNA酶H进一步处理。如所示的，产物通过在FAM或Cy5模式下扫描的在8 M尿素中的12％变性PAGE进行分析。在120-nt靶带以下可以观察到部分延伸的L-DNA产物。由于D-Dpo4-5m将非模板核苷酸添加到3'-末端，所以L-RNA模板和部分逆转录的L-DNA产物被进一步延伸。

图11是逆转录的5'-Cy5-标记的L-DNA（图10中描述的）与通过在有5'-Cy5-标记的引物的情况下使用Q5高保真性DNA聚合酶的PCR制备的具有相同长度和序列的5'-Cy5-标记的D-DNA标记（SEQ ID NO：28）的并列PAGE的照片。

图12显示了从多个循环取样的由D-Dpo4-5m对逆转录的12-nt L-DNA（图10中所述）的PCR扩增。扩增PCR产物，在所示的场合用天然DNA酶I处理，并通过GoldView染色的3％筛分型琼脂糖凝胶电泳进行分析。循环数显示在泳道上方；NC1表示没有逆转录产物的阴性对照；NC2表示没有聚合酶的阴性对照；且M表示DNA标记。

图13A-C显示了76-nt L-tRNA（SEQ ID NO：31）的逆转录、PCR扩增和测序。图13A是显示由合成的D-Dpo4-5m催化的14-nt 5'-FAM-标记的DNA引物（SEQ ID NO：32）于65℃在合成的76-nt L-tRNA（SEQ ID NO：31）上延伸达最多到24小时的PAGE照片。在所示的场合，逆转录的产物用天然DNA酶I进一步处理。通过在8M尿素中的12％变性PAGE分析产物。图13B显示了从多个循环取样的由D-Dpo4-5m对图13A中所示的逆转录的产物的PCR扩增。在所示的场合，将镜像PCR产物用天然DNA酶I进一步处理。通过3％筛分型琼脂糖凝胶电泳分析产物，并通过GoldView染色。循环数显示在泳道上方；NC1表示没有逆转录产物的阴性对照；NC2表示没有聚合酶的阴性对照；且M表示DNA标记。图13C显示了图13B中描述的扩增的产物的化学测序。显示了通过对应于测定的序列的那些的两种不同颜色显示的用于在两部分中对F-DNA进行测序的多重加载策略。C+T反应通过用50%肼于45℃处理2.5分钟进行；C-特异性反应用4 M NH₂OH-HCl (pH 6.0)于90℃处理25秒进行；A+G反应用66%甲酸于室温处理2分钟进行；A>C反应用NaOH于90℃处理5分钟进行。产物分别通过在8 M尿素中的12%或20% 变性PAGE进行分析，并在FAM模式下扫描。

发明具体实施方案描述

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明不必定将其应用限于在下述描述中阐述或通过实施例例示的细节。本发明能够有其他实施方案或能够以各种方式实践或实施。

用于医学、诊断学和农业的镜像核酸的开发面临缺乏灵敏、准确和可重复的L-核酸测序技术的关键障碍。

当将本发明变成实践时，本发明人现已开发了用于通过化学测序方法测序镜像核酸的实用方法。

如在下文及接下来的实施例部分中举例说明的，本发明人表明他们开发的化学测序方法使得能够准确测序若干L-DNA序列，通过所述方法，由非手性化学药品修饰末端标记的L-DNA中的具体核碱基（例如，肼用于C+T反应，盐酸羟胺用于C-特异性反应，甲酸用于A+G反应，且紫外线（UV）照射下的亚甲蓝用于G-特异性反应或NaOH用于A>C反应），继之以通过用哌啶处理靠近所述修饰的位点的链裂开，所获得的片段化产物使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的分离，包含末端标记的带的显示和测序层析谱的生成（SEQ ID NOs: 1-4，实施例1，图1A-D，2，3A-C，4A-C，5A-C，6A-C，9A-B)。

此外，本发明人表明D-RNA和L-RNA序列两者都可分别使用L-Dpo4和D-Dpo4由热稳定的硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV（Dpo4）逆转录为DNA（实施例2，图7A-D、8、10和11）。因此，所获得的DNA可以进一步用于多种应用，例如但不限于扩增、测序、克隆和单细胞转录物组分析（实施例2，图12和13A-C）。

因此，根据本发明的第一方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使所述包含L-核苷酸的核酸序列经历使用选自下述的化学药品的化学测序方法：硫酸二甲酯、甲胺、焦碳酸二乙酯、亚甲蓝、氯钯酸钾、氢氧化钠、四氧化锇、精胺、高锰酸钾、肼、水合肼、盐酸羟胺、焦碳酸二乙酯、甲酸和柠檬酸盐缓冲液。

根据本发明的可供选择的或另外的方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使包含L-核苷酸的核酸序列经历化学测序方法，其中所述核酸序列长度包含超过120个核苷酸。

根据本发明的可供选择的或另外的方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括使包含L-核苷酸的核酸序列经历化学测序方法，其中所述化学测序方法包括凝胶-电泳以测定所述核酸序列。

根据本发明的可供选择的或另外的方面，提供了测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括：

(a) 使用多核苷酸激酶在所述包含L-核苷酸的核酸序列的5’末端进行标记，从而获得标记的包含L-核苷酸的核酸序列；和

如本文所使用的，术语“核苷酸”指天然存在的D-核苷酸、镜像核苷酸（即L-核苷酸）和具有修饰的糖的核苷酸类似物，其包含腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）核碱基。

根据具体实施方案，所述核苷酸包含核糖核苷酸。

如本文所使用的，术语“核糖核苷酸”指具有核糖作为其糖主链的核苷酸。

根据具体实施方案，所述核苷酸包含脱氧核糖核苷酸。

如本文所使用的，术语“脱氧核糖核苷酸”指具有脱氧核糖作为其糖主链的核苷酸。

如本文所使用的，在本文中可互换使用的术语“核酸序列”、“核酸分子”或“多核苷酸”指单链或双链核酸序列，其中核苷酸在链中通过一个核苷酸的糖和另一个的磷酸之间的至少一个共价键相互连接，从而导致交替的糖-磷酸主链。

根据具体实施方案，所述核酸序列为包含核糖核苷酸的核酸序列（例如，RNA序列）、包含脱氧核糖核苷酸的核酸序列[例如，DNA或互补多核苷酸序列（cDNA）]或复合核酸序列（例如，上述的组合）的形式。

根据具体实施方案，所述核酸序列包含核糖核苷酸。

根据具体实施方案，所述核酸序列由核糖核苷酸组成。

根据具体实施方案，所述核酸序列包含脱氧核糖核苷酸。

根据具体实施方案，所述核酸序列由脱氧核糖核苷酸组成。

根据具体实施方案，所述核酸序列是单链核酸序列。

根据具体实施方案，所述核酸序列是双链核酸序列。

根据具体实施方案，所述核酸序列包含D-核苷酸。

根据具体实施方案，所述核酸序列由D-核苷酸组成。

根据具体实施方案，所述核酸序列包含L-核苷酸。

根据具体实施方案，所述核酸序列由L-核苷酸组成。

根据具体实施方案，所述核酸序列由全部为L-异构体的核糖核苷酸组成。

根据具体实施方案，所述核酸序列由全部为L-异构体的脱氧核糖核苷酸组成。

根据具体实施方案，本发明的核酸序列为至少10核苷酸长、至少20核苷酸长、至少50核苷酸长、至少100核苷酸长、至少120核苷酸长、至少150核苷酸长、至少200核苷酸长，各可能性代表本发明的独立实施方案。根据特定实施方案，所述核酸序列为约120核苷酸长。根据特定实施方案，所述核酸序列为约150核苷酸长。根据特定实施方案，所述核酸序列为约200核苷酸长。根据特定实施方案，所述核酸序列长度包含超过120个核苷酸。根据特定实施方案，所述核酸序列长度包含超过150个核苷酸。根据再另一个实施方案，所述核酸序列不长于500核苷酸长。根据再另一个实施方案，所述核酸序列不长于1000核苷酸长。根据另一个具体实施方案，所述核酸序列为10 – 200、10 – 500、50 – 200、50 – 500、100 – 200、100 – 500、120 – 200、120 – 500、150 – 200或150 – 500核苷酸长。

根据具体实施方案，所述核酸序列是适配体、spiegelmer、核酶、spiegelzyme、反义分子、siRNA分子、shRNA、miRNA或诱饵分子（decoy molecule）。

根据具体实施方案，所述测序方法包括测序或从头测序。

由于包含L-核苷酸的核酸序列不是天然存在的，所以根据本发明的具体实施方案，所述核酸序列通过本领域已知的任何方法合成，如酶促合成或固相合成。实施固相合成的设备和试剂可商购自例如Applied Biosystems。也可以采用关于这种合成的任何其他方式；核酸序列的实际合成完全在本领域技术人员能力范围内，且可以经由确定的方法学实现，如在例如J. Sambrook等人，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"，1989，第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York，N.Y.；"PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications"，1990，M. A. Innis (Ed.)，Academic Press: NewYork，N.Y.；P. Tijssen "Hybridization with Nucleic Acid Probes--LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II)"，1993，Elsevier Science；"PCR Strategies"，1995，M. A. Innis (Ed.)，Academic Press: NewYork，N.Y.；和"Short Protocols in Molecular Biology"，2002，F. M. Ausubel (Ed.)，第5版，John Wiley & Sons: Secaucus，N.J.；S. A. Narang等人，Meth. Enzymol. 1979，68: 90-98；E. L. Brown等人，Meth. Enzymol. 1979，68: 109-151；E. S. Belousov等人，Nucleic Acids Res. 1997，25: 3440-3444；D. Guschin等人，Anal. Biochem. 1997，250:203-211；M. J. Blommers等人，Biochemistry，1994，33: 7886-7896；和K. Frenkel等人，Free Radic. Biol. Med. 1995，19: 373-380；以及美国专利No. 4,458,066中详述的。

例如，可以使用基于亚磷酰胺方法的自动固相程序制备核酸序列。在这种方法中，每个核苷酸单独添加到生长中的寡核苷酸链的5'-端，所述生长中的寡核苷酸链在3'-端附着于固相支持体。所添加的核苷酸的形式为三价的3'-亚磷酰胺，其通过在5'-位置的二甲氧三苯甲基（或DMT）基团被保护免于聚合。在碱诱导的亚磷酰胺偶联后，温和氧化以给出五价磷酸三酯中间体以及DMT去除提供了用于寡核苷酸延长的新位点。生成的核酸序列然后从固相支持体切下，并用氢氧化铵脱保护磷酸二酯和环外氨基。这些合成可以在寡核苷酸合成仪上进行，如可商购自Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City，Calif.)、DuPont (Wilmington, Del.)或Milligen (Bedford, Mass.)的那些。可供选择地，所述核酸序列可从本领域众所周知的多个商业来源定制或订购，所述商业来源包括，例如，Midland Certified Reagent Company (Midland，Tex.)、ExpressGen, Inc.(Chicago, Ill.)、Operon Technologies, Inc. (Huntsville, Ala.)以及许多其他公司。

