TW202227100A

TW202227100A - 包含非天然核苷酸之多核苷酸之反轉錄

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Publication number: TW202227100A
Application number: TW110139349A
Authority: TW
Inventors: 佛洛伊德Ｅ羅曼斯柏格; 後補後補; 安曉珘周
Original assignee: 美商新索思股份有限公司; 史基普研究協會
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2022-07-16
Also published as: US20230392140A1; EP4232570A1; WO2022087475A1; CA3196205A1; IL302243A; MX2023004690A; KR20230088898A; JP2023547615A; AU2021364920A1; CN116761885A

Abstract

本發明揭示反轉錄包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸的方法，其包含在包含非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄該多核苷酸，其中該反轉錄酶聚合併入該非天然dNTP之cDNA。在一些實施例中，該多核苷酸係以小於或等於約500 nM之濃度存在，及/或該多核苷酸為tRNA、mRNA、RNA適體，或複數個RNA適體候選者之成員。

Description

包含非天然核苷酸之多核苷酸之反轉錄

一經發現，61個有義密碼子/20個胺基酸遺傳密碼被視為不變的，在所有活生物體中均為保守的。然而，密集的表徵揭露了改變密碼子分配之出人意料的可塑性，且甚至在極少數情況下，擴展至包括非典型胺基酸(ncAA)硒半胱胺酸或吡咯離胺酸。(Yuan, J.等人 FEBS Lett. 2010, 584, 342-349；Hao, B.等人 Science 2002, 296, 1462-1466；Kryukov, G. V.等人 Science 2003, 300, 1439-1443。)所有此等改變均由天然密碼子之重新分配造成，且類似的策略形成了藉由利用終止密碼子及重新編碼抑止因子tRNA/胺基醯基tRNA合成酶(aaRS)之正交對來擴展密碼以包括所關注ncAA的重大努力之基礎。(Xiao, H.等人 Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2016, 8；Wang, L.等人 Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2006, 35, 225-249。)此等重新分配策略之替代方案將聚焦於經由研發非天然鹼基對(UBP)來形成新密碼子。(Malyshev, D. A.等人, Nature 2014, 509, 385-388；Zhang, Y.等人 Nature 2017, 551, 644-647。)最值得注意地，包括(d)NaM-(d)TPT3 UBP (圖1)之若干UBP已用於形成基於大腸桿菌( E. coli)之半合成生物體(SSO)，該等基於大腸桿菌之半合成生物體在其DNA中保留UBP，將其轉錄成mRNA及tRNA，且在提供有選擇性胺醯化具有ncAA之非天然的攜帶反密碼子之tRNA的aaRS時，使用其來轉譯含有ncAA之蛋白質。

雖然(d)NaM-(d)TPT3 UBP能夠產生非天然蛋白質，但併入ncAA之效率視其序列上下文而定，使得一些密碼子比其他密碼子更高效。檢查序列上下文，已鑑別出大量密碼子，其有效地複製為DNA且接著有效地轉錄成RNA並在核糖體處解碼。(Fischer, E. C.等人 Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 570-576。)由於針對UBP在SSO之DNA中的保留率之分析為可用的，因而已知若干低效密碼子之保真度降低係由不良轉錄或不良轉譯造成。然而，缺乏量測轉錄保真度之分析阻礙了鑑別損害保真度之特定步驟。另外，雖然很明顯不同的DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及大腸桿菌核糖體能夠有效地識別UBP，但尚未徹底的探索介導唯一其他常見DNA/RNA交易之反轉錄酶的能力，且唯一可用的資料表明其可能無法有效地識別UBP。(Eggert等人, Towards Reverse Transcription with an Expanded Genetic Alphabet. Chembiochem 2019, 20, 1642-1645。)因此，需要用於反轉錄包含非天然核苷酸之多核苷酸的方法，且需要可確定轉錄及反轉錄之保真度以使得可依據轉錄及轉譯之相對比重來理解SSO ncAA併入蛋白質之保真度的方法。

另外，RNA寡核苷酸可充當識別特異性目標之適體，例如出於抑制或偵測目標之目的。然而，自寡核苷酸庫(具有不同核苷酸序列的寡核苷酸之較大混合物)篩選及選擇RNA適體一般涉及將RNA轉化為cDNA之反轉錄步驟。因此，為研發包含非天然核苷酸之RNA適體，亦需要反轉錄包含非天然核苷酸之RNA的方法。

因此，提供以下實施例。實施例1為一種反轉錄包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸的方法，該方法包含在包含非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄該多核苷酸，其中該反轉錄酶聚合併入該非天然dNTP作為非天然核苷酸之cDNA。

實施例2為如實施例1之方法，其中：該多核苷酸係以小於或等於約500 nM之濃度存在。

實施例2.1為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄酶為SuperScript III。

實施例2.2為如前述實施例中任一項之方法，其中該非天然dNTP不為dTPT3TP。

實施例2.3為如前述實施例中任一項之方法，其中該方法進一步包含使用識別該非天然核苷酸之結合配偶體來量測該cDNA中該非天然核苷酸之量。

實施例2.4為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄酶產生全長cDNA，且至少25%之該全長cDNA包含該非天然核苷酸。

實施例2.5為如前述實施例中任一項之方法，其中該多核苷酸為tRNA、mRNA、RNA適體，或複數種RNA適體候選物之成員。

實施例3為如前述實施例中任一項之方法，其中該多核苷酸為RNA，視情況其中該RNA為mRNA或tRNA。

實施例4為如實施例1至3中任一項之方法，其進一步包含量測該cDNA中該非天然核苷酸之量。

實施例5為一種量測非天然核苷酸之併入的方法，其包含： a. 在包含第一非天然核鹼基之非天然NTP的存在下用RNA聚合酶轉錄包含非天然去氧核糖核苷酸之多核苷酸，以產生包含第一非天然核苷酸之RNA； b. 在包含第二非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄該RNA，其中該反轉錄酶聚合併入該非天然NTP作為第二非天然核苷酸之cDNA；及 c. 量測該cDNA中該第二非天然核苷酸之量。

實施例5.1為如實施例5之方法，其為一種量測轉錄與反轉錄之組合保真度的方法。

實施例5.2為如實施例5之方法，其為一種量測在轉錄及反轉錄期間非天然核苷酸之保留率的方法。

實施例6為如實施例5至5.2中任一項之方法，其中該轉錄步驟係在活體內進行。

實施例7為如前一實施例之方法，其中該轉錄步驟係在原核生物或細菌中進行。

實施例8為如前一實施例之方法，其中該轉錄步驟係在大腸桿菌中進行。

實施例9為如實施例5之方法，其中該轉錄步驟在活體外進行。

實施例10為如實施例5至9中任一項之方法，其中該cDNA分子中該第二非天然核苷酸之量係相對於在轉錄之前該多核苷酸中該非天然去氧核糖核苷酸之量來量測。

實施例11為如實施例5至10中任一項之方法，其中該量測包含： a. 在轉錄之前對該多核苷酸執行生物素移位分析以測定在轉錄之前含有該非天然核苷酸的該多核苷酸之比例；及 b. 對該cDNA執行生物素移位分析以測定含有該非天然核苷酸的該cDNA之比例。

實施例12為如實施例4至10中任一項之方法，其中該cDNA中該非天然核苷酸或該第二非天然核苷酸之量係使用結合非天然核鹼基之結合配偶體來量測。

實施例13為如實施例4至10中任一項之方法，其中量測該cDNA中該非天然核苷酸或該第二非天然核苷酸之量包含凝膠移位分析或生物素移位分析。

實施例14為如前一實施例之方法，其中該生物素移位分析包含： a. 在包含與該cDNA中之該非天然核苷酸配對的生物素化核鹼基之非天然dNTP的存在下擴增該cDNA； b. 使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物分離；及 c. 量測包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物及不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物的量，或包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物的比率，或含有該非天然核苷酸之cDNA的比例。

實施例15為如前一實施例之方法，其中使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核鹼基之DNA擴增產物分離包含凝膠電泳，視情況其中該凝膠電泳為聚丙烯醯胺凝膠電泳。

實施例16為如實施例14至15中任一項之方法，其中使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物分離包含將該等擴增產物與鏈黴抗生物素蛋白一起培育。

實施例17為如前述實施例中任一項之方法，其中該RNA或該多核苷酸在反轉錄期間係以小於或等於約1 μM之濃度存在。

實施例18為如前述實施例中任一項之方法，其中該RNA或該多核苷酸在反轉錄期間係以在以下範圍內之濃度存在：約1至10 nM、約10至20 nM、約20至30 nM、約30至40 nM、約40至50 nM、約50至75 nM、約75至100 nM、約100至150 nM、約150至200 nM、約200至300 nM、約300至400 nM或約400至500 nM。

實施例19為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄酶產生全長cDNA，且其中至少25%之該全長cDNA包含該非天然核苷酸。

實施例20為如前一實施例之方法，其中至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%之該非截斷cDNA包含該非天然核苷酸。

實施例21為如前述實施例中任一項之方法，其中包含該非天然核糖核苷酸之該RNA或該多核苷酸為mRNA。

實施例22為如實施例20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之第一位置(X-N-N或Y-N-N)處。

實施例23為如實施例20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之中間位置(N-X-N或N-Y-N)處。

實施例24為如實施例20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之最後位置(N-N-X或N-N-Y)處。

實施例25為如實施例1至25中任一項之方法，其中在該mRNA中含有該非天然核糖核苷酸之該密碼子為AXC、AYC、GXC、GYC、GXT、GYT、AXA、AXT、TXA或TXT。

實施例26為如實施例1至20中任一項之方法，其中包含該非天然核糖核苷酸之該RNA或該多核苷酸為tRNA。

實施例27為如實施例26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之反密碼子之第一位置(X-N-N或Y-N-N)處。

實施例28為如實施例26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之該反密碼子之中間位置(N-X-N或N-Y-N)處。

實施例29為如實施例26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之該反密碼子之最後位置(N-N-X或N-N-Y)處。

實施例30為如實施例26至29中任一項之方法，其中該tRNA之該反密碼子為GYT、GXT、GYC、GXC、CYA、CXA、AYC或AXC。

實施例31為如實施例1至30中任一項之方法，其中該非天然核糖核苷酸為X，其中X包含

作為該非天然核糖核苷酸之該核鹼基(NaM)。

實施例32為如實施例1至30中任一項之方法，其中該非天然核糖核苷酸為Y，其中Y包含

作為該非天然核糖核苷酸之該核鹼基(TPT3)。

實施例33為如實施例1至20或31至32中任一項之方法，其中該RNA為RNA適體。

實施例34為一種篩選RNA適體候選物之方法，其包含： a. 將複數種不同RNA寡核苷酸與目標一起培育，其中該等RNA寡核苷酸包含至少一種非天然核苷酸； b. 對結合於該目標之該複數種RNA寡核苷酸執行至少一輪選擇； c. 分離結合於該目標之富集RNA寡核苷酸，其中該等經分離之富集RNA寡核苷酸包含RNA適體；及 d. 將該等RNA適體中之一或多者反轉錄成cDNA，其中該等cDNA包含在與該RNA適體中之該至少一種非天然核苷酸互補之位置處的非天然去氧核糖核苷酸，藉此提供對應於該等RNA適體之cDNA分子庫。

實施例35為如前一實施例之方法，其中該複數種不同RNA寡核苷酸包含隨機化核苷酸區域。

實施例36為如前一實施例之方法，其中該隨機化核苷酸區域包含該至少一種非天然核苷酸。

實施例37為如實施例34至36中任一項之方法，其中該等RNA寡核苷酸包含條碼序列及/或引子結合序列。

實施例38為如實施例34至37中任一項之方法，其中該方法進一步包含對該等cDNA分子進行定序。

實施例39為如實施例34至38中任一項之方法，其中執行至少一輪選擇包含移除未結合或微弱結合之RNA寡核苷酸的洗滌步驟。

實施例40為如實施例34至39中任一項之方法，其中該方法進一步包含使該等cDNA分子之序列突變以產生複數個額外序列。

實施例41為如前一實施例之方法，其中使該複數個額外序列轉錄成RNA且經受針對結合於該目標之RNA適體的至少一輪額外選擇。

實施例42為如實施例40至41中任一項之方法，其中使該等cDNA分子之序列突變包含易錯PCR。

實施例43為如實施例34至42中任一項之方法，其中該方法進一步包含增加在額外輪選擇中結合於該目標之選擇壓力。

實施例44為如前一實施例之方法，其中增加選擇壓力包含以比在前一輪中更高的鹽濃度執行一或多個洗滌步驟及/或在該選擇期間包括結合競爭物。

實施例45為如實施例34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體結合該目標之能力。

實施例46為如前一實施例之方法，其中分析該等RNA適體結合該目標之能力包含測定 K _d、 k _on或 k _off。

實施例47為如實施例34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體促效該目標之能力。

實施例48為如前一實施例之方法，其中分析該等RNA適體促效該目標之能力包含測定EC ₅₀值。

實施例49為如實施例34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體拮抗該目標之能力。

實施例50為如前一實施例之方法，其中分析該等RNA適體拮抗該目標之能力包含測定 K _i或IC ₅₀值。

實施例51為如前述實施例中任一項之方法，其中至少一種非天然核苷酸包含：

。

實施例52為如前一實施例之方法，其中經歷反轉錄的多核苷酸中之至少一種非天然核苷酸包含：

。

實施例53為如實施例51或52之方法，其中併入cDNA中之至少一種非天然核苷酸包含：

，且視情況其中該非天然核苷酸中之該至少一種非天然核鹼基不同於經歷反轉錄的該多核苷酸中之該至少一種非天然核鹼基。

實施例54為如實施例51至53中任一項之方法，其中該至少一種非天然核苷酸包含：

。

實施例55為如實施例51至53之方法，其中該至少一種非天然核苷酸包含：

。

實施例56為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄酶為禽類骨髓胚細胞過多症病毒(Avian Myeloblastosis Virus；AMV)反轉錄酶、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus；MMLV)反轉錄酶、Super Script II (SS II)反轉錄酶、Super Script III (SS III)反轉錄酶、Super Script IV (SS IV)反轉錄酶或Volcano 2G (V2G)反轉錄酶。

