JP2004339202A - 6員環を有するヌクレオチドアナログ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】6員環部分を含む化合物、特に、オリゴマー化合物を構築するために使用され得るヘキシトールまたはシクロヘキセン部分を含む特定の化合物、ハイブリダイゼーションのためおよびプローブとしてのこれらのオリゴマー化合物の使用、ならびに当該オリゴマー化合物が使用される、サンプル中の核酸の検出方法。
【選択図】なし
Description
(1)核酸の糖リン酸重合体骨格に連結および/または組み込まれ得、
(2)それの相補的標的配列との修飾オリゴヌクレオチドの対合を妨げず、
(3)1つ以上の標識の付着のための官能基を供給する
ことである。
(a)塩基の対合を妨害し得る、
(b)十分な厳密さの骨格構造を提供し得ない、
(c)低い水溶解性を生じる疎水性構造を主に提供し得る、
(d)化学的修飾に対して限られた影響のみを提供し得る、または
(e)エナンシオマーの混合物を含み得る
ように、注意深く選択されなければならない。
〔1〕式I:
Bは複素環式塩基であり、
R1はR2、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R1は
(1)保護基、
(2)標識、
(3)固相、および
(4)-H
からなる群より選択され、
R2はR1、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R2は-Hおよび-OR6からなる群より選択され、
R3はR1、R2、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R3は
(1)保護基、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)ホスホルアミダイト、
(4)H-ホスホネート、および
(5)トリホスフェート
からなる群より選択され、
R4はR1、R2、R3、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R4は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
R6はR1、R2、R3、R4、R5、R5a、およびR5bから独立し、R6は
(1)-H
(2)保護基、
(3)固相に共有結合された連結部分、
(4)ホスホルアミダイト、および
(5)H-ホスホネート
からなる群より選択され、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R1、R2、R3、R4およびR6から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される
を有する化合物、
(1)フルオレセイン色素、
(2)ローダミン色素、
(3)シアニン色素、
(4)クマリン色素、および
(5)アゾ色素
からなる群より選択されることを特徴とする〔5〕記載の化合物、
R3がR1、R2、R4、R5、R5a、R5b、およびR6から独立し、R3が保護基または連結部分に共有結合された固相である
ことを特徴とする〔1〕〜〔9〕いずれか記載の化合物、
S-B-L-R7
式中、Sは6員環を含む部分であり、
Bは複素環式塩基であり、
Lは連結部分であり、
R7は標識、保護基または固相である
を有するモノマー単位を含んでなるオリゴマー化合物、
Bは複素環式塩基であり、
R7はR5、R5a、R5b、R8、R9、R10、およびR11から独立し、R7は
(1)保護基、
(2)標識、および
(3)固相
からなる群より選択され、
R8はR5、R5a、R5b、R7、R9、R10、およびR11から独立し、R8は-Hおよび-OR11からなる群より選択され、
R9およびR11は互いに独立し、R5、R5a、R5b、R7、R8またはR10から独立し、R9およびR11は
(1)-H、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)ホスフェート、および
(4)ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを有するホスホジエステル
からなる群より選択され、
R10はR5、R5a、R5b、R7、R8、R9およびR11から独立し、R10は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R7、R8、R9、R10およびR11から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される
を有するモノマー単位を有する〔13〕または〔14〕記載のオリゴマー化合物、
(1)フルオレセイン色素、
(2)ローダミン色素、
(3)シアニン色素、
(4)クマリン色素、および
(5)アゾ色素
からなる群より選択されることを特徴とする〔20〕記載のオリゴマー化合物、
(b)固相に結合されたヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの-OH基を別の-0H基によって提供する工程、あるいは固相に結合されたオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの-OH基を該オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの3'末端の該ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの別の-OH基によって提供する工程、
(c)ホスホルアミダイトのリン原子を遊離OH基と反応させて、亜リン酸エステルを形成し、該亜リン酸エステルをホスホトリエステルに酸化する工程、
(d)任意に、工程(c)の任意の未反応-OH基を別の化合物と反応させて、次工程における工程(c)の未反応5'-OH基の任意のさらなる反応を防止する工程、
(e)任意に、工程(d)の生成物のヒドロキシル保護基の除去後、ヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたは〔1〕〜〔12〕いずれか記載の化合物(式中、R2は-OR6であり、R6はホスホルアミダイトであり、R3は保護基である)のホスホルアミダイト誘導体を用いて工程(c)〜(d)を繰り返して、遊離-OH基を提供する工程、
(f)固相からオリゴマー化合物を切断し、保護基を除去し、ホスホトリエステルをホスホジエステルに変換する工程、ならびに
(g)オリゴマー化合物を単離する工程
を含む、〔13〕〜〔25〕いずれか記載のオリゴマー化合物の化学合成のための方法、
(b)任意に、ターミナルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼの存在下、工程(a)の生成物の3'末端の伸長可能なOH基をヌクレオシドトリホスフェートまたは修飾ヌクレオシドトリホスフェートとインキュベートし、それにより該ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが3'-OH基に結合され、それによりピロホスフェートが放出される工程、
