PT1850880E - Agentes terapêuticos à base de aptâmeros úteis no tratamento de distúrbios relacionados com complemento - Google Patents

Agentes terapêuticos à base de aptâmeros úteis no tratamento de distúrbios relacionados com complemento Download PDF

Info

Publication number
PT1850880E
PT1850880E PT67350595T PT06735059T PT1850880E PT 1850880 E PT1850880 E PT 1850880E PT 67350595 T PT67350595 T PT 67350595T PT 06735059 T PT06735059 T PT 06735059T PT 1850880 E PT1850880 E PT 1850880E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
aptamer
seq
arc
nucleotides
complement
Prior art date
Application number
PT67350595T
Other languages
English (en)
Inventor
Claude Benedict
David Epstein
Markus Kurz
Thomas Green Mccauley
James Rottman
Charles Wilson
Dilara Grate
Jeffrey Kurz
Original Assignee
Archemix Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Archemix Llc filed Critical Archemix Llc
Publication of PT1850880E publication Critical patent/PT1850880E/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

ΕΡ1850880Β1
DESCRIÇÃO
AGENTES TERAPÊUTICOS À BASE DE APTÂMEROS ÚTEIS NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS RELACIONADOS COM COMPLEMENTO
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral ao campo de ácidos nucleicos e mais particularmente a aptâmeros capazes de ligar-se à proteína C5 do sistema complemento, útil como agentes terapêuticos e agentes de diagnóstico em distúrbios cardíacos relacionados com complemento, inflamatórios, e autoimunes, lesão por reperfusão isquémica e/ou outras doenças ou distúrbios nas quais a ativação de complemento mediada por C5 está implicada. A presente invenção refere-se ainda a materiais e métodos para a administração de aptâmeros capazes de ligação à proteína de sistema complemento C5.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os aptâmeros são moléculas de ácido nucleico dotadas de uma afinidade de ligação específica às moléculas através de interações diferentes do emparelhamento de base de Watson-Crick clássico.
Os aptâmeros, tais como péptidos gerados por "apresentação em fagos" ou anticorpos monoclonais ("MAbs"), são capazes de ligar-se especificamente a alvos selecionados e modular a atividade alvo, por exemplo, através dos aptâmeros de ligação pode-se bloquear a função de habilidade de alvo. Criados por um processo de seleção in vitro a partir de grupos de oligonucleótidos de sequência aleatória, os aptâmeros foram gerados para cerca de 100 proteínas incluindo fatores de crescimento, fatores 1 ΕΡ1850880Β1 de transcrição, enzimas, imunoglobulinas, e recetores. Um aptâmero típico é de 10 kDa - 15 kDa de tamanho (30 - 45 nucleótidos), liga-se ao seu alvo com afinidade sub-nanomolar, e distingue entre alvos proximamente relacionados (por exemplo, os aptâmeros tipicamente não irão ligar-se a outras proteínas da mesma família genética). Uma série de estudos estruturais mostrou que os aptâmeros são capazes de usar o mesmo tipo de interações de ligação (por exemplo, ligação a hidrogénio, complementaridade eletrostática, contactos hidrófobos, exclusão estérica) que direciona a afinidade e a especificidade em complexos de anticorpo - antigénio.
Os aptâmeros apresentam um número de características desejáveis para utilização como agentes terapêuticos e agentes de diagnóstico incluindo alta especificidade e afinidade, eficácia biológica, e excelentes propriedades farmacocinéticas. Além disso, os mesmos proporcionam vantagens competitivas com relação aos anticorpos e outras biologias proteicas como, por exemplo: 1) Velocidade e controlo. Os aptâmeros são produzidos por um processo inteiramente in vitro, o que permite a rápida geração de protótipos iniciais, incluindo protótipos terapêuticos. A seleção in vitro permite que a especificidade e a afinidade do aptâmero seja altamente controlada e permite a geração de protótipos, incluindo protótipos tanto contra alvos tóxicos como não imunogénicos. 2) Toxicidade e Imunogenicidade. Os aptâmeros enquanto classe demonstraram pouca ou nenhuma toxicidade ou imunogenicidade. Em dosagens crónicas em ratos ou marmotas com altos níveis de aptâmero (10 mg/kg por dia por 90 dias), não foi observada toxicidade por qualquer medição 2 ΕΡ1850880Β1 clínica, celular ou bioquímica. Enquanto a eficácia de muitos anticorpos monoclonais é severamente limitada pela resposta imune aos próprios anticorpos, é extremamente difícil suscitar-se anticorpos em aptâmeros mais provavelmente pelo fato de que os aptâmeros não podem ser apresentados pelas células T por meio de MHC e a resposta imune em geral é treinada de modo a não reconhecer fragmentos de ácido nucleico. 3) Administração. Embora a maior parte dos agentes terapêuticos de anticorpos aprovados sejam administrados por meio de infusão intravenosa (tipicamente em 2-4 horas), os aptâmeros podem ser administrados por injeção subcutânea (a biodisponibilidade do aptâmero por administração subcutânea é > 80% em estudos realizados em macacos (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203 - 212, 1999)). A dita diferença ocorre principalmente em virtude da solubilidade comparativamente baixa e portanto, de grandes volumes necessários para a maior parte dos MAbs terapêuticos. Com uma boa solubilidade (> 150 mg/ml) e comparativamente baixo peso molecular (aptâmero: 10 kDa - 50 kDa; anticorpo: 150 kDa), uma dosagem semanal do aptâmero pode ser enviada por injeção num volume inferior a 0,5 ml. Além disso, o pequeno tamanho dos aptâmeros permite que os mesmos penetrem em áreas de restrições conformativas que não permite que anticorpos ou fragmentos de anticorpos penetrem, apresentando assim uma outra vantagem para os terapêuticos com base em aptâmero ou profilaxia. 4) Escalabilidade e custo. Os agentes terapêuticos à base de aptâmeros são quimicamente sintetizados e consequentemente podem ser prontamente escalados como necessário para ir de encontro à demanda de produção. Considerando que as dificuldades da produção em escala estão atualmente a limitar a disponibilidade de algumas 3 ΕΡ1850880Β1 biologias, e o custo de capital de uma instalação de produção de proteínas em grande escala é enorme, um único sintetizador de oligonucleótido em grande escala pode produzir cerca de 100 kg/ano e necessita de um investimento inicial relativamente modesto. O custo atual de bens para a síntese do aptâmero em escala de quilograma é estimado em $500/grama, comparável àquela para anticorpos altamente otimizados. É esperado que o continuo aprimoramento no desenvolvimento de processos reduza os custos de bens a < $100/grama em cinco anos. 5) Estabilidade. Os aptâmeros terapêuticos são quimicamente robustos. Os mesmos são intrinsecamente adaptados para reganhar atividade em seguida de exposição a fatores tais como calor e desnaturantes e podem ser armazenados por períodos extensos (> 1 ano) a temperatura ambiente como pós liofilizados. O Sistema Complemento O sistema complemento compreende um conjunto de pelo menos 20 proteínas de plasma e proteínas de membrana que atuam juntas num sistema de cascata regulada para atacar as formas extracelulares dos agentes patogénicos (por exemplo, bactérias). O sistema complemento inclui duas cascatas de ativação enzimáticas distintas, os trajetos clássicos e alternativos (Figura 1) , e um trajeto não enzimático, conhecido como o trajeto de ataque de membrana. A primeira cascata enzimaticamente ativada, conhecida como o trajeto clássico, compreende diversos componentes Cl, C4, C2, C3 e C5 (relacionados pela ordem no trajeto) . A iniciação do trajeto clássico do sistema complemento ocorre em seguida da ligação e da ativação do primeiro componente complemento (Cl) por ambos os ativadores imune e não imune. 4 ΕΡ1850880Β1 0 Cl compreende um complexo dependente de cálcio de componentes Clq, Clr e Cls, e é ativado através da ligação do componente Clq. 0 Clq contém seis subunidades idênticas e cada subunidade compreende três cadeias (as cadeias A, B e C) . Cada cadeia apresenta uma região de cabeça globular que é conectada a um prolongamento do tipo colagénio. A ligação e a ativação de Clq por complexos de antigénio-anticorpo ocorre através da região de grupo de cabeça Clq. Numerosos ativadores Clq de não anticorpos incluindo proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, ligam-se e ativam Clq através de um campo distinto na região caule semelhante a colagénio. 0 complexo Clqrs então catalisa a ativação dos componentes complementos C4 e C2, formando um complexo C4bC2a que funciona como uma C3 convertase. A segunda cascata enzimaticamente ativada, conhecida como o trajeto alternativo, é uma via rápida independente de anticorpo para a ativação e amplificação do sistema complemento. 0 trajeto alternativo compreende diversos componentes, C3, Fator B, e Fator D (relacionado em ordem de trajeto). A ativação do trajeto alternativo ocorre quando C3b, uma clivagem proteolítica de C3, é ligada a um agente de ativação de superfície tal como uma bactéria. 0 fator B é então ligado a C3b para gerar mais C3b, produzindo deposição extensa dos complexos de C3b-Ba na superfície de ativação.
Assim, tanto o trajeto de complemento clássico como o alternativo produzem C3 convertases que dividem o fator C3 em C3a e C3b. Neste ponto, ambas as C3 convertases adicionalmente se agrupam em C5 convertases (C4b2a3b 2 C3b3bBb). Estes complexos de subsequentemente clivam o componente complemento C5 em dois componentes: o polipéptido C5a (9 kDa) e o polipéptido C5b (170 kDa) . O polipéptido C5a liga-se a um recetor acoplado a proteína G 5 ΕΡ1850880Β1 de 7 transmembranas, que esteve originalmente associado a leucócitos e é agora conhecido que é expresso numa variedade de tecidos incluindo hepatócitos e neurónios. A molécula C5a é o componente quimiotáctico principal no sistema complemento humano e pode engatilhar uma variedade de respostas biológicas incluindo quimiotaxia de leucócitos, contração da musculatura lisa, ativação dos trajetos de transdução de sinal intracelular, adesão neutrófilo-endotelial, citocina e libertação de mediador de lipido e formação de oxidante. 0 fragmento C5b maior liga-se sequencialmente aos últimos componentes da cascata complemento, C6, C7, C8 e C9 para formar o complexo de ataque de membrana C5b-9 ("MAC"). 0 MAC C5b-9 pode lisar diretamente eritrócitos, e em maiores quantidades é litico para leucócitos e danoso a tecidos tais como músculo, epitélio e células endoteliais. Em quantidades subliticas, o MAC pode estimular a regulação para mais das moléculas de adesão, aumentar o cálcio intracelular e libertar citocina. Ainda, o MAC C5b-9 pode estimular células tais como as células endoteliais e plaquetas sem provocar a lise celular. Os efeitos não liticos de C5a e MAC C5b-9 são algumas vezes relativamente similares.
Embora o sistema complemento exerça um papel importante na manutenção da saúde, o mesmo tem o potencial de ocasionar ou contribuir para a doença. Por exemplo, o sistema complemento esteve implicado em efeitos colaterais relacionados a cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária ("CABG"), numerosas doenças e/ou condições renais, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, vasculares/pulmonares, alergia, infeções, e doenças de biocompatibilidade/choque e retinopatia diabética. 0 sistema complemento não é necessariamente a 6 ΕΡ1850880Β1 única causa do estado mórbido, mas o mesmo pode ser um de uma série de fatores que contribuem para a patogénese.
Em Fitch et al., Circ. 100:2499 - 506 (1999), os efeitos do fragmento de anticorpo de cadeia simples anti-C5 Pexelizumab em pacientes que se submeteram a cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária com bypass cardiopulmonar ("CPB") foram testados. Pacientes individuais receberam Pexelizumab numa dose de bolus único de 10 minutos logo antes de CPB a 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg e 2,0 mg/kg. As amostras de sangue foram removidas e testadas para a atividade de complemento em pré-dose, 5 minutos após a dose, após 5 minutos a 28°C, após o inicio do reaquecimento, após 5 minutos a 37 °C, e cerca de 7 dias após CPB. A análise farmacodinâmica demonstrou a inibição significativa dependente de dose da atividade hemolítica de complemento por cerca de 14 horas a uma dose de 2 mg/kg, e a geração de subprodutos de complemento pró-inflamatório (sC5b-9) foi efetivamente inibida de um modo dependente de dose. Como mencionado anteriormente, entretanto, os agentes terapêuticos de anticorpo apresenta determinadas limitações. O documento WO 99/41271 revela métodos para identificar e preparar Ligandos de Ácido Nucleico de alta afinidade às Proteínas de Sistema Complemento Clq, C3 e C5.
Consequentemente, seria benéfico ter novos inibidores do sistema complemento para utilização como agentes terapêuticos e agentes de diagnóstico no tratamento dos distúrbios relacionados com complemento. 7 ΕΡ1850880Β1
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma ilustração que representa os trajetos clássico e alternativo do sistema complemento. A Figura 2 é uma representação esquemática do processo de seleção de aptâmero in vitro (SELEX™) a partir de grupos de oligonucleótidos de sequência aleatória. A Figura 3A é uma ilustração que representa a sequência de nucleótido e estrutura secundária de um aptâmero anti-C5 (SEQ ID NO: 1), na qual os resíduos sublinhados são resíduos 2'-H pirimidina ou resíduos 2'-fluoro pirimidina, os resíduos em caixa são resíduos 2'-fluoro pirimidina ou resíduos 2'-OMe pirimidina, e os resíduos indicados por uma seta (-0 representam resíduos que devem conter uma modificação 2 ' -fluoro. A Figura 3B é uma ilustração que representa a sequência de nucleótido e uma estrutura secundária do aptâmero anti-C5 ARC 330 (SEQ ID NO: 2), na qual os resíduos circulados são resíduos 2'-H, os resíduos pirimidina são 2'-fluoro substituídos, e a maior parte dos resíduos purina são 2'-OMe substituídos, exceto para os três resíduos 2'-OH purina mostrados delineados. A Figura 3C é uma ilustração que mostra a sequência de nucleótido e uma estrutura secundária do aptâmero anti-C5 ARC 186 (SEQ ID NO: 4), na qual todos os 21 resíduos pirimidina apresentam modificações 2'-fluoro e a maior parte das purinas (14 resíduos) apresentam modificações 2'-OMe, exceto pelos três resíduos de purina 2'-OH mostrados delineados. 8 ΕΡ1850880Β1 A Figura 4 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida). A Figura 5 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3-bis(mPEG- [20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) fixada à extremidade 5' de um aptâmero. A Figura 6 é uma ilustração que mostra as diversas estratégias para a síntese de conjugados de ácido nucleico PEG de alto peso molecular. A Figura 7A é um gráfico que compara a inibição dependente de dose da hemólise por aptâmeros anti-C5 PEGilados (ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), e ARC 187 (SEQ ID NO: 5)), num aptâmero anti-C5 não PEGilado (ARC 186 (SEQ ID NO: 4)); a Figura 7B é um quadro de valores de IC50 dos aptâmeros usados no teste de hemólise ilustrado na Figura 7A; a Figura 7C é um gráfico que compara a inibição dependente de dose da hemólise pelos aptâmeros anti-C5 PEGilados ARC 187 (SEQ ID NO: 5), ARC 1537 (SEQ ID NO: 65), ARC 1730 (SEQ ID NO: (66), e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67); a Figura 7D é um quadro dos valores de IC50 dos aptâmeros usados no teste de hemólise ilustrado na Figura 7C. A Figura 8 é um gráfico do percentual de inibição de hemólise pelo aptâmero anti-C5 ARC 658 (SEQ ID NO: 62), do complemento de soro de cinomolgus versus complemento de soro humano. A Figura 9 é um gráfico que representa a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) á proteína purificada C5 tanto a 37°C como a temperatura ambiente (23°C) em seguida à incubação por 15 minutos. 9 ΕΡ1850880Β1 A Figura 10 é um outro gráfico que representa a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) à proteína C5 purificada tanto a 37 °C como a temperatura ambiente (23°C) em seguida à incubação de 4 horas. A Figura 11 é um gráfico que representa o decurso de tempo de dissociação do complexo de C5*ARC 186 a 23°C. A Figura 12 é um gráfico que representa o decurso de tempo de equilíbrio na formação do complexo de C5*ARC 186 a 23°C. A Figura 13 é um gráfico que representa a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) à proteína C5 versus os componentes a montante e a jusante na cascata de complemento. A Figura 14 é um gráfico que representa o percentual de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) radiomarcado que se ligou a C5 na presença do competidor não marcado ARC 186 (SEQ ID NO: 4), ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5). A Figura 15 é um gráfico que representa a quantidade de proteína complemento C5b produzida nas amostras de sangue incubadas por 5 horas a 25°C e 37°C na presença de concentrações variáveis do aptâmero ARC 186 (SEQ ID NO: 4). A Figura 16 é um gráfico que representa o percentual da inibição de complemento por ARC 187 (SEQ ID NO: 5) na presença de zimosan em soro humano não diluído, sangue humano total citratado ou soro de cinomolgus.
A Figura 17 é um gráfico que representa ARC 658 (SEQ 10 ΕΡ1850880Β1 ID NO: 62) inibe completamente a ativação de complemento (C5a) no modelo de alça de tubo descrito no Exemplo 1D. A Figura 18 é um gráfico que representa as constantes de dissociação para a ronda 10 dos grupos de seleção de C5. As constantes de dissociação (Kds) foram estimadas ao se ajustar os dados à equação: limite de fração de ARN = amplitude*Kd/ (Kd + [C5] ) . "ARC 520" (SEQ ID NO: 70) refere-se ao grupo dRmY não selecionado e o "+" indica a presença do competidor (0,1 mg/ml de ARNt, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão). A Figura 19 é um gráfico que representa as curvas de constante de dissociação de clone de C5. As constantes de dissociação (Kds) foram estimadas ao ajustar-se os dados da equação: limite de fração de ARN = amplitude*Kd/(Kd + [C5]). A Figura 2 0 é um gráfico que representa uma curva de IC50 que ilustra o efeito inibitório da atividade de hemólise das concentrações variáveis do clone de aptâmero anti-C5 ARC 913 (SEQ ID NO: 75) em comparação a ARC 186 (SEQ ID NO: 4). A Figura 21 é uma ilustração que ilustra a estrutura de ARC 187 (SEQ ID NO: 5). A Figura 22 é uma ilustração que ilustra a estrutura de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67). A Figura 23 é um quadro delineando a configuração experimental do primeiro estudo em coração perfusionado isolado. 11 ΕΡ1850880Β1 A Figura 24 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a plasma humano (A) com os traçados de pressão LVP de um coração isolado exposto à solução de aptâmero de controlo (B). A Figura 25 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a soluções de equivalentes molares de 10X e 50X de aptâmero/C5 (onde se assumiu uma concentração de aproximadamente 500 nM para C5 em plasma humano não diluído normal). A Figura 26 é um gráfico que compara as mudanças na frequência cardíaca em batimentos por minuto (bpm) em corações isolados de ratos após exposição a plasma humano e diversas soluções de plasma/aptâmero. A Figura 27 é um gráfico que compara as mudanças no peso do coração em corações isolados de ratos antes e após a exposição a plasma humano contendo proporção molar 0 - IX ARC 186 (SEQ ID NO: 4) (corações enfraquecidos), ou proporção molar 10 - 50X (corações protegidos com aptâmero C5). A Figura 28 é um gráfico que compara a produção de C5a relativa em plasma humano, contendo concentrações variáveis de aptâmero, em seguida à perfusão através de corações isolados de ratos. As concentrações de C5a relativas são traçadas como unidades de absorção (Abs), onde leituras mais elevadas refletem a presença de níveis mais elevados de C5a. A Figura 2 9 é um gráfico que compara a produção de 12 ΕΡ1850880Β1 C5b-9 solúvel em plasma humano contendo concentrações variáveis de aptâmero, em seguida à perfusão através de corações isolados de ratos. A Figura 30 é um gráfico que representa o efeito de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) na clivagem C3 em efluente de coração de rato. A Figura 31 é um quadro que mostra os resultados de coloração imunohistoquímica para o estudo de coração de rato perfusionado isolado. A Figura 32 é um quadro que mostra a proporção molar de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) necessária, em soro de humano ou primata, para proteger o coração contra danos mediados por C5b. A Figura 33 é um gráfico que representa um gráfico log-linear do percentual restante do comprimento total de ARC 186 como uma função do tempo de incubação tanto em plasma de rato como de macaco cinomolgus. A Figura 34 é um quadro que mostra a configuração experimental do estudo farmacocinético conduzido em ratos Sprague-Dawley como descrito no Exemplo 5. A Figura 35 é um quadro que mostra a concentração plasmática média de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) versus tempo em ratos Sprague-Dawley. A Figura 36 é um gráfico que representa a concentração plasmática média de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) com relação ao tempo em seguida à administração intravenosa do 13 ΕΡ1850880Β1 aptâmero em ratos. A Figura 37 é um quadro que mostra a análise não compartimentalizada da concentração versus os dados de tempo representados nas Figuras 35 e 36. A Figura 38A é um quadro que mostra a configuração para o estudo farmacocinético de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em ratinhos; a Figura 38B é um gráfico que representa o perfil f armacocinét ico de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em ratos CD-I após a administração de um único bolus IV; a Figura 38C é um quadro que mostra a análise não compartimentalizada da concentração versos os dados de tempo ilustrados na Figura 38B. A Figura 39 é um quadro que mostra a deteção dos aptâmeros relacionados no tecido cardíaco de ratinho em seguida à administração intravenosa. A Figura 40 é um quadro que mostra a configuração experimental do estudo animal 1, descrito no exemplo 5E . A Figura 41 é um quadro que mostra a concentração de plasma de aptâmero versus o tempo em seguida à administração de bolus intravenoso do aptâmero a macacos cinomolgus. A Figura 42 é um quadro relacionando os parâmetros farmacocinéticos para ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) administrados por via intravenosa em macacos cinomolgus no estudo 1.
As Figuras 43 (a) e 43(c) são gráficos que representam 14 ΕΡ1850880Β1 as concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a com relação ao tempo em seguida à administração intravenosa dos aptâmeros anti-C5 ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) a macacos cinomolgus; as Figuras 43 (b) e 43(d) são gráficos que representam as concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a com relação à concentração dos aptâmeros anti-C5, ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5). A Figura 44 é um quadro que mostra a configuração experimental do estudo 2, descrito no Exemplo 5F. A Figura 45 é um gráfico que mostra a concentração plasmática média de aptâmero em diversos pontos em seguida à administração intravenosa de ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) em macacos cinomolgus. A Figura 46 é um quadro que mostra as duas análises comportamentais da concentração versus dados de tempo em seguida à administração intravenosa do bolus de aptâmero em macacos cinomolgus. A Figura 47 é um gráfico que representa a concentração de C5b-9 versus a concentração de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zimosan em plasma de cinomolgus. A Figura 48 é um gráfico que representa a concentração de C5a versus a concentração de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zimosan em plasma de cinomolgus. A Figura 49 é um quadro que resume o estudo PK-PD de 15 ΕΡ1850880Β1 ARC 187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administraçao por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus. A Figura 50 é um quadro que resume os parâmetros f armacocinét icos para ARC 187 (SEQ ID NO: 5) em macacos cinomolgus após a administração de bolus IV. A Figura 51 é um gráfico que representa os perfis farmacocinéticos calculado e real medidos de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administração por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus. A Figura 52 é um gráfico que mostra que os níveis plasmáticos de ARC 187 ativo (SEQ ID NO: 5) permaneceram constantes durante e após a administração por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus. A Figura 53 é um quadro que mostra as necessidades de dosagem humana prevista para os aptâmeros anti-C5 em cirurgia de CABG. A Figura 54 é um gráfico que representa que ARC 187 (SEQ ID NO: 5) relativamente não apresentou efeito in vitro na coagulação conforme medido pelo tempo de protrombina (PT) e pelo tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT). A Figura 55 é um quadro que resume os efeitos in vitro de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) numa atividade de anticoagulação da heparina, e atividade de pró-coagulação da protamina. A Figura 56 é um gráfico que representa que a ARC 187 (SEQ ID NO: 5) não efetua a reversão da anticoagulação da heparina in vivo. 16 ΕΡ1850880Β1 A Figura 57 é um gráfico que representa que tanto a heparina como a protamina não apresentavam efeito na função ant i-complemento em ARC 187 (SEQ ID NO: 5), medida pela inibição da ativação de complemento de zimosan. A Figura 58 é um gráfico que representa o percentual de inibição da hemólise de eritrócito de ovelha na presença de soro humano como uma função da concentração de aptâmeros anti-C5 ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC 672 (SEQ ID NO: 63). A Figura 59A é um gráfico que representa o percentual de inibição da hemólise na presença de soros de humano, macaco cinomolgus e soro de rato por ARC 1905 (SEQ ID NO: 67); A Figura 59B é um quadro que resume os valores médios de IC50 para a inibição de ativação de complemento em soro de seres humanos, macaco cinomolgus, e de rato por ARC 1905, um aptâmero anti-C5 ou ARC 127, um aptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controlo negativo). A Figura 60 é um gráfico que representa o valor de IC50 para a inibição de ARC 186 radiomarcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função da concentração do competidor não marcado ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC 672 (SEQ ID NO: 63) (eixo horizontal), num teste de ligação de competição. A Figura 61 é um gráfico que representa o valor de IC50 para a inibição do ARC 186 radiomarcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função da concentração do competidor não marcado ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) (eixo horizontal) a 37°C e 25°C num teste de ligação de competição. 17 ΕΡ1850880Β1 A Figura 62 é um gráfico que representa as curvas padrão para ser humano C5a (hC5a) e macaco cinomolgus C5a (hC5a eq). A Figura 63 é um quadro que resume os valores de IC50, IC90 e IC99 para a inibição de ativação de C5 em soro de humanos e macaco cinomolgus por ARC 1905 (SEQ ID NO: 67), como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan. A Figura 64 é um gráfico que representa o percentual de inibição da geração de C5a como uma função da concentração de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em soros de humano e macaco cinomolgus como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan. A Figura 65 é um gráfico que representa o efeito de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) na geração de C3a em soro de humano ou macaco cinomolgus, como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan. A Figura 66 é um quadro que resume os valores médios de IC50, IC90 e IC99 para a inibição de ARC 1905 da ativação do complemento (SEQ ID NO: 67) em soro de seres humanos provenientes de cinco doadores, como medido num modelo de alça de tubo de ativação de complemento. A Figura 67 é um gráfico que representa o percentual de inibição de geração de C5a e C3a como uma função da concentração de ARC 1905, um aptâmero anti-C5, ou ARC 127, um aptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controlo negativo) num modelo de alça de tubo de ativação de complemento. 18 ΕΡ1850880Β1
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona materiais e métodos para o tratamento, prevenção e melhora de doenças relacionadas com complemento. Numa forma de realização, um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de acordo com ARC 186 (SEQ ID NO: 4) conjugada a uma fração de PEG é proporcionado. Em formas de realização particulares, este conjugado de aptâmero ARC 186/PEG compreende substancialmente a mesma afinidade de ligação por proteina complemento C5 como um aptâmero que consiste na sequência de acordo com SEQ ID NO: 4, mas desprovida da fração de PEG. Substancialmente a mesma afinidade de ligação como usada no presente documento significa não mais de cerca de 2 a dez vezes de diferença, preferivelmente não mais de 2 a cinco vezes de diferença em constantes de dissociação como medido pela análise de dot blot. Em algumas formas de realização, as constantes de dissociação são medidas pela competição da análise de dot blot como descrito no Exemplo IA a seguir. A fração de polietileno glicol compreende um peso molecular superior a 40 kDA. Em algumas formas de realização, a fração de PEG é conjugada à extremidade 5' de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) . Em algumas formas de realização, o conjugado de aptâmero/PEG compreende uma semivida, preferentemente uma semivida terminal num modelo de dois compartimentos como determinado pelo método descrito no exemplo 5E a seguir, de pelo menos 15 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, de forma mais preferida pelo menos 48 horas em primatas. Em algumas formas de realização, o conjugado de aptâmero/PEG compreende uma semivida, preferivelmente uma semivida terminal de um modelo de dois compartimentos, de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 horas em ratos. Em algumas formas de realização, o conjugado PEG à extremidade 5' de ARC 18 6 (SEQ ID NO: 4) é um PEG de 4 0 kDA. O PEG de 19 ΕΡ1850880Β1 40 kDA é um PEG ramificado. Em algumas formas de realização o PEG de 40 kDA ramificado é 1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida). Também se descreve no presente documento que o PEG de 40 kDA é 2,3-bis (mPEG- [20 kDa])-propil-1-carbamoilo.
Em formas de realização onde o PEG de 40 kDA ramificado é 1,3-bis(mPEG- [20 kDa])-propil-2-(4 ' - butamida), um aptâmero que tem a estrutura apresentada a seguir é proporcionada:
O
20 kDa mPEG-NH-C-O-i o H o -OCH2CH2CH2-C-N-™· 5'Aptâmero3' 20 kDa mPEG-NH-C-O- onde, indica um ligante Aptâmero = íOmOíCíCGK^nGmOfUíCfUfCniAiiiQmafCOíCíUmGmAniGfUfCfUmGniAniGfUíUfU AjCfCfUmGfQnO-3T (SEQID NO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH e 3T indica uma desoxi timidina invertida.
Também se descrevem no presente documento conjugados onde o PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoilo, em que um aptâmero que tem a estrutura apresentada a seguir é descrito: 20 ΕΡ1850880Β1 ΕΡ1850880Β1 —Ο"—C—Ν*ν*ΛΑΛ· 20 kDa mPEG—O— 20 kDa mPEG—Ό— 5'Aptâmero3' onde indica um ligante Aptâmero = iCntófCKGnnGmGftíKrnfCmAmOurâRXHCfUmamAjnGfUfCfUmGmAniGfUfUíU AÍCÍCíUmG(CniG*3T (SEQID KO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2' -OH e 3T indica uma desoxi timidina invertida.
Em algumas formas de realização deste aspeto da invenção o ligante é um ligante de alquilo. Em formas de realização particulares, o ligante de alquilo compreende 2 a 18 grupos CH2 consecutivos. Em formas de realização preferidas, o ligante de alquilo compreende 2 a 12 grupos CH2 consecutivos. Em formas de realização particularmente preferidas o ligante de alquilo compreende 3 a 6 grupos CH2 consecutivos.
Numa forma de realização particular, um aptâmero, ARC187 (SEQ ID NO: 5), que tem a estrutura apresentada a seguir é proporcionado:
o II
onde Aptâmero 21 ΕΡ1850880Β1 fCmGfCrcGÍOmOiiiO£U£CÍUfCniAinGniG£COfCfUmGniAmGfUfCflhnGmAmGfU£UfU AíCfCfUmGÍCmO-3T (SEQID NO: 4) em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2'-OH e onde 3T indica uma desoxi timidina invertida.
Também descrito no presente documento é ARC1905 (SEQ ID NO: 67), que tem a estrutura apresentada a seguir:
onde Aptâmero =
ÍCniGíCfCGfCmGmGíUfCfUfCmAiiiGinGfCGÍCfUmGniAniOfUíCfUmGmAinGfUíUfU
AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4) em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2'-OH e onde 3T indica e desoxi timidina invertida.
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas. Numa forma de realização, uma composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou um sal da mesma é proporcionada. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem de proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspeto da invenção, uma composição farmacêutica de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para utilização no tratamento, prevenção ou melhora de doenças 22 ΕΡ1850880Β1 in vivo é proporcionada. Ainda, neste aspeto da invenção, ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para utilização na preparação de uma composição farmacêutica é proporcionado.
Em outro aspeto da invenção, métodos de tratamento são proporcionados. Numa forma de realização, o método da invenção compreende tratar, prevenir ou melhorar uma doença mediada por proteína complemento C5, e/ou os derivados da mesma C5a e C5b-9, o método incluindo a administração de uma composição farmacêutica que compreende ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou um sal do mesmo a um vertebrado. Em algumas formas de realização, o método compreende administrar a composição farmacêutica da presente invenção a um mamífero. Em algumas formas de realização, o mamífero é um ser humano.
Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquémicas agudas (enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, lesão por reperfusão/isquémica); doenças inflamatórias agudas (doenças infeciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante aguda/hiperaguda); doenças crónicas inflamatórias e/ou mediadas pelo sistema imune (alergia, asma, artrite reumatoide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição a transplante subaguda/crónica, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstâncias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas formas de realização, as doenças 23 ΕΡ1850880Β1 mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em: lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com cirurgia de CABG, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiperaguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crónica a transplante. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas com cirurgia de CABG. Numa forma de realização particular, a doença a ser tratada é lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG.
Em algumas formas de realização, o método da invenção inclui a administração da composição farmacêutica que compreende ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas de aptâmeros ARC 187 (SEQ ID NO: 5) são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, de 0,75 a cerca de 3 vezes, e de 1,5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena, enquanto em outras formas de realização a composição de aptâmero é administrada para 24 ΕΡ1850880Β1 alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica da presente invenção compreende ARC 187 (SEQ ID NO: 5) é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 uM, cerca de 1 μΜ ou cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas formas de realização a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão continua.
Em formas de realização particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia de CABG, em particular, lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia de CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas formas de realização cerca de 48 horas ou em algumas formas de realização cerca de 72 horas. Numa forma de realização particular do presente aspeto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero de cerca de duas vezes a concentração da proteína complemento endógena é alcançada pela administração de um bolus intravenoso de cerca de 0,75 a 1,25, preferivelmente cerca de 1 mg de aptâmero por kg do paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero onde mg não inclui o peso do PEG conjugado. Em algumas formas de realização, algumas doses mais baixas serão infundidas num coeficiente selecionado a partir da faixa de 0,001 mg/kg/min a 0, 005 mg/kg/min onde 25 ΕΡ1850880Β1 mg não inclui o peso de PEG conjugado. Numa forma de realização particular, a dose mais baixa será infundida num coeficiente de cerca de 0,0013 mg/kg/min. É ainda outra forma de realização do presente aspeto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de bolus intravenoso.
Num outro aspeto da presente invenção, métodos de diagnóstico são proporcionados. Numa forma de realização, o método de diagnóstico compreende colocar em contacto o ARC 187 (SEQ ID NO: 5) com uma composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variante da mesma, e detetar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em algumas formas de realização, a proteína complemento ou uma variante são vertebrados, em particular mamíferos e mais particularmente seres humanos. A presente invenção proporciona uma composição de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para utilização como um agente de diagnóstico in vivo ou in vitro.
Num outro aspeto da invenção, um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: ARC 330 (SEQ ID NO: 2) e ARC 188-189, ARC 250, ARC 296-297, ARC 331-334, ARC 411-440, ARC 457- 459, ARC 473, ARC 522-525, ARC 532, ARC 543-544, ARC 550- 554, ARC 657-658, ARC 672, ARC 706, ARC 1537, ARC 1730, (SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66) é proporcionado. Numa outra forma de realização, qualquer um de ARC 330 (SEQ ID NO: 2) e ARC 188-189, ARC 250, ARC 296-297, ARC 331-334, ARC 411-440, ARC 457-459, ARC 473, ARC 522-525, ARC 532, ARC 543-544, ARC 550-554, ARC 657-658, ARC 672, ARC 706, ARC 1537, ARC 1730, (SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66) para utilização na preparação de uma composição farmacêutica é 26 ΕΡ1850880Β1 proporcionado. Exemplos no presente documento revelam uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem da proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Também se descreve no presente documento um aptâmero que compreende a sequência de nucleótido de acordo com a SEQ ID NO: 1. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 é descrito. Onde o aptâmero descrito no presente documento compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende substancialmente a mesma afinidade de ligação para a proteína complemento C5 como um aptâmero que consiste na sequência de acordo com a SEQ ID NO: 4, mas desprovida da fração de PEG.
Em outros conjugados descritos no presente documento em que o aptâmero compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma semivida, preferivelmente uma semivida terminal num modelo de dois compartimentos como determinado no Exemplo 5E a seguir, de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 30 horas em primatas. Descrito no presente documento, em que o aptâmero compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma semivida, preferivelmente uma semivida terminal num modelo de dois compartimentos, de pelo menos 1 e uma metade, preferentemente pelo menos sete horas em rato. 27 ΕΡ1850880Β1
Os aptâmeros que compreendem uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 são revelados, o aptâmero é sintetizado com um ligante 5' como se segue: H2N 5' Aptâmero 3', em que denota o ligante. 0 ligante pode ser um ligante de alquilo como se segue: H2N- (CH2) n-5' Aptâmero 3' em que n = 2 a 18, preferentemente n = 2-12, mais preferentemente n = 3 a 6, mais preferentemente n = 6, e em que Aptâmero =
KmGíCíCGfCniQtnGfUCfUíCiiTAniGinOfCGfCfUniGiiiAinGíUfCíUniGtnAoiG/UfUfU AíCfCfUniGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4) em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2'-OH e onde 3T indica uma desoxi timidina invertida. 0 aptâmero modificado a amina resultante pode ser conjugado numa fração de PEG selecionada a partir do grupo que consiste num PEG de 10 kDa, PEG de 20 kDa, PEG de 30 kDa, e PEG linear de 40kDa. Descrevem-se composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 ou um sal das mesmas. A composição farmacêutica da invenção pode compreender um veiculo farmaceuticamente aceitável ou diluente. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento, prevenção ou melhora de doença in vivo, que compreende um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6a SEQ NO: 66, particularmente a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 é descrita. 28 ΕΡ1850880Β1
Também se proporciona no presente documento um conjugado de aptâmero IPEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhora de uma doença mediada por proteína complemento C5, que compreende administrar uma composição farmacêutica que compreende um aptâmero ou um sal do mesmo, onde o aptâmero compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 a um vertebrado é revelado. Em exemplos descritos no presente documento, o método compreende administrar a composição farmacêutica da invenção a um mamífero, preferentemente um ser humano.
Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquémicas agudas (enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, lesão por reperfusão/isquémica); doenças inflamatórias agudas (doenças infeciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante aguda/hiperaguda); doenças crónicas inflamatórias e/ou mediadas pelo sistema imune (alergia, asma, artrite reumatoide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição a transplante subaguda/crónica, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstancias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que 29 ΕΡ1850880Β1 consiste em lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com cirurgia. CABG, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiperaguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crónica a transplante. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas com cirurgia de CABG. Numa forma de realização particular, a doença a ser tratada é lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG.
Um método é descrito o qual inclui a administração da composição farmacêutica que compreende um aptâmero que tem uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, a um paciente para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. As composições farmacêuticas de aptâmeros são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, de 0,75 a cerca de 3 vezes, e de 1,5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 30 ΕΡ1850880Β1 endógena, enquanto em outras formas de realização a composição de aptâmero é administrada para alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. A composição farmacêutica é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas formas de realização a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão continua.
Em formas de realização particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia de CABG, em particular, lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia de CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas formas de realização cerca de 48 horas ou em algumas formas de realização cerca de 72 horas. Numa forma de realização particular do presente aspeto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero, por exemplo, de cerca de duas vezes a concentração da proteina complemento endógena em algumas formas de realização, é alcançada pela administração de um bolus intravenoso ao paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero. Ainda em outras formas de realização da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de 31 ΕΡ1850880Β1 bolus intravenoso.
Descrito no presente documento, métodos de diagnóstico são proporcionados. 0 método de diagnóstico compreende colocar em contacto uma composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variante da mesma com um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, e detetar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. A proteína complemento ou a variante é de um vertebrado, particularmente um mamífero, e mais particularmente um ser humano. Descreve-se no presente documento uma composição de aptâmero que tem um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, para utilização como um diagnóstico in vitro ou in vivo. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, para utilização na preparação de uma composição farmacêutica é descrito.
Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido que é 80% idêntica a qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é descrito. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de que é 80% idêntica a uma região única de qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido que é 90% idêntica a qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 32 ΕΡ1850880Β1 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de que é 90% idêntica a uma região única de qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de 40 nucleótidos idênticos contíguos a 40 nucleótidos contíguos incluídos em qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 8 8 a 98 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de 30 nucleótidos idênticos contíguos a 30 nucleótidos contíguos incluídos em qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é revelado. Um aptâmero que se liga especificamente a proteína complemento C5 que compreende uma sequência de nucleótido de 10 nucleótidos idênticos contíguos a 10 nucleótidos contíguos incluídos em qualquer uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 8 8 a 98 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido de acordo com qualquer uma das sequências de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é revelado.
