DE10121235A1 - Verfahren zur Expression von Proteinen in in vitro Translations-Systemen unter Ko-Expression von Faltungshelferproteinen - Google Patents
Verfahren zur Expression von Proteinen in in vitro Translations-Systemen unter Ko-Expression von FaltungshelferproteinenInfo
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Abstract
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression von Zielproteinen in in vitro Translations-Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp70-, Hsp60-, Hsp90-, Hsp100-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.
Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression von Zielproteinen in in
vitro Translations-Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem
System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer oder
mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp70-, Hsp60-, Hsp90-, Hsp100-Protein
familie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.
Die Faltung von großen oligomeren Proteinen wird in vitro häufig durch das Auftreten von Ag
gregation erschwert (Jaenicke und Rudolph, 1986; Buchner, 1996; Jaenicke, 1997). Aggregation
stellt dabei einen Seitenweg zur normalen Faltung dar, der in Konkurrenz zur korrekten Faltung
und Assoziation tritt. Der Grund für die Aggregation liegt in der Ausbildung nicht korrekter in
termolekularer Wechselwirkungen (Kiefhaber et al., 1991), die letztendlich zum Entstehen von
heterogenen Aggregaten führen, in denen die enthaltenen Polypeptidketten irreversibel verloren
sind. In vitro kann Aggregation als unerwünschte Nebenreaktion durch physikalisch-chemische
Parameter wie Proteinkonzentration, Lösungsmittelbedingungen, Temperatur oder Ionenstärke
minimiert werden (Jaenicke und Rudolph, 1989; Kiefhaber et al., 1991; Buchner, 1996; Jaenicke,
1997). In vivo hingegen sind die äußeren Bedingungen für alle Proteine konstant. Eine E. coli Zel
le erreicht trotz der enormen Syntheseleistung von ca. 60 000 Polypeptidketten pro Minute, eine
apparente Faltungsausbeute von praktisch 100% (Lorimer, 1996). Es erfolgt zwar auch in vivo
Mißfaltung und inkorrekte Assemblierung von Proteinen (Hurtley und Helenius, 1989; Pelham,
1989; Helenius et al., 1992), diese wird jedoch durch mehrere zelleigene Faktoren minimiert.
Chaperone oder Hitzeschockproteine verhindern unspezifische Aggregation (Buchner et al.,
1996) und mißgefaltete oder zu langsam faltende Proteine werden abgebaut (Gottesman und
Maurizi, 1992). Mutagenesestudien Hitzeschock-defizienter E. coli Stämme zeigten bei erhöhten
Wachstumstemperaturen das Auftreten von sogenannten "inclusion bodies" (Grangerov et al.,
1991). Unabhängig davon konnte gezeigt werden, daß die Bildung von inclusion bodies als Folge
von Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli durch eine gleichzeitige Überexpression
zelleigener Hitzeschockproteine effizient unterdrückt werden kann (Goloubinoff et al., 1989;
Dale et al., 1994; Amrein et al., 1995). Auch der Import von Proteinen in zelluläre Kompartimen
te, wie Mitochondrien, ist von in den Organellen lokalisierten Hitzeschockproteinen abhängig.
Auf Grund dieser Beobachtungen kann die Faltung von Proteinen als spontaner Prozeß, der von
Faltungshelferproteinen assistiert wird, gesehen werden (Horwich et al., 1993; Hendrick und
Hartl, 1993; Georgopoulos und Welch, 1993). So minimiert das exakte Zusammenspiel dieser
zelleigenen Faktoren die unkorrekten Faltungsprozesse und fördert die korrekte Faltung von
Polypeptiden (Buchner, 1996; Beißinger und Buchner, 1998; Hartl, 1998).
Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen der Faltung in vitro und in vivo besteht außer
dem darin, daß Proteine in der Zelle vektoriell vom N- zum C-Terminus falten (Bergman und
Kühl, 1979; Braakman et al., 1991). Dieser Prozeß erfolgt cotranslational oder während der
Translokation. Hierbei setzt Strukturbildung bereits ein, während das Polypeptid sich noch am
Ribosom befindet oder transloziert wird. Das bedeutet auch, daß zum Teil hydrophobe Regionen
und andere potentielle Interaktionsbereiche eines Polypeptids auf ihre Interaktionspartner, der
noch synthetisiert wird, warten müssen. Während dieser Syntheseprozesse können aber auch
nicht-approbiate Wechselwirkungen auftreten, die nur bedingt reversibel sind und zu Aggre
gationsreaktionen führen können. Andererseits lassen sich bereits in diesem Zustand bei Im
munoglobulinen, Serumalbumin und Hämaglutinin, Disulfidverbrückungen nachweisen (Berg
man & Kühl, 1979; Peters & Davidson, 1982; Braakman et al., 1991). Für Faltungshelferproteine
der Hsp70-Chaperon-Familie konnte gezeigt werden, daß sie bereits während der Translation am
Ribosom mit der naszierenden Polypeptidkette wechselwirken körnen (Egers et al., 1997; Fryd
man et al., 1994; Hansen et al., 1994; Welch et al., 1997). Auch viele andere Prozesse wie z. B. der
Import cytosolisch synthetisierter Polypeptidketten in Mitochondrien, sind von Faltungshelfer
proteinen abhängig (Dekker und Pfanner, 1999). Proteine können hierbei nur im linearen, ent
falteten Zustand durch eine oder beide mitochondrialen Membranen transportiert werden. Mo
lekulare Chaperone sind bei diesem Prozeß sowohl an der Entfaltung bzw. der Stabilisierung des
entfalteten Zustands auf der cytosolischen Seite der Membran als auch am Transport und der
Faltung in den Mitochondrien beteiligt.