(c)任意に、工程(a)または(b)あるいは両方を繰り返す工程、ならびに
(d)オリゴマー化合物を単離する工程
を含む、〔13〕〜〔25〕いずれか記載のオリゴマー化合物の酵素的合成のための方法、
(b)標的核酸の一部または全部と本質的に相補的な〔13〕〜〔25〕いずれか記載のオリゴマー化合物を提供する工程、
(c)任意に、鋳型依存性DNAポリメラーゼおよびプライマーを用いて標的核酸を増幅する工程、
(d)オリゴマー化合物が標的核酸に結合する条件下でサンプルとオリゴマー化合物とを接触させる工程、ならびに
(e)標的核酸の存在、非存在または量の基準として標的核酸とオリゴマー化合物との間の結合生成物またはハイブリダイゼーションの程度を測定する工程
を含む、サンプルにおける標的核酸の検出のための方法、
ならびに該第一プローブのドナー蛍光標識と該第二プローブのアクセプター蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の存在または非存在を検出する工程であって、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移の存在がサンプル中の標的核酸の存在の指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移の非存在がサンプル中の標的核酸の非存在の指標である、工程
を含む、〔33〕記載の方法、
b)標的核酸から二本鎖相補DNAを合成する工程、
c)〔1〕〜〔12〕いずれか記載の化合物およびヌクレオシドトリホスフェートの存在下で標的核酸を増幅し、それにより標識された標的核酸が得られる工程、
d)標識された標的核酸をオリゴマー化合物のアレイに画定された位置でハイブリダイズする工程、ならびに
e)各画定された位置での蛍光強度を測定し、それにより標的核酸の存在または量が測定される工程
を含む、サンプル中の標的核酸の存在または量を測定するための方法、
プライマーセット、
ヌクレオチド、および
〔13〕〜〔25〕いずれか記載のオリゴマー化合物(式中、R7は標識である)
を含有してなるパーツキット、ならびに
ヌクレオシドトリホスフェート、および
ポリメラーゼ
を含有してなるパーツキット。
Bは複素環式塩基であり、
R1はR2、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、
R1は
(1)保護基、
(2)標識、
(3)固相、および
(4)-H
からなる群より選択され、
R2はR1、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、
R2は-Hおよび-OR6からなる群より選択され、
R3はR1、R2、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、
R3は
(1)保護基、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)ホスホルアミダイト、
(4)H-ホスホネート、および
(5)トリホスフェート
からなる群より選択され、
R4はR1、R2、R3、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R4は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
R6はR1、R2、R3、R4、R5、R5a、およびR5bから独立し、
R6は
(1)-H
(2)保護基、
(3)固相に共有結合された連結部分、
(4)ホスホルアミダイト、および
(5)H-ホスホネート
からなる群より選択され、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R1、R2、R3、R4およびR6から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される)
である。
(a)本発明の化合物がポリメラーゼにより認識され、そしてR3がトリホスフェートである場合には、重合反応の間に成長しつつある核酸鎖に組込むことができ、
(b)本発明の化合物は、核酸鎖にいったん組込まれると、好ましくは、相補的塩基に塩基対合することができ、すなわち、増幅反応により生成されるプローブのハイブリダイゼーション能力は、好ましくは、有意には影響をうけないべきであり;そして
(c)基R1の挿入が意図されない場合は、相互作用または消光効果を避けるためには、基R1を標的核酸から離して保つ。
(1)フルオレセイン色素、
(2)ローダミン色素、
(3)シアニン色素、
(4)クマリン色素、および
(5)アゾ色素
からなる群より選択される。
Bは複素環式塩基であり、
R7はR5、R5a、R5b、R8、R9、R10、およびR11から独立し、
R7は
(1)保護基、
(2)標識、
(3)固相、および
(4)-H
からなる群より選択され、
R8はR5、R5a、R5b、R7、R9、R10、およびR11から独立し、
R8は-Hおよび-OR11からなる群より選択され、
R9およびR11は互いに独立し、R5、R5a、R5b、R7、R8またはR10から独立し、
R9およびR11は
(1)-H、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)リン酸塩、および
(4)ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを有するホスホジエステル
からなる群より選択され、
R10はR5、R5a、R5b、R7、R8、R9およびR11から独立し、R10は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R7、R8、R9、R10およびR11から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される。
(a)本発明の化合物がポリメラーゼにより認識され、そしてR3がトリホスフェートである場合には、重合反応の間に成長しつつある核酸鎖に組込むことができ、
(b)本発明の化合物は、核酸鎖にいったん組込まれると、好ましくは、相補的塩基に塩基対合することができ、すなわち、増幅反応により生成されるプローブのハイブリダイゼーション能力は、好ましくは、有意には影響をうけないべきであり;そして
(c)基R1の挿入が意図されない場合は、相互作用または消光効果を避けるためには、基R1を標的核酸から離して保つ。
(1)フルオレセイン色素、
(2)ローダミン色素、
(3)シアニン色素、
(4)クマリン色素、および
(5)アゾ色素
からなる群より選択される。
(1)ヌクレオチドに連結させた第二の標識を有している連結部分、または
