DE10121235A1

DE10121235A1 - Verfahren zur Expression von Proteinen in in vitro Translations-Systemen unter Ko-Expression von Faltungshelferproteinen

Info

Publication number: DE10121235A1
Application number: DE10121235A
Authority: DE
Inventors: Johannes Buchner
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-04-30
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2002-10-31
Also published as: ES2269547T3; JP2002335959A; US6929929B2; DE60213703T2; EP1254962B1; US20020192743A1; EP1254962A1; DE60213703D1; ATE335834T1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression von Zielproteinen in in vitro Translations-Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp70-, Hsp60-, Hsp90-, Hsp100-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression von Zielproteinen in in vitro Translations-Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp70-, Hsp60-, Hsp90-, Hsp100-Protein familie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.

Die Faltung von großen oligomeren Proteinen wird in vitro häufig durch das Auftreten von Ag gregation erschwert (Jaenicke und Rudolph, 1986; Buchner, 1996; Jaenicke, 1997). Aggregation stellt dabei einen Seitenweg zur normalen Faltung dar, der in Konkurrenz zur korrekten Faltung und Assoziation tritt. Der Grund für die Aggregation liegt in der Ausbildung nicht korrekter in termolekularer Wechselwirkungen (Kiefhaber et al., 1991), die letztendlich zum Entstehen von heterogenen Aggregaten führen, in denen die enthaltenen Polypeptidketten irreversibel verloren sind. In vitro kann Aggregation als unerwünschte Nebenreaktion durch physikalisch-chemische Parameter wie Proteinkonzentration, Lösungsmittelbedingungen, Temperatur oder Ionenstärke minimiert werden (Jaenicke und Rudolph, 1989; Kiefhaber et al., 1991; Buchner, 1996; Jaenicke, 1997). In vivo hingegen sind die äußeren Bedingungen für alle Proteine konstant. Eine E. coli Zel le erreicht trotz der enormen Syntheseleistung von ca. 60 000 Polypeptidketten pro Minute, eine apparente Faltungsausbeute von praktisch 100% (Lorimer, 1996). Es erfolgt zwar auch in vivo Mißfaltung und inkorrekte Assemblierung von Proteinen (Hurtley und Helenius, 1989; Pelham, 1989; Helenius et al., 1992), diese wird jedoch durch mehrere zelleigene Faktoren minimiert. Chaperone oder Hitzeschockproteine verhindern unspezifische Aggregation (Buchner et al., 1996) und mißgefaltete oder zu langsam faltende Proteine werden abgebaut (Gottesman und Maurizi, 1992). Mutagenesestudien Hitzeschock-defizienter E. coli Stämme zeigten bei erhöhten Wachstumstemperaturen das Auftreten von sogenannten "inclusion bodies" (Grangerov et al., 1991). Unabhängig davon konnte gezeigt werden, daß die Bildung von inclusion bodies als Folge von Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli durch eine gleichzeitige Überexpression zelleigener Hitzeschockproteine effizient unterdrückt werden kann (Goloubinoff et al., 1989; Dale et al., 1994; Amrein et al., 1995). Auch der Import von Proteinen in zelluläre Kompartimen te, wie Mitochondrien, ist von in den Organellen lokalisierten Hitzeschockproteinen abhängig. Auf Grund dieser Beobachtungen kann die Faltung von Proteinen als spontaner Prozeß, der von Faltungshelferproteinen assistiert wird, gesehen werden (Horwich et al., 1993; Hendrick und Hartl, 1993; Georgopoulos und Welch, 1993). So minimiert das exakte Zusammenspiel dieser zelleigenen Faktoren die unkorrekten Faltungsprozesse und fördert die korrekte Faltung von Polypeptiden (Buchner, 1996; Beißinger und Buchner, 1998; Hartl, 1998).

Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen der Faltung in vitro und in vivo besteht außer dem darin, daß Proteine in der Zelle vektoriell vom N- zum C-Terminus falten (Bergman und Kühl, 1979; Braakman et al., 1991). Dieser Prozeß erfolgt cotranslational oder während der Translokation. Hierbei setzt Strukturbildung bereits ein, während das Polypeptid sich noch am Ribosom befindet oder transloziert wird. Das bedeutet auch, daß zum Teil hydrophobe Regionen und andere potentielle Interaktionsbereiche eines Polypeptids auf ihre Interaktionspartner, der noch synthetisiert wird, warten müssen. Während dieser Syntheseprozesse können aber auch nicht-approbiate Wechselwirkungen auftreten, die nur bedingt reversibel sind und zu Aggre gationsreaktionen führen können. Andererseits lassen sich bereits in diesem Zustand bei Im munoglobulinen, Serumalbumin und Hämaglutinin, Disulfidverbrückungen nachweisen (Berg man & Kühl, 1979; Peters & Davidson, 1982; Braakman et al., 1991). Für Faltungshelferproteine der Hsp70-Chaperon-Familie konnte gezeigt werden, daß sie bereits während der Translation am Ribosom mit der naszierenden Polypeptidkette wechselwirken körnen (Egers et al., 1997; Fryd man et al., 1994; Hansen et al., 1994; Welch et al., 1997). Auch viele andere Prozesse wie z. B. der Import cytosolisch synthetisierter Polypeptidketten in Mitochondrien, sind von Faltungshelfer proteinen abhängig (Dekker und Pfanner, 1999). Proteine können hierbei nur im linearen, ent falteten Zustand durch eine oder beide mitochondrialen Membranen transportiert werden. Mo lekulare Chaperone sind bei diesem Prozeß sowohl an der Entfaltung bzw. der Stabilisierung des entfalteten Zustands auf der cytosolischen Seite der Membran als auch am Transport und der Faltung in den Mitochondrien beteiligt.

Bei der Faltung in vitro sind besonders die Bildung und Isomerisierung von Disulfidbrücken und die cis/trans-Isomerisierung von Prolinen geschwindigkeitsbestimmende Faltungsschritte. In der Zelle werden diese Faltungsschritte von Faltungshelfern katalysiert. Proteindisulfidisomerasen wie PDI oder DsbA beschleunigen Redoxreaktionen von Cysteinen und Disulfiden in Polypepti den in Abhängigkeit von den Redoxbedingungen (Wunderlich und Glockshuber, 1993; Bardwell, 1997). Durch die Beschleunigung dieses Faltungsschrittes verringert sich die Konzentration an Intermediaten während des Faltungsvorgangs. Dadurch wird die konzentrationsabhängige Ag gregation minimiert und die Faltungsausbeute erhöht (Weissman und Kim, 1993; Lillie et al., 1994). Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPI) katalysieren die Isomerisierung zwischen der cis- und trans-Form von Peptidbindungen vor Prolinresten in Polypeptidketten. Im Gegensatz zu allen anderen Peptidbindungen in nativen Proteinen kann diese in ihrer cis-Konfiguration vorlie gen (Schmid, 1997).

Das häufig in in vitro Translationssysteme verwendete E. coli Lysat stellt ein natürliches, für die Proteinfaltung optimales System dar. Im Gegensatz zu einer funktionellen Zelle wird die Menge an benötigten Chaperonen aber nicht automatisch der SyntheseleLstung des Translationsappa rates angepaßt. Die daraus resultierende Überlastung der Faltungsmaschinerie resultiert in vielen Fällen in der Aggregation des Zielproteins. In Abhängigkeit des Zielproteins können verschie denste Komponenten der Faltungsmaschinerie für diese ineffiziente Faltung verantwortlich sein.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, in einem in vitro Translationssystem die Ausbeute an Zielprotein zu erhöhen, indem die Aggregation des Zielproteins durch die Bereitstellung der be nötigten Chaperone in ausreichender Menge im in vitro Translationssystem verhindert wird. Da durch soll zugleich die Effizienz des in vitro Translationssystems gesteigert werden.

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Expression von Ziel-Pro teinen in in vitro Translationssystemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp100-Pro teinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.

Molekulare Chaperone stellen die größte Gruppe von faltungsassistierenden Proteinen dar und werden erfindungsgemäß als Faltungshelferprotein verstanden (Gething und Sambrook, 1992; Hartl, 1996; Buchner, 1996; Beißinger und Buchner, 1998). Aufgrund ihrer Überexpression unter Stressbedingungen können die meisten molekularen Chaperone auch in die Gruppe der Hitze schockproteine eingeordnet werden (Georgopoulos und Welch, 1993; Buchner, 1996), diese Grup pe wird erfindungsgemäß ebenfalls als Faltungshelferprotein verstanden.

Nachfolgend werden wichtige Faltungshelferproteine, die von der vorliegenden Erfindung um faßt werden, näher erläutert. Die Gruppe der molekularen Chaperone läßt sich anhand von Se quenzhomologien und der molekularen Massen in fünf nicht verwandte Proteinklassen, die Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp100-Proteinfamilien und die Familie der kleinen Hitzeschockpro teine unterteilen (Gething und Sambrook, 1992; Hendrick und Hartl, 1993).