Bei der Faltung in vitro sind besonders die Bildung und Isomerisierung von Disulfidbrücken und
die cis/trans-Isomerisierung von Prolinen geschwindigkeitsbestimmende Faltungsschritte. In der
Zelle werden diese Faltungsschritte von Faltungshelfern katalysiert. Proteindisulfidisomerasen
wie PDI oder DsbA beschleunigen Redoxreaktionen von Cysteinen und Disulfiden in Polypepti
den in Abhängigkeit von den Redoxbedingungen (Wunderlich und Glockshuber, 1993; Bardwell,
1997). Durch die Beschleunigung dieses Faltungsschrittes verringert sich die Konzentration an
Intermediaten während des Faltungsvorgangs. Dadurch wird die konzentrationsabhängige Ag
gregation minimiert und die Faltungsausbeute erhöht (Weissman und Kim, 1993; Lillie et al.,
1994). Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPI) katalysieren die Isomerisierung zwischen der
cis- und trans-Form von Peptidbindungen vor Prolinresten in Polypeptidketten. Im Gegensatz zu
allen anderen Peptidbindungen in nativen Proteinen kann diese in ihrer cis-Konfiguration vorlie
gen (Schmid, 1997).
Das häufig in in vitro Translationssysteme verwendete E. coli Lysat stellt ein natürliches, für die
Proteinfaltung optimales System dar. Im Gegensatz zu einer funktionellen Zelle wird die Menge
an benötigten Chaperonen aber nicht automatisch der SyntheseleLstung des Translationsappa
rates angepaßt. Die daraus resultierende Überlastung der Faltungsmaschinerie resultiert in vielen
Fällen in der Aggregation des Zielproteins. In Abhängigkeit des Zielproteins können verschie
denste Komponenten der Faltungsmaschinerie für diese ineffiziente Faltung verantwortlich sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, in einem in vitro Translationssystem die Ausbeute an
Zielprotein zu erhöhen, indem die Aggregation des Zielproteins durch die Bereitstellung der be
nötigten Chaperone in ausreichender Menge im in vitro Translationssystem verhindert wird. Da
durch soll zugleich die Effizienz des in vitro Translationssystems gesteigert werden.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Expression von Ziel-Pro
teinen in in vitro Translationssystemen, dadurch gekennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in
diesem System ko-exprimiert werden. Die ko-exprimierten Faltungshelferproteine sind aus einer
oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp100-Pro
teinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.
Molekulare Chaperone stellen die größte Gruppe von faltungsassistierenden Proteinen dar und
werden erfindungsgemäß als Faltungshelferprotein verstanden (Gething und Sambrook, 1992;
Hartl, 1996; Buchner, 1996; Beißinger und Buchner, 1998). Aufgrund ihrer Überexpression unter
Stressbedingungen können die meisten molekularen Chaperone auch in die Gruppe der Hitze
schockproteine eingeordnet werden (Georgopoulos und Welch, 1993; Buchner, 1996), diese Grup
pe wird erfindungsgemäß ebenfalls als Faltungshelferprotein verstanden.
Nachfolgend werden wichtige Faltungshelferproteine, die von der vorliegenden Erfindung um
faßt werden, näher erläutert. Die Gruppe der molekularen Chaperone läßt sich anhand von Se
quenzhomologien und der molekularen Massen in fünf nicht verwandte Proteinklassen, die
Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp100-Proteinfamilien und die Familie der kleinen Hitzeschockpro
teine unterteilen (Gething und Sambrook, 1992; Hendrick und Hartl, 1993).
