JP7012957B2 - Rna配列の簡便検出法 - Google Patents
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Description
(i)標的核酸の第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的核酸の、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な7~8塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬と、
を含む核酸検出用キットが提供される。
(i)標的核酸の第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基の第1プライマー結合配列と、
第2一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む第1一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的核酸の、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第1一本鎖環状DNA鋳型の第1プライマー結合部位に相補的な7~8塩基の配列と、
を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)第1一本鎖環状DNAの第2一本鎖環状DNA結合配列と同一の配列と、
該配列の5’側に隣接した、第2プライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第2一本鎖環状DNAと、
(iv)第1一本鎖環状DNAの第2一本鎖環状DNA結合配列の5’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第2一本鎖環状DNAの第2プライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(v)グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、と
を含む、核酸検出用キットが提供される。
標的核酸に前記一本鎖環状DNA鋳型および前記プライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的核酸に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅されたグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列をグアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬によって検出する工程、
を含む方法、が提供される。
本発明の第1の態様にかかる標的RNA検出キットは、
(i)標的RNAの第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的RNAの、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な7~8塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬と、
を含む。
標的RNAは、特に限定されず、mRNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)を含むあらゆる種類のRNAを標的として検出することが可能である。検出対象のmRNAは、ポリA配列を有していても、有していなくてもよい。RNAは、siRNA、miRNA、piRNA、rasiRNA、rRNA、tRNAを含むノンコーディングRNAであってもよく、さらに、ウイルスなどのゲノムRNAであってもよい。また、検出対象のRNAの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。疾患特異的に発現するRNAや疾患で発現量が変化するRNA、感染症などの疾患や中毒症などを引き起こすウイルスや病原菌由来のRNAなどが例示される。
一本鎖環状DNA鋳型は、標的RNAの第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む。
プライマー12は、標的RNA11の、第1の部位111の3’側に隣接した第2の部位112に相補的な8~15塩基の配列121と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNA鋳型10のプライマー結合部位102に相補的な7~8塩基の配列122と、を含む。なお、プライマーは担体に固定化するなどして固層化されてもよい。これにより固層での検出も可能となる。固層化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固層化する方法などが挙げられる。
標的RNA11に一本鎖環状DNA鋳型10およびプライマー12をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅(RCA)法によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う。
本発明の第2の態様にかかる標的RNA検出キットは、
(i)標的RNAの第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基の第1プライマー結合配列と、
第2一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む第1一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的RNAの、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第1一本鎖環状DNA鋳型の第1プライマー結合部位に相補的な7~8塩基の配列と、
を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)第1一本鎖環状DNAの第2一本鎖環状DNA結合配列と同一の配列と、
該配列の5’側に隣接した、第2プライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第2一本鎖環状DNAと、
(iv))第1一本鎖環状DNAの第2一本鎖環状DNA結合配列の5’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第2一本鎖環状DNAの第2プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(v)グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、とを含む。
標的RNAについては、第一の態様で説明したとおりである。
第1一本鎖環状DNA鋳型は、標的RNAの第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基のプライマー結合配列と、
第2一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む。
第1一本鎖環状DNA鋳型20は標的RNA21の第1の部位211に相補的な配列201と、
