ES2269547T3 - Metodo para la expresion de proteinas en sistemas de traduccion in vitro con coexpresion de proteinas de ayuda al plegamiento. - Google Patents
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Abstract
Un método para la expresión de proteínas diana en sistemas de traducción in vitro, que se caracterizan por que se coexpresan proteínas de ayuda al plegamiento en este sistema.
Description
Método para la expresión de proteínas en
sistemas de traducción in vitro con coexpresión de proteínas
de ayuda al plegamiento.
La presente invención concierne a un método para
la expresión de proteínas diana en sistemas de traducción in
vitro, que se caracteriza en que se coexpresan proteínas de
ayuda al plegamiento en este sistema. Las proteínas de ayuda al
plegamiento coexpresadas se seleccionan entre una o varias de las
siguientes clases de proteína: la familia de proteínas Hsp70, Hsp60,
Hsp90, Hsp100, la familia de proteínas de choque por calor pequeñas
y las isomerasas.
El plegamiento de las proteínas oligoméricas
grandes in vitro frecuentemente es erróneo a causa de la
aparición de agregación (Jaenicke y Rudolph, 1986; Buchrier, 1996;
Jaenicke, 1997). La agregación es una ruta alternativa al
plegamiento normal que compite con el plegamiento y asociación
correctos. El motivo de la agregación es la formación de
interacciones intermoleculares incorrectas (Kiefhaber et al.,
1991) que en último término dan lugar a la formación de agregados
heterogéneos en los que las cadenas polipeptídicas que estos
contienen se pierden irreversiblemente. Es posible minimizar la
agregación in vitro como reacción colateral no deseada
mediante parámetros físico-químicos como la
concentración de proteína, condiciones del solvente, temperatura o
fuerza iónica (Jaenicke y Rudolph, 1989; Kiefhaber et al.,
1991; Buchner, 1996; Jaenicke, 1997). Por el contrario, las
condiciones externas de todas las proteínas son constantes in vivo.
Una célula de E. coli alcanza un rendimiento de plegamiento
aparente de casi un 100% a pesar de la enorme tasa de síntesis de
casi 60000 cadenas polipeptídicas por minuto (Lorimer, 1996). Aunque
el mal plegamiento y el ensamblaje incorrecto de proteínas también
ocurre in vivo (Hurtley y Helenius, 1989; Pelham, 1989;
Helenius et al., 1992), éste se ve minimizado por varios
endógenos factores celulares. Las chaperonas o proteínas de choque
por calor previenen la agregación no específica (Buchner et
al., 1996) y las proteínas mal plegadas o las proteínas que se
pliegan demasiado despacio son degradadas (Gottesman y Maurizi,
1992). Estudios de mutagénesis en cepas de E. coli
deficientes en choque por calor han mostrado que aparecen los
llamados cuerpos de inclusión a temperaturas de crecimiento
elevadas (Grangerov et al., 1991). Independientemente de esto
se ha demostrado que la formación de cuerpos de inclusión que
resultan de la sobreexpresión de proteínas recombinantes en E.
coli pueden suprimirse eficientemente mediante la sobreexpresión
simultanea de las proteínas de choque por calor endógenas celulares
(Goloubinoff et al., 1989; Dale et al., 1994; Amrein
et al., 1995). La importación de proteínas a los
compartimentos celulares como las mitocondrias también depende de
las proteínas de choque por calor que se localizan en los orgánulos.
En base a estas observaciones se puede considerar el plegamiento de
las proteínas como un proceso espontáneo que es asistido por las
proteínas de ayuda al plegamiento (Horwich et al., 1993;
Hendrick y Hartl, 1993; Georgopoulos y Welch, 1993). Por lo tanto,
la interrelación precisa entre estos factores celulares endógenos
reduce los procesos de plegamiento incorrecto y promueve el
plegamiento correcto de los polipéptidos (Buchner, 1996;
Bei\betainger y Buchner, 1998; Hartl, 1998).