在必需或期望的情况下，所述核酸序列的纯化可通过本领域众所周知的多种方法的任一种执行。核酸序列的纯化一般通过天然丙烯酰胺凝胶电泳、通过如例如J. D.Pearson和F. E. Regnier (J. Chrom.，1983，255: 137-149)所述的阴离子交换HPLC或通过反相HPLC(G. D. McFarland和P. N. Borer，Nucleic Acids Res.，1979，7: 1067-1080)执行。

根据具体实施方案，可以修饰所述核酸序列以含有一个或多个另外共价连接的（直接或利用接头）部分，如，例如，多肽（例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸）、碳水化合物、聚乙二醇（PEG）、羟乙基淀粉（HES）、嵌入剂（如，吖啶、补骨脂素）、螯合剂（如，金属、放射性金属、铁、氧化性金属）和烷化剂（alkylators）。

此外，根据具体实施方案，也可修饰本发明的核酸序列以含有标记，如放射性同位素（如^[125]碘）、发磷光的化学药品、化学发光化学药品、荧光化学药品（荧光团）、酶、荧光多肽、发色团、亲和标签（或结合对的成员）、质量标签、亲脂标签和可通过正电子发射断层显象（PET）或磁共振成像（MRI）检测的分子（造影剂）。

根据具体实施方案，所述标记是荧光化学药品（荧光团）。

合适的荧光团的实例包括，但不限于荧光素酰胺（FAM）、5-碘乙酰氨基荧光素、藻红蛋白（PE）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy-chrome、罗丹明、德克萨斯红等。对于关于荧光团选择、将荧光团连接至各种类型的分子的方法的额外指导，参见Richard P. Haugland，“Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals1992–1994”，第5版，Molecular Probes, Inc. (1994)；授予Oncoimmunin Inc.的美国专利No. 6,037,137；Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press New York，N.Y. (1995)；Kay M.等人，1995. Biochemistry 34:293；Stubbs等人，1996.Biochemistry 35:937；Gakamsky D.等人，“Evaluating Receptor Stoichiometry byFluorescence Resonance Energy Transfer,” in “Receptors: A PracticalApproach,” 第2版，Stanford C.和Horton R. (eds.)，Oxford University Press，UK.(2001)；授予Targesome, Inc.的美国专利No. 6,350,466。

根据具体实施方案，所述标记包含荧光素酰胺（FAM）或5-碘乙酰氨基荧光素。

根据具体实施方案，所述标记包含放射性同位素。

根据其他具体实施方案，所述标记是亲和标签。

所述亲和标签（或结合对的成员）可以是例如由对应的抗体可确定的抗原[例如，可由抗-DIG抗体确定的洋地黄毒苷（DIG）]、具有针对链霉抗生物素蛋白的高亲和力的生物素、可结合第二寡核苷酸的寡核苷酸、结合钙调蛋白结合肽的钙调蛋白、结合CibraconBlue的清蛋白、结合金属螯合支持体的金属螯合剂。

根据具体实施方案，所述标记包含生物素。

根据具体实施方案，所述标记直接连接至所述核酸序列（例如，在5’末端或3’末端）。

根据其他具体实施方案，所述标记间接（例如，使用接头）连接至所述核酸序列（例如，在5’末端或3’末端）。

根据具体实施方案，所述标记连接至所述核酸序列的5’末端或3’末端。

根据具体实施方案，所述标记连接至所述核酸序列的5’末端。

根据另一个具体实施方案，所述标记连接至所述核酸序列的3’末端。

可以采用本领域中广泛实践的各种方法以将所述标记附着至本发明的所述核酸序列。

所述标记可以在合成期间或在合成后间接掺入所述核酸序列中。可供选择地或任选地，所述标记可以在实现本发明的方法之前或之后掺入所述核酸序列中。

因而，根据具体实施方案，所述方法包括在使所述核酸序列经历化学测序之前在5’末端或3’末端标记所述核酸序列，从而获得标记的包含L-核苷酸的核酸序列。

根据具体实施方案，所述方法包括用荧光素酰胺（FAM）、5-碘乙酰氨基荧光素或生物素在5’末端或3’末端标记所述核酸序列。

根据另一个具体实施方案，所述方法包括用荧光素酰胺（FAM）或5-碘乙酰氨基荧光素在5’末端或3’末端标记所述核酸序列。

根据具体实施方案，所述方法包括用多核苷酸激酶在5’末端标记所述核酸序列。

如本文所使用的，术语“多核苷酸激酶（PNK）”，E.C. No. 2.7.1.78，指这样的酶，其催化γ-磷酸从ATP转移到包含L-核苷酸的核酸序列5’末端的游离羟基端，从而导致产生可使用例如放射性同位素进行末端标记的产物。根据具体实施方案，所述多核苷酸激酶指T4噬菌体多核苷酸激酶或T7噬菌体多核苷酸激酶。

多核苷酸激酶可商购自例如BioLabs、Promega、Thermo Fisher Scientific。

根据具体实施方案，所述多核苷酸激酶包含L-氨基酸。

根据具体实施方案，所述多核苷酸激酶包含D-氨基酸。

根据具体实施方案，所述多核苷酸激酶由D-氨基酸组成。

根据具体实施方案，其中所述核酸序列是双链核酸序列，本发明的方法可包括所述双链核酸序列的变性。变性步骤可以在任何步骤中实现（例如，在测序前、在扩增之前或之后、在克隆前、在逆转录后）。变性步骤通常包括将所述双链核酸序列加热至升高的温度并将其在所述升高的温度维持足以使反应混合物中存在的任何双链核酸解离的时间段。为了变性，反应混合物的温度通常升高到并维持于范围为约85℃-约100℃、通常约90℃-约98℃且更通常约93℃-约96℃的温度达范围为3-240秒、3-180秒、2-120秒、100-180秒的时间段。

根据具体实施方案，本发明的所述方法也包含载体核酸序列。

所述载体核酸序列可以是任何未标记的核酸序列，例如，但不限于质粒或基因组DNA。

根据具体实施方案，所述载体核酸序列是未标记的基因组DNA。根据具体实施方案，所述载体是未标记的大肠杆菌（E. coli）基因组DNA。

根据具体实施方案，所述载体浓度为至少1 µg/µl。

根据具体实施方案，使所述核酸序列经历化学测序方法。

如本文所使用的，术语“化学测序”指利用化学药品而不是酶以产生所述核酸序列的不同大小的片段的测序方法，所述片段均具有相同的5’-末端或3’末端。

根据具体实施方案，化学药品是非手性的[即，对于实现反应不依赖于试剂的手性（即，D或L）]。

根据具体实施方案，所述化学测序方法利用所述核酸序列的磷酸二酯主链的非特异性（即，随机）切割，例如，通过酸水解、酸（例如甲酸）、在生理学pH的多胺；如例如在Shapiro & Danzig, 1972、Farand & Beverly, 2008、Komiyama & Yoshinari, 1997中所公开的。

根据具体实施方案，所述化学测序方法利用核碱基-特异性的化学药品。

可用于本发明具体实施方案的核碱基-特异性的化学药品的非限制性实例包括，但不限于硫酸二甲酯、甲胺、焦碳酸二乙酯、亚甲蓝、氯钯酸钾、氢氧化钠、四氧化锇、精胺、高锰酸钾、肼、水合肼、盐酸羟胺、焦碳酸二乙酯、甲酸和柠檬酸盐缓冲液。

根据具体实施方案，所述化学药品选自亚甲蓝、氢氧化钠、盐酸羟胺、甲酸和水合肼。

根据具体实施方案，所述化学侧使用在多个反应容器中的多种反应混合物实现，从而使得每种反应混合物代表所述核酸序列片段的不同群体。

根据具体实施方案，所述化学测序在至少3种分开的反应混合物中实现。

根据具体实施方案，所述化学测序在至少4种分开的反应混合物中实现。

根据具体实施方案，所述多种反应混合物的每一种用对1-2种核碱基特异性的化学药品实现（即，可以修饰1-2种核碱基）。

因而，根据具体实施方案，所述化学测序方法包括C+T修饰反应、C-特异性修饰反应、A+G修饰反应和G-特异性修饰反应。

根据其他具体实施方案，所述化学测序方法包括C+T修饰反应、C-特异性修饰反应、A+G修饰反应和A>C修饰反应。

根据具体实施方案，所述化学测序方法包括T-特异性修饰反应。

C+T修饰反应化学药品的非限制性实例包括水合肼或肼。

C-特异性修饰反应的非限制性实例包括水合肼+盐或盐酸羟胺。

A+G修饰反应的非限制性实例包括焦碳酸二乙酯pH 5、甲酸或柠檬酸盐缓冲液pH4。

G-特异性修饰反应的非限制性实例包括硫酸二甲酯pH 7.0、甲胺+UV、焦碳酸二乙酯pH 8或亚甲蓝+UV。

A>C修饰反应的非限制性实例包括硫酸二甲酯+酸或碱、氯钯酸钾或氢氧化钠。

T-特异性修饰反应的非限制性实例包括四氧化锇、精胺+UV或高锰酸钾。

U+C修饰反应化学药品的非限制性实例包括水合肼或肼。

U特异性修饰反应的非限制性实例包括盐酸羟胺pH 10。

根据具体实施方案，所述化学测序方法包括使用肼的C+T修饰反应、使用盐酸羟胺的C-特异性修饰反应、使用甲酸的A+G修饰反应和使用亚甲蓝+UV的G-特异性修饰反应。

根据具体实施方案，所述化学测序方法包括使用肼的C+T修饰反应、使用盐酸羟胺的C-特异性修饰反应、使用甲酸的A+G修饰反应和使用氢氧化钠的A>C修饰反应。

根据具体实施方案，所述修饰反应在允许发生所述修饰的条件（例如，温度、缓冲液、盐、离子强度、pH和时间）下连同任何额外的反应试剂实现。

根据具体实施方案，所述修饰反应通过部分修饰本发明所述核酸序列的多个分子实现。

如本文所使用的，术语“部分修饰”指用化学药品部分修饰本发明所述核酸序列的多个分子，从而使得在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子时，获得具有完整的5’末端或3’末端的不同大小和组成的多个片段。