(2)修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物に連結させた第二の標識を有している連結部分
であるモノマー単位を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、第二の標識は、好ましくは蛍光であり、そして好ましくは、
(1)フルオレセイン色素、
(2)ローダミン色素、
(3)シアニン色素、
(4)クマリン色素、および
(5)アゾ色素
からなる群より選択される第二の色素である。
(a)R2が-OR6であり、R6がホスホルアミダイトであり、R3が保護基である本発明の化合物を提供する工程、
(b)固相に結合されたヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの-OH基を別の-0H基によって提供する工程、あるいは固相に結合されたオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの-OH基を該オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの3'末端の該ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの別の-OH基によって提供する工程、
(c)ホスホルアミダイトのリン原子を遊離-OH基と反応させて、亜リン酸エステルを形成し、該亜リン酸エステルをホスホトリエステルに酸化する工程、
(d)任意に、工程(c)の任意の未反応-OH基を別の化合物と反応させて、次工程における工程(c)の未反応5'-OH基の任意のさらなる反応(「キャッピング」反応)を防止する工程、
(e)任意に、工程(d)の生成物のヒドロキシル保護基の除去後、ヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたは本発明の化合物(式中、R2は-OR6であり、R6はホスホルアミダイトであり、R3は保護基である)のホスホルアミダイト誘導体を用いて工程(c)〜(d)を繰り返して、遊離-OH基を提供する工程、ならびに
(f)固相からオリゴマー化合物を切断し、保護基を除去し、ホスホトリエステルをホスホジエステルに変換する工程、ならびに
(g)オリゴマー化合物を単離する工程
を含む、本発明のオリゴマー化合物の化学合成のための方法を提供する。
(a)ターミナルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼの存在下、R3がトリホスフェートである本発明の化合物を、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの好ましくは伸長可能なOH基とインキュベートし、それにより該化合物が好ましくは伸長可能なOH基に結合され、それによりピロホスフェートが放出される工程、
(b)任意に、ターミナルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼの存在下、工程(a)の生成物の3'末端の好ましくは伸長可能なOH基をヌクレオシドトリホスフェートまたは修飾ヌクレオシドトリホスフェートとインキュベートし、それにより該ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが好ましくは伸長可能なOH基に結合され、それによりピロホスフェートが放出される工程、
(c)任意に、工程(a)または(b)あるいは両方を繰り返す工程、ならびに
(d)オリゴマー化合物を単離する工程
含む、本発明のオリゴマー化合物の酵素的合成のための方法を提供する。
(a)標的核酸を含むと推測されるサンプルを提供する工程、
(b)標的核酸の一部または全部と本質的に相補的な本発明のオリゴマー化合物を提供する工程、
(c)任意に、鋳型依存性DNAポリメラーゼおよびプライマーを用いて標的核酸を増幅する工程、
(d)オリゴマー化合物が標的核酸に結合する条件下でサンプルとオリゴマー化合物とを接触させる工程、ならびに
(e)標的核酸の存在、非存在または量の基準として結合生成物または標的核酸とオリゴマー化合物との間のハイブリダイゼーションの程度を測定する工程
を含む、サンプル中の標的核酸の検出のための方法を提供する。
(a)一本鎖核酸を含むサンプルを、標的核酸の領域に相補的な配列および本発明のオリゴマー化合物を含むオリゴヌクレオチドと接触させ(ここで、R7は蛍光標識であり、オリゴマー化合物は第二の蛍光標識を含み、ここで、上記オリゴマー化合物は同じ標的核酸配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含むが、オリゴヌクレオチドにより定義される核酸配列は含まない)、ハイブリダイゼーション条件の間に2本鎖の混合物を作製する工程(ここで、該2本鎖は、第一のオリゴヌクレオチドの3'末端がオリゴマー化合物の5'末端の上流であるように、オリゴヌクレオチドおよびオリゴマー化合物にアニールされた標的核酸を含む)、
(b)ポリメラーゼの5'から3'までのヌクレアーゼ活性がアリールされたオリゴマー化合物を切断し、標識フラグメントを放出させるのに十分な条件下で、5'から3'までのヌクレアーゼ活性を示す工程(a)の混合物を維持する工程、ならびに
(c)標識フラグメントの放出の検出および/または測定工程
を含む、サンプル中の標的核酸の検出のための方法を提供する。
少なくとも1つのサイクリング工程を実施する工程、ここで、サイクリング工程が増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み、ここで、該増幅工程がサンプルとプライマーとを接触させて、標的核酸が該サンプル中に存在する場合、増幅生成物を生成する工程を含み、ここで、該ハイブリダイズ工程が該サンプルと1対のプローブとを接触させる工程を含み、ここで、該プローブ対のメンバーが互いにわずか5ヌクレオチド以内で該増幅生成物にハイブリダイズし、ここで、該プローブ対の第一プローブがドナー蛍光標識で標識され、該プローブ対の第二プローブが対応するアクセプター蛍光標識で標識され、該プローブのうちの1つが本発明のオリゴマー化合物である、
ならびに該第一プローブのドナー蛍光標識と該第二プローブのアクセプター蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の存在または非存在を検出する工程、ここで、FRETの存在がサンプル中の標的核酸の存在の指標であり、FRETの非存在がサンプル中の標的核酸の非存在の指標である
を含む、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法を提供する。
a)分析対象のサンプルから標的核酸を提供する工程、
b)標的核酸から二本鎖相補DNAを合成する工程、
c)本発明の化合物およびヌクレオシドトリホスフェートの存在下で標的核酸を増幅し、それにより標識された標的核酸が得られる工程、
