Método para la expresión de proteínas en sistemas de traducción in vitro con coexpresión de proteínas de ayuda al plegamiento.

La presente invención concierne a un método para la expresión de proteínas diana en sistemas de traducción in vitro, que se caracteriza en que se coexpresan proteínas de ayuda al plegamiento en este sistema. Las proteínas de ayuda al plegamiento coexpresadas se seleccionan entre una o varias de las siguientes clases de proteína: la familia de proteínas Hsp70, Hsp60, Hsp90, Hsp100, la familia de proteínas de choque por calor pequeñas y las isomerasas.

El plegamiento de las proteínas oligoméricas grandes in vitro frecuentemente es erróneo a causa de la aparición de agregación (Jaenicke y Rudolph, 1986; Buchrier, 1996; Jaenicke, 1997). La agregación es una ruta alternativa al plegamiento normal que compite con el plegamiento y asociación correctos. El motivo de la agregación es la formación de interacciones intermoleculares incorrectas (Kiefhaber et al., 1991) que en último término dan lugar a la formación de agregados heterogéneos en los que las cadenas polipeptídicas que estos contienen se pierden irreversiblemente. Es posible minimizar la agregación in vitro como reacción colateral no deseada mediante parámetros físico-químicos como la concentración de proteína, condiciones del solvente, temperatura o fuerza iónica (Jaenicke y Rudolph, 1989; Kiefhaber et al., 1991; Buchner, 1996; Jaenicke, 1997). Por el contrario, las condiciones externas de todas las proteínas son constantes in vivo. Una célula de E. coli alcanza un rendimiento de plegamiento aparente de casi un 100% a pesar de la enorme tasa de síntesis de casi 60000 cadenas polipeptídicas por minuto (Lorimer, 1996). Aunque el mal plegamiento y el ensamblaje incorrecto de proteínas también ocurre in vivo (Hurtley y Helenius, 1989; Pelham, 1989; Helenius et al., 1992), éste se ve minimizado por varios endógenos factores celulares. Las chaperonas o proteínas de choque por calor previenen la agregación no específica (Buchner et al., 1996) y las proteínas mal plegadas o las proteínas que se pliegan demasiado despacio son degradadas (Gottesman y Maurizi, 1992). Estudios de mutagénesis en cepas de E. coli deficientes en choque por calor han mostrado que aparecen los llamados cuerpos de inclusión a temperaturas de crecimiento elevadas (Grangerov et al., 1991). Independientemente de esto se ha demostrado que la formación de cuerpos de inclusión que resultan de la sobreexpresión de proteínas recombinantes en E. coli pueden suprimirse eficientemente mediante la sobreexpresión simultanea de las proteínas de choque por calor endógenas celulares (Goloubinoff et al., 1989; Dale et al., 1994; Amrein et al., 1995). La importación de proteínas a los compartimentos celulares como las mitocondrias también depende de las proteínas de choque por calor que se localizan en los orgánulos. En base a estas observaciones se puede considerar el plegamiento de las proteínas como un proceso espontáneo que es asistido por las proteínas de ayuda al plegamiento (Horwich et al., 1993; Hendrick y Hartl, 1993; Georgopoulos y Welch, 1993). Por lo tanto, la interrelación precisa entre estos factores celulares endógenos reduce los procesos de plegamiento incorrecto y promueve el plegamiento correcto de los polipéptidos (Buchner, 1996; Bei\betainger y Buchner, 1998; Hartl, 1998).

Otra diferencia importante entre el plegamiento in vitro e in vivo es que las proteínas en la célula se pliegan de forma vectorial desde el extremo N- al C-terminal (Bergman y Kühl, 1979; Braakman et al., 1991). Este proceso ocurre durante la traducción o translocación. El inicio de la formación de la estructura ya aparece mientras el polipéptido está aun en el ribosoma o durante la translocación. Esto también significa que algunas regiones hidrofóbicas y otras potenciales regiones de interacción del polipéptido han de esperar a su acompañante en la interacción, que aun está por sintetizarse. Sin embargo, pueden ocurrir interacciones no apropiadas durante este proceso de síntesis que solo pueden revertirse bajo ciertas condiciones y pueden dar lugar a reacciones de agregación. Por otro lado, pueden detectarse puentes disulfuro ya en esta etapa en las inmunoglobulinas, albúmina sérica y hemaglutinina (Bergman y Kühl, 1979; Peters y Davidson, 1982; Braakman et al., 1991). Se ha demostrado que las proteínas de ayuda al plegamiento de la familia de chaperonas Hsp70 pueden interaccionar ya con la cadena polipeptídica naciente durante la traducción en el ribosoma (Egers et al., 1997; Frydman et al., 1994; Hansen et al., 1994; Welch et al., 1997). Muchos otros procesos, como la importación de cadenas polipeptídicas sintetizadas en el citosol hacia la mitocondria, dependen de las proteínas de ayuda al plegamiento (Dekker y Pfanner, 1999). En esta conexión las proteínas solo pueden transportarse a través de una o ambas membranas mitocondriales en un estado lineal no plegado. En este proceso molecular las chaperonas están involucradas en el desplegamiento y estabilización del estado desplegado en el lado citosólico de la membrana así como en el transporte y plegamiento en la mitocondria.