根据具体实施方案，所述部分修饰是这样的，从而使得在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子时，获得具有完整的5’末端或3’末端的核酸序列的所有可能片段。

根据具体实施方案，使用多种反应混合物实现所述修饰反应，从而在切割后，获得长度相差单个核苷酸的包含完整5’末端或3’末端的一组片段。

测定获得这种切割模式的合适条件完全在本领域技术人员的能力内。

因而，例如，所述修饰反应可以在多种标准缓冲液中实现，例如，但不限于伯烷基胺，如TRIS（三(羟甲基)氨基甲烷），仲胺，如Tricine（N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸），叔胺如三乙胺、Bis-Tris（双(2-羟乙基)-亚氨基-三(羟甲基)-甲烷），多胺如亚精胺、HEPES（4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸）和PIPES（哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)，季盐离子如四丁铵和四乙铵。含有芳族胺如咪唑的缓冲液也是本领域中已知的。这种缓冲液可以与盐酸、氢氟酸、氢溴酸、磷酸、柠檬酸、邻苯二甲酸、酒石酸、硼酸和本领域已知的其他酸一起使用。其他含有碱金属的合适缓冲液/溶液也是本领域中已知的。其实例是氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、硼酸盐和乙酸盐。所述反应可以在有但不限于Mg⁺²、Ca⁺²、Be⁺²、Ba⁺²、Fe⁺²、Zn⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Cd⁺²、Sr⁺²、Ni⁺²、Co⁺²、Pb⁺²的情况下实现。

根据具体实施方案，所述修饰反应的温度为0 - 150℃，更优选10 - 100℃。

根据具体实施方案，所述修饰反应在15 – 25℃实现。

根据具体实施方案，所述C-特异性修饰反应和/或所述A>C修饰反应在80 – 100℃实现。

根据具体实施方案，所述C-特异性修饰反应和/或所述A>C修饰反应在约90℃实现。

根据具体实施方案，所述pH为1 – 15或4 - 10。

根据具体实施方案，所述C-特异性修饰反应在4-8、4-7、5-7、4-6或5-6的pH实现。

根据具体实施方案，所述C-特异性修饰反应在pH 6实现。

根据具体实施方案，使所述修饰反应发生0.1和60分钟、1 – 60分钟、2 – 60分钟、2 – 40分钟。

根据具体实施方案，使所述C+T修饰反应发生5 – 20分钟。

根据具体实施方案，使所述C-特异性修饰反应发生30 – 60秒。

根据具体实施方案，使所述C-特异性修饰反应发生5 – 30分钟、5 – 20分钟、10 –30分钟、10 -20分钟。

根据具体实施方案，使所述C-特异性修饰反应发生约10分钟。

根据具体实施方案，使所述C-特异性修饰反应发生约20分钟。

根据具体实施方案，使所述A+G修饰反应发生1 – 60分钟、1 – 50分钟、1 – 40分钟、3 – 40分钟。

根据具体实施方案，使所述A+G修饰反应发生约3分钟。

根据具体实施方案，使所述A+G修饰反应发生约10分钟。

根据具体实施方案，使所述A+G修饰反应发生约30分钟。

根据具体实施方案，使所述G-特异性修饰反应于0.5 – 10分钟、1 – 10分钟、1 –5分钟发生。

根据具体实施方案，使所述G-特异性修饰反应于约2分钟发生。

根据具体实施方案，使所述A>C修饰反应于1 – 20分钟、5 – 20分钟、10 – 20分钟发生。

根据具体实施方案，使所述A>C修饰反应发生约12分钟。

根据具体实施方案，所述修饰反应中所述核酸序列的浓度为0.1 – 100 pmol、1 –100 pmol、10 – 100 pmol。

根据具体实施方案，所述修饰反应中所述核酸序列的浓度为约20 pmol。

根据具体实施方案，所述核酸序列溶解于水中。

修饰条件的非限制性实例公开于随后的实施例部分的材料和方法以及表2中，其充当本申请说明书的不可或缺的一部分。

一般，个别分子是否在每个核酸分子的单个核苷酸处或每个核酸分子的多个核苷酸处被修饰是不相干的，只要总体切割保证了所述核酸序列的多个片段（优选所有可能的片段）的体现。

根据具体实施方案，调整所述修饰反应条件以产生在所述核酸序列的多个分子的每一个中的单个核苷酸的修饰。

如果产生单个切割位点，那么获得两个具体片段：一个具有完整的5'-末端且一个具有完整的3'-末端。如果沿着所述核酸分子的主链产生多个切割位点，那么获得至少3个片段：一个具有完整的5'-末端、一个具有完整的3'-末端以及至少一个内部片段。因而，一般5’末端或3’末端用作进一步分析的参考点。

因此，根据具体实施方案，经历测序方法的所述核酸序列包含在充当标记部分的5’末端或3’末端处的修饰。这种标记和标记方法是本领域众所周知的，且在上文中进一步描述。

核苷酸修饰后，通过在靠近由修饰反应产生的修饰的核苷酸处水解所述核酸序列的磷酸二酯主链（本文中称为切割反应）使所述核酸序列片段化。

所述切割反应可以用任何能够在靠近由修饰反应产生的修饰的核苷酸处特异性水解所述核酸序列的磷酸二酯主链而不在靠近未由修饰反应修饰的核苷酸处水解磷酸二酯主链的试剂实现。这种试剂包括，但不限于热，二价阳离子，碱水解，酸水解，氧化剂，还原剂，电离辐射，如X-射线、紫外线、γ-射线。

根据具体实施方案，所述切割反应用哌啶实现。

根据具体实施方案，所述切割反应在允许发生在靠近所述修饰的核苷酸处水解所述核酸序列的磷酸二酯主链的条件（例如，温度、缓冲液、盐、离子强度、pH和时间）下连同任何额外的反应试剂实现。

测定合适条件完全在本领域技术人员的能力内。

因而，例如，所述切割反应可以在多种标准缓冲液中实现，例如，但不限于伯烷基胺，如TRIS（三(羟甲基)氨基甲烷），仲胺，如Tricine（N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸），叔胺如三乙胺、Bis-Tris（双(2-羟乙基)-亚氨基-三(羟甲基)-甲烷），多胺如亚精胺、HEPES（4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸）和PIPES（哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)，季盐离子如四丁铵和四乙铵。含有芳族胺如咪唑的缓冲液也是本领域中已知的。这种缓冲液可以与盐酸、氢氟酸、氢溴酸、磷酸、柠檬酸、邻苯二甲酸、酒石酸、硼酸和本领域已知的其他酸一起使用。其他含有碱金属的合适缓冲液/溶液也是本领域中已知的。其实例是氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、硼酸盐和乙酸盐。所述反应可以在有但不限于Mg⁺²、Ca⁺²、Be⁺²、Ba⁺²、Fe⁺²、Zn⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Cd⁺²、Sr⁺²、Ni⁺²、Co⁺²、Pb⁺²的情况下实现。

根据具体实施方案，所述切割反应的温度为0 - 150℃、10 - 100℃、10 - 100℃或约90℃。

根据具体实施方案，所述pH为1 – 15或4 - 10。

根据具体实施方案，使所述反应发生1 – 120分钟、1 – 60分钟、10 – 60分钟、30– 50分钟。

根据具体实施方案，哌啶的浓度为0.1 – 100 M、1 – 100 M、0.1 – 10 M、1 – 10M或约1 M。

根据具体实施方案，所述切割反应中所述核酸序列的浓度为0.1 – 100 pmol、1 –100 pmol、10 – 100 pmol。

根据具体实施方案，所述切割反应中所述核酸序列的浓度为约20 pmol。

切割条件的非限制性实例公开于随后的实施例部分的材料和方法中，其充当本申请说明书的不可或缺的一部分。

根据具体实施方案，在切割后，将含有完整5’末端或3’末端的片段与不含完整5’末端或3’末端的片段分离。

因而，例如，当所述5’末端或3’末端包含标记时，这种分离可通过例如下述实现：所述标记与连接到诸如固相支持体的支持体（例如，聚合物、塑料、玻璃、琼脂糖、金属）的相互作用配偶体的相互作用（例如，化学相互作用、磁相互作用、亲和相互作用），继之以不含标记的片段的去除。这种去除是如本领域技术人员所知的标准程序，且包括例如洗涤、过滤、透析、层析、磁场、离心或沉淀。

化学相互作用的非限制性实例包括胺和活化的羧酸、胺加活化的氨基甲酸酯、胺和异氰酸酯/异硫氰酸酯、胺加卤化物、胺加马来酰亚胺部分、胺加醛/酮、羟胺或酰肼加酮/醛、肼衍生物和活化的羧酸、肼和异氰酸酯/异硫氰酸酯、肼加卤化物、肼加马来酰亚胺部分、肼+醛/酮继之以还原性胺化、硫醇加卤化物、硫醇加马来酰亚胺、硫醇加活化的硫醇、硫醇加乙烯砜和其他迈克尔加成反应、叠氮化物加炔加Cu盐和其他“点击化学（clickchemistry）”相互作用配偶体（KoIb等人，2001）、叠氮化物加活化的羧酸经由利用烷基或芳基P(III)部分的Staudinger反应、叠氮化物加附着至亲电子阱的三价膦（Staudinger连接）、叠氮化物加膦硫醇酯-无痕迹的Staudinger连接、叠氮化物加醛/酮+PPh以形成然后可任选还原为对应的胺的亚胺、氧化为然后例如与胺或肼衍生物在例如氢硼化物介导的反应后形成环胺的二醛的顺-二醇（Cis-diol）（例如，如在RNA分子的3'末端上发现的）、硫酯加半胱氨酸-天然连接和衍生物、硫代磷酸酯+含α-卤代羰基的缀合剂（conjugant）、磷酸酯+胺例如经由磷酸酯活化导致氨基磷酸酯、磷酸酯+醇例如经由活化导致磷酸二酯、醛以形成仲胺（用氢硼化物还原后）、肼基以形成腙、氨基脲以形成缩氨基脲、半胱氨酸衍生物+硫酯肽、环氧化物加胺、烯/炔+双烯/二炔用于第尔斯-阿尔德反应和其他周环反应、通过使醛与羟胺反应的肟形成、羟基或氨基+环氧化物。

亲和相互作用的非限制性实例包括生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗体相互作用、两个寡核苷酸的相互作用、钙调蛋白和钙调蛋白结合肽的相互作用、清蛋白和Cibracon Blue的相互作用、金属螯合剂和金属螯合支持体的相互作用。