その5’側に連結したプライマー結合配列202と、第2一本鎖環状DNA結合配列203を含む。
配列201の長さは、通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。配列202の長さは7塩基または8塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは30~70%である。第1一本鎖環状DNA鋳型20全体の長さは、好ましくは35~100塩基である。第1一本鎖環状DNA鋳型20は上述した方法で、一本鎖DNA(ssDNA)を環状化することによって得ることができる。
第1オリゴヌクレオチドプライマー22は、標的RNA21の、第1の部位211の3’側に隣接した第2の部位212に相補的な8~15塩基の配列221と、その3’側に連結された、第1一本鎖環状DNA鋳型20のプライマー結合部位202に相補的な7~8塩基の配列222と、を含む。
第2一本鎖環状DNA鋳型24は、第1一本鎖環状DNA20の第2一本鎖環状DNA結合配列203と同一の配列241と、
該配列の5’側に隣接した、第2プライマー結合配列242と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列243と、
を含む。
配列203の長さは、通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。配列242の長さは7塩基または8塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは30~70%である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列243については、第一の態様で説明したのと同様である。第2一本鎖環状DNA鋳型24全体の長さは、好ましくは35~100塩基である。第2一本鎖環状DNA鋳型24は上述した方法で、一本鎖DNA(ssDNA)を環状化することによって得ることができる。
第2オリゴヌクレオチドプライマー25は、第1一本鎖環状DNA20の第2一本鎖環状DNA結合配列203の5’側に隣接した部位204と同一の配列251(好ましくは8~15塩基の配列)と、
該配列の3’側に隣接した、第2一本鎖環状DNAの第2プライマー結合配列242に相補的な配列252(好ましくは7~8塩基の配列)と、
を含む。
図14に示されるように、まず、標的RNA21に第1一本鎖環状DNA鋳型20およびプライマー22をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅(RCA)法によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的RNA21依存的に、プライマー22から第1一本鎖環状DNA鋳型20に沿って第1増幅産物23が増幅される。
このようにしてできた、第1増幅産物23と、第2一本鎖環状DNAの複合体に、第2オリゴヌクレオチドプライマー25がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
また、第2オリゴヌクレオチドプライマー25は、配列251の3’側に、第2一本鎖環状DNA24の第2プライマー結合配列242に相補的な配列252を有するので、第2一本鎖環状DNA24にも配列252を介してハイブリダイズする。
上記第一および第二の態様のいずれにおいても、RCAによって得られる増幅産物にはグアニン四重鎖が含まれるので、グアニン四重鎖結合試薬を用いて検出することができる。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
[1]チオフラビンT(ThT)またはその誘導体
[2]H-aggregate 『 Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
[3]TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
[4] PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
[5]BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan, D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
[6]APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
[7]チアゾールオレンジ(TO)
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
ここで、R1は水素、またはO、SおよびNから選ばれる1種類以上を含んでもよい炭素数1~10(好ましくは1~5)の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「O、SおよびNから選ばれる1種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基(-NR2)(Rは独立して水素または炭素数1~5のアルキル基)、ニトロ基(-NO2)、シアノ基(-CN)、イソシアネート基(-NCO)、ヒドロキシル基(-OH)、アルデヒド基(-CHO)、カルボキシル基(-COOH)、メルカプト基(-SH)、スルホン酸基(-SO3H)等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基(-O-)、イミノ基(-NH-)、チオエーテル基(-S-)、カルボニル基(-C(=O)-)、アミド基(-C(=O)-NH-)、エステル基(-C(=O)-O-)、チオエステル基(-C(=O)-S-)等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
XはO、SまたはNHを示し、より好ましくはOである。
以下、本発明の方法に使用し得る、グアニン四重鎖検出試薬の一例として、ThT誘導体の合成例と、ThT誘導体を用いたグアニン四重鎖検出の実験例を示す。
NMRスペクトルはJNM-ECS400およびJNM-ECA600(日本電子株式会社、東京、日本)を使用して測定された。ESIマススペクトルはAPI2000質量分析計(アプライドバイオシステムズ株式会社、東京、日本)を使用して測定された。蛍光スペクトルはLS-55蛍光分光光度計(株式会社パーキンエルマージャパン、神奈川、日本)を使用して測定された。