Das am Besten untersuchte Chaperon überhaupt ist GroEL, ein Vertreter der Hsp60 Familie aus
E. coli. Die Vertreter der Hsp60 Familie werden auch als Chaperonine bezeichnet und in zwei
Gruppen unterteilt. GroEL und sein Ko-Chaperon GroES und deren stark homologe Verwandte
aus anderen Bakterien sowie Mitochondrien und Chloroplasten bilden die Gruppe der I Cha
peronine (Sigler et al., 1998; Fenton und Horwich, 1994). Die Hsp60 Proteine aus dem eukaryoti
schen Cytosol und aus Archebakterien werden als Gruppe II Chaperonine zusammengefaßt
(Gutsche et al., 1999). In beiden Gruppen zeigen die Hsp60 Proteine einen ähnlichen oligomeren
Aufbau. Im Falle von GroEL und den anderen Gruppe I Chaperoninen lagern sich 14 GroEL Un
tereinheiten zu einem Zylinder aus zwei heptameren Ringen zusammen, während die heptamere
Ringstruktur bei den Chaperoninen der Gruppe II aus Archebakterien meist aus zwei unter
schiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Vertreter der Gruppe II Chaperonine aus dem eu
karyotischen Cytosol, wie z. B. der CCT-Komplex aus Hefe, sind hingegen aus 8 verschiedenen
Untereinheiten mit genau definierter Organisation aufgebaut (Liou und Willison, 1997). Im
zentralen Hohlraum dieses Zylinders können nicht native Proteine eingelagert und gebunden
werden. Das Ko-Chaperon GroES bildet ebenfalls einen heptameren Ring und bindet in dieser
Form an den Polen des GroEL-Zylinders. Diese Bindung von GroES führt allerdings zu einer
Limitierung der Substratbindung in Abhängigkeit ihrer Größe 10-55 kDa (Ewalt et al., 1997). Die
Substratbindung wird dabei durch ATP-Bindung und Hydrolyse reguliert.
Neben den Vertretern der Hsp60 Familie binden auch die Hsp70 Proteine an die naszierende
Polypeptidkette (Beckman et al., 1990; Welch et al., 1997). Sowohl in prokaryotischen als auch in
eukaryotischen Zellen existieren meist mehrere konstitutiv exprimierte und stressinduzierte Ver
treter der Hsp70 Familie (Vickery et al., 1997; Welch et al., 1997). Diese sind neben der Protein
faltung direkt am Ribosom auch an der Translokation von Proteinen über Zell- und Organell
membranen beteiligt (Schatz & Doberstein, 1996). Es wurde gezeigt, daß Proteine nur im unge
falteten bzw. teilgefalteten Zustand durch Membranen geschleust werden können (Hannavy et
al., 1993). Während des Translokationsprozesses in Organellen sind vor allem Vertreter der
Hsp70 Familie an der Entfaltung und Stabilisierung auf der cytosolischen Seite, als auch an der
Rückfaltung auf der Organellseite beteiligt (Hauke und Schatz, 1997). Dabei ist bei allen Prozes
sen die ATPase-Aktivität von Hsp70 essentiell für die Funktion des Proteins. Charakteristisch für
das Hsp70-System ist die Kontrolle der Aktivität durch Ko-Chaperone (Hsp40; DnaJ), wobei
durch gezielte Modulation der ATPase-Aktivität das Gleichgewicht zwischen Substratbindung
und Freisetzung beeinflußt wird (Bukau und Horwich, 1998).
Mit etwa 1% des löslichen Proteins im eukaryontischen Cytosol stellt Hsp90 eines der am stärk
sten exprimierten Proteine dar (Welch und Feramisco, 1982). Die Vertreter dieser Familie agie
ren vorwiegend in multimeren Komplexen, wobei sie eine Vielzahl von wichtigen Signaltrans
duktionsproteinen mit nativähnlichen Strukturen erkennen. Durch die Bindung an Hsp90 und
seine Partnerproteine werden diese Strukturen stabilisiert und so die Bindung von Liganden an
die Signalproteine erleichtert. So können die Substrate ihre aktive Konformation erlangen (Sulli
van et al., 1997; Bohen et al., 1995; Buchner, 1999).
In jüngster Zeit zeichneten sich besonders die Hsp100 Chaperone durch ihre Fähigkeit in Zusam
menarbeit mit den Hsp70 Chaperonen bereits gebildete Aggregate wieder aufzulösen aus (Parsell
et al., 1994; Goloubinoff et al., 1999; Mogk et al., 1999). Während ihre Hauptaufgabe die Ver
mittlung von Thermotoleranz zu sein scheint (Schirmer et al., 1994; Kruger et al., 1994), ver
mitteln einige Vertreter wie ClpA und ClpB zusammen mit der Protease-Untereinheit ClpP den
proteolytischen Abbau von Proteinen (Gottesman et al., 1997).
Die fünfte Klasse von Chaperonen, die kleinen Hitzeschockproteine (sHsps), stellen eine sehr di
vergente Familie von Hitzeschockproteinen dar, die in fast allen Organismen gefunden werden.