En el caso de plegamiento in vitro la formación e isomerización de los puentes disulfuro y la isomerización en cis/trans de las prolinas son concretamente la tasa que determina los pasos de plegamiento. Estos pasos de plegamiento son catalizados por ayudantes del plegamiento en la célula. Las isomerasas de disulfuro de proteínas como la PDI o DsbA aceleran las reacciones rédox de las cisteínas y disulfuros en los polipéptidos en función de las condiciones rédox (Wunderlich y Glockshuber, 1993; Bardwell, 1997). La aceleración de este paso de plegamiento reduce la concentración de intermediarios durante el proceso de plegamiento. Esto reduce la agregación dependiente de concentración y aumenta el rendimiento del plegamiento (Weissman y Kim, 1993; Lillie et al., 1994). Las peptidil-prolil-cis/isomerasas (PPI) catalizan la isomerización entre la forma cis y trans de los enlaces peptídicos frente a los residuos prolina en las cadenas polipeptídicas. Al contrario del resto de enlaces peptídicos en las proteínas nativas, estos pueden estar presentes en su configuración cis (Schmid, 1997).

El lisado de E. coli que se utiliza frecuentemente en los sistemas de traducción in vitro es un sistema natural y óptimo para el plegamiento de proteínas. Pero al contrario que en una célula funcional, la cantidad de chaperonas necesarias no se adapta automáticamente a la cantidad sintetizada por el aparato de traducción. La sobrecarga resultante de la maquinaria de plegamiento, en muchos casos resulta en la agregación de la proteína diana. Varios componentes de la
maquinaria de plegamiento pueden ser responsables de este plegamiento ineficiente que depende de la proteína diana.

El objeto de la presente invención fue aumentar el rendimiento de proteína diana en un sistema de traducción in vitro evitando la agregación de la proteína diana al proporcionar las chaperonas necesarias en una cantidad adecuada en el sistema de traducción in vitro. Esto debería aumentar al mismo tiempo la eficiencia del sistema de traducción in vitro.

El objeto se consigue de acuerdo con la invención mediante un método para la expresión de proteínas diana en sistemas de traducción in vitro que se caracterizan en que proteínas ayudantes al plegamiento se coexpresan en este sistema. Las proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento se seleccionan de entre una o varias de las siguientes clases de proteína: la familia de proteínas Hsp70, Hsp60, Hsp90, Hsp100, la familia de proteínas de choque por calor pequeñas y las isomerasas.

Las chaperonas moleculares son el mayor grupo de proteínas de asistencia al plegamiento, y de acuerdo con la invención se definen como proteínas de ayuda al plegamiento (Gething y Sambrook, 1992; Hartl, 1996; Buchner, 1996; Beibinger y Buchner, 1998). Debido a su sobreexpresión en condiciones de estrés, la mayoría de chaperonas moleculares también se pueden localizar en el grupo de las proteínas de choque por calor (Georgopolous y Welch, 1993; Buchner, 1996), este grupo también se define de acuerdo con la invención como proteínas de ayuda al plegamiento.

Importantes proteínas de ayuda al plegamiento que están incluidas en la presente invención se explican en más detalle a continuación. El grupo de las chaperonas moleculares puede dividirse en base a homologías de secuencia y a las masas moleculares en cinco clases de proteínas no relacionadas, es decir las familias de proteínas Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 y la familia de las proteínas de choque por calor pequeñas (Gething y Sambrook, 1992; Hendrick y Hartl, 1993).

La chaperona mejor investigada de todas es GroEL, que es un miembro de la familia Hsp60 de E. coli. Los miembros de la familia Hsp60 también se denominan chaperoninas y se dividen en dos grupos. GroEL, su cochaperona GroES y sus parientes altamente homólogos de otras bacterias, así como de las mitocondrias y cloroplastos forman el grupo de chaperoninas I (Sigler et al., 1998; Fenton y Horwich, 1994). Las proteínas Hsp60 del citosol de las eucariotas y de las arqueobacterias forman juntas el grupo de chaperoninas II (Gutsche et al., 1999). Las proteínas Hsp60 de ambos grupos tienen una estructura oligomérica similar. En el caso de GroEL y el otro grupo de chaperoninas 1, las 14 subunidades de GroEL se asocian para formar un cilindro que se compone de dos anillos heptámeros, mientras que el grupo de chaperoninas II de las arqueobacterias la estructura de anillo de heptámero está compuesto normalmente por dos subunidades diferentes. Por el contrario los miembros del grupo de chaperoninas II del citosol de las eucariotas, como el complejo CCT de las levaduras, se componen de ocho subunidades diferentes con una organización claramente definida (Liou y Willison, 1997). Las proteínas no nativas pueden intercalarse y unirse a cavidad central de este cilindro. La cochaperona GroES también forma un anillo heptamérico y se une de este modo a los extremos del cilindro de GroEL. Sin embargo, esta unión de GroES resulta en una limitación de la unión de sustratos en función de su tamaño, de 10-55 kDa; (Ewalt et al., 1997). La unión de sustratos está regulada mediante la unión e hidrólisis de ATP.