Hsp60

Das am Besten untersuchte Chaperon überhaupt ist GroEL, ein Vertreter der Hsp60 Familie aus E. coli. Die Vertreter der Hsp60 Familie werden auch als Chaperonine bezeichnet und in zwei Gruppen unterteilt. GroEL und sein Ko-Chaperon GroES und deren stark homologe Verwandte aus anderen Bakterien sowie Mitochondrien und Chloroplasten bilden die Gruppe der I Cha peronine (Sigler et al., 1998; Fenton und Horwich, 1994). Die Hsp60 Proteine aus dem eukaryoti schen Cytosol und aus Archebakterien werden als Gruppe II Chaperonine zusammengefaßt (Gutsche et al., 1999). In beiden Gruppen zeigen die Hsp60 Proteine einen ähnlichen oligomeren Aufbau. Im Falle von GroEL und den anderen Gruppe I Chaperoninen lagern sich 14 GroEL Un tereinheiten zu einem Zylinder aus zwei heptameren Ringen zusammen, während die heptamere Ringstruktur bei den Chaperoninen der Gruppe II aus Archebakterien meist aus zwei unter schiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Vertreter der Gruppe II Chaperonine aus dem eu karyotischen Cytosol, wie z. B. der CCT-Komplex aus Hefe, sind hingegen aus 8 verschiedenen Untereinheiten mit genau definierter Organisation aufgebaut (Liou und Willison, 1997). Im zentralen Hohlraum dieses Zylinders können nicht native Proteine eingelagert und gebunden werden. Das Ko-Chaperon GroES bildet ebenfalls einen heptameren Ring und bindet in dieser Form an den Polen des GroEL-Zylinders. Diese Bindung von GroES führt allerdings zu einer Limitierung der Substratbindung in Abhängigkeit ihrer Größe 10-55 kDa (Ewalt et al., 1997). Die Substratbindung wird dabei durch ATP-Bindung und Hydrolyse reguliert.

Hsp70

Neben den Vertretern der Hsp60 Familie binden auch die Hsp70 Proteine an die naszierende Polypeptidkette (Beckman et al., 1990; Welch et al., 1997). Sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen existieren meist mehrere konstitutiv exprimierte und stressinduzierte Ver treter der Hsp70 Familie (Vickery et al., 1997; Welch et al., 1997). Diese sind neben der Protein faltung direkt am Ribosom auch an der Translokation von Proteinen über Zell- und Organell membranen beteiligt (Schatz & Doberstein, 1996). Es wurde gezeigt, daß Proteine nur im unge falteten bzw. teilgefalteten Zustand durch Membranen geschleust werden können (Hannavy et al., 1993). Während des Translokationsprozesses in Organellen sind vor allem Vertreter der Hsp70 Familie an der Entfaltung und Stabilisierung auf der cytosolischen Seite, als auch an der Rückfaltung auf der Organellseite beteiligt (Hauke und Schatz, 1997). Dabei ist bei allen Prozes sen die ATPase-Aktivität von Hsp70 essentiell für die Funktion des Proteins. Charakteristisch für das Hsp70-System ist die Kontrolle der Aktivität durch Ko-Chaperone (Hsp40; DnaJ), wobei durch gezielte Modulation der ATPase-Aktivität das Gleichgewicht zwischen Substratbindung und Freisetzung beeinflußt wird (Bukau und Horwich, 1998).

Hsp90

Mit etwa 1% des löslichen Proteins im eukaryontischen Cytosol stellt Hsp90 eines der am stärk sten exprimierten Proteine dar (Welch und Feramisco, 1982). Die Vertreter dieser Familie agie ren vorwiegend in multimeren Komplexen, wobei sie eine Vielzahl von wichtigen Signaltrans duktionsproteinen mit nativähnlichen Strukturen erkennen. Durch die Bindung an Hsp90 und seine Partnerproteine werden diese Strukturen stabilisiert und so die Bindung von Liganden an die Signalproteine erleichtert. So können die Substrate ihre aktive Konformation erlangen (Sulli van et al., 1997; Bohen et al., 1995; Buchner, 1999).