Exemplos descritos no presente documento imediatamente acima podem compreender ainda uma modificação química selecionada a partir do grupo que consiste em: uma substituição química numa posição de açúcar; uma substituição química numa posição fosfato; e uma substituição química numa posição de base de uma sequência de ácido nucleico. A modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em: incorporação de um nucleótido modificado; cobertura de 3', conjugação a um composto não 33 ΕΡ1850880Β1 imunogénico de alto peso molecular; conjugação a um composto lipofílico; e modificação da estrutura principal de fosfato.
Em formas de realização preferidas deste aspeto da invenção, o aptâmero modula uma função de uma proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em formas de realização particularmente preferidas, o aptâmero inibe a função da proteína complemento C5 ou uma variante da mesma, preferivelmente in vivo, e ainda mais preferivelmente in vivo em seres humanos. Numa forma de realização do presente aspeto da invenção, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é a clivagem da proteína complemento C5.
Em algumas formas de realização do outro aspeto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que bloqueia a clivagem da proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido 80% idêntica, preferivelmente 90% idêntica a uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal da mesma é descrita. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido 80% idêntica, preferivelmente 90% idêntica a uma única região de uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal da mesma é descrita. Uma 34 ΕΡ1850880Β1 composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que tem 40, 30 ou 10 nucleótidos contíguos idênticos a 40, 30 ou 10 nucleótidos, respetivamente, a uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é descrita. Exemplos descritos no presente documento podem compreender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Descreve-se uma composição farmacêutica para utilização no tratamento, prevenção ou melhora da doença in vivo, onde a composição farmacêutica compreende um aptâmero que tem uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal do mesmo. Um aptâmero que tem uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 para utilização na preparação de uma composição farmacêutica é descrito. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem de proteína complemento C5 in vivo ou um sal do mesmo e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável é descrita.
Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquémicas agudas (enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, lesão por reperfusão/isquémica); doenças inflamatórias agudas (doenças infeciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante aguda/hiperaguda); doenças crónicas inflamatórias e/ou mediadas pelo sistema imune (alergia, asma, artrite reumatoide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES) , rejeição a transplante 35 ΕΡ1850880Β1 subaguda/crónica, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstâncias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG, lesão miocárdica relacionada com a angioplastia de balão e lesão miocárdica relacionada com a reestenose, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com cirurgia de CABG, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiperaguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crónica a transplante. Em algumas formas de realização, as doenças mediadas por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas com cirurgia de CABG. Numa forma de realização particular, a doença a ser tratada é lesão miocárdica relacionada com a cirurgia de CABG.
Um método descrito no presente documento inclui a administração da composição farmacêutica que compreende um aptâmero que tem uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, a um 36 ΕΡ1850880Β1 paciente para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. As composições farmacêuticas de aptâmeros são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, de 0,75 a cerca de 3 vezes, e de 1,5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena, enquanto em outras formas de realização a composição de aptâmero é administrada para alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. A composição farmacêutica da presente invenção é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou cerca de 500 nM.
Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas formas de realização a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão contínua.
Em formas de realização particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia de CABG, em particular, lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia de CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas formas de realização cerca de 48 horas ou em algumas formas de realização cerca de 72 horas. Numa forma de realização particular do presente aspeto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero, por exemplo, de cerca de duas vezes a concentração da proteína 37 ΕΡ1850880Β1 complemento endógena em algumas formas de realização, é alcançada pela administração de um bolus intravenoso ao paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero. É ainda outra forma de realização do presente aspeto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de bolus intravenoso.
Um método de diagnóstico é descrito, o método compreende colocar em contacto a composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variante da mesma com um aptâmero que compreende a sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, e detetar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. A proteína complemento ou uma variante são vertebrados, em particular mamíferos e mais particularmente seres humanos. A presente invenção proporciona uma composição de aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, para utilização como diagnóstico in vivo ou in vitro.
Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido que consiste essencialmente numa sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69 é revelado. Um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótido que consiste numa sequência de nucleótido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69 é revelado. Os aptâmeros descritos no presente documento podem ser usados num método de diagnóstico. 38 ΕΡ1850880Β1
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Os pormenores de uma ou mais formas de realização da invenção são determinados na descrição acompanhante a seguir. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles no presente documento descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Outras caracteristicas, objetivos, e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição. Na memória descritiva, formas singulares também incluem plurais a não ser que claramente indicado o contrário no contexto. A não ser que definido de outra forma, todos os temos técnicos e científicos usados no presente documento apresentam o mesmo significado comummente entendido por aqueles peritos na especialidade ao qual pertence a presente invenção. Em caso de conflito, a presente Memória descritiva irá controlar. 0 Método SELEX™
Um método adequado para a geração de um aptâmero é o processo intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" ("SELEX™") em geral ilustrado na Figura 2. 0 processo SELEX™ é um método para a evolução in vitro de moléculas de ácido nucleico com elevada especificidade de ligação a moléculas alvo e é descrito, por exemplo, na Patente US N° 5.475.096 intitulada "Nucleic Acid Ligands", e Patente US N° 5.270.163 (veja-se também WO 91/19813) intitulada "Nucleic Acid Ligands". Cada ligante de ácido nucleico identificado por SELEX™, isto é, cada aptâmero, é um ligante especifico de um composto ou molécula alvo determinado. O processo SELEX™ baseia-se na perceção única de que os ácidos nucleicos apresentam capacidade suficiente de formação de uma variedade de estruturas bi e tridimensional e suficiente versatilidade 39 ΕΡ1850880Β1 química disponível dentro de seus monómeros para agir como ligantes (isto é, formar pares de ligação específica) com, de fato, qualquer composto químico, seja monomérico ou polimérico. Moléculas de qualquer tamanho e composição podem servir como alvos. SELEX™ baseia-se como um ponto de partida sobre uma grande biblioteca ou grupo de oligonucleótidos de uma única fita que compreende sequências aleatórias. Os oligonucleótidos podem ser ADN, ARN ou híbridos de ADN/ARN modificados ou não modificados. Em alguns exemplos, o grupo compreende oligonucleótidos 100% ou parcialmente aleatórios. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleótidos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma sequência fixa e/ou conservada incorporada na sequência aleatória. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleótidos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma sequência fixa e/ou conservada na sua extremidade 5' e 3' que pode compreender uma sequência compartilhada tal como campos de hibridização para primers PCR, sequências promotoras para ARN polimerases (por exemplo, T3, T4, T7 e SP6), campos de restrição, ou sequências homopoliméricas tais como traços poli A ou poli T, núcleos catalíticos, campos para a ligação seletiva à colunas de afinidade, e outras sequências para facilitar a clonagem e/ou o sequenciamento de um nucleótido de interesse. As sequências conservadas são sequências, diferentes das sequências fixas anteriormente descritas, compartilhadas por um número de aptâmeros que se ligam ao mesmo alvo.
Os oligonucleótidos dos grupos preferivelmente incluem uma porção de sequência aleatória assim como sequências fixas necessárias para a amplificação eficiente. Tipicamente, os oligonucleótidos do grupo de partida contêm 40 ΕΡ1850880Β1 sequências terminais 5' e 3' que marqeiam a região interna de 30 - 50 nucleótidos aleatórios. Os nucleótidos aleatórios podem ser produzidos numa série de maneiras incluindo a sintese química e a seleção de tamanho a partir de ácidos nucleicos celulares aleatoriamente clivados. A variação de sequência em ácidos nucleicos de teste pode também ser introduzida ou aumentada por mutagénese antes ou durante das iterações de seleção amplificação. A porção de sequência aleatória do oligonucleótido pode ser de qualquer comprimento e pode compreender ribonucleótidos e/ou desoxiribonucleótidos e pode incluir nucleótidos modificados ou não naturais ou nucleótidos análogos. Veja-se, por exemplo, Patente US N° 5.958.691; Patente US N° 5.660.985; Patente US N° 5.958.691; Patente US N° 5.698.687; Patente US N° 5.817.635; Patente US N° 5.672.695, e Publicação PCT WO 92/07065. Os oligonucleótidos aleatórios podem ser sintetizados a partir dos nucleótidos ligados a fosfodiéster usando técnicas de síntese de oligonucleótido de fase sólida, bem conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399 - 5467 (1986) e Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575 - 5578 (1986). Os oligonucleótidos aleatórios podem também ser sintetizados usando métodos de fase de solução tais como os métodos de síntese de triéster. Veja-se, por exemplo, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978). A síntese típica realizada em equipamento de síntese de ADN automatizado produziu 1014-1015 moléculas individuais, um número suficiente para a maior parte dos experimentos com SELEX™. Regiões suficientemente grandes no desenho de sequências aumentam a probabilidade de cada molécula sintetizada em representar uma sequência única. A biblioteca de partida de oligonucleótidos pode ser 41 ΕΡ1850880Β1 gerada por síntese química automatizada num sintetizador de ADN. Para sintetizar sequências aleatórias, misturas de todos os quatro nucleótidos são adicionadas a cada etapa de adição de nucleótido durante o processo de síntese, permitindo a incorporação aleatória de nucleótidos. Como determinado acima, numa forma de realização, os oligonucleótidos aleatórios compreendem sequências inteiramente aleatórias; entretanto, em outras formas de realização, os oligonucleótidos aleatórios podem compreender trechos de sequências não aleatórias ou parcialmente aleatórias. As sequências parcialmente aleatórias podem ser criadas ao se adicionar quatro nucleótidos em proporções molares diferentes em cada etapa de adição. A biblioteca de partida de oligonucleótidos pode ser ou de ARN ou de ADN. Nos casos onde a biblioteca de ARN deve ser usada como a biblioteca de partida a mesma é tipicamente gerada pela transcrição da biblioteca de ADN in vitro usando polimerase ARN T7 ou polimerases ARN T7 modificadas e purificadas. A biblioteca de ARN ou ADN é então misturada com um alvo sob condições favoráveis para a ligação e submetidas a iterações em etapas de ligação, divisão e amplificação, usando o mesmo esquema de seleção geral, para alcançar de fato qualquer critério de afinidade e seletividade de ligação desejados. Mais especificamente, partindo com uma mistura que contém o grupo de partida dos ácidos nucleicos, o método SELEX™ inclui etapas de: (a) colocar em contacto a mistura com o alvo sob condições favoráveis de ligação; (b) dividir os ácidos nucleicos não ligados a partir dos ácidos nucleicos que se ligaram especificamente a moléculas alvo; (c) dissociar os complexos de ácido nucleico alvo; (d) amplificar os ácidos nucleicos dissociados a partir dos complexos de ácido nucleico alvo para produzir uma mistura enriquecida de 42 ΕΡ1850880Β1 ligante de ácidos nucleicos; e (e) reiterar as etapas de ligação, divisão, dissociação e amplificação através de tantos ciclos quanto desejados para produzir ligantes de ácido nucleico de alta afinidade altamente específicos à molécula alvo. Nos casos onde aptâmeros de ARN são selecionados, o método SELEX™ adicionalmente compreende as etapas de: (i) reverter a transcrição dos ácidos nucleicos dissociados a partir dos complexos de ácido nucleico alvo antes da amplificação na etapa (d) ; e (ii) transcrever os ácidos nucleicos amplificados a partir da etapa (d) antes de reiniciar o processo.
Dentro da mistura de ácido nucleico que contém um grande número de sequências e estruturas possíveis, há uma grande variedade de afinidades de ligação para um determinado alvo. Uma mistura de ácido nucleico que compreende, por exemplo, 20 segmentos aleatórios de nucleótido podem ser dotados de 420 possibilidades candidatas. Aqueles com maiores constantes de afinidade para o alvo são mais propensos a ligarem-se ao alvo. Após a divisão, dissociação e amplificação, uma segunda mistura de ácido nucleico é gerada, enriquecida para os candidatos de maior afinidade de ligação. Vias adicionais de seleção progressivamente favorecem os melhores ligantes até que a mistura de ácido nucleico resultante seja predominantemente composta apenas de uma ou de poucas sequências. As ditas podem então ser clonadas, sequenciadas e individualmente testadas quanto a afinidade de ligação como ligantes puros ou aptâmeros.
Ciclos de seleção e de amplificação são repetidos até que os objetivos desejados sejam alcançados. Num caso mais geral, a seleção/amplificação é continuada até que nenhum aprimoramento significativo na resistência de ligação seja alcançado na repetição do ciclo. O método é tipicamente 43 ΕΡ1850880Β1 usado para amostrar aproximadamente 1014 diferentes espécies de ácidos nucleicos mas podem ser usado para amostrar tanto quanto 1018 espécies diferentes de ácidos nucleicos. Em geral, moléculas de aptâmero de ácido nucleico são selecionadas num procedimento de 5 ciclos a 20 ciclos. Numa forma de realização, a heterogeneidade é introduzida apenas em estágios de seleção iniciais e não ocorrem através do processo de replicação.
Numa forma de realização de SELEX™, o processo de seleção é tão eficiente no isolamento dos ditos ligantes de ácido nucleico que se ligam mais fortemente ao alvo selecionado, que apenas um ciclo de seleção e amplificação é necessário. Uma dita seleção eficiente pode ocorrer, por exemplo, em processos do tipo cromatográfico onde a habilidade do ácido nucleico de se associar com alvos ligados a uma coluna, opera de tal forma que a coluna é suficientemente capaz de permitir a separação e o isolamento de ligantes de ácidos nucleicos de mais alta afinidade.
Em muitos casos, não é necessariamente desejável se realizar as etapas iterativas de SELEX™ até que um único ligante de ácido nucleico seja identificado. A solução ligante de ácido nucleico especifica a alvo pode incluir uma família de estruturas de ácido ou motivos que apresentam um número de sequências conservadas e um número de sequências que podem ser substituídas ou adicionadas sem afetar de forma significativa a afinidade dos ligantes de ácido nucleico ao alvo. Ao se terminar o processo de SELEX™ antes da conclusão, é possível se determinar a sequência de um número de membros da família de solução de ligante de ácido nucleico.
Uma variedade de estruturas primárias, secundárias e 44 ΕΡ1850880Β1 terciárias de ácido nucleico é conhecida. As estruturas ou motivos que estão mais comummente envolvidas nas interações do tipo não-Watson-Crick são ditas como alças de hairpin, abaulamentos simétricos e assimétricos, pseudo-nós e uma miriade de combinações das mesmas. Quase todos os casos conhecidos dos ditos motivos sugerem que os mesmos podem ser formados numa sequência de ácido nucleico de mais de 30 nucleótidos. Por esta razão, é com frequência preferido que os procedimentos SELEX™ com segmentos aleatórios contíguos sejam iniciados com as sequências de ácidos nucleicos contendo um segmento aleatório entre cerca de 20 a cerca de 50 nucleótidos e em algumas formas de realização de cerca de 30 a cerca de 40 nucleótidos. Num exemplo, sequência de 5'-fixa : aleatória : 3'-fixa compreende uma sequência aleatória de cerca de 30 a cerca de 50 nucleótidos. O método SELEX™ de núcleo foi modificado para alcançar um número de objetivos específicos. Por exemplo, a Patente US N° 5.707.796 descreve a utilização de SELEX™ junto com eletroforese de gel para selecionar moléculas de ácido nucleico com características estruturais específicas, tais como ADN dobrado. A Patente US N° 5.763.177 descreve métodos com base em SELEX™ para a seleção de grupos fotoreativos contendo ligantes de ácido nucleico capazes de ligar-se e/ou fotoreticular a e/ou fotoinativar uma molécula alvo. A Patente US N° 5.567.588 e a Patente US N° 5.861.254, descrevem métodos com base em SELEX™ que alcançam uma divisão altamente eficiente entre os oligonucleótidos dotados de alta e baixa afinidade para a molécula alvo. A Patente US N° 5.496.938 descreve métodos para a obtenção de ligantes de ácido nucleico aprimorados após o processo SELEX™ ter sido realizado. A Patente US N° 5.705.337 descreve métodos para ligar covalentemente um ligante ao seu alvo. SELEX™ pode também ser usado para se obter ligantes de 45 ΕΡ1850880Β1 ácido nucleico que se ligam a mais de um campo na molécula alvo, e para se obter ligantes de ácido nucleico que incluem espécies de ácido não nucleico que se ligam a campos específicos no alvo. SELEX™ proporciona meios para o isolamento e a identificação de ligantes de ácido nucleico que se ligam a qualquer alvo desejável, incluindo biomoléculas grandes e pequenas tais como as proteínas de ligação - ácido nucleico e proteínas não conhecidas por ligação a ácidos nucleicos como parte da função biológica das mesmas assim como cofatores e outras pequenas moléculas. Por exemplo, a Patente US N° 5.580.737 descreve sequências de ácido nucleico identificadas através de SELEX™ que são capazes de ligar-se com alta afinidade à cafeína e ao análogo proximamente relacionado, teofilina.
Contra-SELEX™ é um método de aprimorar a especificidade dos ligantes de ácido nucleico a uma molécula alvo ao eliminar as sequências de ligante de ácido nucleico com reatividade cruzada a uma ou mais moléculas não alvo. Contra-SELEX™ é compreendido das etapas de: (a) preparar uma mistura candidata de ácidos nucleicos; (b) colocar em contacto a mistura com o alvo onde os ácidos nucleicos dotados de maior afinidade ao alvo com relação à mistura candidata pode ser dividida a partir do restante da mistura candidata; (c) dividir os ácidos nucleicos de maior afinidade a partir do restante da mistura candidata; (d) dissociar os ácidos nucleicos de maior afinidade do alvo; (e) colocar em contacto os ácidos nucleicos de maior afinidade com uma ou mais moléculas alvo de modo que os ligantes de ácido nucleico com afinidade específica para a(s) molécula(s) não alvo sejam removidos; (f) amplificar os ácidos nucleicos com afinidade específica apenas à molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida para a sequência de ácido nucleico com uma afinidade relativamente mais alta e especificidade para 46 ΕΡ1850880Β1 ligação à molécula alvo. Como descrito acima para SELEX™, os ciclos de seleção e amplificação são repetidos como necessário até que o objetivo desejado seja alcançado.
Um problema potencial encontrado na utilização de ácidos nucleicos como vacinas terapêuticas é que os oligonucleótidos em sua forma de fosfodiéster podem ser rapidamente degradados nos fluidos corporais por enzimas intracelulares e extracelulares tais como as endonucleases e exonucleases antes do efeito desejado se manifestar. 0 método SELEX™ abrange assim a identificação de ligantes de ácido nucleico de alta afinidade contendo nucleótidos modificados que conferem caracteristicas aprimoradas no ligante, tais como caracteristicas de estabilidade in vivo aprimorada ou de envio aprimorada. Exemplos das ditas modificações incluem as substituições quimicas nas posições de ribose e/ou fosfato e/ou de base. Os ligantes de ácido nucleico identificados por SELEX™ contendo os nucleótidos modificados são descritos, por exemplo, na Patente US N° 5.660.985, que descreve derivados de nucleótido contendo oligonucleótidos quimicamente modificados na posição 2' de ribose, posição 5 de pirimidinas, e posição 8 de purinas; a Patente US N° 5.576.703, que descreve oligonucleótidos contendo diversas pirimidinas 2'- modificadas, e a Patente US N° 5.580.737 que descreve ligantes de ácido nucleico altamente específicos contendo um ou mais nucleótidos modificados com substituintes 2'- amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'—F), e/ou 2'-OMe (2'-OMe).
Modificações dos ligantes de ácido nucleico contempladas na presente invenção incluem, mas não são limitadas àquelas que proporcionam outros grupos químicos que incorporam carga adicional, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligação a hidrogénio, interação eletrostática, e capacidade de fluxo às bases dos ligantes 47 ΕΡ1850880Β1 de ácido nucleico ou ao ligante de ácido nucleico como um todo. Modificações que geram populações de oligonucleótido que são resistentes a nucleases podem também incluir uma ou mais ligações de internucleótido substitutas, açúcares alterados, bases alteradas, ou combinações dos mesmos. As ditas modificações incluem, mas não são limitados a, modificações de açúcar na posição 2' , modificações de pirimidina na posição 5', modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exociclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracilo; modificações de estrutura, modificações de fosforotioato ou fosfato de alquilo, metilações, e combinações de emparelhamento de base não usuais tais como isobases isocitidina e isoguanidina. Modificações podem também incluir modificações 3' e 5' tais como cobertura.
Numa forma de realização, os oligonucleótidos são proporcionados nos quais o grupo P(0)0 é substituível por P (0) S ("tioato"), P(S)S ( "dit ioato") , P(0)NR2 ("amidato") , P(0)R, P(0)0R'C0 ou CH2 ("formacetal") ou 3'-amina (-NH-CH2- CH2-) , onde cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído. Os grupos de ligação podem ser fixados a nucleótidos adjacentes através de uma ligação -0-, - N-, ou -S-. Não é necessário que todas as ligações no oligonucleótido sejam idênticas. Como usado no presente documento, o termo fosforotioato abrange um ou mais átomos de oxigénio não ligados por ponte numa ligação fosfodiéster substituída por um ou mais átomos de enxofre.
Em formas de realização adicionais, os oligonucleótidos compreendem grupos de açúcar modificados, por exemplo, um ou mais grupos hidroxilo é substituído com halogéneo, grupos alifáticos, ou funcionalizados como éteres ou aminas. Numa forma de realização, a posição 2', 48 ΕΡ1850880Β1 do resíduo furanose é substituída por qualquer um do grupo OMe, O-alquilo, O-alilo, S-alquilo, S-alilo, ou halo. Métodos de síntese de açúcares 2'- modificados são descritos, por exemplo, em Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733 - 738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629 - 2635 (1991); e Hobbs, et al., Biochemistry 12:5138 - 5145 (1973). Outras modificações são conhecidas daqueles peritos na especialidade. As ditas modificações podem ser modificações do processo pré-SELEX™ ou modificações do processo pós-SELEX™ (modificações dos ligantes não modificados anteriormente identificados) ou podem ser produzidas por incorporação no processo SELEX™.
As modificações do processo pré-SELEX™ ou aquelas produzidas pela incorporação no processo SELEX™ produzem ligantes de ácido nucleico tanto com especificidade para o alvo SELEX™ dos mesmos como estabilidade aprimorada, por exemplo, estabilidade in vivo. As modificações do processo pós- SELEX™ produzidas nos ligantes de ácido nucleico podem resultar em estabilidade aprimorada, por exemplo, estabilidade in vivo, sem afetar adversamente a capacidade de ligação do ligante de ácido nucleico. 0 método SELEX™ abrange a combinação de oligonucleótidos selecionados com outros oligonucleótidos selecionados e unidades funcionais não oligonucleótido como descrito na Patente US N° 5.637.459 e na Patente US N° 5.683.867 . 0 método SELEX™ abrange ainda a combinação de ligantes de ácido nucleico selecionados com compostos de alto peso molecular lipofílicos e não imunogénicos num complexo diagnóstico ou terapêutico, como descrito, por exemplo, na Patente US N° 6.011.020, Patente US N° 6.051.698 e na Publicação PCT N° WO 98/18480. Estas patentes e pedidos ensinam a combinação de uma estrutura ampla de formatos e de outras propriedades, com as 49 ΕΡ1850880Β1 propriedades de amplificação e de replicação de oligonucleótidos com as propriedades desejáveis de outras moléculas. A identificação dos ligantes de ácido nucleico em péptidos pequenos e flexíveis por meio do método SELEX™ também foi explorada. Os pequenos péptidos apresentam estruturas flexíveis e em geral existem em solução num equilíbrio de múltiplos conformadores, e assim foi inicialmente pensado que as afinidades de ligação podem ser limitadas pela entropia de conformação perdida com a ligação a um péptido flexível. Entretanto, a possibilidade de identificação de ligantes de ácido nucleico a pequenos peptídeos em solução foi demonstrada na Patente US N° 5.648.214. Nesta patente, os ligantes de ácido nucleico de alta afinidade a ARN à substância P, um peptídeo de amino ácido, foram identificados.
Os aptâmeros com especificidade e afinidade de ligação ao (s) alvo(s) da presente invenção são tipicamente selecionados pelo processo SELEX™ como no presente documento descrito. Como parte do processo SELEX™, as sequências selecionadas para ligar o alvo são então opcionalmente minimizadas para determinar a sequência mínima que tem uma afinidade de ligação desejada. As sequências selecionadas e/ou sequências minimizadas são opcionalmente otimizadas ao se realizar mutagénese aleatória ou direcionada da sequência para aumentar a afinidade de ligação ou alternativamente para determinar quais posições na sequência são essenciais para a atividade de ligação.
Adicionalmente, seleções podem ser realizadas com sequências que incorporam nucleótidos modificados para estabilizar as moléculas de aptâmero contra a degradação in 50 ΕΡ1850880Β1 vi vo. SELEX™ de 2' Modificado
De modo a que um aptâmero seja adequado para utilização como um terapêutico, o mesmo é preferivelmente económico de sintetizar, seguro e estável in vivo. Aptâmeros de ARN do tipo selvagem e ADN são tipicamente não estáveis in vivo em virtude da suscetibilidade dos mesmos à degradação por nucleases. A resistência à degradação por nuclease pode ser grandemente aumentada pela incorporação de um grupo de modificação na posição 2'.
Grupos flúor e amino foram incorporados com sucesso em bibliotecas de oligonucleótido a partir das quais os aptâmeros foram selecionados subsequentemente. Entretanto, as ditas modificações aumentam grandemente o custo da síntese do aptâmero resultante, e pode introduzir preocupações de segurança em alguns casos pelo fato da possibilidade de que os nucleótidos modificados podem ser reciclados em ADN hospedeiro por degradação de oligonucleótidos modificados e utilização subsequente de nucleótidos como substratos para a síntese de ADN.
Os aptâmeros que contêm nucleótidos 2'-OMe ("2'- OMe") como proporcionado em algumas formas de realização no presente documento, superam muitos dos ditos inconvenientes. Os oligonucleótidos contendo os nucleótidos 2'-OMe são abundantes em sistemas biológicos, polimerases naturais não aceitam NTPs 2'-0-metilo como substratos sob condições fisiológicas, assim, não há preocupação de segurança com relação à reciclagem dos nucleótidos 2'-OMe no ADN hospedeiro. 0 método SELEX™ usado para gerar os aptâmeros 2'-modificados é descrito, por exemplo, no documento US 2004/0197804 Al, e US 2005/0037394 Al, 51 ΕΡ1850880Β1 intitulado "Method for in vitro Selection of 2'-OMe Substituted Nucleic Acids". A presente invenção inclui aptâmeros que se ligam e modulam a função da proteína complemento C5 que contém nucleótidos modificados (por exemplo, nucleótidos que apresentam uma modificação na posição 2') para produzir um oligonucleótido mais estável do que o oligonucleótido não modificado em relação à degradação enzimática e química assim como degradação térmica e física. Embora haja diversos exemplos de aptâmeros que contêm 2'-OMe na literatura (veja-se, por exemplo, Green et ai., Current Biology 2, 683 - 695, 1995) estes foram gerados pela seleção in vitro das bibliotecas de transcrições modificadas nas quais os resíduos C e U foram 2'-fluoro (2'-F) substituídos e os resíduos A e G foram 2'-OH. Uma vez que as sequências funcionais foram identificadas e então cada resíduo A e G foi testado quanto a tolerância à substituição 2'-OMe, e o aptâmero foi resintetizado dotado de todos os resíduos A e G que toleraram a substituição 2'-OMe como os resíduos 2'-OMe. A maior parte dos resíduos A e G dos aptâmeros gerados no modo de duas etapas toleraram a substituição com os resíduos 2'-OMe, embora em média, aproximadamente 20% não o fizeram. Consequentemente, os aptâmeros gerados usando o presente método tendem a conter de dois a quatro resíduos 2'-OH, e a estabilidade e os custos de síntese são comprometidos em consequência disto. Ao se incorporar os nucleótidos modificados na reação de transcrição que gera os oligonucleótidos estabilizados usados nos grupos de oligonucleótido a partir dos quais os aptâmeros são selecionados e enriquecidos por meio de SELEX™ (e/ou de suas variações e aprimoramentos, incluindo aqueles no presente documento descritos); os métodos da presente invenção eliminam a necessidade de estabilização dos oligonucleótidos de aptâmero selecionados (por exemplo, 52 ΕΡ1850880Β1 por re-síntese dos oligonucleótidos de aptâmero com nucleótidos modificados).
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona aptâmeros que compreendem combinações de modificações de 2'- OH, 2' -F, 2'-desoxi, e 2'-OMe dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Descrevem-se no presente documento aptâmeros que compreendem combinações de modificações de 2'-OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2'-OMe, 2'-NH2 e 2'-metoxiet ilo dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Descrevem-se no presente documento aptâmeros que compreendem 56 combinações de modificações de 2'-OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2'- OMe, 2'-NH2 e 2'-metoxietilo dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP.
Os aptâmeros 2' modificados da invenção são criados usando polimerases modificadas, por exemplo, uma polimerase T7 modificada, que tem um coeficiente de incorporação de nucleótidos modificados dotados de substituintes volumosos na posição furanose 2' que é mais alta do que aquela das polimerases do tipo selvagem. Por exemplo, uma polimerase T7 mutante simples (Y639F) na qual o residuo de tirosina na posição 639 foi mudado em fenilalanina prontamente utiliza trifosfatos nucleótidos 2'-desoxi, 2'-amino- e 2'-fluoro-(NTPs) como substratos e foi amplamente usado para sintetizar ARN modificados para uma variedade de aplicações. Entretanto, a dita polimerase T7 mutante, ao que consta, não pode prontamente utilizar (isto é, incorporar) NTPs com substituintes 2' volumosos tais como os substituintes 2'-OMe ou 2'-azido (2'-N3). Para a incorporação de substituintes 2' volumosos, um mutante de polimerase T7 duplo (Y639F/H784A) dotado de uma histidina na posição 784 mudada num residuo de alanina para a mutação Y639F foi descrito e foi usado em circunstâncias limitadas para incorporar NTPs de piridina modificados. Veja-se, 53 ΕΡ1850880Β1
Padilla, R. e Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. Uma única polimerase T7 mutante (H784A) que tem uma histidina na posição 784 mudada num resíduo de alanina também foi descrita. Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138. Em ambas as polimerases Y639F/H784A mutante dupla e H784A mutante simples, a mudança num resíduo de amino ácido menor tal como alanina permite a incorporação de substratos de nucleótidos mais volumosos, por exemplo, os nucleótidos substituídos 2'-O metilo.
Em geral, observou-se que sob as condições no presente documento descritas, o mutante simples Y693F pode ser usado para a incorporação de todos os NTPs substituídos a 2'-OMe exceto pelo GTP e o mutante duplo Y639F/H784A pode ser usado para a incorporação de todos os NTPs substituídos a 2'-OMe incluindo GTP. Espera-se que as propriedades de processos de mutantes simples H784A similares a Y639F e mutantes Y639F/H784A quando usados sob as condições no presente documento descritas.
Os oligonucleótidos 2'-modificados podem ser nucleótidos inteiramente sintetizados ou modificados, ou com um subconjunto de nucleótidos modificados. As modificações podem ser as mesmas ou diferentes. Todos os nucleótidos podem ser modificados, e todos podem conter a mesma modificação. Todos os nucleótidos podem ser modificados, mas podem conter modificações diferentes, por exemplo, todos os nucleótidos contendo a mesma base podem ser dotados de um tipo de modificação, enquanto os nucleótidos contendo outras bases podem ser dotados de diferentes tipos de modificação. Todos os nucleótidos purina podem ser dotados de um tipo de modificação (ou não são modificados) , enquanto todos os nucleótidos pirimidina apresentam outro tipo de modificação (ou não são 54 ΕΡ1850880Β1
modificados). Desta forma, as transcrições, ou grupos de transcrições são gerados usando qualquer combinação de modificações, incluindo, por exemplo, ribonucleótidos (2' — OH), desoxiribonucleótidos (2'-desoxi), 2'-F, e nucleótidos 2'-OMe. Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe C e U e r-OH A e G é dita como uma mistura "rRmY" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "rRmY". Uma mistura de transcrição contendo desoxi A e G e 2'-OMe U e C é dita como uma mistura "dRmY" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "dRmY". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, C, e U, e 2' -OH G é dita como uma mistura "rGmH" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "rGmH". Uma mistura de transcrição alternada contendo 2'-OMe A, C, U e G e 2'-OMe A, UeCe2'-FGé dita como uma "mistura alternada" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros de "mistura alternada". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, C, e G, onde cerca de 10% de G's são ribonucleótidos, é dita como uma mistura "r/mGmH" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "r/mGmH". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, e C, e 2'-F G é dita como uma mistura "fGmH" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "fGmH". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, e C, e desoxi G é dita como uma mistura "dGmH" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "dGmH". Uma mistura de transcrição contendo A, e 2'- OMe C, G e U é dita como uma mistura "dAmB" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "dAmB", e a mistura de transcrição contendo todos os nucleótidos 2' -OH é dita como uma mistura "rN" e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são ditos como aptâmeros "rN" ou "rRrY". Um aptâmero "mRmY" é um contendo todos os nucleótidos 2'-OMe e é em geral derivado a partir de um oligonucleótido r/mGmH 55 ΕΡ1850880Β1 pela substituição pós SELEX, quando possível, de qualquer 2'-OH Gs com 2'-OMe Gs.
Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-OH, 2'-desoxi e 2'-OMe. Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-desoxi e 2'-OMe. Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-desoxi e 2'-OMe nos quais as pirimidinas são 2'-OMe (tal como dRmY, mRmY ou dGmH). A incorporação de nucleótidos modificados em aptâmeros da presente invenção é realizada antes (pré-) do processo de seleção (por exemplo, um processo de modificação pré-SELEX™). Opcionalmente, os aptâmeros da invenção nos quais os nucleótidos modificados foram incorporados pelo processo de modificação pré-SELEX™ podem ser adicionalmente modificados pelo processo de modificação pré-SELEX™ (isto é, um processo de modificação pós-SELEX™ após o processo de modificação pré-SELEX™). As modificações do processo pré-SELEX™ produzem ligantes de ácido nucleico modificados com especificidade para alto SELEX™ e ainda com estabilidade aprimorada in vivo. As modificações do processo pós-SELEX™, isto é, modificações de (por exemplo, truncagem, deleção, substituição ou modificações de nucleótido adicional dos ligantes anteriormente identificados dotados de nucleótidos incorporados pelo processo de modificação pré-SELEX™) podem resultar num aprimoramento adicional da estabilidade in vivo sem afetar adversamente a capacidade de ligação do ligante de ácido nucleico dotado de nucleótidos incorporados pelo processo de modificação pré-SELEX™.
Para gerar grupos de transcrição de ARN 2'-modifiçados (por exemplo, 2'-OMe) em condições sob as quais a polimerase aceita os NYPs 2'-modificados, a polimerase preferida é um mutante duplo Y693F/H784A ou o mutante 56 ΕΡ1850880Β1 simples Y693F. Outras polimerases em particular aquelas que exibem alta tolerância para os substituintes-2' volumosos, podem ainda ser usadas na presente invenção. As ditas polimerases podem ser classificadas quanto a capacidade das mesmas em testar sua capacidade em incorporar nucleótidos modificados sob condições de transcrição no presente documento descritas.
Uma série de fatores foi determinada como sendo importante para as condições de transcrição úteis nos métodos no presente documento descritos. Por exemplo, aumentos nos rendimentos de transcrição modificados são observados quando a sequência líder é incorporada na extremidade 5' de uma sequência fixa na extremidade 5' do molde de transcrição de ADN, de modo que pelo menos cerca dos 6 primeiros resíduos da transcrição resultante são todos purinas.
Outro fator importante na obtenção de transcrições que incorporam os nucleótidos modificados é a presença ou concentração de 2'-OH GTP. A transcrição pode ser dividida em duas fases: a primeira fase é a iniciação, durante a qual um NTP é adicionado à extremidade 3'-hidroxilo de GTP (ou outra guanosina substituída) para produzir um dinucleótido que é então estendido sobre 10 - 12 nucleótidos; a segunda fase é o alongamento, durante o qual a transcrição procede além da adição do primeiro dos 10 -12 nucleótidos. Observou-se que pequenas quantidades de 2'-OH GTP adicionadas à mistura de transcrição contendo um excesso de 2'-OMe e 2'-OH GTP, e um excesso de 2 '-OMe GTP em 2'-OH GTP permite a incorporação principalmente de 2' -OMe GTP.
Outro fator importante na incorporação de nucleótidos substituídos a 2'-OMe em transcritos é a utilização tanto 57 ΕΡ1850880Β1 de magnésio como de manganês divalente na mistura de transcrição. Combinações diferentes de concentrações de cloreto de magnésio e de cloreto de manganês foram observadas afetar os rendimentos dos transcritos 2'-0Me, a concentração ideal do cloreto de magnésio e de manganês sendo dependente da concentração na mistura de reação de transcrição de NTPs, gue formam complexos de com os iões de metal divalentes. Para se obter os melhores rendimentos dos transcritos 2'-OMe substituídos (isto é, todos A, C e u e cerca de 90% de nucleótidos G) , concentrações de aproximadamente 5 mM de cloreto de magnésio e 1,5 mM de cloreto de manganês são preferidos quando cada NTP estiver presente a uma concentração de 0,5 mM. Quando a concentração de cada NTP for 1,0 mM, as concentrações de aproximadamente 6,5 mM de cloreto de magnésio e 2,0 mM de cloreto de manganês são preferidas. Em qualquer caso, os desvios das ditas concentrações de cerca de duas vezes ainda proporcionam quantidades significativas dos transcritos modificados. A transcrição inicial com GMP ou guanosina é também importante. O dito efeito resulta da especificidade da polimerase para o nucleótido de iniciação. Como resultado, o nucleótido 5'-terminal de qualquer transcrito gerado desta forma é provável ser 2' -OH G. A concentração preferida de GMP (ou guanosina) é de 0,5 mM e mesmo mais preferivelmente 1 mM. Foi também observado que ao se incluir PEG, preferivelmente PEG-8000, na reação de transcrição é útil se maximizar a incorporação de nucleótidos modificados.
Para a máxima incorporação de 2'-OMe ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) e GTP (-90%) ("r/mGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% 58 ΕΡ1850880Β1 (peso/volume), Triton X- 100 0,01% (peso/volume), MgCl2 5 mM (6,5 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 1,0 mM) , MnCl2 1,5 mM (2,0 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 1,0 mM), 2'-OMe NTP (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 1,0 mM) , 2 '-OH GTP 30 μΜ, 2 '-OH GMP 500 μΜ, pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN polimerase Y639F/H784AT7, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência lider de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento. Como usado no presente documento, uma unidade de polimerase de ARN T7 mutante Y639F/H784A (ou qualquer outra polimerase ARN T7 mutante no presente documento especificada) é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmol NTPs de 2'-OMe em transcritos sob as condições r/mGmH. Como usado no presente documento, uma unidade de pirofosfatase inorgânica é definida como a quantidade de enzima que irá libertar 1,0 mole de ortofosfato inorgânico por minuto a um pH 7,2 e 25 °C.
Para a incorporação máxima (100%) de 2'-OMe ATP, UTP e CTP ("rGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01%
(peso/volume), MgCl2 5 mM (9,6 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 2,0 mM) , MnC12 1,5 mM (2,9 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 2,0 mM) , 2'-OMe NTP (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2,0 mM) , pH 7,5, 15 unidades/ml de polimerase ARN Y639F T7, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência lider de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100%) de 2'-OMe UTP e CTP ("rRmY") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% 59 ΕΡ1850880Β1 (peso/volume) , MgCl2 5 mM (9,6 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 2,0 mM) , MnCl2 1,5 mM (2,9 mM onde a concentração de cada 2'-OMe NTP é 2,0 mM) , 2'-OMe NTP (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2,0 mM) , pH 7,5, 15 unidades/ml de polimerase ARN Y639F/H784A T7, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência lider de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100%) de desoxi ATP e GTP e 2'-OMe UTP e CTP ("dRmY") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2'- OMe NTP (cada) 200 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de polimerase ARN Y639F T7, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência lider de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100%) de 2'-OMe ATP, UTP e CTP e 2'F GTP ("fGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume) , Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2'-OMe NTP (cada) 2,0 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de polimerase ARN Y639F T7, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência lider de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.
Para a incorporação máxima (100%) de desoxi ATP e 2'-OMe UTP, GTP e CTP ("dAmB") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2'- OMe NTP (cada) 200 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de polimérase ARN Y639F T7, 5 unidades/ml de 60 ΕΡ1850880Β1 pirofosfatase inorgânica, e toda a sequência líder de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.