2-アミノ-6-メチルベンゾチアゾール、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(DHP)、ブロモ酢酸メチル、p-トルエンスルホン酸ピリジニウム(PPTS)、および水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)は東京化成工業株式会社(東京、日本)から購入したものである。シリカゲル60、トリフルオロ酢酸(TFA)は関東化学株式会社(東京、日本)から購入したものである。アセトニトリル(MeCN)、塩化アンモニウム、ジクロロメタン(CH2Cl2)、ジエチルエーテル、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)、リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)、エタノール(EtOH)、エチレングリコール、塩酸(HCl水溶液)、塩化マグネシウム六水和物(MgCl2・6H2O)、硫酸マグネシウム七水和物、メタノール(MeOH)、塩化カリウム(KCl)、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)、水酸化カリウム(KOH)、塩化ナトリウム(NaCl)、リン酸二水素ナトリウム二水和物(NaH2PO4・2H2O)、硫酸ナトリウム(Na2SO4)およびチオフラビンT(ThT)は和光純薬工業株式会社(大阪、日本)から購入したものである。ウシ胸腺DNA(ウシの胸腺由来のデオキシリボ核酸、XV型)、4-(ジメチルアミノ)ベンゾイルクロリドおよびTrizma(登録商標)塩基はSigma-Aldrich,Inc.(ミズーリ州、米国)から購入したものである。オリゴヌクレオチドは株式会社日本バイオサービス(埼玉、日本)および株式会社ジーンデザイン(大阪、日本)から購入したものである。
我々はThT中の候補置換部位として4つのメチル基に焦点を当てた。分子動態(MD)シミュレーションに基づいて、ベンゾチアゾール環上のN3位のメチル基のみがGカルテット平面と有意に重なり合うことが示唆された。したがって、我々はこの位置に置換基を導入することが異なるG4タイプを区別するための特異性を改善させることになるかもしれないと考えた。
そこで、最初に7ステップ反応により2-アミノ-6-メチルベンゾチアゾールからThT-DBとThT-HEを合成した。
ThT-HE: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.13-8.12 (1H, d) 7.90-7.89 (2H, d) 7.73 (1H, s) 7.62-7.61 (1H, d) 6.86-6.85 (2H, d) 4.94 (2H, s) 4.37 (2H, s) 3.16 (6H, s) 2.57 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 313.1, [M+]の計算値= 313.14;
ThT-DB: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.20-8.19 (1H, d) 7.79 (1H, s) 7.70-7.69 (2H, d) 7.61-7.60 (1H, d) 7.55-7.54 (2H, d) 6.75-6.74 (2H, d) 6.53-6.52 (2H, d) 5.49 (2H, s) 4.74 (2H, s) 3.12 (6H, s) 3.04 (6H, s) 2.55 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値=460.1, [M+]の計算値=460.21。
次に、様々なG4形成オリゴヌクレオチドが存在する状態でのThTとThT誘導体の蛍光特性とG4における化合物誘導性のトポロジー変化を調べた。
22mer DNA(22AG:5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' (配列番号1)および22Kit:5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'(配列番号2))、
26mer DNA(26Tel:5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'(配列番号3))、
27mer DNA(27Myc:5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'(配列番号4))、
20mer DNA(20Src:5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'(配列番号5))、および
18mer RNA(18Ras:5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'(配列番号6))。
テロメア領域(22AGおよび26Tel)、
c-MycP1プロモーターのヌクレアーゼ高感受性エレメント領域(27Myc)、
チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーンの転写開始部位の87ヌクレオチド上流域(22Kit)、
非受容体型チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーン(20Src)、および
ヒトNRASプロトオンコジーン転写物の5’非翻訳領域(18Ras)。
17mer DNA(ssDNA:5’-GGGTTACTACGAACTGG-3’(配列番号7))、及び
ssDNA の相補配列(cDNA:5’-CCAGTTCGTAGTAACCC-3’(配列番号8))。
ssDNAは一本鎖DNAとして使用し、cDNAはssDNAと1:1の比率で混合し、二本鎖DNA(dsDNA)として使用した。
TRS50K(50mMトリス塩酸、50mM KCl;pH7.2);
PBS150K(92mM HPO4 2-、150mM K+、15mM Na+;pH7.0);
PBS140KM(80mM HPO4 2-、2.5mM SO42-、140mM K+、10mM Na+、2.5mM Mg2+;pH7.4)、および
PBS153NM(10mM HPO4 2-、146mM Cl-、153mM Na+、2.7mM K+、2.5mM Mg2+;pH7.4)。
PBS150KとPBS140KMは細胞内イオン成分と似ており、PBS153NMは典型的なリン酸生理食塩水である。
8種類のオリゴヌクレオチド(22AG、26Tel、27Myc、22Kit、20Src、18Ras、ssDNA、およびdsDNA)を21μMの濃度でそれぞれ緩衝液TRS50K、PBS150K、PBS140KM、およびPBS153NMに溶解し、サーマルサイクラーを使用して95℃で0.5分間加熱して変性し(18Rasについては40℃で)、0.5℃/分の割合で25℃まで冷却することによってリフォールディングさせた。これらの溶液を適切なオリゴヌクレオチド濃度まで希釈し、アリコット(50μLずつ)を25℃で30分間保温し、次にそれぞれ緩衝液TRS50K、PBS150K、PBS140KM、およびPBS153NMの中の色素(ThT、ThT-DB、およびThT-HE;10.5μM)の20μLの溶液と混合した。さらに、これらの混合物を25℃で30分間保温した。色素の放射スペクトルは、415nmで励起し、450nmと600nmの間で蛍光をモニターすることにより得た。
図2にThT、ThT-DB、およびThT-HEを27MycまたはdsDNAと混合したときの結果を示し、図3-1~3-3にThT、ThT-DB、およびThT-HEを各種緩衝液中で、各種オリゴヌクレオチドと混合したときの結果を示す。
図2より、ThTはdsDNA存在下でもかなりの蛍光を発しバックグラウンドが高いのに対し、ThT-DB、およびThT-HEはdsDNA存在下ではほとんど蛍光を発しないのでグアニン四重鎖特異性が高いことがわかった。
Kd値を図3-4~3-6中の滴定曲線から決定し、表1に記載した。
表1の結果から、ThT-HEの標的G4への親和性は概してThTの標的G4への親和性と比べて低かったが、ThT-DBの標的G4への親和性はほぼ同等であった。