Hsp100

In jüngster Zeit zeichneten sich besonders die Hsp100 Chaperone durch ihre Fähigkeit in Zusam menarbeit mit den Hsp70 Chaperonen bereits gebildete Aggregate wieder aufzulösen aus (Parsell et al., 1994; Goloubinoff et al., 1999; Mogk et al., 1999). Während ihre Hauptaufgabe die Ver mittlung von Thermotoleranz zu sein scheint (Schirmer et al., 1994; Kruger et al., 1994), ver mitteln einige Vertreter wie ClpA und ClpB zusammen mit der Protease-Untereinheit ClpP den proteolytischen Abbau von Proteinen (Gottesman et al., 1997).

sHsps

Die fünfte Klasse von Chaperonen, die kleinen Hitzeschockproteine (sHsps), stellen eine sehr di vergente Familie von Hitzeschockproteinen dar, die in fast allen Organismen gefunden werden. Namensgebend für diese Familie von Chaperonen ist ihr relativ geringes monomeres Molekular gewicht von 15-40 kDa. In der Zelle existieren sHsps aber meist als hocholigomere Komplexe mit bis zu 50 Untereinheiten, woraus Molekülmassen von 125 kDa bis zu 2 MDa beobachtet wurden (Spector et al., 1971; Arrigo et al., 1988; Andreasi-Bassi et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997). In vitro können sHsps wie die anderen Chaperone die Aggregation von Proteinen unterdrücken (Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993; Merck et al., 1993; Jakob und Buchner, 1994, Lee et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997b). Dabei binden sHsps bis zu ein Substratmolekül je Untereinheit und zeigen somit eine höhere Effizienz als das Modellchaperon GroEL (Jaenicke und Creighton, 1993; Ganea und Harding, 1995; Lee et al., 1997; Ehrnsperger et al., 1998a). Unter Streßbedingungen verhindert die Bindung von nicht nativem Protein an sHsps die irreversible Aggregation der Pro teine. Durch die Bindung an sHsps werden die Proteine in einem löslichen faltungskompeten ten Zustand gehalten. Nach der Wiederherstellung von physiologischen Bedingungen kann das nicht native Protein von ATP-abhängigen Chaperonen wie Hsp70 aus dem Komplex mit sHsp gelöst und reaktiviert werden.

Isomerasen

Als Isomerasen kommen für das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise Faltungskatalysa toren aus der Klasse der Peptidyl-prolyl-cis/trans Isomerasen und Vertreter der Disulfidisomera sen.

Faltungshelferproteine, die in gleicher oder ähnlicher Weise funktionieren wie die oben beschrie benen Faltungshelferproteine, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, daß die ko-exprimierten Faltungshelferpro teine Vertreter der Hsp60-Proteinfamilie sind. Weiterhin werden bevorzugt zusätzlich Ko-Cha perone ko-exprimert. Besonders bevorzugt ist gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß Hsp60 als Faltungshelferprotein und Hsp10 als Ko-Chaperon ko-exprimert wird. Besonders be vorzugt wird, daß das ko-exprimierte Faltungshelferprotein GroEL ist. Insbesondere bevorzugt ist das Verfahren, wenn GroEL/GroES ko-exprimiert werden.

Eine andere bevorzugte Variante des Verfahrens besteht darin, daß die ko-exprimierten Faltungs helferproteine Vertreter der Hsp70-Proteinfamilie sind. Weiterhin werden bevorzugt zusätzlich Ko-Chaperone ko-exprimert. Besonders bevorzugt ist bei dieser Variante, daß das ko-exprimierte Faltungshelferprotein ein menschliches Hsp70-Protein ist. Insbesondere ist dann bevorzugt, daß das Hsp70 als Faltungshelferprotein und Hsp40 als Ko-Chaperon ko-exprimert wird. Am mei sten wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend dieser Variante bevorzugt, daß Hsp70 aus Mensch und Hdjl (Hsp40 aus Mensch) ko-exprimiert werden.

Erfindungsgemäß können die Zielproteine alle Arten von pro- und eukaryontischen Proteinen und auch archaeale Proteine sein. Problematisch in in vitro Transkriptions/Translationssystemen war bisher insbesondere die Expression von sekretorischen Proteinen und Membranproteinen, besonders dann wenn keine Faltungshelferproteine in ausreichender Menge vorhanden sind. Die erfolgreiche Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen wurde im Stand der Technik zwar beschrieben, war aber deutlichen Limitationen unterworfen (Huppa und Ploegh, 1997; Falk et al., 1997). Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen bzw. sekretorischen Proteinen als Zielprotein, da Faltungshelferproteine durch die Ko-expression in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, daß die Steigerung der Volumenausbeute des Zielproteins in in vitro Transkriptions-/Translationssystemen im präpara tiven Maßstab erfolgt.