Para cada uma das (a) transcrições acima, é preferivelmente realizada a uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 50°C, preferivelmente de cerca de 30°C a cerca de 45°C, e de forma mais preferida em cerca de 37°C por um período de pelo menos duas horas e (b) 50 nM - 300 nM de um molde de transcrição de ADN de dupla fita é usado (molde de 200 nM é usado na ronda 1 para aumentar a diversidade (molde de 300 nM é usado nas transcrições em dRmY)), e para as rodadas subsequentes, aproximadamente 50 nM, uma diluição de 1/10 de uma reação PCR otimizada, usando as condições no presente documento descritas é usada) . Os moldes de transcrição de ADN preferidos são descritos a seguir (onde ARC 254 e ARC 256 transcrevem sob todas as condições 2'- OMe e ARC 255 transcreve sob as condições rRmY). ARC254 (SEQ ID NO: 99): 5 ’ CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’ ARC255 (SEQ ID NO: 100): 5 ’ <)ATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNGT AG A ACGTTCTCTCCTCTCCCT AT AGTG AGTCGTATTA-3 ’ ARC256 (SEQ ID NO: 101): 5 ’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3*
Sob as condições de transcrição de rN da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-OH adenosina trifosfatos (ATP), 2'-OH guanosina trifosfatos (GTP), 2'-OH citidina trifosfatos (CTP), e 2'-OH uridina
trifosfatos (UTP). Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição de rN da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-OH adenosina, 2'-OH guanosina, 2'-OH citidina, e 2'-OH 61 ΕΡ1850880Β1 uridina. Numa forma de realização preferida de transcrição de rN, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OH adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 8 0% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OH citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OH uridina. Numa forma de realização mais preferida da transcrição de rN, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OH adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OH citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OH uridina. Numa forma de realização ainda mais preferida de transcrição de rN, os oligonucleótidos modificados da presente invenção compreendem uma sequência onde pelo menos 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2' -OH adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2' -OH citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OH uridina.
Sob as condições de transcrição de rRmY da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-OH adenosina trifosfatos, 2'-OH guanosina trifosfatos, 2'-OH citidina trifosfatos, e 2'-OMe uridina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição rRmY da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-OH adenosina, 2'-OH guanosina, 2'-OH citidina, e 2'-OMe uridina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreende uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OH adenosina, pelo menos 62 ΕΡ1850880Β1 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OH citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OH adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OH citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde pelo menos 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OH adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OH citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina.
Sob as condições de transcrição de dRmY da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-desoxi adenosina trifosfatos, 2'-desoxi guanosina trifosfatos, 2'-0-metil citidina trifosfatos, e 2'-0-metil uridina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição dRmY da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-desoxi adenosina, 2'-desoxi guanosina, 2'-0-metil citidina, e 2'-0-metil uridina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-desoxi adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-desoxi guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2' -0-metil citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de 63 ΕΡ1850880Β1 uridina são 2'-0-metil uridina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-desoxi adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-desoxi guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-O- metil citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-0-metil uridina. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde pelo menos 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-desoxi adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-desoxi guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-0-metil citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2' -0-metil uridina.
Sob as condições de transcrição de rGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-OH guanosina trifosfatos, 2'-OMe citidina trifosfatos, 2'-OMe uridina trifosfatos, e 2'-OMe adenosina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição rGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-OH guanosina, 2'-OMe citidina, 2'-OMe uridina e 2'-OMe adenosina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo 64 ΕΡ1850880Β1 menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina.
Sob as condições de transcrição de r/mGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-OMe adenosina trifosfatos, 2'-OMe citidina trifosfatos, 2'-OMe guanosina trifosfatos, 2'-OMe uridina trifosfatos, e 2'-OH guanosina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição r/mGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-OMe adenosina, 2'-OMe citidina, 2'-OMe guanosina e 2'-OMe uridina, onde a população de nucleótidos de guanosina apresenta uma máxima de cerca de 10% de 2'-OH guanosina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados r/mGmH resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OMe guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e mais do que cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma 65 ΕΡ1850880Β1 sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e não mais de cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'- OMe adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2' -OH guanosina e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, e não mais de cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OH guanosina.
Sob as condições de transcrição de fGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-OMe adenosina trifosfatos, 2'-OMe uridina trifosfatos, 2'-F citidina trifosfatos, e 2'-OH guanosina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as condições de transcrição fGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-OMe adenosina, 2'-OMe uridina, 2'-OMe citidina, e 2'-F guanosina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-F guanosina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina, pelo menos 66 ΕΡ1850880Β1 90% de todos os nucleótidos de uridina são 2'- OMe uridina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2 '-F guanosina. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-OMe adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-F guanosina.
Sob as condições de transcrição de dAmB da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2'-desoxi adenosina trifosfatos, 2'-OMe citidina trifosfatos, 2'- OMe guanosina trifosfatos e 2'-OMe uridina trifosfatos. Os oligonucleótidos modificados produzidos usando as misturas de transcrição dAmB da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2'-desoxi adenosina, 2'-OMe citidina, 2'-OMe guanosina, e 2'-OMe uridina. Numa forma de realização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-desoxi adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OMe guanosina, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'- desoxi adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OMe guanosina, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de 67 ΕΡ1850880Β1 uridina são 2'-OMe uridina. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são 2'-desoxi adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de citidina são 2'-OMe citidina, pelo menos 100% de todos os nucleótidos de guanosina são 2'-OMe guanosina, e pelo menos 100% de todos os nucleótidos de uridina são 2'-OMe uridina.
Em cada caso, os produtos de transcrição podem então ser usados como a biblioteca no processo SELEX™ para identificar os aptâmeros e/ou determinar o motivo conservado de sequências que apresentam especificidade de ligação a um determinado alvo. As sequências resultantes já são estabilizadas, eliminando esta etapa do processo para surgir como uma sequência de aptâmero estabilizada e proporcionando um aptâmero altamente mais estabilizado em resultado. Outra vantagem do processo SELEX™ 2'-OMe é que as sequências resultantes são propensas a serem dotadas de menos nucleótidos 2'-OMe na sequência, possivelmente nenhum. Na medida em que os nucleótidos 2'-OH permanecem, os mesmos podem ser removidos ao se realizar modificações pós-SELEX™.
Como descrito a seguir, rendimentos mais baixos mas ainda úteis de transcritos que incorporam amplamente os nucleótidos 2'-substituídos podem ser obtidos sob condições diferentes das condições otimizadas acima descritas. Por exemplo, as variações das condições de transcrição acima incluem: A concentração de tampão HEPES pode variar de 0 a 1 M. A presente invenção contempla também a utilização de outros agentes de tamponamento dotados de uma pKa entre 5 e 10 incluindo, por exemplo, Tris(hidroximetil)aminometano. 68 ΕΡ1850880Β1 A concentração de DTT pode variar de 0 a 400 nM. Os métodos da presente invenção proporcionam também a utilização de outros agentes de redução incluindo, por exemplo, mercaptoetanol. A concentração de espermidina e/ou espermina pode variar de 0 mM a 20 mM. A concentração de PEG-8000 pode variar de 0 a 5% (peso em volume). Os métodos da presente invenção ainda proporcionam a utilização de polimero hidrofilico incluindo, por exemplo, outro PEG de peso molecular ou outros polialquileno glicóis. A concentração de Triton X-100 pode variar de 0 a 0,1% (peso em volume). Os métodos da presente invenção proporcionam ainda a utilização de detergentes não iónicos incluindo, por exemplo, outros detergentes diferentes dos detergentes Triton-X. A concentração de MgCl2 pode variar de 0,5 mM a 50 mM. A concentração de MnCl2 pode variar de 0,15 mM a 15 mM. Tanto MgCl como MnCl devem estar presentes dentro dos intervalos descritos e na forma de realização preferida estão presentes em cerca de uma proporção de 10 para 3 de MgCl/MnCl, preferivelmente a proporção é de cerca de 3-5:1, de forma ainda mais preferida, a proporção é de 3-4:1. A concentração de NTP 2'-OMe (cada NTP) pode variar de 5 μΜ a 5 mM. A concentração de GTP 2'-OH pode variar de 0 μΜ a 300 μΜ. A concentração de GMP 2'-OH pode variar de 0 a 5 mM. 69 ΕΡ1850880Β1 Ο ρΗ pode variar de ρΗ 6 a ρΗ 9. Os métodos da presente invenção podem ser praticados dentro do intervalo de atividade de pH da maior parte das polimerases que incorporam os nucleótidos modificados. Além disso, os métodos da presente invenção proporcionam a utilização opcional de agentes quelantes na condição de reação de transcrição incluindo, por exemplo, EDTA, EGTA, e DTT.
Os aptâmeros selecionados dotados da maior afinidade e ligação especifica como demonstrado por testes biológicos são descritos nos exemplos a seguir são terapêuticos adequados para tratar as condições nas quais a proteína complemento C5 está envolvida em patogénese.
Aptâmeros com Afinidade de Ligação à Proteína de Sistema Complemento C5
Embora o sistema complemento desempenhe um papel importante na manutenção da saúde, o mesmo é dotado do potencial de ocasionar ou contribuir para doença. Assim, é desejável se desenvolver inibidores de sistema complemento para utilização terapêutico. É particularmente desejável se desenvolver inibidores de proteína complemento C5 pelo fato de que a mesma é um complemento tanto das vias clássica como da alternativa das cascatas de ativação de complemento (Matis e Rollins (1995) Nature Medicine 1(8): 839 - 842). Assim, a inibição de C5 pode evitar os danos mediados por complemento ocasionados por qualquer uma das vias. Algumas das proteínas do sistema complemento, tal como Clq e C3, são importantes nos mecanismos de defesa normais contra os micro-organismos e na depuração de componentes imunes e de tecido danificado; entretanto, C5 é relativamente pouco importante para as ditas funções. Assim, a função de C5 pode ser iniciada por períodos de tempo curtos ou longos sem comprometer o papel de proteção do sistema complemento. 70 ΕΡ1850880Β1
Um inibidor terapêutico de C5 é também desejável pelo fato de que a inibição da clivagem de C5 evita a geração de duas atividades complemento potencialmente danosas. Primeiro, a inibição da geração de C5 a partir da clivagem de C5 elimina as atividades principais quimiotácticas e vasoativas. Segundo, a inibição da geração de C5b a partir da clivagem de C5 bloqueia o complexo citolítico de ataque de membrana C5b-9 ("MAC"). A inibição de clivagem de C5 bloqueia os efeitos tanto de C5a como de C5b em leucócitos e em tecidos tais como as células endoteliais (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149:1079).
Tanto C5a como MAC estiveram implicadas em inflamação aguda e crónica associadas à doença humana, e o papel das mesmas nos estados mórbidos foi confirmado em modelos animais. C5 é necessário para dano vascular pulmonar dependente de complemento e de neutrófilo (Ward (1997) J. Lab. Clin. Med. 129:400; Mulligan et al., (1998) J. Clin. Invest. 98:503), e está associado com ativação plaquetária e de neutrófilo em choque e em danos por queimadura (Schmid et al., (1997) Shock 8:119). MAC media danos musculares em miastenia gravis autoimune aguda (Biesecker e Gomez (1989) J. Immunol. 142:2654), rejeição de órgão em transplante (Baldwin et al., (1995) Transplantation 59:797; Brauer et al., (1995) Transplantation 59:288; Takahashi et al., (1997) Immunol. Res. 16:273), e danos renais em glomerulonefrite autoimmune (Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39:1779; Nangaku (1997) Kidney Int. 52:1570). Tanto C5a como o MAC estão implicados na isquemia do miocárdio aguda (Homeister e Lucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17), danos do SNC agudo (Bednar et al., (1997) J. Neurosurg. 86:139) e crónico (Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14:19), ativação de leucócito durante circulação extracorpórea (Sun et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23:2909; Spycher e Nydegger (1995) Infusionsther. 71 ΕΡ1850880Β1
Transfusionsmed. 22:36) e em danos a tecidos associados às doenças autoimunes incluindo artrite e lúpus (Wang et ai., (1996) Immunology 93:8563). A ativação de complemento esteve também implicada em retinopatia diabética, e pode compor ou iniciar danos da vasculatura retinal (Zhang et ai., (2002) Diabetes 51:3499). A ativação complementar constitutiva de baixo nivel normalmente ocorre no olho não diabético, evidenciado pela presença de MAC e de proteína reguladora de complemento nos olhos de ratos não diabéticos, indicando que a desregulação do complemento ocorre em pacientes diabéticos (Sohn et ai., (2000) IOVS 41:3492). Além disso, a deposição de C5b-9 foi detetada em vasos retinais de doadores humanos diabéticos onde a ausência de doadores humanos não diabéticos (Zhang et al.), a expressão reduzida de CD55 e de CD59 é mostrada em retinas diabéticas (Zhang et al.), e CD59 glicolado está presente em urina de pacientes diabéticos, mas não em pacientes não diabéticos (Acosta et al., (2002) PNAS 97, 5450 - 5455). Além disso, o sistema complemento e vascular é conhecido por ser ativado em diabetes do tipo I. Veja-se, por exemplo, Hansen, T.K. et al., Diabetes, 53: 1570 - 1576 (2004) . C5a ativa as células endoteliais por meio da interação com sistemas imune e de complemento. Veja-se, por exemplo, Albrecht, E.A. et al., Am J Pathology, 164: 849 - 859 (2004) . O sistema vascular é ativado em doenças oculares que incluem retinopatia diabética. Veja-se, por exemplo, Gert, V.B. et al., Invest Opthalmol Vis Sei, 43: 1104 - 1108 (2002). O sistema complemento é também ativado na retinopatia diabética. Veja-se, por exemplo, Gert, V.B. et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sei., 43: 1104 - 1108 (2002) e Badouin, C et al., Am. J. Opthalmol., 105:383 - 388 (1988).
Em algumas formas de realização, os materiais da 72 ΕΡ1850880Β1 presente invenção compreendem uma série de aptâmeros de ácido nucleico de cerca de 15 nucleótidos a cerca de 60 nucleótidos de comprimento os quais se ligam especificamente a proteína complemento C5 e que funcionalmente modulam, por exemplo, bloqueiam a atividade de proteína complemento C5 in vivo e/ou em ensaios à base de célula.
Os aptâmeros que são capazes de se ligar especificamente e modular a proteína complemento C5 são determinados no presente documento. Os ditos aptâmeros proporcionam baixa toxicidade, segurança e forma de realização de tratamento eficaz, melhora e/ou prevenção de uma variedade de doenças ou distúrbios relacionados com complemento, incluindo, por exemplo, distúrbios cardíacos relacionados com complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas por C5 relacionadas à cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária (CABG), ativação de neutrófilo e leucócito sistémico, maior risco de enfarte do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de complemento mediadas por C5 relacionados com intervenção coronariana percutânea), lesão por reperfusão-isquemia (por exemplo, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, ulcerações produzidas por frio), distúrbios inflamatórias relacionados com complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e distúrbios autoimunes relacionados com complemento (por exemplo, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES)). Outras indicações para as quais a inibição de C5 é desejável incluem, por exemplo, inflamação de pulmão, (Mulligan et ai. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), ativação extracorpórea de complemento (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564), ativação de complemento ativada a anticorpo (Biesecker et al. (1989) J. Immunol. 142:2654), 73 ΕΡ1850880Β1 glomerulonefrite e outras doenças renais, indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados por C5, por exemplo, retinopatia diabética, e hemoglobinúria noturna paroxística. Os ditos aptâmeros podem também ser usados em diagnóstico.
Os ditos aptâmeros podem incluir modificações como no presente documento descritas incluindo, por exemplo, a conjugação a compostos lipofílicos ou de alto peso molecular (por exemplo, PEG), a incorporação de fração de cobertura, a incorporação de nucleótidos modificados, e modificações da estrutura de fosfato.
Numa outra forma de realização da invenção, um aptâmero isolado de ocorrência não natural gue se liga à proteína complemento C5 é proporcionado. Em algumas formas de realização, o aptâmero isolado de ocorrência não natural apresenta uma constante de dissociação ("Kd") para a proteína complemento C5, de menos de 100 μΜ, menos de 1 μΜ, menos de 500 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 1 nM, menos de 500 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM. Em algumas formas de realização da invenção a constante de dissociação é determinada por titulação de dot blot como descrito no exemplo 1 a seguir.
Numa outra forma de realização, o aptâmero da presente invenção modula a função da proteína complemento C5. Numa outra forma de realização, o aptâmero da presente invenção inibe a função de C5 enguanto em outra forma de realização o aptâmero estimula a função de C5. Uma variante da proteína complemento C5 como usado no presente documento abrange as variantes gue realizam essencialmente a mesma função gue a função da proteína complemento C5. Uma variante da proteína complemento C5 preferivelmente compreende substancialmente a mesma estrutura e em algumas 74 ΕΡ1850880Β1 formas de realização compreende 80% de identidade de sequência, mais preferivelmente 90% de identidade de sequência, e de forma ainda mais preferida 95% de identidade de sequência com a sequência de amino ácido da proteína complemento C5 que compreende a sequência de amino ácido a seguir (SEQ ID NO: 102) (citada em Haviland et al., J. Immunol. 1991 Jan 1;146(1) :362-8).: X mgllgilcfl iflgktwgqe qtyvisapki frvgaseniv iqvygyteaf datisiksyp 61 dkk£syesgh vhlesenkfq nsailtiqpk qlpggqnpva yvylewskh fskskrmpit 121 ydngflfiht dkpvytpdqs vkvrvyalnd dlkpakretv lt£idpegae vdmveeidhi 191 giiafpdfki psnprygmwt ikakykedfs ttgtayfevk eyvlphfsvs iepeynfigy 241 kn£kn£eiti karyfynkw teadvyitfg iredlkddqk emmqtamqnt mlingiaqvt 301 £dsetavkel eyysledlnn kylyiavtvl estggfseea eipgikyvle pyklnlvatp 361 lflkpgipyp ikvqvkdald qlvggvpvtl naqtidvnqe tadldpskav trvddgvaaf 421 vlnlpsgvtv lefnvktdap dlpeenqare gyraiayssl sqsylyidwt dnhkallvge 481 hlnilvtpke pyidkithyn ylilskgkil hfgtrekfsd asyqsinlpv tqnmvpasrl 541 lvyyivtgeq tãelvsdsvw lnieekcgnq lqvhlspãaâ ayspgqtvsl nraatgmdswv 601 alaavdsavy gvqrgakkpl ervfqfleka dlgcgagggl nnanvfhlag ltfltnanad 661 dsqendepck eilrprrtlq kkieeiaaky khawkkccy dgacvnndet ceqraarisl 721 gprcikafte ccwasqlra nishkdmqlg rlhmktllpv skpeirsyfp eewlwevhlv 781 prrkqlqfal pdslttweiq gvglsntgic vadtvkakvf kdvflemnip yswrgeqiq 841 lkgtvynyrt sgmqfcvkms avegietses pvidhqgtks skcvrqkveg eeshlvtftv 901 Ipleiglhni nfaletwfgk eilvktlrw pegvkresys gvtldprgiy gtisrrkefp 961 yripldlvpk teikrilsvk gllvgeilaa vlaqeginil thlpkgsaea elmswpvfy 1021 vfhyletgnh wnifhsdpli ekqklkkklk egmlsimeyr nadysysvwk ggsaatwlta 1081 falrvlgqvn kyveqnqnsi cnsllwlven yqldngsfke nsqyqpiklq gtlpvearen 1141 slyltaftvi girkafdicp lvkidtalik adnfllentl paqstftlai sayalslgdk 1201 thpqfrsíva alkrealvkg npplyrfwkd nlqhkdasvp ntgtarnrvet tayalltsln 1261 lkdinyvnpv ikwlseeqry gggfyetqdt inaiegltey allvkqlrls mdidvaykhk 1321 galhnykmtd knflgrpvev llnddlivst gfgsglatvh vttwhktst seevcsfylk 1381 idtqdíeash yrgygnsdyk rlvacasykp sreeassgas havmdislpt gisaneedlk 1441 alvegvdqlf tdyqlkdghv ilqlnsipsa dflcvrfrif elfgvgflsp atftvyeyhr 1501 pdkqctmfya tsnikiqkvc egaackcvea dcgqmqeeld ltigaetrkq tackpeiaya 1561 ykvsitsitv envfvkykatlldiyktgea vaekdseitf ikkvtctnae lvkgrqylim 1621 gkealqikyn fsfryiypld sltwieywpr dttcsacqaf lanldefaed ifinge
Em algumas formas de realização da invenção, a identidade da sequência das variantes alvo é determinada usando BLAST como descrito a seguir. Os termos "identidade 75 ΕΡ1850880Β1 de sequência" no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou proteína, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou apresentam um percentual especificado de resíduos de amino ácido ou nucleótidos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para a correspondência máxima, como medido usando um dos algoritmos de comparação de sequência a seguir ou por inspeção visual. Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência à qual as sequências de teste são comparadas. Quando se um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são proporcionadas a um computador, coordenadas subsequentes são designadas se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. 0 algoritmo de comparação de sequência então calcula o percentual da identidade da sequência para a(s) sequência(s) de teste com relação à sequência de referência, com base nos parâmetros designados do programa. 0 alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de
Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa por métodos de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFAS TA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual (veja-se em geral, Ausubel et al., infra).
Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar o percentual de identidade de sequência é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (a seguir no presente documento, "BLAST"), 76 ΕΡ1850880Β1 veja-se, por exemplo, Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990) e Altschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389 - 3402 (1997) . O software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (a seguir no presente documento "NCBI")· Os parâmetros de partida usados na determinação da identidade de sequência usando o software oferecido pela NCBI, por exemplo, BLASTN (para sequências de nucleótidos) e BLASTP (para as sequências de amino ácido) são descritos em McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004).
Numa outra forma de realização da presente invenção, o aptâmero apresenta substancialmente a mesma habilidade de ligar-se à proteína complemento C5 como aquela de um aptâmero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98 é proporcionado. Numa outra forma de realização da presente invenção, os aptâmeros apresentam substancialmente a mesma estrutura e a habilidade de ligar-se à proteína complemento C5 como aquela de um aptâmero que compreende qualquer uma das: SEQ ID NOS: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98. Numa outra forma de realização, os aptâmeros da presente invenção são usados como um ingrediente ativo nas composições farmacêuticas. Numa outra forma de realização, os aptâmeros ou composições que compreendem os aptâmeros da presente invenção são usados para tratar uma variedade de doenças ou distúrbios relacionados com complemento incluindo qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em: distúrbios cardíacos relacionados com complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas por C5 relacionadas à cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária (CABG) tal como sangramento no pós-operatório, ativação de neutrófilo e leucócito sistémico, maior risco de enfarte do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de 77 ΕΡ1850880Β1 complemento mediadas por C5 relacionados com intervenção coronária percutânea), lesão por reperfusão-isquemia (por exemplo, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, ulcerações produzidas por frio), distúrbios inflamatórias relacionados com complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e distúrbios autoimunes relacionados com complemento (por exemplo, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES), inflamação de pulmão, ativação extracorpórea de complemento, ativação de complemento ativada a anticorpo e indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados por complemento, tais como, retinopatia diabética.
Numa forma de realização, os aptâmeros C5 da presente invenção incluem uma mistura de nucleótidos 2'-fluoro modificados, nucleótidos 2'-OMe modificados ("2'-0Me") e resíduos 2'- OH purina. Uma sequência genérica descritiva (SEQ ID NO: 1) para o aptâmero anti-C5 modificado é mostrada no quadro 1, e a estrutura é mostrada na Figura 3A. A grande maioria de purinas (A e G) foi modificada em 2'-OMe, excluindo apenas dois resíduos G que permaneceram 2'-OH (resíduos mostrados delineados). Os resíduos circulados representam um subconjunto de pirimidinas que pode ser simultaneamente modificado em 2Ή sem alterar substancialmente a atividade anti-C5 do aptâmero (veja-se, ARC 330 no quadro 1 a seguir (SEQ ID NO: 2, Figura 3B)). Os resíduos sublinhados mostrados na Figura 3 A representam resíduos de pirimidina que podem conter ou uma modificação 2'-fluoro ou uma 2 '-H (mas não 2'-OMe), enquanto que os resíduos em caixas representam pirimidina que podem conter uma modificação 2'-fluoro ou uma 2'-OMe (mas não 2'-H). O resíduo indicado com uma seta (^) deve conter uma modificação 2'-fluoro. Sem a modificação 2'-fluoro no resíduo indicado pela seta (^), a atividade hemolítica resultante do aptâmero resultante é substancialmente 78 ΕΡ1850880Β1 reduzida. Numa forma de realização preferida, um aptâmero anti-C5 da presente invenção compreende uma sequência de nucleótido de acordo com SEQ ID NO: 1.
Um exemplo de um aptâmero anti-C5 de acordo com a presente invenção é ARC 186 (SEQ ID NO: 4) que é mostrado na Figura 3C e descrito na Patente US N° de série 6.395.888. Todos os 21 resíduos de pirimidina de ARC 186 apresentam modificações 2'-fluoro. A maior parte das purinas (14 resíduos) apresenta modificações 2'-0Me, exceto por três resíduos purina 2'-OH (mostrado em delineado na Figura 3C). Os aptâmeros anti-C5 da presente invenção podem ainda incluir diferentes misturas de modificações 2'-fluoro e 2'-H. Por exemplo, outro aptâmero anti-C5 da presente invenção é o ARC 330 (SEQ ID NO: 2) mostrado na Figura 3B. O ARC 330 (SEQ ID NO: 2) contém sete modificações 2'-H (resíduos circulados na Figura 3B), 14 resíduos de pirimidina com modificações 2'-fluoro, 14 resíduos de purina om modificações 2'-OMe, e três resíduos purina 2'-OH (mostrados em delineado na Figura 3B).
Outras combinações de aptâmeros contendo uma mistura de modificações 2'-fluoro, modificações 2'-OMe, resíduos 2'-OH e conjugação a compostos de alto peso molecular não imunogénicos (por exemplo, PEG) de tamanho variável, cada um dos quais foi derivado de ARC 186 (SEQ ID NO: 4), são descritos no quadro 1 a seguir. A não ser que indicado o contrário, as sequências de nucleótido no quadro 1 a seguir são listadas na direção de 5' para 3' . Para cada uma das sequências individuais no quadro 1, todas as modificações purina 2'-OMe ou pirimidina são indicadas por um "m" precedendo o nucleótido correspondente; todas as modificações pirimidina 2'-fluoro são indicadas por um "f" precedendo o nucleótido 79 ΕΡ1850880Β1 correspondente; todas as modificações purina ou desoxi pirimidina são indicadas por um "d" precedendo o nucleótido correspondente; e qualquer purina ou pirimidina que apareça sem "m", "f", ou "d" precedendo o nucleótido indica um resíduo 2'-OH. Além disso, "3T" indica uma timidina desoxi invertida, "NH" indica um grupo de polietileno glicol dotado do peso molecular indicado, e "biotina" indica um aptâmero que tem biotina conjugada à extremidade 5'.
Quadro 1: SEQ ID NO: 1
XiX»fCfCrQíCXiX+íUX(X(X)X»XfX|oXiirOX«XuXwXi^wXitXwXwXa*^iXaXi>íUíí%«5C»XMXwX»if CXm
onde: X! = fC ou mC X2=rG ou mG X3=rG ou mG X4=rG ou mG x5=fc ou dC X6=fU ou dT X7 = fC ou dC X8=rA ou mA Xg—rG ou mG Xio=rG ou mG Xn=f C ou dC Xl2 = f C ou mC Xl3 = fU ou mU Xi4=rG ou mG Xl5 = rA ou mA Xl6 = rG ou mG X17=fU ou dT Xl8 = f C ou dC X19=fU ou dT X2 0=rG ou . mG ^21 = r^ ou mA X22 = rG ou mG 80 ΕΡ1850880Β1 X23=fU ou dT X24=rA ou mA X25=fC ou dC X26=fC ou dC X27=fU ou dT X28=rG ou mG X29=rG ou mG ARC330 (SEQ ID NO: 2) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
CfCfUmGfCmC ARC185 (SEQ ID NO: 3) GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUf
CGfUfC ARC186 (SEQ ID NO:4) fÇmOfCfCOÍCmOmOtUfCÍUnQtiAraQmOfCOfCÍUmGraAmOfUfCfUinOmAmGfUfUfUAfCfCfUmOfCni
0-3T ARC187 (SEQ ID NO: 5) 40kDn PEG-* KH· (CmGfCfCOíCmCuiGfUfCfyfCmAmOinOtCCÍCfUmOmAmaaifClUmGmAinOftJfUfUAfCfCftJmOrCm a-3t
Onde o PEG de 40 kDa ramificado é ,3-bis(mPEQ-[20 kDa])- propil-2-(4'-butamida) ARC188 (SEQ ID NO: 6)
AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUf UfCGfUfC ARC189 (SEQ ID NO: 7) AGfCmGfCfCGiCmGmCfUfCfUfCmAmGniGfCCfCfUmGniAmGfUfCfUmGmAtnGfUfUfUAfCfCfUmGf
CmG ARC250 (SEQ ID NO: 8) GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGGfCGfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAfCfCfUGf CG ARC296 (SEQ ID NO: 9)
fCmG fCfCGfCmGmGfUdCT dCm A m Gm GdCG fCfUmOm Am GTdCTm Gm Am GfU fU fU A dCdCfUmGfCmG -3T ARC297 (SEQ ID NO: 10)
mCmGmCÍCG flCm GmG fUd CTdCmAm Gm GdCGfÇfUm Gm Am OTdCTno Gm Am GfUfUfUAdCdC fUm GmC mG-3T ARC331 (SEQ ID NO: 11) dCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGtnAmGflJfUfUAfCfCfUmGdCm
G ARC332 (SEQ ID NO: 12) dCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf 81 ΕΡ1850880Β1
CfCfUmGfCmG ARC333 (SEQ ID NO: 13) fCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
CfCfUmGfCmG ARC334 (SEQ ID NO: 14) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
CfCfUmGdCmG ARC411 (SEQ ID NO: 15) fCmGmCfCGfCraGmOfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTraOmAmOfUfUfUAfCtCfUinGfCm
G ARC412 (SEQ ID NO: 16) fCmGfCfCGíCraGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTniGmAmGfUfUfUAfCICfUmGniCm
G ARC413 (SEQ ID NO: 17) mCmGfCiCGflCmGmGfUdCTdCtnAmGmGdCGfCfUniGntAjiiGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCm
G ARC414 (SEQ ID NO: 18)
jnCmGmCfCGfCmGmGfU dCTd Cm AmGmGdCGfCfUmGm AmG TdCTmGmAmGfUfU fU AfCfCfU mGmC mO ARC415 (SEQ ID NO: 19) f CmGf CdCGf CmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUAf
CfCfUmGfCmG ARC416 (SEQ ID NO: 20) fCmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
CfCfUmGfCmG ARC417 (SEQ ID NO: 21) fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
CfCfUmGfCmG ARC418 (SEQ ID NO: 22) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf
GfLfUmGfCmG ARC419 (SEQ ID NO: 23)
fCmCfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfC fCfUmGfCmG ARC42 0 (SEQ ID NO: 24)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfC fCfUmGfCmG ARC421 (SEQ ID NO: 25) 82
ΕΡ1850880Β1 fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAfC fCfUmGfCmG ARC422 (SEQ ID NO: 26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUTfUAfC fCfUmGfCmG ARC423 (SEQ ID NO: 27)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGI1lAmGfUfUTA
fCfCtUmGfCmG ARC424 (SEQ ID NO: 28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTAfCfC fUmGfCmG ARC425 (SEQ ID NO: 29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAf CfCTmGfCmG ARC426 (SEQ ID NO: 30) fCmGfCfCGfCmGmGmUdCTdCmAmGmGdCGfCfUrnGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCm
G ARC427 (SEQ ID NO: 31) fCniGfCniCGfCmGmG£UdCTdCmAmOmGdCGfCfUmGmAniGTdCTmGmAmGfUfUfUAflCfCfUmGfCm
G ARC428 (SEQ ID NO: 32) fCmGfCfCOmCmGtnGaJdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAniGTdCTmGnTAmGfUfUf UAfCfCfUmGfCm ARC429 (SEQ ID NO: 33) fifmGfCmCGmCmGmGfUtJCrdCraAmGmGdCGÍCfUmGmAmGTíKrraiGTirtAtBGRlfUiUAJCfCfUtiÍGfCm
G ARC430 (SEQ ID NO: 34)
íCnsGiÇfCOfCmGinGfiJdCÍUáCmAwGmGdGGtnCfUjr.GitiAmGfUdCtlJraGirtAmGfUfUífíAfCÍCfUiaGÍC
tnG ARC431 (SEQ ID NO: 35) f CmG f C f CG fCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGfCmUmGmAmGfUdC fUmGmAmGfUfUf UAfCfCfUmGfCm ARC432 (SEQ ID NO: 36)
fCmG fCfCG {CmGmGfUdCfUdCm Am GaGdCGmCmUmCtoiAniGfUdCfUmGM AmGfUfUfOACíCfUmGf CmG ARC433 (SEQ ID NO: 37)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdC TdCmAmGmGdCGfCfUmGmAni GTdCTmGmAmGmUfUfUA fCfCfUmGfCm ARC434 (SEQ ID NO: 38) 83 ΕΡ1850880Β1 PCwGfCf€GfCTr5atwCfUáCTáCmAmGmOdCOfCíUmGmAmGTáCTmGniArnOfLimUfUAfCfCft:T«GfCm <3 ARC435 (SEQ ID NO: 39) fCmGíCP3GfCmGinC5ftyCTtiCmAi;íõmG4CGfCfl.imGmAmGTâCTmGmAtí>CfL'fUmUAft';{CíUfflGíCm
G ARC436 (SEQ ID NO: 40)
fCin CfCfCG fCmGni GfOdCTdCfnAmGmGdCGfCfUmGmAinCTdCrmGmAroGraUsnGinyAíCíCfUmGft: ntO ARC437 (SEQ ID NO: 41) fCiS\G{CfCGfCiflGmGfUdCTáC^ArnGmG âCGÍCRJfnGmAmGTdCTmGmAprfflflHlífUA OCmUroCfCt»
G ARC438 (SEQ ID NO: 42)
í&nGfCíCdG^GmGfUdCTdCmAmGimGdCG^fUsiGmAmGTdCTmGroAmGRjaifUAfCjXífUmGÍCiB
G ARC439 (SEQ ID NO: 43) fCmCifCfCGfCniGmGRÍdCTáCmÀmCmGdCdGfCfUmGníAmGTdCTmGmAmGÍUnJtUArcfCfUmGCra
O ARC440 (SEQ ID NO: 44)
fCmGfCfCGf CmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfC fUmGmAmGTdC TmGmAmGfUfUfUdA fCfCfUmGfCm ARC457 (SEQ ID NO: 45)
mGfCmGfUfCGfCmGmGfUdCTdCinAniGmGdCGfCfUmGaiABiGTdCTmGmARiGrUfUfUAfCíCíGTnAPC
xnGmC ARC458 (SEQ ID NO: 46)
mGmGmGfCGíCfcGTtiGnjdCTdCiriAmGaiCMCGíCfEJmGlítiAMGTdCTmGniAníCífiJíGaiAfCCílíroCmC
raC ARC459 (SEQ ID NO: 47)
TnGfGwiGfCfCGCmGTOGfUtíCTíiCmAjwCiniGáCGfCfUiBGrnAmGTdCTmGfRAmGfUíUÍUAKaGfUmGPC
ihOiiiC ARC473 (SEQ ID NO: 48)
niGs«Gn5AfCmCífCfCGKmGrnGfUiGftJfCmAmGmGfCGfCfU*flGmAi«OfUfCaÍ!íiGmAmGíXmJaJAfCfC
fUttjGíGmGfUíCRiOT ARC522 (SEQ ID NO: 49) rnCmíGfGmGfCfCGfGmGmGfOdCTdCiTíAfflGmGcCGmCniUmGroAjxiGTdd^GniiAroGTfU^AdCdCTm
GfCmCmCjTsC ARC523 (SEQ ID NO: 50)
mGmGmCraGfCfCGfCrfiGmGfUdCTdCnxAroGííiGcíCGmCraUmaniAmGTdCTmGríiAmCmTAdCáCTwiG
dCmOmCmC ARC524 (SEQ ID NO: 51)
mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTmA
dCdCTmGdCmGmCmC ARC525 (SEQ ID NO: 52)
mGnvGTTíÇmGdCdCCkiCmGjn OTdCtrj UmGraAíBGmGdCGmCmUmGmAmGmU mCtnUniGm AmGTTTmA dÇdCTmOdCrrtGmCmC ARC532 (SEQ ID NO: 53)
Biotina- 84 ΕΡ1850880Β1 AGfC«íGfCfCGíCraOm<3fUfCfl.ifCmAimGmGfCOfCn!inOmAmGfUfCfUítiOmAm<3{XJfUftiArCfU0JtnGf
CmO ARC543 (SEQ ID NO: 54) nCimOfD««K'íCGfCmGmGfUdC1\lCníAmGmGdCGfCílIíftGfflAmGTdCTmGraAmGaJfUflJAICfCnjm
GÍCmGmCmC ARC544 (SEQ ID NO: 55)
mGii? G íCm G ^ÍCGfCm<MGfUmCn>Ui «Cm A iníJníGntCGfGíUtnGmATPiGrn UirtQnUtndmAreGfUfUFU Af GfCfGsfsGfCtnGmCmC ARC550 (SEQ ID NO: 56)
fCTOGfCfCGfCroOmGfUfGfJiCroAmQBiafCGfCmmC.mAwGfUfCrJmGínAniGfURJfUmAfCiCíljnnGfC
mOST ARC551 (SEQ ID NO: 57)
fCmGfCííXSfCniOniOfU mifC^mCimOfCGniCm UmGffiAinafU KfUfflOroAmOfU ÍU EUAfCfCfUmG EC mGAT ARC552 (SEQ ID NO: 58)
fCinGfCfCGfCmGmGfUfaTJfCtnAíiiGTtiGÍCGfCHjíiiGtuAtnGfUfCaimamAmGTfUftJAÍCPCfUmGfCtitO
-3T ARC553 (SEQ ID NO: 59) íGmafaCGfCwaíiGWfCíUfCniAmGmGtGGrtiCmUmOwArTiGtirfCaJmGmAmOflifUaJmAÈCfCmsíGf
OmG-3T ARC554 (SEQ ID NO: 60)
ÍQBGfCfOM^iOmGWfCfUfCmAj«GmGfDGmCníUmamAínGfUfCflhr(Gí«Ar(iGTfUfUniA£CfCfUinGíC
mG-3T ARC 657 (SEQ ID NO: 61) PEG de 20 kDa-NH-
CfflGfCfCGfCmGíííCflJiÇaífCmAítíGiTJGCGBCfUmOmAmGfLKCfUEnGmAntGaJfíJRiAfCfCfUmGfCm
G-JT ARC 658 (SEQ ID NO: 62) PEG de 30 kDa-NH- fCmafCfCGfGmGwGÍUfCtlJfCiiiAHiGinGfCGfCfOmGmAmGfUfCfíJmOtnAmGfJfUfUAÍCfClTJmGfCtn
GdT ARC 672 (SEQ ID NO: 63) NH2- EOnGrcffiGfCmGKiGfUfCfUfCmAmOroGrCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUaJRiÀfCfCftJmGíCm
G-3T ARC706 (SEQ ID NO: 64) PEG de 10 kDa-NH- fCwiGíCfCGíGmGmGRJfCfU&AwGTOGfCGfCfUmGfliAmGfUPCfíMGmAmGfunjíUAfCiCajmGfCni
ff-3T ARC1537 (SEQ ID NO: 65) ARC1537 (SEQ ID NO: 65) PEG de 40kDa -NH-
f&wGCfíSfC^jOmGaj^fUfQ^A^OTOPKMCnteiiGmí mOOifOFOraOmAmOíl! ÍOfU AfCÍCfUmGíCm G-3T ARC1730 (SEQ ID NO: 66) PBG20K-NH- íCmGfCfCGíCmOmGfUPDfUfCmAmGmGfCGfCAJinOmAniCfUfCfUmGmAmGfUflJfUAfCfCfUmGfCm
Q.NH-PEG20K 85 ΕΡ1850880Β1 ARC1905 (SEQ ID NO: 67) 40K CÊO-NH- -
fdnOfCfCQfCmG mQfUfCfUfCm AjnOmOfCOfCfUmQm^mO AJfCtUmQ mAtnGfUflJfU AlCfCfUmG fCm Q-3T
Onde o PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])- propil-l-carbamoilo ARC243 (SEQ ID NO: 68)
GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCfUfCGfCGAfUGfUGAGfCfCfCAGAfCGAfCf UfCGfCfC ARC244 (SEQ ID NO: 69)
GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCf CfC
Em algumas formas de realização os agentes terapêuticos à base de aptâmeros da presente invenção apresentam grande afinidade e especificidade a seus alvos e ainda reduzem os efeitos secundários prejudiciais das substituições de nucleótidos que ocorrem não naturalmente se os agentes terapêuticos à base de aptâmeros se fracionarem no corpo dos pacientes ou sujeitos. Em algumas formas de realização, as composições terapêuticas contendo os agentes terapêuticos à base de aptâmeros da presente invenção são livres ou apresentam uma quantidade reduzida de nucleótidos fluorados.