1.環状DNAテンプレートの作製
(1)5μMの1本鎖DNA(55mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Betaine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2)60℃で16時間インキュベートさせた。
(3)PAGE精製を行い、一本鎖環状DNAの生成を確認した。
1本鎖DNA(55mer)
phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAACCTTCCCCACCCTCCCCACCCT(配列番号9)
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)
(1)溶液の調製
Positive Control(POS_SYBR GoldおよびPOS_ThT誘導体)
200nMの環状DNAテンプレート 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー<1> 2μL(最終濃度160nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。
テンプレートとプライマーのみ(Sa1~6およびTa1~6)
200nMの環状DNA 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー(表2参照) 2μL(最終濃度160nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。
テンプレートとプライマーとターゲットRNA(Sb1~6およびTb1~6)
200nMの環状DNA 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー(表2参照) 2μL(最終濃度160nM)、800nMのターゲットRNA 2μL(80nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液
2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水6μLを混合した(計20μL)。
DNAプライマー<1>(20mer) GGA AGG TTT TAA AGG AGA AC(配列番号10)
DNAプライマー<2>(16mer) GGA TCA GGC CAT TTT T(配列番号11)
DNAプライマー<3>(18mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG(配列番号12)
DNAプライマー<4>(19mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG G(配列番号13)
DNAプライマー<5>(20mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG GG(配列番号14)
DNAプライマー<6>(21mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG GGA(配列番号15)
ターゲットRNA(40mer)
GGG UUG GCC AAA GGA GAA CCU CAA GCU CCU GGC CUG AUC C(配列番号16)
用いた試薬
phi29 DNA Polymerase(New England Biolabs Japan,東京,日本)
(1)で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。
(2)の反応溶液 16μLに5×PBS153NMバッファーを4μL加えた。これを94℃から25℃まで0.5℃ずつ温度を降下させアニーリングを行った。
アニーリングを行った溶液 10μLと蛍光色素(SaとSbには1×PBS153NMバッファーで800倍に希釈したSYBR Gold溶液、最終濃度4800倍、TaとTbには1×リン酸バッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度5μM)2μLを混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に256nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
ThT(チオフラビンT)誘導体 (ThT-HE)
SYBR Goldライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社,東京,日本
5×PBS153NM
50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO4 2-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
ポリメラーゼ反応では、設計上ターゲットであるRNA存在下で反応が進行することが望ましい。よってSaおよびTaは蛍光を発しないはずである。
一方、プライマーの長さはテンプレートとプライマーのみで反応が進行しない長さが望ましい。今回は16,18,19,20,21merの長さで検討を行った。
はじめにPOS_SYBRおよびPOS_ThT誘導体であるが、両者とも反応が進行して蛍光を発していることがわかる。
一方、ThT誘導体は、グアニン四重鎖を染色するため、RNAがないときは蛍光を発さず、RNAがあるときは蛍光を発するという、RNAの有無の検出に用いることができることが分かった。ただし、プライマーの一本鎖環状DNAにハイブリダイズする部分が長すぎるとRNAがなくとも増幅反応が起こってしまうので、プライマーの一本鎖環状DNAにハイブリダイズする部分の長さを7~8塩基にするのがよいことがわかった。
検出方法2 (ストレプトアビジンビーズを使用したRCA)(図6)
[1] 環状DNAテンプレートの作製
(1) 5μMの1本鎖DNA(55mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Betaine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で16時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。
1本鎖DNA(55mer)
phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAACCTTCCCCACCCTCCCCACCCT(配列番号17)
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)
(1) ストレプトアビジン担持磁気ビーズ(理論上4.5 pmolのビオチンと結合可能)に1×Phi29 polymerase bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×Phi29 polymerase bufferを除去した。これを2回繰り返した。
(2) (1)に1.6μM 5′ビオチン化DNAプライマーA及びB(1×Phi29 polymerase buffer に調製済み)を1μL加えて37℃、30分間インキュベートさせた。