Otra diferencia importante entre el plegamiento
in vitro e in vivo es que las proteínas en la célula
se pliegan de forma vectorial desde el extremo N- al
C-terminal (Bergman y Kühl, 1979; Braakman et
al., 1991). Este proceso ocurre durante la traducción o
translocación. El inicio de la formación de la estructura ya aparece
mientras el polipéptido está aun en el ribosoma o durante la
translocación. Esto también significa que algunas regiones
hidrofóbicas y otras potenciales regiones de interacción del
polipéptido han de esperar a su acompañante en la interacción, que
aun está por sintetizarse. Sin embargo, pueden ocurrir interacciones
no apropiadas durante este proceso de síntesis que solo pueden
revertirse bajo ciertas condiciones y pueden dar lugar a reacciones
de agregación. Por otro lado, pueden detectarse puentes disulfuro ya
en esta etapa en las inmunoglobulinas, albúmina sérica y
hemaglutinina (Bergman y Kühl, 1979; Peters y Davidson, 1982;
Braakman et al., 1991). Se ha demostrado que las proteínas de
ayuda al plegamiento de la familia de chaperonas Hsp70 pueden
interaccionar ya con la cadena polipeptídica naciente durante la
traducción en el ribosoma (Egers et al., 1997; Frydman et
al., 1994; Hansen et al., 1994; Welch et al.,
1997). Muchos otros procesos, como la importación de cadenas
polipeptídicas sintetizadas en el citosol hacia la mitocondria,
dependen de las proteínas de ayuda al plegamiento (Dekker y Pfanner,
1999). En esta conexión las proteínas solo pueden transportarse a
través de una o ambas membranas mitocondriales en un estado lineal
no plegado. En este proceso molecular las chaperonas están
involucradas en el desplegamiento y estabilización del estado
desplegado en el lado citosólico de la membrana así como en el
transporte y plegamiento en la mitocondria.
En el caso de plegamiento in vitro la
formación e isomerización de los puentes disulfuro y la
isomerización en cis/trans de las prolinas son concretamente la tasa
que determina los pasos de plegamiento. Estos pasos de plegamiento
son catalizados por ayudantes del plegamiento en la célula. Las
isomerasas de disulfuro de proteínas como la PDI o DsbA aceleran las
reacciones rédox de las cisteínas y disulfuros en los polipéptidos
en función de las condiciones rédox (Wunderlich y Glockshuber, 1993;
Bardwell, 1997). La aceleración de este paso de plegamiento reduce
la concentración de intermediarios durante el proceso de
plegamiento. Esto reduce la agregación dependiente de concentración
y aumenta el rendimiento del plegamiento (Weissman y Kim, 1993;
Lillie et al., 1994). Las
peptidil-prolil-cis/isomerasas (PPI)
catalizan la isomerización entre la forma cis y trans de los enlaces
peptídicos frente a los residuos prolina en las cadenas
polipeptídicas. Al contrario del resto de enlaces peptídicos en las
proteínas nativas, estos pueden estar presentes en su configuración
cis (Schmid, 1997).
El lisado de E. coli que se utiliza
frecuentemente en los sistemas de traducción in vitro es un
sistema natural y óptimo para el plegamiento de proteínas. Pero al
contrario que en una célula funcional, la cantidad de chaperonas
necesarias no se adapta automáticamente a la cantidad sintetizada
por el aparato de traducción. La sobrecarga resultante de la
maquinaria de plegamiento, en muchos casos resulta en la agregación
de la proteína diana. Varios componentes de la
maquinaria de plegamiento pueden ser responsables de este plegamiento ineficiente que depende de la proteína diana.
maquinaria de plegamiento pueden ser responsables de este plegamiento ineficiente que depende de la proteína diana.
El objeto de la presente invención fue aumentar
el rendimiento de proteína diana en un sistema de traducción in
vitro evitando la agregación de la proteína diana al
proporcionar las chaperonas necesarias en una cantidad adecuada en
el sistema de traducción in vitro. Esto debería aumentar al
mismo tiempo la eficiencia del sistema de traducción in
vitro.
El objeto se consigue de acuerdo con la
invención mediante un método para la expresión de proteínas diana en
sistemas de traducción in vitro que se caracterizan en que
proteínas ayudantes al plegamiento se coexpresan en este sistema.
Las proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento se seleccionan de
entre una o varias de las siguientes clases de proteína: la familia
de proteínas Hsp70, Hsp60, Hsp90, Hsp100, la familia de proteínas de
choque por calor pequeñas y las isomerasas.