Os aptâmeros da presente invenção podem ser sintetizados usando quaisquer sínteses de nucleótidos conhecidas na técnica incluindo a síntese de nucleótido de fase sólida bem conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, Froehler et ai., Nucl. Acid Res. 14:5399 - 5467 (1986) e Froehler et ai., Tet. Lett. 27:5575 - 5578 (1986)) e métodos de solução de fase tais como os métodos de síntese de triéster (veja-se, por exemplo, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al., Tet. Lett., 86 ΕΡ1850880Β1 28:2449 (1978)). Composições Farmacêuticas A presente invenção inclui também composições que contêm moléculas de aptâmero que se ligam a proteína complemento C5. Em algumas formas de realização, as composições são adequadas para utilização interno e incluem uma quantidade eficaz de um composto farmacologicamente ativo da invenção, isolado ou em combinação, com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos são especialmente úteis em que os mesmos apresentam toxicidade muito baixa se houver alguma.
As composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir uma patologia, tal como uma doença ou desordem, ou aliviar os sintomas das ditas doenças ou distúrbios num paciente. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir as patologias associadas a distúrbios cardíacos relacionados com complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas por C5 relacionadas à cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária (CABG) tal como sangramento no pós-operatório, ativação de neutrófilo e leucócito sistémico, maior risco de enfarte do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de complemento mediadas por C5 relacionados com intervenção coronária percutânea), lesão por reperfusão-isquemia (por exemplo, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, ulcerações produzidas por frio), distúrbios inflamatórias relacionados com complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e distúrbios autoimunes relacionados com complemento (por exemplo, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (LES ou 87 ΕΡ1850880Β1 lúpus), inflamação de pulmão, ativação extracorpórea de complemento, ativação de complemento ativada a anticorpo e indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados por complemento, tais como, retinopatia diabética. As composições da presente invenção úteis para a administração a um sujeito que sofre, ou está predisposto a uma doença ou desordem que está relacionada ou derivada a partir de proteína complemento C5 à qual os aptâmeros da presente invenção se ligam especificamente.
As composições da presente invenção podem ser usadas num método para o tratamento de um paciente ou indivíduo que tem uma patologia. Os métodos da presente invenção envolvem a administração ao paciente ou indivíduo de um aptâmero ou uma composição que compreende aptâmeros que se ligam a uma proteína complemento C5, de modo que a ligação do aptâmero a uma proteína complemento C5 altera a sua função biológica, desta forma tratando a patologia. 0 paciente ou indivíduo que tem uma patologia, isto é, o paciente ou indivíduo tratado pelos métodos da presente invenção pode ser um vertebrado, mais particularmente um mamífero, ou mais particularmente um ser humano.
Na prática, os aptâmeros ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são administrados em quantidades as quais serão suficientes para exercer a sua atividade biológica desejada, por exemplo, inibição da ligação do alvo aptâmero ao seu recetor, evitando a clivagem de uma proteína alvo.
Um aspeto da presente invenção compreende uma composição de aptâmero da presente invenção em combinação, com outros tratamentos para os distúrbios mediadas por complemento C5. A composição de aptâmero da presente 88 ΕΡ1850880Β1 invenção pode conter, por exemplo, mais de um aptâmero. Em alguns exemplos, uma composição de aptâmero da invenção, contendo um ou mais compostos da invenção é administrada em combinação com outra composição útil tal como um agente anti-inflamatório, um imunosupressor, um agente antiviral, ou similares. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser administrados em combinação com um agente citotóxico, citostático ou guimioterápico tal como um agente alquilante, antimetabólito, inibidor mitótico ou antibiótico citotóxico, como descrito acima. Em geral, as formas farmacêuticas atualmente disponíveis dos agentes terapêuticos conhecidos para utilização nas ditas combinações serão adequadas. "Terapêutica de combinação" (ou "co-terapêutica") inclui a administração de uma composição de aptâmero da presente invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico pretendido proporcionar o efeito benéfico a partir da co-ação dos ditos agentes terapêuticos. 0 efeito benéfico da combinação inclui, mas não é limitado a, co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração dos ditos agentes terapêuticos tipicamente em combinação é realizada por um período de tempo definido (em geral, minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada). A "terapêutica de combinação" pode, mas em geral não, abrange a administração de dois ou mais agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separados que incidental e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. A "terapêutica de combinação" pretende englobar a administração dos ditos agentes terapêuticos num modo sequencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado num momento diferente, assim 89 ΕΡ1850880Β1 como a administração dos ditos agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, num modo substancialmente simultâneo. A administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, ao se administrar ao sujeito uma única cápsula que tem uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas simples para cada um dos agentes terapêuticos. A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas não são limitados a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, e absorção direta através de tecidos de membrana mucosa. Por exemplo, o primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção e ainda outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados por via tópica.
Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados tipicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é fundamental a não ser que indicado o contrário. A "terapêutica de combinação" pode ainda englobar a administração dos agentes terapêuticos como acima descrito em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapêutica de combinação adicionalmente compreende um tratamento não fármaco, o tratamento não fármaco pode ser conduzido em qualquer ocasião desejável, desde que o efeito benéfico da co-ação de combinação de agentes terapêuticos e tratamento de não fármaco seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento não fármaco é temporariamente removido da 90 ΕΡ1850880Β1 administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.
As composições terapêuticas ou farmacológicas da presente invenção em geral compreenderão uma quantidade eficaz do(s) componente(s) ativo(s) de terapêutica, dissolvido ou disperso num meio farmaceuticamente aceitável. 0 meio ou veículo farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotónicos e agentes de retardo de absorção e similares. A utilização do dito meio e agentes de substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecida na técnica. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições terapêuticas da presente invenção. A preparação das composições farmacêuticas ou farmacológicas será conhecida daqueles peritos na especialidade na luz da presente descrição. Tipicamente, as ditas composições podem ser preparadas como injetáveis, seja como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para soluções, ou suspensões em líquido antes de injeção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de libertação de tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo gotas oculares, loções, pomadas, inalantes e similares. A utilização de formulações estéreis, tais como enxagúes com base em salina, por cirurgiões, médicos e profissionais de cuidados da saúde para tratar áreas particulares no campo cirúrgico podem ser particularmente úteis. As composições podem também ser enviadas por micro dispositivos, micropartícuias ou esponjas.
De acordo com a formulação, os agentes terapêuticos 91 ΕΡ1850880Β1 serão administrados de uma forma compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade que seja farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de libertação de fármacos e similares podem também ser utilizadas.
Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume da composição a ser administrada depende do animal hospedeiro a ser tratado. Quantidades precisas de composto ativo necessárias para a administração dependem do julgamento do técnico e são peculiares a cada indivíduo.
Um volume mínimo de uma composição necessária para dispersar os compostos ativos é tipicamente utilizado. Regimes adequados para a administração são também variáveis, mas podem ser tipificados ao se administrar inicialmente os compostos e monitorar os resultados e então ministrando doses adicionais controladas em intervalos adicionais.
Por exemplo, par a administração oral na forma de comprimido ou cápsula (por exemplo, cápsula de gelatina), o componente de fármaco ativo pode ser combinado com um veículo oral, farmaceuticamente aceitável, não tóxico e inerte tal como etanol, glicerol, água e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, ligantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes colorantes adequados podem também ser incorporados na mistura. Os ligantes adequados incluem amido, silicato de alumínio magnésio, pasta de amido, gelatina, celulose de metilo, carboximetil celulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares naturais tais como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como 92 ΕΡ1850880Β1 acácia, tragacanto, ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras e similares. Os lubrificantes usados nas ditas formas farmacêuticas incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicol e similares. Os desintegradores incluem, sem limitação, amido, celulose de metilo, agar, bentonita, amidos de goma xantano, agar, ácido algínico ou os sais dos mesmos, ou misturas efervescentes, e similares. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sucrose, manitol, sorbitol e celulose e/ou glicina.
As composições injetáveis são preferivelmente soluções aquosas isotónicas ou suspensões, e supositórios são preferidos com vantagem a partir das emulsões graxas ou suspensões. As composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como conservantes, estabilizantes, humectantes ou agentes emulsificantes, promotores de solução, sais para regular pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, os mesmos podem ainda conter outras substâncias terapêuticas valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou de revestimento convencionais, respetivamente, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferivelmente cerca de 1% a 50% do ingrediente ativo.
Os compostos da presente invenção podem também ser administrados nas ditas formas farmacêuticas oral como comprimidos ou cápsulas de libertação controlada e sustentada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Líquidos, em particular as composições injetáveis podem, por exemplo, ser preparados por dissolução, 93 ΕΡ1850880Β1 dispersão, etc. 0 composto ativo é dissolvido ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e similares, para deste modo formar a solução ou suspensão injetável. Além disso, formas sólidas adequadas para a dissolução em liquido antes da injeção podem ser formuladas.
Os compostos da presente invenção podem ser administrados na forma intravenosa (tanto em bolus como por infusão), intraperitonial, subcutânea ou intramuscular, todas as quais utilizando as formas bem conhecidas daqueles peritos na especialidade farmacêutica. Os injetáveis podem ser preparados de formas convencionais, seja em soluções liquidas ou em suspensões. A administração injetável parentérica é em geral usada para as injeções e infusões subcutâneas, intramuscular ou intravenosa. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parentérica emprega a implantação de sistemas de libertação lenta ou de libertação sustentada, que garante que um nível constante de dosagem seja mantido, de acordo com a Patente US N° 3.710.795.
Ainda, os compostos preferidos para a presente invenção podem ser administrados na forma intranasal por utilização tópico de veículos, intranasais, inalantes ou por meio de vias transdérmicas, usando as ditas formas de adesivos de pele transdérmicos bem conhecidos daqueles peritos na especialidade. Para ser administrada na forma de um sistema de envio transdérmico, a administração de dosagem, evidentemente, será contínuo em vez de intermitente através do regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, unguentos, loções, aerossol, sprays e géis, onde a concentração do 94 ΕΡ1850880Β1 ingrediente ativo será tipicamente no intervalo de 0,01% a 15% p/p ou p/v.
Para composições sólidas, os excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sucrose, carbonato de magnésio, e similares podem ser usados. O composto ativo acima definido pode também ser formulado como supositórios usando, por exemplo, polialguileno glicóis, por exemplo, propileno glicol, como o veiculo. Em algumas formas de realização, supositórios são preparados com vantagem a partir de emulsões graxas ou suspensões.
Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de envio lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas formas de realização, uma película de componentes lipídicos é hidratada com uma solução aquosa de fármaco para formar uma camada lipídica que encapsula o fármaco, como descrito na Patente US N° 5.262.564. Por exemplo, as moléculas de aptâmero no presente documento descritas podem ser proporcionadas como um complexo com um composto lipofílico ou não imunogénico, composto de alto peso molecular construído usando os métodos conhecidos na técnica. Um exemplo dos complexos de ácido nucleico associado é proporcionado na Patente US N° 6.011.020.
Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados a polímeros solúveis como veículos de fármaco direcionáveis. Os ditos polímeros podem incluir 95 ΕΡ1850880Β1 polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamidafenol, polihidroxietilaspanamidafenol, ou polietilenoóxidopolilisina substituída com resíduos de palmitoil. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados à classe de polímeros biodegradáveis úteis em alcançar a libertação controlada do fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidiidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.
Se for desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode também conter quantidades menores de substâncias não tóxicas auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substâncias tais como, por exemplo, acetato de sódio, e oleato de trietanolamina. 0 regime de dosagem que utiliza os aptâmeros é selecionado de acordo com uma variedade de fatores que incluem o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e a condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratadas; a via de administração. A função renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular ou sal do mesmo utilizado. Um médico ou veterinário versado na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da fármaco necessária para evitar, combater ou interromper o progresso da condição.
As dosagens orais da presente invenção, quando usadas para os efeitos indicados, estarão no intervalo de cerca de 0,05 mg/dia a 7500 mg/dia oralmente. As composições são preferivelmente proporcionadas na forma de comprimidos marcados contendo 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 96 ΕΡ1850880Β1 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 e 1000,0 mg do ingrediente ativo. Os compostos da presente invenção podem ser administrados numa dose diária única, ou a dose diária total pode ser administrada em doses divididas de duas, três ou quatro vezes ao dia.
As dosagens infundidas, dosagens intranasais e as dosagens transdérmicas estarão variando entre 0,05 mg/dia a 7500 mg/dia. As dosagens subcutâneas, intravenosas e intraperineais estarão variando entre 0,05 mg/dia a 3800 mg/dia.
Niveis plasmáticos eficazes dos compostos da presente invenção variam de 0,002 mg/ml a 50 mg/ml.
Modulação da farmacocinética e biodistribuição dos agentes terapêuticos à base de aptâmeros E importante que as propriedades farmacocinéticas para todos os terapêuticos com base em oligonucleótido, incluindo aptâmeros, sejam confecionados de modo a corresponder à aplicação farmacêutica desejada. Embora os aptâmeros direcionados contra os alvos extracelulares não sofram de dificuldades associadas ao envio intracelular (como é o caso com os terapêuticos com base em ARNi e antissense) , os ditos aptâmeros devem ainda ser capazes de serem distribuídos a órgãos e tecidos alvo, e permanecer no corpo (não modificado) por um período de tempo consistente com o regime de dosagem desejado.
Assim, a presente invenção proporciona materiais e métodos para afetar as farmacocinéticas das composições de aptâmeros, e em particular, a habilidade de sintonizar as farmacocinéticas de aptâmero. A capacidade de sintonia (isto é, a capacidade de modular) as f armacocinéticas de 97 ΕΡ1850880Β1 aptâmero é alcançada através da conjugação de frações de modificação (por exemplo, polímeros PEG) ao aptâmero e/ou a incorporação de nucleótidos modificados (por exemplo, 2'-fluoro ou 2'-0Me) para alterar a composição química do ácido nucleico. A habilidade de modular a farmacocinética do aptâmero é usada no aprimoramento das aplicações terapêuticas existentes, ou alternativamente, no desenvolvimento de novas aplicações terapêuticas. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, por exemplo, em antineoplásicas ou instalações de cuidados intensivos onde pode ser desejado uma rápida depuração ou desligamento de fármaco, é desejável se reduzir o tempo de residência dos aptâmeros na circulação. Alternativamente, em outras aplicações terapêuticas, por exemplo, terapias de manutenção, onde a circulação sistémica de um terapêutico é desejada, pode ser desejável se aumentar os tempos de residência dos aptâmeros na circulação.
Além disso, a capacidade de modulação da farmacocinética de um aptâmero é usada para modificar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico num sujeito. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, pode ser desejável se alterar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico num esforço de se alcançar um tipo particular de tecido ou um órgão especifico (ou um conjunto de órgãos). Nas ditas aplicações, o aptâmero terapêutico preferivelmente se acumula num tecido ou órgão (s) especifico. Em outras aplicações terapêuticas, pode ser desejável se alcançar tecidos que exibam um marcador celular ou um sintoma associado a uma determinada doença, dano celular ou outra patologia anormal, de modo que o aptâmero terapêutico preferivelmente se acumule no tecido afetado. Por exemplo, como descrito no documento US 2006/0030535 AI intitulado "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer 98 ΕΡ1850880Β1
Therapeutics)", a PEGilação de um aptâmero terapêutico (por exemplo, PEGilação com um polímero PEG de 20 kDa) é usada para alcançar tecidos inflamados, de modo que o aptâmero terapêutico PEGilado preferivelmente se acumula no tecido inflamado.
Para se determinar os perfis de farmacocinética e biodistribuição dos agentes terapêuticos à base de aptâmeros' (por exemplo, aptâmeros conjugados ou aptâmeros dotados de químicas alternadas, tais como nucleótidos modificados) uma variedade de parâmetros são modificados. Os ditos parâmetros incluem, por exemplo, a semivida (11/2), a depuração plasmática (Cl), o volume de distribuição (Vss), a área sob a curva de concentração - tempo (AUC), a concentração máxima observada de soro ou plasma (Cmax) , e o tempo médio de residência (MRT) de uma composição de aptâmero. Como usado no presente documento, o termo "AUC" refere-se a área sob o gráfico de concentração plasmática do aptâmero terapêutico com relação ao tempo após a administração de aptâmero. 0 valor AUC é usado para estimar a biodisponibilídade (isto é, o percentual de aptâmero terapêutico administrado na circulação após a administração do aptâmero) e/ou a depuração total (Cl) (isto é, o coeficiente no qual o aptâmero terapêutico é removido da circulação) de um aptâmero terapêutico determinado. 0 volume de distribuição refere-se à concentração plasmática de um aptâmero terapêutico com relação à quantidade de aptâmero presente no corpo. Quanto maior o VSS, mais aptâmero é encontrado fora do plasma (isto é, maior o extravasamento). A presente invenção proporciona materiais e métodos para modular, de modo controlado, as farmacocinéticas e a biodistribuição das composições de aptâmero estabilizadas in vivo por conjugação de um aptâmero a uma fração de 99 ΕΡ1850880Β1 modulação tal como uma pequena molécula, péptido, ou grupo polímero terminal, ou pela incorporação de nucleótidos modificados no aptâmero. Como no presente documento descrito, a conjugação de uma fração modificada e/ou alterar nucleótidos da composição química se altera os aspetos fundamentais do tempo de residência na circulação e distribuição aos tecidos.
Além da depuração realizada pelas nucleases, os oligonucleótidos agentes terapêuticos são submetidos a eliminação por meio de filtragem renal. Como tal, o oligonucleótido resistente a nuclease administrado por via intravenosa tipicamente exibe uma semivida in vivo de < 10 minutos, a não ser que a filtragem possa ser bloqueada. Isto pode ser realizado seja pela facilitação da rápida distribuição fora da corrente sanguínea e dentro dos tecidos ou pelo aumento do peso molecular aparente do oligonucleótido acima do corte de tamanho eficaz para o glomérulo. A conjugação de pequenos terapêuticos a um polímero PEG (PEGilação), a seguir descrita, pode aumentar dramaticamente o tempo de residência dos aptâmeros na circulação, desta forma aumentando a frequência de dosagem e aumentando a eficácia contra os alvos vasculares.
Os aptâmeros podem ser conjugados a uma variedade de frações modificadoras, tais como polímeros de alto peso molecular, por exemplo, péptidos PEG, por exemplo, Tat (um fragmento de 13 amino ácidos da proteína Tat do HIV (Vives, et al. (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant (uma sequencia de 16 aminoácidos derivada da terceira hélice da proteína homeótica da Drosophila antennapedia (Pietersz, et al. (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) e Arg7 (um péptido de permeação celular, curto e positivamente carregado composto de poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al. (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J. et al. 100 ΕΡ1850880Β1 (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); e moléculas pequenas, por exemplo, compostos lipofílicos tais como colesterol. Dentre os diversos conjugados no presente documento descritos, as propriedades in vivo dos aptâmeros são alternadas mais profundamente por formação de complexos de com os grupos PEG. Por exemplo, a formação de complexos de com um aptâmero terapêutico modificado 2'-F e 2'-OMe com um polímero PEG de 20 kDa impede a filtragem renal e promove a distribuição tanto de tecidos, saudáveis como de inflamados. Além disso, o conjugado de polímero PEG de 20 kDa - aptâmero provou ser quase tão eficaz quanto o polímero PEG de 40 kDa na prevenção da filtragem renal de aptâmeros. Embora um efeito da PEGilação seja na depuração de aptâmero, a exposição sistémica prolongada proporcionada pela presença da fração 20 kDa também facilitou a distribuição dos aptâmeros nos tecidos, em particular aqueles de órgãos altamente infundidos e aqueles no campo da inflamação. 0 conjugado de aptâmero - polímero PEG de 20 kDa direciona a distribuição de aptâmero ao campo da inflamação, de modo que o aptâmero PEGilado preferivelmente se acumula no tecido inflamado. Em alguns casos, o conjugado de aptâmero - polímero PEG de 20 kDa é capaz de aceder o interior das células, tais como por exemplo, as células renais.
Em geral, os efeitos nas farmacocinéticas do aptâmero e na distribuição no tecido produzidos pelas frações de modificação de alto peso molecular, incluindo colesterol e péptidos de permeação celular, são menos pronunciados do que aqueles produzidas em resultado de PEGilação ou modificação de nucleótidos (por exemplo, uma composição química alternada). Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é sugerido que as associações mediadas por colesterol com lipoproteínas plasmáticas, postuladas ocorrer no caso de um conjugado antissense, são evitados no 101 ΕΡ1850880Β1 contexto particular da estrutura dobrada conjugada de colesterol - aptâmero, e/ou refere-se ao aspeto da natureza lipofílico do grupo colesterol. Da mesma forma gue o colesterol, a presença de uma marcação de péptido Tat promove a depuração do aptâmero da corrente sanguínea, com níveis comparativamente altos de conjugado aparecendo nos rins em 48 horas. Outros péptidos (por exemplo, Ant, Arg7) gue foram reportados na técnica por mediar a passagem de macromoléculas através das membranas celulares in vitro, não aparecem para promover a depuração de aptâmero na circulação. Entretanto, da mesma forma gue Tat, o conjugado Ant se acumula significativamente nos rins com relação a outros parâmetros. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é possível gue a apresentação desfavorável das frações de modificação de péptido Ant e Arg7 no contexto dos aptâmeros dobrados tridimensionalmente in vivo, prejudiquem a capacidade dos ditos péptidos de influenciar as propriedades de transporte do aptâmero.
Os nucleótidos modificados podem também ser usados para modular a depuração plasmática dos aptâmeros. Por exemplo, um aptâmero não conjugado que incorpora tanto as químicas de estabilização 2'-F e 2'-0Me, que são típicas da geração de aptâmeros atuais na medida em que os mesmos exibem um alto grau de estabilidade de nuclease in vitro e in vivo, exibe rápida perda a partir do plasma (isto é, rápida depuração plasmática) e uma rápida distribuição nos tecidos, principalmente nos rins, quando em comparação ao aptâmero não modificado.
Ácidos Nucleicos Derivatizados de PEG
Como nucleicos molecular acima descrito, a derivatização de ácidos com polímeros não imunogénicos de alto peso apresenta o potencial de alterar as propriedades 102 ΕΡ1850880Β1 farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos ácidos nucleicos tornando-os mais agentes terapêuticos mais eficazes. Mudanças favoráveis na atividade podem incluir maior resistência à degradação por nucleases, reduzida filtragem através dos rins, reduzida exposição ao sistema imune, e distribuição alterada do terapêutico através do corpo.
As composições de aptâmero da presente invenção podem ser derivadas com frações de polialquileno glicol ("PAG"). Exemplos de ácidos nucleicos PAG derivados são encontrados no documento US 2004/0180360 AI. Polímeros típicos usados na presente invenção incluem poli(etileno glicol) ("PEG"), também conhecido como poli(óxido etileno) ("PEO") e polipropileno glicol (incluindo poli isopropileno glicol). Além disso, copolímeros de bloco ou aleatórios de diferentes óxidos de alquileno (por exemplo, óxido de etileno e óxido de propileno) podem ser usados em diversas aplicações. Em sua forma mais comum, um polialquileno glicol, tal como PEG, é um polímero linear terminado em cada extremidade com grupos hidroxilo: H0-CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2-OH. Este polímero, alfa-, omega-diidroxilpoli(etileno glicol), pode também ser representado como HO-PEG-OH, onde é entendido que o símbolo —PEG-representa a unidade estrutural a seguir: -CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2- onde n tipicamente varia de cerca de 4 a cerca de 10.000.
Como mostrado, a molécula PEG é difuncional e é algumas vezes dita como "PEG diol". As porções terminais da molécula PEG são frações hidroxilo relativamente não reativas, os grupos -OH, que podem ser ativados, ou convertidos em frações funcionais, para a fixação do PEG a outros compostos como campos reativos no composto. Os ditos PEG dióis ativados são ditos no presente documento como PEGs bi-ativados. Por exemplo, as frações terminais de PEG 103 ΕΡ1850880Β1 diol foram funcionalizadas como éster carbonato ativo para a reação seletiva com frações amino pela substituição das frações hidroxilo relativamente não reativas, -OH, com as frações éster succinimidilo ativas a partir da N- hidroxi succinimida.
Em muitas aplicações, é desejável se cobrir a molécula PEG numa extremidade com uma fração essencialmente não reativa de modo que a molécula PEG seja monofuncional (ou monoativada) . No caso de terapêuticos de proteína que em geral exibem múltiplos campos de reação para os PEGs ativados, os PEGs ativados bi-funcionais levam a uma extensa reticulação, produzindo agregados pobremente funcionais. Para se gerar PGs monoativados, uma fração hidroxilo na terminação na terminação da molécula PEG diol tipicamente é substituída com uma fração de extremidade metoxi não reativa, -OCH3. A outra, uma terminação não coberta da molécula PEG, tipicamente é convertida numa fração de extremidade reativa que pode ser ativada para a fixação ao campo reativo na superfície ou uma molécula tal como uma proteína. PAGs são polímeros que tipicamente apresentam as propriedades de solubilidade em água e em muitos solventes orgânicos, faltam de toxicidade, e faltam de imunogenicidade. Uma utilização de PAG é de ligar-se covalentemente ao polímero em moléculas insolúveis para produzir a molécula PAG resultante "conjugada" solúvel. Por exemplo, observou-se que a fármaco insolúvel em água paclitaxel, quando acoplada a PEG, torna-se solúvel em água. Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60:331 - 336 (1995). Os conjugados de PAG são com frequência usados não só para aumentar a solubilidade e a estabilidade mas também para prolongar a semivida das moléculas na circulação sanguínea. 104 ΕΡ1850880Β1
Os compostos polialquilados da presente invenção são tipicamente entre 5 kDa e 80 kDa de tamanho, entretanto, qualquer tamanho pode ser usado, a escolha dependendo do aptâmero e da aplicação. Outros compostos PAG da presente invenção estão entre 10 kD e 80 kD de tamanho. Ainda outros compostos PAG da presente invenção estão entre 10 kD e 60 kD de tamanho. Por exemplo, um polímero PAG pode ser de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho. Os ditos polímeros podem ser lineares ou ramificados.
Diferente dos agentes terapêuticos proteicos biologicamente expressos, os terapêuticos de ácido nucleico são tipicamente quimicamente sintetizados a partir de nucleótidos de monómero ativados. Os conjugados de PEG -ácido nucleico podem ser preparados ao se incorporar o PEG usando a mesma síntese iterativa de monómero. Por exemplo, os PEGs ativados por conversão a uma forma fosforoamidita podem ser incorporados na síntese de oligonucleótido de fase sólida. Alternativamente, a síntese de oligonucleótido pode ser completada com a incorporação específica de campo de um campo de fixação PEG reativo. Mais comummente, isto foi realizado pela adição de uma amina de fase primária na terminação 5' (incorporada usando uma fosforoamidita modificada na etapa de acoplamento da síntese de fase sólida) . Usando a dita abordagem, um PEG reativo (por exemplo, um que é ativado de modo que irá reagir e formar uma ligação com uma amina) é combinado com o oligonucleótido purificado e a reação de acoplamento é realizada em solução. Em algumas formas de realização, os polímeros são moléculas PEG ramificadas. Ainda em ouras formas de realização, os polímeros são PEG ramificado de 40 kDa, veja-se, por exemplo, (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) ilustrado na Figura 4. em algumas formas de realização, o PEG ramificado de 40 kDa (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) é fixado na extremidade 5' do 105 ΕΡ1850880Β1 aptâmero como ilustrado na Figura 5. A habilidade da conjugação PEG em alterar a biodistribuição de um agente terapêutico está relacionada a uma série de fatores incluindo o tamanho do aptâmero (por exemplo, como medido em termos de raio hidrodinâmico) do conjugado. Conjugados maiores (> 10 kDa) são conhecidos para bloquear de modo mais eficaz a filtragem por meio do rim e de consequentemente aumentar a semivida de pequenas macromoléculas no soro (por exemplo, péptidos, oligonucleótidos antissense). A habilidade de conjugados PEG bloquear a filtragem foi mostrada aumentar com o tamanho do PEG até aproximadamente 50 kDa (aumentos adicionais apresentam efeito benéfico mínimo na medida em que a semivida se torna definida pelo metabolismo mediado a macrófago em vez de pela eliminação pelos rins). A produção de PEGs de alto peso molecular (> 10 kDa) pode ser difícil, ineficaz, e antieconómica. Como uma via na direção da síntese de conjugados de PEG de alto peso molecular - ácido nucleico, o trabalho anterior esteve focalizado na geração de PEGs ativados de maior peso molecular. Um método de gerar as ditas moléculas envolve a formação de PEG ativado ramificado nas quais dois ou mais PEGs são fixados ao núcleo central portando o grupo ativado. As porções terminais das ditas moléculas PEG de maior peso molecular, isto é, frações hidroxilo (-OH) relativamente não reativas, podem ser ativadas, ou convertidas em frações funcionais, para a fixação de um ou mais dos PEGs a outros compostos em campos reativos no composto. PEGs ativados ramificados apresentam mais de duas terminações, e nos casos onde as duas ou mais terminações foram ativadas, as ditas moléculas PEG de maior peso molecular ativadas são ditas no presente documento como, PEGs multi-ativados. Em alguns casos, nem todas as 106 ΕΡ1850880Β1 ramificações na molécula PEG ramificada são ativadas. Em casos onde quaisquer duas terminações na molécula PEG ramificada são ativadas, as ditas moléculas PEG são ditas como PEGs bi-ativados. Em alquns casos onde apenas duas terminações na molécula PEG ramificada é ativada, as ditas moléculas PEG são ditas como momoativadas. Como um exemplo da dita abordagem, a PEG ativada preparada pela fixa,ção de dois PEGs monometoxi a um núcleo de lisina é subsequentemente ativado para reação foi descrita (Harris et ai., Nature, vol. 2: 214 - 221, 2003). A presente invenção proporciona outra via económica de síntese de conjugados PEG de alto peso molecular - ácido nucleico (preferivelmente, aptâmero) incluindo ácidos nucleicos PEGilados aumentados. A presente invenção abrange também os oligonucleótidos multiméricos ligados a PEG, por exemplo, aptâmeros dimerizados. A presente invenção também refere-se a composições de alto peso molecular onde a fração de estabilização de PEG é um ligante que separa as diferentes porções de um aptâmero, por exemplo, o PEG é conjugado dentro de uma única sequência de aptâmero, de modo que a disposição linear da composição de aptâmero de alto peso molecular, por exemplo, é ácido nucleico - PEG -ácido nucleico (- PEG - ácido nucleico)n onde n é superior ou igual a 1.
As composições de alto peso molecular da presente invenção incluem aquelas dotadas de um peso molecular de pelo menos 10 kD. As composições tipicamente apresentam um peso molecular entre 10 kD e 80 kD de tamanho. As composições de alto peso molecular da presente invenção são de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho. A fração de estabilização é uma molécula, ou uma porção de molécula, que aprimora as propriedades 107 ΕΡ1850880Β1 farmacocinéticas e farmacodinâmicas das composições de aptâmero de alto peso molecular da presente invenção. Em alguns casos, a fração de estabilização é uma molécula ou porção de molécula que traz dois ou mais aptâmeros, ou domínios de aptâmeros, nas proximidades, ou proporciona redução da liberdade rotacional das composições de aptâmero de alto peso molecular da presente invenção. Uma fração de estabilização pode ser polialquileno glicol, tal como polietileno glicol, que pode ser linear ou ramificado, um homopolímero ou um heteropolímero. Outras frações de estabilização incluem polímeros tais como ácidos péptido nucleicos (PNA). Os oligonucleótidos podem também ser frações de estabilização; os ditos oligonucleótidos podem incluir nucleótidos modificados, e/ou ligações modificadas, tais como fosforotioatos. Uma fração de estabilização pode ser uma parte integral de uma composição de aptâmero, isto é, a mesma é covalentemente ligada ao aptâmero.
As composições da presente invenção podem incluir composições de aptâmero de alto peso molecular nas quais duas ou mais frações de ácido nucleico são covalentemente conjugadas a pelo menos uma fração de polialquileno glicol. As frações de polialquileno glicol servem como frações de estabilização. Nas composições onde uma fração de polialquileno glicol é covalentemente ligada em qualquer uma das extremidades a um aptâmero, de modo que o polialquileno glicol se une às frações de ácido nucleico junto numa molécula, o polialquileno glicol é dito ser uma fração de ligação. Nas ditas composições, a estrutura primária da molécula covalente inclui a disposição linear de ácido nucleico - PAG - ácido nucleico. Um exemplo é a composição que tem uma estrutura primária de ácido nucleico - PEG - ácido nucleico. Outro exemplo é uma disposição linear de ácido nucleico - PEG - ácido nucleico - PEG -ácido nucleico. 108 ΕΡ1850880Β1
Para produzir o conjugado ácido nucleico - PEG - ácido nucleico, o ácido nucleico é originalmente sintetizado de modo que o mesmo apoia um único campo reativo (por exemplo, é mono-ativado). Numa forma de realização preferida, o dito campo reativo é um grupo amino introduzido na terminação-5' pela adição de uma fosforoamidita modificada como a ultima etapa na síntese de fase sólida do oligonucleótido. Em seguida da desproteção e da purificação do oligonucleótido modificado, o mesmo é reconstituído em alta concentração numa solução que minimiza a hidrólise espontânea de PEG ativado. Numa forma de realização preferida, a concentração do oligonucleót ido é de 1 mM e a solução reconstituída contém 200 mM de tampão de NaHC03, pH 8,3. A síntese do conjugado é iniciada pela lenta adição em etapas de PEG bifuncional altamente purificado. Numa forma de realização preferida, o PEG diol é ativado em ambas as extremidades (biativado) pela derivatização com propionato de succinimidilo. Em seguida à reação, o conjugado EPG - ácido nucleico é purificado por eletroforese de gel ou cromatografia líquida para separar espécies completas, parciais, e não conjugadas. As múltiplas moléculas PAG concatenadas (por exemplo, como os copolímeros de bloco ou aleatórios) ou cadeias PAG menores podem ser ligadas para alcançar os diversos comprimentos (ou pesos moleculares). Ligantes não PAG podem ser usados entre as cadeias PAG de comprimentos variáveis. 0 2'-0Me, 2'-fluoro e outras modificações de nucleótidos modificados estabilizam o aptâmero contra nucleases e aumentam a sua semivida in vivo. A cobertura 3'-3'-dT também aumenta a resistência a exonuclease. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 5.674.685; 5.668.264; 6.207.816; e 6.229.002. 109 ΕΡ1850880Β1
Derivatização de PAG de um ácido nucleico reativo
Os conjugados de PAG - ácido nucleico - PAG de alto peso molecular podem ser preparados pela reação de um PEG monofuncional ativado com um ácido nucleico contendo mais de um campo reativo. Numa forma de realização, o ácido nucleico é bireativo, ou biativado, e contém dois campos reativos: um grupo 5'- amino e um grupo 3'-amino introduzido no oligonucleótido através da síntese de fosforoamidita, por exemplo, 3'-5'- diPEGilação como ilustrado na Figura 6. Em formas de realização alternativas, os campos reativos podem ser introduzidos em posições internas, usando, por exemplo, a posição-5 de pirimidinas, a posição-8 de purinas, ou a posição-2' de ribose como campos para a fixação de aminas primárias. Nas ditas formas de realização, o ácido nucleico pode ser dotado de diversos campos ativados ou reativos e é dito ser multiplado ativado. Em seguida da síntese e da purificação, o oligonucleótido modificado é combinado com PEG monoativado sob condições que promovem a reação de seleção com os campos reativos de oligonucleótido e ainda minimizam a hidrólise espontânea. Na forma de realização preferida PEG- monometoxi é ativado com propionato de succinimidilo e a reação acoplada é realizada em pH 8,3. Para direcionar a síntese de PEG bi-substituído, o excesso estequiométrico de PEG é proporcionado ao oligonucleótido. Em seguida da reação, o conjugado de PEG - ácido nucleico é purificado por eletroforese de gel ou cromatografia liquida para separar espécies completas, parciais e não conjugadas.
Os domínios de ligação podem ainda ser dotados de uma ou mais frações de polialquileno glicol fixadas à mesma. Tais PAGs podem ser de comprimentos variáveis e podem ser usados em combinações apropriadas para alcançar o peso molecular desejado da composição. 110 ΕΡ1850880Β1 0 efeito de um ligante particular pode ser influenciado tanto pela composição química como pelo comprimento. Um ligante que for muito longo, muito curto, ou que forme interações estéricas desfavoráveis e/ou iónicas com o alvo pode impedir a formação do complexo entre o aptâmero e o alvo. Um ligante, que é mais longo que o necessário para expandir a distancia entre os ácidos nucleicos, pode reduzir a estabilidade da ligação ao reduzir a concentração eficaz do ligante. Assim é com frequência necessário se otimizar as composições ligantes e os comprimentos de modo a maximizar a afinidade de um aptâmero ao alvo. A citação das publicações e dos documentos de patente não tem a intenção de ser admitida ser pertinente à técnica anterior, nem constitui qualquer admissão com relação ao conteúdo ou datas das mesmas. A presente invenção agora tendo sida descrita apenas no sentido de descrição escrita, aqueles peritos na especialidade reconhecerão que a invenção pode ser praticada numa variedade de formas de realização e que a descrição e os exemplos a seguir a seguir são com o objetivo apenas de ilustração e não limitam as reivindicações que se seguem. EXEMPLO 1
Atividade de Aptâmero anti-C5 nas Vias de Complemento Clássica e Alternativa
Exemplo IA: Ensaio de Hemólise. 0 teste CH50 mede a capacidade do sistema complemento numa amostra de teste de soro de lisar 50% das células numa suspensão padronizada de eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo. Uma solução de soro humano a 0,2% foi 111 ΕΡ1850880Β1 misturada com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL) na presença ou ausência de diversos aptâmeros anti-C5. 0 ensaio foi realizado de acordo com o protocolo de kit em salina tamponada com veronal contendo cálcio, magnésio e 1% de gelatina (tampão de complemento GVB++) e incubada por 30 minutos a 37°C. Após a incubação, as amostras foram configuradas para granular os eritrócitos intactos. A densidade ótica a 412 nm (OD4i2) do sobrenadante foi lida para guantificar a libertação da hemoglobina solúvel gue foi proporcional à extensão da hemólise (Green et al., (1995) Chem. Biol. 2:683 - 95). Para verificar que os aptâmeros bloquearam a ativação de C5, alguns sobrenadantes de hemólise foram analisados quanto a presença de C5 e de C5b-9 por ELISA (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA) em seguida dos protocolos dos kits de ELISA.
A adição de um aptâmero anti-C5 não PEGilado (ARC 186) (SEQ ID NO: 4) à mistura de reação inibiu a hemólise de uma forma dependente de dose, como mostrado no gráfico da Figura 7A, com uma IC50 de 0,5 ± 0,1 nM, (veja-se Figura 7B) , um valor que é consistente com a KD determinada por filtração de nitrocelulose. Em concentrações de aptâmeros muito elevadas (> 10 nM) , a extensão da hemólise foi essencialmente indistinguível a partir do fundo (sem soro adicionado), indicando que ARC 186 (SEQ ID NO: 4) foi capaz de bloquear completamente a atividade de complemento. A conjugação do aptâmero ARC 186 (SEQ ID NO: 4) com grupos de PEG de 20 kDa (ARC 657; SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 61), 30 kDa (ARC 658; SEQ ID NO: 62), 40 kDa ramificado (1,3-bis (mPEG- [20 kDa]) - propil-2-(4'-butamida) (ARC 187; SEQ ID NO: 5), 40 kDa ramificado (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoil) (ARC 1905; SEQ ID NO: 67), 40 kDa linear (ARC 1537; SEQ ID NO: 65), e 2x20 kDa linear (ARC 1730; SEQ ID 112 ΕΡ1850880Β1 NO: 66) apresentou pouco efeito na atividade inibitória de aptâmero no ensaio de hemólise CH50 (Figura 7A - Figura 7D) .