實施例57為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄酶為SuperScript III。

實施例58為如前述實施例中任一項之方法，其中該非天然dNTP不為dTPT3TP。

實施例59為如前述實施例中任一項之方法，其中該反轉錄在活體外發生。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2020年10月23日申請之美國臨時專利申請案第63/104,785號之權益，該案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。關於聯邦贊助之研究之申明

本發明係在政府支持下，在由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之授權號GM118178下進行。在本發明中政府具有某些權利。定義

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與熟習所主張之主題所屬技術者通常所理解相同的含義。應理解，前述一般描述及以下詳細描述僅為例示性及解釋性的且不限制所主張之任何主題。在本申請案中，除非另外特定陳述，否則單數之使用包括複數。必須指出，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數種參考物。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式的使用不為限制性的。

如本文中所使用，範圍及量可表述為「約」特定值或範圍。約亦包括準確量。因此，「約5 µL」意謂「約5 µL」以及「5 µL」。一般而言，術語「約」包括將預期在實驗誤差內之量。

如本文中所使用之術語化學結構之「類似物」係指保留與母結構相當大的相似性的化學結構，但其可能不易於以合成方式衍生自母結構。在一些實施例中，核苷酸類似物為非天然核苷酸。在一些實施例中，核苷類似物為非天然核苷。易於以合成方式衍生自母化學結構之相關化學結構稱為「衍生物」。

核苷酸由核鹼基、糖及至少一種磷酸構成。核苷酸因此可指由DNA及RNA構成之核苷三磷酸、RNA及DNA聚合酶之受質、核苷二磷酸或核苷單磷酸。核苷酸涵蓋天然存在之核苷酸或非天然核苷酸(亦即核苷酸類似物)。天然存在之核苷酸包括在天然存在之DNA或RNA中發現的核苷酸，包括天然存在之去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。非天然核苷酸含有與天然存在之核苷酸中的核鹼基、糖及/或磷酸部分的一些類型之差異。經修飾核苷酸包含3'OH或5'OH基團、主鏈、糖組分或核鹼基中之一或多者之修飾，及/或非天然存在之連接分子之添加。非天然核苷酸包括DNA或RNA類似物(例如，含有核鹼基類似物、糖類似物及/或非原生主鏈及類似物)。

在一些實施例中，「核苷」為包含核鹼基部分及糖部分之化合物。核苷包括但不限於天然存在之核苷(對應於在DNA及RNA中發現之核苷酸)、經修飾核苷及具有模擬核鹼基及/或糖基團之核苷。核苷包括包含任何多種取代基之核苷。核苷可為經由核鹼基與還原糖基團之間的醣苷連接形成之醣苷化合物。

「核鹼基」一般為核苷之雜環部分，且可為芳族或部分不飽和的。核鹼基不包括核苷或核苷酸之糖組分(例如，核糖、去氧核糖或其類似物；糖類似物之實例(亦稱為經修飾糖)在本文中別處進行描述)。核鹼基可為天然存在的，可經修飾，可不攜帶與天然核鹼基之類似性，且可例如藉由有機合成來合成。在某些實施例中，核鹼基包含能夠在使用或不使用氫鍵之情況下與另一核酸之核鹼基相互作用的任何原子或原子群。在某些實施例中，非天然核鹼基不衍生自天然核鹼基。應注意，非天然核鹼基不一定具有鹼性特性；然而，為簡單起見而將其稱為核鹼基。在一些實施例中，當提及核鹼基時，「(d)」指示核鹼基可連接至去氧核糖或核糖。核鹼基通常亦稱為鹼基。

在一些實施例中，如本發明中所描述之非天然mRNA密碼子及非天然tRNA反密碼子可依據其DNA編碼序列來書寫。舉例而言，非天然tRNA反密碼子可書寫為GYU或GYT。

如本文中所使用之術語「多核苷酸」係指DNA、RNA、DNA樣或RNA樣聚合物，諸如此項技術中所熟知之肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、非天然鹼基及類似物。多核苷酸可在自動合成器中合成，例如使用胺基偶磷酯化學方法或適於合成器使用之其他化學方法。

「DNA」包括但不限於cDNA及基因體DNA。DNA可藉由共價或非共價手段連接至另一生物分子，包括但不限於RNA或肽。「RNA」包括編碼RNA，例如信使RNA (mRNA)。在一些實施例中，RNA為rRNA、RNAi、snoRNA、微小RNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA、長ncRNA或其任何組合或雜合體。在一些情況下，RNA為核糖核酸酶之組分。DNA及RNA可呈任何形式，包括但不限於直鏈、環狀、超螺旋、單股及雙股。

「mRNA」為包含能夠藉由核糖體轉譯之ORF的RNA。

「tRNA」為能夠用天然胺基酸或ncAA填充且通過核糖體參與mRNA之轉譯的RNA。

肽核酸(PNA)為合成DNA/RNA類似物，其中肽樣主鏈置換DNA或RNA之磷酸糖類主鏈。PNA寡聚物在與互補DNA結合時展示更高的結合強度及更大的特異性，其中PNA/DNA鹼基失配比DNA/DNA雙螺旋中之類似失配更去穩定化。此結合強度及特異性亦適用於PNA/RNA雙螺旋。PNA不易由核酸酶或蛋白酶識別，此使其對酶降解具有抗性。PNA亦在寬pH範圍內為穩定的。亦參見Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (1991年12月). 「Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide」, Science254 (5037): 1497-500. 數位物件識別碼：10.1126/science.1962210. PMID 1962210；及Egholm M, Buchardt O, Christensen L, Behrens C, Freier SM, Driver DA, Berg RH, Kim SK, Nordén B及Nielsen PE (1993), 「PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson-Crick Hydrogen Bonding Rules」. Nature365 (6446): 566-8. 數位物件識別碼：10.1038/365566a0. PMID 7692304。

鎖核酸(LNA)為經修飾RNA核苷酸，其中LNA核苷酸之核糖部分經連接2'氧及4'碳之額外橋修飾。橋將核糖「鎖定」在通常發現於A-形式雙螺旋中之3'-內(北)構形中。無論何時需要，LNA核苷酸可與寡核苷酸中之DNA或RNA殘基混合。此類寡聚物可以化學方式合成且為可商購的。鎖定核糖構形增強了核鹼基堆疊及主鏈預組織。參見例如Kaur, H；Arora, A；Wengel, J；Maiti, S (2006), 「Thermodynamic, Counterion, and Hydration Effects for the Incorporation of Locked Nucleic Acid Nucleotides into DNA Duplexes」, Biochemistry45 (23): 7347-55. 數位物件識別碼：10.1021/bi060307w. PMID 16752924；Owczarzy R.；You Y., Groth C.L., Tataurov A.V. (2011), 「Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes.」, Biochem.50 (43): 9352-9367. 數位物件識別碼：10.1021/bi200904e. PMC 3201676. PMID 21928795；Alexei A. Koshkin；Sanjay K. Singh, Poul Nielsen, Vivek K. Rajwanshi, Ravindra Kumar, Michael Meldgaard, Carl Erik Olsen, Jesper Wengel (1998), 「LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition」, Tetrahedron54 (14): 3607-30. 數位物件識別碼：10.1016/S0040-4020(98)00094-5；及Satoshi Obika；Daishu Nanbu, Yoshiyuki Hari, Ken-ichiro Morio, Yasuko In, Toshimasa Ishida, Takeshi Imanishi (1997),「Synthesis of 2'- O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering」, Tetrahedron Lett.38 (50): 8735-8. 數位物件識別碼：10.1016/S0040-4039(97)10322-7。

「適體」係指可特異性結合例如具有高親和力之目標的寡核苷酸。適體可包含RNA且可包含天然或非天然核苷酸。

如本文中所使用，「全長」意謂諸如cDNA之多核苷酸相對於模板化其合成之互補序列(模板多核苷酸)為非截斷的。在模板多核苷酸包含非天然核苷酸之情況下，全長多核苷酸包含在與模板多核苷酸中之非天然核苷酸互補之位置中的核苷酸及其3'之核苷酸。全長多核苷酸與截斷多核苷酸相反，截斷多核苷酸係在完成之前合成終止的結果，例如在與模板多核苷酸中之非天然核苷酸互補的位置處或附近。

本文中所使用之章節標題僅用於組織目的且不應解釋為限制所描述主題。反轉錄包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸的方法

本文中揭示反轉錄包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸的方法。在此類方法中，可在包含非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄多核苷酸。反轉錄酶聚合併入非天然dNTP之cDNA，例如在與多核苷酸中非天然核糖核苷酸之位置互補的cDNA之位置中。

在一些實施例中，多核苷酸係以小於或等於約500 nM之濃度存在。在一些實施例中，RNA或多核苷酸在反轉錄期間係以在以下範圍內之濃度存在：約1至10 nM、約10至20 nM、約20至30 nM、約30至40 nM、約40至50 nM、約50至75 nM、約75至100 nM、約100至150 nM、約150至200 nM、約200至300 nM、約300至400 nM或約400至500 nM。在一些實施例中，濃度處於或低於約100 nM，例如約5至100 nM，諸如約10至100 nM。在一些實施例中，濃度處於或低於約50 nM，例如約5至50 nM，諸如約10至50 nM。在一些實施例中，濃度處於或低於約30 nM，例如約5至30 nM，諸如約10至30 nM。如實例中所描述，使用比先前試圖反轉錄包含非天然核苷酸之多核苷酸更低的濃度可改善反轉錄反應之效能。

可商購反轉錄酶可用於所揭示之方法中。在一些實施例中，反轉錄酶為禽類骨髓胚細胞過多症病毒(AMV)反轉錄酶、莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)反轉錄酶、Super Script II (SS II)反轉錄酶、Super Script III (SS III)反轉錄酶、Super Script IV (SS IV)反轉錄酶或Volcano 2G (V2G)反轉錄酶。在一些實施例中，反轉錄酶為SuperScript III (例如，可獲自ThermoFisher Scientific, 目錄號18080093)。SuperScript III為經基因工程改造之MMLV反轉錄酶，其藉由引入若干突變來降低核糖核酸酶H活性、增加半衰期及改善熱穩定性來形成。

包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸可為反轉錄酶之任何適合受質，例如RNA、RNA-DNA融合物或DNA。反轉錄酶已知接受除RNA以外的DNA或RNA-DNA雜合體作為受質。在一些實施例中，包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸為RNA。舉例而言，RNA可為mRNA。在另一實例中，RNA可為tRNA。在又另一實例中，RNA可為RNA適體，或複數個適體候選者之成員(通常稱為「庫」)，例如其中複數個適體候選者在相同或不同反應容器或腔室中經歷反轉錄。前述實施例中任一項中之多核苷酸可包含除非天然核苷酸以外的其他修飾；例如，可存在包含非天然核鹼基，且在相同及/或其他核苷酸位置處對核鹼基或一或多種糖及/或磷酸之修飾的非天然核苷酸。

在RNA為mRNA之情況下，非天然核糖核苷酸可位於密碼子中。非天然核苷酸可出現於密碼子之第一、第二或第三位置中。例示性密碼子為AXC、AYC、GXC、GYC、GXT、GYT、AXA、AXT、TXA或TXT，其中非天然核糖核苷酸可由X或Y表示。在一些實施例中，X包含

作為非天然核糖核苷酸之核鹼基(NaM；此處及通篇出於清楚起見而僅展示非天然去氧或核糖核苷酸/核苷之核鹼基部分)，及/或Y包含

作為非天然核糖核苷酸之核鹼基(TPT3)。

在RNA為tRNA之情況下，非天然核糖核苷酸可位於tRNA之反密碼子中。非天然核苷酸可出現於反密碼子之第一、第二或第三位置中。例示性反密碼子為GYT、GXT、GYC、GXC、CYA、CXA、AYC或AXC，其中非天然核糖核苷酸可由X或Y表示。在一些實施例中，X包含

作為非天然核糖核苷酸之核鹼基(NaM)，及/或Y包含

作為非天然核糖核苷酸之核鹼基(TPT3)。

各種非天然核鹼基為已知的且可用作dNTP及/或非天然核糖核苷酸中之非天然核鹼基。在一些實施例中，非天然核鹼基獨立地選自由以下組成之群：

。在一些實施例中，非天然dNTP不為dTPT3TP。

在一些實施例中，非天然核鹼基選自下文所示之彼等，其中波浪線或R鑑別與糖(例如，去氧核糖或核糖)之連接點：

。

在一些實施例中，核鹼基包含以下結構：

，其中各X獨立地為碳或氮；R ₂為視情況存在的，且當存在時獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、鹵素、氰基或疊氮基；其中各Y獨立地為硫、氧、硒或二級胺；其中各E獨立地為氧、硫或硒；且其中波浪線指示鍵結至核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物之點，其中核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物呈連接至單磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基(視情況包含α-硫代三磷酸酯基、β-硫代三磷酸酯基或γ-硫代三磷酸酯基)的游離形式，或包括於RNA或DNA中或包括於RNA類似物或DNA類似物中。在一些實施例中，R ₂為低碳數烷基(例如，C ₁-C ₆)、氫或鹵素。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，R ₂為氟。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，X為碳。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，E為硫。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，Y為硫。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，核鹼基具有以下結構：

。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，E為硫且Y為硫。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，波浪線指示鍵結至核糖基或去氧核糖基部分之點。在本文中所描述之核鹼基之一些實施例中，波浪線指示鍵結至連接至三磷酸酯基之核糖基或去氧核糖基部分之點。