Las chaperonas moleculares son el mayor grupo de
proteínas de asistencia al plegamiento, y de acuerdo con la
invención se definen como proteínas de ayuda al plegamiento (Gething
y Sambrook, 1992; Hartl, 1996; Buchner, 1996; Beibinger y Buchner,
1998). Debido a su sobreexpresión en condiciones de estrés, la
mayoría de chaperonas moleculares también se pueden localizar en el
grupo de las proteínas de choque por calor (Georgopolous y Welch,
1993; Buchner, 1996), este grupo también se define de acuerdo con la
invención como proteínas de ayuda al plegamiento.
Importantes proteínas de ayuda al plegamiento
que están incluidas en la presente invención se explican en más
detalle a continuación. El grupo de las chaperonas moleculares puede
dividirse en base a homologías de secuencia y a las masas
moleculares en cinco clases de proteínas no relacionadas, es decir
las familias de proteínas Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 y la familia
de las proteínas de choque por calor pequeñas (Gething y Sambrook,
1992; Hendrick y Hartl, 1993).
La chaperona mejor investigada de todas es
GroEL, que es un miembro de la familia Hsp60 de E. coli. Los
miembros de la familia Hsp60 también se denominan chaperoninas y se
dividen en dos grupos. GroEL, su cochaperona GroES y sus parientes
altamente homólogos de otras bacterias, así como de las mitocondrias
y cloroplastos forman el grupo de chaperoninas I (Sigler et
al., 1998; Fenton y Horwich, 1994). Las proteínas Hsp60 del
citosol de las eucariotas y de las arqueobacterias forman juntas el
grupo de chaperoninas II (Gutsche et al., 1999). Las
proteínas Hsp60 de ambos grupos tienen una estructura oligomérica
similar. En el caso de GroEL y el otro grupo de chaperoninas 1, las
14 subunidades de GroEL se asocian para formar un cilindro que se
compone de dos anillos heptámeros, mientras que el grupo de
chaperoninas II de las arqueobacterias la estructura de anillo de
heptámero está compuesto normalmente por dos subunidades diferentes.
Por el contrario los miembros del grupo de chaperoninas II del
citosol de las eucariotas, como el complejo CCT de las levaduras, se
componen de ocho subunidades diferentes con una organización
claramente definida (Liou y Willison, 1997). Las proteínas no
nativas pueden intercalarse y unirse a cavidad central de este
cilindro. La cochaperona GroES también forma un anillo heptamérico y
se une de este modo a los extremos del cilindro de GroEL. Sin
embargo, esta unión de GroES resulta en una limitación de la unión
de sustratos en función de su tamaño, de 10-55 kDa;
(Ewalt et al., 1997). La unión de sustratos está regulada
mediante la unión e hidrólisis de ATP.
Además de los miembros de la familia Hsp60, las
proteínas Hsp70 también se unen a la cadena polipeptídica en
formación (Beckman et al., 1990; Welch et al., 1997).
Normalmente hay varios miembros de la familia Hsp70 expresados
constitutivamente e inducidos por estrés presentes en las células
procariotas así como en las eucariotas (Vickery et al., 1997;
Welch et al., 1997). Aparte de estar involucradas en el
plegamiento de proteínas directamente en el ribosoma, estas
proteínas también están involucradas en la translocación de
proteínas a través de las membranas celular y de los orgánulos
(Schatz y Doberstein, 1996). Se ha demostrado que las proteínas sol
pueden transportarse a través de las membranas en un estado
desplegado o parcialmente plegado (Hannavy et al., 1993).
Durante el proceso de translocación en los orgánulos, son
principalmente los miembros de la familia Hsp70 los que están
involucrados en al desplegamiento y estabilización en la cara
citosólica así como en el replegamiento en el lado del orgánulo
(Hauke y Schatz, 1997). En todos estos procesos la actividad ATPasa
de Hsp70 es esencial para la función de la proteína. Una
característica típica del sistema Hsp70 es el control de la
actividad por cochaperonas (Hsp40; DnaJ), en el que el equilibrio
entre la unión y la liberación del sustrato está influenciada por la
modulación específica de la actividad ATPasa (Bukau y Horwich,
1998).