Además de los miembros de la familia Hsp60, las proteínas Hsp70 también se unen a la cadena polipeptídica en formación (Beckman et al., 1990; Welch et al., 1997). Normalmente hay varios miembros de la familia Hsp70 expresados constitutivamente e inducidos por estrés presentes en las células procariotas así como en las eucariotas (Vickery et al., 1997; Welch et al., 1997). Aparte de estar involucradas en el plegamiento de proteínas directamente en el ribosoma, estas proteínas también están involucradas en la translocación de proteínas a través de las membranas celular y de los orgánulos (Schatz y Doberstein, 1996). Se ha demostrado que las proteínas sol pueden transportarse a través de las membranas en un estado desplegado o parcialmente plegado (Hannavy et al., 1993). Durante el proceso de translocación en los orgánulos, son principalmente los miembros de la familia Hsp70 los que están involucrados en al desplegamiento y estabilización en la cara citosólica así como en el replegamiento en el lado del orgánulo (Hauke y Schatz, 1997). En todos estos procesos la actividad ATPasa de Hsp70 es esencial para la función de la proteína. Una característica típica del sistema Hsp70 es el control de la actividad por cochaperonas (Hsp40; DnaJ), en el que el equilibrio entre la unión y la liberación del sustrato está influenciada por la modulación específica de la actividad ATPasa (Bukau y Horwich, 1998).

Alrededor del 1% de la proteína soluble en el citosol de las eucariotas es Hsp90, que por lo tanto es una de las proteínas más fuertemente expresadas (Welch y Feramisco, 1982). Los miembros de esta familia actúan principalmente en complejos multiméricos en los que reconocen numerosas proteínas de transducción de señales importantes con estructuras similares a las proteínas nativas. La unión a Hsp90 y sus proteínas acompañantes estabiliza estas estructuras y así facilita la unión de ligandos a las proteínas señalizadoras. De este modo, los sustratos consiguen tener su conformación activa (Sullivan et al., 1997; Bohen et al., 1995; Buchner, 1999).

Recientemente las chaperonas Hsp100 se han diferenciado particularmente por su capacidad de cooperación con las chaperonas Hsp70 para disociar los agregados ya formados (Parsell et al., 1994; Goloubinoff et al., 1999; Mogk et al., 1999). Aunque su función principal parece ser la mediación en la tolerancia térmica (Schirmer et al., 1994; Kruger et al., 1994), algunos miembros como ClpA y ClpB junto con las subunidad proteasa ClpP median la degradación proteolítica de proteínas (Gottesman et al., 1997).

La quinta clase de chaperonas, las proteínas de choque por calor pequeñas (sHsp) son una familia de proteínas de choque por calor muy divergente que se encuentran en casi todos los organismos. La razón para la denominación de esta familia de chaperonas es su peso molecular monomérico relativamente bajo de 15-40 kDa. Sin embargo, las sHsp normalmente se encuentran en la célula como complejos altamente oligoméricos que contienen hasta 50 subunidades y que se ha observado que tienen una masa molecular de entre 125 kDa y 2 MDa (Spector et al., 1971; Arrigo et al., 1988; Andreasi-Bassi et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997). Como otras chaperones, las sHsp pueden suprimir la agregación de las proteínas in vitro (Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993; Merck et al., 1993; Jakob y Buchner, 1994, Lee et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997b). En este proceso, las sHsp se unen a hasta una molécula sustrato por subunidad, y por lo tanto tienen una eficiencia mayor que la de la chaperona modelo GroEL (Jaenicke y Creighton, 1993; Ganea y Harding, 1995; Lee et al., 1997; Ehrnsperger et al., 1998a). En condiciones de estrés, la unión de proteína no nativa a las sHsp evita la agregación irreversible de las proteínas. La unión a las sHsp mantiene las proteínas en un estado soluble competente para el plegamiento. Tras la restauración de las condiciones fisiológicas la proteína no nativa puede liberarse del complejo con las sHsp por las chaperonas dependientes de ATP como Hsp70 y reactivarse.

Los catalizadores de plegamiento de la clase de las peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas y los miembros de las isomerasas de disulfuro por ejemplo se consideran como isomerasas para el método de acuerdo con la invención.

Las proteínas de ayuda al plegamiento que funcionan del mismo modo o de un modo similar a las proteínas de ayuda al plegamiento descritas anteriormente también están incluidas por la presente invención.

De acuerdo con la presente invención es preferible que las proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento sean miembros de la familia de proteínas Hsp60. Además, es preferible que las cochaperonas se coexpresen de forma adicional. De acuerdo con el método de acuerdo con la invención es particularmente preferible que se coexpresen la Hsp60 como proteína de ayuda al plegamiento y la Hsp 10 como cochaperona. Es particularmente preferible que la proteína de ayuda al plegamiento coexpresada sea GroEL. Es particularmente preferible un método en el que se coexpresan GroEL/GroES.