Namensgebend für diese Familie von Chaperonen ist ihr relativ geringes monomeres Molekular
gewicht von 15-40 kDa. In der Zelle existieren sHsps aber meist als hocholigomere Komplexe mit
bis zu 50 Untereinheiten, woraus Molekülmassen von 125 kDa bis zu 2 MDa beobachtet wurden
(Spector et al., 1971; Arrigo et al., 1988; Andreasi-Bassi et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997). In
vitro können sHsps wie die anderen Chaperone die Aggregation von Proteinen unterdrücken
(Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993; Merck et al., 1993; Jakob und Buchner, 1994, Lee et al., 1995;
Ehrnsperger et al., 1997b). Dabei binden sHsps bis zu ein Substratmolekül je Untereinheit und
zeigen somit eine höhere Effizienz als das Modellchaperon GroEL (Jaenicke und Creighton, 1993;
Ganea und Harding, 1995; Lee et al., 1997; Ehrnsperger et al., 1998a). Unter Streßbedingungen
verhindert die Bindung von nicht nativem Protein an sHsps die irreversible Aggregation der Pro
teine. Durch die Bindung an sHsps werden die Proteine in einem löslichen faltungskompeten
ten Zustand gehalten. Nach der Wiederherstellung von physiologischen Bedingungen kann das
nicht native Protein von ATP-abhängigen Chaperonen wie Hsp70 aus dem Komplex mit sHsp
gelöst und reaktiviert werden.
Als Isomerasen kommen für das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise Faltungskatalysa
toren aus der Klasse der Peptidyl-prolyl-cis/trans Isomerasen und Vertreter der Disulfidisomera
sen.
Faltungshelferproteine, die in gleicher oder ähnlicher Weise funktionieren wie die oben beschrie
benen Faltungshelferproteine, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, daß die ko-exprimierten Faltungshelferpro
teine Vertreter der Hsp60-Proteinfamilie sind. Weiterhin werden bevorzugt zusätzlich Ko-Cha
perone ko-exprimert. Besonders bevorzugt ist gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß
Hsp60 als Faltungshelferprotein und Hsp10 als Ko-Chaperon ko-exprimert wird. Besonders be
vorzugt wird, daß das ko-exprimierte Faltungshelferprotein GroEL ist. Insbesondere bevorzugt
ist das Verfahren, wenn GroEL/GroES ko-exprimiert werden.
Eine andere bevorzugte Variante des Verfahrens besteht darin, daß die ko-exprimierten Faltungs
helferproteine Vertreter der Hsp70-Proteinfamilie sind. Weiterhin werden bevorzugt zusätzlich
Ko-Chaperone ko-exprimert. Besonders bevorzugt ist bei dieser Variante, daß das ko-exprimierte
Faltungshelferprotein ein menschliches Hsp70-Protein ist. Insbesondere ist dann bevorzugt, daß
das Hsp70 als Faltungshelferprotein und Hsp40 als Ko-Chaperon ko-exprimert wird. Am mei
sten wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend dieser Variante bevorzugt,
daß Hsp70 aus Mensch und Hdjl (Hsp40 aus Mensch) ko-exprimiert werden.
Erfindungsgemäß können die Zielproteine alle Arten von pro- und eukaryontischen Proteinen
und auch archaeale Proteine sein. Problematisch in in vitro Transkriptions/Translationssystemen
war bisher insbesondere die Expression von sekretorischen Proteinen und Membranproteinen,
besonders dann wenn keine Faltungshelferproteine in ausreichender Menge vorhanden sind. Die
erfolgreiche Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen wurde im Stand
der Technik zwar beschrieben, war aber deutlichen Limitationen unterworfen (Huppa und
Ploegh, 1997; Falk et al., 1997). Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die
Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen bzw. sekretorischen Proteinen
als Zielprotein, da Faltungshelferproteine durch die Ko-expression in ausreichender Menge zur
Verfügung gestellt werden.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, daß die Steigerung der
Volumenausbeute des Zielproteins in in vitro Transkriptions-/Translationssystemen im präpara
tiven Maßstab erfolgt.
Im folgenden Abschnitt werden in vitro Translationssysteme, auf die sich die vorliegende Erfin
dung beziehen kann, näher erläutert, insbesondere gekoppelte in vitro Transkriptions-/Trans
lationssysteme. Die derzeit effizientesten Systeme basieren auf E. coli-, Kaninchen Retikulozyten-
oder Weizenkeim-Lysaten (Spirin, 1990; Stiege und Erdman, 1995). Normalerweise werden sie
als Batch-Reaktionen mit einem definierten Reaktionsvolumen eingesetzt. Auf E. coli basierende
Reaktionen können dabei in einem Temperaturbereich von 24-38°C eingesetzt werden. Für diese
Batchverfahren wird in der Regel der 30S Überstand von E. coli Lysaten verwendet, der aufgrund
des hohen Gehalts an endogener mRNA, vor dem Einsatz für die in vitro Translation mit RNase
behandelt werden muß (Zubay, 1973). Auf Weizenkeimlysaten basierende Reaktionen werden
normalerweise nur in einem Temperaturbereich von 20-27°C eingesetzt (Tulin et al., 1995), ha
ben aber gegenüber E. coli Lysaten den Vorteil, daß sie durch das geringe Level an endogener
mRNA direkt für die Expression exogener Expressionsvorlagen eingesetzt werden können. Reti
kulozyten-Lysate werden durch direkte Lyse von anemischem Kaninchen Blut hergestellt, aus
dem durch RNase Behandlung die endogenen mRNAs entfernt werden. Diese Systeme werden in
der Regel für Arbeiten im Temperaturbereich von 30-38°C eingesetzt (Pelham und Jackson,
1976). Dabei ist zu beachten, daß die Arbeitstemperatur nicht nur Einfluß auf die Translations
prozesse hat, sondern auch die Faltung der Zielproteine extrem von der jeweiligen Arbeitstem
peratur abhängig ist.