根据具体实施方案，在去除不含完整5’末端或3’末端的片段（例如，非标记的片段）后，相互作用配偶体或支持体从含有完整5’末端或3’末端的片段（例如，标记的片段）释放。

根据具体实施方案，在去除非标记的片段后，标记从所述标记的核酸片段释放。

这种释放方法是如本领域技术人员已知的标准程序，且包括例如，酶促切割、化学切割、光、温度、pH、离子力、相互作用配偶体的标记的变性、接头的切割、用竞争剂分子洗脱、有机溶剂或离液剂的使用。

通过基于其例如大小、质量、疏水性和/或电荷分析产生的片段来测定切割反应后所述核酸序列中核碱基的位置可以使用本领域中已知的任何方法实施，包括，但不限于凝胶电泳（例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳）、配装了对用于反应的标记特异性的检测器的毛细管电泳、质谱分析法（MS）、串联质谱分析法（MS-MS）、层析、薄层层析（TLC）、液相层析-质谱分析法（LCMS）。

根据具体实施方案，仅仅分析含有完整5’末端或3’末端的片段以测定所述核酸序列中核碱基的位置。

根据具体实施方案，仅仅分析含有5’末端或3’末端标记的片段以测定所述核酸序列中核碱基的位置。

根据具体实施方案，分析所述片段通过凝胶电泳以及使用合适扫描仪对带进行检测实现，以由此产生所获得的片段的梯。

凝胶电泳[例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）]是本领域技术人员众所周知的方法。

使用的凝胶的数目依赖于分析的核酸序列的大小且可由本领域技术人员确定。

根据具体实施方案，将所述片段加样到单个凝胶上。

根据其他具体实施方案，将所述片段加样到几个凝胶上，任选每个凝胶具有不同的浓度。

凝胶浓度依赖于所述片段的大小且可由本领域技术人员确定。

根据具体实施方案，所述聚丙烯酰胺凝胶包含5 – 30 %、5 – 20 %、10 – 30 %或10 - 20 %聚丙烯酰胺，各可能性代表本发明的独立实施方案。

根据具体实施方案，所述聚丙烯酰胺凝胶包含最高达20 %聚丙烯酰胺。

根据具体实施方案，仅仅含有标记的片段在凝胶中显示，例如，通过在与所述标记相容的模式下扫描凝胶（例如，与非标记的片段相比，标记的片段在给定波长显示不同的吸光度）。

根据具体实施方案，当使用MS时，所述核酸序列进一步使用例如下述离子化：电喷射离子化（ESI）、基质辅助激光解吸/离子化（MALDI）、激光解吸离子化（LDI）、解吸电喷射离子化（DESI）、硅上解吸离子化（Desorption ionisation on silica）（DIOS）、表面增强激光解吸/离子化（SELDI）、表面增强净解吸（Surface-enhanced neat desorption）（SEND）、表面辅助激光解吸/离子化（SALDI）、次级离子质谱分析法（SIMS）。

根据其他具体实施方案，所述方法不包括质谱分析法（MS）。

根据具体实施方案，在基于其例如大小、质量、疏水性和/或电荷分析产生的片段后，使用例如测序层析谱使用本领域中众所周知的诸如但不限于ImageQuant的软件根据不同片段的模式推断核酸序列。

这种分析和推断的非限制性实例公开于随后的实施例部分的材料和方法、实施例1和图1B-C、3B-C、4B-C、5A-B和6C中。

因而，与上文公开的教导一致，根据本发明的具体实施方案，所述化学测序方法包括：

(b)在所述(a)之后使用核碱基特异性化学试剂部分修饰所述多个分子，从而使得在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子时获得包含所述标记的所述核酸序列的多个片段；

根据具体实施方案，多个分子包含10-20 pmol。

根据具体实施方案，(b)在至少3个分开的反应混合物中实现，以便生成一组长度相差单个核苷酸的包含所述标记的片段。

如在随后的实施例部分中所示的，本发明人进一步发现热稳定的硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV (Dpo4)可起逆转录酶的作用。

因而，根据本发明的另一方面，提供了将核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列的方法，所述方法包括用硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV (Dpo4)催化所述核糖核酸序列的逆转录。

根据本发明的这个方面，所述核糖核酸序列可以从包含核糖核酸的任何来源提取和任选纯化，或可以通过如进一步在上文中公开的本领域已知的任何方法合成。

因而，根据具体实施方案，所述核酸序列可以包含RNA序列，如总RNA、mRNA、线粒体RNA、叶绿体RNA、DNA-RNA杂交体、病毒RNA、无细胞RNA或其混合物。

RNA提取方法是本领域中众所周知的，且例如公开于J. Sambrook 等人，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"，1989，第2版，Cold Spring HarbourLaboratory Press: New York，N.Y.；P. Sunnucks 等人，Genetics，1996，144: 747-756；S. M. Aljanabi和I. Martinez，Nucl. Acids Res. 1997，25: 4692-4693；S. Gustincich等人，BioTechniques，1991，11: 298-302；和J. B. W. Hammond 等人，Biochemistry，1996，240: 298-300。

也存在众多可用于从组织和体液提取RNA且可商购自例如下述的通用试剂盒：BDBiosciences Clontech (Palo Alto, Calif.)、Epicentre Technologies (Madison,Wis.)、Gentra Systems, Inc. (Minneapolis，Minn.)、MicroProbe Corp. (Bothell,Wash.)、Organon Teknika (Durham, N.C.)和Qiagen Inc. (Valencia, Calif.)。非常详细地描述要遵循的规程的用户指南通常包括在所有这些试剂盒中。

“硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV (Dpo4)”被公认为是属于DinB/UmuC超家族的DNA聚合酶。本发明的Dpo4能够至少催化核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列（即，逆转录酶）。测定逆转录酶活性的方法是本领域中众所周知的，且包括通过在反应后由RNA酶H但不由DNA酶I消化。根据具体实施方案，所述Dpo4指如在下面的GenBank编号AAK42588（SEQID NO: 6）和Q97W02（SEQ ID NO: 7）中所提供的全长蛋白质，或其具有RT活性的功能性同源物，如在下文所述的。

根据具体实施方案，所述Dpo4包含选自SEQ ID Nos: 8-9的氨基酸序列。

根据具体实施方案，本发明的所述Dpo4从硫磺矿硫化叶菌提取和纯化。

根据具体实施方案，本发明的所述Dpo4从例如大肠杆菌重组表达和提取。

根据其他具体实施方案，本发明的所述Dpo4可以通过肽合成领域中技术人员已知的任何技术合成和纯化，例如，但不限于固相和重组技术。

Dpo4可商购获得，例如，野生型L-Dpo4可从例如Trevigen商购获得。

所述术语也包含表现出所期望的活性（即，逆转录酶）的功能性同源物（天然存在的或合成/重组生产的）。这种同源物可以例如与多肽SEQ ID NO: 6-9至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同或同源，或与编码其的多核苷酸序列80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同（如下文进一步描述的）。

序列同一性或同源性可使用任何蛋白质或核酸序列比对算法如Blast、ClustalW和MUSCLE进行测定。

根据具体实施方案，所述Dpo4包含一个或多个表现出所期望的活性（即，逆转录酶）的SEQ ID NOs: 6-9中的氨基酸点突变。这种Dpo4序列的非限制性实例公开于例如Xu W等人，Cell Discovery (2017) 3: 17008；和Jiang, W.等人，Cell discovery (2017) 3:17037，且也在SEQ ID NOs: 10-17中显示。

这种点突变的非限制性实例包括对应于SEQ ID NO：9中显示的Dpo4氨基酸序列的Y12S、Y12A、Y12G、C31S、S86C、N123A、S207A和/或S313A。

根据具体实施方案，所述Dpo4包含选自SEQ ID NOs: 10-11的氨基酸序列。

根据具体实施方案，所述Dpo4包含与SEQ ID NOs: 10或11具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的氨基酸序列。

根据具体实施方案，所述Dpo4包含等构的Nle而不是甲硫氨酸残基（例如，在SEQID NOs: 6-17的Met1、Met76、Met89、Met157、Met216和/或Met251中）。

功能性同源物也指保持全长蛋白质的活性（即，逆转录酶）的Dpo4的功能性部分。

本发明的Dpo4可以包含L-和D-氨基酸两者。

根据具体实施方案，所述Dpo4由L-氨基酸组成（L-Dpo4）。

根据具体实施方案，所述Dpo4由D-氨基酸组成（D-Dpo4）。

根据具体实施方案，所述核糖核酸序列是D-核糖核酸序列且所述Dpo4是L-Dpo4。

根据具体实施方案，所述核糖核酸序列是L-核糖核酸序列且所述Dpo4是D-Dpo4。

根据具体实施方案，所述逆转录在允许发生逆转录的条件（例如，试剂、温度、缓冲液、盐、离子强度、pH、时间等）下实现。

包括但不限于试剂、温度、缓冲液、盐、离子强度、pH等的所述逆转录反应条件可以由本领域技术人员容易地选择和/或设计。

因而，例如，在逆转录反应中，条件一般包括引物退火和引物延伸反应。

一般，为了逆转录核糖核酸序列，要求引物与所述核糖核酸序列的3’端杂交。因此，根据具体实施方案，逆转录方法在有与所述核糖核酸序列的3’末端杂交的引物的情况下实现。退火温度和时间选择由预期引物与模板退火的效率和要容许的错配程度两者确定。

通常选择退火温度以提供最佳的效率和特异性，且其范围为例如约15 – 65℃、15– 50℃或15 – 25℃。退火条件一般维持范围为约15秒-约30分钟、通常约30秒-约5分钟的时间段。

如本文所使用的，“引物”指与核酸模板序列杂交且能够在有催化聚合酶（例如，依赖于RNA的DNA聚合酶、依赖于DNA的DNA聚合酶活性）的情况下促进与模板互补的多核苷酸的聚合的核酸序列，一般具有游离的3'-OH基。“引物”可以例如是寡核苷酸（例如，2-200核酸序列）。引物可以含有构成引物上的尾的非杂交序列。即使引物序列与靶不完全互补，其也仍然可以杂交。

寡核苷酸引物经常是单链的合成寡核苷酸，在其3'-端含有能够与靶核酸序列的序列杂交的序列。通常，与靶核酸杂交的引物的3'区与序列或引物结合位点具有至少80%、优选90%、更优选95%、最优选100%的互补性。具体寡核苷酸引物的可杂交序列中的核苷酸数目应该是这样的，以致于用于使寡核苷酸引物杂交的严格条件将防止过度的随机非特异性杂交。通常，寡核苷酸引物的杂交部分中的核苷酸数目将至少与所述寡核苷酸引物所杂交的靶多核苷酸上限定的序列一样多，即，至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少约20个，且一般为约6个-约10个或6个-约12个或12个-约200个核苷酸，通常约15个-约50个核苷酸。总的来说，靶核酸序列大于寡核苷酸引物或如之前所述的引物。