在一些實施例中，核鹼基為核酸聚合物之組分。在一些實施例中，核鹼基為tRNA之組分。在一些實施例中，核鹼基為tRNA中之反密碼子之組分。在一些實施例中，核鹼基為mRNA之組分。在一些實施例中，核鹼基為mRNA之密碼子之組分。在一些實施例中，核鹼基為RNA或DNA之組分。在一些實施例中，核鹼基為DNA中之密碼子之組分。在一些實施例中，核鹼基與另一互補核鹼基形成核鹼基對。

非天然核鹼基之額外實例包括2-硫代尿嘧啶、2'-去氧尿苷、4-硫基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)、5-鹵代尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、6-偶氮-尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代尿嘧啶、假尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧雜乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧雜乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、5-鹵代胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、環胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、5,6-二氫胞嘧啶、5-硝基胞嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、氮雜胞嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-乙醯胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、啡㗁𠯤胞苷([5,4-b][l,4]苯并㗁𠯤-2(3H)-酮)、啡噻𠯤胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻𠯤-2(3H)-酮)、啡㗁𠯤胞苷(9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并㗁𠯤-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、2-胺基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-丙基-腺嘌呤、2-胺基-2'-去氧腺苷、3-去氮雜腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基及8-羥基取代之腺嘌呤、N6-異戊烯基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-甲基硫-N6-異戊烯基腺嘌呤、6-氮雜-腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、鳥嘌呤之2-丙基及烷基衍生物、3-去氮雜鳥嘌呤、6-硫-鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基及8-羥基取代之鳥嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、6-氮雜-鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、1-甲基肌苷、Q核苷(queosine)、β-D-半乳糖苷基Q核苷、肌苷、β-D-甘露糖苷基Q核苷、懷丁氧苷(wybutoxosine)、羥基尿素、(acp3)w、2-胺基吡啶或2-吡啶酮。

在一些實施例中，非天然核鹼基選自尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)、2-胺基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(尤其5-溴基)、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤以及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。某些非天然核酸，諸如5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2取代之嘌呤、N-6取代之嘌呤、O-6取代之嘌呤、2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加雙螺旋形成之穩定性的彼等物、通用核酸、疏水性核鹼基、混雜核鹼基、尺寸擴展核鹼基、氟化核鹼基、5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基、其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、5-鹵代胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH ₃)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸之其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(尤其5-溴基)、5-三氟甲基、其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、3-去氮雜鳥嘌呤、3-去氮雜腺嘌呤、三環嘧啶、啡㗁𠯤胞苷([5,4-b][l,4]苯并㗁𠯤-2(3H)-酮)、啡噻𠯤胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻𠯤-2(3H)-酮)、G-夾鉗(G-clamp)、啡㗁𠯤胞苷(例如，9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并㗁𠯤-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、其中嘌呤或嘧啶核鹼基經其他雜環置換之彼等物、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥苷、2-胺基吡啶、2-吡啶酮、氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基尿素、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶及5-碘尿嘧啶、2-胺基-腺嘌呤、6-硫-鳥嘌呤、2-硫基-胸腺嘧啶、4-硫基-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫基-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、5-羥基胞嘧啶、2'-去氧尿苷、2-胺基-2'-去氧腺苷，以及描述於以下中之彼等者：美國專利第3,687,808號；第4,845,205號；第4,910,300號；第4,948,882號；第5,093,232號；第5,130,302號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,645,985號；第5,681,941號；第5,750,692號；第5,763,588號；第5,830,653號及第6,005,096號；WO 99/62923；Kandimalla等人, (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I.編, John Wiley & Sons, 1990, 858-859；Englisch等人, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；及Sanghvi, 第15章, Antisense Research and Applications, Crooke及Lebleu編, CRC Press, 1993, 273-288。額外核鹼基修飾可發現於例如美國專利第3,687,808號；Englisch等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613中。

包含各種雜環核鹼基及各種糖部分(及糖類似物)之非天然核酸為此項技術中可獲得的，且在一些情況下，核酸包括除天然存在之核酸之主要五種核鹼基組分以外的一種或若干種雜環核鹼基。舉例而言，在一些情況下，雜環核鹼基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-胺基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤經由9位置、嘧啶經由1位置、吡咯并嘧啶經由7位置且吡唑并嘧啶經由1位置連接至核酸之糖部分。

在一些實施例中，核苷酸類似物亦在磷酸酯部分處經修飾。經修飾磷酸酯部分包括但不限於具有兩個核苷酸之間的鍵處之修飾且含有例如以下之磷酸酯部分：硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；膦酸甲酯及其他膦酸烷基酯，包括膦酸3'-伸烷基酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯；硫羰基胺基磷酸酯；膦酸硫羰基烷基酯；硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯。應理解，在兩個核苷酸之間的此等磷酸酯或經修飾磷酸酯鍵係經由3'-5'鍵或2'-5'鍵，且鍵含有反轉極性，諸如3'-5'與5'-3'或2'-5'與5'-2'。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。眾多美國專利教示如何製造及使用含有經修飾磷酸酯之核苷酸，且包括但不限於3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；及5,625,050。

在一些實施例中，非天然核酸包括2',3'-二去氧基-2',3'-二去氫-核苷(PCT/US2002/006460)、5'-取代之DNA及RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人, J. Org Chem., 1995, 60, 788-789；Wang等人, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890；及Mikhailov等人, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343；Leonid等人, 1995, 14(3-5), 901-905；及Eppacher等人, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)，或製成為具有經修飾核鹼基之單磷酸酯的5'-取代之單體(Wang等人, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)。

在一些實施例中，非天然核酸包括在糖環之5'位置及2'位置處的修飾(PCT/US94/02993)，諸如5'-CH ₂-取代之2'-O-保護核苷(Wu等人, Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143及Wu等人, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924)。在一些情況下，非天然核酸包括已經製備以用於併入至寡核苷酸中的醯胺連接之核苷二聚體，其中在二聚體(5'至3')中的3'連接之核苷包含2'-OCH ₃及5'-(S)-CH ₃(Mesmaeker等人, Synlett, 1997, 1287-1290)。非天然核酸可包括經2'-取代之5'-CH ₂(或O)修飾之核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可包括5'-亞甲基膦酸酯DNA及RNA單體以及二聚體(Bohringer等人, Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726；Collingwood等人, Synlett, 1995, 7, 703-705；及Hutter等人, Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806)。非天然核酸可包括具有2'-取代之5'-膦酸酯單體(US2006/0074035)及其他經修飾之5'-膦酸酯單體(WO1997/35869)。非天然核酸可包括5'-修飾之亞甲基膦酸酯單體(EP614907及EP629633)。非天然核酸可包括在5'及/或6'位置處包含羥基的5'或6'-膦酸酯核糖核苷之類似物(Chen等人, Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786；Jung等人, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509；Gallier等人, Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933；及Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033)。非天然核酸可包括具有5'-磷酸酯基之5'-膦酸酯去氧核糖核苷單體及二聚體(Nawrot等人, Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82)。非天然核酸可包括具有6'-膦酸酯基之核苷，其中5'或/及6'位置未經取代或經以下取代：硫代三級丁基(SC(CH3) ₃) (及其類似物)；亞甲基胺基(CH ₂NH ₂) (及其類似物)或氰基(CN) (及其類似物) (Fairhurst等人, Synlett, 2001, 4, 467-472；Kappler等人, J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038；Kappler等人, J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184；Vrudhula等人, J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894；Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377；Geze等人, J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640；及Hampton等人, J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414)。

在一些實施例中，非天然核酸亦包括糖部分之修飾。在一些情況下，核酸含有一或多個核苷，其中糖基已經修飾。此類糖修飾之核苷可賦予增強的核酸酶穩定性、增加的結合親和力或某些其他有益生物特性。在某些實施例中，核酸包含經化學修飾之核呋喃糖環部分。化學修飾之核呋喃糖環之實例包括而不限於取代基之添加(包括5'及/或2'取代基；橋接兩個環原子以形成雙環核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R ₁)(R ₂) (R=H、C ₁-C ₁₂烷基或保護基置換核糖基環氧原子)；及其組合。化學修飾之糖之實例可見於WO2008/101157、US2005/0130923及WO2007/134181中。

在一些情況下，經修飾之核酸包含經修飾之糖或糖類似物。因此，除核糖及去氧核糖以外，糖部分可為戊醣、去氧戊醣、己醣、去氧己醣、葡萄糖、阿拉伯糖(arabinose)、木糖、來蘇糖(lyxose)或糖「類似物」環戊基。糖可呈哌喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可為核糖、去氧核糖、阿拉伯糖或2'-O-烷基核糖之呋喃糖苷，且糖可以[α]或[β]變旋異構組態連接至各別雜環核鹼基。糖修飾包括但不限於2'-烷氧基-RNA類似物、2'-胺基-RNA類似物、2'-氟-DNA及2'-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合體(chimeras)。舉例而言，糖修飾可包括2'-O-甲基-尿苷或2'-O-甲基-胞苷。糖修飾包括2'-O-烷基-取代之去氧核糖核苷及2'-O-乙二醇樣核糖核苷。已知此等糖或糖類似物及各別「核苷」之製備，其中此類糖或類似物連接至雜環核鹼基(核酸鹼基)。亦可進行糖修飾且將其與其他修飾組合。

糖部分之修飾包括核糖及去氧核糖之天然修飾以及非天然修飾。糖修飾包括但不限於在2'位置處之以下修飾：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C ₁至C ₁₀烷基或C ₂至C ₁₀烯基及炔基。2'糖修飾亦包括但不限於-O[(CH ₂) _nO] _mCH ₃、-O(CH ₂) _nOCH ₃、-O(CH ₂) _nNH ₂、-O(CH ₂) _nCH ₃、-O(CH ₂) _nONH ₂及-O(CH ₂) _nON[(CH ₂) _nCH ₃)] ₂，其中n及m為1至約10。

在2'位置處之其他修飾包括但不限於C ₁至C ₁₀低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH ₃、OCN、Cl、Br、CN、CF ₃、OCF ₃、SOCH ₃、SO ₂、CH ₃、ONO ₂、NO ₂、N ₃、NH ₂、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷基胺基、經取代之矽基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入基團(intercalator)、用於改善寡核苷酸之藥物動力學特性的基團或用於改善寡核苷酸之藥效動力學特性的基團及具有類似特性之其他取代基。類似修飾亦可在糖上之其他位置處進行，尤其3'末端核苷酸上的糖之3'位置或5'末端核苷酸之2'至5'連接之寡核苷酸及5'位置中。經修飾之糖亦包括含有在橋接環氧處之修飾(諸如CH ₂及S)的經修飾之糖。核苷酸糖類似物亦可具有糖模擬物(諸如環丁基部分)而非呋喃戊醣基糖。存在教示此類經修飾之糖結構之製備且詳述及描述一系列核鹼基修飾的眾多美國專利，諸如美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；第4,845,205號；第5,130,302號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,681,941號；及第5,700,920號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。

具有經修飾之糖部分的核酸之實例包括而不限於包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH ₃及2'-O(CH ₂) ₂OCH ₃取代基之核酸。在2'位置處之取代基亦可選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-(C ₁-C _1O烷基)、OCF ₃、O(CH ₂) ₂SCH ₃、O(CH ₂) ₂-O-N(R _m)(R _n)及O-CH ₂-C(=O)-N(R _m)(R _n)，其中各R _m及R _n獨立地為H或經取代或未經取代之C ₁-C ₁₀烷基。

在某些實施例中，本文中所描述之核酸包括一或多種雙環核酸。在某些此類實施例中，雙環核酸包含在4'核糖基環原子與2'核糖基環原子之間的橋。在某些實施例中，本文中所提供之核酸包括一或多種雙環核酸，其中橋包含4'至2'雙環核酸。此類4'至2'雙環核酸之實例包括但不限於下式中之一者：4'-(CH ₂)-O-2' (LNA)；4'-(CH ₂)-S-2'；4'-(CH ₂) ₂-O-2' (ENA)；4'-CH(CH ₃)-O-2'及4'-CH(CH ₂OCH ₃)-O-2'及其類似物(參見美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH ₃)(CH ₃)-O-2'及其類似物(參見WO2009/006478；WO2008/150729；US2004/0171570；美國專利第7,427,672號；Chattopadhyaya等人, J. Org. Chem., 209, 74, 118-134及WO2008/154401)。亦參見例如：Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava等人, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379；Elayadi等人, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram等人, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；美國專利第4,849,513號；第5,015,733號；第5,118,800號；第5,118,802號；第7,053,207號；第6,268,490號；第6,770,748號；第6,794,499號；第7,034,133號；第6,525,191號；第6,670,461號；及第7,399,845號；國際公開案第WO2004/106356號、第WO1994/14226號、第WO2005/021570號、第WO2007/090071號及第WO2007/134181號；美國專利公開案第US2004/0171570號、第US2007/0287831號及第US2008/0039618號；美國臨時申請案第60/989,574號、第61/026,995號、第61/026,998號、第61/056,564號、第61/086,231號、第61/097,787號及第61/099,844號；以及國際申請案第PCT/US2008/064591號、第PCT US2008/066154號、第PCT US2008/068922號及第PCT/DK98/00393號。

在某些實施例中，核酸包含連接之核酸。核酸可使用任何核酸間鍵連接在一起。兩個主要類別之核酸間連接基團係由存在或不存在磷原子來定義。代表性含磷核酸間鍵包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯(P=S)。代表性不含磷核酸間連接基團包括但不限於亞甲基甲基亞胺基(-CH ₂-N(CH ₃)-O-CH ₂-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰基胺基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H) _2-O-)；及N,N*-二甲基肼(-CH ₂-N(CH ₃)-N(CH ₃))。在某些實施例中，具有對掌性原子之核酸間鍵可製備為外消旋混合物、單獨的鏡像異構物(例如，膦酸烷基酯及硫代磷酸酯)。非天然核酸可含有單一修飾。非天然核酸可含有在部分中之一者內或在不同部分之間的多個修飾。