(3) (2)に1×Phi29 polymerase bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×Phi29 polymerase bufferを除去した。これを2回繰り返した。
5′-ビオチン化DNAプライマーA (18mer)
5′-Biotin-GGA TCA GGC CAT TTT TGG-3′(配列番号18)
5′-ビオチン化DNAプライマーB (19mer)
5′-Biotin-GGA TCA GGC CAT TTT TGG G-3′(配列番号19)
使用した試薬
Streptavidin Mag Sepharose (GEヘルスケア・ジャパン株式会社, 東京, 日本)
(1) Reaction
5′-ビオチン化DNAプライマーA使用=サンプル<2>
5′-ビオチン化DNAプライマーB使用=サンプル<4>
調製したプライマー結合ストレプトアビジンビーズに200nMの環状DNAテンプレート 1μL(最終濃度20nM)、Target RNA 1μL (最終濃度80nM)、10×添付バッファー1μL、10×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 1μL (最終濃度1mM)、1U/μLのPhi29 Polymerase 1μL (最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計10μL)。
5′-ビオチン化DNAプライマーA使用=サンプル<1>
5′-ビオチン化DNAプライマーB使用=サンプル<3>
調製したプライマー結合ストレプトアビジンビーズに200nMの環状DNAテンプレート 1μL(最終濃度20nM)、10×添付バッファー1μL、10×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 1μL (最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 1μL (最終濃度0.1U/μL)、水5μLを混合した(計10μL)。
phi29 DNA Polymerase(New England Biolabs Japan,東京,日本)
1×PBS153NM: 10 mM HPO4 2-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
上記[3]で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。
(1) 1×PBS153NM bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×PBS153NM bufferを除去した。これを2回繰り返した。
(2) (1)に30μLのThT-HE溶液(ThT-HE:15μM、PBS153NM Buffer:1×)を反応液に加えた。ThT-HEの最終濃度は5μMでPBS153NMBufferは1×の濃度になる。
色素液添加後に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
プライマー結合ビーズ用いて反応を行ったところ、いずれのプライマーを用いた場合でもビーズを用いない方法(方法1)よりも蛍光の視認性が良くなった(図7)。
検出方法3 (2種類のテンプレート使用したRCA)
[1] テンプレートの作製
(1) 5μMの1本鎖DNA(Cid_Pre_T:67mer, Cid_Mai_T:62mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Beatine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で24時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。
Cid_Pre_T (67mer)
Phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAAAGAAGCTGTTGTATTGTTGTCGAAGAAGAAAAGT(配列番号20)
Cid_Mai_T (62mer)
Phosphate-CCCAACCCTACCCACCCTCAAGAAAAAAAAGTGATAATTGTTGTCGAAGAAGAAAAAAAATT(配列番号21)
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)
環状Cid_Pre_T:(67mer)
CCC CAA AAA GGA GCT TGA GGT TCT CCT TTA AAA AGA AGC TGT TGT ATT GTT GTC GAA GAA GAA AAG T(配列番号20)
両端で結合して環状化している。
環状Cid_Mai_T:(62mer)
CCC AAC CCT ACC CAC CCT CAA GAA AAA AAA GTG ATA ATT GTT GTC GAA GAA GAA AAA AAA TT(配列番号21)
両端で結合して環状化している。
Cid_Pre_PP:(20mer)
AAC CTC AAG CTC CTT TTT GG(配列番号22)
Cid_P18:(18mer)
GGA TCA GGC CAT TTT TGG(配列番号23)
Cid_Mai_PP:(22mer)
TCT TCG ACA ACA ATT ATC ACT T(配列番号24)
Cid_Mai_P18:(18mer)
GAA GCT GTT GTT ATC ACT(配列番号25)
Pre-amplifier template (環状Cid_Pre_T) 4nM
Pre-amplifier primer (Cid_P18 or Cid_Pre_PP) 40nM
Target RNA 2nM
Main-amplifier template (環状Cid_Mai_T) 40nM
Main-amplifier primer (Cid_Mai_P18 or Cid Mai_PP) 200nM
Phi29 polymerase buffer 1×
BSA (Bovine serum albumin) 0.1mg/μL
dNTPs (dATP, TTP, dGTP, dCTP) 1mM
Phi29 polymerase 0.05U/μL
<1> Negative control
5μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
<2>Negative control (Cid_Mai_P18のみで反応しないことの確認)4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度:200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
<3>Negative control (Cid_P18添加で反応しないことの確認)
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度 1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度:40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
<4>Negative control (RNA添加で反応しないことの確認)