d)標識された標的核酸をオリゴマー化合物のアレイに画定された位置でハイブリダイズする工程、ならびに
e)各画定された位置での蛍光強度を測定し、それにより標的核酸の存在または量が測定される工程
を含む。これは、アレイフォーマットを使用する標的核酸の検出のために使用される方法である。好ましくは、米国特許第5,545,522号;第5,716,785号;米国特許第5,891,636号;米国特許第6,291,170号で記述される方法は、本発明の方法の工程b)およびc)で使用され、それにより、二本鎖cDNAは細菌T7-プロモーターを含有しているプライマーで合成され、標識RNAはリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下で転写され、それにより標識はヌクレオシドトリホスフェートのいくつかに連結される。この場合には標的核酸は、好ましくはリボ核酸である。
N-Fmoc-N'-アクリリル-1,6-ジアミノヘキサン
1.26g(3ミリモル)のFmocジアミノヘキサン(BachemQ 2045)を含有する90mlの無水(abs)クロロホルムに、1.70ml(12ミリモル)のトリエチルアミンを添加した。混合液を、0℃まで冷却し、そして300μl(3.6ミリモル)の塩化アクリル酸を滴下した。混合物を、室温まで加温させ、そして一晩攪拌した。懸濁液を濾過し、そして濾液を、回転エバポレーターで蒸発させた。残りを、溶出剤としてクロロホルム/メタノール4:1(シリカゲル上のTLC対照クロロホルム/メタノール4:1:Rf=0.75)を用いてシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
5.8mg(0.023ミリモル)の酢酸パラジウム(Aldrich20,586-9)、13mg(0.05ミリモル)のトリフェニルホスフィン(Merck 808270)および86μl(0.61ミリモル)のトリエチルアミンを、15分間、16mlの無水ジオキサンで還流させた。その後、392mg(1ミリモル)のN-Fmoc-N'-アクリリル-1,6-ジアミノヘキサンおよび180mg(0.47ミリモル)の1,5-無水-2,3-ジデオキシ-2-(5-ヨードウラシル-1-イル)-D-アラビノ-ヘキシトール(Verheggen,I.ら、J.Med.Chem.38巻(1995年)826-835頁)を添加し、そして混合液を、80℃で3時間、加熱した。混合液を、室温まで冷却させ、そして濾過した。濾液を、回転エバポレーターを使用することによって、乾固するまで蒸発させた。残りを、溶出剤としてクロロホルム/メタノール5:1(TLCシリカゲル:クロロホルム/メタノール4:1:Rf=0.47)を用いてシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
生成物を含む画分を収集し、そして回転エバポレーターを使用して乾固するまで蒸発させた。収量:210mg。
200mg(0.32ミリモル)の1,5-無水-2-(5-(6-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ-ヘキシルカルバモイル)-ビニル)-ウラシル-1イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトールを、3×5mlの無水ピリジンと同時蒸発させ、そしてその後、5mlの無水ピリジンに溶解させた。その後、140mg(0.39ミリモル)の4,4'-塩化ジメトキシトリチルを含有する5mlのピリジンを、攪拌しながら、15分以内で室温にて添加する。反応混合液を、さらに2時間、室温で攪拌した。その後、ピリジンを蒸発させ、そして残渣を、50mlの酢酸エチルで溶解させ、そして50mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で二回洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして乾固するまで蒸発させた。残渣を、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル/1%トリエチルアミン勾配)により精製した。生成物画分を合わせ、蒸発させ、そして高真空で乾燥させた。収量:235mg。
200mg(0.21ミリモル)の6-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-1,5-無水-2-(5-(6-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ-ヘキシルカルバモイル)-ビニル)-ウラシル-1イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトールを、Ar雰囲気下で、5mlのジクロロメタン中に溶解させた。その後、68μl(0.38ミリモル)のN-エチルジイソプロピルアミン、そして15分以内に、72mg(0.28ミリモル)のクロロ-2-シアノエチオキシ-ジイソプロピルアミノ-ホスファンを含有する5mlのジクロロメタンを添加した。反応混合液を、室温で1時間攪拌した。その後、10mlのジクロロメタンを添加した。反応混合液を、20mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で二回洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして乾固するまで蒸発させた。残渣を、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー(n-ヘキサン/アセトン勾配)により精製した。生成物画分を合わせ、蒸発させ、そして高真空で乾燥させた。収量:170mg。
1,5-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール6モノホスフェートジリチウム塩
127mg(0.48ミリモル)の1,5-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール(Verheggen,I.ら、J.Med.Chem.36巻(1993年)2033-2040頁)を、12mlトリエチルホスフェートに溶解させ、そして260μlジイソプロピルエチルアミンを添加した。フラスコを、氷浴で、0〜4℃まで冷却し、36μlホスホルオキシクリロドを添加した。0〜4℃で10分間、攪拌した後、トリエチルアミン/酢酸緩衝液0.1M(pH8.5)を添加した。溶媒を、回転エバポレーターを使用して40℃で、0.1mbarで蒸発させた。残渣を、20mlの水に溶解させ、そして260nmでのUV/VIS検出器により監視しながら、DEAEセファデックスA25Cl上のイオン交換(緩衝液A水、緩衝液B0.5M LiCl、100%Bまで60分での勾配)により精製した。対応の画分を収集し、そして減圧下で、1〜3mlの体積まで蒸発させた。生成物溶液を、200mlのアセトン/エタノールの2:1混合液に添加した。懸濁液を遠心分離し、生じたペレットをアセトンで3回洗浄して、LiClを除去し、その後、高真空で乾燥させた。収量120mg。