對核酸之主鏈磷酸酯修飾包括但不限於膦酸甲酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、二硫代磷酸酯(phosphodithioate)及硼烷磷酸酯，且可以任何組合形式使用。亦可使用其他非磷酸酯鍵。

在一些實施例中，主鏈修飾(例如，膦酸甲酯、硫代磷酸酯、磷醯胺酸及二硫代磷酸酯核苷酸間鍵)可對經修飾核酸賦予免疫調節活性及/或增強其活體內穩定性。

在一些情況下，磷衍生物(或經修飾磷酸酯基)連接至糖或糖類似物部分且可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯或其類似物。含有經修飾磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵之例示性多核苷酸可發現於Peyrottes等人, 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848；Chaturvedi等人, 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323；及Schultz等人, (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973；Matteucci, 1997, 「Oligonucleotide Analogs: an Overview」, Oligonucleotides as Therapeutic Agents(Chadwick及Cardew編) John Wiley and Sons, New York, NY；Zon, 1993, 「Oligonucleoside Phosphorothioates」, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, 第165-190頁；Miller等人, 1971, JACS 93:6657-6665；Jager等人, 1988, Biochem. 27:7247-7246；Nelson等人, 1997, JOC 62:7278-7287；美國專利第5,453,496號；及Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179中。

在一些情況下，主鏈修飾包含用替代部分(諸如陰離子、中性或陽離子基團)置換磷酸二酯鍵。此類修飾之實例包括：陰離子核苷間鍵；N3'至P5'胺基磷酸酯修飾；硼烷磷酸酯DNA；促寡核苷酸；中性核苷間鍵，諸如膦酸甲酯；醯胺連接之DNA；亞甲基(甲基亞胺基)鍵；甲縮醛及硫代甲縮醛鍵；含有磺醯基之主鏈；N-𠰌啉基寡聚物；肽核酸(PNA)；及帶正電去氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179)。經修飾之核酸可包含嵌合或混合主鏈，該主鏈包含一或多個修飾，例如磷酸酯鍵之組合，諸如磷酸二酯鍵與硫代磷酸酯鍵之組合。

磷酸酯之替代物包括例如短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵。此等包括具有以下之彼等物：N-𠰌啉基鍵(部分由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH ₂組分部分之其他物。眾多美國專利揭示如何製造及使用此等類型之磷酸酯替代物且包括但不限於：美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,264,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,610,289號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；及第5,677,439號。亦應理解，在核苷酸替代物中，核苷酸之糖及磷酸酯部分均可經例如醯胺型鍵(胺基乙基甘胺酸) (PNA)置換。美國專利第5,539,082號；第5,714,331號；及第5,719,262號教示如何製造及使用PNA分子，該等專利中之每一者以引用之方式併入本文中。亦參見Nielsen等人, Science, 1991, 254, 1497-1500。亦有可能將其他類型之分子(結合物)連接至核苷酸或核苷酸類似物以增強例如細胞攝取。結合物可化學連接至核苷酸或核苷酸類似物。此類結合物包括但不限於脂質部分，諸如膽固醇部分(Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)；膽酸(Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人, Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)；硫代膽固醇(Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)；脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人, EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118；Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75, 49-54)；磷脂，例如二十六烷基-外消旋-甘油或l-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-S-H-膦酸三乙銨(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)；多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)；或金剛烷乙酸(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)；棕櫚醯基部分(Mishra等人, Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)；或十八烷基胺或己胺基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)。眾多美國專利教示此類結合物之製備且包括但不限於美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號；及第5,688,941號。

在一些實施例中，包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸(亦稱為核酸)例如來自任何來源或組合物，諸如DNA、cDNA、gDNA (基因體DNA)、RNA、siRNA (短抑制性RNA)、RNAi、tRNA、mRNA或rRNA (核糖體RNA)；且呈任何形式(例如，直鏈、環狀、超螺旋、單股、雙股及類似物)。在一些實施例中，核酸包含核苷酸、核苷或多核苷酸。在一些情況下，核酸包含天然及非天然核酸。在一些情況下，核酸亦包含非天然核酸，諸如DNA或RNA類似物(例如，含有核鹼基類似物、糖類似物及/或非原生主鏈及類似物)。應理解，術語「核酸」並不係指或表示特定長度之多核苷酸鏈，因此多核苷酸及寡核苷酸亦包括於定義中。核酸有時為載體、質體、噬質體、自主複製序列(autonomously replicating sequence；ARS)、著絲點(centromere)、人工染色體、酵母人工染色體(例如，YAC)或能夠在宿主細胞中複製或經複製之其他核酸。在一些情況下，非天然核酸為核酸類似物。在額外情況下，非天然核酸來自胞外來源。在其他情況下，非天然核酸可用於本文中所提供之生物體(例如經遺傳修飾之生物體)的胞內空間。在一些實施例中，非天然核苷酸不為天然核苷酸。在一些實施例中，不包含天然核鹼基之核苷酸包含非天然核鹼基。

在一些實施例中，多核苷酸用作反轉錄酶之受質或藉由反轉錄酶合成，該反轉錄酶包含除至少一種非天然核苷酸以外的天然核苷酸。例示性天然核苷酸包括而不限於ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP及dGMP。例示性天然去氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP及dGMP。例示性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP及GMP。應理解，核苷酸之三磷酸形式為用於聚合之受質，且在添加至新生多核苷酸鏈後，核苷酸轉化為單磷酸形式之核苷酸。

一般而言，核苷酸類似物或非天然核苷酸包含核苷酸，該核苷酸含有對核鹼基、糖或磷酸酯部分的一些類型之修飾。在一些實施例中，修飾包含化學修飾。在一些情況下，修飾在3'OH或5'OH基團處、在主鏈處、在糖組分處或在核鹼基處出現。在一個態樣中，經修飾之核酸包含對3'OH或5'OH基團、主鏈、糖組分或核鹼基中之一或多者的修飾，及/或非天然存在之連接分子之添加。在一個態樣中，經修飾之主鏈包含除磷酸二酯主鏈以外的主鏈。在一個態樣中，經修飾之糖包含除去氧核糖(在經修飾之DNA中)以外或除核糖(經修飾之RNA)以外的糖。在一個態樣中，經修飾之核鹼基包含除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶(在經修飾之DNA中)以外的核鹼基，或除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶(在經修飾之RNA中)以外的核鹼基。

在一些實施例中，核酸包含至少一個經修飾之核鹼基。在一些情況下，核酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個或更多個經修飾之核鹼基。在一些情況下，對核鹼基部分之修飾包括對A、C、G及T/U以及不同嘌呤或嘧啶核鹼基之天然及合成修飾。在一些實施例中，修飾為對於腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶或胸腺嘧啶(在經修飾之DNA中)之經修飾形式或腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶或尿嘧啶(經修飾之RNA)之經修飾形式。經修飾之核鹼基可為在本文中別處特定描述的經修飾核鹼基中之任一者。

在一些實施例中，反轉錄酶產生全長cDNA。在一些實施例中，反轉錄酶產生cDNA，該cDNA包含在與經歷反轉錄之多核苷酸中的非天然核糖核苷酸互補之位置中的核苷酸，及在與非天然核糖核苷酸互補之位置中的核苷酸之3'的複數個核苷酸(例如，至少2、5、10或20個核苷酸)，且包括與經歷反轉錄之多核苷酸完全互補的cDNA。在一些實施例中，cDNA包含與經歷反轉錄之多核苷酸一樣多的至少90%、95%、97%或99%核苷酸。在一些實施例中，cDNA與經歷反轉錄之多核苷酸完全互補。在一些實施例中，至少25%之cDNA包含非天然核鹼基。在一些實施例中，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%之cDNA包含非天然核鹼基。非天然鹼基對

在一些實施例中，非天然核苷酸在併入期間及/或之後藉由例如反轉錄酶與另一非天然核苷酸形成鹼基對(非天然鹼基對；UBP)。在一些實施例中，穩定整合之非天然核苷酸為可與另一核苷酸(例如，天然或非天然核苷酸)形成鹼基對之非天然核苷酸。在一些實施例中，穩定整合之非天然核苷酸為可與另一非天然核苷酸形成鹼基對(非天然鹼基對(UBP))之非天然核苷酸。舉例而言，第一非天然核苷酸可與第二非天然核苷酸形成鹼基對。舉例而言，可在併入核酸中期間及/或之後進行鹼基配對的一對非天然核苷三磷酸酯包括(d)5SICS ((d)5SICSTP)之三磷酸酯及(d)NaM ((d)NaMTP)之三磷酸酯。其他實例包括但不限於：(d)CNMO ((d)CNMOTP)之三磷酸酯及(d)TPT3 ((d)TPT3TP)之三磷酸酯。此類非天然核苷酸可具有核糖或去氧核糖糖部分(由「(d)」指示)。舉例而言，可在併入核酸中時進行鹼基配對的一對非天然核苷三磷酸酯包括(d)TAT1 ((d)TAT1TP)之三磷酸酯及(d)NaM ((d)NaMTP)之三磷酸酯。在一些實施例中，可在併入核酸中時進行鹼基配對的一對非天然核苷三磷酸酯包括(d)CNMO ((d)CNMOTP)之三磷酸酯及(d)TAT1 ((d)TAT1TP)之三磷酸酯。在一些實施例中，可在併入核酸中時進行鹼基配對的一對非天然核苷三磷酸酯包括(d)TPT3 ((d)TPT3TP)之三磷酸酯及(d)NaM ((d)NaMTP)之三磷酸酯。在一些實施例中，非天然核苷酸不與天然核苷酸(A、T、G、C、U)實質上形成鹼基對。在一些實施例中，穩定整合之非天然核苷酸可與天然核苷酸形成鹼基對。

在一些實施例中，穩定整合之非天然(去氧)核糖核苷酸為可形成UBP但不與天然(去氧)核糖核苷酸中之每一者實質上形成鹼基對的非天然(去氧)核糖核苷酸。在一些實施例中，穩定整合之非天然(去氧)核糖核苷酸為可形成UBP但不與一或多種天然核酸實質上形成鹼基對的非天然(去氧)核糖核苷酸。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A、T及C實質上形成鹼基對，但可與G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A、T及G實質上形成鹼基對，但可與C形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與C、G及A實質上形成鹼基對，但可與T形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與C、G及T實質上形成鹼基對，但可與A形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A及T實質上形成鹼基對，但可與C及G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A及C實質上形成鹼基對，但可與T及G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A及G實質上形成鹼基對，但可與C及T形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與C及T實質上形成鹼基對，但可與A及G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與C及G實質上形成鹼基對，但可與T及G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與T及G實質上形成鹼基對，但可與A及G形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與G實質上形成鹼基對，但可與A、T及C形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與A實質上形成鹼基對，但可與G、T及C形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與T實質上形成鹼基對，但可與G、A及C形成鹼基對。舉例而言，穩定整合之非天然核苷酸可能不與C實質上形成鹼基對，但可與G、T及A形成鹼基對。

能夠形成非天然DNA或RNA鹼基對(UBP)之例示性非天然核苷酸包括但不限於(d)5SICS、(d)NaM、(d)TPT3、(d)MTMO、(d)CNMO、(d)TAT1及其組合。在一些實施例中，非天然核苷酸鹼基對包括但不限於：

。在一些實施例中，諸如在RNA已經歷反轉錄之情況下，形成UBP，其中非天然核鹼基如上文所展示或在本文中別處進行描述，且糖中之一者為核糖或其經修飾形式(但不為去氧核糖)。量測寡核苷酸中之非天然核苷酸含量

在一些實施例中，本文中所揭示之方法包含量測例如cDNA中非天然核苷酸之量。在cDNA係由自DNA分子轉錄之RNA產生的情況下，此方法可用於獨立於轉譯測定在轉錄期間非天然核苷酸之保留率之保真度之下限。在一些實施例中，該方法係用於量測轉錄與反轉錄之組合保真度。在一些實施例中，該方法係用於量測在轉錄及反轉錄期間非天然核苷酸之保留率。

在一些實施例中，量測步驟可使用識別非天然核鹼基的結合配偶體。在非天然核鹼基包含生物素部分之情況下，結合配偶體可為生物素結合劑(例如，鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白(avidin)、中性抗生物素蛋白(Neutravidin)或抗生物素抗體)。在一些實施例中，生物素結合劑與諸如珠粒之固體載體締合(例如，諸如共價結合於固體載體)。在一些實施例中，結合配偶體為鏈黴抗生物素蛋白。結合配偶體之結合可在凝膠移位分析或遷移移位分析中進行評定，此係因為結合於結合配偶體之多核苷酸(理解為包含非天然核鹼基)將展現與未結合之多核苷酸(理解為缺少非天然核鹼基)不同的電泳遷移率。在藉由反轉錄酶併入之核苷酸之非天然核鹼基自身不包含生物素部分或結合配偶體之其他目標的情況下，結合配偶體仍可用於例如如下量測非天然核鹼基之量。互補分子或擴增子可由確實包含生物素化非天然核鹼基之cDNA (例如，如針對在實例中所執行之生物素移位分析所描述)產生，其可接著作為cDNA的代表進行分析，在計算中進行適當調整。在一些實施例中，cDNA之擴增係藉由PCR來進行。例示性生物素化非天然核鹼基可使用dMMO2bioTP (dNaMTP之生物素化類似物)及d5SICSTP (在複製期間比dTPT3TP自身更佳地與dMMO2bio配對的dTPT3TP之類似物)併入互補分子或擴增子中。(Malyshev等人, A Semi-Synthetic Organism with an Expanded Genetic Alphabet. Nature 2014, 509, 385-388.)其中產生含有生物素化非天然核鹼基之互補分子或擴增子的此方法被視為由片語「使用識別非天然核苷酸之結合配偶體量測cDNA中非天然核苷酸之量」及類似物涵蓋。