Num estudo adicional, a atividade inibitória do aptâmero anti-C5 PEGilado AR1905 (40 kDa ramificado (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoil); SEQ ID NO: 67) foi comparada ao seu precursor não PEGilado, ARC 672 (SEQ ID NO 63) que contém um terminal 5'-amina, no teste de hemólise CH50 acima descrito. Uma solução de soro humano (Innovative Research, Southfield, MI) foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL) na presença ou ausência de diversas concentrações de ARC 1905 e ARC 627 respetivamente de modo que a concentração final do soro em cada teste foi de 0,1% e o teste foi rodado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. As reações de hemólise foram incubadas por 1 hora a 37°C com agitação para garantir que as células permaneceram em suspensão. NO final da incubação, as células intactas foram granuladas por centrifugação (2.000 rpm, 2 minutos, a temperatura ambiente), 200 pL de sobrenadante foram transferidos a uma placa de polistireno de fundo arredondado (VWR, cat#62409-003) . A densidade ótica a 415 nm (OD415) do sobrenadante foi lida para quantificar a libertação da hemoglobina solúvel. O percentual de inibição de cada concentração de aptâmero foi calculado usando uma equação de% de inibição = 100-100 X (^amostra Asem soro) / (Asem aptâmero ^sem soro) t Onde Aamospra é a absorvância da amostra em concentrações variáveis de aptâmero, Asem SOro é a absorção em virtude da hemólise de fundo na ausência de soro (100% de controlo de inibição) e Asem aptâmero é a absorvância em virtude da atividade de complemento basal na ausência do aptâmero (0% de controlo de inibição). Os valores de IC50 foram determinados a partir do gráfico de% de inibição versus [inibidor] usando 113 ΕΡ1850880Β1 a equação de% de inibição = (% de inibição) máxima x [inibidor]71 / (IC50" + [inibidor]") + fundo. Os valores de IC90 e de IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as equações IC90 = IC50 x [ 90/(10 0-90 ]1/73 e IC90 = IC50 x [ 99/(100-99]1/71. Os valores de IC50 para ARC 1905 e ARC 627 no presente estudo paralelo foram 0,648 +/- 0,0521 e 0,913 +/- 0,0679 respetivamente (veja-se também Figura 58) confirmando adicionalmente que a PEGilação apresentou pouco, se algum, efeito sobre a função de aptâmero. A análise de ELISA da hemólise do sobrenadante indicou que a dita inibição funcional esteve correlacionada com o bloqueio da libertação de C5a. Assim, os dados de hemólise mostraram que ARC 186 (SEQ ID NO: 4), e seus conjugados PEGilados, são inibidores de complemento altamente potentes que funcionam para bloquear a ativação catalisada a convertase de C5.
Os testes de hemólise com material não PEGilado indicaram que o aptâmero anti-C5 não sofreu reação cruzada com C5 a partir de uma série de espécies não primatas, incluindo ratos, cobaia, cães e porcos. Entretanto, a atividade inibitória significativa foi observada em triagens de soro de primatas, incluindo o soro do macaco cinomolgus, macaco rhesus e chimpanzé. A eficácia in vitro do aptâmero anti-C5 foi adicionalmente investigada em soro de cinomolgus usando ARC 658 (SEQ ID NO: 62), o análogo de 30 kDa-PEG de ARC 186 (SEQ ID NO: 4). Numa comparação lado a lado (n = 3) , ARC 658 inibiu a atividade de complemento humano com uma IC50 de 0,21 nM ± 0,0 nM e uma atividade de complemento de cinomolgus com uma IC50 de 1,7 ± 0,4 nM (Figura 8) . Assim ARC 658 (SEQ ID NO: 62) é 8 ± 3 vezes menos potente em soro de cinomolgus em comparação ao humano por esta medição. 114 ΕΡ1850880Β1
Num estudo relacionado, os efeitos do aptâmero anti-C5 PEGilado ramificado de 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa] ) propil-l-carbamoil) , ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) na via clássica de ativação de complemento como testado pela hemólise de eritrócito de ovelha foram investigados na presença de humanos (Innovative Research, Southfield, MI), macaco cinomolgus (Bioreclamation, Hicksville, NY), ou soro de rato (Bioreclamation, Hicksville, NY) . Os ditos testes foram realizados em soro altamente diluído, 0,1% para humanos e macaco cinomolgus, e 0,3% para ratos, sob as mesmas condições gue as utilizadas para comparar os efeitos inibitórios de ARC 1905 contra ARC 672 na hemólise de eritrócitos de ovelhas como descrito diretamente acima. Numa comparação lado a lado, a inibição completa (90% -99%) da atividade de complemento in vitro foi alcançada com ARC 1905 tanto em soro de seres humano como em de macacos cinomolgus enquanto que ARC 1905 exibiu pouca ou nenhuma atividade inibitória específica na amostra de complemento de rato (Figura 59A) . De forma similar a ARC 658, ARC 1905 foi aproximadamente 10 vezes menos potente contra a atividade de complemento de macaco cinomolgus sob as condições de teste, como refletido nos valores de IC90 e de IC99 reportados na Figura 59B.
Testes de Ligação de Filtro de Nitrocelulose. Os aptâmeros individuais foram marcados com 32P na extremidade 5' pela incubação com γ-32Ρ-ΑΤΡ e polinucleótido quinase (New England Biolabs, Beverly, MA). O aptâmero radiomarcado foi purificado de ATP livre por filtração de gel seguido de eletroforese de gel de poliacrilamida. Para se medir a afinidade de aptâmero anti-C5, o aptâmero radiomarcado (^ 10 pM) foi incubado com crescentes concentrações (0,05 nM -100 nM) de proteína C5 purificada (Quidel, San diego, CA) em solução salina tamponada a fosfato contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C) e 37°C, por 15 minutos 115 ΕΡ1850880Β1 e 4 horas de intervalos de tempo. As reações de ligação foram analisadas por filtração de nitrocelulose usando múltiplas filtragens a vácuo, 96 cavidades, dot-blot Minifold I (Schleicher & Schuell, Keene, NH) . Um meio de filtração de três camadas foi utilizado, consistindo (de cima para baixo) em nitrocelulose Protran (Schleicher & Schuell), náilon Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e papel de gel blot GB002 (Schleicher & Schuell). A camada de nitrocelulose, que se liga seletivamente à proteína sobre o ácido nucleico, preferivelmente reteve o aptâmero anti-C5 no complexo com uma proteína ligante, enquanto o aptâmero anti-C5 que não formou complexo passou através da nitrocelulose e aderiu ao náilon. 0 papel de gel blot foi incluído simplesmente como um meio de suporte para os outros filtros. Em seguida à filtração, as camadas de filtro foram separadas, secas e expostas a uma tela de fósforo (Amersham Biosciences) e quantificadas usando um sistema de imagem blot Storm 860 Phosphorimager© (Amersham Biosciences).
Como mostrado na Figura 9 e na Figura 10, concentrações crescentes de C5 aumentam a proporção de ARC 186 capturado na membrana de nitrocelulose. A dependência do ARC 186 ligado nas concentrações crescentes de C5 é bem descrita pelo modelo de ligação de campo único (C5 + ARC 186 <-> C5«ARC 186;% de ligado = Cmax / (1 + KD / [C5] ) ; Cmax é o percentual ligado máximo em saturação de [C 5]; KD é a constante de dissociação). As curvas de ligação de ARC 186 em duas temperaturas em seguida à incubação a 15 minutos ou a 4 horas são mostradas nas Figuras 9 e 10, respetivamente. Em seguida, uma incubação de 15 minutos, as curvas de ligação de ARC 186 em 23°C e 37°C são essencialmente indistinguíveis em erro, se encaixando em valores KD de 0,5 nM - 0,6 nM (Figura 9) . As diferenças entre as curvas de ligação a 23°C e 37°C tornaram-se mais pronunciadas quando 116 ΕΡ1850880Β1 0 tempo de incubação é estendido. Em seguida de uma incubação de 4 horas (Figura 10), a KD observada a 23° reduziu para 0,08 nM ± 0,01 nM, embora a KD observada a 37°C permaneceu inalterada (0,06 nM ± 0,01 nM).
Para demonstrar a base para a necessidade de longa incubação a temperatura ambiente, a afinidade a esta temperatura foi adicionalmente explorada por meio da utilização de métodos cinéticos. A taxa da reação indireta que descreve a dissociação de C5*ARC 186 é vind = k_![C5*ARC 186] , onde vind é a taxa (unidades de M min-1) e k_! é a constante da taxa de dissociação de primeira ordem (unidades de min-1) . A taxa da reação direta descrevendo a formação do complexo C5*ARC 186 é Vdir = kq[C5] [ARC 186], onde Vdir é a taxa (unidades de M min-1) e Jcj é a constante de taxa de associação de segunda ordem (unidades de M-1min-T). Os dados foram analisados usando a suposição de pseudoprimeira ordem, onde a concentração de um reagente (C5 neste caso) é mantida num vasto excesso em relação ao outro ([C5]>> [ARC 186], e assim permanece essencialmente inalterado no decurso da reação. Sob as ditas condições, a reação a seguir é descrita pela equação de taxa para um processo de primeira ordem, Vdir = kq' [ARC 186], onde kq' = kq [C5 ] .
Para analisar a dissociação de C5*ARC 186, ARC 186 radiomarcado (< 10 pM) foi pré-equilibrado com 5 nM de proteína C5 em solução salina tamponada a fosfato contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C). A reação de dissociação foi iniciada pela adição de um ARC 186 não marcado (1 μΜ) , que atua como uma armadilha para o C5 livre, e interrompida pela filtração por nitrocelulose separando o ARC 186 radiomarcado ligado do livre. O decurso de tempo da dissociação de ARC 186 foi obtido ao variar a duração entre o início da reação de dissociação e a 117 ΕΡ1850880Β1 filtração. 0 decurso de tempo de dissociação, observado como a redução no percentual de ARC 186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose (igual ao percentual ligado a C5) é bem descrito pelo decaimento uniexponencial onde% de ARC 186 ligado = 100 x e-k-lt (veja-se Figura 11) . O valor da constante de taxa de dissociação, k_lf determinado por este método é 0,013 ± 0,02 min”1, correspondendo a uma semivida (t1/2 = ln2 / k_i) de 53 ± 8 min.
Para analisar a reação de associação, a constante de taxa de equilíbrio (keq) para a formação de C5*ARC 186 foi medida na presença de concentrações variáveis de proteína C5 (1-5 nM) . A formação de complexo foi iniciada ao misturar junto a proteína C5 e ARC 186 radiomarcado em PBS contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C), e interrompida por fracionamento de filtração por nitrocelulose. Como descrito para as reações de dissociação, um decurso de tempo da formação de complexo foi obtido ao variar-se a duração entre o início da reação e a filtração. 0 decurso de tempo de equilíbrio, observado como um aumento no percentual de ARC 186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose, é bem descrito pelo decaimento uni-exponencial onde% de ARC 186 ligado = 100 x (1 - e klt) . Os decursos de equilíbrio para 1 nM, 2 nM e 4 nM de C5 são exibidos na Figura 12. Como é esperado, o valor de keq aumenta linearmente com [C5] (keg (1 nM) = 0,19 ± 0,02 min-1; keq (2 nM) = 0,39 ± 0,03 min-1; keq (3 nM) = 0,59 ± 0,05 min-1; keq (4 nM) = 0,77 ± 0,06 min”1; keq (5 nM) = 0,88 ± 0,06 min”1) . Sob as condições da experiência, a relação entre keq, k2 e k-j é keq = ki[C5] + . Assim, uma estimativa de k2 é derivada da inclinação de um gráfico de keq com relação a [ C 5 ] (veja-se inserção na Figura 12), neste caso 0,18 ± 0,01 nM”1mm”1. 118 ΕΡ1850880Β1
Estes dados indicam que sob as condições de baixa concentração de C5 (por exemplo, 0,1 nM) , uma incubação extensa é necessária de modo a que a mistura de C5 e ARC 186 radiomarcado alcance o equilíbrio. Sob estas condições, keq = (0,18 ± 0,01 nM”1mm^1) (0,1 nM) + 0,013 min-1 = 0,0 3 min-1, correspondendo a uma semivida de 22 minutos. Assim, uma incubação de aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente (~ 5 semividas) é necessária para completar (> 95%) de equilíbrio. Um tempo curto de incubação (por exemplo, 15 minutos) irá subestimar de forma significativa a afinidade real do complexo, como mostrado acima pela diferença nas afinidades observadas por uma incubação de 15 minutos (KD = 0,5 nM) com relação a uma incubação de 4 horas (KD = 0,08 nM) . Uma estimativa alternativa de KD de temperatura ambiente pode ser calculada para dados cinéticos de acordo com a relação KD = k/ k1. Neste caso, a KD calculada é 0,07 nM + 0,01 nM, que é completamente consistente com a KD determinada acima pelos métodos termodinâmicos. A especificidade de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) para C5 foi também avaliada em testes de filtração de nitrocelulose em comparação com o componente complemento tanto a montante como a jusante a partir de C5 na cascata de complemento. As proteínas humanas purificadas e os complexos de proteicos foram adquiridos da Complement Technologies (Tyler, TX) incluindo: Clq (cat. # A099.18; 2,3 μΜ), C3 (cat. # AI 13c. 8; 27 μΜ), C5 (cat. # A120.14; 5,4 μΜ), C5a des Arg (cat. # A145.6; 60 μΜ) , sC5b-9 (cat. # A127.6; 1 μΜ), fator B (cat. #A135.12; 11 μΜ) e fator H (cat. # A137.13P; 6,8 μΜ) . As reações de ligação foram estabelecidas ao se realizar diluições em série de proteína em PBS mais 1 mM de MgCl2, 0,02 mg/ml de BSA e 0,002 mg/ml de ARNt, incubando por 1-4 horas a 25°C ou 37°C, e então aplicadas ao aparelho de filtração de nitrocelulose como acima descrito. As 119 ΕΡ1850880Β1 constantes de dissociação KD foram determinadas a partir de gráficos de semi-log de% de ligação de nitrocelulose com relação a [C5] com uma adaptação dos dados da equação:% de ligação de nitrocelulose = amplitude X[C5]/(KD +[C5]).
Os resultados ilustrados na Figura 13 mostram que o aptâmero essencialmente não reconhece C5a (KD » 3 μΜ) , embora o mesmo exiba uma fraca afinidade para C5b-9 (KD > 0,2 μΜ) , presumivelmente em virtude das interações com o componente C5b. Outros componentes complementos exibem afinidade de moderada a fraca para o aptâmero. O C3 não ativado essencialmente não se liga ao aptâmero, entretanto, o fator H (KD ~ 100 nM) e, a uma extensão muito menor, Clq (KD >0,3 μΜ) se liga . Juntos, os dados indicam que ARC 186 (SEQ ID NO: 4) se liga com alta afinidade à C5 humana, principalmente por meio do reconhecimento do domínio C5b. Assim, ARC 186 e seus derivados PEGilados, por exemplo, ARC 1905 não devem interferir com a geração de C3b, que é importante para a opsonização bacteriana, ou com o controlo inato de ativação C por fatores reguladores. A conjugação de aptâmeros com frações PEG de alto peso molecular introduz a possibilidade de impedimento esférico levando a afinidade reduzida. Os aptâmeros modificados a PEG não são prontamente avaliados quanto à ligação direta por testes de filtração por nitrocelulose em virtude da tendência dos ditos aptâmeros se aderirem à nitrocelulose mesmo na ausência de proteína alvo. Entretanto, as afinidades relativas dos ditos aptâmeros podem ser avaliadas a partir de sua habilidade comparativa em competir com o aptâmero não PEGilado radiomarcado 10 μΜ) para a ligação ao alvo como medido por filtração de nitrocelulose conhecida como o teste de ligação competitiva, implementado a 37°C. Na medida em que a concentração de competidores frios (isto é, não 120 ΕΡ1850880Β1 radiomarcados) aumenta, o percentual de aptâmero radiomarcado ligado à proteína alvo diminui. Como mostrado na Figura 14, maiores concentrações de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) ou aptâmero PEGilado (ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), e ARC 187 (SEQ ID NO: 5)) (0,05 - 1000 nM) prontamente competem com o ARC 186 (SEQ ID NO: 4) radiomarcado para a ligação na presença de 2 nM de proteína C5. Além disso, as curvas de titulação para todos os quatro aptâmeros quase se sobrepõem, indicando que a conjugação PEG em caso de ARC 657, ARC 658 e ARC 187 apresenta pouco ou nenhum efeito na afinidade do aptâmero para C5.
Num estudo similar, o efeito da conjugação PEG na ligação a C5 foi testado por comparação de ARC 672 (ARC 186 com uma amina 5'-terminal; SEQ ID NO 63) com ARC 1905 (ARC 627 conjugada com uma (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoilo ramificado de 40 kDa) PEG) usando o teste de ligação competitiva. 10 μΜ de estoque de cada aptâmero foram preparados em PBS mais 1 mM MgCl2, 0,01 mg/ml BSA, 0,002 mg/ml de ARNt, e diluído em série para gerar uma série de amostra 10X cobrindo um intervalo > 100 vezes da concentração de aptâmero. Alíquotas de 12 pL de cada amostra foram então adicionadas numa placa de 96 cavidades de 96 pL de ARC 18 6 radiomarcado com 32P para gerar uma solução de 1, IX de marcação e competidor frio. 90 pL de solução marcadora/competidora foi então adicionado a 10 pL de 10X proteína C5 para iniciar as reações. A concentração final de ARC 186 marcado em cada reação foi mantida constante. As reações de ligação foram equilibradas por 15 - 30 min a 37°C, e então filtradas sobre um aparelho de filtro de nitrocelulose acima descrito. Para os objetivos de análise de dados, os aptâmeros competidores frios foram tratados como inibidores competitivos para a interação de ARC 186/C5; o percentual de inibição foi calculado pela normalização dos dados para controlar as reações 121 ΕΡ1850880Β1 desprovidas de competidor (0% de controlo de inibição). Os valores de IC50 foram determinados a partir dos gráficos de semi-log de% de inibição com relação a [ARC 672] ou [ARC 1905] por uma adaptação dos dados à equação:% de inibição = amplitude x [competidor] η/ΙΟ50η + [competidor]").
Como mostrado na Figura 60, a adição de um PEG ramificado de 40 KDa (2, 3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoilo) apresenta pouco ou nenhum efeito na afinidade de aptâmero como medido pela ligação competitiva. Os valores de KD de 0,46 +/- 0, 149 nM e 0,71 +/- 0,130 nM foram aproximados para ARC 672 e ARC 1905 respetivamente por sua intercepção-y da linha de encaixe a IC50 com relação aos dados C5 na Figura 60. Ambos os valores são próximos ao KD determinado para ARC 186 a 37°C. A dependência de temperatura da interação entre ARC 1905 e C5 foi também estimada pelo teste de competição. A ARC 1905 foi diluída em série para gerar séries de amostras 10X como descritas acima. As reações de ligação foram equilibradas por 1 hora - 4 horas a 25°C ou 37°C, e então filtradas num aparelho de filtro de nitrocelulose. O percentual de inibição foi calculado para normalizar os dados para as reações de controlo que são desprovidos de competidor (0% de controlo de inibição) ou desprovidos de proteína C5 (100% de controlo de inibição). Os valores IC50 foram determinados a partir dos gráficos de semi-log de% de inibição com relação a [ARC 672] ou [ARC 1905] por uma adequação dos dados da equação:% de inibição = amplitude x [competidor] n/IC50n + [competidor]11). Como mostrado na Figura 61, o ARC 1905 liga-se a C5 com alta afinidade tanto a 25°C como a 37°C. Os valores de KD de 0,15 ± 0,048 nM e 0,69 ± 0,148 nM foram obtidos a 25°C e a 37°C, respetivamente, a partir da intercepção-y de IC50 versus os dados de C5. Ambos os valores são consistentes com os 122 ΕΡ1850880Β1 valores de KD determinados para a interaçao ARC 185/C5 descrita acima.
Exemplo 1B: Teste de Sangue Total. 0 efeito do aptâmero anti-C5 sobre a via alternativa do sistema complemento foi analisado usando o teste de sangue total a seguir. Na ausência de um anticoagulante, o sangue foi obtido a partir de voluntários humanos normais. Aliquotas de sangue (não contendo anticoagulante) foram incubadas com concentrações crescentes de ARC 196 (SEQ ID NO: 4) por 5 horas a temperatura ambiente ou 37°C. As amostras foram centrifugadas para isolar o soro e a presença de C5b no soro foi detetada por sC5b-9 ELISA (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA). Como mostrado na Figura 15, a atividade de anticomplemento, como refletida na produção de C5b-9, entre as amostras incubadas em diferentes temperaturas divergiu em 3 μΜ. Os dados de temperatura ambiente indicaram gue a concentração do aptâmero necessitou de uma inibição quantitativa estão no intervalo de 3 - 6 μΜ, enquanto que a concentração reportada de C5 é de aproximadamente 400 nM. Estes resultados sugerem que mais que 10 x de excesso molar de aptâmero anti-C5 (Arl8 6; SEQ ID NO: 4) podem ser necessários para a completa inibição da atividade de C5.
Exemplo 1C: Ativação de complemento por zimosan.
Zimosan é um componente polissacárido da parede celular da levedura, e um ativador potente da cascata de complemento alternativa. A adição de zimosan às amostras ex vivo de sangue, plasma ou soro resulta no acúmulo de produtos de ativação de complemento, incluindo C5a e a versão solúvel de C5b9 (sC5b-9). As amostras do soro humano não diluído (Center for Blood Research, Boston, MA), sangue 123 ΕΡ1850880Β1
humano total citratado (Center for Blood Research, Boston, MA) ou soro de cinomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) foram aumentados com concentrações crescentes de ARC 658 (SEQ ID NO: 62), o análogo de PEG de 30K de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) . Para ativar o complemento, zimosan (Sigma, St. Louis, MO) numa suspensão 10X foi adicionado às amostras a uma concentração final de 5 mg/ml. Em seguida a uma incubação de 15 minutos a 37 °C, as partículas de zimosan foram removidas por centrifugação e a extensão da ativação complemento foi determinada por C5a e/ou sC5b-9 ELISA (kit C5b-9 ELISA, Quidel, San Diego, CA; kit C5a ELISA, BD Biosciences, San Diego, CA).
Na ausência do aptâmero, o tratamento com zimosan ativa -50% do soro ou do sangue total C5, em comparação com -1% de ativação na amostra não tratada. A adição do aptâmero anti-C5 até 50 nM (-10% de concentração de C5 no sangue) possui pouco efeito na formação de sC5b-9.
Entretanto, a titulação adicional de C5 com concentrações crescentes de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) inibiu a ativação de C5 numa maneira dependente de dose como visto na Figura 16. No soro humano ou sangue total, a inibição quantitativa (-99%) foi observada a 0,8 - 1 μΜ de ARC 658 (SEQ ID NO: 62), correspondendo a -2 equivalentes molares do aptâmero para C5. Concentrações mais elevadas do aptâmero foram necessárias para alcançar a inibição comparável no soro de cinomolgus. Neste caso, 99% de inibição foi alcançada apenas na presença de 10 μΜ de aptâmero, ou -20 equivalentes molares do aptâmero para C5.
Num estudo similar, os efeitos inibitórios de ARC 1905 (((2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoil) ramificado de 40 KDa, a versão PEGilada de ARC 186) foi testada em amostras de seres humanos e de macaco cinomolgus usando zimosan para ativar o complemento por meio da via 124 ΕΡ1850880Β1 alternativa como se segue. Zimosan A da Saccharomyces cerevisiae foi fornecido pela Sigma-Aldrich, Inc. (n° de cat. Z4250-1G, St. Louis, MO). 0 zimosan A foi fornecido como um pó e foi ressuspenso em PBS de Dulbecco (Gibco, Carlsbad, CA, n° de cat. 14190-144) para produzir uma suspensão de 50 mg/ml. Soro humano normal congelado (N° de cat. IPLA-SER) foi adguirido da Innovative Research (Southfield, MI) , soro de macaco cinomolgus congelado (N° de cat. CYNSRM) foi adquirido da Bioreclamation (Hicksville, NY). Frascos de soro de 5 ml - 10 ml proporcionados pelo fornecedor foram descongelados a 37°C, separados em alíquotas de (~1 ml) e armazenados a -20°C. As aliquotas foram removidas logo antes do utilização por incubação a 37 °C e armazenados em gelo durante as experiências. A concentração final do soro em cada teste foi de -100%. Um estogue de 20 μΜ de ARC 1905 foi preparado em salina 0,9% e diluído em série para gerar uma série de amostras lOx cobrindo um intervalo de -90 vezes de concentrações de aptâmeros. Uma amostra sem aptâmero (só de salina) foi também incluída como um controlo negativo (0% de inibição). 90 pL de soro foi pipetado em poços de uma placa de PCR de 96 poços (VWR, n° de cat. 1442-9596) . 10 pL de amostra de aptâmero foram diluídos diretamente no soro a temperatura ambiente e misturados. 8 pL de 50 mg/ml de zimosan foram pipetados em poços de uma placa de PCR de 96 poços separada. Ambas as placas foram simultaneamente pré-incubadas a 37 °C durante 15 minutos. Imediatamente em seguida à pré-incubação, 80 pL da mistura de soro/aptâmero foi adicionada diretamente a 8 pL de zimosan e misturada, produzindo uma concentração final de zimosan de 5 mg/ml. A placa de reação foi selada e incubada por 15 minutos a 37°C. No final da incubação, a reação foi rapidamente arrefecida ao se pipetar 8 pL de 0,5 M de EDTA em poços e 125 ΕΡ1850880Β1 misturados. A zimosan foi granulada por centrifugação (3700 rpm, 5 min, a temperatura ambiente) e ~80 pL do sobrenadante arrefecido foram transferidos a uma nova placa de PCR de 96 poços e selados. O sobrenadante foi rapidamente congelado em azoto liquido e armazenado a -20°C. Para controlar a ativação de fundo independente de zimosan, amostras de soro foram preparadas e tratadas exatamente como acima descrito, exceto que 8 pL de salina foi adicionado em vez de zimosan. A extensão da ativação de C5 foi determinada a partir dos niveis relativos de C5a gerados em cada amostra ativada com zimosan, como medido por C5a ELISA (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, n° de cat. EIA-3327) seguindo o protocolo do kit C5a ELISA. O kit C5a ELISA inclui reagentes específicos humanos e é formatado para a análise de C5a humano (hC5a) nas amostras de plasma ou de soro. Foi, no entanto, necessário caracterizar a resposta de ELISA à C5a do macaco cinomolgus usando padrões de concentração de cinomolgus. Para preparar um conjunto de padrões habituais, alíquotas de 0,5 ml de soro de seres humanos e de macaco cinomolgus foram incubadas com 5 mg/ml de zimosan por 15 minutos a 37 °C, rapidamente arrefecida com 12,5 pL de 0,5 M EDTA e centrifugado para remover o zimosan. A concentração de C5a na amostra de soro humano ativada a zimosan foi determinada ser aproximadamente 2 ng/ml de hC5a em comparação ao plasma padrão hC5a proporcionado com o kit. A concentração de C5a na amostra de macaco cinomolgus, expressa em equivalentes de C5a humano (hC5a eq.), foi determinada ser aproximadamente 0,6 pg/ml de hC5a eq. Séries de padrões que cobrem um intervalo de 0,4 ng/ml - 400 ng/ml de hC5a ou 0,12 ng/ml - 120 ng/ml de hC5a eq., foram preparadas por diluição em soro de rato (que não interfere com ELISA). Os padrões foram pré-tratados com um reagente de precipitação de proteína como direcionado no protocolo do kit ELISA e 126 ΕΡ1850880Β1 aplicado sem diluição adicional na placa ELISA. A placa ELISA foi lida numa absorção máxima de 450 nm (A450 ) usando uma leitora de placa de absorção VersaMax UV/vis (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . A A450 variou com uma concentração de C5a a partir de um nivel baixo de 0,1 - 0,2 de C5a baixo, formando um platô em aproximadamente 3,5 de C5a alto. Para o objetivo de quantificar C5a nas amostras de teste, os limites superior e inferior da quantificação foram, respetivamente 25 ng/ml e 0,78 ng/ml de hC5a para humano e 15 ng/ml e 0,94 ng/ml de hC5a eq. para macaco cinomolgus. A4 50 com relação ng/ml de hC5a ou hC5a eq. foi traçado como mostrado na Figura 62, e uma curva padrão foi obtida a partir de uma adaptação de 4-parâmetros aos dados usando a equação y = ((A - D)/(l + (x/C)B)) + D.
Logo antes da análise de C5a, as amostras de teste (incluindo apenas salina e nenhum controlo de zimosan) foram pré-tratadas com um reagente de precipitação de proteína como direcionado no protocolo do kit ELISA, e então diluídas em série em 0,9% de salina. Os níveis de C5a nas amostras de teste não diluídas (incluindo algumas de controlos não zimosan) tipicamente excederam o limite superior de quantificação (ULOQ). Portanto, as diluições de 1/5, 1/50 e 1/250 foram testadas para acomodar o intervalo completo das concentrações de C5a na amostra de teste. Os níveis de C5a foram quantificados por comparação com a curva padrão apropriada (humano ou macaco cinomolgus) e corrigidas para diluição. 0% de inibição em cada concentração de aptâmero foi calculado usando a equação% de inibiçaO 100 100 X (C5aamostra — 05USem zimozan) / (C5aapenas saima ~~ C5asem ZimoSan) · Os valores de IC50 foram determinados a partir de um gráfico de% de inibição versus [ARC 1905] usando a equação% de inibição = (% de inibição) máximo X [ARC 1905]" / (IC50" + [ARC 1905]") + fundo. Os valores de IC90 e IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as 127 ΕΡ1850880Β1 equações IC90 = IC50 x [90 / (100-90]17^ e IC99 = IC50 x [99/ (100-99] 1/n. A extensão da ativação C3 (a etapa na via de complemento comum logo a montante de C5) foi determinada a partir dos niveis relativos de C3a gerado em cada amostra ativada a zimosan, como medido por C3a ELISA (Becton-Dickinson OptiEIA C3a ELISA kit, n° de cat. 550499, Franklin Lakes, NJ) seguindo o protocolo do kit C3a ELISA.
Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controlos de apenas salina e sem zimosan) foram diluidas em série em 0,9% de salina. O ELISA C3a é mais sensível do que para C5a; portanto, diluições de 1/500, 1/5000 e 1/25.000 foram necessárias para acomodar a amplo intervalo de concentrações de C3a. Kits padrões, derivados de soro humano foram usados em vez dos padrões habituais preparados para a análise de C5a. Uma vez que os niveis de C3a não variaram grandemente, os padrões específicos humanos proporcionaram uma indicação suficiente de seus níveis relativos.
Os dados gerados a partir de ELISAs tanto de C5a como de C3a, foram analisados usando Microsoft Excel, e valores médios de percentual de inibição foram traçados usando Kaleidagraph (v. 3.51, Synergy Software). Os valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinados usando o plug-in XLfit 4.1 para Excel. Os efeitos comparativos de ARC 1905 na ativação de complemento de humano e macaco cinomolgus, como medido pela dita abordagem, são resumidos na Figura 63 e Figura 64. Como pode ser observado a partir das ditas Figuras, a inibição completa da ativação de C5 por meio da via alternativa é alcançável in vitro com ARC 1905 tanto nos soros de humano como no de macaco cinomolgus. No soro humano, a concentração de ARC 1905 necessitou de 90% de 128 ΕΡ1850880Β1 inibição de ativação de C5 numa amostra não diluída foi de 442 ± 23 nM, aproximadamente equivalentes à concentração molar média de C5. Entretanto, o ARC 1905 foi de 4 a 6 vezes menos potente contra a atividade complemento de macaco cinomolgus sob as condições do teste, como refletido nos valores de IC90 e IC99.
Os efeitos da ativação de ARC 1905 C3, como medido pelos níveis de C3a, são resumidos na Figura 65. O fundamento lógico para direcionar especificamente a extremidade final da via de complemento é de bloquear as funções pró-inflamatórias de C5a e o complexo de ataque de membrana (MAC) sem comprometer as funções de luta de patógeno dos fatores a montante que culminam na geração de C3a e C3b. Os dados na Figura 65 demonstram que ARC 1905, cerca de 2 μΜ, não inibe a geração de C3a e indica que a ativação de complemento a montante não sofre impacto negativo pela ARC 1905. O bloqueio essencialmente completo da via alternativa da ativação de C5 foi alcançado tanto nas amostras de soro de humano como na de macaco cinomolgus usando ARC 1905. O ARC 1905 foi aproximadamente da ordem de magnitude menos potente na inibição da ativação de C5 em macaco cinomolgus do que na ativação de C5 em seres humanos sob as condições de teste. Embora não se tenha a intenção de estar ligados a uma teoria, o efeito inibitório de ARC 1905 na ativação de complemento é específico para C5 uma vez que a ativação de C3 não foi inibida.
Exemplo 1D: Modelo de alça de tubo da ativação de complemento
Para testar a habilidade do aptâmero anti-C5 em bloquear a ativação de complemento induzida por exposição de materiais estranhos, como observado em circuito bypass cardiopulmonar, foi utilizado o modelo de alça de tubo 129 ΕΡ1850880Β1 descrito por Nilsson e colegas (Gong et al., (1996) Journal of Clinicai Immunology 16, 222-9; Nilsson et al., (1998) Blood 92, 1661-7). Tubos médico/cirúrgicos Tygon S-50-HL (1/4" de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. ((Lima, OH), cat. # 00542) foi cortado em comprimentos de aproximadamente 300 mm (aproximadamente 9 ml de volume) e preenchido com 5 ml de sangue de dador humano contendo 0,4 unidades/ml de heparina (Celsus) e concentrações variáveis de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) (0-5 μΜ) . Cada comprimento do tubo Tygon foi fechado em alça com secções curtas (—50 mm) de um tubo de ligação de silicone não cirúrgico (3/8" de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. (formulação R-3603, cat. # 00271) como descrito em Gong et al. As alças de tubo foram giradas por 1 hora em aproximadamente 30 rpm num banho de 37°C. os conteúdos da alça foram então vertidos em tubos cónicos de polipropileno contendo EDTA (10 mM de concentração final) para arrefecer a ativação do complemento. O plasma pobre em plaquetas foi isolado por centrifugação e analisado quanto a C5a e C3a por ELISA (C3a ELISAkit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA). A ativação de complemento total na ausência do aptâmero foi pequena em comparação ao teste de zimosan. Tipicamente, os niveis de C5a aumentaram em aproximadamente 6 ng/ml após 1 hora de incubação, correspondendo à ativação de < 1% do C5 disponível. No entanto, o dito aumento foi reproduzível e inibido por titulação com ARC 658 (SEQ ID NO: 62). Como mostrado na Figura 17, 300 nM - 400 nM de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) foram suficientes para alcançar 99% de inibição de ativação de C5, um nível que é aproximadamente equivalente ou relativamente menos do que a concentração molar de C5 no sangue. Embora não seja desejado estar ligado a qualquer teoria, embora menos aptâmero seja necessário para se obter 99% de inibição de ativação de C5 130 ΕΡ1850880Β1 no presente modelo do que no modelo de zimosan, a dita observação pode refletir as diferenças substanciais no estimulo de complemento - ativação usado nos dois testes. A geração de C3a foi também monitorizada como um controlo para se verificar que ARC 658 (SEQ ID NO: 62) não bloqueou as etapas de ativação mais precocemente do que C5 na cascata de complemento. Os níveis de C3a aumentaram aproximadamente 4.000 ng/ml após 1 hora de incubação, correspondendo à ativação em torno de 10% do C3 disponível. Diferente da geração de C5a, pouca inibição dependente de dose da geração de C3a foi observada com a titulação com
ARC 658 (SEQ ID NO: 62) demonstrando que ARC 658 (SEQ ID NO: 62) bloqueia especificamente a clivagem de C5.
O estudo de modelo de alça de tubo foi repetido com o aptâmero anti-C5 ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) . O ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) foi diluído em série em 0,9% de salina para
gerar séries de amostras 20X cobrindo um intervalo de 10 vezes o das concentrações de aptâmero (10 nM - 1000 nM final no teste). As amostras contendo aptâmero irrelevante (ARC 127) foram incubadas para controlar os efeitos não específicos do oligonucleótido. Uma amostra sem aptâmero (apenas salina) foi também incluída como controlo negativo. As amostras de um único dador de sangue foram retiradas por métodos de flebotomia padrão a partir de voluntários internos. Sangue total foi obtido a partir de 5 dadores separados diretamente numa seringa de 60 ml (Becton-Dickinson, (Franklin Lakes, NJ) , cat. # 309653) e imediatamente cotados em bivalirudina (20 μΜ final) (Prospec-Tany Technogene Ltd., (Israel), lot # 105BIV01) +/- aptâmero. O anticoagulante bivalirudina, um inibidor direto de trombina, foi usado em vez de heparina que interfere com a ativação de complemento. O modelo de alça de tubo foi realizado essencialmente 131 ΕΡ1850880Β1 como descrito imediatamente acima. Secções de -300 mm de tubo (diâmetro de 1/4", volume -9 ml) foram preenchidos com 5 ml de amostras de sangue/aptâmero/bivalirudina imediatamente após o sangue ter sido colhido do dador. Os tubos foram então firmemente fixados em alças com secções curtas (~ 50 mm) de tubo de ligação de silicone, produzindo um volume de gás de -4 ml. As alças de tubo foram giradas verticalmente em 32 rpm durante a incubação a 37 °C num banho de água por 1 hora. Após incubação, todos os 5 ml de amostra foram transferidos a um tubo cónico de 15 ml (Corning, (Corning, NY) , cat. # 430766) contendo 100 pL de 0,5 M EDTA, proporcionando uma concentração final de EDTA de 10 mM. 1 ml de sobrenadante plasmático foi colhido a partir de cada uma das amostras arrefecidas em seguida da centrifugação (Eppendorf Centrifuge 5804) a 4°C (3,300 rpm, 20 minutos). Os sobrenadantes foram rapidamente congelados em azoto liquido e armazenados a -20°C. para o controlo da ativação de fundo, uma amostra pré-CPB foi preparada ao se adicionar 5 ml de sangue fresco diretamente ao tubo cónico de 15 ml em gelo contendo 100 pL de 0,5 M de EDTA. Esta amostra foi processada para plasma e armazenada como acima descrito. A extensão de ativação de C5 foi determinada a partir dos niveis relativos de C5a gerados em cada amostra ativada, como medido pelo ELISA C5a como descrito imediatamente acima. O ELISA C5a foi realizado em amostras de plasma não diluídas de acordo com o protocolo do kit ELISA e os níveis de amostra de C5a foram quantificados por comparação com os padrões de C5a proporcionados pelo fabricante. O percentual de inibição da geração de C5a em cada concentração de aptâmero foi calculado usando a equação: % de inibição = 100-100 X (C5aamostra - C5apré-cPB) / (C5aapenas salina — C5apr^-Qpg) . Os valores de IC50 foram determinados a partir de um gráfico de% de inibição com 132 ΕΡ1850880Β1 relação a [ARC 1905] usando a equaçao% de inibição = (% de inibição) máximo X [ARC 19 0 5 ] n / (IC50n + [ARC 1905] n) + fundo. Os valores de IC90 e IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as equações IC90 = IC50 x [90/(100-90 ] 1/n e IC99 = IC50 x [99/ (100-99] 1/ri. A extensão de ativação de C3 foi determinada a partir dos niveis relativos de C3a gerados em cada amostra ativada, como medido por ELISA C3a imediatamente descrito acima. Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controlos de apenas salina e pré-CPB) foram diluídas em série em 0,9% de salina. O ELISA C3a é mais sensível do que para C5a; portanto, uma diluição de 1/5000 foi necessária para acomodar o intervalo de concentrações de C3a. Os níveis de amostra de C3a foram quantificados em comparação aos kits padrões, e% de inibição foi calculado como descrito para C5a. Os dados foram analisados usando Microsoft Excel, e valores médios de percentual de inibição foram traçados usando Kaleidagraph (v. 3.51, Synergy
Software) . Os valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinados usando o plug-in XLfit 4.1 para Excel.