Im folgenden Abschnitt werden in vitro Translationssysteme, auf die sich die vorliegende Erfin dung beziehen kann, näher erläutert, insbesondere gekoppelte in vitro Transkriptions-/Trans lationssysteme. Die derzeit effizientesten Systeme basieren auf E. coli-, Kaninchen Retikulozyten- oder Weizenkeim-Lysaten (Spirin, 1990; Stiege und Erdman, 1995). Normalerweise werden sie als Batch-Reaktionen mit einem definierten Reaktionsvolumen eingesetzt. Auf E. coli basierende Reaktionen können dabei in einem Temperaturbereich von 24-38°C eingesetzt werden. Für diese Batchverfahren wird in der Regel der 30S Überstand von E. coli Lysaten verwendet, der aufgrund des hohen Gehalts an endogener mRNA, vor dem Einsatz für die in vitro Translation mit RNase behandelt werden muß (Zubay, 1973). Auf Weizenkeimlysaten basierende Reaktionen werden normalerweise nur in einem Temperaturbereich von 20-27°C eingesetzt (Tulin et al., 1995), ha ben aber gegenüber E. coli Lysaten den Vorteil, daß sie durch das geringe Level an endogener mRNA direkt für die Expression exogener Expressionsvorlagen eingesetzt werden können. Reti kulozyten-Lysate werden durch direkte Lyse von anemischem Kaninchen Blut hergestellt, aus dem durch RNase Behandlung die endogenen mRNAs entfernt werden. Diese Systeme werden in der Regel für Arbeiten im Temperaturbereich von 30-38°C eingesetzt (Pelham und Jackson, 1976). Dabei ist zu beachten, daß die Arbeitstemperatur nicht nur Einfluß auf die Translations prozesse hat, sondern auch die Faltung der Zielproteine extrem von der jeweiligen Arbeitstem peratur abhängig ist.

Die Proteinsynthese in solchen Batch-Reaktionen wird nur solange aufrecht erhalten, bis die er sten wichtigen Komponenten aufgrund von Degradation, Inhibition oder Energiemangel nicht mehr funktionsfähig sind. Das größte Problem ist in diesem Zusammenhang die Energieversor gung der Proteinsynthese (Yao et al., 1997, Matveev et al., 1996), wodurch in diesen Batch- Reaktionen nur relativ kurze Synthesezeiten und damit nur relativ geringe Ausbeuten an Ziel proteine (durchschnittlich 0,1-20 µg/ml) erreicht werden können (Mosca et al., 1983).

Die für die Proteinsynthese notwendige mRNA kann jedoch auch direkt in den Expressions systemen hergestellt werden. Für diese sogenannten gekoppelten Transkriptions/Translations systeme können in auf E. coli Lysaten basierenden Systemen sowohl die endogene RNA Poly merase als auch exogene Phagen RNA Polymerase zur Herstellung der mRNA benutzt werden (Chen und Zubay, 1983; Köhrer et al., 1996). Dahingegen werden in eukaryontischen Systemen exogene Phagen RNA Polymerasen eingesetzt (Craig et al., 1992; Baranov und Spirin, 1993). In solchen eukaryontischen Systemen werden dann aber natürlich auch entsprechende DNA-Vor lagen mit den entsprechenden Promotorelementen benötigt.

Mit den continuos-exchange cell-free translation apparatus (CECF) bzw. continuos-flow-cell-free translation apparatus gelang es, das Problem der kurzen Expressionszeiten und der Energiever sorgung der Systeme zu lösen (Spirin et al., 1988; Spirin, 1991). Die grundlegende Idee basiert dabei auf der kontinuierlichen Versorgung der Reaktion mit Energie und niedermolekularen Komponenten und der kontinuierlichen Entfernung von niedermolekularen Beiprodukten. Da bei wird die Reaktion über eine semipermeable Membran aus einem separaten Fütterungskom partiment versorgt.

Bevorzugt handelt es sich bei dem in vitro Translationssystem um ein gekoppeltes in vitro Trans kriptions-/Translationssystem. Insbesondere bevorzugt findet die gekoppelte in vitro Transkrip tions-/Translation in einem CFCF- oder CEFC-Reaktor statt.

Für die Ko-expression in in vitro Transkriptions/Translationssystemen können Vektoren bzw. DNA-Vorlagen verwendet werden, die in ihrem Aufbau den Expressionsvektoren der Zielpro teine entsprechen. In auf E. coli-Lysaten basierenden Systemen können dabei sowohl Promotoren für die endogen E. coli RNA Polymerase verwendet werden, als auch Vektoren mit Promotoren exogener viraler Polymerasen. Dabei sollten die Vektoren neben den Promotorregionen auch eine Ribosomenbindestelle und geeignete Terminatorregionen enthalten. Prinzipiell ist auch der Einsatz linearer DNA-Expressionsvorlagen (z. B. PCR-Produkt) möglich. Werden zirkuläre Ex pressionsvektoren verwendet, die für den experimentellen Einsatz vorher in vivo amplifiziert werden müssen, sollten geeignete Replikationsstartpunkte und mindestens ein selektionierbarer Marker enthalten sein. Der Ko-expressionszeitraum und die Ko-expressionsstärke von Cha peronen können in Abhängigkeit von den jeweiligen Substratproteinen optimiert werden (Lott speich und Zorbas, 1998).