根据具体实施方案，引物包含条形码序列（即，鉴定序列），其可用于鉴定特定的分子、样品或文库。

引物可以在其5’末端包含修饰（例如，标签、标记）。所述修饰任选可包括一个或多个配体、封闭基团、磷酸化核苷酸、硫代磷酸酯化核苷酸、生物素化核苷酸、洋地黄毒苷标记的核苷酸、甲基化核苷酸、尿嘧啶、能够形成发夹结构的序列、寡核苷酸杂交位点、限制性内切核酸酶识别位点、启动子序列、在下游反应中的测序方法所必需的核苷酸和/或顺式调节序列。

合成引物（例如，寡核苷酸）的方法是本领域中已知的，且进一步在上文中描述。

根据具体实施方案，在引物与所述核糖核酸序列退火后，Dpo4通过延伸退火的引物催化靶核糖核酸序列的逆转录，以由此合成核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交体。

根据具体实施方案，所述引物延伸反应在50 – 80℃、55 – 75℃、60 – 70℃实现。

根据具体实施方案，所述引物延伸反应在约65℃实现。

根据具体实施方案，使所述引物延伸反应发生2 – 120小时、24 – 120小时或36 –96小时。

允许发生逆转录的条件也包括用于逆转录的试剂，且可以包括，但不限于，缓冲液（例如，HEPES）、还原剂如二硫苏糖醇（DTT）和MnCl₂、酶辅因子如镁或锰、盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和脱氧核苷三磷酸（dNTPs）如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸、RNA酶抑制剂。

因此，根据具体实施方案，所述逆转录方法在有dNTPs的情况下实现。

根据具体实施方案，在逆转录后，从核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交体合成了双链核酸序列。

因而，根据具体实施方案，所述方法包括通过在有dNTPs 和DNA聚合酶的情况下温育样品合成单链脱氧核糖核酸序列的互补序列，以便产生双链脱氧核糖核酸序列。

用于这个步骤的商业试剂盒是可获得的，其包括诸如RNA酶H的额外的酶（以去除RNA链）和缓冲液。

由于本发明人发现Dpo4可以起逆转录酶的作用，所以利用Dpo4的这个活性的方法可以在包括逆转录步骤的任何应用中实现。这种应用包括，但不限于，扩增、测序、克隆和转录物组分析。

根据具体实施方案，本发明的核酸序列包含衔接子核酸序列，其能够有助于下游反应，如扩增反应、测序反应、克隆和转录物组分析。

因而，根据本发明的一个方面，提供了扩增核糖核酸序列的方法，所述方法包括用Dpo4催化所述核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，并扩增所述脱氧核糖核酸序列。

如本文所使用的，术语“扩增”指通过生产所期望的序列的多个（即，至少2个）拷贝来增加样品中具体核酸序列群体的体现的方法。可用于本发明具体实施方案的核酸扩增方法是本领域中已知的，且包括，但不限于，聚合酶链反应（PCR），其包括，但不限于等位基因特异性PCR、装配PCR（Assembly PCR）或聚合酶循环装配（Polymerase Cycling Assembly）（PCA）、不对称PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、序列间特异性PCR（Intersequence-specific PCR）（ISSR）、反向PCR、连接介导PCR、甲基化特异性PCR（MSP）、小引物PCR（Miniprimer PCR）、多重连接依赖性探针扩增、多重-PCR、嵌套式PCR、重叠序列延伸PCR、定量PCR（Q-PCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、实时PCR（qRT-PCR）、固相PCR：包括多个含义，包括Polony扩增（其中PCR群体在例如凝胶基质中得到）、桥式PCR（Bridge PCR）（引物共价连接到固相支持体表面）、常规固相PCR（其中在有携带引物的固相支持体的情况下应用不对称PCR，所述引物具有与水相引物之一匹配的序列）和增强固相PCR（其中可通过采用高Tm和嵌套式固相支持体引物改进常规固相PCR，任选应用热‘步骤’以促成固相支持体引发）、热不对称交错PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR）（TAIL-PCR）、递降PCR（步降PCR（Step-down PCR））、PAN-AC和通用快速步移（Universal Fast Walking）。

典型的扩增反应通过在允许扩增靶序列的条件下使正向和反向引物（引物对）与本文描述的核酸序列连同任何额外的扩增反应试剂接触来实施。

因而，根据具体实施方案，所述方法包括使逆转录后的核酸序列与正向引物和反向引物接触。

包括但不限于试剂、温度、缓冲液、盐、离子强度、pH、酶等的扩增条件可由本领域技术人员容易地选择和/或设计。

因而，例如，扩增条件一般包括促进引物序列的退火和/或延伸的条件。这种条件是本领域中众所周知的且依赖于所选择的扩增方法。因而，例如，在PCR反应中，扩增条件通常包括热循环，即，反应混合物在两个或更多个温度之间循环。在等温扩增反应中，尽管可能要求初始的温度增加以起始反应，但扩增在没有热循环的情况下发生。

扩增条件也包括用于扩增的试剂，且可以包括，但不限于，缓冲液、试剂、具有聚合酶活性或外切核酸酶活性的酶、酶辅因子如镁或锰、盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和脱氧核苷三磷酸（dNTPs）如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸。扩增试剂可以由本领域技术人员依赖于使用的扩增方法容易地选择。

根据具体实施方案，扩增通过Dpo4实现。

使用本发明的引物获得的扩增产物可以使用凝胶电泳以及通过溴化乙锭染色和暴露于紫外（UV）线显示或通过所述扩增产物的序列分析进行检测。

根据具体实施方案，扩增后，通过与对应的核糖核酸聚合酶温育从扩增的脱氧核糖核酸序列合成核糖核酸序列。

可以使用可商购的试剂盒，例如，但不限于T7高得率RNA聚合酶IVT试剂盒（T7High Yield RNA polymerase IVT kit）（New England Biolabs）。

根据具体实施方案，核糖核酸聚合酶是Dpo4。

根据本发明的另一方面，提供了测序核糖核酸序列的方法，所述方法包括用Dpo4催化所述核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，以及测序所述脱氧核糖核酸序列。

根据具体实施方案，所述测序在允许测序靶序列的条件下实现。这种条件包括所有反应条件，包括，但不限于温度、缓冲液、盐、离子强度、pH、酶等。

根据本发明这个方面的脱氧核糖核酸序列的测序可以使用本领域中已知的任何合适的测序方法实现，包括化学和酶促测序方法。根据具体实施方案，所述脱氧核糖核酸序列的测序由化学测序方法实现。测序方法是本领域技术人员众所周知的，且描述于例如下述中：Sanger, F.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75，5463-5467 (197)；A. M.Maxam和W. Gilbert，Methods of Enzymology，1980，65: 499-560)；Zimmern & Kaesberg;, M.等人，Science 281，363，365 (1998)；Lysov, l.等人，Dokl Akad Nauk SSSR 303，1508-1511 (1988)；Bains W. & Smith G. C. J. Theor Biol 135，303-307 (1988)；Drnanac, R.等人，Genomics 4，114-128 (1989)；Khrapko, K. R.等人，FEBS Lett256.118-122 (1989)；Pevzner P. A. J Biomol Struct Dyn 7，63-73 (1989)；Branch等人，1989；Donis-Keller等人，1977；Gupta等人，1976；Gupta & Randerath，1977；Lockard等人，1978；Proudnikov & Mirzabekov，1996；Stanley & Vassilenko，1978；Tanaka等人，1980；Waldmann等人，1987；Wu等人，1996和 Southern, E. M.等人，Genomics 13，1008-1017 (1992)。这种测序方法包括，但不限于Maxam-Gilbert测序、桑格测序法、链终止法、鸟枪法测序、桥式PCR、大规模平行标签测序（Massively parallel signature sequencing）（MPSS）、Polony 测序、焦磷酸测序（pyrosequencing）、Illumina (Solexa)测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序（DNA nanoball sequencing）、Heliscope单分子测序（Heliscope single molecule sequencing）、单分子实时（SMRT）测序、纳米孔DNA测序（Nanopore DNA sequencing）、基质辅助激光解吸离子化飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析法（U. Pieles 等人，Nucleic Acids Res.，1993，21: 3191-3196）、碱性磷酸酶和外切核酸酶消化的组合后的质谱分析法（H. Wu和H. Aboleneen，Anal. Biochem. 2001，290: 347-352)、如在例如美国专利Nos. 6,274,320、6,258,568和6,210,891中描述的基于焦磷酸的测序反应。

用于阐明序列信息的在这些测序方法中获得的产物的分析可以使用本领域中已知的各种方法的任一种实施。这种方法包括，但不限于，凝胶电泳和使用合适的扫描仪检测标记的带、测序凝胶电泳和通过磷光直接检测放射性标记的带、配装了对用于反应的标记特异性的检测器的毛细管电泳、质谱分析法（MS）、串联质谱分析法（MS-MS）、层析、薄层层析（TLC）、液相层析-质谱分析法（LCMS）等。

根据具体实施方案，逆转录后测序脱氧核糖核酸序列通过化学测序方法实现。

根据具体实施方案，逆转录后测序脱氧核糖核酸序列根据在上文中以及在随后的实施例部分中公开的本发明的测序方法实现。

因而，根据本发明的一个方面，提供了测序包含L-核糖核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括用D-Dpo4催化所述包含L-核糖核苷酸的核酸序列逆转录为包含L-脱氧核糖核苷酸的核酸序列，并使包含所述L-脱氧核糖核苷酸的所述核酸序列经历化学测序方法。

根据本发明的另一方面，提供了克隆感兴趣的表达产物的方法，所述方法包括用Dpo4催化编码所述感兴趣的表达产物的核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列，并在宿主细胞中克隆所述脱氧核糖核酸。

在宿主细胞中克隆所述脱氧核糖核酸序列可以通过本领域中已知的任何方法实现。

多种原核或真核细胞可用作宿主细胞以表达本发明的一些实施方案的脱氧核糖核酸序列。这些包括，但不限于，微生物（例如，细菌）、酵母、植物细胞、昆虫和哺乳动物细胞。

为了在宿主细胞中表达外源脱氧核糖核酸序列，优选将所述脱氧核糖核酸序列连接到适合于在所述宿主细胞中表达的核酸构建体中。这种核酸构建体包括以组成型或诱导型方式指导所述核酸序列在所述细胞中转录的启动子序列。