Os efeitos médios de ARC 1905 e do aptâmero irrelevante, ARC 127, na ativação de complemento em cinco dadores são resumidos na Figura 66. Como mostrado na Figura 67 o bloqueio completo da ativação de C5, como refletido na geração de C5a, foi alcançado com < 500 nM de ARC 1905, embora o aptâmero relevante não tenha apresentado efeito inibitório em cerca de 1 μΜ. Os valores médios de IC50, IC90 e IC99 do sangue total médio foram de 119 ± 28,6 nM, 268 ± 39,2 nM e 694 ± 241 nM, respetivamente (Figura 66). Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é razoável se assumir que ARC 1905 seja excluído do volume sanguíneo celular, que compreende aproximadamente 45% do total. Os valores de IC50, IC90 e IC99, ajustados para refletir a 133 ΕΡ1850880Β1 inibição de C5 no plasma, portanto, foram de 216 ± 52,0 nM, 487 ± 71 nM e 1261 ± 438 nM. Estes valores são consistentes com os parâmetros calculados para a inibição de ARC 1905 da ativação de complemento induzida a zimosan no soro sugerindo que os componentes do sangue celular não interferem de forma significativa com a atividade anti-C5 de ARC 1905. A geração de C3a não foi inibida por ARC 1905 ou pelo aptâmero irrelevante em até 1 μΜ. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, isto sugere que o ARC 1905 nem inibe a reação de convertase de C3, nem bloqueia outras etapas que contribuem para a ativação de cascata alternativa tal como o conjunto de deposição de C3 e convertase. EXEMPLO 2
Seleções e Sequências De Novo
Seleção de C5 com grupo dRmY
Duas seleções foram realizadas para identificar os aptâmeros dRmY para proteína C5 de comprimento total humana. A proteína C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA ou Advanced Research Technologies, San Diego, CA) foi usada na forma de comprimento total ("FL") e na forma parcialmente tripsinizada ("TP") e ambas as seleções foram seleções diretas contra os alvos de proteína que foram imobilizados numa placa hidrófoba. Ambas as seleções produziram grupos significativamente enriquecidos para ligação de C5 de comprimento total com relação ao grupo não selecionado simples. Todas as sequências mostradas no presente exemplo são mostradas de 5' a 3'.
Preparação de Grupo: um modelo de ADN com sequência TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN (30) GGTCG 134 ΕΡ1850880Β1
ATCGATCGATCATCGATG (ARC 520; SEQ ID NO: 70) foi sintetizado usando um sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™, e desprotegido por métodos padrão. Os modelos foram amplificados com iniciador 5' T AAT ACGAC T CAC T AT AGGGAGAGGAGAGAAC GT T C T AC (SEQ ID NO: 71) e iniciador 3' CATCGATGATCGATCGATCGACC (SEQ ID NO: 72) e então usados como o modelo para a transcrição in vitro com polimerase de T7 ARN simples. As transcrições foram usadas usando 200 mM HEPES, 40 mM DTT, 2 mM
espermidina, 0,01% Triton X-100, 10% PEG-8000, 9, 5 mM
MgCl2, 2,9 mM MnCl2, 2 mM NTPs, 2 mM GMP, 2 mM de espermina, 0,01 unidades/yL de pirofosfatase inorgânica, e polimerase Y639F simples de mutante T7.
Seleção: na ronda 1, uma etapa de seleção positiva foi conduzida em colunas de ligação de filtro de nitrocelulose. Em suma, 1 x 1015 moléculas (0,5 nmol) de ARN agrupado foram incubadas em 100 yL de tampão de ligação (IX DPBS) com 3 uM de C5 de comprimento total ou 2,6 uM de C5 parcialmente tripsinizada por 1 hora a temperatura ambiente. Complexos de ARN:proteína e moléculas de ARN livres foram separadas usando 0,45 um de colunas de centrifugação de nitrocelulose oferecida pela Schleicher & Schuell (Keene, NH). As colunas foram pré-lavadas com 1 ml de IX DPBS, e então as soluções contendo ARN:proteína foram adicionadas às colunas e centrifugadas numa centrífuga a 1500 g por 2 minutos. Três lavagens com 1 ml de tampão foram realizadas para remover ligações não específicas a partir dos filtros, então os complexos de ARN:proteína fixados aos filtros foram eluídos duas vezes com lavagens de 200 yL de tampão de eluição (7 M de uréia, 100 mM de acetato de sódio, 3 mM de EDTA, preaquecido a 95°C) . O ARN eluído foi precipitado (2 yL de glicogénio, 1 volume de isopropanol, ^ de volume de etanol) . O ARN foi transcrito em reverso com o sistema ThermoScript RT-PCR™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante, 135 ΕΡ1850880Β1 usando iniciador 3' descrito acima SEQ ID NO: 72, seguido de amplificação de PCR (20 mM Tris pH 8,4, 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,5 μΜ iniciadores SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, 0,5 mM cada dNTP, 0,05 unidades/pL de Taq polimerase (New England Biolabs, Beverly, MA) ) . Os modelos de PCR foram purificados usando colunas Centricep (Princeton Separations, Princeton, NJ) e usados para transcrever o próximo grupo de ronda.
Em rondas subsequentes de seleção, a separação de ARN ligado e livre foi realizada em placas hidrofóbicas Nunc Maxisorp (Nunc, Rochester, NY). A ronda foi iniciada ao se imobilizar 20 pmol tanto de C5 de comprimento total como C5 tripsinizada à superfície d aplaca por 1 hora a temperatura ambiente em 100 pL de IX DPBS. O sobrenadante foi então removido e os poços foram lavados 4 vezes com 120 pL de tampão de lavagem (IX DPBS). Os poços de proteína foram então bloqueadas com um tampão IX DPBS contendo 0,1 mg/ml de ARNt de levedura e 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão como competidores. A concentração do grupo usada foi sempre pelo menos um excesso de cinco vezes a da concentração de proteína. O grupo de ARN foi também incubado por 1 hora a temperatura ambiente em poços vazias para remover quaisquer sequências de ligação plásticas, e então incubadas numa poço bloqueada sem proteína para remover do grupo quaisquer sequências de ligação do competidor antes da etapa de seleção positiva. O ARN do grupo foi então incubado por 1 hora a temperatura ambiente e o ARN ligado ao C5 imobilizado foi reverso transcrito diretamente na placa de seleção pela adição de RT mix (iniciador 3', SEQ ID NO: 72 e Thermoscript RT, Invitrogen) seguido de incubação a 65°C por 1 hora. O ADNc resultante foi usado como o modelo para PCR PCR (Taq polymerase, New England Biolabs). O ADN modelo de grupo amplificado foi dessalinizado com coluna Centrisep (Princeton Separations) de acordo com as condições 136 ΕΡ1850880Β1 recomendadas pelo fabricante e usado para programar a transcrição do ARN de grupo para a próxima ronda de seleção. 0 grupo transcrito foi purificado por gel em gel de poliacrilamida a 10% a cada ronda. 0 progresso da seleção foi monitorizado usando um teste de ligação de filtro sanduíche (dot blot) . O grupo ARN 5'-32P-marcado (concentração de traço) foi incubado com C5, IX DPBS plus 0,1 mg/ml de ARNt e 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão, por 30 minutos a temperatura ambiente, e então aplicado a um sanduíche de filtro de nitrocelulose e náilon num aparelho dot blot (Schleicher e Schuell). O percentual de ARN em grupo ligado à nitrocelulose foi calculado e monitorizado aproximadamente a cada 3 rondas com uma tela de ponto único. ( + /- 300 nM C5) . As medições do grupo Kd foram realizadas usando uma titulação de proteína e de um aparelho de dot blot como acima descrito.
Dados de Seleção: ambas as seleções foram enriguecidas após 10 rondas sobre o grupo naive. Veja-se Figura 18. Na ronda 10, o grupo Kd foi de aproximadamente 115 nM para o comprimento total e de 150 nM para a seleção tripsinizada, mas a extensão da ligação foi de apenas cerca de 10% no platô em ambos. Os grupos R10 foram clonados usando o kit de clonado TOPO TA (Invitrogen) e sequenciados.
Informação de Sequência: 45 clones a partir de cada grupo foram sequenciados. 0 grupo de RIO de comprimento total foi dominado por um único clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) que constitui 24% do grupo, 2 conjuntos de duplicatas e sequências simples constituíram o restante. O grupo RIO tripsínizado conteve 8 cópias da mesma sequência ARC 913 (SEQ ID NO: 75), mas o grupo foi dominado por outra sequência (AMX221.A7; 46%). O clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) era dotado de uma Kd de cerca de 140 nM e a extensão da 137 ΕΡ1850880Β1 ligação foi a 20%. Veja-se Figura 19. A seguência individual relacionada no guadro 5 é relacionada na direção de 5' para 3' , e representa a seguência de ribonucleótido do aptâmero que foi selecionado sob as condições proporcionadas de dRmY SELEX™. Nas formas de realização da presente invenção derivadas a partir da dita seleção (e como refletida na listagem de sequências) as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-OMe. A sequência relacionada no quadro 5 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3'-invertido). A sequência única do aptâmero a seguir se inicia no nucleótido 23, imediatamente em seguida da sequência fixa GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 73), e vai até que encontra a sequência de ácido nucleico 3' fixa GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (SEQ ID NO: 74) .
Quadro 5: Sequência de nucleótido do aptâmero C5 dRmY ARC 913 (SEQ ID NO: 75)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGG
UCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
Ensaio de Hemólise: o efeito de ARC 913 (SEQ ID NO: 75) na via clássica do sistema complemento foi analisado usando o teste de hemólise anteriormente descrito, comparado tanto ao ARC 186 (SEQ ID NO: 4) (aptâmero anti-C5, controlo positivo) e o grupo dRmY não selecionado (controlo negativo). No ensaio de inibição hemolítica, uma solução de 0,2% de soro humano total foi misturado com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Test, Diamedix Corporation, Miami, FL) na presença de ARC 913 (SEQ ID NO: 75) titulado. O ensaio foi realizado em salina tamponada a veronal contendo cálcio, magnésio e gelatina a 1% (GVB++ de tampão complemento) e 138 ΕΡ1850880Β1 incubado por 1 hora a 25°C. Após a incubação as amostras foram centrifugadas. A densidade ótica a 415 nm (DO 415) do sobrenadante foi lida. A inibição da atividade de hemólise é expressa como% de atividade de hemólise em comparação ao controlo. Veja-se Figura 20. A IC50 do aptâmero foi calculada ser cerca de 30 nM. EXEMPLO 3
Composição e Otimização de Sequência
Exemplo 3A: Minimização de ARC 913:
Seis construções com base em ARC 913 (SEQ ID NO: 75) foram transcritos, purificados em gel, e testados em dot blots para a ligação a C5. ARC 954 foi similar ao clone parental com uma Kd de 130 nM e extensão de ligação a 20%, enquanto ARC 874 (SEQ ID NO: 76) foi o único outro clone que se ligou a C5 com a Kd de 1 uM.
As sequências individuais relacionadas no quadro 6 são relacionadas na direção de 5' a 3' e foram derivadas a partir dos aptâmeros que foram selecionadas sob as condições proporcionadas de dRmY SELEX. Nas formas de realização da invenção derivadas a partir da presente seleção (e como refletido na listagem de sequência) as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e G) são 2'-OMe. Cada uma das sequências relacionadas no quadro 6 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3'-invertido).
Quadro 6. Sequências de nucleótidos de clones de ARC 913 minimizados. ARC 874 (SEQ ID NO: 76)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG ARC 875 (SEQ ID NO: 77) 139 ΕΡ1850880Β1 CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG ARC 876 (SEQ ID NO: 78) GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC ARC 877 (SEQ ID NO: 79) GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC ARC 878 (SEQ ID NO: 80) GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC ARC 954 (SEQ ID NO: 81)
CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG
Exemplo 3B: Otimização de ARC 913: Re-seleção aditivada
De modo a tanto otimizar o clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) para a afinidade de ligação a C5 como para determinar os elementos chave, uma re-seleção aditivada foi conduzida. As re-seleções aditivadas são usadas para explorar as necessidades de sequência dentro de um clone ativo ou minimizador. As seleções são realizadas com um grupo sintético degenerado que foi projetado com base numa sequência única. 0 nivel de degeneração em geral varia de 70% a 85% de nucleótido do tipo selvagem. Em geral, as mutações neutras são observadas mas em alguns casos de mudanças de sequência pode resultar em aprimoramentos com relação a afinidade. A informação de sequência compósita pode então ser usada para identificar o motivo de ligação mínimo e ajudar nos esforços de otimização.
Preparação de grupo: Sequência do modelo taat acgact cactat aGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN pó) GTTACGACTAG CATCGATG (SEQ ID NO: 82) se baseou em ARC 913 (SEQ ID NO: 75) e foi sintetizada com cada resíduo originando a partir da região aleatória aditivada a um nível de 15%, isto é, em cada posição aleatória ("N"), o resíduo apresenta uma chance de 85% de ser o nucleótido encontrado na sequência 140 ΕΡ1850880Β1 de tipo selvagem CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG (SEQ ID NO: 83) e 15% de chance de ser um dos outros três nucleótidos. 0 modelo e o grupo de ARN para a re-seleção aditivada foram preparados essencialmente como acima descrito. Os modelos foram amplificados com os iniciadores taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 84) e CATCGATGCTAGTCGTAAC (SEQ ID NO: 85). As duas seleções foram realizadas com C5 de comprimento total, uma seleção usando uma concentração mais elevada de sal na etapa de lavagem. 0 protocolo de seleção foi realizado como acima descrito, com duas exceções: 1) ronda 1 foi realizada em placas hidrofóbicas (assim como todas as etapas subseguentes) com apenas uma etapa positiva; e 2) não foi usado nenhum competidor durante a seleção. A concentração de C5 e a concentração do grupo de ARN foi mantida constante a 200 nM e 1 uM, respetivamente.
Dados de re-seleção aditivada. Tanto a seleção normal como a com alto teor de sal foram enriguecidas após 5 rondas sobre o grupo simples. Na ronda 5 o grupo Kd foi de aproximadamente 165 nM para a seleção de alto teor de sal e de 175 nM para a seleção normal de sal. A extensão de ligação foi de cerca de 20% no platô em ambas. Os grupos R4 foram clonados usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), e 48 clones de cada grupo foram sequenciados. 12 clones de cada grupo foram transcritos e testados num teste de dot blot de ponto único a 500 nM de C5. As constantes de dissociação (Kds) foram mais uma vez medidas usando o teste de dot blot anteriormente descrito. Kds foi estimado para os 11 melhores clones identificados na tela de ponto único, ao se adaptar os dados da equação: fração de ARN ligado = amplitude*Kd/ (Kd + [C5]). Os clones com os três melhores Kds foram SEQ ID NO: 91 (73 nM) , SEQ 141 ΕΡ1850880Β1 ID NO: 96 (84 nM) e SEQ ID NO: 95 (92 nM) . As sequências para os ditos 11 clones estão relacionadas a seguir no quadro 7.
As sequências relacionadas no quadro 7 são relacionadas na direção de 5' para 3' e representam as sequências de nucleótidos do aptâmero que foram selecionadas sob as condições proporcionadas por dRmY SELEX™. Nas formas de realização da invenção derivadas a partir da presente seleção (e como refletido na listagem de sequências), as sequências correspondentes que compreendem as combinações dRmY dos resíduos, como indicado no texto, onde as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-OMe. Cada uma das sequências listadas no quadro 7 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3'-invertido). As sequências únicas de cada aptâmero a seguir se iniciam no nucleótido 23, imediatamente em seguida da sequência 5' fixa GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 86), e vai até encontrar a sequência de ácido nucleico 3' fixa GUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 87).
Quadro 7. Sequências de Nucleótidos de Clones a partir de 142 CO Tf
Re-seleção Aditivada
QQ O 00 00 O LO 00 CL LU O o o O o d o d d d d C o z o C C C c o O D c z o o o o d O C o c o o o o c d O o o d d d d o C O d z o C C C c u U D C c z o o o o d O C o o c o o o o c C O o o o C C C c o d O C c o D D D D o u C D z c o o o o c c c d O o z c c c c d o d o C c o o o o o o o o c O o c o o o o <1 <1 <1 o O o o c c c c o d o o C c o d d d d o d o c d z c d d d d c o c d d z z o o o o d o d d o o z o d o o d o d o o o o o o o o o o o o o z o d d d d o o o o d z o C C C c o o o d C c z o o o o d o d C o z c o o o d c d c C o o o d d d d o C o o d z o o o o c o o o o o z z o d o o d d o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o C C C c c c c C c o c o o o o o o o o o o o o o o o o o o c o o o υ υ υ υ υ υ υ υ υ υ υ c c c c c c c c c z c d d d d d d d d d z z C C C C C o C C C o c o o c D o o o o z o z c c c C c o c c c c c d d d d d c d d d z z C C c c C c c C c c c o o o o o o o o o o o o o o o o o o d o o o o o o o o o o o o c o c c c C c c c d c c c o o o O o o o o o o o c c c O o c c C z c c o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o d d d d d d d d z z z d d d d d o d d z o z d d d d d d d o z z z o o o o o D o o o o o o o o o o o o C o z o d d d d d d d d z z z d d d d d d d d z z z o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o C C C C C c C C c c c d d d d d d d d z z z u o o u u u u o u o u d d d d d d d d z z z d d d d d d d d z z z o o o o o o o o o o o o o ____ o o o o o o o o o 00 C o\ C o C rH C OJ C 00 C C IO C <£> c I" c 00 c 00 C 00 C σ\ C (Λ C (Λ C (Λ C (Λ C (Λ C σ\ c (Λ c (Λ c o o o o o o o o o o o • · C • · C • · C • · C • · C • · C • · C • · C • · c • · c • · c O o o o o o o o o o O o o o o o O o o o o o Z C z C z C z C z C z c z C z C z c z c z c o o o o o o o o o o o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o Ω o H c H c H c H c H c H c H c H c H c H c H c o o o o o o o o o o o cm c cm c CM c CM c CM c CM c CM c CM c CM c CM c CM c a o a o H o u o u o U o u o u o U o u o u o W o w o W o w o w o W o w o w o W o w o w o — o — o — o — o — o — o — o — o — o — o — o ΕΡ1850880Β1
Exemplo 3C: Modificação PEG ramificado de 40 kDa de ARC 186 O oligonucleótido 5' NH2- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGnWnGfUfCfUmGmAmGfU-fUfUAfCfCfUmGfCmG-3T -3' (ARC672, SEQ ID NO: 63) foi sintetizado num sintetizador de ADN Expedite (ABI, Foster City, CA), de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante usando o padrão comercialmente oferecido ARN 2'-OMe e ARN 2'-F e fosforoamiditas de ARN protegidos por TBDMS (Glen Research, Sterling, VA) e um suporte CPG de desoxitimidina invertida. A função amina terminal foi fixada com o modificador 5'-amino, 6-(Trifluoroacetilamino) hexil-(2-cianoetil)- (N,N-diisopropil)-fosforamidita, C6- TFA (Glen Research, Sterling, VA) . Após a desproteção, os oligonucleótidos foram purificados por cromatografia de troca de ião em resina Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences) e precipitados com etanol. O aptâmero modificado a amina foi conjugado em diferentes frações PEG pós-sinteticamente. O aptâmero foi dissolvido numa solução de água/DMSO (1:1) a uma concentração entre 1,5 mM e 3 mM. Tampão carbonato de sódio, pH 8,5 foi adicionado a uma concentração final de 100 mM, e o oligo foi reagido durante a noite com um excesso molar de 1,7 do reagente PEG desejado (por exemplo, éster carbonato de p-nitrofenilo ARC 1905 40 kDa Sunbright GL2-400NP [NOF Corp, Japão], ou éster mPEG2-NHS ARC 187 de 40 kDa [Nektar, Huntsville AL]) dissolvido num volume igual de acetonitrilo. Os produtos resultantes foram purificados por cromatograf ia de permuta de ião em resina Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences), e dessalinizados usando cromatografia de fase reversa realizada em resina
Amberchrom CG300-S (Rohm e Haas), e liofilizados. A estrutura de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) é mostrada na Figura 21 enquanto a estrutura de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) é mostrada na Figura 22. 144 ΕΡ1850880Β1 EXEMPLO 4
Modelo de Coração Perfuslonado Isolado
Exemplo 4A: Prova de Princípio com ARC 186 A concentração média do componente complemento C5 no plasma humano é de aproximadamente 500 nM. Com a exposição de corações de ratinhos isolados perfusionados com tampão Krebs Heinseleit a 6% de plasma humano, a cascata de complemento humana é ativada, levando à clivagem de C5 em C5a e C5b. O componente C5b subsequentemente forma um complexo com os componentes complemento C6, C7, C8 e C9 também conhecidos como o "complexo de ataque à membrana" ("MAC" ou C5b-9) que danifica os vasos sanguíneos cardíacos e os miócitos cardíacos, levando assim à disfunção miocárdica (pressão diastólica final aumentada, arritmias) e assistolia (Evans et al., Molecular Immunology, 32, 1183 - 1195 (1995)). Antes, os anticorpos de cadeia monoclonal e simples que bloqueiam a clivagem de C5 humana (Pexelizumab ou uma versão de cadeia simples de Pexelizumab scFv) foram testados no presente modelo e mostraram exibir danos e disfunção miocárdicos (Evans et al., 1995). O dito modelo foi usado para estabelecer o aptâmero de bloqueio de C5 ARC 186 (SEQ ID NO: 4), como o Pexeluzimab, inibiu o dano de complemento mediado a C5 humano nos corações isolados de ratos com perfusão. Ratinhos C57 Bl/6 foram adquiridos da Charles River Laboratories, (Wilmington, MA). Em suma, em seguida à indução de anestesia profunda, cada coração de ratinho foi removido e montado numa agulha cega inserida na aorta, através da qual o coração foi continuamente perfusionado com tampão Krebs Heinseleit. O transdutor de pressão (Mouse Specifics, Boston, MA) foi inserido no ventrículo esquerdo permitindo 145 ΕΡ1850880Β1 o movimento contínuo dos batimentos cardíacos e a pressão intraventricular. Após um período de 15 minutos de equilíbrio durante o qual as medições de linha basal foram obtidas, os corações foram subsequentemente perfusionados com tampão e 6% de plasma humano +/- aptâmero em diversas concentrações (veja-se Figura 23) . Durante estes estudos e como descrito em Evans et al., foi demonstrado que os corações que foram perfusionados com tampão Krebs Heinseleit + 6% de plasma humano, experimentaram falha dentro de 5 minutos de adição de plasma ao perfusionado, enquanto que os corações que foram continuamente perfusionados só com tampão continuaram a bater por mais duas horas. Consequentemente, a duração de cada experiência foi arbitrariamente definida como 15 minutos. 0 delineamento do presente estudo com ARC 186 é apresentado na Figura 23. A pressão intraventricular foi monitorizada e registada continuamente resultando num traçado de onda de pressão (Figuras 24 e 25) . 0 ponto de bypass mais baixo representa o final da pressão diastólica ("EPD") e o ponto de bypass mais elevado representa a pressão sistólica ("SP"). As ondas de pressão basal aparecem à esquerda da linha preta vertical marcada "0" mostrada em cada traçado. Como anteriormente publicado (Evans et al., 1995), os corações perfusionados com 6% de plasma humano experimentaram um rápido aumento na pressão diastólica final ventricular esquerda, por último, culminando em assistolia (parada cardíaca) dentro de 5 minutos (Figura 24). Quando o aptâmero irrelevante foi adicionado ao plasma humano num excesso molar de 50 vezes, EDP aumentada e a assistolia foram também observadas (Figura 24).
Quando ARC 186 foi adicionado ao sistema em equivalente molar, houve também um aumento precipitado na 146 ΕΡ1850880Β1 EDP, culminando e assistolia (Figura 25). Em todos os três grupos de corações gue experimentaram danos mediados por complemento, maior EDP e assistolia, o coração ficou visivelmente edematoso e túrgido no final da experiência. Quando ARC 186 foi adicionado ao plasma num excesso molar de 10 vezes a 50 vezes (Figura 25) , as ondas de pressão ventricular permaneceram normais e não foi observado assistolia. Além disso, o edema e turgidez anteriormente descritos não foram aparentes nestes grupos.
Durante cada experiência, a freguência cardíaca para o grupo durante cada intervalo foi traçada em gráficos. Como mostrado na Figura 26, os corações perfusionados sem aptâmero ou com aptâmeros irrelevantes desenvolveram assistolia rapidamente, em geral dentro de 5 minutos. ARC 186 adicionado ao sistema em eguivalência molar retardou relativamente a instalação da assistolia. Os corações neste grupo acabaram, entretanto por falhar. ARC 186 adicionado ao plasma num excesso molar de 10 vezes ou de 50 vezes preservou a frequência cardíaca pela duração de cada experiência. O aumento percentual no peso do coração sobre a linha basal foi calculado para uma amostra representativa de falhas cardíacas (no aptâmero ou um excesso molar de 50 vezes do aptâmero irrelevante) e comparado aos corações protegidos com ARC 186 (excesso molar de 10 vezes e de 50 vezes de ARC 186). Como mostrado na Figura 27, os corações protegidos com ARC 186 ganharam significativamente menos peso do que os corações que falharam nos grupos de controlo.
Em virtude do ARC 186 inibir a C5 mas não a clivagem de C3, os produtos de clivagem de C3 (C3a) nas não os produtos de clivagem de C5 (C5a ou C5b) devem ser 147 ΕΡ1850880Β1 encontrados no efluente que flui a partir dos corações isolados protegidos por ARC 186. Para se mostrar diretamente que ARC 186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano, níveis relativos de proteínas complemento C5a e C5b (produtos de clivagem de C5) e C3a (um produto de clivagem de C3) foram medidos num efluente de tampão a partir de diversos grupos dos kits ELISA comercialmente oferecidos (kit ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA; kit ELISA C5a e C3a, BD Biosciences, San Diego, CA) . 0 ARC 186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano e a produção de C5a (Figura 28) e C5b-9 (Figura 29) numa maneira dependente de dose. De forma diferente, o ARC 186 não apresentou efeito na clivagem de C3 humano em C3a e C3b (Figura 30) adicionalmente demonstrando que a especificidade para C5 da molécula.
Uma vez gerados, os fragmentos C3b e C5b de complemento são depositados localmente em tecidos nas vizinhanças do campo de ativação de complemento. Em seguida da conclusão das experiências, os corações de ratinhos foram congelados em meio OCT (Sakura Finetelc, Torrance, CA) , seccionados e então corados usando imunohistoquímica padrão para a presença de C3b humano (clone Hll, Chemicon, Temecula, CA), C5b-9 humano (clone aEll, DAKO, Carpintería, CA) . Ou o controlo IgG de ratinho (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . Os resultados do estudo são apresentados na Figura 31.
Como descrito no presente estudo, o aptâmero de bloqueio de C5 ARC 186 foi testado num modelo in vivo de danos a tecidos mediados por complemento de componente C5 que usa corações isolados de ratinhos perfusionados com tampão de Krebs Heinseleit e 6% de plasma humano heparinizado, com base no modelo descrito num estudo anteriormente publicado que testou os efeitos do anticorpo 148 ΕΡ1850880Β1 anti-C5, Pexeluzimab no sistema complemento (Evans, Molecular Immunol 32:1183, (1995). Usando este modelo, foi demonstrado que o aptâmero de bloqueio de C5 (a) inibiu a clivaqem de C5 de plasma humano (mas não de C3), (b) inibiu a deposição de C5b humano (mas não de C3b) em tecido cardíaco de rato e (c) inibiu a disfunção miocárdica mediada por C5b-9 humano em concentrações clinicamente relevantes (5 μΜ, um excesso molar de 10 vezes do aptâmero vs. C5) . Os ditos dados mostram que quando a cascata de complemento humana é ativada de modo fisiologicamente relevante, os aptâmeros de bloqueio de C5 são capazes de inibir a clivagem de C5 plasmático e evitar os danos e a disfunção miocárdica.
Exemplo 4B: Eficácia do Aptâmero PEGilado
Os materiais e métodos usados no presente estudo foram exatamente os mesmos descritos no Exemplo 4B acima. O desenho experimental e os resultados são apresentados na Figura 32. A primeira metade da experiência usou plasma humano heparinizado (Center for Blood Research, Harvard Medicai School, Boston, MA) como a fonte de complemento e a segunda metade usou plasma de macaco cinomolgus heparinizado (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) como a fonte de complemento. Um aptâmero PEGilado (ARC 658; SEQ ID NO: 62) foi adicionado ao sistema em proporções molares crescentes. Embora todos os traçados de pressão ventricular relevante tenham sido colhidos, o quadro relaciona a presença ou a ausência de um aumento na pressão diastólica final (EDP), se ou não ocorreu assistolia e o tempo até que o coração falhou (definido como a presença de um EDP elevada e assistolia).
Durante as experiências com plasma humano, a dose ideal de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) foi determinada como sendo 149 ΕΡ1850880Β1 a equivalência molar (500 nM) enquanto que durante os experiências com plasma de primata não humano, um excesso molar de 50 vezes (25 μΜ) foi necessário para proteger o coração de danos mediados por C5b (veja-se Figura 32).
Os ditos dados são consistentes com a diferença de afinidade do aptâmero anti-C5 para o C5 de humano com relação ao de primata não humano indicada pelos dados in vitro. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, durante nosso estudo subsequente com PK/PD de macaco cinomolgus descrito no exemplo 5, adicionalmente foi demonstrado que um excesso molar de 30 vezes do aptâmero foi necessário para inibir a clivagem de C5 plasmático mediada por zimozan, adicionalmente suportando a noção de que o aptâmero se liga ao C5 de primata com menor afinidade do que ao C5 humano.
Coletivamente, estes estudos indicam que ambos os aptâmeros ARC 186 (SEQ ID NO: 4) e em maior extensão ARC 658 (SEQ ID NO: 62) são eficazes no modelo de coração de rato isolado perfusionado. O dito modelo demonstra também que significativamente mais ARC 658 (SEQ ID NO: 62) teve que ser usado para inibir o dano cardíaco mediado a C5 em plasma de macaco cinomolgus (excesso molar de 30+), em comparação com o dano cardíaco mediado a C5 humano (equivalente molar), adicionalmente suportando os dados in vitro que indicaram que o aptâmero apresentava afinidade mais baixa para o C5 de primata. Finalmente, estes dados indicaram que os macacos cinomolgus precisam ser dosados além de um excesso molar de 30 vezes de modo a demonstrar in vivo o bloqueio de C5 durante os estudos de PK/PD. 150 ΕΡ1850880Β1 EXEMPLO 5
Metabolismo de Fármaco & Farmacocinética de Aptâmeros anti-C5 em Animais
Nos Exemplos 5A - 5G, todos os dados de concentração baseados em massa referem-se apenas ao peso molecular da porção de oligonucleótido do aptâmero, não são relativos à massa conferida pela conjugação de PEG.
Exemplo 5A: Estabilidade metabólica do Inibidor de C5 ARC 186 em plasma de primatas e de ratos 0 precursor de oligonucleótido não PEGilado dos aptâmeros (isto é, ARC 186; SEQ ID NO: 4) foi testado em plasma de rato e de macaco cinomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) de modo a avaliar sua estabilidade, padrão cinético, e vias de degradação. 0 teste foi realizado usando a extremidade 5' radiomarcada (32P) do aptâmero incubado a 37°C em 95% plasma agrupado (citratado) no decorrer de 50 h. A certos intervalos selecionados, frações de plasma contendo aptâmero foram retiradas, imediatamente rapidamente congeladas em azoto liquido, e armazenadas a -80°C. A deteção e a análise do aptâmero e seus metabólitos em plasma foram obtidas usando extração de liquido liquido (fenol-clorofórmio) seguida por eletroforese de gel (num gel de poliacrilamida desnaturante a 10%) e autorradiografia de alta resolução. A Figura 33 mostra um gráfico log-linear do percentual restante do comprimento total do aptâmero como uma função do tempo de incubação tanto em plasma de rato como de macaco cinomolgus. O perfil de degradação em ambas as espécies parece ser essencialmente monofásico, com uma proporção constante de k - 0,002 hr^1. 151 ΕΡ1850880Β1
Exemplo 5B: Farmacocinética de ARC 657, ARC 658 e ARC 187 na subsequente administração intravenosa em ratos.
Para avaliar o perfil farmacocinético de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5), e para estimar a dosagem e a sua frequência necessária a primatas e humanos, o estudo da farmacocinética foi conduzido em ratos Sprague-Dawley cateterizados (Charles River Labs, Wilmington, MA) . Aptâmeros foram formulados para injeção a 10 mg/ml (peso oligo) em solução salina padrão filtrada e esterilizada (0,2 pm) num frasco de dosagem pré-esterilizado em condições assépticas. A via de administração usada para o estudo em ratos foi a de bolus intravenoso pela via de veia da cauda numa dose de 10 mg/kg. Os grupos de estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram retiradas várias amostras de sangue pré-dosagem a intervalos selecionados no decorrer de 48 horas. O projeto do estudo está esboçado na Figura 34. Amostras de sangue foram obtidas através de implante cirúrgico de cateter na veia jugular, transferidas diretamente para tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão, e colocadas em gelo até o processamento para obtenção de plasma. O plasma foi colhido por centrifugação dos tubos sangue-EDTA a 5000 rpm por 5 minutos e o plasma sobrenadante foi transferido para um novo tubo pré-marcado. As amostras de plasma foram estocadas a -80°C até o momento da análise. A análise das amostras de plasma para ARC 187 foi obtida através da utilização de material de análise homogéneo utilizando a adição direta de frações de plasma ao material de análise contendo o reagente fluorescente detetor de ácido nucleico comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR) . Depois de um breve período de incubação (5 min) à temperatura ambiente, 152 ΕΡ1850880Β1 protegido da luz, as lâminas do material de análise foram lidas por um leitor de lâmina fluorescente (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). 0 sinal fluorescente de cada fonte era proporcional ã concentração do aptâmero na fonte, e amostras das concentrações foram calculadas pela interpolação dos valores de fluorescência a partir de uma curva padrão de concentração de fluorescência (valores médios de curvas duplicadas ou triplicadas). As médias das concentrações de plasma foram obtidas a cada momento dos três animais em cada grupo. A concentração de plasma versus dados de tempo foi submetida à análise não compartimentada (NCA) usando o software de modelagem industrial padrão de farmacocinética WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Estimativas foram obtidas para os seguintes parâmetros primários de f armacocinét ica: concentração máxima de plasma, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; semivida terminal, ti/2; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estável, Vss.
As médias da concentração de plasma versus dados de tempo são mostradas na Figura 35 e are assinalado na Figura 36. A concentração versus dados de tempo foi submetida a análise não compartimentada (NCA) usando WinNonLin™ v.4.0. A dita análise forneceu os valores apresentados na Figura 37.
Como antecipado, o aptâmero de 40 kDa ARC 187 (SEQ ID NO: 5) apresentou a semivida mais longa e o aptâmero 20 kDa, ARC 657 (SEQ ID NO: 61), a mais curta. O Vss observado relativo ao volume de plasma conhecido (—40 ml/kg) sugeriu um grau moderado de ligação/sequestração do ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para proteínas e/ou matriz de tecido no espaço extra vascular. Assumindo a necessidade de manter um excesso molar de 5 vezes do aptâmero, os resultados desse estudo 153 ΕΡ1850880Β1 sugerem que ARC 187 (SEQ ID NO: 5) fornece uma vantagem significativa em termos da frequência de dosagem e da quantidade total de aptâmero necessário para manter os níveis de plasma desejados.
Estudos prévios (dados não mostrados) em roedores e primatas com aptâmeros de composição similar têm mostrado uma proporcionalidade/linearidade das doses que estão acima de 30 mg/kg, então não está previsto que este nível de dosagem irá resultar num comportamento farmacocinético não linear.
Exemplo 5C: Farmacocinética de ARC 187 e ARC 1905 e ratinhos após administração intravenosa
Para avaliar o perfil farmacocinético do oligonucleót ido da medula óssea ARC 186 (SEQ ID NO: 4) conjugado com um PEG de 40 kDa ramificado diferente daquele do ARC 187 (SEQ ID NO:5), o estudo f armacocinético foi conduzido em fêmeas de ratinhos CD-I (obtidos de Charles River Labs, Wilmington, MA) . Aptâmeros foram formulados para injeção a 2,5 mg/ml (peso de oligo) em solução salina padrão filtrada e esterilizada (0,2 pm) num frasco de dosagem pré-esterilizado em condições asséticas. A via de administração usada para o estudo em ratos foi a de bolus intravenoso pela via de veia da cauda numa dose de 10 mg/kg. Os grupos de estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram retiradas várias amostras de sangue pré-dosagem (isto é, o grupo de controlo não medicado) a intervalos selecionados no decorrer de 72 horas. O projeto do estudo está esboçado na Figura 38A.
Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca, transferidas diretamente para tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão, e colocadas em gelo até o 154 ΕΡ1850880Β1 processamento para obtenção de plasma. 0 plasma foi colhido por centrifugação dos tubos sangue-EDTA a 5000 rpm por 5 minutos e o plasma sobrenadante foi transferido para um novo tubo pré-marcado. As amostras de plasma foram estocadas a -80°C até o momento da análise. A análise das amostras de plasma para ARC 187 foi obtida através da utilização de material de análise homogéneo utilizando a adição direta de frações de plasma ao material de análise contendo o reagente fluorescente detetor de ácido nucleico comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR) . Depois de um breve período de incubação (5 min) à temperatura ambiente, protegido da luz, as lâminas do material de análise foram lidas por um leitor de lâmina fluorescente (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . O sinal fluorescente de cada fonte era proporcional à concentração do aptâmero na fonte, e amostras das concentrações foram calculadas pela interpolação dos valores de fluorescência a partir de uma curva padrão de concentração de fluorescência (valores médios de curvas duplicadas ou triplicadas). As médias das concentrações de plasma foram obtidas a cada momento dos três animais em cada grupo. A concentração de plasma versus dados de tempo foi submetida a análise não compartimentada (NCA) usando o software de modelagem industrial padrão de farmacocinética WinNonLin™ v. 4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA) . Estimativas foram obtidas para os seguintes parâmetros primários de farmacocinética: concentração máxima de plasma, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; semivida terminal, ti/2; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estável, Vss. A concentração de plasma média versus os dados de tempo é colocada num gráfico na Figura 38B. A concentração versus dados de tempo foi submetida à análise não compartimentada (NCA) usando WinNonLin™ v. 4.0. 155 ΕΡ1850880Β1 A dita análise revelou os valores apresentados na Figura 38C. Como antecipado, os PEGs de 40 kDa de ambos os fornecedores apresentaram farmacocinética equivalente em ratinhos.
As mesmas amostras de plasma para ARC 187 e 1905 usadas para a análise de oligreen, descrita logo acima, foram analisadas usando uma validação com liquido de cromatografia de alta performance (HPLC) e material de análise com deteção UV. A média dos valores da concentração de plasma para ARC 187 e ARC 1905 foi calculada usando Microsoft Excel 2003. Quando os valores da concentração de plasma estavam a seguir do limite mínimo de deteção do material de análise bioanalítico na pré-dosagem (tempo 0) , o valor zero foi determinado. Os valores a seguir do limite mínimo de deteção obtidos a partir de amostras colhidas no período pós-dosagem foram omitidos da média de cálculo da concentração de plasma. Os dados da média da concentração de plasma foram usados num modelo independente de análise FK usando WinNonlin, versão 5.1 (Pharsight Corporation, Mountainview, CA) . A área sob a curva de concentração de plasma-tempo (AUC0-úitimo) foi estimada usando a regra trapezoidal. Para efeito de cálculo, qualquer valor que estivesse a seguir do limite mínimo de deteção no material analisado, com exceção das amostras de pré-dosagem, foi excluído dos cálculos para estimativas de parâmetros FK. A aparente semivida terminal foi calculada usando a fórmula 11/2, = 0, 693/λζ onde λζ é a constante de taxa de eliminação estimada a partir da regressão da inclinação final da curva de concentração versus tempo. Pelo menos três valores de concentração de plasma depois do pico da concentração na fase terminal foram usados para determinar λζ e a taxa de determinação (r2) precisava ser â 0,85. 156 ΕΡ1850880Β1
Em geral, a análise de cromatografia liquida de alta performance (HPLC) confirma a análise de oligreen descrita logo acima, que representa que ARC 1905 e ARC 187 foram reconhecidos como sendo bioequivalentes com base em comparações das estimativas das médias dos parâmetros Cmax, AUCo-úitimo e AUCo—. Diferenças nos valores AUC0-úitimo e AUC0_« para ARC 1905 relativas ao ARC 187 (como medidas por HPLC) estavam bem dentro dos valores aceitáveis dos critérios de bioequivalência de ± 20%.