Um eine maximale Effizienz der Chaperonmaschinerie während der Synthesereaktion zu gewähr leisten, sollte die Ko-expression reguliert werden. Eine entsprechende Regulation läßt sich einer seits durch die dosierte Zugabe der Ko-expressionsvektoren erreichen, oder andererseits durch regulatorische Sequenzen in den Promotorregionen des Vektors, über welche Induktion und Stärke der Expression reguliert werden können. Für eine entsprechende Regulation können bei spielsweise IPTG induzierbare lac-Operator-Sequenzen, Bindesequenzen für Tetracyclinrepres soren oder Katabolit induzierbare Regulatorsequenzen (z. B. Arabinose Operator) verwendet wer den. Dabei muß allerdings die getrennte Induktion der Zielproteinexpression und der Chaperon koexpression bedacht werden.

Es ist also bevorzugt, daß die Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko- Chaperone reguliert wird. Insbesondere ist bevorzugt, daß die Expression der Ziel-Proteine von der Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone getrennt in duzierbar ist.

DNA-Vorlagen für eukaryontische Systeme sollten ebenfalls aus entsprechenden Promotor-Re gionen für virale RNA-Polymerasen, den für die Initiation der Translation nötigen eukaryon tischen Sequenzen und geeigneten Terminatoren bestehen. Zirkuläre Expressionsvektoren, die für den experimentellen Einsatz in E. coli amplifiziert werden müssen, sollten außerdem eine Re plikationsstartsequenz für E. coli und mindestens einen in E. coli selektionierbaren Marker ent halten. Auch hier könnte die Regulation der Chaperonkoexpression durch entsprechende regu latorische Sequenzen für die viralen Promotoren erreicht werden (Lottspeich und Zorbas, 1998).

Da die Überlastung der Chaperonmaschinerie vom jeweiligen Zielprotein und der Stärke der Ex pression des Zielproteins abhängt, ist auch die Menge an benötigten Chaperonen stark vom Ziel protein abhängig. Dadurch kann im Einzelfall die Optimierung der Expressionsstärken beider Expressionsvorlagen wichtig sein. Eine entsprechende Optimierung kann neben der direkten Re gulation der Expression über die Promotoren, und zwar durch die Variation der eingesetzten Menge an Expressionsvorlagen, erreicht werden. Bei stark aggregationsanfälligen Zielproteinen kann dabei durchaus ein extremer Überschuß an Chaperonen nötig sein, während sich bei an deren Zielproteinen die zu starke Ko-expression von Chaperone evtl. sogar störend auf die Ex pression an Zielprotein auswirkt. In Abhängigkeit vom Zielprotein kann sowohl die Ko-expres sion einzelner Chaperone als auch die Ko-expression mehrerer Chaperone für die funktionelle Expression des Zielproteins nötig sein. Dabei ist auch zu bedenken, daß die meisten Chaperone nur als komplexe Systeme mit entsprechenden Ko-Chaperonen effektiv arbeiten. Besonders be vorzugt ist daher die Ko-Expression von Chaperonen und entsprechenden Ko-Chaperonen.

Die erfindungsgemäße Aufgabe kann auch gelöst werden durch die Zugabe von gereinigten Cha peronen und Ko-Chaperonen in der benötigten Menge. Allerdings ist dieses Verfahren relativ teuer.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung eines Vektors enthal tend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein für das erfindungsgemäße Verfahren. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon für das erfindungsgemäße Verfahren.

Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Vektors enthal tend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein und weiterhin enthaltend eine Promotor region, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminatorregion für das erfindungsgemäße Ver fahren. Ebenfalls insbesondere bevorzugt ist die Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon und weiterhin enthaltend eine Promotorregion, eine Riboso menbindungsstelle, eine Terminatorregion für das erfindungsgemäße Verfahren.

In den folgenden Beispielen wurde das erfindungsgemäße Verfahren zum einen im Rapid Trans lation System (RTS-System) mit der mitochondrialen Zitrat Synthase als Zielprotein (Schweine herz; EC 4.1.3.7) durchgeführt. Als weiteres Zielprotein wurde GFP eingesetzt. Unerwarteter weise führte sowohl die Ko-expression von GroEL/ES im RTS-System als auch die Zugabe von GroEL/ES zu einer Steigerung der Expressionsausbeuten in präparativem Maßstab.