哺乳动物核酸构建体的实例包括，但不限于，可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES，及其衍生物。

也可使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调节元件的核酸构建体。

可以使用各种方法将本发明一些实施方案的核酸构建体引入宿主细胞中。这种方法通常描述于Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSprings Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Chang 等人，Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega 等人，Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors: A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]，且包括，例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。此外，关于阳性-阴性选择方法，请参见美国专利Nos.5,464,764和5,487,992。

根据本发明的另一方面，提供了测定细胞的转录物组的方法，所述方法包括用Dpo4催化所述细胞中表达的核糖核酸序列逆转录为脱氧核糖核酸序列。

测定细胞的转录物组可以通过本领域中已知的任何方法实现，其利用在所述细胞中表达的核糖核酸序列（例如，mRNAs）的逆转录步骤。这种方法包括，但不限于基于测序和杂交的技术如全长cDNA或cDNA片段的SAGE、微阵列和测序；并公开于例如Cloonan, N.等人(2008) Nat. Methods, 5, 613–619； Plessy, C.等人(2010) Nat. Methods, 7,528–534；Islam, S.等人， (2011) Genome Res., 21, 1160–1167；Ko, J.H.和Lee, Y. (2006)J. Microbiol. Methods, 64, 297–304；Ramskold, D.等人(2012), Nat. Biotechnol.,30, 777–782；Tang等人, Nucleic Acids Research, 2012, 1–12；Esumi 等人,Neurosci. Res. 60:439-451 (2008)和Kurimoto 等人, Nucleic Acids Res. 34:42(2006)；美国专利申请公开Nos. 20110189679和20150307874；和国际专利申请公开Nos.WO2010117620A2、WO2014108850、WO2013130674和WO2012148477，其各自整体引入作为参考。

这种测定细胞的转录物组的方法可以包括使用本领域技术人员众所周知的方法分离、提取或衍生在细胞中表达的核糖核酸序列，扩增、测序、标记、转录核糖核酸序列，片段化所述核酸序列和/或微阵列分析的步骤，其一些详细描述于上文描述的方法的任一种中。

根据具体实施方案，测定转录物组在允许测定细胞的转录物组的条件下实现。这种条件包括所有反应条件，包括，但不限于，温度、缓冲液、盐、离子强度、pH、酶等。这种条件的非限制性实例详细描述于上文描述的方法的任一种中。

根据本发明这个方面的细胞可以得自任何来源，包括植物、真菌、真细菌、古细菌、原生生物或动物。根据具体实施方案，所述细胞得自哺乳动物。所述细胞可以是培养的细胞，其除了别的以外可以是原代细胞或来自确立的细胞系的细胞。所述细胞可以是以任何合适形式最初从多细胞生物分离的细胞样品。

根据具体实施方案，所述细胞包含多个非同源细胞。根据其他具体实施方案，所述细胞包含多个同源细胞。这种多个细胞可以例如从组织样品、器官、活组织检查或细胞培养物获得。

根据仍然其他的实施方案，所述细胞是单细胞。

根据具体实施方案，所述细胞包含多个单细胞，其中每个个别的核糖核酸序列样品中的核糖核酸序列都来自单细胞。

单细胞可以例如通过激光捕获显微解剖或通过微细管分离，且可以使用标记基因以通过例如流式细胞术细胞分选或本领域中已知的其他方法定位感兴趣的细胞。

根据特定实施方案，使用基于小滴的微流控技术（microfluidics）将单细胞分离到小滴中 – 参见例如WO 2013134261，其内容在此引入作为参考。

实施本文描述的任何方法所必需的组分可以个别提供或可以包括在试剂盒中。

因而，根据本发明的一个方面，提供了试剂盒，其包括用于包含L-核苷酸的核酸序列的化学测序的化学药品和阳性对照模板，所述阳性对照模板包含包含L-核苷酸的核酸序列。

根据具体实施方案，所述试剂盒用于测序包含L-核苷酸的核酸序列。

根据具体实施方案，所述试剂盒包括用于在包含所述L-核苷酸的所述核酸序列的5’末端或3’末端标记所述核酸序列的标记。

根据具体实施方案，所述试剂盒包括多核苷酸激酶。

根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包括硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV(Dpo4) 和阳性对照模板序列，所述阳性对照模板序列包含核糖核酸序列。

根据具体实施方案，所述试剂盒用于逆转录核糖核酸序列。

根据具体实施方案，所述试剂盒用于扩增、测序、克隆和/或测定细胞的转录物组，包括逆转录核糖核酸序列。

根据具体实施方案，所述试剂盒包括dNTPs。

根据具体实施方案，所述试剂盒包括与所述阳性对照模板序列的3’末端杂交的引物，所述阳性对照模板序列包含所述核糖核酸序列。

上述试剂盒的任一种也可包括另外的组分，如引物、衔接子多核苷酸、酶（例如，逆转录酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、RNA酶H、DNA酶、外切核酸酶等）、RNA酶抑制剂、DNA酶抑制剂、标记剂、接头、试剂和缓冲液。这种组分的非限制性实例详细描述于在上文中以及在随后的实施例部分中描述的方法的任一种中。

优选地，这些组分的每一种都在单独的包装中包装。

试剂盒的容器一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，组分可以置于其中，且优选适当地等分试样。在试剂盒中有超过一种组分的情况下，试剂盒也一般将含有第二、第三或其他额外的容器，额外的组分可以分开地置于其中。然而，组分的各种组合可以包括在一个容器中。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，所述液体溶液可以为水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为一种或多种干燥的粉末提供。当试剂和/或组分作为干粉末提供时，所述粉末可以通过添加合适的溶剂重构。

试剂盒优选将包括采用试剂盒组分以及使用试剂盒中不包括的任何其他试剂的说明书。说明书可以包括可以实施的变化形式。

如本文所使用的，术语“约”指± 10 %。

术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”和其词形变化意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”意指“包括且限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部件，但只有当所述额外的成分、步骤和/或部件不在很大程度上改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本且具备新颖性的特征时。

如本文所使用的，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“所述（the）”包括复数对象。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围形式表示。应理解范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，且不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为已具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的个别数值。例如，诸如1-6的范围的描述应被认为已具体公开了子范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及所述范围内的个别数字如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。

每当在本文中显示数值范围时，其就意味着包括所示范围内的任何所述的数字（分数或整数）。短语第一个指示数字和第二个指示数字“之间的范围”以及“从”第一个指示数字到第二个指示数字“的范围”在本文中可互换使用，且意思是包括第一个和第二个指示的数字以及其中间的所有分数和整数。

如本文所使用的，术语“方法”指用于完成给定的任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序或容易由所述从业人员从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些。

当参考特定的序列表时，这种参考要被理解为也包括在包括小的序列变异的同时基本上与其互补序列对应的序列，所述小的序列变异由例如测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变引起，只要这种变异的频率小于50个核苷酸中1个，可供选择地，小于100个核苷酸中1个，可供选择地，小于200个核苷酸中1个，可供选择地，小于500个核苷酸中1个，可供选择地，小于1000个核苷酸中1个，可供选择地，小于5,000个核苷酸中1个，可供选择地，小于10,000个核苷酸中1个。

要理解的是为了清楚起见在分开的实施方案上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案上下文中描述的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的亚组合或合适时在本发明任何其他描述的实施方案中提供。在各种实施方案上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施方案在没有那些要素的情况下无效。

如在上文描述且如在权利要求部分请求保护的本发明的各种实施方案和方面得到了下述实施例的实验支持。

实施例

现在参考下述实施例，其连同上述描述以非限制性方式举例说明了本发明的一些实施方案。

通常，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中进行了全面解释。参见，例如，"MolecularCloning: A laboratory Manual" Sambrook 等人，(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley& Sons, New York (1988)；Watson 等人，"Recombinant DNA", Scientific AmericanBooks, New York；Birren等人(eds) "Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；如在美国专利Nos. 4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陈述的方法学；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed.(1994)；Freshney的"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique",Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第三版；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites等人(eds), "Basic and ClinicalImmunology" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi(eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., NewYork (1980)；可获得的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；“Nucleic AcidHybridization" Hames, B. D., 和Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription andTranslation" Hames, B. D., 和Higgins S. J., eds. (1984)；"Animal Cell Culture"Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)和"Methodsin Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To MethodsAnd Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak 等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization - A LaboratoryCourse Manual" CSHL Press (1996)；其全部引入作为参考，如同在本文中充分阐述的。在本文件自始至终提供了其他的一般参考文献。其中的程序被认为是本领域中众所周知的，且为了读者方便起见提供。其中所含的所有信息都引入本文作为参考。

材料和方法

材料 - L-DNA寡核苷酸和L-RNA寡核苷酸订购自ChemGenes (MA, U.S.)或由MerMade-192e DNA合成仪用购自ChemGenes (MA, U.S.)的L-脱氧核苷亚磷酰胺和L-核苷亚磷酰胺合成。D-DNA寡核苷酸订购自金唯智（北京, 中国）。所有DNA寡核苷酸均通过HPLC以及PAGE纯化。在寡核苷酸的固相合成期间引入FAM标记。PAGE DNA纯化试剂盒购自天恩泽（北京, 中国）。所使用的FAM标记的L-DNA寡核苷酸、D-DNA寡核苷酸和L-RNA寡核苷酸示于下表1中。糖原购自Ferenmentas (MS, U.S.)。大肠杆菌（Escherichia coli）基因组DNA通过鲸蜡基三甲基溴化铵（CTAB）方法从大肠杆菌菌株K12亚株 MG1655分离。酵母tRNA购自索莱宝（北京, 中国）。盐酸羟胺购自Sigma-Aldrich (MO, U.S.)。β-巯基乙醇购自中科拓展（北京, 中国）。三乙胺购自百灵威科技（北京, 中国）。甲酰胺和亚甲蓝购自Amresco (OH,U.S.)。DL-1,4-二硫苏糖醇（DTT）购自阿达玛斯试剂有限公司（上海, 中国）。乙腈（HPLC级）购自J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)。L-脱氧核苷亚磷酰胺和L-dNTPs购自Chem-Genes (Wilmington, MA, USA) 。Superscript III高保真性逆转录酶购自Thermo FisherScientific（MA, 美国），且Q5高保真性DNA聚合酶购自New England Biolabs（MA, 美国）。