在一些實施例中，使用識別非天然核鹼基之結合配偶體量測cDNA中非天然核苷酸之量包含生物素移位分析。生物素移位分析涵蓋基於結合或不結合於生物素結合劑(諸如鏈黴抗生物素蛋白)之微分遷移率將生物素化產物與非生物素化產物進行區分的任何分析。遷移率可為例如電泳遷移率(例如，凝膠電泳遷移率或毛細管電泳遷移率)或層析遷移率(例如，使用凝膠過濾、離子交換或疏水相互作用層析)。

在cDNA係由自DNA分子轉錄之RNA產生的情況下，轉錄可在活體外或活體內進行。在一些實施例中，轉錄在細菌或原核生物(諸如大腸桿菌)中進行。在一些實施例中，自其轉錄RNA之DNA分子為ssDNA或dsDNA。

在一些實施例中，方法包含計算轉錄-反轉錄(T-RT)保真度(轉錄及反轉錄步驟之總保真度)。舉例而言，T-RT保真度可測定為(a)含有非天然核苷酸之cDNA之比例與(b)在轉錄之前含有非天然核苷酸之DNA之比例的比率。在諸如擴增之另一合成步驟用於製備生物素化DNA的情況下，可藉由因子來調整比率以補償另一合成步驟中之非天然鹼基對損失。如實例中所展示，1.06為該因子之例示值。篩選RNA適體候選者之方法

本文中亦揭示篩選RNA適體候選者之方法。在一些實施例中，方法包含將複數種不同RNA寡核苷酸(「庫」)與目標一起培育，其中RNA寡核苷酸包含至少一種非天然核苷酸。在一些實施例中，方法包含對結合於目標之複數種RNA寡核苷酸執行至少一輪選擇。在一些實施例中，方法包含分離結合於目標之富集RNA寡核苷酸，其中經分離之富集RNA寡核苷酸包含RNA適體。在一些實施例中，方法包含將RNA適體中之一或多者反轉錄成cDNA中，其中cDNA包含在與RNA適體中之非天然核鹼基互補之位置處的非天然去氧核糖核苷酸，藉此提供對應於RNA適體之cDNA分子庫。

在一些實施例中，複數種不同RNA寡核苷酸包含隨機化核苷酸區域。此可例如在核苷酸合成程序之某些循環中使用混合核苷酸池或藉由在由DNA模板轉錄寡核苷酸之前執行誘變PCR來產生。隨機化核苷酸區域可包含一或複數個隨機化位置。在存在複數個隨機化位置之情況下，其可為連續的，或間雜有一或多個非隨機化核苷酸或非隨機化核苷酸之區段。在一些實施例中，非天然核鹼基在隨機化區域內(例如，3'至第一隨機化位置及5'至第二隨機化位置)。在一些實施例中，非天然核鹼基在至少一個隨機化位置之5個或10個核苷酸內。在一些實施例中，非天然核鹼基緊鄰一隨機化位置，或緊鄰兩個隨機化位置。

在一些實施例中，RNA寡核苷酸包含條碼序列及/或引子結合序列。如實例7中所說明，條碼序列可用於鑑別非天然核鹼基之位置，且引子結合序列可用於在選擇之後進行活性序列之下游分析。

在一些實施例中，對由RNA適體產生之cDNA進行定序。在一些實施例中，使由RNA適體產生之cDNA突變以產生複數個額外序列，其接著可轉錄成RNA以執行至少另一輪選擇。可例如藉由易錯PCR來執行使cDNA突變。

在一些實施例中，選擇包含用以移除未結合或微弱結合之RNA寡核苷酸的洗滌步驟。在嚴格度增加之情況下，可採用一系列洗滌步驟，例如以隨著方法進行提供更多的選擇壓力。

藉由該方法鑑別之RNA適體可例如單獨地針對其結合、促效或拮抗目標之能力進行分析。在一些實施例中，分析RNA適體結合目標之能力包含測定 K _d、 k _on或 k _off。在一些實施例中，分析RNA適體促效目標之能力包含測定EC ₅₀值。在一些實施例中，分析RNA適體拮抗目標之能力包含測定 K _i或IC ₅₀值。多核苷酸之額外特徵

本文中所描述之特徵可在可行的程度上與任何所揭示之實施例組合。在一些實施例中，包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸包含至少15個核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸包含至少20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。在一些實施例中，包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸包含一或多個ORF。ORF可來自任何合適的來源，有時來自基因體DNA、mRNA、反轉錄RNA或互補DNA (cDNA)或包含前述中之一或多者之核酸庫，且來自含有所關注核酸序列、所關注蛋白質或所關注活性之任何生物體物種。可自其獲得ORF的生物體之非限制性實例例如包括細菌、酵母、真菌、人類、昆蟲、線蟲、牛、馬、犬、貓、大鼠或小鼠。在一些實施例中，本文中所描述之核苷酸及/或核酸試劑或其他試劑經分離或純化。可經由所公開之活體外方法形成包括非天然核苷酸之ORF。在一些情況下，核苷酸或核酸試劑包含非天然核鹼基。

多核苷酸有時包含與ORF相鄰之核苷酸序列，該核苷酸序列與ORF一起轉譯且編碼胺基酸標籤。編碼標籤之核苷酸序列位於核酸試劑中之ORF之3'及/或5'，藉此在由ORF編碼之蛋白質或肽之C端或N端處編碼標籤。可利用不廢止活體外轉錄及/或轉譯之任何標籤且其可由技術人員適當選擇。標籤可促進所需ORF產物自培養物或醱酵培養基分離及/或純化。在一些情況下，核酸試劑之庫與本文中所描述之方法及組合物一起使用。舉例而言，具有至少100、1000、2000、5000、10,000或超過50,000個特有多核苷酸之庫存在於庫中，其中各多核苷酸包含至少一個非天然核鹼基。

多核苷酸可包含通常根據核酸之預期用途選擇的某些元件，例如調控元件。以下元件中之任一者可包括於核酸試劑中或自核酸試劑排除。多核苷酸例如可包括以下核苷酸元件中之一或多者或全部：一或多個啟動子元件、一或多個5'非轉譯區域(5'UTR)、可插入目標核苷酸序列之一或多個區域(「插入元件」)、一或多個目標核苷酸序列、一或多個3'非轉譯區域(3'UTR)及一或多個選擇元件。多核苷酸可具備此類元件中之一或多者，且其他元件可在將核酸引入所要生物體中之前插入核酸中。在一些實施例中，所提供之核酸試劑包含啟動子、5'UTR、視情況存在之3'UTR及一或多個插入元件，目標核苷酸序列係藉由該一或多個插入元件插入(亦即選殖)核苷酸試劑中。在某些實施例中，所提供之核酸試劑包含啟動子、一或多個插入元件及視情況存在之3'UTR，且5'UTR/目標核苷酸序列與視情況存在之3'UTR一起插入。元件可以適用於在所選表現系統中表現(例如，在所選生物體中表現，或例如在無細胞系統中表現)之任何次序來配置，且在一些實施例中，核酸試劑在5'至3'方向上包含以下元件：(1)啟動子元件、5'UTR及一或多個插入元件；(2)啟動子元件、5'UTR及目標核苷酸序列；(3)啟動子元件、5'UTR、一或多個插入元件及3'UTR；以及(4)啟動子元件、5'UTR、目標核苷酸序列及3'UTR。在一些實施例中，UTR可經最佳化以改變或增加完全天然或含有非天然核苷酸的ORF之轉錄或轉譯。

例如表現卡匣及/或表現載體之多核苷酸可包括多種調控元件，包括啟動子、強化子、轉譯起始序列、轉錄終止序列及其他元件。「啟動子」一般為在關於轉錄起始位點之相對固定位置中時起作用的一或多個DNA序列。舉例而言，啟動子可在核苷酸三磷酸酯轉運子核酸區段之上游。「啟動子」含有RNA聚合酶與轉錄因子之基本相互作用所需的核心元件且可含有上游元件及反應元件。「強化子」一般係指在距轉錄起始位點不固定距離處起作用之DNA序列且可為至轉錄單元之5'或3''。此外，強化子可在內含子內以及在編碼序列自身內。強化子之長度通常在10個與300個核苷酸之間，且其可順式起作用。強化子起作用以增加自附近啟動子之轉錄。如同啟動子，強化子通常亦含有介導轉錄之調控的反應元件。強化子通常決定表現之調控且可用於改變或最佳化ORF表現，包括完全天然或含有非天然核苷酸之ORF。

如上文所指出，多核苷酸亦可包含一或多個5'UTR及一或多個3'UTR。舉例而言，用於真核宿主細胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或成核細胞)及原核宿主細胞(例如，病毒、細菌)中之表現載體可含有傳訊以用於終止轉錄的序列，此可影響mRNA表現。此等區域可經轉錄為編碼mRNA之組織因子蛋白質之未轉譯部分中的聚腺苷酸化區段。3'非轉譯區域亦包括轉錄終止位點。在一些較佳實施例中，轉錄單元包含聚腺苷酸化區域。此區域之一個益處為其增加經轉錄單元將如同mRNA一般進行處理及轉運的可能性。已明確確立聚腺苷酸化訊息在表現構築體中之鑑別及用途。在一些較佳實施例中，同源聚腺苷酸化訊息可用於轉基因構築體中。

5'UTR可包含其所起源之核苷酸序列內源的一或多個元件，且有時包括一或多個外源性元件。5'UTR可源自例如來自任何適合的生物體(例如，病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)之任何適合的核酸，諸如基因體DNA、質體DNA、RNA或mRNA。技術人員可基於所選表現系統(例如，在所選生物體中表現，或例如在無細胞系統中表現)為5'UTR選擇適當的元件。5'UTR有時包含技術人員所已知的以下元件中之一或多者：強化子序列(例如，轉錄或轉譯)、轉錄起始位點、轉錄因子結合位點、轉譯調控位點、轉譯起始位點、轉譯因子結合位點、輔助蛋白質結合位點、回饋調控劑結合位點、Pribnow盒、TATA盒、-35元件、E-盒(螺旋-環-螺旋結合元件)、核糖體結合位點、複製子、內部核糖體進入位點(IRES)、緘默子元件及類似物。在一些實施例中，啟動子元件可經分離以使得為適當條件性調控所必需的所有5'UTR元件均含於啟動子元件片段中，或在啟動子元件片段之功能子序列內。

多核苷酸中之5' UTR可包含轉譯強化子核苷酸序列。轉譯強化子核苷酸序列通常位於多核苷酸中之啟動子與目標核苷酸序列之間。轉譯強化子序列通常結合於核糖體，有時為18S rRNA結合核糖核苷酸序列(亦即40S核糖體結合序列)，且有時為內部核糖體進入序列(IRES)。IRES一般經由多種特異性分子間相互作用而與接觸40S核糖體次單元之精確置放的RNA三級結構形成RNA架構。核糖體強化子序列之實例為已知的且可由技術人員鑑別(例如Mignone等人, Nucleic Acids Research 33: D141-D146 (2005)；Paulous等人, Nucleic Acids Research 31: 722-733 (2003)；Akbergenov等人, Nucleic Acids Research 32: 239-247 (2004)；Mignone等人, Genome Biology 3(3): reviews0004.1-0001.10 (2002)；Gallie, Nucleic Acids Research 30: 3401-3411 (2002)；Shaloiko等人, 數位物件識別碼：10.1002/bit.20267；及Gallie等人, Nucleic Acids Research 15: 3257-3273 (1987))。

轉譯強化子序列有時為真核序列，諸如克紮克(Kozak)共有序列或其他序列(例如，螅體(hydroid polyp)序列，GenBank寄存編號U07128)。轉譯強化子序列有時為原核序列，諸如夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)共有序列。在某些實施例中，轉譯強化子序列為病毒核苷酸序列。舉例而言，轉譯強化子序列有時係來自植物病毒之5'UTR，諸如菸草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus)；TMV)、苜蓿花葉病毒(Alfalfa Mosaic Virus)；AMV)、菸草蝕刻病毒(Tobacco Etch Virus；ETV)、馬鈴薯病毒Y (Potato Virus Y；PVY)、蕪菁花葉(馬鈴薯Y (poty))病毒(Turnip Mosaic (poty) Virus)及豌豆種子源性花葉病毒(Pea Seed Borne Mosaic Virus)。在某些實施例中，來自TMV之長度為約67個鹼基的ω序列包括於多核苷酸中作為轉譯強化子序列(例如，不含鳥苷核苷酸，且包括長度為25個核苷酸之聚(CAA)中心區域)。

3'UTR可包含其所起源之核苷酸序列內源的一或多個元件，且有時包括一或多個外源性元件。3'UTR可起源於例如來自任何適合的生物體(例如，病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)之任何適合的核酸，諸如基因體DNA、質體DNA、RNA或mRNA。技術人員可基於所選表現系統(例如，在例如所選生物體中表現)來選擇用於3'UTR之適當元件。3'UTR有時包含技術人員所已知的以下元件中之一或多者：轉錄調控位點、轉錄起始位點、轉錄終止位點、轉錄因子結合位點、轉譯調控位點、轉譯終止位點、轉譯起始位點、轉譯因子結合位點、核糖體結合位點、複製子、強化子元件、緘默子元件及聚腺苷尾。3'UTR通常包括聚腺苷尾且有時不包括聚腺苷尾，且若聚腺苷尾存在，則一或多個腺苷部分可經添加或自其缺失(例如，約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個腺苷部分可經添加或減去)。