Otra variante preferida del método es en la que las proteínas de ayuda al plegamiento coexpresadas son miembros de la familia de proteínas Hsp70. Además preferiblemente se coexpresan cochaperonas de forma adicional. En esta variante es particularmente preferible que la proteína de ayuda al plegamiento coexpresada sea una proteína Hsp70 humana. En particular, es preferible entonces que coexpresen Hsp70 como proteína de ayuda al plegamiento y Hsp40 como cochaperona. De acuerdo con el método de la invención, la Hsp70 de humano y la Hdj1 (Hsp40 de humano) se coexpresan muy preferiblemente en esta variante.

De acuerdo con la invención, las proteínas diana pueden ser todo tipo de proteínas de procariotas y eucariotas, y también proteínas de arqueobacterias. La expresión de proteínas secretadas y proteínas de membrana era anteriormente particularmente problemática en sistemas de transcripción/traducción in vitro, especialmente cuando las proteínas de ayuda al plegamiento no estaban presentes en cantidades adecuadas. Aunque la expresión correcta de lipoproteínas y proteínas de membrana se han descrito previamente, ésta es sujeto de limitaciones considerables (Huppa y Ploegh, 1997; Falk et al., 1997). El método de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la expresión de lipoproteínas, proteínas de membrana y proteínas secretadas como proteínas diana, ya que se pueden proporcionar proteínas de ayuda al plegamiento mediante la coexpresión en la cantidad adecuada.

Una ventaja del método de acuerdo con la invención es concretamente que el aumento del volumen de proteína diana obtenido en los sistemas de transcripción/traducción in vitro ocurre a una escala preparativa.

Los sistemas de traducción in vitro que pueden serla base de la presente invención y en particular los sistemas acoplados de transcripción/traducción in vitro se describen en más detalle en la siguiente sección. En la actualidad, los sistemas más eficientes se basan en E. coli, reticulocitos de conejo o lisados de germen de trigo (Spirin, 1990; Stiege y Erdman, 1995). Estos se utilizan normalmente en reacciones en serie con un volumen de reacción definido. Las reacciones basadas en E. coli pueden utilizarse en un rango de temperatura de 24-38°C. Para estos procesos en grupo, normalmente se utiliza el sobrenadante 30S de los lisados de E. coli, que debido al elevado contenido de mRNA endógenos tiene que tratarse con RNasa previamente a su utilización para la traducción in vitro (Zubay, 1973). Las reacciones basadas en los lisados de germen de trigo típicamente se utilizan solo en un rango de temperatura de 20-27°C (Tulin et al., 1995), pero tienen la ventaja comparados con los lisados de E. coli de que pueden utilizarse directamente para la expresión de moldes de expresión exógenos debido al bajo nivel de mRNA endógenos. Los lisados de reticulocitos se preparan mediante lisis directa de sangre de conejos anémicos, de los que se eliminan los mRNA endógenos mediante el tratamiento con RNasa. Estos sistemas se utilizan normalmente para procesos en un rango de temperatura de 30-38°C (Pelham y Jackson, 1976). Sin embargo, debe notarse que la temperatura de trabajo no solo tiene un efecto sobre los procesos de traducción sino que también el plegamiento de las proteínas diana es extremadamente dependiente de la respectiva temperatura de trabajo.

La síntesis de proteínas en tales reacciones en serie solo pueden mantenerse hasta que los primeros componentes importantes ya no funcionan debido a la degradación, inhibición o pérdida de energía. El mayor problema en esta conexión es el suministro de energía para la síntesis de proteínas (Yao et al., 1997, Matveev et al., 1996) que es el motivo por el que solo se alcanzan tiempos relativamente cortos de síntesis en estas reacciones en serie y por tanto, solo rendimientos relativamente bajos de proteína diana (una media de 0,1-20 \mug/ml) (Mosca et al., 1983).

Sin embargo, el mRNA necesario para la síntesis de proteínas también puede producirse directamente en los sistemas de expresión. Para estos llamados sistemas acoplados de transcripción/traducción es posible utilizar la polimerasa de RNA endógena así como polimerasas de RNA fágicas exógenas para preparar el mRNA en los sistemas basados en lisados de E. coli (Chen y Zubay, 1983; Köhrer et al., 1996). Por el contrario, en los sistemas eucariotas se utilizan polimerasas de RNA fágicas exógenas (Craig et al., 1992; Baranov y Spirin, 1993). Pero en ese caso, por supuesto, en tales sistemas eucariotas son necesarios los DNA molde apropiados con los correspondientes elementos promotores.

El problema de los tiempos de expresión cortos y del suministro de energía a los sistemas se resolvió con el equipo de traducción libre de células de intercambio continuo (CECF) o equipo de traducción libre de células de flujo continuo (Spirin et al., 1988; Spirin, 1991). La idea fundamental se basa en el suministro continuo de energía y de componentes de peso molecular bajo a la reacción y la eliminación continua de productos secundarios de peso molecular bajo. En esta conexión, la reacción se suministra a través de una membrana semipermeable desde un compartimiento separado de alimentación.