Die Proteinsynthese in solchen Batch-Reaktionen wird nur solange aufrecht erhalten, bis die er
sten wichtigen Komponenten aufgrund von Degradation, Inhibition oder Energiemangel nicht
mehr funktionsfähig sind. Das größte Problem ist in diesem Zusammenhang die Energieversor
gung der Proteinsynthese (Yao et al., 1997, Matveev et al., 1996), wodurch in diesen Batch-
Reaktionen nur relativ kurze Synthesezeiten und damit nur relativ geringe Ausbeuten an Ziel
proteine (durchschnittlich 0,1-20 µg/ml) erreicht werden können (Mosca et al., 1983).
Die für die Proteinsynthese notwendige mRNA kann jedoch auch direkt in den Expressions
systemen hergestellt werden. Für diese sogenannten gekoppelten Transkriptions/Translations
systeme können in auf E. coli Lysaten basierenden Systemen sowohl die endogene RNA Poly
merase als auch exogene Phagen RNA Polymerase zur Herstellung der mRNA benutzt werden
(Chen und Zubay, 1983; Köhrer et al., 1996). Dahingegen werden in eukaryontischen Systemen
exogene Phagen RNA Polymerasen eingesetzt (Craig et al., 1992; Baranov und Spirin, 1993). In
solchen eukaryontischen Systemen werden dann aber natürlich auch entsprechende DNA-Vor
lagen mit den entsprechenden Promotorelementen benötigt.
Mit den continuos-exchange cell-free translation apparatus (CECF) bzw. continuos-flow-cell-free
translation apparatus gelang es, das Problem der kurzen Expressionszeiten und der Energiever
sorgung der Systeme zu lösen (Spirin et al., 1988; Spirin, 1991). Die grundlegende Idee basiert
dabei auf der kontinuierlichen Versorgung der Reaktion mit Energie und niedermolekularen
Komponenten und der kontinuierlichen Entfernung von niedermolekularen Beiprodukten. Da
bei wird die Reaktion über eine semipermeable Membran aus einem separaten Fütterungskom
partiment versorgt.
Bevorzugt handelt es sich bei dem in vitro Translationssystem um ein gekoppeltes in vitro Trans
kriptions-/Translationssystem. Insbesondere bevorzugt findet die gekoppelte in vitro Transkrip
tions-/Translation in einem CFCF- oder CEFC-Reaktor statt.
Für die Ko-expression in in vitro Transkriptions/Translationssystemen können Vektoren bzw.
DNA-Vorlagen verwendet werden, die in ihrem Aufbau den Expressionsvektoren der Zielpro
teine entsprechen. In auf E. coli-Lysaten basierenden Systemen können dabei sowohl Promotoren
für die endogen E. coli RNA Polymerase verwendet werden, als auch Vektoren mit Promotoren
exogener viraler Polymerasen. Dabei sollten die Vektoren neben den Promotorregionen auch
eine Ribosomenbindestelle und geeignete Terminatorregionen enthalten. Prinzipiell ist auch der
Einsatz linearer DNA-Expressionsvorlagen (z. B. PCR-Produkt) möglich. Werden zirkuläre Ex
pressionsvektoren verwendet, die für den experimentellen Einsatz vorher in vivo amplifiziert
werden müssen, sollten geeignete Replikationsstartpunkte und mindestens ein selektionierbarer
Marker enthalten sein. Der Ko-expressionszeitraum und die Ko-expressionsstärke von Cha
peronen können in Abhängigkeit von den jeweiligen Substratproteinen optimiert werden (Lott
speich und Zorbas, 1998).
Um eine maximale Effizienz der Chaperonmaschinerie während der Synthesereaktion zu gewähr
leisten, sollte die Ko-expression reguliert werden. Eine entsprechende Regulation läßt sich einer
seits durch die dosierte Zugabe der Ko-expressionsvektoren erreichen, oder andererseits durch
regulatorische Sequenzen in den Promotorregionen des Vektors, über welche Induktion und
Stärke der Expression reguliert werden können. Für eine entsprechende Regulation können bei
spielsweise IPTG induzierbare lac-Operator-Sequenzen, Bindesequenzen für Tetracyclinrepres
soren oder Katabolit induzierbare Regulatorsequenzen (z. B. Arabinose Operator) verwendet wer
den. Dabei muß allerdings die getrennte Induktion der Zielproteinexpression und der Chaperon
koexpression bedacht werden.