Exemplo 5D: Estudo de captação de tecidos dos inibidores de C5 ARC 657, ARC 658 e ARC 187 em seguida à administração de bolus intravenoso em ratinhos
As fêmeas CD-I de ratinhos foram obtidas de Charles River Labs (Wilmington, MA) . A formulação de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para injeção estava em solução salina a 5 mg/ml. As formulações das dosagens foram esterilizadas e filtradas (0,2 μιτι) , postas em frascos esterilizados de dosagem sob condições asséticas e os animais receberam um bolus intravenoso por via da veia da cauda numa dose de 25 mg/kg. O estudo consistiu em grupo de 3 animais para cada quatro instantes, t = pré-dosagem, 3, 6, 12 horas. Em seguida à exsanguinação, a vasculatura de cada animal foi irrigada extensivamente (V ~ 30 ml) com solução salina para remover quaisquer resquícios de sangue ainda na vasculatura. Os tecidos (coração, fígado, rim) foram colhidos, pesados, e depois homogeneizados a 50% p/v em solução salina padrão, e armazenada a -80°C até o momento da análise. A análise de tecidos para ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) foi realizada usando o método do tipo ELISA baseado em hibridização. Neste estudo, uma sonda de captura biotinilada foi pré- 157 ΕΡ1850880Β1 imobilizada nos poços de microplacas de 96- poços numa solução de ligação com concentração de 125 nM por 3 horas. As poços da placa foram lavadas 5 vezes com PBS lx. As placas foram então bloqueadas com SuperBlock lx em TBS na proporção de 150 μΐ/poço (Pierce Chemical, Rockford, IL) . As placas foram lavadas novamente, cobertas, e armazenadas a 4°C até serem usadas. Em tubos separados, a(s) amostra(s) foi (foram) recozida(s) num tampão contendo uma sonda de deteção marcada com FAM (5'- fluoresceina) a 200 nM a 90°C por 10 minutos, depois arrefecidas em gelo. Os modelos-padrão de concentração e amostras de controlo de plasma/tecido também foram pré-cozidos com soluções de sonda de deteção e depois pipetados nas poços das placas de cultura contendo sonda de captura de biotina imobilizada, e recozidos a 45°C por 2,5 h. As placas foram então lavadas novamente, e preenchidas com 100 pL/poço de uma solução contendo PBS lx com 1 pg/ml de anticorpo monoclonal anti-fluorescente conjugado com peroxidase de rábano silvestre (anti-FITC MAb-HRP, Molecular Probes, Eugene, OR) em PBS lx, e incubadas por aproximadamente 1 hora. As placas foram lavadas novamente como descrito acima. Os poços das placas de cultura foram então preenchidas com 100 pL de uma solução contendo um substrato fluorogénico HRP (QuantaBlu, Pierce Chemical, Rockford, IL) , e incubados por 20 minutos - 30 minutos protegidos da luz. Depois de 45 minutos de incubação, foram adicionados 100 pL/poço de uma solução imobilizante para temperar a reação de precipitação fluorescente. As placas tiveram sua leitura imediatamente feita em fluorimetro de placa (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com excitação de 325 nm e emissão detetada a 420 nm. Cada poço teve sua leitura feita por 10 vezes. Todos os três aptâmeros eram detetáveis no tecido do coração nos três momentos selecionados (Figura 39) . 158 ΕΡ1850880Β1
Exemplo 5E: Estudo 1 de farmacocinética e farmacodinâmica dos Inibidores de C5 ARC 657 ARC 658 e ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa A formulação de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) para injeção foi feita em solução salina padrão a 10 mg/ml e as formulações de dosagem foram filtradas e esterilizadas (0,2 pm) em frascos de dosagem pré-esterilizados sob condições asséticas. A via de administração usada para o estudo com macacos foi a de bolus intravenoso via um cateter cirurgicamente implantado na veia femoral numa dose de 30 mg/kg (aproximadamente 50 vezes o excesso molar). O projeto do estudo está esboçado na Figura 40. As amostras de sangue foram obtidas a partir dos cateteres das veias femorais, transferidas diretamente para tubos revestidos de citrato de sódio, misturadas por inversão, e colocadas no gelo até que fossem centrifugadas para separar o plasma (3000 rpm por 5 minutos) . O plasma foi então dividido em frações de 250 pL que foram estocadas a -80 °C e uma fração de cada amostra foi avaliada para medir a concentração de aptâmero usando o método Oligreen™ baseado fluorescência previamente descrito na secção sobre FK de ratos logo acima. A concentração de plasma primária com relação aos dados de tempo está apresentada na forma de quadro na Figura 41. Como antecipado, aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ ID NO: 5) persistiram no plasma pelo periodo mais longo de tempo enquanto que os aptâmeros PEG de 20 kDa ARC 657 (SEQ ID NO: 61) persistiram pelo periodo de tempo mais curto. A inspeção dos dados mostrados na Figura 41 sugeriu que os dados seriam melhor adequados por modelos bi-compartimentados. Portanto, as estimativas de parâmetros farmacocinéticos relatados na Figura 42 são derivadas de uma modelo bi-compartimentados o software de modelagem de 159 ΕΡ1850880Β1 farmacocinética padrão da indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).
Como mostrado na Figura 42, todos os aptâmeros são dotados de um valor Cmax similar, entre 23 e 30 μΜ, indicando que a dose de aptâmero (30 mg/kg) era suficiente para atingir a 50 vezes o excesso molar de aptâmero de plasma com relação a concentração de C5. Embora os ditos valores sejam diferentes por 10.000 no peso molecular, ARC 657 (PEG de 20 kDa) (SEQ ID NO: 61) e ARC 658 (PEG de 30 kDa) , (SEQ ID NO: 62) têm valores de (AUC) , ti/2 (a) e de exposições similares. Em contrapartida, ARC 187 (SEQ ID NO: 5) teve uma exposição significativamente maior dos valores (AUC), uma ti/2 (oí) prolongada e uma 11/2 (β) ligeiramente mais longa do que as outras moléculas.
As aliquotas adicionais das amostras de plasma colhidas durante os estudo de farmacocinética foram subsequentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 em primatas. O estudo de ativação por zimosan foi executado como descrito acima para determinar a quantidade se C5b-9 e C5a de primata gerados respetivamente. Os dados foram assinalados de várias formas diferentes incluindo a concentração de C5b-9 com relação a amostragem de tempo (Figura 43a), concentração C5b-9 com relação a concentração de aptâmero (Figura 43b), concentração de C5a com relação a amostragem de tempo (Figura 43c), e concentração de C5a com relação a concentração de aptâmero (Figura 43d). O aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ ID NO: 5) inibiu a clivagem de C5 de primata (concentração de C5b-9 e de C5a) pelo período de tempo mais longo (Figuras 43 a e 43c). Quando os dados de C5b-9 e C5a foram assinalados com relação a concentração de aptâmero, isso indicou que o 160 ΕΡ1850880Β1 aptâmero bloqueador da concentração de C5 tinha que exceder 30 vezes o excesso molar, independente do tamanho das moléculas PEG, de modo que a clivagem de C5 seja completamente inibida (Figuras 43b e 43d).
Em resumo, os dados de PK/PD relativos ao estudo do macaco cinomolgus demonstraram que (a) como antecipado, pelo menos um 30 vezes o excesso molar do aptâmero (cerca de 15 μΜ de concentração de aptâmero no plasma) é necessário para inibir a clivagem de C5 in vivo nos macacos cinomolgus, independente do tamanho do grupo PEG, (b) os aptâmeros de bloqueio de C5 não causaram evidente toxidade nesta espécie, e (c) quando os animais receberam dosagens de niveis relativamente altos (50 vezes o excesso molar) , os niveis de aptâmero no plasma estavam bem dentro do espetro apropriado para o estudo durante o período de amostragem para permitir o cálculo dos parâmetros de farmacocinética.
Exemplo 5F: Estudo 2 de farmacocinética e farmacodinâmica dos Inibidores de C5 ARC 658 e ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa O estudo 2 foi similar em seu projeto ao estudo 1 descrito acima, com as exceções a seguir: a) apenas dois compostos foram avaliados (ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5); b) o número de animais foi aumentado para quatro por grupo; e c) a amostra de plasma do minuto 1 foi descartada e substituída por uma amostra da hora 144 para garantir que o cálculo da semivida terminal estava baseado em mais momentos de dados. A reformulação e a dosagem desses dois aptâmeros, amostras de sangue e técnicas para isolamento do plasma foram idênticas às usadas pelos métodos descritos acima no estudo 1. A descrição do estudo 2 está resumida na Figura 44. 161 ΕΡ1850880Β1
Após o estudo 2 ter sido completado, as alíquotas de plasma foram analisadas conforme descrito no estudo 1 para determinar a) a concentração do aptâmero no plasma em diversos momentos após a administração intravenoso e b) a eficácia do bloqueio de C5. A concentração de aptâmero no plasma foi assinalada em função do tempo (Figura 45) e os dados primários para ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) foram apresentados em forma de quadro nas Figuras 39 e 40, respetivamente. O aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ ID NO: 5) persistiu no plasma pelo período de tempo mais longo. A inspeção da Figura 45 indicou que os dados seriam mais bem adequados por modelos bi-compartimentados. Portanto, as estimativas de parâmetros farmacocinéticos relatados na Figura 4 6 são derivadas de uma modelo bi-compart imentados o software de modelagem de farmacocinética padrão da indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).
Comparando os parâmetros farmacocinéticos gerados durante os estudos 1 e 2 de FK/FD acima, os dados para ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) foram similares com exceção da medida de ti/2 (a) de ARC 187. Apesar de não pretender estar restrita a nenhuma teoria, a discrepância nas medidas de ti/2 (a) para o ARC 187 entre os dois estudos se dá provavelmente graças ao tamanho reduzido das amostras no estudo piloto.
Como demonstrado na Figura 46, os valores Cmax foram semelhantes para ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5). Em contrapartida, a exposição do fármaco (AUC) estava significantemente maior em animais tratados com ARC 187 (SEQ ID NO: 5) . Ainda, ARC 187 prolongou os valores ti/2(oí) e t1/2(&) comparado a ARC 658 (SEQ ID NO: 62). Esses 162 ΕΡ1850880Β1 dados, juntos dos dados gerados durante o estudo PK/PD 1 indicaram que os aptâmeros ARC 187 de bloqueio de C5 podiam proporcionar os mais efetivos bloqueios in vivo de C5 para uma dose especifica.
As alíquotas adicionais de plasma colhidas durante o estudo de farmacocinética foram subsequentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 em primatas. Como antes, a ativação do material de análise por zimosan foi executada para determinar a quantidade de C5b-9 e C5a de primata, respetivamente, gerada. Os dados foram assinalados como concentração de C5b-9 com relação a concentração de aptâmero (Figura 47) e concentração de C5a com relação a concentração de aptâmero (Figura 48) . Como previamente demonstrado durante o estudo 1 de PK/PD, a concentração de aptâmero de bloqueio de C5 deve exceder 30 vezes o excesso molar (do aptâmero para a concentração de C5 no plasma), ou aproximadamente 15 μΜ, independente do tamanho da molécula PEG, de modo a inibir completamente a clivagem de C5 em primatas (Figuras 41 e 42).
Através da inspeção dos dados nos quadros das Figuras 39 e 40, torna-se aparente que após um bolus I.V. de 30 mg/kg, ARC 658 (SEQ ID NO: 62) permanecia acima de 15 μΜ por aproximadamente 4 horas enquanto que ARC 187 permanecia acima de 15 μΜ por aproximadamente 8 horas. Deste modo, administrada uma dose similar do fármaco, o aptâmero ARC 187 de 40 K provê eficácia clinica por aproximadamente duas vezes mais que o aptâmero ARC 658 de 30K (SEQ ID NO: 62).
Em resumo, o macaco cinomolgus deve ser tratado com pelo menos 30 vezes o excesso molar de aptâmero vs C5 no plasma de modo a bloquear a conversão de C5 in vivo. Os ditos dados são consistentes com os estudos prévios in vitro (hemólise) e ex vivo (coração de ratinho isolado 163 ΕΡ1850880Β1 perfusionado) que sugeriram que os aptâmeros de ligação de C5 possuem uma baixa afinidade para C5 primata em comparação ao C5 humano. Foi demonstrado que os aptâmeros de bloqueio de C5 podem ser facilmente administrados como um bolus intravenoso e uma dose de até 30 mg/kg, o que equivale a aproximadamente 50 vezes o excesso molar de aptâmero vs concentração de C5.
Exemplo 5G: ARC 1905 em macaco cinomolgus logo após a administração de bolus IV A f armacodinâmica dos inibidores de C5 ARC 1905 foi avaliada no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa. A formulação de ARC 1905 para injeção estava em solução salina padrão a 7,5 mg/ml e as formulações de dosagem foram filtradas e esterilizadas (0,2 pm) em frascos de dosagem pré-esterilizados sob condições asséticas. Os macacos cinomolgus (n = 4) receberam uma dosagem em 0 (solução salina de controlo) ou 30 mg/kg via administração de bolus intravenoso. As amostras de sangue foram obtidas de uma veia periférica ou pelo acesso arterial e as amostras de sangue (0,5 ml) foram transferidas para tubos de dipotássio (K2) EDTA, colocados em gelo húmido, e centrifugados no prazo de 30 minutos da colheita a aproximadamente 4 0C.
As amostras de plasma foram analisadas in vitro para determinar a eficácia de ARC 1905 no bloqueio de C5 de primatas. O ensaio de zimosan previamente descrito em relação a ARC 1905 no Exemplo 1C foi usado para determinar a quantidade de C5a de primata gerado. O decréscimo dos valores pós-zimosan de C5a em 0,5 e 2 horas depois da dosagem indica que ARC 1905 inibiu a clivagem de C5 in vivo no macaco cinomolgus de maneira similar a ARC 187 quando dosados a aproximadamente na mesma concentração e na mesma 164 ΕΡ1850880Β1 via de administração como medido in vitro usando o ensaio de ativação de zimosan.
Exemplo 5H: Farmacocinética e farmacodinâmica do inibidor de C5 ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração e infusão de bolus IV A farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) dos perfis de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) também foram avaliadas em macacos cinomolgus depois da carga de bolus intravenoso seguido imediatamente pelo inicio infusão de intravenosa. 0 projeto deste estudo é mostrado na Figura 49. A carga da dosagem do bolus e a proporção da infusão necessária para obter a concentração de plasma em estado estacionário alvo de 1 uM foram calculados usando os parâmetros de farmacocinética derivados do estudo apenas no bolus I.V. listado na Figura 50.
Um total de três macacos cinomolgus recebeu a administração de bolus IV de ARC 187 a 1 mg/kg, seguido imediatamente pelo inicio infusão de intravenosa na proporção de 0,0013 mg/kg/minuto por um período de 48 horas. Amostras de sangue total foram colhidas de 0 hora a 192 horas pós-tratamento, colocadas em gelo húmido, processadas para plasma, e depois estocadas a -80°C. A concentração de ARC 187 nas amostras de plasma foi determinada usando tanto o teste de fluorescência de ácido nucleico (descrito no Exemplo 5B) guanto um teste de validação GLP usando cromatografia líguida (HPLC). O material de teste do método HPLC para a determinação de ARC 187 no plasma de macacos foi validado por ClinTrials BioResearch (Montreal, Canada). A validação do estudo estava de acordo com as regras do Good Laboratory Practice (GLP) da United States Food e Drug Administration (FDA) (21 165 ΕΡ1850880Β1 CFR §58) . 0 método de ensaio de HPLC foi validado em relação a: seletividade, linearidade, limite mínimo de deteção (LLOQ), transferência, precisão e exatidão do teste, estabilidade da solução estocada, estabilidade média da injeção, estabilidade da matriz de médio prazo, estabilidade de degelo, estabilidade da matriz a longo prazo e integridade da diluição. 0 espetro dinâmico linear da concentração do teste foi determinado como sendo de 0,080 a 50,0 μΜ. O perfil de PK medido de ARC 187 sob estas condições conformou-se bem com o perfil calculado que foi gerado usando apenas os parâmetros de PK do bolus IV (veja-se Figura 51) . A concentração de plasma alvo de 1 uM foi estabelecida em < 5 min pós-dose e mantida por toda a duração da infusão. Depois da infusão ser cessada, o aptâmero mostrou uma depuração terminal da semivida, ti/2 (β) ~ 40-60 h.
As atividades de farmacodinâmica de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) no macaco cinomolgus foram avaliadas ex vivo usando amostras de plasma colhidas durante o estudo de PK no teste de ativação por zimosan previamente descrito com a modificação das amostras de plasma de cinomolgus foram diluídas 10 vezes em plasma 10% humano e depois tratadas com 5 mg/ml de zimosan. A ativação de C5, como refletido pelo surgimento de produtos da clivagem de C5, foi medida por ELISA específico para C5a humano (kit de ELISA de C5a, BD Biosciences, San Diego, CA) . A concentração de ARC 187 ativo em cada amostra era então quantificada por comparação com uma curva padrão derivada dos ensaios de zimosan usando amostras preparadas com níveis conhecidos de ARC 187 (veja-se Figura 52) . Esse estudo indica que ARC 187 mantém sua atividade anti-complemento durante e mesmo logo após a infusão, a níveis substancialmente consistentes com os 166 ΕΡ1850880Β1 perfis de farmacocinética descritos acima.
Exemplo 51: Prognóstico dos requisitos para dosagem em humanos
Os requisitos para a dosagem em humanos para prevenção, melhora, ou tratamento das complicações relacionadas à cirurgia cardiovascular, estão baseados nas suposições a seguir: primeiro, pacientes de cirurgias cardiovasculares receberão a administração de uma única dose de bolus intravenoso do aptâmero anti-C5 antes de iniciada a cirurgia, seguida por infusão continua para estabilizar e manter um estado estável da concentração de plasma em 1,5 μΜ por 24 horas - 48 horas depois da cirurgia cardiovascular. A dose do bolus e as estimativas da proporção de infusão estão baseadas em cálculos usando os parâmetros farmacocinéticos derivados dos estudos previamente descritos de apenas bolus IV e de bolus mais infusão em macacos cinomolgus. A dose estimada de bolus de ARC 187 é de 1 mg/kg, e a proporção da infusão associada é de 0,0013 mg/kg/minuto. Para este regime de bolus mais infusão por 48 horas, o requisito total de fármaco antecipado é de 0,4 g para ARC 187, onde massa refere-se apenas ao peso do oligonucleótido (veja a coluna 7 no quadro da Figura 53) . A coluna 2 do quadro mostrada na Figura 53 refere-se ao peso do grupo PEG conjugado com a porção de oligonucleótido de ARC 187, a coluna 3 refere-se ao peso molecular da porção de oligonucleótido de ARC 187 (e será o mesmo para todos os aptâmeros no presente documento contidos que compreendem ARC 186 (SEQ ID NO: 4) como sua sequência de oligonucleótido) , a coluna 4 refere-se ao peso molecular de PEG de 40 kDA conjugado a ARC 186 (SEQ ID NO: 4) pela via química da amina reativa como descrito no Exemplo 3C acima, a coluna 5 refere-se a semivida de fase α de ARC 187 em modelos bi- 167 ΕΡ1850880Β1 compartimentados, e a coluna 6 refere-se a semivida de fase β de ARC 187 em modelos bi-compartimentados. EXEMPLO 6
Aptâmeros anti-C5 e Interação Heparina/Protamina
Uma aplicação antecipada do aptâmero anti-C5 é como um profilático para a prevenção ou migração dos efeitos laterais inflamatórios associados à cirurgia de enxerto bypass de artéria coronária (CABG). Altas concentrações de heparina anticoagulante (3-5 unidades/ml ou 1 - 2 μΜ) são tipicamente administradas por bomba bypass; reversão do efeito de heparina após o procedimento, e restauração da hemostase normal, é alcançada pela administração das concentrações similarmente altas de protamina (~5 μΜ) . Considerando os perigos potenciais dos pacientes com relação a qualquer interferência na eficácia de qualquer uma das ditas fármacos, foi necessário se demonstrar que os aptâmeros anti-C5 (1) não alteram as atividades de qualquer uma das fármacos e (2) não exibem efeitos inerentes na hemostase que possa complicar o tratamento de anticoagulação do paciente. A heparina é um polissacárido sulfatado com uma carga liquida negativa e uma massa molecular média de aproximadamente 15 kDa que exerce um efeito inibitório numa série de proteases na cascata de coagulação ao promover interações com a antitrombina. A protamina, um polipéptido de com carga altamente positiva, é capaz de bloquear a atividade da heparina por meio de uma interação pobremente caracterizada que é de natureza pelo menos parcialmente eletrostática. 0 núcleo funcional de ARC 187 (SEQ ID NO: 5), da mesma forma que a hepatina, é altamente aniónica. Assim, é concebível que ARC 187 possa ligar-se não 168 ΕΡ1850880Β1 especificamente aos campos de ligação de heparina ou protamina e interferir com as atividades das ditas moléculas. Os estudos a seguir investigaram as propriedades anticoagulantes inerentes (isto é, como heparina) do ARC 187, os efeitos de ARC 187 na função da heparina, os efeitos de ARC 187 na neutralização de heparina por protamina, e os efeitos da protamina nas propriedades de inibição de complemento do ARC 187.
Exemplo 6A: Efeitos in vitro de ARC 187 na coagulação
Os efeitos inerentes de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) na capacidade de coagulação plasmática foram investigados usando os testes clínicos padrão dos braços intrínsecos e extrínsecos da cascata de coagulação, o tempo de protrombina (PT) e o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), respetivamente. Como mostrado na Figura 54, a titulação de plasma humano citratado com concentrações bem em excesso das doses projetadas (até 20 μΜ) resultou em nenhuma alteração em PT, e apenas em relativa elevação na aPTT.
Para avaliar os efeitos in vitro de ARC 187 nas funções de heparina e protamina, o sangue de 3 indivíduos foi obtido em 4-5 unidades/ml de heparina, as doses associadas aos níveis de heparina usados na cirurgia de CABG. A capacidade de coagulação das ditas amostras foi avaliada usando o tempo de coágulo ativado (ACT), um teste de coagulação de sangue total rotineiramente utilizado para monitorar a atividade de heparina durante cirurgia. Nas ditas concentrações de heparina, na ausência de outros aditivos, o ACT foi significativamente prolongado a partir do valor de linha basal de ~ 150 segundos a ~ 500 segundos na presença de 4 U/ml de heparina, ou ~ 800 na presença de 5 U/ml de heparina. A adição de 10 μΜ de ARC 187 às ditas 169 ΕΡ1850880Β1 amostras apresentou pouco efeito no tempo de coagulação, demonstrando que ARC 187 não interfere com a atividade anticoagulante da heparina. 0 efeito anticoagulante de heparina foi prontamente neutralizado por titulação com protamina de cerca de 6 - 8 μΜ (4 U/ml de heparina) ou 12 μΜ (5 U/ml de heparina). Os valores ACT na presença de heparina e as concentrações neutralizantes de protamina foram essencialmente indistinguíveis a partir da linha basal. Uma vez que o núcleo do ácido nucleico de ARC 187 (12 kDa) é de peso molecular mais elevado do que o da protamina (5 kDa) , deve ser esperado que as concentrações equimolares de ARC 187 adicionadas à protamina sejam suficientes para completamente reverter a atividade neutralizante da protamina. Entretanto, a pré-incubação da protamina com concentrações aproximadamente equivalentes de ARC 187 apresentou pouco efeito na ACT. As amostras de sangue contendo as concentrações neutralizantes de protamina exibiram valores de ACT similares na presença ou na ausência de 10 μΜ de ARC 187, indicando que a ARC 187 apresentou apenas um ligeiro se algum efeito na atividade pró-coagulante da protamina. Estes resultados são resumidos na Figura 55.
Exemplo 6B: Efeitos in vivo de ARC 187 na coagulação
As interações entre a função da heparina e da protamina durante a administração concorrente do aptâmero anti-C5 ARC 187 (SEQ ID NO: 5), em doses clínicas de heparina e doses clínicas/subclínicas/superclínicas de protamina foram investigadas para determinar se a presença de concentrações plasmáticas subclínicas/superclínicas de ARC 187 poderiam interferir com a reversão da anticoagulação da heparina pela protamina. Os resultados do 170 ΕΡ1850880Β1 estudo são resumidos na Figura 56. Em suma, os valores de ACT da linha basal não foram afetados por 10 uM (isto é, um excesso molar de 10 vezes da dose clínica) de ARC 187 em todas as doses de heparina testadas. De forma similar, a extensão da anticoagulação pela heparina não foi afetada por 10 uM de ARC 187. Na ausência de ARC 187, a eficácia minima da dose de protamina foi de ~ 30% (dose clinica é de 100%). Além disso, a reversão da anticoagulação de heparina por 30% de protamina não foi afetada pelo excesso molar de 10 vezes na dose clínica (isto é, 10 uM) de ARC 187. Assim, a utilização de ARC 187 para a inibição de complemento num cenário clínico (por exemplo, CABG) não deve ser afetada pela utilização concorrente de heparina e protamina em doses típicas.
Exemplo 6C: Efeito de heparina e protamina sobre a função anti-complemento de ARC 187
Os efeitos da heparina e da protamina sobre a atividade anti-complemento de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) foram examinados nas amostras de sangue total citratadas ativadas com zimosan , como descrito no exemplo 1. Logo antes da ativação de zimosan, ARC 187 foi titulado em amostras de sangue citratado tratado sob quatro condições: D sem tratamento (sem heparina ou protamina); 2) 4 U/ml de heparina; 3) 6 μΜ de protamina; : 4) 4 U/ml de heparina + 6 μΜ de protamina. Em seguida da ativação com zimosan, a ativação de C5 foi quantificada por medição de ELISA de sC5b-9 no plasma (kit C5b-9 ELISA, Quidel, San Diego, CA). Para cada condição, os resultados, expressos como o percentual de inibição de ativação de C5 com relação a concentração de ARC 187, foram indistinguíveis dentro do erro (veja-se Figura 57) . Em todos os casos a inibição completa foi alcançada com 1 μΜ - 2 μΜ de ARC 187. Assim, a heparina e protamina, em separado ou combinadas em 171 ΕΡ1850880Β1 concentrações relevantes ao utilização das mesmas em cirurgia de CABG, não parece afetar a atividade anticoagulante de ARC 187. A invenção gue foi agora descrita por meio de descrição escrita e exemplo, os peritos na especialidade reconhecerão que a invenção pode ser praticada numa variedade de formas de realização e que a descrição e exemplos acima são para propósitos de ilustração e não de limitação das seguintes reivindicações.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Archemix Corp., et al. <120> Agentes terapêuticos à base de aptâmeros úteis no tratamento de distúrbios relacionados com complemento <130> 23239-576 CIP-061 <150> 11/058.134 <151> 2005-02-14 <160> 102 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético 172 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <223> citosina nas posições 3, 4, 6 e 37 são <22 0> <221> misc-feature <223> uridina nas posições 9, 30 e 31 são 2'-<22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(1) <223> n na posição 1 é 2'-fluoro citidina ou citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (2)..(2) <223> n na posição 2 é 2' -OH guanosina ou guanosina <22 0> <221> misc-feature <222> (7)..(7) <223> n na posição 7 é 2' -OH guanosina ou guanosina <22 0> <221> misc-feature <222> (8)..(8) <223> n na posição 8 é 2' -OH guanosina ou guanosina <22 0> <221> misc-feature 2'-fluoro fluoro 2'-O-metil 2'-O-metil 2'-O-metil 2'-O-metil <222> (10)..(10) 173 ΕΡ1850880Β1 <223> η na posição 10 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (11)..(11) <223> n na posição 11 é 2'-fluoro uridina ou desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (12)..(12) <223> n na posição 12 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (13) . . (13) <223> n na posição 13 é 2'-OH adenosina ou 2'-0-metil adenosina <22 0> <221> misc-feature <222> (14)..(14) <223> n na posição 14 é 2’-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> <221> misc-feature <222> (15) . . (15) <223> n na posição 15 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> <221> misc-feature 174 ΕΡ1850880Β1 <222> (16)..(16) <223> η na posição 16 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (18)..(18) <223> n na posição 18 é 2'-fluoro citosina ou 2'-0-metil citosina <22 0> <221> misc-feature <222> (19)..(19) <223> n na posição 19 é 2'-fluoro uridina ou 2'-0-metil uridina <22 0> <221> misc-feature <222> (20) . . (20) <223> n na posição 20 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> <221> misc-feature <222> (21)..(21) <223> n na posição 21 é 2'-OH adenosina ou 2'-0-metil adenosina <22 0> <221> misc-feature <222> (22)..(22) <223> n na posição 22 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> 175 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (23) . . (23) <223> n na posição 23 é 2'-fluoro uridina ou desoxi timidi na <22 0> <221> misc-feature <222> (24) . . (24) <223> n na posição 24 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidi na <22 0> <221> misc-feature <222> (25) . . (25) <223> n na posição 25 é 2’-fluoro uridina ou desoxi timidi na <22 0> <221> misc-feature <222> (26) . . (26) <223> n na posição 26 é 2'-OH guanosina ou 2' - Ό-metil guanos ina <22 0> <221> misc-feature <222> (27)..(27) <223> η na posição 27 é 2'-OH adenosina ou 2'-0-metil adenosina <22 0> <221> misc-feature <222> (28)..(28) <223> n na posição 28 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> 176 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (29) . . (29) <223> η na posição 29 é 2'-fluoro uridina ou desoxi timidi na <22 0> <221> misc-feature <222> (32) . . (32) <223> n na posição 32 é 2' -OH adenosina ou 2'-O-metil adenos ina 177 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (33) .. (33) <223> η na posição 33 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (34) . . (34) <223> n na posição 34 é 2'-fluoro citosina ou desoxi citidina <22 0> <221> misc-feature <222> (35) . . (35) <223> n na posição 35 é 2'-fluoro uridina ou desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (36)..(36) <223> n na posição 36 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <22 0> <221> misc-feature <222> (38)..(38) <223> n na posição 38 é 2'-OH guanosina ou 2'-0-metil guanosina <4 0 0> 1 nnccgcnnun nnnnnngnnn nnnnnnnnnu unnnnncn 38 178 ΕΡ1850880Β1
<210> 2 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi, e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <400> 2 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 3 <211> 42 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature 179 ΕΡ1850880Β1 <222> (D · · (42) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <4 0 0> 3 gacgaugcgg ucucaugcgu cgagugugag uuuaccuucg uc 42 <210> 4 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32,em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 4 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 5 180 ΕΡ1850880Β1
<211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 181 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 é uma modificada por um PEG de 40 kDa ramificado (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida)) unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 5 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 6 182 ΕΡ1850880Β1 <211> 44 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (44) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <4 0 0> 6 aggacgaugc ggucucaugc gucgagugug aguuuaccuu cguc 44 <210> 7 <211> 40 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (40) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 2, 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH, e posições 1 e 34, em que adenosina é 2'-OH 183 ΕΡ1850880Β1 <4Ο0> 7
agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 8 <211> 40 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 8 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40
<210> 9 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature 184 ΕΡ1850880Β1 <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2' -fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que citidina é desoxi, e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 9 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39
<210> 10 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo, exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro, exceto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que citidina é 185 ΕΡ1850880Β1 desoxi; nas posições 1, 3, e 37, em que citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <4 0 0> 10 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39
<210> 11 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-0-metilo, exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 1, 3, 10, 12, 16, 24 e 37, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina 186 ΕΡ1850880Β1 <4 Ο 0> 11 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 12 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) nas 32, nas , e
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 1, 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 12 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 13 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> 187 ΕΡ1850880Β1 <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) exceto posição nas 32, nas ; e
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) são 2'-fluoro; exceto em que citidina é desoxi ão desoxi timidina <223> todas as pirimidinas posições 3, 10, 12, 16 e 24, posições 11, 23, e 25, que s <4 0 0> 13 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) nas 32,
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH <22 0> 188 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, 24 e 37, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 14 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 15 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, e 24, em que citidina é desoxi; na posição 3, em que citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 15 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 189 ΕΡ1850880Β1
<210> 16 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que quanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 37, em que citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 . e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 16 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature 190 ΕΡ1850880Β1 <222> (1) . . (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 1, em que citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 17 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 18 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; nas 191 ΕΡ1850880Β1 ΕΡ1850880Β1 nas posições 1, 3 e 37, em que citosina é 2'-O-metilo; e posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <4 0 0> 18 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas 32,
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..( 38) <223> todas as pirimidinas posições 4, 10, 12, 16 e 24, at posições 11, 23, e 25, que nas ; e são 2'-fluoro; exceto em que citidina é desoxi são desoxi timidina <4 0 0> 19 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 20 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial 192 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas 32, nas ; e nas 32,
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 6, 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 20 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 21 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH 193 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 4, 6, 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições i—1 \—1 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 21 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 22 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <220> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, 18 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 22 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 194 ΕΡ1850880Β1
<210> 23 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'- -O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi ; e nas posições 11, 19, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 23 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 24 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> 195 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, 18 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 19, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 24 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 25 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas 196 ΕΡ1850880Β1 posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 29, que são desoxi timidina <400> 25 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtu uaccugcg 38 <210> 26 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 30, que são desoxi timidina <400> 26 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagut uaccugcg 38 <210> 27 <211> 38 <212> ADN <213> artificial sqeuence 197 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas 32, nas ; e nas 32, <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi nas posições 11, 23, 25 e 31, que são desoxi timidina <400> 27 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu taccugcg 38
<210> 28 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <223> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição em que adenosina é 2' -OH 198 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25, 29, 30 e 31, que são desoxi timidina <400> 28 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtt taccugcg 38
<210> 29 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-flouro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 35, que são desoxi timidina <400> 29 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uacctgcg 38 199 ΕΡ1850880Β1
<210> 30 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) exceto posição nas 32,
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que citidina é desoxi; na posição 9, em que uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 30 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 31 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artifi <22 0> <223> aptâmero sintéti 200 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 4, em que citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <400> 31 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 32 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature 201 ΕΡ1850880Β1 <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 6, em que citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <400> 32 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 33 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 4 e 6, em que citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são desoxi timidina <400> 33 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 202 ΕΡ1850880Β1
<210> 34 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que quanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e na posição 18, em que citosina é 2'-0-metilo <400> 34 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 35 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) 203 ΕΡ1850880Β1
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e na posição 19, em que uridina é 2'-0-metilo <400> 35 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38
<210> 36 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 18, em que citosina é 2'-O-metilo; e na posição 204 ΕΡ1850880Β1 19, em que uridina é 2'-0-metilo <400> 36 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38
<210> 37 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 29, em que uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 37 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 38 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial 205 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 30, em que uridina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 38 38 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg
<210> 39 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) exceto nas
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH 206 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 31, em que uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 39 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 40 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2'-OH <220> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas nas ; e <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; posições 29, 30 e 31, em que uridina é 2'-0-metilo nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina 207 ΕΡ1850880Β1 <4Ο0> 40 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 41 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; na posição 35, em que uridina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 41 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 42 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> 208 ΕΡ1850880Β1 <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto na
posição 5, em que guanosina é desoxi; na posição 17, em que guanosina é 2'-OH; e posição 32, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 42 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 43 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D ·· (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto na
posição 5, em que guanosina é 2' -OH; na posição 17, em que guanosina é desoxi; e posição 32, em que adenosina é 2' -OH 209 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas ; e <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 43 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38
<210> 44 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas 32, <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH; e posição em que adenosina é desoxi <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) nas ; e <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 44 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 210 ΕΡ1850880Β1
<210> 45 <211> 40 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (40)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 6 e 18, em que guanosina é 2'-OH; e posição 33, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 11, 13, 17 e 25, em que citidina é desoxi; na posição 40, em que citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 12, 24 e 26, que são desoxi timidina <400> 45 gcgucgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccuacgc 40 <210> 46 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> 211 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH; e posição 32, em que adenosina é desoxi <22 0> <221> misc-feature <222> (1) • · (38; ) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que citidina é desoxi; nas posições 36, 37 e 38 em que citosina é 2' -O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são desoxi timidina <400> 46 gggcgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccuccc 38
<210> 47 <211> 40 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (40)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 6 e 18, em que guanosina é 2'-OH; e posição 33, em que adenosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto nas 212 ΕΡ1850880Β1 ΕΡ1850880Β1 posições 11, 13, 17 e 25, posição 40, em que cit posições 12, 24 e 26, que na nas em que citidina é desoxi osina é 2'-O-metilo; e são desoxi timidina <400> 47 gcgccgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccugcgc 40
<210> 48 <211> 45 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (44)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 8 e 20, em que guanosina é 2'-OH; e posição 35 em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (44) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> <221> misc-feature <222> (45) .. (45) <223> timidina na posição 45 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 48 ggacgccgcg gucucaggcg cugagucuga guuuaccugc gucut 45 213 ΕΡ1850880Β1
<210> 49 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature
<222> (D .. (42) 1 <223> todas as purinas são 2'- Ό-metilo; exceto nas posições 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que adeno sina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; exceto nas posições \—1 C\] \—1 18, 26, 35 e 36, que são desoxi citidina; e nas posições 20, 41 e 42, em que citosina é 2'-O-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; exceto na posição 21, em que uridina é 2'-O-metilo; e nas posições 13, 25, 27, 31 e 37, que são desoxi timidina <400> 49 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tuuacctgcg cc 42 <210> 50 <211> 42 214 ΕΡ1850880Β1
<212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as citosinas são 2,-fluoro; exceto nas posições 12, 14, 18, 26, 35, 36 e 39, que são desoxi citidina; e nas posições 3, 20, 41 e 42, em que citosina é 2'-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> uridina na posição 11 é 2'-fluoro; uridina na posição 21 é 2'-O-metilo; posições 13, 25, 27, 31, 32, 33 e 37 são desoxi timidina <400> 50 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42
<210> 51 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial 215 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (42) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (42) <223> citosina nas posições 5, 6, 8, 12, 14, 18, 26, 35, 36 e 39 são desoxi citidina; e citosina nas posições 3, 20, 4 1 e 42 são 2'-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (42) <223> uridina na posição 21 é 2'-O-metilo; posições 11, 13, 2 5, 27, 31, 32, 33 e 37 são desoxi timidina <4 0 0> 51 ggcgccgcgg tctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42 <210> 52 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature 216 ΕΡ1850880Β1 <222> (D .· (42) <223> todas as purinas são 2'-0- -metilo; exceto nas posições 7 e 19, em que guanosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (42) <223> uridina nas posições 13, 21, 25 e 27 são 2'-0- metilo ; posições 11 , 31, 32, 33 e 37 são desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (42) <223> citosina nas posições 5, 6, 8, 12, 18, 35, 36 e 39 são desoxi citidina; e citosina nas posições 3, 14, 20, 26, 41 e 42 são 2'- O-metilo <4 0 0> 52 ggcgccgcgg tcucaggcgc ugagucugag tttacctgcg cc 42
<210> 53 <211> 40 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (1) <223> adenosina na posição 1 tem biotina conjugada à extremidade 5' <22 0> 217 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (1) .. (40) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 3, 8 e 20, em que guanosina é 2' -OH; e na
posição 2, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 53 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40
<210> 54 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 12, 14, 18 e 26, que são desoxi citidina; e nas posições 218 ΕΡ1850880Β1 41 e 42, em que citosina é 2'-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; posições 13, 25, e 27 são desoxi timidina <400> 54 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag uuuaccugcg cc 42