Alrededor del 1% de la proteína soluble en el
citosol de las eucariotas es Hsp90, que por lo tanto es una de las
proteínas más fuertemente expresadas (Welch y Feramisco, 1982). Los
miembros de esta familia actúan principalmente en complejos
multiméricos en los que reconocen numerosas proteínas de
transducción de señales importantes con estructuras similares a las
proteínas nativas. La unión a Hsp90 y sus proteínas acompañantes
estabiliza estas estructuras y así facilita la unión de ligandos a
las proteínas señalizadoras. De este modo, los sustratos consiguen
tener su conformación activa (Sullivan et al., 1997; Bohen
et al., 1995; Buchner, 1999).
Recientemente las chaperonas Hsp100 se han
diferenciado particularmente por su capacidad de cooperación con las
chaperonas Hsp70 para disociar los agregados ya formados (Parsell
et al., 1994; Goloubinoff et al., 1999; Mogk et
al., 1999). Aunque su función principal parece ser la mediación
en la tolerancia térmica (Schirmer et al., 1994; Kruger et
al., 1994), algunos miembros como ClpA y ClpB junto con las
subunidad proteasa ClpP median la degradación proteolítica de
proteínas (Gottesman et al., 1997).
La quinta clase de chaperonas, las proteínas de
choque por calor pequeñas (sHsp) son una familia de proteínas de
choque por calor muy divergente que se encuentran en casi todos los
organismos. La razón para la denominación de esta familia de
chaperonas es su peso molecular monomérico relativamente bajo de
15-40 kDa. Sin embargo, las sHsp normalmente se
encuentran en la célula como complejos altamente oligoméricos que
contienen hasta 50 subunidades y que se ha observado que tienen una
masa molecular de entre 125 kDa y 2 MDa (Spector et al.,
1971; Arrigo et al., 1988; Andreasi-Bassi
et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997). Como otras
chaperones, las sHsp pueden suprimir la agregación de las proteínas
in vitro (Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993; Merck
et al., 1993; Jakob y Buchner, 1994, Lee et al., 1995;
Ehrnsperger et al., 1997b). En este proceso, las sHsp se unen
a hasta una molécula sustrato por subunidad, y por lo tanto tienen
una eficiencia mayor que la de la chaperona modelo GroEL (Jaenicke y
Creighton, 1993; Ganea y Harding, 1995; Lee et al., 1997;
Ehrnsperger et al., 1998a). En condiciones de estrés, la
unión de proteína no nativa a las sHsp evita la agregación
irreversible de las proteínas. La unión a las sHsp mantiene las
proteínas en un estado soluble competente para el plegamiento. Tras
la restauración de las condiciones fisiológicas la proteína no
nativa puede liberarse del complejo con las sHsp por las chaperonas
dependientes de ATP como Hsp70 y reactivarse.
Los catalizadores de plegamiento de la clase de
las
peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas
y los miembros de las isomerasas de disulfuro por ejemplo se
consideran como isomerasas para el método de acuerdo con la
invención.
Las proteínas de ayuda al plegamiento que
funcionan del mismo modo o de un modo similar a las proteínas de
ayuda al plegamiento descritas anteriormente también están incluidas
por la presente invención.
De acuerdo con la presente invención es
preferible que las proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento
sean miembros de la familia de proteínas Hsp60. Además, es
preferible que las cochaperonas se coexpresen de forma adicional. De
acuerdo con el método de acuerdo con la invención es particularmente
preferible que se coexpresen la Hsp60 como proteína de ayuda al
plegamiento y la Hsp 10 como cochaperona. Es particularmente
preferible que la proteína de ayuda al plegamiento coexpresada sea
GroEL. Es particularmente preferible un método en el que se
coexpresan GroEL/GroES.
Otra variante preferida del método es en la que
las proteínas de ayuda al plegamiento coexpresadas son miembros de
la familia de proteínas Hsp70. Además preferiblemente se coexpresan
cochaperonas de forma adicional. En esta variante es particularmente
preferible que la proteína de ayuda al plegamiento coexpresada sea
una proteína Hsp70 humana. En particular, es preferible entonces que
coexpresen Hsp70 como proteína de ayuda al plegamiento y Hsp40 como
cochaperona. De acuerdo con el método de la invención, la Hsp70 de
humano y la Hdj1 (Hsp40 de humano) se coexpresan muy preferiblemente
en esta variante.