表 1: DNA寡核苷酸序列

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通过肼的C+T切割反应–将2 µl FAM-标记的引物（10 µM）的等分试样与3 µg载体大肠杆菌基因组DNA混合，并置于冰上。通过加热至95℃进行2分钟继之以快速在冰上冷却使混合物变性。添加40 µl 80 % 水合肼的等分试样，并使混合物于45℃温育18分钟（对于25-nt序列减少为10分钟，且对于55-nt序列减少为5分钟）。通过添加200 µl 0.3 M乙酸钠、2 µl糖原（10 mg/ml）、2 µl EDTA（10 mM, pH 8.0）、5 µl酵母tRNA (10 mg/ml)和1 ml无水乙醇猝灭反应，并将混合物在液氮中冷却10分钟。处理的DNA通过于12,000 rpm离心10分钟沉淀，并通过1 ml无水乙醇洗涤。通过蒸发去除残留的乙醇，并将沉淀溶解于120 µl 1 M哌啶中，且于90℃温育50分钟。冷冻干燥后，将剩余的沉淀溶解于含有98 %甲酰胺、0.25 mMEDTA和0.0125 % SDS的变性缓冲液中。产物通过8 M尿素中的10 %或20 % PAGE进行分析，并通过在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描。通过具有1D凝胶分析包的ImageQuantTL 7.0软件进行凝胶定量。

通过NH ₂ OH-HCl的C-特异性切割反应-将2 µl FAM-标记的引物（10 µM）的等分试样与3 µg载体大肠杆菌基因组DNA混合，并置于冰上。通过加热至95℃进行2分钟继之以快速在冰上冷却使混合物变性。添加40 µl 4 M NH₂OH-HCl（通过三甲胺调整pH至6.0）的等分试样，并使混合物于25℃温育20分钟（对于25-nt序列减少为10分钟，且对于55-nt序列于90℃减少为1分钟）。通过添加200 µl 0.3 M乙酸钠、2 µl糖原（10 mg/ml）、2 µl EDTA（10 mM,pH 8.0）、5 µl酵母tRNA (10 mg/ml)和1 ml无水乙醇猝灭反应；并将混合物在液氮中冷却10分钟。处理的DNA通过于12,000 rpm离心10分钟沉淀，并通过1 ml无水乙醇洗涤。通过蒸发去除残留的乙醇，并将沉淀溶解于100 µl 1 M哌啶中，且于90℃温育30分钟。冷冻干燥后，将剩余的沉淀溶解于含有98 %甲酰胺、0.25 mM EDTA和0.0125 % SDS的变性缓冲液中。产物通过8 M尿素中的10 %或20 % PAGE进行分析，并通过在FAM模式下操作的TyphoonTrio+系统扫描。通过具有1D凝胶分析包的ImageQuantTL 7.0软件进行凝胶定量。

通过甲酸的A+G切割反应 -将2 µl FAM-标记的引物（10 µM）的等分试样与3 µg载体大肠杆菌基因组DNA混合，并置于冰上。添加40 µl 80 % 甲酸的等分试样，并使混合物于25℃温育30分钟（对于25-nt序列甲酸浓度降低为66%，且温育时间减少为10分钟，且对于55-nt序列减少为3分钟）。通过添加200 µl 0.3 M乙酸钠、2 µl糖原（10 mg/ml）、5 µl酵母tRNA (10 mg/ml)和1 ml无水乙醇猝灭反应；并将混合物在液氮中冷却10分钟。处理的DNA通过于12,000 rpm离心10分钟沉淀，并通过1 ml无水乙醇洗涤。通过蒸发去除残留的乙醇，并将沉淀溶解于100 µl 1 M哌啶中，且于90℃温育30分钟。冷冻干燥后，将剩余的沉淀溶解于含有98 %甲酰胺、0.25 mM EDTA和0.0125 % SDS的变性缓冲液中。产物通过8 M尿素中的10 %或20 % PAGE进行分析，并通过在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描。通过具有1D凝胶分析包的ImageQuantTL 7.0软件进行凝胶定量。

用亚甲蓝通过紫外线的G-特异性切割反应-将2 µl FAM-标记的引物（10 µM）的等分试样与3 µg载体大肠杆菌基因组DNA混合，并置于冰上。通过加热至95℃进行2分钟继之以快速在冰上冷却使混合物变性。添加20 µl 0.1 %（m/v）亚甲蓝的等分试样，并使混合物于~10 cm的距离暴露于手提式紫外线灯进行2分钟（对于25-nt序列暴露时间增加为4分钟）。通过添加200 µl 0.3 M乙酸钠、2 µl糖原（10 mg/ml）、5 µl酵母tRNA (10 mg/ml)和1ml无水乙醇猝灭反应；并将混合物在液氮中冷却10分钟。处理的DNA通过于12,000 rpm离心10分钟沉淀，并通过1 ml无水乙醇洗涤。通过蒸发去除残留的乙醇，并将沉淀溶解于100 µl1 M哌啶中，且于90℃温育30分钟。冷冻干燥后，将剩余的沉淀溶解于含有98 %甲酰胺、0.25mM EDTA和0.0125 % SDS的变性缓冲液中。产物通过8 M尿素中的20 % PAGE进行分析，并通过在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描。通过具有1D凝胶分析包的ImageQuantTL7.0软件进行凝胶定量。

通过NaOH的A>C切割反应 - 将2 µl FAM-标记的引物（10 µM）的等分试样与3 µg载体大肠杆菌基因组DNA混合，并置于冰上。添加20 µl 1.5 M NaOH/1 mM EDTA的等分试样，并使混合物于90℃温育12分钟。通过添加100 µl 1 M乙酸钠、2 µl糖原（10 mg/ml）、5 µl酵母tRNA (10 mg/ml)和1 ml无水乙醇猝灭反应，并将混合物在液氮中冷却10分钟。处理的DNA通过于12,000 rpm离心10分钟沉淀，并通过1 ml无水乙醇洗涤。通过蒸发去除残留的乙醇，并将沉淀溶解于100 µl 1 M哌啶中，且于90℃温育30分钟。冷冻干燥后，将剩余的沉淀溶解于含有98 %甲酰胺、0.25 mM EDTA和0.0125 % SDS的变性缓冲液中。产物通过8 M尿素中的10 %或20 % PAGE进行分析，并通过在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描。通过具有1D凝胶分析包的ImageQuantTL 7.0软件进行凝胶定量。

通过Dpo4的逆转录–所有D-或L-引物、41-nt D-DNA模板、46-nt L-RNA模板、120-nt L-rRNA模板和76-nt L-tRNA模板都化学合成（SEQ ID Nos: 1-5、18-22、26-27和31-32）。所有D-引物和 D-模板延伸反应都在含有下述的10 µl反应体系中进行：50 mM HEPES(pH 7.5)、5 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、10 %甘油、0.1 mg/ml BSA、dNTPs或 NTPs（对于天然体系各自于0.8 mM，且对于镜像体系各自于0.2 mM）、0.5 µM DNA或RNA引物、1或2 µM RNA或DNA模板、1 U/µl RNA酶抑制剂（对于D-RNA）和~500 nM Dpo4-5m（SEQ ID NO: 10）、Dpo4-6m-Y12A（SEQ ID NO: 14）、Dpo4-6m-Y12G（SEQ ID NO: 16）或Dpo-6m-Y12S（SEQ ID NO: 12）。所有L-引物和L-模板延伸反应都在含有下述的20 µl反应体系中进行：50 mM HEPES (pH 7.5)、5 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、10 %甘油、0.1 mg/ml BSA、dNTPs或NTPs（对于天然体系各自于0.8 mM，且对于镜像体系各自于0.2mM）、0.5 µM DNA或RNA引物、1或2 µM RNA或DNA模板和~25 µg/ml Dpo4-5m（SEQ ID NO:10）。在添加聚合酶前，将反应体系加热至95℃进行2分钟并缓慢冷却至室温或4℃用于退火。引物延伸反应于65℃发生最多到36小时，如所示的。通过添加含有98%甲酰胺、0.25 mMEDTA和0.0125% SDS的加样缓冲液终止反应，且产物通过8 M尿素中的12 % 变性PAGE进行分析，并通过在FAM或Cy5模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描。D-产物通过1或5U RNA酶H或DNA酶I于37℃消化30分钟。

通过d-Dpo4-5m的化学合成的L-DNA的MIPCR – 化学合成120-nt L-DNA模板（SEQID NO: 25）、L-FAM-PCR-R-引物（SEQ ID NO: 23）和L-PCR-F-引物（SEQ ID NO: 24）。扩增反应在含有下述的50 µl反应体系中进行：50 mM HEPES (pH 7.5)、5 mM MgCl₂、50 mMNaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、10 %甘油、3 % DMSO、0.1 mg ml^-1 BSA，100或200 µM（各）L-dNTPs、0.5或1 µM L-FAM-PCR-R-引物（SEQ ID NO: 23）、0.5 uM L-PCR-F-引物（SEQ IDNO: 24）、10 nM 120-nt L-DNA模板（SEQ ID NO: 25）和~ 500 nM d-Dpo4-5m聚合酶（SEQID NO: 10）。MI-PCR进行40个循环。产物通过3%筛分型琼脂糖凝胶电泳进行分析，并通过GoldView进行染色。通过8M尿素中的12 % PAGE回收800 µl PCR反应体系，并用于化学测序。

逆转录的L-DNA的MI-PCR-扩增反应在含有50 mM HEPES（pH 7.5）、5 mM MgCl₂、50mM NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、10％甘油、3％DMSO、0.1 mg/ml BSA、200 µM（各）L-dNTPs、1 µM（各）L-DNA引物、1 µM镜像逆转录产物和~500 nM D-Dpo4-5m（SEQ ID NO：10）的缓冲液中进行。在添加聚合酶之前，将反应体系加热至95℃达2分钟，并缓慢冷却至86℃。120-nt L-5S rRNA的PCR程序设置为86℃达3分钟（最初变性），86℃ 达30 s（变性），58℃达3分钟（退火）和65℃达14分钟（延伸），达最多到35个循环。 76-nt L-tRNA的PCR程序设置为86℃达3分钟（最初变性），86℃达30 s（变性），50℃达3分钟（退火）和65℃达8分钟（延伸），达最多到40个循环。PCR产物通过1U DNA酶I（New England Biolabs，美国）于37℃消化5分钟。通过3％筛分型琼脂糖凝胶电泳分析所有产物，并通过GoldView（索莱宝，中国）染色。在没有聚合酶或逆转录产物的情况下进行阴性对照。