<210> 55 <211> 42 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 7 e 19, em que guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 12, 14, 18, 26, 41 e 42, em que citosina é 2'- O-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (42) 219 ΕΡ1850880Β1 <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; exceto nas posições 13, 25, e 27, em que uridina é 2'-0-metilo <400> 55 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg cc 42 <210> 56 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3' -3' ligada) <400> 56 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 57 220 ΕΡ1850880Β1
<211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) exceto na na posição <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; posição 18, em que citosina é 2'-O-metilo; e 19 em que uridina é 2'-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3' -3' ligada) <400> 57 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 58 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 221 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto na posição 29, que é desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH; e na posição
32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 58 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39 <210> 59 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) 222 ΕΡ1850880Β1 <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2' -OH <22 0> <221> misc-feature <222> (D .· (38) 1 <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto na posição 18, em que citosina é 2'-O-metilo; e posição 19, em que uridina é 2'-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 59 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39
<210> 60 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature
<222> (1) (38) 1 <223> todas as purinas são 2' -0- -metilo; posições 5 e 17, em que guanosina é 0 1 (XI exceto nas <22 0> <221> misc-feature 223 ΕΡ1850880Β1 <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; exceto na posição 18, em que citosina é 2'-O-metilo; na posição 19, em que uridina é 2'-O-metilo; e na posição 29, que é desoxi timidina <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3' -3' ligada) <400> 60 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39
<210> 61 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (1) <223> citosina na posição 1 é modificada por um PEG de 20 kDa unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 224 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D .· (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) .. (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 61 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 62 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D . · (D <223> citosina na posição 1 é modificada por um PEG de 30 kDa unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 225 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 62 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 63 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D . · (D <223> citosina na posição 1 é modificada por um ligante de amina 5' <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 226 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 63 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 64 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D . · (D <223> citosina na posição 1 é modificada por um PEG de 10 kDa unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 227 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 64 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 65 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D . · (D <223> citosina na posição 1 é modificada por um linear 40 kDa PEG unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 228 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas
posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 65 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 66 <211> 38 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D . · (D <223> citosina na posição 1 é modificada por um PEG de 20 kDa unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <22 0> 229 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (1) . . (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (38) .. (38) <223> guanosina na posição 38 é modificada por um PEG de 20 kDa unido ao nucleótido via um ligante de amina <400> 6 6 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38
<210> 67 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 é modificada por um 40 kDa ramificado (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoil) PEG unido ao nucleótido via um ligante de amina <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro 230 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (38)
<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; exceto nas posições 5 e 17, em que guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que adenosina é 2'-OH <22 0> <221> misc-feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma 3' desoxi timidina invertida (3'-3' ligada) <400> 67 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39
<210> 68 <211> 46 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (46) <223> todas as pirimidinas são 2,-fluoro <400> 6 8 ggcgauuacu gggacggacu cgcgauguga gcccagacga cucgcc 46
<210> 69 <211> 40 <212> ARN 231 ΕΡ1850880Β1 <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 6 9 ggcuucugaa gauuauuucg cgaugugaac uccagacccc 40
<210> 70 <211> 92 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> molde sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (40)..(69) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, c, g, ou t) <400> 70 taatacgact caetataggg agaggagaga acgttctacn nntmnnnnnn nttrmnimnnn 60 nnnnnnnnng gtcgatcgat cgatcatcga tg 92 <210> 71 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 232 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 71 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 72 <211> 23 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 72 catcgatgat cgatcgatcg acc 23 36 <210> 73 <211> 22 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> região fixa sintética <4 0 0> 73 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 74 <211> 23 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> região fixa sintética 233 ΕΡ1850880Β1 <4Ο0> 74 ggucgaucga ucgaucaucg aug 23
<210> 75 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (75) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 75 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75
<210> 76 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 76 234 ΕΡ1850880Β1 ccuugguuug gcacaggcau acauacgcag gg 32
<210> 77 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 77 ccuugguuug gcacaggcau acaaacgcag gg 32
<210> 78 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (25) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 78 ggguuuggca caggcauaca uaccc 25 235 ΕΡ1850880Β1
<210> 79 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (25) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 79 ggguuuggca caggcauaca aaccc 25
<210> 80 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) .. (32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são i^O-metilo <400> 80 ggcggcacag gcauacauac gcaggggucg cc 32 <210> 81 236 ΕΡ1850880Β1 <211> 47 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (47) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 81 cguucuaccu ugguuuggca caggcauaca uacgcagggg ucgaucg 47 <210> 82 <211> 88 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> molde sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (40)..(69) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <4 0 0> 82 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nrmnnnnnnn nruinnnnnnn 60 nnnnnnnnng teacgactag catcgaCg 86 <210> 83 <211> 39 237 ΕΡ1850880Β1 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> molde sintético <4 0 0> 83 cttggtttgg cacaggcata catacgcagg ggtcgatcg 39 <210> 84 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 84 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 85 <211> 19 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 85 catcgatgct agtcgtaac 19 <210> 86 <211> 22 <212> ARN <213> sequência artificial 238 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <223> região fixa sintética <4 0 0> 86 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 87 <211> 19 <212> ARN <213> sequência artificial <22 0> <223> região fixa sintética <4 0 0> 87 guuacgacua gcaucgaug 19 <210> 88 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (D · · (80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 88 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgãuC 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 239 ΕΡ1850880Β1
<210> 89 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 89 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggugucgauc 60 uguuacgacu agcaucgaug 30
<210> 90 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 90 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uaaauacgca gggcucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 30 240 ΕΡ1850880Β1
<210> 91 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(80) as 60 80 <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 91 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcccaggca uauauacgca gggauugauc cguuacgacu agcaucgaug
<210> 92 <211> 78 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (78) as 6Q 78 <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 92 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcgcaggca uacauacgca gguegaucgg uuacgacuag caucgaug <210> 93 241 ΕΡ1850880Β1
<211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 93 gggagaggag agaacguucu accuuguugu ggcacagcca aeccuacgca cggaucgccc 60 gguuacgacu ageaucgaug 80
<210> 94 <211> 69 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (69) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 94 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuaogacua 69 <210> 95 242 ΕΡ1850880Β1
<211> 79 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (79) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 95 gggagaggag agaacguucu accuuagguu cgcacuguca uacauacaca cgggcaaucg 60 guuacgacua gcaucgaug 79
<210> 96 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1) . . (75) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <22 0> <221> misc-feature <222> (34) . . (34) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, u, c, ou g) 243 ΕΡ1850880Β1 <22 0> <221> misc-feature <222> (43) . . (43) <223> η pode ser qualquer nucleótido (a, t, u, c, ou g) <400> 96 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcncaggca uanauacgea cgggucgauc 60 gguuacgacu ageau 75
<210> 97 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2,-0-metilo <400> 97 gggagaggag agaacguucu accuuucucu gccacaagca uaccuucgcg ggguucuauu 60 gguuacgacu agcaucgaug ΘΟ <210> 98 <211> 79 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> aptâmero sintético <22 0> 244 ΕΡ1850880Β1 <221> misc-feature <222> (1) . . (79) as 60 79 <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 98 999a9a99a9 agaaeguucu accuugguuu ggcacaggca uauauacgca gggucgaucc guuacgacua gcaucgaug
<210> 99 <211> 93 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> molde sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (25)..(54) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <400> 99 60 93 categafcgct agtcgtaaog atocnnnnnn imnnimnrmn jirmnnnnnnn nnnncgagaa cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta <210> 100 <211> 92 <212> ADN <213> artificial <22 0> <223> molde sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (24) . . (53) 245 ΕΡ1850880Β1 <223> η pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <4 0 0> 100 catgcatcgc gactgactag ccgnimnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn mmgtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 101 <211> 92 <212> ADN <213> artificial <22 0> <223> molde sintético <22 0> <221> misc-feature <222> (24)..(53) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <4 0 0> 101 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtegtat ta 92 <210> 102 <211> 1676 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> C5 sintético <4 0 0> 102 246 ΕΡ1850880Β1
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cya Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15
Trp Gly Gin Glu Gin Thr Tyr Vai Ile Ser Ala Pro Lye Ile Phe Arg 20 25 30
Vai Gly Ala Ser Glu Asa ile Vai Ile Gin Vai Tyr Gly Tyr Thr Glu 3S 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr lie Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe S0 SS 60
Ser Tyr Ser Ser Gly Hie Vai Hia Leu Ser Ser Glu Asa Lys Phe Gin 65 70 . 75 SO
Asn Ser Ala Ile Leu Thr He Gin Pro Lys Gin Leu Pro Gly Gly Gin 85 90 95
Asn Pro Vai Ser Tyr Vai Tyr Leu Glu Vai Vai Ser Lys Hie Phe Ser 100 105 110
Lys Ser Lys Arg Het Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125
His Thr Aap Lye Pro Vai Tyr Thr Pro Asp Gin Ser Vai Lye Vai Arg 130 135 140
Vai Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Vai 145 150 155 160
Leu Thr Phe 11e Asp Pro Glu Gly Ser Glu Vai Asp Met Vai Glu Glu 165 170 175
Ile Asp Hie Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 1SS 190
Aan Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Vai Lys Glu Tyr Vai Leu 210 215 220
Pro His Phe Ser Vai Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 247 ΕΡ1850880Β1
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Qlu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255
Asn Lye Vai Vai Thr Glu Ala Aep Vai Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 26S 270
Glu Asp Leu Lys Aep Aep Gin Lye Glu Met Met Gin Thr Ala Met Gin 275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Sln Vai Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300
Thr Ala Vai Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 3OS 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Vai Thr Vai Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly lie Lye Tyr Vai Leu Ser Pco Tyr 340 345 350
Lys Leu Asn Leu Vai Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly ile Pro 355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Vai Gin Vai Lys Asp Ser Leu Asp Gin Leu Vai Gly 370 375 380
Gly Vai Pro Vai Thr Leu Asn Ala Gin Thr Xle Asp Vai Asn Gin Glu 385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lye Ser Vai Thr Arg Vai Aap Asp Gly 405 410 415
Vai Ala Ser Phe Vai Leu Asn Leu Pro Ser Gly Vai Thr Vai Léu Glu 420 425 430
Phe Asn Vai Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gin Ala 435 440 445
Arg Glu Gly Tyr 450
Arg Ala Ile Ala Tyr 455
Ser
Ser Leu Ser Gin Ser Tyr 460
Lys Ala Leu Leu Vai Gly Glu 475 480
Leu Tyr lie Asp Trp Thr Asp Asn His 465 470
His Leu Asn Ile
Ile Vai Thr Pro Lys
Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 248 ΕΡ1850880Β1
48S 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu He Leu Ser Lys Gly Lys ile Ile His Phe 500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gin Ser Ile Asn Ile 515 520 525
Pro Vai Thr Gin Asn Met vai Pro Ser Ser Arg Leu Leu Vai Tyr Tyr 530 535 540
Ile Vai Thr Gly Glu Gin Thr Ala Glu Leu Vai Ser Asp Ser Vai Trp 545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gin Leu Gin Vai Híb Leu Ser 565 570 575
Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gin Thr Vai Ser Leu Asn Met 580 565 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Vai Ala Leu Ala Ala Vai Aap Ser Ala 595 600 605
Vai Tyr Gly Vai Gin Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Vai Phe 610 615 620
Gin Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Vai Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gin Glu Asn Aap Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670
Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 660 665
Lys Tyr Lys His Ser Vai Vai Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 69S 700
Vai Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Vai Vai Ala Ser 725 730 735 249 ΕΡ1850880Β1
Gin Leu Arg Ala Asn Ile Ser Hls Lye Asp Met Gin Leu Gly Arg Leu 740 74S 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Vai Ser Lys Pro Glu lie Arg Ser Tyr 755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Vai His Leu Vai Pro Arg Arg Lye 770 775 7Ô0
Gin Leu Gin Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gin 785 790 795 800
Gly Vai Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Vai Ala Asp Thr Vai Lya 805 810 915
Ala Lys Vai Phe Lys Asp Vai phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830
Vai Vai Arg Gly Glu Gin Ile Gin Leu Lys Gly Thr Vai Tyr Asn Tyr 835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gin Phe Cys Vai Lys Met Ser Ala Vai Glu Gly 850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Vai Ile Asp His Gin Gly Thr Lys Ser 865 870 875 380
Ser Lya Cys Vai Arg Gin Lys Vai Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Vai 885 890 895
Thr Phe Thr Vai Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910
Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Vai Lys Thr Leu Arg 915 920 925
Vai Vai Pro Glu Gly Vai Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Vai Thr Leu 930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Vai Pro Lys Thr Glu Xle Lys Arg Ile 965 970 975 250 ΕΡ1850880Β1
Leu Ser Vai Lys Gly Leu Leu VaX Gly <31u Ile Leu Ser Ala Vai Leu 980 985 990
Ser Gin Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Vai Vai Pro Vai Phe Tyr Vai Phe His 1010 1015 1020
Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn lie Phe Sis Ser Asp Pro 1025 1030 1035
Leu lie Glu Lys Gin Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050
Leu Ser ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Vai 1055 1060 1065
Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080
Arg Vai Leu Gly Gin Vai Asn Lys Tyr Vai Glu Gin Asn Gin Asn 1085 1090 1095
Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Vai Glu Asn Tyr Gin Leu 1100 1105 1110
Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Aen Ser Gin Tyr Gin Pro Ile Lys 1115 1120 1125
Leu Gin Gly Thr Leu Pro Vai Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140
Leu Thr Ala Phe Thr Vai Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 USO 1155
Cys Pro Leu Vai Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn 1160 1165 1170
Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gin Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185
Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 251 ΕΡ1850880Β1
Gin Phe Arg Ser He Vai ser Ala Leu Lya Arg Glu Ala Leu Vai 1205 1210 1215
Lye Gly Asn Pro Pro lie Tyr Arg Phe Trp Lye Asp Asn Leu Gin 1220 1225 1230
Hie Lye Aep Ser Ser Vai Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Vai 1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260
Xle Asn Tyr Vai Asn Pro Vai Xle Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gin 1265 1270 1275
Arg Tyr Gly Gly Qly Phe Tyr Ser Thr Gin Asp Thr Xle Asn Ala 1280 1285 1290 IIe Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Vai Lys Gin Leu Arg 1295 1300 1305
Leu Ser Met Asp Xle Asp Vai Ser Tyr Lys Hie Lys Gly Ala Leu 1310 1315 1320
His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Vai 1325 1330 1335
Glu Vai Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Vai Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350
Ser Gly Leu Ala Thr Vai His Vai Thr Thr Vai Vai His Lys Thr 1355 1360 1365
Ser Thr Ser Glu Glu Vai Cya Ser Phe Tyr Leu Lys He Asp Thr 1370 1375 1380
Gin Asp Xle Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395
Tyr Lys Arg Ile Vai Ala Cys Ala Ser Tyr Lya Pro Ser Arg Glu 1400 1405 1410
Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Vai Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425
Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Aep Leu Lys Ala Leu Vai 252 ΕΡ1850880Β1 1430 1435 1440 Glu Gly Vai Aap Gin Leu Phe Thr Asp Tyr Gin ile Lys Asp Gly 1445 1450 1455 Hie Vai Ile Leu Gin Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu 1460 1465 1470 Cya Vai Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Vai Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr vai Tyr Glu Tyr Hia Arg Pro Aap Lya 1490 1495 1500 Gin Cya Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn ile Lys Ile Gin Lya 1S0S 1510 1515 Vai Cya Glu Gly Ala Ala cys Lys cys vai Glu Ala Aap Cya Gly 1520 1525 1530 Gin Met Gin Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg 1535 1540 1545 Lys Gin Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lya Vai 1550 1555 1560 Ser ile Thr Ser Ile Thr Vai Glu Asn Vai Phe Vai Lys Tyr Lys 1565 1570 1575 Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Vai Ala Glu 1580 1585 1590 Lys Aap Ser Glu ile Thr Phe Ile Lys Lys Vai Thr Cys Thr Asn 1595 1600 1605 Ala Glu Leu Vai Lys Gly Arg Gin Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu 1610 1615 1620 Ala Leu Gin Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro 1625 1630 1635 Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr 1640 1645 1650 Cys Ser Ser Cys Gin Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala 1655 1660 1665
Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cya 1670 1675 253 ΕΡ1850880Β1
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição wo 9941271 A [0017] us 5475096 A [0123] us 5270163 A [0123] wo 9119813 A [0123] us 5958691 A [0126] us 5660985 A [0126] us 5698687 A [0126] us 5817635 A [0126] us 5672695 A [0126] wo 9207065 A [0126] us 5707796 A [0134] us 5763177 A [0134] us 5567588 A [0134] us 5861254 A [0134] us 5496938 A [0134] us 5705337 A [0134] us 5580737 A [0135] us 5756703 A [0137] us 5637459 A [0142] us 5683867 A [0142] us 6011020 A [0142] us 6051698 A [0142] wo 9818480 A [0142] [0137] [0137] [0230] 254 ΕΡ1850880Β1 • US 5648214 A [0143] • US 20040197804 AI [0147] • US 20050037394 Al [0147] • US 6395888 B [0201] • US 3710795 A [0227] • US 5262564 A [0230] • US 20060030535 Al [0239] • US 20040180360 Al [0247] • US 5674685 A [0260] • US 5668264 A [0260] • US 6207816 A [0260] • US 6229002 A [0260] • US 11058134 B [0382]
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • TUCKER et al. J. Chromatography B., 1999, vol. 7 32, 203-212 [0007] • FITCH et al. Circ., 1999, vol. 100, 2499-506 [0016] • FROEHLER et al. Nucl. Acid Res., 1986, vol. 14, 5399- 5467 [0126] [0206] • FROEHLER et al. Tet. Lett., 1986, vol. 27, 5575-5578 [0126] [0206] • SOOD et al. Nucl. Acid Res., 1977, vol. 4, 2557 [0126] [0206] HIROSE et al. Tet. Lett., 1978, vol. 28, 2449 [0126] SPROAT et al. Nucl. , Acid Res., 1991, vol. 19, 733-738 [0140] COTTEN et al. Nucl. . Acid Res., 1991, vol. 19, 2629- 2635 [0140] • HOBBS et al. Biochemistry, 1973, vol. 12, 5138-5145 [0140] • GREEN et al. Current Biology, 1995, vol. 2, 683-695 [0148] • PADILLA, R. ; SOUSA, R. Nucleic Acids Res., 2002, vol. 255 ΕΡ1850880Β1 30 (24), 138 [0150] • PADILLA et al. Nucleic Acids Research, 2002, vol. 30, 138 [0150] • MATIS; ROLLINS. Nature Medicine, 1995, vol. 1 (8), 839-842 [0187] • WARD. Am. J. Pathol., 1996, vol. 149, 1079 [0188] • WARD. J. Lab. Clin. Med., 1997, vol. 129, 400 [0189] • MULLIGAN et al. J. Clin. Invest., 1998, vol. 98, 503 [0189] [0192] • SCHMID et al. Shock, 1997, vol. 8, 119 [0189] BIESECKER ; GOMEZ. J. Immunol., 1989, vol. 142, 2654 [0189] BALDWIN et al. Transplantation, 1995, vol. 59, 797 [0189] • BRAUER et al. Transplantation, 1995, vol. 59, 288 [0189] • TAKAHASHI et al. Immunol. Res., 1997, vol. 16, 273 [0189] • BIESECKER. J. Exp. Med., 1981, vol. 39, 1779 [0189] • NANGAKU. Kidney Int., 1997, vol. 52, 1570 [0189] • HOMEISTER ; LUCCHESI. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1994, vol. 34, 17 [0189] • BEDNAR et al. J. Neurosurg., 1997, vol. 86, 139 [0189] • MORGAN. Exp. Clin. Immunogenet., 1997, vol. 14, 19 [0189] • SUN et al. Nucleic Acids Res., 1995, vol. 23, 2909 [0189] • SPYCHER ; NYDEGGER. Infushionsther. Transfusionsmed., 1995, vol. 22, 36 [0189] • WANG et al. Immunology, 1996, vol. 93, 8563 [0189] • ZHANG et al. Diabetes, 2002, vol. 51, 3499 [0190] • SOHN et al. IOVS, 2000, vol. 41, 3492 [0190] • ACOSTA et al. PNAS, 2002, vol. 97, 5450-5455 [0190] • HANSEN, T.K. et al. Diabetes, 2004, vol. 53, 1570-1576 [0190] 256 ΕΡ1850880Β1 • ALBRECHT, E.A. et al. Am J Pathology, 2004, vol. 164, 849-859 [0190] • GERT, V.B. et al. Invest Opthalmol Vis Sei, 2002, vol. 43, 1104-1108 [0190] • BADOUIN, C et al. Am J Opthalmol, 1988, vol. 105, 383-388 [0190] • RINDER et al. J. Clin. Invest., 1995, vol. 96, 1564 [0192] • BIESECKER et al. J. Immunol., 1989, vol. 142, 265 [0192] • HAVILAN et al. J Immunol., 01 January 1991, vol. 146 (1), 362-8 [0195] • SMITH; WATERMAN. Adv. Appl. Math., 1981, vol. 2, 482 [0197] • NEEDLEMAN ; WUNSCH. J Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 [0197] • PEARSON ; LIPMAN. Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 1988, vol. 85, 2444 [0197] • ALTSCHUL et al. J Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0198] • ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 15, 3389-3402 [0198] • MCGINNIS et al. Nucleic Acids Res., 2004, vol. 32, W20-W25 [0198] • HIROS et al. Tet. Lett., 1978, vol. 28, 2449 [0206] • VIVES et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272 (25), 16010-7 [0243] • PIETERSZ et al. Vaccine, 2001, vol. 19 (11-12), 1397-405 [0243] • ROTHBARD et al. Nat. Med., 2000, vol. 6 (11), 1253-7 [0243] • ROTHBARD, J et al. J. Med. Chem., 2002, vol. 45 (17), 3612-8 [0243] • GREENWALD et al. J. Org. Chem., 1995, vol. 60, 331-336 [0250] 257 ΕΡ1850880Β1 • HARRIS et al. Nature, 2003, vol. 2, 214-221 [0254] • GREEN et al. Chem. Biol., 1995, vol. 2, 683-95 [0265] • GONG et al. Journal of Clinicai Immunology, 1996, vol. 16, 222-9 [0294] • NILSSON et al. Blood, 1998, vol. 92, 1661-7 [0294] • EVANS. Molecular Immunology, 1995, vol. 32, 1183-1195 [0323] • EVANS. Molecular Immunol, 1995, vol. 32, 1183 [0331]
Lisboa, 25 de Fevereiro de 2014 258

Claims (10)

  1. ΕΡ1850880Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um conjugado de aptâmero/polietileno glicol (PEG) ou um sal do mesmo, em gue o conjugado de aptâmero/PEG tem a estrutura apresentada a seguir: 0
    5'Aptâmero3' och2ch2ch2- 20 kDa mPEG-NH-C-O-O 20 kDa mPEG-NH-C-O-l onde indica um ligante, onde Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGPCnjmGinAmGfUfCnjmGmAmC;fUfUfUAfCf CfUmGtfCmG-3T (SEQID NO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2'-OH e 3T indica uma desoxi timidina invertida. a a 2. 0 conjugado de aptâmero/PEG de acordo com reivindicação 1, em que o conjugado de aptâmero/PEG tem estrutura apresentada a seguir: o 20 kDa mPEG-NH-C-0 20 kDa mPEG-NH-C-O >0 OCHzCH2CH2-C-N H
    0-:5' Aptâmero 3' onde Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCinAmGmGfCGfCfUmGmAinGfUfCfUmGaiAmGfUflJfUAfCf CfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-0Me e todos os outros nucleótidos são 2'-0H e 3T indica uma desoxi timidina invertida. 3. 0 conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 1, em que o ligante é um ligante de alquilo que compreende 6 grupos CH2 consecutivos, um ligante de 1 ΕΡ1850880Β1 alquilo que compreende entre 2 a 18 grupos CH2 consecutivos, um ligante de alquilo que compreende entre 2 a 12 grupos CH2 consecutivos, ou um ligante de alquilo que compreende entre 3 a 6 grupos CH2 consecutivos.
  2. 4. Uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou um sal do mesmo e um veiculo farmaceuticamente aceitável ou diluente. 5. 0 conjugado de aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1-3, para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhora de uma doença mediada por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero.
  3. 6. Utilização do conjugado de aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 - 3 no fabrico de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma doença mediada por proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero. 7. 0 conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 5 ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o mamífero é um ser humano. 8. 0 conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 5 ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o distúrbio é enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, isquemia/lesão por reperfusão, doença infeciosa, septicemia, choque, alergia, asma, artrite reumatoide e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistémico (SLE), glomerulonefrite e outras doenças renais, lesão do miocárdio relacionada com cirurgia de bypass de artéria coronária (CABG), lesão do miocárdio relacionada 2 ΕΡ1850880Β1 com angioplastia de balão, lesão do miocárdio relacionada com reestenose, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com cirurgia de CABG, complicações mediadas por proteína complemento relacionadas com intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxissomal, rejeição a transplante aguda, rejeição a transplante hiperaguda, rejeição a transplante subaguda, ou rejeição a transplante crónica. 9. 0 conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 5 ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o distúrbio a ser tratado é uma doença isquémica aguda, doença inflamatória aguda, doença inflamatória crónica ou doença mediada pelo sistema imune.
  4. 10. O conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 5 ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o conjugado de aptâmero/PEG é administrado antes da cirurgia e a administração é continuada por pelo menos 24 horas.
  5. 11. O conjugado de aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 5 ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o conjugado de aptâmero/PEG é administrado intravenosamente.
  6. 12. Um método de diagnóstico in vitro que compreende colocar em contacto o conjugado de aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 com uma composição suspeita de compreender proteína complemento C5 ou uma variante da mesma e detetar a presença ou ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma.
  7. 13. O método de diagnóstico in vitro de acordo com a reivindicação 12, em que a proteína complemento C5 ou 3 ΕΡ1850880Β1 variante da mesma é uma proteína complemento C5 humana ou variante da mesma.
  8. 14. Utilização do conjugado de aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um diagnóstico in vitro.
  9. 15. Um conjugado de aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização como um diagnóstico in vivo.
  10. 16. Um conjugado de aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização no tratamento, prevenção ou melhora de doença in vivo. Lisboa, 25 de Fevereiro de 2014 4
PT67350595T 2005-02-14 2006-02-14 Agentes terapêuticos à base de aptâmeros úteis no tratamento de distúrbios relacionados com complemento PT1850880E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/058,134 US7803931B2 (en) 2004-02-12 2005-02-14 Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1850880E true PT1850880E (pt) 2014-03-05

Family

ID=36916987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT67350595T PT1850880E (pt) 2005-02-14 2006-02-14 Agentes terapêuticos à base de aptâmeros úteis no tratamento de distúrbios relacionados com complemento

Country Status (21)

Country Link
US (8) US7803931B2 (pt)
EP (2) EP2623602A3 (pt)
JP (1) JP5253818B2 (pt)
KR (4) KR20150095956A (pt)
CN (4) CN108148840B (pt)
AU (1) AU2006214437C1 (pt)
BR (1) BRPI0607002B1 (pt)
CA (4) CA2992874C (pt)
CY (1) CY1115059T1 (pt)
DK (1) DK1850880T3 (pt)
ES (1) ES2449047T3 (pt)
HK (3) HK1110329A1 (pt)
IL (2) IL185312A (pt)
MX (1) MX2007009807A (pt)
NZ (1) NZ560804A (pt)
PL (1) PL1850880T3 (pt)
PT (1) PT1850880E (pt)
RU (1) RU2406507C2 (pt)
SI (1) SI1850880T1 (pt)
WO (1) WO2006088888A2 (pt)
ZA (1) ZA200707191B (pt)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
EP2281885A1 (en) * 2003-08-27 2011-02-09 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
DK2860251T3 (en) * 2004-02-12 2018-06-06 Archemix Llc APTAPMER PHARMACEUTICALS USEFUL IN TREATMENT OF COMPLEMENT-RELATED DISEASES
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
AU2013204622B2 (en) * 2006-03-08 2016-04-21 Archemix Llc Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
AU2016204713B2 (en) * 2006-03-08 2017-08-10 Iveric Bio., Inc. Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
CA3148917A1 (en) * 2006-03-08 2007-09-13 Archemix Llc Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
JP2009544627A (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 プロミックス・ピーティーワイ・リミテッド 内膜過形成および関連する状態に対する治療
BRPI0716823A2 (pt) * 2006-09-15 2015-05-26 Enzon Pharmaceuticals Inc Conjunto poliméricos contendo porções positivamente carregadas
RU2010116245A (ru) * 2007-09-24 2011-11-10 Ноксон Фарма Аг (De) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ C5a
WO2010039690A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of inhibiting biomaterial-induced procoagulant activity using complement inhibitors
AU2009313203B2 (en) * 2008-11-10 2015-08-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
WO2010108657A2 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 Noxxon Pharma Ag C5a binding nucleic acids and the use thereof
ES2786007T3 (es) 2012-01-10 2020-10-08 Aptarion Biotech Ag Nuevos ácidos nucleicos de unión a C5a
WO2013126006A1 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement c5
RU2018114903A (ru) * 2012-04-06 2019-03-04 Омерос Корпорейшн Композиции и способы ингибирования masp-1, и/или masp-2, и/или masp-3 для лечения пароксизмальной ночной гемоглобинурии
WO2014066744A2 (en) 2012-10-25 2014-05-01 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
RS63212B1 (sr) 2012-11-02 2022-06-30 Bioverativ Usa Inc Antikomplementna c1s antitela i njihove primene
RU2523450C1 (ru) * 2013-05-06 2014-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) Способ профликатики ранней послеоперационной когнитивной дисфункции у пациентов после коронарного шунтирования в условиях искуственного кровообращения
US20150017163A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Ophthotech Corporation Methods for Treating or Preventing Ophthalmological Conditions
DE102013112915A1 (de) 2013-11-22 2015-05-28 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) DNA-Aptamere, die E- und P-Selektine spezifisch binden
EP4223317A3 (en) 2014-06-12 2023-09-27 RA Pharmaceuticals, Inc. Modulation of complement activity
GB201411150D0 (en) * 2014-06-23 2014-08-06 Altermune Technologies Llc Novel aptamers and therapeutic uses thereof
SI3250230T1 (sl) 2015-01-28 2022-01-31 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulatorji aktivnosti komplementa
PT3280440T (pt) 2015-04-06 2023-02-14 Bioverativ Usa Inc Anticorpos anti-c1s humanizados e métodos de utilização destes
FI3685847T3 (fi) 2015-12-16 2023-04-03 Ra Pharmaceuticals Inc Komplementtiaktiivisuuden modulaattoreita
DE102016100039A1 (de) 2016-01-04 2017-07-06 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) α6-Integrin bindendes DNA-Aptamer
AU2017210042B2 (en) 2016-01-20 2021-01-21 396419 B.C. Ltd. Compositions and methods for inhibiting Factor D
BR112019011053A2 (pt) 2016-12-07 2019-10-15 Ra Pharmaceuticals Inc moduladores da atividade do complemento
WO2018136827A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d
WO2019022986A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Vitrisa Therapeutics, Inc. NUCLEIC ACID COMPOSITIONS AND METHODS OF INHIBITING D-FACTOR

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US5981481A (en) 1974-12-06 1999-11-09 The Johns Hopkins University Human C3b/C4b receptor (CR1)
US5212071A (en) 1988-04-01 1993-05-18 The Johns Hopkins University Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1)
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
US4935363A (en) * 1987-03-30 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Sterol regulatory elements
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
US5244805A (en) 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5070010A (en) * 1989-10-30 1991-12-03 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining anti-viral transactivating activity
HUT62658A (en) 1990-03-21 1993-05-28 Isis Pharmaceuticals Inc Reagent and process for modifying expression of gene by imitating rna
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5476766A (en) * 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5861254A (en) * 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5654151A (en) * 1990-06-11 1997-08-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV Nucleocapsid nucleic acid ligands
ES2259800T3 (es) * 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5527894A (en) * 1990-06-11 1996-06-18 Nexstar Pharmacueticals, Inc. Ligands of HIV-1 tat protein
US6395888B1 (en) 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5580737A (en) * 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5567588A (en) * 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5707796A (en) * 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US6011020A (en) * 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5648214A (en) * 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5459015A (en) * 1990-06-11 1995-10-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US5543293A (en) * 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US6147204A (en) 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5668264A (en) 1990-06-11 1997-09-16 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5635615A (en) * 1990-06-11 1997-06-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US5472841A (en) * 1990-06-11 1995-12-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase
US5726017A (en) * 1990-06-11 1998-03-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands
US5503978A (en) * 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5674685A (en) * 1990-06-11 1997-10-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5683867A (en) * 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US6140490A (en) * 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
WO1992005285A1 (en) 1990-09-21 1992-04-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Protein sequence-specific oligonucleotide sequences
JP3257675B2 (ja) 1990-10-12 2002-02-18 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ビッセンシャフテン エー．ファウ． 修飾リボザイム
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
IE920561A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for thrombin and methods of use
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5252216A (en) 1992-03-24 1993-10-12 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
AU5442194A (en) 1992-10-14 1994-05-09 University Research Corporation Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5262564A (en) * 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
CA2155933C (en) 1993-02-12 2000-04-04 James L. Levin Pulmonary administration of scr1 and other complement inhibitory proteins
US5428149A (en) * 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
RU2073518C1 (ru) 1993-06-17 1997-02-20 Совместное русско-американское акционерное общество закрытого типа "Неофарм" Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза
JPH08512323A (ja) 1993-07-09 1996-12-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション タンパク精製方法
US5817635A (en) 1993-08-09 1998-10-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
WO1995007364A1 (en) 1993-09-08 1995-03-16 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands and improved methods for producing the same
EP1889910A3 (en) 1993-09-17 2009-09-02 SomaLogic, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
EP0767657A4 (en) 1994-06-22 1999-01-20 Nexstar Pharmaceuticals Inc NEW METHOD FOR THE PRODUCTION OF KNOWN AND NEW 2'-MODIFIED NUCLEOSIDES BY INTRAMOLECULAR NUCLEOPHILE SUBSTITUTION
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5723750A (en) 1995-01-12 1998-03-03 Vanderbilt University Transgenic plants expressing disassembly deficient viral coat proteins
US6013443A (en) * 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
EP1741780A3 (en) 1995-06-02 2007-03-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity oligonucleotide ligands to growth factors
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
US6111095A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
JP4335975B2 (ja) * 1995-06-07 2009-09-30 ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド Ｄｎａポリメラーゼに対する結合・阻害核酸リガンド
CA2630098A1 (en) 1996-02-01 1997-08-07 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5668564A (en) * 1996-02-20 1997-09-16 R.A. Miller Industries, Inc. Combined AM/FM/cellular telephone antenna system
WO1997042317A1 (en) 1996-05-07 1997-11-13 T Cell Sciences, Inc. APTAMERS FOR COMPLEMENT PROTEIN C3b
US6051698A (en) * 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
IL129497A0 (en) 1996-10-25 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals Inc Vascular endothelial growth factor (vegf) nucleic acid ligand complexes
US6278039B1 (en) 1997-05-28 2001-08-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. C. elegans deletion mutants
US7419663B2 (en) * 1998-03-20 2008-09-02 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US6251588B1 (en) 1998-02-10 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Method for evaluating oligonucleotide probe sequences
DE69926536T3 (de) 1998-12-22 2013-09-12 Genentech, Inc. Antagonisten von vaskular-endothelialen zellwachstumsfaktoren und ihre anwendung
US6329145B1 (en) 1999-02-09 2001-12-11 Gilead Science, Inc. Determining non-nucleic acid molecule binding to target by competition with nucleic acid ligand
US20020102581A1 (en) 1999-02-19 2002-08-01 Hageman Gregory S. Diagnostics and therapeutics for ocular disorders
US7306799B2 (en) 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US6573299B1 (en) * 1999-09-20 2003-06-03 Advanced Medical Instruments Method and compositions for treatment of the aging eye
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001087351A1 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
CA2442092A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
DK1463563T3 (da) 2001-12-14 2009-04-20 Alcon Inc Superoxiddismutas-mimetika til behandling af öjenlidelser og -sygdomme
RU2222345C2 (ru) 2002-01-21 2004-01-27 Волчек Игорь Анатольевич Фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия
AU2003208871A1 (en) 2002-02-18 2003-09-04 Lynkeus Bio Tech Gmbh Novel retina specific human proteins wdr17, net01, protein kinase a203, protein kinase mak a194, protein a105, protein a106 and c12orf3variants
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
AU2003247576A1 (en) 2002-06-18 2003-12-31 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
WO2004041160A2 (en) 2002-10-30 2004-05-21 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
EP1581548A4 (en) 2002-11-21 2008-04-23 Archemix Corp MULTIVALENT APTAMER THERAPEUTIC WITH IMPROVED PHARMACODYNAMIC PROPERTIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
US20050037394A1 (en) 2002-12-03 2005-02-17 Keefe Anthony D. Method for in vitro selection of 2'-substituted nucleic acids
WO2004050899A2 (en) 2002-12-03 2004-06-17 Archemix Corporation Method for in vitro selection of 2’-substituted nucleic acids
CA2513004A1 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corporation Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
CL2004001996A1 (es) 2003-08-08 2005-05-06 Eyetech Pharmaceuticals Inc Aptameros anti-vegf (factor de crecimiento endotelial vascular) con bloqueo nucleotidico 5'-5' o 3'-3' invertido, composicion que lo contiene, util para trastornos de neovascularizacion.
EP2281885A1 (en) 2003-08-27 2011-02-09 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
DK2860251T3 (en) * 2004-02-12 2018-06-06 Archemix Llc APTAPMER PHARMACEUTICALS USEFUL IN TREATMENT OF COMPLEMENT-RELATED DISEASES
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US20060030535A1 (en) 2004-03-05 2006-02-09 Healy Judith M Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
US20070059336A1 (en) 2004-04-30 2007-03-15 Allergan, Inc. Anti-angiogenic sustained release intraocular implants and related methods
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
JP2008507557A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 ヴァンダ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 眼疾患の治療法
EP1807107B1 (en) 2004-11-02 2011-09-07 Archemix Corp. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
KR20080025181A (ko) 2005-06-30 2008-03-19 아케믹스 코포레이션 완전 2'-변형된 핵산 전사체를 생성하기 위한 물질 및 방법
CA3148917A1 (en) 2006-03-08 2007-09-13 Archemix Llc Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
EP2831278B1 (en) 2012-03-28 2019-05-08 Somalogic, Inc. Aptamers to pdgf and vegf and their use in treating pdgf and vegf mediated conditions
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
AU2017217677A1 (en) * 2016-02-08 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20180030446A1 (en) 2018-02-01
AU2006214437A1 (en) 2006-08-24
BRPI0607002A2 (pt) 2009-07-28
US20110060027A1 (en) 2011-03-10
CA2992874A1 (en) 2006-08-24
CN104404046A (zh) 2015-03-11
EP1850880B1 (en) 2013-11-27
US8946184B2 (en) 2015-02-03
HK1110329A1 (en) 2008-07-11
KR20130064145A (ko) 2013-06-17
PL1850880T3 (pl) 2014-04-30
HK1256789A1 (zh) 2019-10-04
CN103352037A (zh) 2013-10-16
WO2006088888A3 (en) 2007-10-04
NZ560804A (en) 2010-08-27
CA2597889C (en) 2015-11-10
US8436164B2 (en) 2013-05-07
US7803931B2 (en) 2010-09-28
KR20150095956A (ko) 2015-08-21
BRPI0607002B1 (pt) 2021-06-22
US20150159158A1 (en) 2015-06-11
CN104404046B (zh) 2018-02-23
ZA200707191B (en) 2008-07-30
EP2623602A2 (en) 2013-08-07
CN101155822B (zh) 2013-07-24
KR101374931B1 (ko) 2014-03-17
US8236773B2 (en) 2012-08-07
CA2597889A1 (en) 2006-08-24
IL226339A0 (en) 2013-06-27
IL226339B (en) 2018-05-31
ES2449047T3 (es) 2014-03-18
EP2623602A3 (en) 2013-10-09
SI1850880T1 (sl) 2014-04-30
KR20140019039A (ko) 2014-02-13
US9617546B2 (en) 2017-04-11
CA2992874C (en) 2021-08-03
AU2006214437C1 (en) 2013-03-28
CA2897900C (en) 2018-03-13
EP1850880A2 (en) 2007-11-07
DK1850880T3 (en) 2014-03-03
US20060018871A1 (en) 2006-01-26
CY1115059T1 (el) 2016-12-14
US20190185858A1 (en) 2019-06-20
HK1207661A1 (en) 2016-02-05
EP1850880A4 (en) 2010-09-22
CN108148840A (zh) 2018-06-12
JP2008530133A (ja) 2008-08-07
US10947544B2 (en) 2021-03-16
IL185312A (en) 2013-05-30
KR20070114159A (ko) 2007-11-29
RU2007134212A (ru) 2009-03-20
KR101622490B1 (ko) 2016-05-18
US20130237589A1 (en) 2013-09-12
CN108148840B (zh) 2021-09-24
CA3124030A1 (en) 2006-08-24
US20120322860A1 (en) 2012-12-20
CN101155822A (zh) 2008-04-02
AU2006214437B2 (en) 2012-08-16
WO2006088888A2 (en) 2006-08-24
MX2007009807A (es) 2007-10-08
US11913000B2 (en) 2024-02-27
US20210332361A1 (en) 2021-10-28
JP5253818B2 (ja) 2013-07-31
RU2406507C2 (ru) 2010-12-20
CA2897900A1 (en) 2006-08-24
IL185312A0 (en) 2011-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11913000B2 (en) Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
ES2808955T3 (es) Agentes terapéuticos de base aptámeros útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con complemento
PT2596807E (pt) Aptâmeros de ligação ao complemento e agentes anti-c5 úteis no tratamento de distúrbios oculares