De acuerdo con la invención, las proteínas diana
pueden ser todo tipo de proteínas de procariotas y eucariotas, y
también proteínas de arqueobacterias. La expresión de proteínas
secretadas y proteínas de membrana era anteriormente particularmente
problemática en sistemas de transcripción/traducción in
vitro, especialmente cuando las proteínas de ayuda al
plegamiento no estaban presentes en cantidades adecuadas. Aunque la
expresión correcta de lipoproteínas y proteínas de membrana se han
descrito previamente, ésta es sujeto de limitaciones considerables
(Huppa y Ploegh, 1997; Falk et al., 1997). El método de
acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la
expresión de lipoproteínas, proteínas de membrana y proteínas
secretadas como proteínas diana, ya que se pueden proporcionar
proteínas de ayuda al plegamiento mediante la coexpresión en la
cantidad adecuada.
Una ventaja del método de acuerdo con la
invención es concretamente que el aumento del volumen de proteína
diana obtenido en los sistemas de transcripción/traducción in
vitro ocurre a una escala preparativa.
Los sistemas de traducción in vitro que
pueden serla base de la presente invención y en particular los
sistemas acoplados de transcripción/traducción in vitro se
describen en más detalle en la siguiente sección. En la actualidad,
los sistemas más eficientes se basan en E. coli,
reticulocitos de conejo o lisados de germen de trigo (Spirin, 1990;
Stiege y Erdman, 1995). Estos se utilizan normalmente en reacciones
en serie con un volumen de reacción definido. Las reacciones basadas
en E. coli pueden utilizarse en un rango de temperatura de
24-38°C. Para estos procesos en grupo, normalmente
se utiliza el sobrenadante 30S de los lisados de E. coli, que
debido al elevado contenido de mRNA endógenos tiene que tratarse con
RNasa previamente a su utilización para la traducción in
vitro (Zubay, 1973). Las reacciones basadas en los lisados de
germen de trigo típicamente se utilizan solo en un rango de
temperatura de 20-27°C (Tulin et al., 1995),
pero tienen la ventaja comparados con los lisados de E. coli de
que pueden utilizarse directamente para la expresión de moldes
de expresión exógenos debido al bajo nivel de mRNA endógenos. Los
lisados de reticulocitos se preparan mediante lisis directa de
sangre de conejos anémicos, de los que se eliminan los mRNA
endógenos mediante el tratamiento con RNasa. Estos sistemas se
utilizan normalmente para procesos en un rango de temperatura de
30-38°C (Pelham y Jackson, 1976). Sin embargo, debe
notarse que la temperatura de trabajo no solo tiene un efecto sobre
los procesos de traducción sino que también el plegamiento de las
proteínas diana es extremadamente dependiente de la respectiva
temperatura de trabajo.
La síntesis de proteínas en tales reacciones en
serie solo pueden mantenerse hasta que los primeros componentes
importantes ya no funcionan debido a la degradación, inhibición o
pérdida de energía. El mayor problema en esta conexión es el
suministro de energía para la síntesis de proteínas (Yao et
al., 1997, Matveev et al., 1996) que es el motivo por el
que solo se alcanzan tiempos relativamente cortos de síntesis en
estas reacciones en serie y por tanto, solo rendimientos
relativamente bajos de proteína diana (una media de
0,1-20 \mug/ml) (Mosca et al., 1983).
Sin embargo, el mRNA necesario para la síntesis
de proteínas también puede producirse directamente en los sistemas
de expresión. Para estos llamados sistemas acoplados de
transcripción/traducción es posible utilizar la polimerasa de RNA
endógena así como polimerasas de RNA fágicas exógenas para preparar
el mRNA en los sistemas basados en lisados de E. coli (Chen y
Zubay, 1983; Köhrer et al., 1996). Por el contrario, en los
sistemas eucariotas se utilizan polimerasas de RNA fágicas exógenas
(Craig et al., 1992; Baranov y Spirin, 1993). Pero en ese
caso, por supuesto, en tales sistemas eucariotas son necesarios los
DNA molde apropiados con los correspondientes elementos
promotores.