5ml乾燥ピリジンを、120mg(0.34ミリモル)の1,5-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール6モノホスフェートジリチウム塩および250mg(1.2ミリモル)の1,2-ビス[(ジメチルアミノ)メチレン]ヒドラジンに添加し、そして混合液を、蒸発させた。
工程IIの残り(1,5-無水-2-(6-(1,2,4-トリアゾル-4-イル)-プリン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール-6-モノホスフェート)を、20mlの水に溶解させ、濾過し、そして80℃で15時間、1mlジアミノヘキサンと反応させた。混合液を、減圧下で蒸発させた。残渣を、5mlの0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH=8)に溶解させ、そして260nmで監視しながら、0.1mから0.3Mまでの重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配形態を使用して、DEAEセファデックスA25上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。適切な画分(TLC上でのニンヒドリンでの発色)を収集し、そして減圧下で蒸発させた。残渣を、水で希釈し、そして再度、真空で蒸発させた。この方法を、3回繰返した。収量80mg。
80mg(0.12ミリモル)N6-(6-アミノヘキシル)-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール-6-モノホスフェートビストリエチルアンモニウム塩を、10mlの水に溶解させ、10mlのS-エチルトリフルオロチオアセテートを添加し、そして5M水酸化リチウムを用いてpHを10に調整した。混合液を、室温で4時間攪拌した。混合液を、25ml0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH=8)で希釈した。溶液を、DEAEセファデックスカラムにかけ、そして260nmで監視しながら、0.1〜0.4Mまでの重炭酸トリエチルアンモニウム(pH8)の勾配で溶出させた。トリフルオロアセチル化生成物を含む画分を収集し、そして減圧下で蒸発させた。過剰の重炭酸トリエチルアンモニウムを、数回の水との同時蒸発により除去した。収量82mg。
82mg(0.11ミリモル)N6-(6-トリフルオロアセトアミノヘキシル)-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール-6-モノホスフェートビストリエチルアンモニウム塩を、3ml乾燥DMF中に溶解させ、89mg(0.55ミリモル)カルボニルジイミダゾールを添加し、混合液を、室温で2時間攪拌した。0.5mlメタノールを添加し、そして混合液を、室温(RT)で20分間攪拌した。メタノールを減圧下での蒸発により除去した。その後、0.7mlの0.8Mビストリブチルアンモニウムピロホスフェートを含有するDMF(0.55ミリモル)溶液を添加した。混合液を、室温で、一晩攪拌した。溶媒を、回転エバポレーターを使用することにより、40℃で、0.1mbarで蒸発させた。残渣を、5mlの0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH=8)に溶解させた。溶液を、DEAEセファデックスカラムにかけ、そして260nmで監視しながら、0.1〜1Mまでの重炭酸トリエチルアンモニウム(pH8)の勾配で溶出させた。トリホスフェートを含む画分を収集し、そして減圧下で蒸発させた。過剰の重炭酸トリエチルアンモニウムを、数回の水との同時蒸発により除去した。収量69mg。
69mg(0.06ミリモル)N6-(6-トリフルオロアセトアミノヘキシル)-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール-6-トリホスフェートを、4mlの水に溶解させ、添加し、そしてpHを、6MNaOHで、11.5に調整した。混合液を、室温で4時間攪拌した。その後、pHを、2M HClでpH8に調整し、そして10mlの0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH=8)を添加した。溶液を、DEAEセファデックスカラムにかけ、そして260nmで監視しながら、0.1〜1.0Mまでの重炭酸トリエチルアンモニウム(pH8)の勾配で溶出させた。トリホスフェートを含む画分を収集し、そして真空で蒸発させた。アミノ基の存在を、ニンヒドリン反応により確認した。過剰な重炭酸トリエチルアンモニウムを、数回の水との同時蒸発により除去した。収量40mg。
40mg(0.03ミリモル)N6-(6-アミノヘキシル)-無水-2-(アデニン-9-イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール-6-トリホスフェートテトラトリエチルアンモニウム塩を、250μlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解させた。25mg(0.055ミリモル)ビオチンヘキサンカルボン酸NHSエステル(Sigma注文番号B2643)を含有する800μlのアミン非含有DMF溶液を添加した。混合液を、室温で一晩攪拌した。溶媒を、真空で蒸発させた。残りを、5mlの0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH=8)に溶解させた。溶液を、DEAEセファデックスカラムにかけ、そして260nmで監視しながら、0.2〜1.2M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH8)による勾配で溶出させた。ビオチニル化トリホスフェートを含む画分を収集し、そして真空で蒸発させた。過剰の重炭酸トリエチルアンモニウムを、水との数回の同時蒸発により蒸発させた。収量15mg。NMR(BrukerDPX300、溶媒D2O)。1H [ppm]: 1.10-1.85 (m) [22H], 2.18 (m) [4H], 2.45(d broad) [1H], 2.65(d) [1H], 2.85(dd) [1H], 3.08(m) [4H],3.56(s,broad) [2H], 3.61 (m) [2H], 3.79(m) [1H], 4.08 (d) [1H], 4.28(m) [4H],4.50 (dd) [1H],8.20 (s) [1H], 8.42(s) [1H], 31P [ppm]: - 21.77 (t);10.08 (d); 9.50 (d)