Figurenbeschreibung

Abb. 1: Einfluß von GroEL/ES auf die Ausbeute an aktiver, gereinigter CS im RTS-System:
CS Expression von pIVEX 2.4b ohne Zusatz von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b, Ko- Expression von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b unter Zusatz von 150 nM gereinigtem GroEL und 300 nM gereinigtem GroES.

Abb. 2: Einfluß von Hsp70 und Hsp40 auf die Ausbeute an GFP im RTS-System:
GFP Expression ohne Zusatz von Hsp70 (aus Mensch) und Hdjl (Hsp40 aus Mensch). GFP Ex pression mit Ko-Expression von Hsp70 und Hdjl. GFP Expression unter Zusatz von 300 nM Hsp70 und 300 nM Hdjl.

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Beispiel 1

Für die Expression im RTS-System wurde ein das Zitrat Synthasegen enthaltender pIVEX 2.4b Vektor (Roche, Molecular Biochemicals) verwendet, wodurch das Zitrat Synthasegen mit einem n-terminal fusioniertem His-tag exprimiert wird. Die Reaktionen wurden bei 27°C, 140 rpm für 24 h unter Verwendung von RTSmini Kits der Ch. Nr. 85869220 (Roche, Molecular Biochem icals) durchgeführt.

Um die Aggregation der exprimierten Zitrat Synthase zu unterdrücken wurde einerseits GroEL/ES ko-exprimiert und andererseits gereinigtes GroEL/ES zu den RTS-Reaktionen zugege ben.

Es wurden jeweils 8 µg pIVEX 2.4b und 8 µg des GroEL/ES exprimierenden Plasmids eingesetzt. Das GroEL/ES exprimierende Plasmid entspricht einem modifiziertem pET-Vektor (Novagen, Milwaukee, USA), der das GroEL/ES-Operon unter der Kontrolle eines T7-Promotors exprimiert (Ishii Yasuhawa et al., 1995). Die Expression der 3 Proteine wurde mit SDS-PAGE und Immuno blot überprüft. Alle Proteine werden in etwa gleichen Mengen exprimiert.

Das zur Zugabe verwendete GroEL/ES wurde wie in Schmidt et al., (1994) beschrieben gereinigt. Zu dem RTS-System wurde 150 nM GroEL und 300 nM GroES zugesetzt.

Nach erfolgter RTS-Reaktion wurden die Reaktionsansätze für 10 min bei 14 000 g und 4°C zen trifugiert, um die Aggregate von den löslichen Komponenten zu trennen. Die lösliche Fraktion wurde 1 : 10 mit Ni-NTA Äquilibrierungspuffer verdünnt (100 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, pH 7,4) und mit einer kontinuierlichen Flussrate von 0,5 ml/min auf eine 1 ml Ni-NTA-Superflow Säule (Quiagen) geladen. Die Säule wurde mit erst 5 ml Äquilibrierungspuffer und anschließend mit 5 ml Waschpuffer (100 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazol, pH 6,8) gewaschen. Die Zitrat Synthase wurde dann mit 3 ml Elutions Puffer (100 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol, pH 7,5) von der Säule eluiert.

Das bei der Kondensation von Oxalacetat entstehende Seitenprodukt Coenzym A reduziert stoichiometrisch das Ellman's Reagenz (DTNB), was mit einer Erhöhung der Absorption bei 412 nm einher geht. Über diese Reaktion kann korrekt gefaltete, aktive Zitrat Synthase nachgewiesen werden. Für die Aktivitätsbestimmung wurden 50 µl der gereinigten Zitrat Synthase (Elutions fraktion), 90 µl TE-Puffer (50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 8,0), 10 µl Oxalacetat (10 mM, in 50 mM Tris), 10 µl DTNB (in TE-Puffer) und 30 µl Acetyl-CoA (in TE-Puffer) gemischt und bei 25°C inkubiert. Die Änderung der Absorption wurde kontinuierlich über einen Zeitraum von 5 min gemessen und die Absorptionsänderung pro Minute ermittelt. Die Absorptionsänderung von gereinigter Zitrat Synthase aus jeweils 3 verschiedenen RTS-Reaktionen wurde gemittelt. Die gemittelte Absorptionsänderung der RTS-Reaktionen ohne GroEL/ES Ko-Expression wurde auf 1 normiert.

Ergebnis

Wie in Abb. 1 gezeigt lassen sich durch beide Ansätze höhere Ausbeuten an aktiver, ge reinigter mitochondrialer Zitrat Synthase erzielen. Überraschenderweise funktioniert die Ko- Expression des GroEL/ES-Systems genauso gut wie die direkte Zugabe von gereinigtem GroEL und GroES. Die Ausbeute an aktivem, gereinigtem Zielprotein erhöhte sich durch die Ko-Ex pression von GroEL/ES um das 5fache.