El problema de los tiempos de expresión cortos y
del suministro de energía a los sistemas se resolvió con el equipo
de traducción libre de células de intercambio continuo (CECF)
o equipo de traducción libre de células de flujo continuo
(Spirin et al., 1988; Spirin, 1991). La idea fundamental se
basa en el suministro continuo de energía y de componentes de peso
molecular bajo a la reacción y la eliminación continua de productos
secundarios de peso molecular bajo. En esta conexión, la reacción se
suministra a través de una membrana semipermeable desde un
compartimiento separado de alimentación.
El sistema de traducción in vitro es
preferiblemente un sistema acoplado de transcripción/traducción
in vitro. La transcripción/traducción acoplada in
vitro preferiblemente se da en un reactor CFCF o CEFC.
Los vectores o moldes de DNA pueden utilizarse
para la coexpresión en sistemas de transcripción/traducción in
vitro, cuya estructura corresponde a la de los vectores de
expresión de las proteínas diana. En los sistemas basados en lisados
de E. coli es posible utilizar promotores para la polimerasa
de RNA endógena de E. coli así como vectores que contienen
promotores para las polimerasas virales exógenas. En esta conexión,
los vectores también pueden contener un sitio de unión de ribosomas
y las regiones terminadoras adecuadas además de las regiones
promotoras. En principio, también es posible utilizar moldes de
expresión de DNA lineal (por ejemplo un producto de PCR). Si se
utilizan vectores de expresión circulares, que se han de amplificar
previamente in vivo antes de utilizarlos experimentalmente,
estos deben contener orígenes de replicación adecuados y al menos un
marcador de selección. El periodo de tiempo de la coexpresión y la
potencia de la coexpresión de las chaperonas puede optimizarse para
las respectivas proteínas sustrato (Lottspeich y Zorbas, 1998).
Para asegurar una eficiencia máxima de la
maquinaria de las chaperonas durante la reacción de síntesis, debe
regularse la coexpresión. Una regulación adecuada puede conseguirse,
por un lado, mediante la adición medida de los vectores de
coexpresión o, por otro lado, mediante secuencias reguladoras en las
regiones promotoras del vector que pueden regular la inducción y la
potencia de la expresión. Las secuencias del operador lac inducible
por IPTG, secuencias de unión a represores de tetraciclina o
secuencias reguladoras inducibles por catabolitos (por ejemplo
operador arabinosa) pueden utilizarse para tal regulación. Sin
embargo, en esta conexión se debe tener en cuenta la inducción
separada de la expresión de la proteína diana y de la coexpresión de
la chaperona.
Por lo tanto, es preferible regular la
coexpresión de las proteínas de ayuda al plegamiento o de las
chaperonas. En particular, es preferible que la expresión de las
proteínas diana pueda inducirse de forma separada de la coexpresión
de las proteínas de ayuda al plegamiento o de las cochaperonas.
Los moldes de DNA para los sistemas eucariotas
también deben componerse de regiones promotoras adecuadas para las
polimerasas de RNA virales, las secuencias eucariotas necesarias
para iniciar la traducción y los terminadores adecuados. Los
vectores de expresión circulares que deben amplificarse en E.
coli para su utilización experimental, también deben contener
una secuencia de origen de replicación para E. coli y al
menos un marcador de selección en E. coli. En este caso
también es posible regular la coexpresión de chaperonas mediante las
secuencias reguladoras adecuadas para los promotores virales
(Lottspeich y Zorbas, 1998).
Como la sobrecarga de la maquinaria de las
chaperonas depende de la respectiva proteína diana y de la tasa de
expresión de la proteína diana, la cantidad de chaperonas necesarias
depende fuertemente de la proteína diana. Por lo tanto, en los casos
individuales puede ser importante optimizar las tasas de expresión
de ambos moldes de expresión. Tal optimización puede conseguirse
mediante la variación de la cantidad de molde de expresión utilizado
además de la regulación directa de la expresión a través de los
promotores. En el caso de proteínas diana que sean muy susceptibles
a la agregación, puede además ser necesaria la utilización de un
gran exceso de chaperonas, mientras para otras proteínas diana una
coexpresión potente de chaperonas podría incluso interferir con la
expresión de la proteína diana. en función de la proteína diana, su
expresión funcional puede requerir la coexpresión de chaperonas
únicas así como la coexpresión de varias chaperonas. En esta
conexión también debe notarse que la mayoría de chaperonas solo
funcionan de forma efectiva como sistemas complejos con las
correspondientes cochaperonas. Por lo tanto, la coexpresión de
chaperonas y las cochaperonas adecuadas es particularmente
preferible.