この化合物を、上記と同じ合成経路を使用することにより、9-[1R,3S,4R)-3-ヒドロキシ-4-ヒドロキシメチルシクロヘキセニル]アデニン(Wang,J.、Herdewijn,P.、J.Org.Chem.64巻(1999年)7820-7827頁)から合成した。
200mg(0.82ミリモル)1,5-無水-2-(ウラシル-1イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール(Verheggen,I.ら、J.Med.Chem.38巻(1995年)826-835頁)を、上記の手順により、150mg(0.44ミリモル)のモノホスフェートに変換した。モノホスフェートを、Moffat,J.G., Khorana, H.G. J. Am. Chem. Soc. 1961年、83巻、649-658頁に記載されている手順によりトリホスフェートに変換した。したがって、150mg(0.44ミリモル)の1,5-無水-2-(ウラシル-1イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール6モノホスフェートジリチウム塩を、DowexH+型50X8-100カラムを通過させることにより、遊離酸に変換した。これを、水で溶出させ、そして紫外線吸収画分を収集し、そして2mlまで濃縮した。2mlのtertブチルアルコールを添加し、そして混合液を、還流コンデンサーおよびゴム隔壁を具備した二首フラスコに移した。注射針を使用して、0.3ml(3ミリモル)モルホリンを添加した。混合液を、還流するまで加熱し、そして0.6mg(2.9ミリモル)ジクロロヘキシルカルボジイミドを含有する3mltertブチルアルコール溶液を、2時間かけて滴下した。混合液を、15時間還流させた。混合液を、室温まで冷却し、そして濾過した。濾液を、2mlまで濃縮し、そして濃縮液を、ジエチルエーテルで三回抽出した。水相を、真空で乾固するまで蒸発させた。残渣を、5mlDMFに溶解させ、そして、2.8mlのビストリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェートの0.8M溶液を含有するDMF(2.2ミリモル)溶液に添加した。混合液を、室温で、アルゴン下で一晩攪拌した。回転エバポレーターを使用することにより、溶媒を、40℃で減圧下で蒸発させた。残渣を5mlの水に溶解させた。溶液を、DEAEにかけた。トリホスフェートを含む画分を収集し、そして真空セファデックスカラム下で5mlまで濃縮し、そして260nmで監視しながら、0.1〜1.2M塩化リチウムの勾配で溶出させた。生成物溶液を、400mlのアセトン/エタノールの2:1混合液に添加した。懸濁液を遠心分離し、得られたペレットを、アセトンで3回洗浄して、LiClを除去し、その後、高真空で乾燥させた。収量100mg。
100mg(0.19ミリモル)の1,5-無水-2-(ウラシル-1イル)-2,3-ジデオキシ-D-アラビノ-ヘキシトール6トリホスフェートおよび106mg(0.33ミリモル)酢酸水銀IIを、5mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中に溶解させた。混合液を、50℃で、4時間攪拌した。室温まで冷却した後、混合液を、40mlの水で希釈した。新たに作製した酢酸アリルアミン溶液(0.77ml(13ミリモル))を、4M酢酸で中和し、そして150mg(1.5ミリモル)ジカリウムテトラクロロパラジネートを添加し、そして混合液を、室温で、24時間攪拌した。反応混合液を、0.45μm膜フィルターを通して濾過し、そして濾液を、DEAE-セファデックスカラムにかけ、そしてそれを、260nmで監視しながら、0.1〜1M重炭酸トリエチルアンモニウム(pH8)の勾配で溶出させた。主要UVピークを収集し(ニンヒドリン反応陽性)、そしてRP18Hypersilカラム上で、260nmで監視しながら、緩衝液100%A:0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(pH8.0)から100%緩衝液B:0.1M酢酸トリエチルアンモニウム/アセトニトリル1:1までの勾配で逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。アミノアリルトリホスフェートを含む画分を収集し、そして真空で蒸発させた。アミノ基の存在を、ニンヒドリン反応により確証した。過剰酢酸トリエチルアンモニウムを、水との数回の同時蒸発により除去した。収量80mg。
80mg(0.08ミリモル)を、上記の手順によりビオチンヘキサカルボン酸NHSエステル(Sigma注文番号B2643)を含有するホウ酸緩衝液/DMFで標識した。
収量:10mg。
31P[ppm]: - 22.04 (t); -9.83 (d); 9.61 (d)
組込み研究
2'デオキシ-NTPアナログであると考えられるビオチニル化hUTP、hATPおよびCeATP(図4参照)の組込み速度を、AMV逆転写酵素を使用して標識されたcDNAのドットブロット希釈列を介して標準ビオチン-16-dUTPと比較した。最初に、本発明者らは、ドットブロット希釈列に基づいて様々な比のビオチンhUTP:dUTPの影響を調査した(SA-AP/CPD*を用いた検出)。本発明者らは、1:4比(=20%)が、標識するのに十分であることを見出した。この比を使用して、様々なアナログをビオチンdUTPと比較した。組込み効率は、ビオチンhATP<ビオチンhUTP=ビオチンdCeATP<ビオチンdUTPの順で増大する(図5a〜cを参照)。
Bio-h-dUTPの性能を、マイクロアレイに基づく発現プロファイリング実験で試験した。この使用は、研究者に、平行して多くの遺伝子のmRNAレベルを監視するのを可能にする。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、指示された方式で固体表面(すなわち、スライドガラス)に共有結合させた。次の工程では、このオリゴヌクレオチドのアレイを、定義されたサンプル(すなわち、組織、細胞株など)に由来する標的分子のプールとハイブリダイズさせる。標的の合成のために、総RNAを、サンプルから単離しなければならない。その後、mRNAを、オリゴdTプライマーでプライムし、続いて逆転写酵素を使用して酵素によってcDNAを合成した。この工程の間に、ビオチン標識ヌクレオチドを、cDNA鎖に挿入する。ハイブリダイゼーションのために、cDNAを精製し、そしてアレイにかけた。一晩、インキュベーションを行い、続いてストリンジェントな洗浄手順を行った。アレイの洗浄の後、蛍光団で標識されたストレプトアビジン結合体とともにインキュベーションを行った。シグナル検出のために、ハイブリダイズした標的分子の量を定量するために、スライドガラスを、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて走査した。コンピュータ処理分析を利用することにより、シグナル強度は、特定遺伝子を表す個別のオリゴヌクレオチドとに対応した。