Beispiel 2

Für die Untersuchung der Einflüsse von Hsp70 Chaperonen auf die Expression im RTS-System wurde GFP als Modellsubstrat verwendet. Die Reaktionen wurden bei 27°C, 140 rpm für 24 h un ter Verwendung von RTSmini Kits der Ch. Nr. 85869220 (Roche, Katalog) durchgeführt. Um die Oxidation von GFP während der Reaktion zu gewährleisten, wurden nur halbe Ansätze einge setzt. Es wurden jeweils 5 µg des in den RTSmini-Kits enthaltenen GFP-Kontrollplasmids ver wendet.

Um die Einflüsse von Hsp70 auf die Expressionsausbeute im System zu untersuchen wurde einerseits menschliches Hsp70 und Hsp40 ko-exprimiert und andererseits gereinigtes Hsp70 und Hsp40 zu den RTS-Reaktionen zugegeben.

Es wurden jeweils 8 µg der Hsp70 und Hsp40 exprimierenden Plasmide eingesetzt. Das Hsp70 exprimierende Plasmid entspricht einem pET11a-Vektor (Novagen, Milwaukee, USA), das Hsp40 (Hdjl) exprimierende Plasmid entspricht einem pET21d-Vektor (Novagen, Milwaukee, USA), beide Gene werden unter der Kontrolle eines T7-Promotors exprimiert. Zu dem RTS- System wurde 300 nM Hsp70 und 300 nM Hdjl zugesetzt (Abravaya et al., 1992).

Nach erfolgter RTS-Reaktion wurden die Reaktionsansätze für 10 min bei 14000 g und 4°C zen trifugiert, um die Aggregate von den löslichen Komponenten zu trennen. Von den löslichen Frak tionen wurde die Fluoreszenz-Emission von 430-580 nm, bei einer Anregung von 395 nm gemes sen. Die relative Fluoreszenz bei 503 nm des Ansatzes ohne Zusatz oder Ko-Expression von Cha peronen wurde auf 1 normiert und mit der Fluoreszenz der Ansätze mit Chaperonen verglichen. Um Effekte durch nachträgliche Oxidation von GFP auszuschließen wurden die Proben nach 24 Stunden erneut vermessen, wobei keine Unterschiede beobachtet werden konnten.

Ergebnis

Wie in Abb. 2 gezeigt lassen sich durch beide Ansätze höhere Ausbeuten an aktivem GFP erzielen. Überraschenderweise funktioniert sowohl die Zugabe, als auch die Ko-Expression der Hsp70 Chaperone. Die Ausbeute an aktivem Zielprotein erhöhte sich durch die Ko-Expression von Hsp70 und Hsp40 um das Doppelte. Die direkte Zugabe führt zu einer Steigerung der Aus beute um mehr als das 3fache.

Claims

1. Verfahren zur Expression von Ziel-Proteinen in in vitro Translationssystemen, dadurch ge kennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Faltungs helferproteine aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt sind:
Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp 100-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Fal tungshelferproteine Vertreter der Hsp60-Proteinfamilie sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Ko-Chaperone ko-ex primiert werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Hsp60 als Faltungshelferprotein und Hsp10 als Ko-Chaperon ko-exprimiert wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3-5, dadurch gekennzeichnet, daß das ko-exprimierte Faltungshelferprotein GroEL ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-6, dadurch gekennzeichnet, daß GroEL/GroES ko exprimiert werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Fal tungshelferproteine Vertreter der Hsp70-Proteinfamilie sind.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Ko-Chaperone ko-ex primiert werden.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das ko-exprimierte Fal tungshelferprotein ein menschliches Hsp70-Protein ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Hsp70 als Faltungs helferprotein und Hsp40 als Ko-Chaperon ko-exprimiert wird.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10-11, dadurch gekennzeichnet, daß Hsp70 aus Mensch und Hdjl (Hsp40 aus Mensch) ko-exprimiert werden.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem in vitro Translationssystem um ein gekoppeltes in vitro Transkriptions-/Translationssystem han delt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Ko-Expres sion der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone reguliert wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Zielproteine von der Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone ge trennt induzierbar ist.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß die gekoppelte in vitro Transkription/Translation in einem CFCF- bzw. CEFC-Reaktor stattfindet.

17. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.

18. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon für ein Ver fahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.

19. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein und weiterhin enthaltend eine Promotorregion, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminator region für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.

20. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon und weiterhin enthaltend eine Promotorregion, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminatorregion für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.