Es ist also bevorzugt, daß die Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-
Chaperone reguliert wird. Insbesondere ist bevorzugt, daß die Expression der Ziel-Proteine von
der Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone getrennt in
duzierbar ist.
DNA-Vorlagen für eukaryontische Systeme sollten ebenfalls aus entsprechenden Promotor-Re
gionen für virale RNA-Polymerasen, den für die Initiation der Translation nötigen eukaryon
tischen Sequenzen und geeigneten Terminatoren bestehen. Zirkuläre Expressionsvektoren, die
für den experimentellen Einsatz in E. coli amplifiziert werden müssen, sollten außerdem eine Re
plikationsstartsequenz für E. coli und mindestens einen in E. coli selektionierbaren Marker ent
halten. Auch hier könnte die Regulation der Chaperonkoexpression durch entsprechende regu
latorische Sequenzen für die viralen Promotoren erreicht werden (Lottspeich und Zorbas, 1998).
Da die Überlastung der Chaperonmaschinerie vom jeweiligen Zielprotein und der Stärke der Ex
pression des Zielproteins abhängt, ist auch die Menge an benötigten Chaperonen stark vom Ziel
protein abhängig. Dadurch kann im Einzelfall die Optimierung der Expressionsstärken beider
Expressionsvorlagen wichtig sein. Eine entsprechende Optimierung kann neben der direkten Re
gulation der Expression über die Promotoren, und zwar durch die Variation der eingesetzten
Menge an Expressionsvorlagen, erreicht werden. Bei stark aggregationsanfälligen Zielproteinen
kann dabei durchaus ein extremer Überschuß an Chaperonen nötig sein, während sich bei an
deren Zielproteinen die zu starke Ko-expression von Chaperone evtl. sogar störend auf die Ex
pression an Zielprotein auswirkt. In Abhängigkeit vom Zielprotein kann sowohl die Ko-expres
sion einzelner Chaperone als auch die Ko-expression mehrerer Chaperone für die funktionelle
Expression des Zielproteins nötig sein. Dabei ist auch zu bedenken, daß die meisten Chaperone
nur als komplexe Systeme mit entsprechenden Ko-Chaperonen effektiv arbeiten. Besonders be
vorzugt ist daher die Ko-Expression von Chaperonen und entsprechenden Ko-Chaperonen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe kann auch gelöst werden durch die Zugabe von gereinigten Cha
peronen und Ko-Chaperonen in der benötigten Menge. Allerdings ist dieses Verfahren relativ
teuer.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung eines Vektors enthal
tend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein für das erfindungsgemäße Verfahren. Des
weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Vektors enthaltend
ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon für das erfindungsgemäße Verfahren.
Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Vektors enthal
tend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein und weiterhin enthaltend eine Promotor
region, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminatorregion für das erfindungsgemäße Ver
fahren. Ebenfalls insbesondere bevorzugt ist die Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen
codierend für ein Ko-Chaperon und weiterhin enthaltend eine Promotorregion, eine Riboso
menbindungsstelle, eine Terminatorregion für das erfindungsgemäße Verfahren.
In den folgenden Beispielen wurde das erfindungsgemäße Verfahren zum einen im Rapid Trans
lation System (RTS-System) mit der mitochondrialen Zitrat Synthase als Zielprotein (Schweine
herz; EC 4.1.3.7) durchgeführt. Als weiteres Zielprotein wurde GFP eingesetzt. Unerwarteter
weise führte sowohl die Ko-expression von GroEL/ES im RTS-System als auch die Zugabe von
GroEL/ES zu einer Steigerung der Expressionsausbeuten in präparativem Maßstab.
Abb. 1: Einfluß von GroEL/ES auf die Ausbeute an aktiver, gereinigter CS im RTS-System:
CS Expression von pIVEX 2.4b ohne Zusatz von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b, Ko- Expression von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b unter Zusatz von 150 nM gereinigtem GroEL und 300 nM gereinigtem GroES.
CS Expression von pIVEX 2.4b ohne Zusatz von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b, Ko- Expression von GroEL/ES. CS Expression von pIVEX 2.4b unter Zusatz von 150 nM gereinigtem GroEL und 300 nM gereinigtem GroES.
Abb. 2: Einfluß von Hsp70 und Hsp40 auf die Ausbeute an GFP im RTS-System:
GFP Expression ohne Zusatz von Hsp70 (aus Mensch) und Hdjl (Hsp40 aus Mensch). GFP Ex pression mit Ko-Expression von Hsp70 und Hdjl. GFP Expression unter Zusatz von 300 nM Hsp70 und 300 nM Hdjl.