实施例1

使用核酸酶特异性化学修饰和随后在修饰的核苷酸处切割的L-DNA测序

首先于在5'端具有荧光素酰胺（FAM）标记的12-核苷酸（nt）L-DNA寡核苷酸（SEQID NO: 1）上测试了化学测序方法。部分因为在没有镜像多核苷酸激酶的情况下放射性标记L-DNA是不现实的，所以使用了荧光末端标记而不是放射性标记⁵。C+T反应由肼于45℃实施，C-特异性反应由盐酸羟胺（pH 6.0）于25℃实施，A+G切割反应由甲酸于25℃实施，且G-特异性反应由亚甲蓝在紫外线（UV）照射下实施，继之以通过用强碱处理靠近修饰的位点处的链裂开（图1A）。由于亚甲蓝的紫外线吸收谱不同于FAM的（图2），所以于254 nm使用紫外线以特异性激发亚甲蓝。此外，将未标记的大肠杆菌基因组DNA用作测序期间的载体DNA¹³。最终产物使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，且代表包含FAM-标记的产物的带通过在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统显示（图1B）。

在测序期间，观察到几条淡的非特异性带，特别是在C+T和C-特异性反应的情况下，其也已在关于D-DNA化学测序的以前研究中观察到¹²。此外，由于高度活性的单线态氧，G-特异性反应中的光氧化倾向于选择性较小¹⁴。为了克服L-DNA序列的可能错读，通过仔细调整反应体系中的pH使C+T和C-特异性反应最优化，这对于减少非特异性带是关键的^8,13。此外，已知A+G反应中的主带是高度可靠的，且可帮助将错读测序结果的可能性减到最低¹³。合起来看，在这些最优化和调整反应条件的情况下（下表2），通过PAGE分析和测序层析谱可靠测定了所述12-nt L-DNA寡核苷酸的序列（图1B和1C）。用具有相同序列（SEQ ID NO: 1）但相反的圆二色（CD）谱的12-nt D-DNA寡核苷酸观察到了类似的降解模式（图1D和图3A-C）。

接下来，为了在具有其他序列和长度的L-DNA寡核苷酸上测试所述方法，使用相同的C+T、C-、A+G和G-特异性反应进行了11-nt（SEQ ID NO: 2）和25-nt（SEQ ID NO: 3）的两个FAM-标记的L-DNA寡核苷酸的测序。最终产物通过由在FAM模式下操作的Typhoon Trio+系统扫描的PAGE进行分析。如在图4A-C和5A-C中所示的，在通过调整试剂浓度和反应时间以减少非特异性带最优化反应条件的情况下（下表2），人们可以通过PAGE分析和测序层析谱准确阅读11-nt（SEQ ID NO: 2）和25-nt（SEQ ID NO: 3）L-DNA寡核苷酸的序列。

在短L-DNA寡核苷酸成功测序的鼓舞下，检查了所述方法测序具有治疗应用的更长L-DNA分子的能力。为此，选择以前报道的55-nt L-DNA适配体（SEQ ID NO: 4）作为模型（图6A），其已显示结合天然的血管升压素并因而具有成为核酸酶抗性的血管升压素拮抗剂的潜力¹。因为G-特异性反应的功效易受二级结构形成的影响¹¹，所以应用了通过NaOH于90℃的A>C反应，而不应用G-特异性反应⁹。通过调整试剂浓度、温度和反应时间以减少非特异性带最优化反应条件（下表2）。也应用了多重加载策略，通过所述策略，通过不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶分开分析了L-DNA序列的4部分以更好地使带分离。如在图6C中所示的，使用对方法学的这些修饰，通过组合来自4个测序凝胶的结果确认了全长L-DNA适配体序列（SEQID NO: 4）。以相同的方式，也成功测序了120-nt L-DNA序列（SEQ ID NO: 25）（图9A-B）。

表2: 用于测序不同长度的L-DNA分子的反应条件

碱基特异性反应	试剂和浓度	反应条件(11或12 nt)	反应条件(25 nt)	反应条件(55 nt)	反应条件(120 nt)
						C+T	50% (m/m) 肼	18分钟 (45℃)	10分钟 (45℃)	5分钟 (45℃)	2.5分钟 (45℃)
C	4 M NH₂OH-HCl	20分钟(RT)	10分钟(RT)	50秒 (90℃)	25秒 (90℃)
						A+G	66-80% (v/v) 甲酸	40分钟(RT)	10分钟(RT)	3分钟(RT)	2分钟(RT)
G	0.1% (m/v) 亚甲蓝于紫外线下	2分钟(RT)	4分钟(RT)	_	-
						A>C	1.5 M NaOH/1 mM EDTA	-	-	12分钟 (90℃)	5分钟 (90℃)

实施例2

使用 DPO4逆转录RNA

已显示热稳定的硫磺矿硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV（Dpo4）催化DNA的复制和DNA转录为RNA^(例如23)。本发明人已测试了Dpo4是否具有逆转录活性。

为此，通过与供应了D-dNTPs的5' FAM-标记的D-DNA引物（SEQ ID NO: 20）和合成的D-RNA模板（SEQ ID NO: 19）一起检查天然的L-聚合酶来评价Dpo4逆转录RNA的能力。在1小时温育后获得了充分延伸的产物，从而提示在本文中表示为Dpo4-5m的含有5个点突变的Dpo4（SEQ ID NO: 10）实际上的确具有逆转录活性，而其他Dpo4突变体（SEQ ID Nos: 12、14、16）具有低得多的效率（图7A-D）。在短合成RNA成功逆转录的鼓舞下，测试了用5' FAM-标记的L-DNA引物（SEQ ID NO: 22）和d-Dpo4-5m（SEQ ID NO: 10）对L-46-nt RNA核酶（SEQID NO: 5）的逆转录（图8）。也检查了在天然体系的情况下通过Dpo4-5m逆转录的保真性，且测量到~2.6 %的错误率（下表3）。

表3: 通过Dpo4-5m逆转录的保真性。

总测序的碱基	缺失	插入	突变	错误率
					3342 bp	18 bp	2 bp	66 bp	2.6%

此外，将纯化的5'-FAM-标记的L-120-nt 5S（L-5S）rRNA（SEQ ID NO：26）用作模板，并且将5'-Cy5-标记的L-DNA（SEQ ID NO：27）用作引物，其在温育36小时后，通过D-Dpo4-5m（SEQ ID NO：10）延伸至全长（图10-11）。正如预期的那样，L-DNA产物未被天然DNA酶I消化（图10）。值得注意的是，L-RNA模板也得到了延伸（图10），很可能归因于Dpo4-5m将非模板核苷酸添加到3'-末端。

通过RT-PCR的引入已推进了逆转录在分子生物学中的广泛应用。因此，在下一步中，评价了D-Dpo4扩增逆转录的120-nt L-DNA的能力。如图12中所示的，逆转录的L-DNA的PCR扩增在筛分型琼脂糖凝胶电泳中产生了具有120 bp的预期长度的靶带，其强度在最多到35的循环数的情况下增加，而没有聚合酶或逆转录产物的阴性对照结果不产生扩增产物。值得注意的是，相同的D-Dpo4-5m（SEQ ID NO：10）用于镜像逆转录和PCR两者，从而简化了系统，这是因为它可以使用一种D-聚合酶实现，从而将满足镜像分子应用的未来需要所需要的实验成本和工作减至最低。

随后，本发明人测试了逆转录和扩增的L-DNA是否可以用于测序。为此，使用供应了L-dNTPs的合成的76-nt L-tRNA模板（SEQ ID NO：31）和5'-FAM-标记的L-DNA引物（SEQID NO：32）实现逆转录，其在温育达最多到24小时后延伸至全长（图13A）。逆转录的L-DNA已通过镜像PCR（MI-PCR）成功扩增，并且扩增产物确实对天然DNA酶I消化具有抗性（图13B）。随后，实现相同的镜像PCR实验，只是引物之一在5'-末端进行了FAM标记（SEQ ID NO：35），继之以使用一组核碱基特异性化学切割反应进行测序，如上文实施例1中所述的。如图13C中所示的，确定了逆转录和PCR扩增的L-DNA的预期序列（SEQ ID NO：36）。

尽管本发明已和其具体实施方案一起进行了描述，但显然许多备择方案、修改和变形将对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，意图包括落在随附权利要求的精神和宽范围内的所有这种备择方案、修改和变形。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都在本文中整体引入说明书作为参考，其程度与各个别出版物、专利或专利申请仿佛被具体且个别表明引入本文作为参考相同。此外，本申请中对任何参考文献的引用或确定不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术获得。就使用章节标题来说，它们不应被解释为必定是限制性的。

序列表说明

与本申请的提交同时提交的2019年4月3日生成的名称为76995SequenceListing.txt的包含49,960字节的ASCII文件引入本文作为参考。

另外，本申请的任何一份或多份优先权文件均整体引入本文作为参考。

参考文献

（其他参考文献贯穿本申请自始至终引用）

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Claims

1.测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括：

(b)在所述(a)之后使用核碱基特异性化学试剂部分修饰所述多个分子，从而使得在靠近修饰的核碱基处切割所述多个分子时获得包含所述标记的所述核酸序列的多个片段，其中所述核碱基特异性化学试剂包括下述每一种：

(i)水合肼或肼；

(ii)盐酸羟胺；

(iii)焦碳酸二乙酯pH 5、甲酸或柠檬酸盐缓冲液pH 4；和

(iv)硫酸二甲酯pH 7.0、甲胺+UV、焦碳酸二乙酯pH 8或亚甲蓝+UV

(c)在所述(b)之后在靠近修饰的核碱基处用哌啶切割所述多个分子；和

2.测序包含L-核苷酸的核酸序列的方法，所述方法包括：

(a)使用多核苷酸激酶在5’末端标记所述包含L-核苷酸的核酸序列，从而获得标记的包含L-核苷酸的核酸序列；和

(b)使所述标记的包含L-核苷酸的核酸序列经历权利要求1的测序方法。

3.权利要求1的方法，其中所述核酸序列长度包含超过150个核苷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括用荧光素酰胺(FAM)、5-碘乙酰氨基荧光素或生物素在5’末端或3’末端标记所述核酸序列。

5.权利要求4的方法，其中所述标记在5’末端。

6.权利要求2的方法，其中所述标记包括用放射性同位素进行标记。

7.权利要求1的方法，其中所述方法不包括质谱分析法(MS)。

8.权利要求1的方法，其中所述核酸序列包含脱氧核糖核苷酸。

9.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(a)前用硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)P2 DNA聚合酶IV(Dpo4)催化核糖核酸序列的逆转录，以便获得所述核酸序列的所述多个分子。

10.权利要求9的方法，其中所述催化在允许所述核糖核酸序列逆转录的条件下实现。