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、20nM Target RNA (最終濃度:2nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
<5>Negative control (pre側の反応進行によってMain側が反応しないことの確認)
3μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度:4nM)、400nM Cid_Pre_PP (最終濃度:40nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。(図8)
<6>Negative control (pre側の反応進行によってMain側が反応しないことの確認)
2μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template (最終濃度:4nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度:40nM)、20nM Target RNA (最終濃度:2nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。(図9)
<7>Positive control
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、2μM Cid_Mai_PP (最終濃度:200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。(図10)
<8>Positive control (pre側の反応進行によってMain側が反応することの確認)
2μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度:4nM)、400nM Cid_Pre_PP (最終濃度:40nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度:200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。(図11)
<9>Reaction
1μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度:1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度:0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度:4nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度:40nM)、20nM Target RNA (最終濃度:2nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度:40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度:200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。(図12)
反応液の調製は96wellプレートを使って行った。37℃で1時間反応させた。
20μLのThT-HE溶液(ThT-HE:15μM、PBS153NM Buffer:1.5×)を反応液に加えた。ThT-HEの最終濃度は5μMでPBS153NMBufferは1×の濃度になる。
1×PBS153NM
10 mM HPO4 2-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
色素液添加後に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
グアニン四重鎖を生成する反応は<7>、<8>、<9>である(図13)。他のNegative controlにおいては蛍光がほとんど確認できなかった。このことから、Main側の反応の制御能が高いといえる。また、環状テンプレートが1つの場合よりもTarget RNAの濃度は低くできることから高い検出能も達成できた。
Claims (7)
- (i)標的核酸の第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基のプライマー結合配列と、
検出用試薬結合配列と相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的核酸の、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な7~8
塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)検出用試薬と、
を含む核酸検出用キット。 - (i)標的核酸の第1の部位に相補的な10~30塩基の配列と、
該配列の5’側に隣接した、7~8塩基の第1プライマー結合配列と、
第2一本鎖環状DNA鋳型結合配列と、
を含む第1一本鎖環状DNA鋳型と、
(ii)標的核酸の、第1の部位の3’側に隣接した第2の部位に相補的な8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第1一本鎖環状DNA鋳型の第1プライマー結合部位に相補的
な7~8塩基の配列と、
を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(iii)第1一本鎖環状DNA鋳型の第2一本鎖環状DNA鋳型結合配列と同一の配列と、
該配列の5’側に隣接した、第2プライマー結合配列と、
検出用試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第2一本鎖環状DNA鋳型と、
(iv)第1一本鎖環状DNA鋳型の第2一本鎖環状DNA鋳型結合配列の5’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第2一本鎖環状DNA鋳型の第2プライマー結合配列に相補的
な配列と、
を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(v)検出用試薬、と
を含む、核酸検出用キット。 - 前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項1または2に記載の核酸検出用キット。
- グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がC3N1-10C3N1-10C3N1-10C3配列を含む、請求項3に記載の核酸検出用キット。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のキットを使用した標的核酸の検出方法であって、
標的核酸に前記一本鎖環状DNA鋳型および前記プライマーをハイブリダイズさせる工程、
ローリングサークル増幅によって標的核酸に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された検出用試薬結合配列含有配列を検出用試薬によって検出する工程、
を含む方法。
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