GFP Expression ohne Zusatz von Hsp70 (aus Mensch) und Hdjl (Hsp40 aus Mensch). GFP Ex pression mit Ko-Expression von Hsp70 und Hdjl. GFP Expression unter Zusatz von 300 nM Hsp70 und 300 nM Hdjl.
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Welch WJ, Feramisco JR (1982) J Biol Chem 257: 14949-14959
Welch WJ, Eggers DK, Hansen WJ, Nagata H (1997) in: Molecular Chaperones in Life Cycle of Proteins. Fink AL, Goto Y (Hrsg.) Marcel Dekker, New York, 71-93
Weissman JS, Kim PS (1993) Nature 365, 185-188
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Zubay G (1973) Annu Rev Genet 7: 267-287
Für die Expression im RTS-System wurde ein das Zitrat Synthasegen enthaltender pIVEX 2.4b
Vektor (Roche, Molecular Biochemicals) verwendet, wodurch das Zitrat Synthasegen mit einem
n-terminal fusioniertem His-tag exprimiert wird. Die Reaktionen wurden bei 27°C, 140 rpm für
24 h unter Verwendung von RTSmini Kits der Ch. Nr. 85869220 (Roche, Molecular Biochem
icals) durchgeführt.
Um die Aggregation der exprimierten Zitrat Synthase zu unterdrücken wurde einerseits
GroEL/ES ko-exprimiert und andererseits gereinigtes GroEL/ES zu den RTS-Reaktionen zugege
ben.
Es wurden jeweils 8 µg pIVEX 2.4b und 8 µg des GroEL/ES exprimierenden Plasmids eingesetzt.
Das GroEL/ES exprimierende Plasmid entspricht einem modifiziertem pET-Vektor (Novagen,
Milwaukee, USA), der das GroEL/ES-Operon unter der Kontrolle eines T7-Promotors exprimiert
(Ishii Yasuhawa et al., 1995). Die Expression der 3 Proteine wurde mit SDS-PAGE und Immuno
blot überprüft. Alle Proteine werden in etwa gleichen Mengen exprimiert.
Das zur Zugabe verwendete GroEL/ES wurde wie in Schmidt et al., (1994) beschrieben gereinigt.
Zu dem RTS-System wurde 150 nM GroEL und 300 nM GroES zugesetzt.
Nach erfolgter RTS-Reaktion wurden die Reaktionsansätze für 10 min bei 14 000 g und 4°C zen
trifugiert, um die Aggregate von den löslichen Komponenten zu trennen. Die lösliche Fraktion
wurde 1 : 10 mit Ni-NTA Äquilibrierungspuffer verdünnt (100 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, pH
7,4) und mit einer kontinuierlichen Flussrate von 0,5 ml/min auf eine 1 ml Ni-NTA-Superflow
Säule (Quiagen) geladen. Die Säule wurde mit erst 5 ml Äquilibrierungspuffer und anschließend
mit 5 ml Waschpuffer (100 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazol, pH 6,8) gewaschen.
Die Zitrat Synthase wurde dann mit 3 ml Elutions Puffer (100 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl,
300 mM Imidazol, pH 7,5) von der Säule eluiert.
Das bei der Kondensation von Oxalacetat entstehende Seitenprodukt Coenzym A reduziert
stoichiometrisch das Ellman's Reagenz (DTNB), was mit einer Erhöhung der Absorption bei 412 nm
einher geht. Über diese Reaktion kann korrekt gefaltete, aktive Zitrat Synthase nachgewiesen
werden. Für die Aktivitätsbestimmung wurden 50 µl der gereinigten Zitrat Synthase (Elutions
fraktion), 90 µl TE-Puffer (50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 8,0), 10 µl Oxalacetat (10 mM, in
50 mM Tris), 10 µl DTNB (in TE-Puffer) und 30 µl Acetyl-CoA (in TE-Puffer) gemischt und bei
25°C inkubiert. Die Änderung der Absorption wurde kontinuierlich über einen Zeitraum von
5 min gemessen und die Absorptionsänderung pro Minute ermittelt. Die Absorptionsänderung
von gereinigter Zitrat Synthase aus jeweils 3 verschiedenen RTS-Reaktionen wurde gemittelt. Die
gemittelte Absorptionsänderung der RTS-Reaktionen ohne GroEL/ES Ko-Expression wurde auf
1 normiert.
Wie in Abb. 1 gezeigt lassen sich durch beide Ansätze höhere Ausbeuten an aktiver, ge
reinigter mitochondrialer Zitrat Synthase erzielen. Überraschenderweise funktioniert die Ko-
Expression des GroEL/ES-Systems genauso gut wie die direkte Zugabe von gereinigtem GroEL
und GroES. Die Ausbeute an aktivem, gereinigtem Zielprotein erhöhte sich durch die Ko-Ex
pression von GroEL/ES um das 5fache.