在一些實施例中，5'UTR及/或3'UTR之修飾用以改變(例如，增加、添加、減小或實質上消除)啟動子之活性。啟動子活性之改變可進而改變肽、多肽或蛋白質之活性(例如，例如酶活性)，其係藉由來自包含經修飾之5'或3'UTR之可操作地連接的啟動子元件的所關注之一或多個核苷酸序列之轉錄的改變來進行。舉例而言，微生物可藉由基因修飾而經工程改造以表現包含經修飾之5'或3'UTR的多核苷酸，在某些實施例中，該經修飾之5'或3'UTR可添加新穎活性(例如，通常未在宿主生物體中發現之活性)，或藉由增加自可操作地連接至所關注核苷酸序列(所關注同源或異源核苷酸序列)之同源或異源啟動子之轉錄來增加現有活性之表現。在一些實施例中，微生物可藉由基因修飾經工程改造以表現包含經修飾之5'或3'UTR之核酸試劑，在某些實施例中，該經修飾之5'或3'UTR可藉由減小或實質上消除自可操作地連接至所關注核苷酸序列之同源或異源啟動子之轉錄來減小活性之表現。 製造之套組及製品

在某些實施例中，本文中揭示與一或多種本文中所描述之方法一起使用的套組及製品。此類套組包括載劑、封裝或經分隔以容納一或多個容器(諸如小瓶、管及類似物)的容器，容器中之每一者包含待用於本文中所描述之方法中的單獨元件中之一者。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。在一個實施例中，容器由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。

在一些實施例中，套組包括適合的封裝材料以容納套組之內含物。在一些情況下，封裝材料係由熟知方法構築，較佳地提供無菌、無污染物的環境。本文中採用之封裝材料可包括例如在經出售以用於與核酸定序系統一起使用的商業套組中所常用的彼等封裝材料。例示性封裝材料包括而不限於能夠將本文中所闡述之組分保持在固定界限內的玻璃、塑膠、紙、箔及類似物。

封裝材料可包括指示組分之特定用途的標記。在對於套組中所存在之組分之特定組合適當時，由標記指示之套組的用途可為本文中所闡述之方法中之一或多者。舉例而言，標記可指示套組適用於合成多核苷酸之方法或適用於測定核酸之序列的方法。

封裝試劑或組分之使用說明書亦可包括於套組中。說明書通常將包括描述反應參數之有形表現，諸如待摻合的套組組分及樣本之相對量、試劑/樣本摻合物之維持時間段、溫度、緩衝條件及類似物。

將理解，並非對於特定反應所必需之所有組分均需存在於特定套組中。實際上，一或多種額外組分可由其他來源提供。與套組一起提供之說明書可鑑別待提供之一或多種額外組分及其可自何處獲得。

在一些實施例中，提供一種套組，其適用於例如使用本發明提供之用於製備基因工程改造細胞的方法而將非天然核酸穩定併入細胞核酸中。在一個實施例中，本文所描述之套組包括基因工程改造之細胞及一或多種非天然核酸。

在額外實施例中，本文中所描述之套組提供細胞及含有用於引入至該細胞中之異源基因的核酸分子，以藉此提供基因工程改造之細胞，諸如包含此段落中上文所描述之實施例中之任一者之核酸的表現載體。實例 用於活體外及活體內轉錄及反轉錄實驗之材料、方法及實驗程序

在適用於實例1至5中時使用以下實驗程序。

材料。用於此研究中之質體及引子之完整清單提供於表4及表5中。引子及天然寡核苷酸購自IDT (Coralville, Iowa)。藉由Genewiz (San Diego, CA)執行定序。使用商業小規模製備(miniprep)套組(D4013, Zymo Research；Irvine, CA)純化質體。PCR產物係使用商業DNA純化套組(D4054, Zymo Research)純化且使用Infinite M200 Pro板讀取器(TECAN)藉由A260/A280吸收定量。涉及RNA物種之所有實驗係藉由無核糖核酸酶的試劑、滴管尖端、管及手套來進行以避免污染。

在商業上合成(WuXi AppTec；Shanghai, China)及三磷酸化(TriLink BioTechnologies LLC；San Diego, CA及MyChem LLC；San Diego, CA) dNaM、dTPT3、NAM、TPT3、d5SICS及dMMO2 ^bio之核苷。所有非天然寡核苷酸係藉由Biosearch Technologies (Petaluma, CA)來合成及HPLC純化。含有非天然鹼基對之所有DNA樣本儲存於-20℃下。所有RNA樣本儲存於-80℃下。表 4 .引子

引子	序列

表 5 .寡核苷酸

寡核苷酸	序列

與非天然鹼基對之 PCR 反應。簡言之，遵循OneTaq之製造商說明書(OneTaq DNA聚合酶, M0480L, New England Biolabs, (NEB))，其中各自添加100 nM dNaMTP及dTPT3TP。在所有情況下將延伸步驟調整至4 min。

EGFP 及 tRNA 模板之構築 。EGFP模板質體pUCCS2_EGFP(NNN)及pUCCYBA_EGFP(NNN)由具有EGFP序列上下文之Golden Gate組裝製成。用於所有Golden Gate組裝中之插入物為用合成的含dNaM之寡核苷酸以及引子YZ73及YZ74 (表6)產生的PCR產物。質體pUCCS2_EGFP(NNN)及pUCCYBA_EGFP(NNN)在Golden Gate組裝之後純化且使用Qubit (ThermoFisher)定量。EGFP模板質體(2 ng)用於產生模板之PCR反應中，其中引子ED101及AZ38用於pUCCS2_EGFP(NNN)，且引子ED101及AZ87用於pUCCYBA_EGFP(NNN)。使PCR產物經受DpnI消化且接著經純化以得到用於活體外轉錄之EGFP模板。表 6.引子使用

目標基因	RT 反應引子	Bio- 引子 PCR 引子	cDNA 生物素移位引子
EGFP	AZ188	bio-YZ73/YZ74	YZ73/AZ172
sfGFP	AZ200	bio-YZ73/YZ74	YZ73/AZ172
活體內馬氏(mazei) tRNA	AZ189	bio-YZ435/YZ546	YZ435/YZ74

tRNA模板由合成的含dNaM之寡核苷酸與引子AZ01及AZ67藉由直接PCR製成。純化PCR產物，以得到用於活體外轉錄之tRNA模板。

用於SSO活體內轉譯實驗中之pSyn_sfGFP(NNN)_mm(NNN)質體由Golden Gate組裝製成。用於所有Golden Gate組裝中之插入物為用合成的有dNaM之寡核苷酸與用於mRNA密碼子插入物之引子集合YZ73/YZ74或用於tRNA反密碼子插入物之引子集合YZ435/YZ436產生的PCR產物。質體pSyn_sfGFP(NNN)_mm(NNN)在Golden Gate組裝之後純化且使用Qubit定量。

生物素移位分析 。使用d5SICSTP及dMMO2bio-TP與對應引子集合來分析非天然鹼基對在RNA物種之模板中之保留率。使用Image Lab (Bio-Rad)定量帶強度。藉由將各樣本之原始移位百分比除以在構築EGFP質體時用於Golden Gate組裝中的合成的含dNaM之寡核苷酸模板之原始移位百分比，將非天然鹼基對保留率歸一化。生物素移位分析詳細論述於Malyshev等人, A Semi-Synthetic Organism with an Expanded Genetic Alphabet. Nature 2014, 509, 385-388中。

EGFP mRNA 之 活體外轉錄 。相應地在具有或不具有1.25 mM非天然三磷酸核糖核苷酸之情況下在各活體外轉錄反應(具有拖尾之HiScribe T7 ARCA, E2060S, New England Biolabs, (NEB))中使用模板(500至1000 ng)，隨後進行純化(D7010, Zymo Research)。mRNA產物係藉由Qubit定量且接著以5 μg等分試樣儲存於-80℃下之溶液中。

tRNA 之 活體外轉錄 。相應地在具有或不具有2 mM非天然三磷酸核糖核苷之情況下在各活體外轉錄反應(T7 RNA聚合酶, E0251L, NEB)中使用模板(500至1000 ng)，隨後進行純化(D7010, Zymo)。tRNA產物係藉由Qubit定量且接著經受再摺疊(95℃持續1 min，37℃持續1 min，10℃持續2 min)。所有tRNA以1800 ng等分試樣儲存於-80℃下。

反轉錄 。在具有以下修改之情況下根據製造商對各反轉錄酶之說明書來進行反轉錄反應。在所有反轉錄反應中，除非另外陳述，否則每20 μL反應物使用1 μg mRNA或20 ng tRNA、0.5 mM dNTP及0.2 mM dNaMTP或dTPT3TP。對於SuperScript III (18080044, ThermoFisher)，將反應物在55℃下培育45 min，在70℃下去活化15 min，隨後進行核糖核酸酶H (M0297S, New England Biolabs, (NEB))及核糖核酸酶A (R1253, ThermoFisher)消化。對於SuperScript IV (18090010, ThermoFisher)，將反應物在55℃下培育20 min，在80℃下去活化10 min，隨後進行核糖核酸酶H、核糖核酸酶A及蛋白酶K (P8107S, New England Biolabs, (NEB))消化。對於AMV反轉錄酶(M0277S, New England Biolabs, (NEB))，將反應物在42℃下培育60 min，在80℃下去活化5 min，隨後進行核糖核酸酶H及核糖核酸酶A消化。在消化之後，將10 μL之各反應混合物用RNA負載染料(B0363S, New England Biolabs, (NEB))變性且經受用8 M尿素(CAS 57-13-6, Sigma Aldrich)進行10%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳以用於cDNA偵測。其他10 μL之反應混合物使用商業RNA純化套組(D7011, Zymo Research；Irvine, CA)來純化且使用Qubit定量產物cDNA。

單股 DNA 分離。使用來自用於IVT反應之dsDNA模板的生物素化5'引子經由PCR擴增來製備asDNA。使用Dynabeads™ MyOne™鏈黴抗生物素蛋白C1 (65001, ThermoFisher)根據製造商說明書使產物生物素化dsDNA (bio-dsDNA)經受親和力單股分離方案。簡言之，將珠粒(20 μL)用WB緩衝液預洗滌3次且接著與經純化之bio-dsDNA (20 μL，約50 ng/μL)混合。在37℃下在平緩搖動下將混合物培育2 h。使用磁性台架將珠粒與緩衝液分離。接著將珠粒用WB緩衝液洗滌3次且使用100 μL 0.1 M NaOH (洗滌時間＜30 s)溶離非生物素化股。接著使用管柱純化來純化經溶離之非生物素化asDNA。

SSO 活體內轉譯 。在補充有50 mM磷酸鉀(CAS 7778-77-0, Sigma Aldrich)、5 μg/mL氯胺苯醇(CAS 56-75-7, Sigma Aldrich)及100 μg/mL卡本西林(carbenicillin) (C1613, Sigma Aldrich)之2×YT (Y2377, Sigma Aldrich) (本文中之後在此章節中稱為「培養基」)中，將YZ3+pGEX-MbPylRS TetR細胞之2 mL隔夜培養物在相同培養基中稀釋至0.03之OD600，且生長至0.3至0.4之OD600。將培養物在搖動下在冰水浴中快速冷卻5 min，且接著以3,200×g粒化10 min。接著將細胞用一培養體積之經預淬冷熱壓處理的Milli-Q H2O洗滌兩次。接著將細胞再懸浮於額外淬冷H ₂O中，達至50至60之OD600。對於各所測試樣本，將50 μL之所得電感受態細胞與含有嵌入sfGFP及tRNA ^Pyl基因內之UBP的0.5 ng之Golden Gate組裝質體組合且接著轉移至預淬冷電穿孔比色管(0.2 cm間隙)。根據製造商的針對細菌之說明書對細胞進行電穿孔(Gene Pulser II；Bio-Rad) (25 kV、2.5 μF及200 Ω電阻器)，接著立即用950 μL之預溫熱培養基稀釋。接著用預溫熱培養基將10 μL之此稀釋液稀釋至50 μL之最終體積，補充有150 mM dNaMTP及10 μM dTPT3TP。使轉化在37℃下恢復1 h。將恢復培養物接種於補充有50 μg/mL吉歐黴素(zeocin) (R25001, ThermoFisher)、150 μM dNaMTP、10 μM dTPT3TP及2% w/v瓊脂之固體培養基上，接著在37℃下使其生長隔夜。

將單一菌落分離且用於接種補充有50 μg/mL吉歐黴素(本文中之後此章節中稱為「生長培養基」)且提供150 μM dNaMTP及10 μM dTPT3TP之300 μL液體介質，接著經由OD600使用具有590/20 nm過濾器之Envision 2103多標記盤讀取器(Perkin Elmer)監測細胞生長。在約0.7之OD600下收集細胞，且接著使等分試樣(100 μL)經受小規模製備。使經分離質體經受生物素移位分析以測定UBP保留率。接著將顯示已保留UBP之菌落在補充有150 μM dNaMTP及10 μM dTPT3TP之300 μL生長培養基中稀釋回至約0.1至0.2之OD600。在0.4至0.6之OD600下，除非另外陳述，否則培養物補充有250 μM NaMTP及30 μM TPT3TP，以及10 mM之ncAA N6-(2-疊氮基乙氧基)-羰基-L-離胺酸(AzK)。接著使培養物生長額外20 min，隨後將IPTG (CAS 367-93-1, Sigma Aldrich)添加至1 mM之濃度且生長1 h，以誘導T7 RNA聚合酶、tRNA ^Pyl及PylRS之轉錄。每30 min監測細胞之生長(OD600)及GFP螢光。接著用100 ng/mL無水四環素(anhydrotetracycline) (CAS 13803-65-1, Sigma Aldrich)誘導sfGFP之表現。在生長額外3 h之後，收集細胞培養物且在冰上冷卻。將50 μL之培養物用於質體分離以測定UBP保留率(生物素移位分析)；剩餘250 μL之培養物用於總RNA提取以量測T-RT保留率。