El sistema de traducción in vitro es preferiblemente un sistema acoplado de transcripción/traducción in vitro. La transcripción/traducción acoplada in vitro preferiblemente se da en un reactor CFCF o CEFC.

Los vectores o moldes de DNA pueden utilizarse para la coexpresión en sistemas de transcripción/traducción in vitro, cuya estructura corresponde a la de los vectores de expresión de las proteínas diana. En los sistemas basados en lisados de E. coli es posible utilizar promotores para la polimerasa de RNA endógena de E. coli así como vectores que contienen promotores para las polimerasas virales exógenas. En esta conexión, los vectores también pueden contener un sitio de unión de ribosomas y las regiones terminadoras adecuadas además de las regiones promotoras. En principio, también es posible utilizar moldes de expresión de DNA lineal (por ejemplo un producto de PCR). Si se utilizan vectores de expresión circulares, que se han de amplificar previamente in vivo antes de utilizarlos experimentalmente, estos deben contener orígenes de replicación adecuados y al menos un marcador de selección. El periodo de tiempo de la coexpresión y la potencia de la coexpresión de las chaperonas puede optimizarse para las respectivas proteínas sustrato (Lottspeich y Zorbas, 1998).

Para asegurar una eficiencia máxima de la maquinaria de las chaperonas durante la reacción de síntesis, debe regularse la coexpresión. Una regulación adecuada puede conseguirse, por un lado, mediante la adición medida de los vectores de coexpresión o, por otro lado, mediante secuencias reguladoras en las regiones promotoras del vector que pueden regular la inducción y la potencia de la expresión. Las secuencias del operador lac inducible por IPTG, secuencias de unión a represores de tetraciclina o secuencias reguladoras inducibles por catabolitos (por ejemplo operador arabinosa) pueden utilizarse para tal regulación. Sin embargo, en esta conexión se debe tener en cuenta la inducción separada de la expresión de la proteína diana y de la coexpresión de la chaperona.

Por lo tanto, es preferible regular la coexpresión de las proteínas de ayuda al plegamiento o de las chaperonas. En particular, es preferible que la expresión de las proteínas diana pueda inducirse de forma separada de la coexpresión de las proteínas de ayuda al plegamiento o de las cochaperonas.

Los moldes de DNA para los sistemas eucariotas también deben componerse de regiones promotoras adecuadas para las polimerasas de RNA virales, las secuencias eucariotas necesarias para iniciar la traducción y los terminadores adecuados. Los vectores de expresión circulares que deben amplificarse en E. coli para su utilización experimental, también deben contener una secuencia de origen de replicación para E. coli y al menos un marcador de selección en E. coli. En este caso también es posible regular la coexpresión de chaperonas mediante las secuencias reguladoras adecuadas para los promotores virales (Lottspeich y Zorbas, 1998).

Como la sobrecarga de la maquinaria de las chaperonas depende de la respectiva proteína diana y de la tasa de expresión de la proteína diana, la cantidad de chaperonas necesarias depende fuertemente de la proteína diana. Por lo tanto, en los casos individuales puede ser importante optimizar las tasas de expresión de ambos moldes de expresión. Tal optimización puede conseguirse mediante la variación de la cantidad de molde de expresión utilizado además de la regulación directa de la expresión a través de los promotores. En el caso de proteínas diana que sean muy susceptibles a la agregación, puede además ser necesaria la utilización de un gran exceso de chaperonas, mientras para otras proteínas diana una coexpresión potente de chaperonas podría incluso interferir con la expresión de la proteína diana. en función de la proteína diana, su expresión funcional puede requerir la coexpresión de chaperonas únicas así como la coexpresión de varias chaperonas. En esta conexión también debe notarse que la mayoría de chaperonas solo funcionan de forma efectiva como sistemas complejos con las correspondientes cochaperonas. Por lo tanto, la coexpresión de chaperonas y las cochaperonas adecuadas es particularmente preferible.

La expresión de las proteínas diana también puede conseguirse mediante la adición de chaperonas purificadas y cochaperonas en la cantidad necesaria. Sin embargo, este proceso es relativamente caro.

Otro tópico que también se incluye en la presente invención es la utilización de un vector que contiene un gen que codifica para una proteína de ayuda al plegamiento para el método de acuerdo con la invención. Otro sujeto que se incluye en la presente invención es la utilización de un vector que contiene un gen que codifica para una cochaperona para el método de acuerdo con la invención.

Un tópico especial incluido en la presente invención es la utilización de un vector que contiene un gen que codifica para una proteína de ayuda al plegamiento y de forma adicional contiene una región promotora, un lugar de unión de ribosomas y una región terminadora para el método de acuerdo con la invención. Es también particularmente preferible utilizar un vector que contenga un gen que codifica para una cochaperona y de forma adicional contenga una región promotora, un lugar de unión de ribosomas y una región terminadora para el método de acuerdo con la
invención.