個別のラット遺伝子(ラットのオリゴ試験セット)に特異的なオリゴヌクレオチドを含むガラス製アレイ(MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany)を、三連で配列した。キット手引により、RNeasy Kit(ドイツ国ヒルデンのキアゲン(QIAGEN))を利用することにより、RNA単離を行った。肝臓組織サンプルから単離された肝臓由来の100マイクログラムの総マウスRNAは、標識Bio-h-dUTPの組込みを含めて、cDNA合成キット(ドイツ国マンハイムのロッシュ(Roche))を使用して標的標品のための鋳型として利用した。標識手順:100μgの総RNAを、2μgのオリゴdT24マーと共に、18μlH2O中で70℃で10分間インキュベートし、氷上で冷却させた。5μl RT-緩衝液、4μl DTT、4μl dNTP(5mM A、G、Cおよび3mMT)、0.4μl Bio-h-dUTP、1.8μl AMV逆転写酵素、0.2μl RNAsin、3.5μl H2Oを含む反応混合物を添加し、そして42℃で1時間インキュベートした。10μlの1NNaOHを添加し、続いて65℃での10分のインキュベーションにより、標識反応を終結させた。
予想されるとおり、標的配列のいずれとも適合しないプローブ配列を含む対照スポットはシグナルを示さず、したがって、ハイブリダイゼーション手順の内で特異性を確保する。さらに、肝臓で発現されることが知られていない遺伝子に対応するスポットは、低いかまたはシグナルなしを示した。他方では、広範な組織で発現される遺伝子、ならびに肝臓に特異的な遺伝子は、このアプローチでBio-h-dUTPの優れた性能を示すことが明らかに検出された(図7を参照)。
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US 6,156,501
US 4,458,066
US 4,996,143
US 5,130,238
US 5,210,015
US 5,314,893
US 5,451,463
US 5,487,972
US 5,565,322
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Claims (27)
- 式I:
Bは複素環式塩基であり、
R1はR2、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R1は
(1)保護基、
(2)標識、
(3)固相、および
(4)-H
からなる群より選択され、
R2はR1、R3、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R2は-Hおよび-OR6からなる群より選択され、
R3はR1、R2、R4、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R3は
(1)保護基、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)ホスホルアミダイト、
(4)H-ホスホネート、および
(5)トリホスフェート
からなる群より選択され、
R4はR1、R2、R3、R5、R5a、R5bおよびR6から独立し、R4は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
R6はR1、R2、R3、R4、R5、R5a、およびR5bから独立し、R6は
(1)-H
(2)保護基、
(3)固相に共有結合された連結部分、
(4)ホスホルアミダイト、および
(5)H-ホスホネート
からなる群より選択され、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R1、R2、R3、R4およびR6から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される
を有する化合物。 - 連結部分Lが炭素原子、酸素原子または窒素原子および反応性基を含むことを特徴とする請求項1記載の化合物。
- R1が標識であることを特徴とする請求項1または2記載の化合物。
- 6員環のC1原子とYとの間の点線が二重結合の存在を示し、YがCR5aであり、R5aがアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから選択されることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の化合物。
- 二重結合が存在しない場合、YがO、S、またはCR5aR5bであることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の化合物。
- R3がトリホスフェートであり、R2が-OR6(式中、R6は-Hである)であり、R4が-Hまたは-OHであることを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の化合物。
- R2がR1、R3、R4、R5、R5a、R5b、およびR6から独立し、R2が-OR6(式中、R6はホスホルアミダイトである)であり;
R3がR1、R2、R4、R5、R5a、R5b、およびR6から独立し、R3が保護基または連結部分に共有結合された固相である
ことを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の化合物。 - 式:
S-B-L-R7
式中、Sは6員環を含む部分であり、
Bは複素環式塩基であり、
Lは連結部分であり、
R7は標識、保護基または固相である
を有するモノマー単位を含んでなるオリゴマー化合物。 - 6員環がシクロヘキサン、シクロヘキセン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピランまたはピペリジンの誘導体である請求項9記載のオリゴマー化合物。
- 式III:
Bは複素環式塩基であり、
R7はR5、R5a、R5b、R8、R9、R10、およびR11から独立し、R7は
(1)保護基、
(2)標識、および
(3)固相
からなる群より選択され、
R8はR5、R5a、R5b、R7、R9、R10、およびR11から独立し、R8は-Hおよび-OR11からなる群より選択され、
R9およびR11は互いに独立し、R5、R5a、R5b、R7、R8またはR10から独立し、R9およびR11は
(1)-H、
(2)固相に共有結合された連結部分、
(3)ホスフェート、および
(4)ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを有するホスホジエステル
からなる群より選択され、
R10はR5、R5a、R5b、R7、R8、R9およびR11から独立し、R10は-H、-OH、アルキル、ハロゲン、-O-R5、-S-R5、NR5R5a、標識または固相に共有結合された連結部分であり、