總 RNA 提取。在活體內轉譯實驗之後，收集大腸桿菌培養物且以10,000 rpm離心(離心機5415 C, Eppendorf) 30秒，且捨棄上清液。接著將1 mL TRIzol (15596026, ThermoFisher)添加至各樣本中。將混合物均質化且在室溫下培育5 min。將200 μL氯仿(CAS 67-66-3, Sigma Aldrich)添加至各樣本中且將混合物渦動至均勻化，隨後室溫培育3 min以允許相分離。隨後，將樣本在4℃下以12,000 rpm離心15 min，將無色水相收集至新管中，且將500 μL異丙醇(CAS 67-63-0, Sigma Aldrich)添加至水相中。在室溫下培育10 min之後，將樣本在4℃下以7,000 rpm離心10 min，且捨棄上清液。接著用2.1 mL 75%乙醇洗滌樣本。使管蓋保持打開以允許樣本在室溫下乾燥30 min，且用20 μL無核糖核酸酶之水溶解所得總RNA。使用Qubit量測總RNA之濃度。實例 1. 依序 活體外轉錄 (IVT) 及反轉錄

為探究反轉錄酶有效識別含有UBP之RNA的能力，使用可商購反轉錄酶：SuperScript III、SuperScript IV及AMV反轉錄酶執行依序活體外轉錄(IVT)及反轉錄。使含有其中d NaM或d TPT3位於編碼密碼子151之第二核苷酸的位置處之EGFP基因的DNA進行PCR擴增且用作IVT反應之模板，其補充有對應非天然核糖核苷三磷酸酯，但以其他方式根據製造商說明書運行。將RNA純化且接著用作使用或不使用非天然去氧核苷三磷酸酯執行之RT反應的模板(另外，引子安裝了3'-延伸部以有助於分析，參見以下段落)。在1小時之後，使一半RT反應經受PAGE凝膠電泳以定性地評定全長及截斷產物之存在，且另一半經純化以用於後續表徵非天然核苷酸之保留率。

在AMV反轉錄酶之情況下，含有 NaM或 TPT3之RNA模板在d TPT3TP或d NaMTP不存在時主要僅產生截斷cDNA產物，且在提供d TPT3TP或d NaMTP時主要僅產生全長產物(圖2)。相比之下，在SuperScript III或SuperScript IV之情況下，使用任一模板觀測全長cDNA產物而不論是否添加有非天然三磷酸酯(圖2)。基本上如Malyshev等人, A Semi-Synthetic Organism with an Expanded Genetic Alphabet. Nature 2014, 509, 385-388中所描述執行之生物素移位分析用於偵測RT產物中非天然核苷酸之存在。在各天然dNTP以及d MMO2bioTP (d NaMTP之生物素化類似物)及d 5SICSTP (在複製期間比d TPT3TP自身更佳地與d MMO2bio配對的d TPT3TP之類似物)之存在下藉由PCR擴增經純化之cDNA。退火至藉由RT引子(參見上文)安裝之序列的3'-引子之使用防止自原始IVT反應剩餘的任何DNA模板之擴增(圖3)。PCR產物接著與鏈黴抗生物素蛋白一起培育且經受PAGE電泳，其中移位與未移位帶之所得比率指示含有非天然核苷酸的cDNA之百分比。如所預期，當非天然三磷酸酯自RT反應保留時，未觀測到移位產物。相比之下，在將互補非天然三磷酸酯添加至RT反應中時，觀測到顯著移位，從而指示使用全部三種反轉錄酶，大量cDNA產物含有非天然核苷酸(圖2)。實例 2.tRNA 模板濃度之影響之研究

藉由PCR產物之IVT由含有在對應於反密碼子之第二核苷酸的位置處的d NaM或d TPT3之合成寡核苷酸產生的tRNA模板用於研究tRNA模板濃度對非天然核鹼基反轉錄之效率的影響。在最高濃度之tRNA (25 ng/μL)下，在其對應非天然去氧核糖三磷酸酯之存在下 NaM或 TPT3模板之反轉錄分別產生88%及44%全長產物。有趣地，在較低tRNA模板濃度下，全長產物之百分比增加。使用0.5 μg/mL模板，反轉錄在 NaM或 TPT3模板之情況下分別產生97%及92%全長產物(圖3，表1)。表 1.使用含有NaM或TPT3之RNA，SuperScript III RT反應全長cDNA產物比率之RNA濃度依賴性的原始資料。

RNA (ng/ 反應 )	含有 NaM 之 RNA 全長產物比率	含有 TPT3 之 RNA 全長產物比率
#1	#2	#3	#1	#2	#3
500	0.8789	0.9028	0.8818	0.4423	0.5734	0.5148
250	0.9008	0.9155	0.9186	0.5226	0.5589	0.6222
100	0.9247	0.9477	0.9489	0.7157	0.6153	0.7373
50	0.9567	0.9688	0.9747	0.8543	0.8374	0.8786
25	0.9651	0.9759	0.9844	0.9061	0.9217	0.8854
10	0.9731	0.9757	0.9918	0.9167	0.9401	0.9065

實例 3. 在依序 活體外轉錄 (IVT) 及反轉錄之後關於 UBP 保留率 之分析

研發分析以在使用T7 RNA聚合酶進行依序活體外轉錄(IVT)及使用可商購反轉錄酶：SuperScript III、SuperScript IV及AMV反轉錄酶進行反轉錄(RT)之後定量地量測UBP保留率。為僅聚焦於在IVT及RT期間出現之非天然核苷酸損失(亦即排除在IVT模板之PCR製備期間出現的任何損失)，分析亦分析反義DNA模板(R (asDNA))之非天然核苷酸含量(圖4)。組合T-RT保真度經計算為：

，其中包括常數α=1.06以解釋UBP損失在製備bio-dsDNA所需之額外PCR步驟中的貢獻。由於T-RT保留率對應於在轉錄及反轉錄兩者期間之非天然核苷酸損失，因而其提供在T-RT反應之任一步驟期間非天然核苷酸保留率之下限。

首先應用T-RT保真度分析來測定使用EGFP mRNA的IVT轉錄保真度之下限，該等EGFP mRNA含有非天然第151位密碼子，包括A XC、A YC、G XC、G YC、G XT或G YT ( X= NaM且 Y= TPT3)，其中每一者已用於表現哺乳動物細胞中之非天然蛋白質。明顯地，具有 NaM或 TPT3之所有序列產生全長cDNA作為主要產物，其中組合T-RT保留率為90%至100%(圖5A、圖6)。至少在此序列上下文中，非天然鹼基對以合理的保真度在活體外轉錄(及反轉錄)。

接著，探索具有反密碼子G YT、G XT、G YC、G XC、C YA及C XA的馬氏甲烷球菌( M. mazei) tRNA之T-RT。不論其是否含有 NaM或 TPT3，各tRNA基因均再次產生全長cDNAs作為主要產物，且非天然核苷酸保留率範圍介於90%至100% (圖5B、圖6)。tRNA之結構增加並不明顯地妨礙其使用非天然反密碼子進行之活體外轉錄及反轉錄。

先前報導了HEK293T細胞能夠使用EGFP(GXC) mRNA及馬氏甲烷球菌tRNA(G YC)來產生含有ncAA AzK之EGFP蛋白質。(Zhou等人, Progress toward Eukaryotic Semisynthetic Organisms: Translation of Unnatural Codons. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 20166-20170。)在彼等先前實驗中，HEK293T細胞具備AzK且分別用含有非天然密碼子及反密碼子之mRNA及tRNA以及用AzK填充馬氏tRNA的編碼嵌合PylRS之DNA質體轉染。用於製備mRNA的80%之DNA模板含有非天然核苷酸，且活體內表現的70%之蛋白質含有AzK。使用EGFP(G XC)基因之最小轉錄保真度之上述分析，真核核糖體之轉譯保真度係如下估計：

。

包括A XA、A XT、T XA及T XT之若干非天然密碼子先前已在大腸桿菌SSO中鑑別為在DNA複製期間良好保留，但僅低效地產生具有ncAA之蛋白質。(Fischer等人, New Codons for Efficient Production of Unnatural Proteins in a Semisynthetic Organism. Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 570-576。)此表明其並未藉由SSO中之T7 RNAP良好轉錄，及/或其並未在核糖體處良好解碼。使單獨含有各密碼子之DNA經受活體外研發之T-RT分析。再次展示各模板產生全長cDNA作為主要產物，其中非天然核苷酸保留率為大約90% (圖5A)。此資料表明轉錄相對高效且指示此等密碼子不能高效地參與轉譯。實例 4. 大腸桿菌 SSO 中之 活體內轉錄之表徵實例3中研發之T-RT保持率分析用於表徵自大腸桿菌SSO分離之RNA。分別使用編碼含有第151位密碼子A XC、G XC或G XT之sfGFP基因及含有對應反密碼子G YT、G YC或A YC之馬氏甲烷球菌tRNA基因的pSyn質體轉化ML2細胞。在各情況下，先前展示SSO產生具有較高保真度之非天然蛋白質(Fischer, E. C.等人, Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 570-576)。此處，如上文所描述來分析非天然核苷酸在asDNA中以及各mRNA及tRNA內之保留率。資料揭露 NaM密碼子之轉錄在SSO中在幾乎無非天然核苷酸損失的情況下進行。對於tRNA， TPT3反密碼子之保留率範圍介於85%至100% (圖7A至圖7B，表2)。表 2.自SSO活體內轉譯實驗提取的mRNA及tRNA之T-RT保留率及標準差之原始資料。( n=3)。

	T-RT 保留率	標準差
密碼子AXC	1.06	0.02
密碼子AYC	1.04	0.06
密碼子GXC	1.07	0.09
密碼子GYC	0.88	0.03
密碼子GXT	1.07	0.04
密碼子GYT	0.96	0.07
密碼子GXA	0.80	0.05
反密碼子GYT	0.91	0.04
反密碼子GXT	0.86	0.03
反密碼子GYC	0.93	0.11
反密碼子GXC	1.06	0.03
反密碼子AYC	1.00	0.03
反密碼子AXC	1.09	0.07
反密碼子TYC	0.82	0.03

資料指示，含有 NaM之mRNA之轉錄保真度較高，且雖然含有 TPT3之tRNA之轉錄保真度略微較低，但此並不引起ncAA併入之保真度減小。

與上文所檢查之密碼子相反，先前展示大腸桿菌SSO不能使用 TPT3密碼子A YC、G YC或G YT有效地產生sfGFP蛋白質(同樣在密碼子151處，且使用含有對應非天然反密碼子之馬氏甲烷球菌tRNA) (Fischer, E.C.等人, Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 570-576)。此處，檢查對應mRNA及tRNA之SSO轉錄(圖7A至圖7B，表2)。資料揭露含有較少功能性密碼子/反密碼子對中之每一者的mRNA及tRNA兩個均以與介導高水準ncAA併入之先前所分析對不可區分的效率及保真度產生。此指示SSO中A YC、G YC或G YT密碼子之不佳表現係由大腸桿菌核糖體之轉譯效率降低引起。亦即，在大腸桿菌SSO中，轉譯一般比對UBP序列上下文之轉錄更敏感。

除未良好轉譯之 TPT3密碼子以外，一個 NaM密碼子G XA以略微受損之ncAA併入保真度(50%至60%)產生sfGFP，儘管DNA中之保留率較高。當檢查在攜帶此密碼子/反密碼子對之SSO中產生的RNA時，發現tRNA及尤其mRNA在兩種情況下均以略微較低的保真度(大約80%)產生(圖7A至圖7B，表2)。鑒於天然mRNA之非線性貢獻的可能性(歸因於更有效的轉譯)，此資料表明，與其他密碼子相反，對SSO中G XA密碼子之ncAA併入保真度降低的顯著貢獻係由轉錄之保真度降低引起。實例 5. 非天然核糖核苷酸三磷酸酯濃度對 SSO 中之 轉錄的影響

上文所描述之T-RT保真度分析進一步用於探究轉錄保真度對非天然核糖核苷酸三磷酸酯濃度之依賴性。除提供不同量之 NaMTP或 TPT3TP之外，使攜帶sfGFP(G XT)及馬氏甲烷球菌tRNA(A YC)之SSO如上生長。當 TPT3TP之濃度在250 mM下保持恆定，且 NaMTP之濃度減小時， NaM於mRNA中之保留率保持較高，直至濃度下降至小於50 μM (圖8A至圖8B，表3)。當 NaMTP之濃度在250 mM下保持恆定，且 TPT3TP之濃度改變時， TPT3於tRNA中之保留率即使在所檢查之最低濃度(10 μM)下亦保持較高(圖8A至圖8B，表3)。因此，SSO可耐受比NaMTP更低濃度之TPT3TP。表 3.SSO活體內轉譯實驗中T-RT保留率對NaMTP或TPT3TP濃度的依賴性之原始資料。( n=3)。

	NaMTP 濃度 (mM)	T-RT 保留率	標準差
mRNA	250	0.93	0.07
125	0.94	0.03
50	0.88	0.07
25	0.81	0.11
12.5	0.70	0.10
	TPT3TP 濃度 (mM)	T-RT 保留率	標準差
tRNA	250	0.94	0.05
125	0.95	0.09
50	0.98	0.04
25	0.97	0.03
12.5	0.95	0.06