En los siguientes ejemplos se realiza el método de acuerdo con la invención en un sistema de traducción rápido (sistema RTS) utilizando la citrato sintasa mitocondrial como proteína diana (de corazón porcino; EC 4.1.3.7). La GFP se utilizó como otra proteína diana. Inesperadamente la coexpresión de GroEL/ES en el sistema RTS así como la adición de GroEL/ES resultó en un aumento en los rendimientos de expresión a una escala preparativa.

Figura 1

Expresión de CS del pIVEX 2.4b sin la adición de GroEL/ES. Expresión de CS del pNEX 2.4b, con coexpresión de GroEL/ES. Expresión de CS del pNEX 2.4b con la adición de GroEL purificado 150 nM y GroES purificado 300 nM.

Figura 2

Expresión de GFP sin la adición de Hsp70 (de humano) y Hdj1 (Hsp40 de humano). Expresión de GFP con coexpresión de Hsp70 y Hdj1. Expresión de GFP con la adición de Hsp70 300 nM y Hdj1 300 nM.

Abravaya K, Myers MP, Murphy SP, Morimoto RI (1992) Genes Dev 6: 1153-1164.

Amrein KE, Takacs B, Stieger M, Molonos J, Flint NA, Burn P (1995) Proc Natl Acad

Arrigo AP, Suhan JP, Welch WJ (1988) Mol Cell Biol 8: 5059-5071

Baranov VI, Spirin AS (1993) Methods Enzymol 217: 123-142

Beckman RP, Mizzen LE, Welch WJ (1990) Science 248: 850-854

Beissinger M, Buchner J (1998) Biol Chem 379, 245-259

Bergman L, Kühl WM (1979) J Biol Chem 267: 6786-6800

Bohen SP, Kralli A, Yamamoto KR (1995) Science 268: 1303-1304

Braakman I, Hoover-Litty H, Wagner KR, Helenius A (1991) J Cell Biol 114: 401-411

Buchner J (1996) FASEB J 10: 10-19

Buchner J (1999) Trends Biochem Sci 24: 136-141

Bukau B, Harwich AL (1998) Cell, 92: 351-66

Chen HZ, Zubay G (1983) Methods Enzymol 101: 674-690

Craig EA (1992) en: The Molecular and Celular Biology of the Yeast S. cerevisiae. Jones EW (Editor) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 501-537

Dale GE, Schönfeld HJ, Langen, Stieger M (1994) Protein Eng 7: 925-931

Dekker PJT, Pfanne N (1999) en: Molecular Chaperones and Folding Catalysts, Bukau B (Editor), Harwood Academic publischers, 235-263

Egers DK, Welch WJ, Hansen WJ(1997) Mol Biol Cell 8:1559-1573

Ehrnsperger M, Graber S, Gaestel M, Buchner J (1997) EMBO J 16: 221-229

Ehmsperger M, Hergersberg C, Wienhues U, Nichtl A, Buchner J (1998) Anal Biochem 259: 218-225

Ewalt KL, Hendrick JP, Houry WA, Hartl FU (1997) Cell, 90: 491-500

Falk MM, Buehler LK, Kumar NM, Gilula NB (1997) EMBO J 16: 2703-2716

Fenton WA, Kashi Y, Furtak K, Horwich A (1994) Nature 371, 614-619

Frydman J, Nimmersgern, Ohstuka K, Hartl FU (1994) Nature 370: 11-117

Ganea E, Harding JJ (1995) Eur J Biochem 231: 181-185

Georgopoulos C, Welch WJ (1993) Annu Rev Cell Biol 9:601-634

Gething MJ, Sambrook JF (1992) Nature 355: 33-45

Gottesman S, Maurizi MR, Wickner S (1997) Cell 91: 435-438

Goloubinoff P, Gatenby AA, Lorimer GH (1989) Nature 337: 44-47

Goloubinoff P, Mogk A, Zvi AP, Tomoyasu T, Bukau B (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:13732-13737

Grangerov AI, Martin ES, Krupenko MA, Kashlev MV, Nikiforov VG (1991) FEBS Lett 291: 22-224

Gutsche I, Essen LO, Baumeister W (1999) J Mol Biol 293: 295-312

Hannavy K, Rospert S, Schatz G (1993) Curr Opin Cell Biol 5:694-700

Hansen WJ, Lingappa VR, Welch WJ (1994) J Biol Chem 269: 26610-26613

Hartl FU (1996) Nature 381: 571-579

Hartl FU (1998) Biol Chem 379: 235-240

Hauke V, Schatz G(1997) EMBO J 16: 4560-4567

Hendrick JP, Hartl FU (1993) Annu Rev Biochem 62: 349-384

Horwitz J (1992) Proc Natl Acad Sci 89: 10449-10453

Horwitz J, Bova MP, Ding LL, Haley DA, Stewart PL (1999) Eye 13: 403-408

Huppa JB, Ploegh HL (1997) J Exp Med 186: 393-403

Jaenicke R (1997) en: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins. Fink AL, Goto Y (Editor), Marcel Dekker, New York, 35-70