6員環のC1原子とYとの間の点線は二重結合の任意の存在を示し、二重結合が存在する場合YはCR5aであり、
あるいは二重結合が存在しない場合YはO、S、NR5およびCR5aR5bからなる群より選択され、
R5、R5aおよびR5bは互いに独立し、R7、R8、R9、R10およびR11から独立し、R5はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、保護基または-Hから独立して選択され、R5aおよびR5bはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから独立して選択される
を有するモノマー単位を有する請求項9または10記載のオリゴマー化合物。 - 連結部分Lが炭素原子、酸素原子または窒素原子および反応性基を含むことを特徴とする請求項11記載のオリゴマー化合物。
- R7が標識であることを特徴とする請求項9〜12いずれか記載のオリゴマー化合物。
- R8が-OR11であり、R9およびR11がオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、R10が-Hまたは-OHであることを特徴とする請求項11〜13いずれか記載のオリゴマー化合物。
- 二重結合が存在しない場合、YがO、SまたはCR5aR5bであることを特徴とする請求項11〜14いずれか記載のオリゴマー化合物。
- 6員環のC1原子とYとの間の点線が二重結合の存在を示し、YがCR5aであり、R5aがアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、または-Hから選択されることを特徴とする請求項11〜14いずれか記載のオリゴマー化合物。
- 異なる配列を有する複数のオリゴマー化合物のアレイを含んでなる、標的核酸とオリゴマー化合物との間の相互作用を分析するための組成物であり、該オリゴマー化合物が請求項10〜15いずれか記載のオリゴマー化合物であり、R7が固相であるか、あるいはR9、R10またはR11が該固相に共有結合された連結部分である、組成物。
- R2が-OR6であり、R3およびR6がホスホルアミダイト、連結部分に共有結合された固相または保護基である、請求項1〜8いずれか記載の化合物の請求項10〜15いずれか記載のオリゴマー化合物の化学合成のための使用。
- 核酸の標識化のための請求項1〜8いずれか記載の化合物の使用。
- 相補核酸とのハイブリダイゼーション反応における、請求項9〜16いずれか記載のオリゴマー化合物または請求項17記載の組成物の使用。
- プライマー、プローブまたは捕捉プローブとしての請求項9〜16いずれか記載のオリゴマー化合物の使用。
- (a)ターミナルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼの存在下、R3がトリホスフェートである請求項1〜8いずれか記載の化合物を、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの伸長可能なOH基とインキュベートし、それにより該化合物が伸長可能なOH基に結合され、それによりピロホスフェートが放出される工程、
(b)任意に、ターミナルトランスフェラーゼまたはポリメラーゼの存在下、工程(a)の生成物の3'末端の伸長可能なOH基をヌクレオシドトリホスフェートまたは修飾ヌクレオシドトリホスフェートとインキュベートし、それにより該ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが3'-OH基に結合され、それによりピロホスフェートが放出される工程、
(c)任意に、工程(a)または(b)あるいは両方を繰り返す工程、ならびに
(d)オリゴマー化合物を単離する工程
を含む、請求項9〜16いずれか記載のオリゴマー化合物の酵素的合成のための方法。 - (a)標的核酸を含むと推測されるサンプルを提供する工程、
(b)標的核酸の一部または全部と本質的に相補的な請求項9〜16いずれか記載のオリゴマー化合物を提供する工程、
(c)任意に、鋳型依存性DNAポリメラーゼおよびプライマーを用いて標的核酸を増幅する工程、
(d)オリゴマー化合物が標的核酸に結合する条件下でサンプルとオリゴマー化合物とを接触させる工程、ならびに
(e)標的核酸の存在、非存在または量の基準として標的核酸とオリゴマー化合物との間の結合生成物またはハイブリダイゼーションの程度を測定する工程
を含む、サンプルにおける標的核酸の検出のための方法。 - 工程(e)において、ハイブリダイゼーションの程度が、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ加水分解により標的核酸にハイブリダイズされたオリゴマー化合物から放出された第一または第二蛍光標識の定量により測定される、請求項23記載の方法。
- 少なくとも1つのサイクリング工程を実施する工程であって、ここで、サイクリング工程が増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み、ここで、該増幅工程がサンプルとプライマーとを接触させて、標的核酸が該サンプル中に存在する場合、増幅生成物を生成する工程を含み、ここで、該ハイブリダイズ工程が該サンプルと1対のプローブとを接触させる工程を含み、ここで、少なくとも1つのプローブが6員環を含むモノマー単位を含有してなるオリゴマー化合物であり、ここで、該プローブ対のメンバーが互いにわずか5ヌクレオチド以内で該増幅生成物にハイブリダイズし、ここで、該プローブ対の第一プローブがドナー蛍光標識で標識され、該プローブ対の第二プローブが対応するアクセプター蛍光標識で標識される、工程;
ならびに該第一プローブのドナー蛍光標識と該第二プローブのアクセプター蛍光標識との間の蛍光共鳴エネルギー転移の存在または非存在を検出する工程であって、ここで、蛍光共鳴エネルギー転移の存在がサンプル中の標的核酸の存在の指標であり、蛍光共鳴エネルギー転移の非存在がサンプル中の標的核酸の非存在の指標である、工程
を含む、請求項23記載の方法。 - a)分析対象のサンプルから標的核酸を提供する工程、
b)標的核酸から二本鎖相補DNAを合成する工程、
c)請求項1〜8いずれか記載の化合物およびヌクレオシドトリホスフェートの存在下で標的核酸を増幅し、それにより標識された標的核酸が得られる工程、
d)標識された標的核酸をオリゴマー化合物のアレイに画定された位置でハイブリダイズする工程、ならびに
e)各画定された位置での蛍光強度を測定し、それにより標的核酸の存在または量が測定される工程
を含む、サンプル中の標的核酸の存在または量を測定するための方法。 - 鋳型依存性ポリメラーゼ、
プライマーセット、
ヌクレオチド、および
請求項9〜16いずれか記載のオリゴマー化合物(式中、R7は標識である)
を含有してなるパーツキット。
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