實例 7. 使用轉錄及反轉錄實現 RNA 適體選擇之擴展

為研發靶向所關注蛋白質之RNA適體，首先由DNA藉由IVT產生RNA庫，使其經受選擇以在所需RNA中富集庫，藉由RT轉化回DNA以進行PCR擴增，且接著進行分析或藉由IVT轉化回RNA，且使其經受額外輪選擇。因此，為研發包含非天然核苷酸之RNA適體，含有非天然核苷酸之DNA必須有效地反轉錄成包含非天然核苷酸之RNA。在此實例中，具有非天然核苷酸之一系列相關DNA寡核苷酸轉化為具有對應非天然核苷酸之RNA，接著使其經受針對抑制性效能之選擇。寡核苷酸之長度可為約100個鹼基。將初始DNA寡核苷酸中約40個核苷酸之區域隨機化，且在側接條碼序列(以鑑別非天然核苷酸位置)及引子結合序列該區域之複數個(例如，3個)不同位置處併入單一dNaM。由此產生複數個(例如，3個)相關DNA庫。使複數個隨機化寡核苷酸庫之等莫耳混合物在包括dTPT3TP及dNaMTP之反應中進行PCR擴增。引發dTPT3核苷酸合成之引子包括經由二硫鍵或可商購且常用的其他可裂解部分連接至其5'端的生物素標籤。在擴增之後，dsDNA係藉由結合於經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之磁性珠粒，使珠粒經受緩衝液洗滌步驟，且接著用0.1 mM NaOH洗滌以溶離含dNaM之ssDNA庫來純化。含dTPT3之ssDNA庫可藉由使用30 mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP) (或任何其他適合的試劑)進行還原裂解而自珠粒釋放。ssDNA庫接著可用作補充有適當非天然核糖三磷酸酯(TPT3TP或NaMTP)之T7 RNA聚合酶介導之IVT反應的模板。DNA經核降解且庫經純化(例如，使用旋轉管柱，諸如Zymo ssDNA/RNA純化套組)。

使庫摺疊。接著使所得摺疊庫經受選擇以結合於所關注蛋白質。將庫與所關注目標蛋白質一起培育，例如固定於高蛋白質吸收ELISA盤上，洗滌，且接著藉由用甲醯胺洗滌三次來溶離。用於結合於所關注蛋白質之選擇壓力經由各種方法來增加，包括藉由在後續輪選擇中逐漸升高洗滌緩衝液中鹽之濃度，或添加酵母tRNA作為結合緩衝液中之結合競爭物。在各輪選擇之後，分離結合於所關注蛋白質之RNA，且溶離RNA寡核苷酸。根據本文中所描述之方法將RNA寡核苷酸反轉錄成cDNA。cDNA係用dTPT3TP及dNaMTP且用相同生物素化引子對進行PCR擴增，且視需要使其經受額外輪選擇，藉此提供富集之適體集合。

在遵循上述步驟進行若干輪選擇之後，將富集之個別RNA適體反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，且定序(例如，其中非天然核苷酸經天然核苷酸置換以進行定序，且依賴於條碼序列來鑑別非天然核苷酸位置)。研究富集RNA寡核苷酸當中之序列同源性，且選擇序列子集以進行進一步表徵。接著合成且摺疊所選RNA適體。接著各適體單獨地針對其結合目標蛋白質(或在目標蛋白質為酶時抑制其活性)之能力進行分析。將適體之抑制效能定量為 K _d或 K _i值。視情況，大部分有前景的RNA寡核苷酸可反轉錄成cDNA，且其序列進一步經由易錯PCR隨機化以產生額外庫以進行其他輪選擇。 * * *

雖然本文中已展示且描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，僅藉助於實例來提供此類實施例。在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到眾多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例之各種替代例可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍限定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。

本發明之各種態樣詳細闡述於隨附申請專利範圍中。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其附圖的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：

圖 1展示dNAM與dTPT3之間及NaM與TPT3之間的非天然鹼基對。

圖 2展示在不同反轉錄(RT)反應條件下cDNA偵測之變性凝膠及cDNA之定性生物素移位。

圖 3展示在使用SuperScript III之RT反應中隨RNA濃度而變的全長cDNA比率。

圖 4展示用於量測非天然核苷酸保留率的例示性轉錄-反轉錄(T-RT)過程之示意圖。

圖 5A 至圖 5B展示包含所指示密碼子之序列在T-RT保留率分析中之保真度水準。

圖 6展示用不同密碼子及反密碼子進行cDNA偵測的變性凝膠之影像。

圖 7A 至圖 7B展示來自包含所指示密碼子之序列的活體內轉譯實驗的mRNA之T-RT保留率(其中先前報導之蛋白質移位值在可用時如下所示)。

圖 8A 至圖 8B展示在活體內轉譯實驗中mRNA轉錄保真度分別對NaMTP濃度或TPT3TP濃度之依賴性。


          <![CDATA[<110> 美商新索思股份有限公司(SYNTHORX, INC.)]]>
                美商史基普研究協會(THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE)
          <![CDATA[<120> 包含非天然核苷酸之多核苷酸之反轉錄]]>
          <![CDATA[<130> 36271-812.851]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
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Claims

一種反轉錄包含非天然核糖核苷酸之多核苷酸的方法，其包含在包含非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄該多核苷酸，其中該反轉錄酶聚合併入該非天然dNTP作為非天然核苷酸之cDNA。
如請求項1之方法，其中： (a)該多核苷酸係以小於或等於約500 nM之濃度存在； (b)該反轉錄酶為SuperScript III； (c)該非天然dNTP不為dTPT3TP； (d)該方法進一步包含使用識別該非天然核苷酸之結合配偶體來量測該cDNA中該非天然核苷酸之量； (e)該反轉錄酶產生全長cDNA，且至少25%之該全長cDNA包含該非天然核苷酸；及/或 (f)該多核苷酸為tRNA、mRNA、RNA適體，或複數個RNA適體候選者之成員。
如請求項1或2之方法，其中該多核苷酸為RNA，視情況其中該RNA為mRNA或tRNA。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含量測該cDNA中該非天然核苷酸之量。
一種量測非天然核苷酸之併入的方法，其包含： a. 在包含第一非天然核鹼基之非天然NTP的存在下用RNA聚合酶轉錄包含非天然去氧核糖核苷酸之多核苷酸，以產生包含第一非天然核苷酸之RNA； b. 在包含第二非天然核鹼基之非天然dNTP的存在下用反轉錄酶反轉錄該RNA，其中該反轉錄酶聚合併入該非天然NTP作為第二非天然核苷酸之cDNA；及 c. 量測該cDNA中該第二非天然核苷酸之量。
如請求項5之方法，其中該轉錄步驟係在活體內進行。
如前一請求項之方法，其中該轉錄步驟係在原核生物或細菌中進行。
如前一請求項之方法，其中該轉錄步驟係在大腸桿菌( E. coli)中進行。
如請求項5之方法，其中該轉錄步驟在活體外進行。
如請求項5至9中任一項之方法，其中該cDNA分子中該第二非天然核苷酸之量係相對於在轉錄之前該多核苷酸中該非天然去氧核糖核苷酸之量來量測。
如請求項5至10中任一項之方法，其中該量測包含： a. 在轉錄之前對該多核苷酸執行生物素移位分析以測定在轉錄之前含有該非天然核苷酸的該多核苷酸之比例；及 b. 對該cDNA執行生物素移位分析以測定含有該非天然核苷酸的該cDNA之比例。
如請求項4至10中任一項之方法，其中該cDNA中該非天然核苷酸或該第二非天然核苷酸之量係使用結合非天然核鹼基之結合配偶體來量測。
如請求項4至10中任一項之方法，其中量測該cDNA中該非天然核苷酸或該第二非天然核苷酸之量包含凝膠移位分析或生物素移位分析。
如前一請求項之方法，其中該生物素移位分析包含： a. 在包含與該cDNA中之該非天然核苷酸配對的生物素化核鹼基之非天然dNTP的存在下擴增該cDNA； b. 使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物分離；及 c. 量測包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物及不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物的量，或包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物的比率，或含有該非天然核苷酸之cDNA的比例。
如前一請求項之方法，其中使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核鹼基之DNA擴增產物分離包含凝膠電泳，視情況其中該凝膠電泳為聚丙烯醯胺凝膠電泳。
如請求項14至15中任一項之方法，其中使包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物與不包含該生物素化核苷酸之DNA擴增產物分離包含將該等擴增產物與鏈黴抗生物素蛋白一起培育。
如前述請求項中任一項之方法，其中該RNA或該多核苷酸在反轉錄期間係以小於或等於約1 μM之濃度存在。
如前述請求項中任一項之方法，其中該RNA或該多核苷酸在反轉錄期間係以在以下範圍內之濃度存在：約1至10 nM、約10至20 nM、約20至30 nM、約30至40 nM、約40至50 nM、約50至75 nM、約75至100 nM、約100至150 nM、約150至200 nM、約200至300 nM、約300至400 nM或約400至500 nM。
如前述請求項中任一項之方法，其中該反轉錄酶產生全長cDNA，且其中至少25%之該全長cDNA包含該非天然核苷酸。
如前一請求項之方法，其中至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%之非截斷cDNA包含該非天然核苷酸。
如前述請求項中任一項之方法，其中包含該非天然核糖核苷酸之該RNA或該多核苷酸為mRNA。
如請求項20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之第一位置(X-N-N或Y-N-N)處。
如請求項20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之中間位置(N-X-N或N-Y-N)處。
如請求項20之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該mRNA之密碼子之最後位置(N-N-X或N-N-Y)處。
如請求項1至25中任一項之方法，其中在該mRNA中含有該非天然核糖核苷酸之該密碼子為AXC、AYC、GXC、GYC、GXT、GYT、AXA、AXT、TXA或TXT。
如請求項1至20中任一項之方法，其中包含該非天然核糖核苷酸之該RNA或該多核苷酸為tRNA。
如請求項26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之反密碼子之第一位置(X-N-N或Y-N-N)處。
如請求項26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之該反密碼子之中間位置(N-X-N或N-Y-N)處。
如請求項26之方法，其中該非天然核糖核苷酸(X或Y)位於該tRNA之該反密碼子之最後位置(N-N-X或N-N-Y)處。
如請求項26至29中任一項之方法，其中該tRNA之該反密碼子為GYT、GXT、GYC、GXC、CYA、CXA、AYC或AXC。
如請求項1至30中任一項之方法，其中該非天然核糖核苷酸為X，其中X包含
作為該非天然核糖核苷酸之該核鹼基(NaM)。
如請求項1至30中任一項之方法，其中該非天然核糖核苷酸為Y，其中Y包含
作為該非天然核糖核苷酸之該核鹼基(TPT3)。
如請求項1至20或31至32中任一項之方法，其中該RNA為RNA適體。
一種篩選RNA適體候選者之方法，其包含： a. 將複數種不同RNA寡核苷酸與目標一起培育，其中該等RNA寡核苷酸包含至少一種非天然核苷酸； b. 對結合於該目標之該複數種RNA寡核苷酸執行至少一輪選擇； c. 分離結合於該目標之富集RNA寡核苷酸，其中該等經分離之富集RNA寡核苷酸包含RNA適體；及 d. 將該等RNA適體中之一或多者反轉錄成cDNA，其中該等cDNA包含在與該RNA適體中之該至少一種非天然核苷酸互補之位置處的非天然去氧核糖核苷酸，藉此提供對應於該等RNA適體之cDNA分子庫。
如前一請求項之方法，其中該複數種不同RNA寡核苷酸包含隨機化核苷酸區域。
如前一請求項之方法，其中該隨機化核苷酸區域包含該至少一種非天然核苷酸。
如請求項34至36中任一項之方法，其中該等RNA寡核苷酸包含條碼序列及/或引子結合序列。
如請求項34至37中任一項之方法，其中該方法進一步包含對該等cDNA分子進行定序。
如請求項34至38中任一項之方法，其中執行至少一輪選擇包含移除未結合或微弱結合之RNA寡核苷酸的洗滌步驟。
如請求項34至39中任一項之方法，其中該方法進一步包含使該等cDNA分子之序列突變以產生複數個額外序列。
如前一請求項之方法，其中使該複數個額外序列轉錄成RNA且經受針對結合於該目標之RNA適體的至少一輪額外選擇。
如請求項40至41中任一項之方法，其中使該等cDNA分子之序列突變包含易錯PCR。
如請求項34至42中任一項之方法，其中該方法進一步包含增加在額外輪選擇中結合於該目標之選擇壓力。
如前一請求項之方法，其中增加選擇壓力包含以比在前一輪中更高的鹽濃度執行一或多個洗滌步驟及/或在該選擇期間包括結合競爭物。
如請求項34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體結合該目標之能力。
如前一請求項之方法，其中分析該等RNA適體結合該目標之能力包含測定 K _d、 k _on或 k _off。
如請求項34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體促效該目標之能力。
如前一請求項之方法，其中分析該等RNA適體促效該目標之能力包含測定EC ₅₀值。
如請求項34至44中任一項之方法，其進一步包含分析該等RNA適體拮抗該目標之能力。
如前一請求項之方法，其中分析該等RNA適體拮抗該目標之能力包含測定 K _i或IC ₅₀值。
如前述請求項中任一項之方法，其中至少一種非天然核苷酸包含：

。
如前一請求項之方法，其中經歷反轉錄的多核苷酸中之至少一種非天然核苷酸包含：

。
如請求項51或52之方法，其中併入cDNA中之至少一種非天然核苷酸包含：

，且視情況其中該非天然核苷酸中之該至少一種非天然核鹼基不同於經歷反轉錄的該多核苷酸中之該至少一種非天然核鹼基。
如請求項51至53中任一項之方法，其中該至少一種非天然核苷酸包含：
。
如請求項51至53之方法，其中該至少一種非天然核苷酸包含：
。
如前述請求項中任一項之方法，其中該反轉錄酶為禽類骨髓胚細胞過多症病毒(Avian Myeloblastosis Virus；AMV)反轉錄酶、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus；MMLV)反轉錄酶、Super Script II (SS II)反轉錄酶、Super Script III (SS III)反轉錄酶、Super Script IV (SS IV)反轉錄酶或Volcano 2G (V2G)反轉錄酶。
如前述請求項中任一項之方法，其中該反轉錄酶為SuperScript III。
如前述請求項中任一項之方法，其中該非天然dNTP不為dTPT3TP。
如前述請求項中任一項之方法，其中該反轉錄在活體外發生。