Jaenicke R, Creighton TE (1993) Curr Biol 3: 234-235

Jaenicke R, Rudolph R (1986) Methods Enzymol 131: 218-250

Jaenicke R, Rudolph R (1989) en: Protein Structure: A Practical Approach. Creighton TE (Editor), IRL Press, Oxford, 191-223

Jakob U, Gaestel M, Engel K, Buchner J (1993) J Biol Chem 268: 1517-1520

Jakob U, Buchner J (1994) Trends Biochem Sci 19: 205-211

Kiefhaber T, Rudolph R, Kohler HH, Buchner J (1991) Bio/Technolog 9,825-829

Köhrer C, Mayer C, Grübner P, Piendl W (1996) Eur J Biochem 236: 234-239

Kruger E, Volker U, Hecker M (1994) J Bacteriol 176: 3360-3367

Lee GJ, Pokala N, Vierling E (1995) J Biol Chem 270: 10432-10438

Lee GJ, Roseman AM, Saibil HR, Vierling E (1997) EMBO J 16: 659-671

Lillie H, McLaughlin S, Freedman RB, Buchner J (1994) J Biol Chem 269: 14290-14296

Liou AK, Willison KR (1997) EMBO J 16: 4311-4361

Lorimer GH (1996) FASEB J 10: 5-9

Lottspeich F, Zorbas H (1998) Bioanalytik (Hrsg.) Spektrurn Verlag, Berlín

Matveev SV, Vnokurov LM, Shaloiko LA, Matveeva EA, Alakhov YB (1996) Biochim Biophys Acta 1293: 207-212

Mosca JD, Wu JM, Suhadolnik PJ (1983) Biochemistry 22: 346-354

Parsell DA, Kowal AS, Singer MA, Lindquist S (1994) Nature 372: 475-478

Pelham HRB, Jackson RJ (1976) Eur J Biochem 67: 247-256

Peters T Jr, Davidson LK (1982) J Biol Chem 257: 8847-8853

Schatz G, Doberstein B (1996) Science 271: 1519-1526

Schirmer EC, Lindquist S, Vierling E (1994) Plant Cell 6: 1899-1909

Schmidt M, Bucheler U, Kaluza B, Buchner J (1994) J Biol Chem 269: 27964-27972

Schmid FX (1997) en: Protein Structure: A Practical Approach. Creighton RE (Editor) IRL Press, Oxford,
253-299

Sigler PB, Xu Z, Rye HS, Burston SG, Fenton WA, Horwich AL (1998) Annu Rev Biochem 67: 581-608

Spector A, Li LK, Augusteyn RC, Schneider A, Freund T (1971) Biochem J 124: 337-343

Spirin AS, Baranov VI, Ryabova LA, Ovodov SY, Alakhov YB (1988) Science 242: 11621164

Spirin AS (1990) en: The Ribosome: Structure, Funktion and Evolution. Hill EH, Dahlberg A, Garrot RA, Moore PB, Schlessinger D, Warrner JR, Washington DC (Editores) American Society for Microbiology, 56-70

Spirin AS (1991) en: Frontiers in Bioprocessing II. Todd P, Skidar SK, Bier M, Washington DC (Editores) American Chemical Society, 31-43

Stiege W, Erdman VA (1995) J Biotechnol 1995 41: 81-90

Sullivan W, Stensgard B, Caucutt G, Bartha B, McMahon N, Alnemri ES, Litwack G, Toft (1997) J Biol Chem 272: 8007-8012

Tulin EE, Ken-Ichi T, Shin-Ichiro E (1995) Biotechnol Bioeng 45: 511-516

Vickery LE, Silberg JJ, Ta DT (1997) Protein Sci 6: 1047-1056

Welch WJ, Feramisco JR (1982) J Biol Chem 257: 14949-14959

Welch WJ, Eggers DK, Hansen WJ, Nagata H (1997) en: Molecular Chaperones in Life Cycle of Proteins. Fink AL, Goto Y (Editores) Marcel Dekker, New York, 71-93

Weissman JS, Kim PS (1993) Natur 365,185-188

Wunderlich M, Glockshuber R (1993) Prot Sci 2: 717-726

Yao SL, Shen XC, Suzuki E (1997) J Ferment Bioeng 84: 7-13

Zubay G (1973) Annu Rev Genet 7: 267-287

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Un vector pIVEX 2.4b vector (Roche, Molecular Biochemicals) que contiene el gen de la citrato sintasa se utilizó para la expresión en el sistema RTS, que expresa el gen de la citrato sintasa con una cola de His fusionada al extremo N-terminal. Las reacciones se llevaron a cabo durante 24 h a 27°C, 140 rpm utilizando unos miniequipos de RTS con Nº de lote 85869220 (Roche, Molecular Biochemicals).

La agregación de la citrato sintasa expresada se suprimió mediante, la coexpresión de GroEL/ES por un lado, y mediante la adición de GroEL/ES purificado a las reacciones de RTS, por el otro lado.