Für die Untersuchung der Einflüsse von Hsp70 Chaperonen auf die Expression im RTS-System
wurde GFP als Modellsubstrat verwendet. Die Reaktionen wurden bei 27°C, 140 rpm für 24 h un
ter Verwendung von RTSmini Kits der Ch. Nr. 85869220 (Roche, Katalog) durchgeführt. Um die
Oxidation von GFP während der Reaktion zu gewährleisten, wurden nur halbe Ansätze einge
setzt. Es wurden jeweils 5 µg des in den RTSmini-Kits enthaltenen GFP-Kontrollplasmids ver
wendet.
Um die Einflüsse von Hsp70 auf die Expressionsausbeute im System zu untersuchen wurde
einerseits menschliches Hsp70 und Hsp40 ko-exprimiert und andererseits gereinigtes Hsp70 und
Hsp40 zu den RTS-Reaktionen zugegeben.
Es wurden jeweils 8 µg der Hsp70 und Hsp40 exprimierenden Plasmide eingesetzt. Das Hsp70
exprimierende Plasmid entspricht einem pET11a-Vektor (Novagen, Milwaukee, USA), das
Hsp40 (Hdjl) exprimierende Plasmid entspricht einem pET21d-Vektor (Novagen, Milwaukee,
USA), beide Gene werden unter der Kontrolle eines T7-Promotors exprimiert. Zu dem RTS-
System wurde 300 nM Hsp70 und 300 nM Hdjl zugesetzt (Abravaya et al., 1992).
Nach erfolgter RTS-Reaktion wurden die Reaktionsansätze für 10 min bei 14000 g und 4°C zen
trifugiert, um die Aggregate von den löslichen Komponenten zu trennen. Von den löslichen Frak
tionen wurde die Fluoreszenz-Emission von 430-580 nm, bei einer Anregung von 395 nm gemes
sen. Die relative Fluoreszenz bei 503 nm des Ansatzes ohne Zusatz oder Ko-Expression von Cha
peronen wurde auf 1 normiert und mit der Fluoreszenz der Ansätze mit Chaperonen verglichen.
Um Effekte durch nachträgliche Oxidation von GFP auszuschließen wurden die Proben nach 24
Stunden erneut vermessen, wobei keine Unterschiede beobachtet werden konnten.
Wie in Abb. 2 gezeigt lassen sich durch beide Ansätze höhere Ausbeuten an aktivem GFP
erzielen. Überraschenderweise funktioniert sowohl die Zugabe, als auch die Ko-Expression der
Hsp70 Chaperone. Die Ausbeute an aktivem Zielprotein erhöhte sich durch die Ko-Expression
von Hsp70 und Hsp40 um das Doppelte. Die direkte Zugabe führt zu einer Steigerung der Aus
beute um mehr als das 3fache.
Claims (20)
1. Verfahren zur Expression von Ziel-Proteinen in in vitro Translationssystemen, dadurch ge
kennzeichnet, daß Faltungshelferproteine in diesem System ko-exprimiert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Faltungs
helferproteine aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt sind:
Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp 100-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.
Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, Hsp 100-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Fal
tungshelferproteine Vertreter der Hsp60-Proteinfamilie sind.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Ko-Chaperone ko-ex
primiert werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Hsp60 als Faltungshelferprotein
und Hsp10 als Ko-Chaperon ko-exprimiert wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3-5, dadurch gekennzeichnet, daß das ko-exprimierte
Faltungshelferprotein GroEL ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-6, dadurch gekennzeichnet, daß GroEL/GroES ko
exprimiert werden.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ko-exprimierten Fal
tungshelferproteine Vertreter der Hsp70-Proteinfamilie sind.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Ko-Chaperone ko-ex
primiert werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das ko-exprimierte Fal
tungshelferprotein ein menschliches Hsp70-Protein ist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Hsp70 als Faltungs
helferprotein und Hsp40 als Ko-Chaperon ko-exprimiert wird.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10-11, dadurch gekennzeichnet, daß Hsp70 aus
Mensch und Hdjl (Hsp40 aus Mensch) ko-exprimiert werden.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem in
vitro Translationssystem um ein gekoppeltes in vitro Transkriptions-/Translationssystem han
delt.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Ko-Expres
sion der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone reguliert wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Zielproteine
von der Ko-Expression der Faltungshelferproteine beziehungsweise der Ko-Chaperone ge
trennt induzierbar ist.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß die gekoppelte in
vitro Transkription/Translation in einem CFCF- bzw. CEFC-Reaktor stattfindet.
17. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein für
ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.
18. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon für ein Ver
fahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.
19. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Faltungshelferprotein und
weiterhin enthaltend eine Promotorregion, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminator
region für ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.
20. Verwendung eines Vektors enthaltend ein Gen codierend für ein Ko-Chaperon und weiterhin
enthaltend eine Promotorregion, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Terminatorregion für
ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16.
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