Se utilizaron 8 \mug de pIVEX 2.4b y 8 \mug del plásmido que expresa GroEL/ES en cada caso. El plásmido que expresa GroEL/ES corresponde a un vector pET modificado (Novagen, Milwaukee, EEUU) que expresa el operón GroEL/ES bajo el control de un promotor T7 (Ishii Yasuhawa et al., 1995). La expresión de las 3 proteínas se comprobó con un SDS-PAGE e inmunotransferencia. Todas las proteínas se expresan en cantidades aproximadamente iguales.

Se purificó el GroEL/ES utilizado para la adición, como se describe en Schmidt et al., (1994). Se añadieron GroEL 150 nM y GroES 300 nM al sistema RTS.

Tras la finalización de la reacción RTS, las mezclas de reacción se centrifugaron durante 10 min a 14000 g y 4°C para separar los agregados de los componentes solubles. La fracción soluble se diluyó 1:10 con tampón de equilibrado Ni-NTA (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4) y se cargó a una tasa de flujo continua de 0,5 ml/min en una columna de 1 ml Ni-NTA Superflow (Qiagen). La columna se lavó inicialmente con 5 ml de tampón de equilibrado y subsiguientemente con 5 ml de tampón de lavado (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM, pH 6,8). La citrato sintasa se eluyó entonces de la columna con 3 ml de tampón de elución (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 7.5).

El coenzima A que se forma como producto secundario de la condensación de oxaloacetato reduce estequiométricamente el reactivo de Ellman (DNTB), lo que está asociado con un aumento de la absorción a 412 nm. La citrato sintasa activa plegada correctamente puede detectarse con esta reacción. Para la determinación de la actividad se mezclaron 50 \mul de la citrato sintasa purificada (fracción de elución), 900 \mul de tampón TE (Tris/HCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0), 10 \mul de oxaloacetato (10 mM en Tris 50 mM), 10 ml de DTNB (en tampón TE) y 30 \mul de acetil-coA (en tampón TE), y se incubaron a 25°C. El cambio en la absorbancia se midió de forma continua durante un periodo de 5 min y se determinó el cambio en la absorbancia por minuto. El cambio en la absorbancia de la citrato sintasa purificada se promedió en cada caso a partir de tres reacciones RTS diferentes. El promedio del cambio en la absorbancia en las reacciones RTS sin coexpresión de GroEL/ES se normalizó a 1.

Como se muestra en la figura 1 ambas aproximaciones dan lugar a rendimientos elevados de citrato sintasa mitocondrial purificada activa. De forma sorprendente, la coexpresión del sistema GroEL/ES funcionó igual de bien que la adición directa de GroEL y GroES purificados. El rendimiento de proteína diana purificada activa aumentó 5 veces mediante la coexpresión de GroEL/ES.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

La GFP se utilizó como un sustrato modelo para examinar los efectos de las chaperonas Hsp70 sobre la expresión en el sistema RTS. Las reacciones se llevaron a cabo durante 24 h a 27°C, 140 rpm utilizando el mini equipo RTS Nº de lote 85869220 (Roche, catálogo). Para asegurar que la GFP se oxidaba durante la reacción, solo se utilizó la mitad de las cantidades. En cada caso se utilizaron 5 \mul del plásmido control de GFP que contiene el miniequipo RTS.

Para examinar los efectos de la Hsp70 sobre el rendimiento de la expresión en el sistema, se coexpresaron la Hsp70 y la Hsp40 de humano, y por otro lado, se añadieron Hsp70 y Hsp40 purificadas a las reacciones RTS. En cada caso se utilizaron 8 \mug de los plásmidos de expresión de Hsp70 y Hsp40. El plásmido que expresa la Hsp70 corresponde al vector pET11a (Novagen, Milwaukee, EEUU), el plásmido que expresa la Hsp40 (Hdj1) corresponde al vector pET21d (Novagen, Milwaukee, EEUU), y ambos genes se expresaron bajo el control del promotor T7. Se añadieron al sistema RTS Hsp70 300 nM y Hdj1 300 nM (Abravaya et al., 1992).

Tras la finalización de la reacción RTS, las mezclas de reacción se centrifugaron durante 10 min a 14000 g y 4°C para separar los agregados de los componentes solubles. La emisión de fluorescencia de las fracciones solubles se midió a 430-580 nm con una excitación de 395 nm. La fluorescencia relativa a 503 nm de la mezcla sin adición o coexpresión de las chaperonas se normalizó a 1 y se comparó con la fluorescencia de las mezclas que contienen chaperonas. Para excluir los efectos de la subsiguiente oxidación de la GFP, las muestras se midieron de nuevo tras 24 horas, aunque no se observó diferencia alguna.

Como se muestra en la figura 2, ambas aproximaciones dan lugar a rendimientos elevados de GFP activa. De forma sorprendente, funcionó tanto la adición como la coexpresión de las chaperonas Hsp70. El rendimiento de proteína diana activa se dobló mediante la coexpresión de Hsp70 y Hsp40. La adición directa dio lugar a un aumento de más de 3 veces el rendimiento.