La expresión de las proteínas diana también
puede conseguirse mediante la adición de chaperonas purificadas y
cochaperonas en la cantidad necesaria. Sin embargo, este proceso es
relativamente caro.
Otro tópico que también se incluye en la
presente invención es la utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una proteína de ayuda al plegamiento para el
método de acuerdo con la invención. Otro sujeto que se incluye en la
presente invención es la utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una cochaperona para el método de acuerdo con
la invención.
Un tópico especial incluido en la presente
invención es la utilización de un vector que contiene un gen que
codifica para una proteína de ayuda al plegamiento y de forma
adicional contiene una región promotora, un lugar de unión de
ribosomas y una región terminadora para el método de acuerdo con la
invención. Es también particularmente preferible utilizar un vector
que contenga un gen que codifica para una cochaperona y de forma
adicional contenga una región promotora, un lugar de unión de
ribosomas y una región terminadora para el método de acuerdo con
la
invención.
invención.
En los siguientes ejemplos se realiza el método
de acuerdo con la invención en un sistema de traducción rápido
(sistema RTS) utilizando la citrato sintasa mitocondrial como
proteína diana (de corazón porcino; EC 4.1.3.7). La GFP se utilizó
como otra proteína diana. Inesperadamente la coexpresión de GroEL/ES
en el sistema RTS así como la adición de GroEL/ES resultó en un
aumento en los rendimientos de expresión a una escala
preparativa.
Figura
1
Expresión de CS del pIVEX 2.4b sin la adición de
GroEL/ES. Expresión de CS del pNEX 2.4b, con coexpresión de
GroEL/ES. Expresión de CS del pNEX 2.4b con la adición de GroEL
purificado 150 nM y GroES purificado 300 nM.
Figura
2
Expresión de GFP sin la adición de Hsp70 (de
humano) y Hdj1 (Hsp40 de humano). Expresión de GFP con coexpresión
de Hsp70 y Hdj1. Expresión de GFP con la adición de Hsp70 300 nM y
Hdj1 300 nM.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Un vector pIVEX 2.4b vector (Roche, Molecular
Biochemicals) que contiene el gen de la citrato sintasa se utilizó
para la expresión en el sistema RTS, que expresa el gen de la
citrato sintasa con una cola de His fusionada al extremo
N-terminal. Las reacciones se llevaron a cabo
durante 24 h a 27°C, 140 rpm utilizando unos miniequipos de RTS con
Nº de lote 85869220 (Roche, Molecular Biochemicals).
La agregación de la citrato sintasa expresada se
suprimió mediante, la coexpresión de GroEL/ES por un lado, y
mediante la adición de GroEL/ES purificado a las reacciones de RTS,
por el otro lado.
Se utilizaron 8 \mug de pIVEX 2.4b y 8 \mug
del plásmido que expresa GroEL/ES en cada caso. El plásmido que
expresa GroEL/ES corresponde a un vector pET modificado (Novagen,
Milwaukee, EEUU) que expresa el operón GroEL/ES bajo el control de
un promotor T7 (Ishii Yasuhawa et al., 1995). La expresión de
las 3 proteínas se comprobó con un SDS-PAGE e
inmunotransferencia. Todas las proteínas se expresan en cantidades
aproximadamente iguales.
Se purificó el GroEL/ES utilizado para la
adición, como se describe en Schmidt et al., (1994). Se
añadieron GroEL 150 nM y GroES 300 nM al sistema RTS.
Tras la finalización de la reacción RTS, las
mezclas de reacción se centrifugaron durante 10 min a 14000 g y 4°C
para separar los agregados de los componentes solubles. La fracción
soluble se diluyó 1:10 con tampón de equilibrado
Ni-NTA (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, NaCl 300 mM, pH
7,4) y se cargó a una tasa de flujo continua de 0,5 ml/min en una
columna de 1 ml Ni-NTA Superflow (Qiagen). La
columna se lavó inicialmente con 5 ml de tampón de equilibrado y
subsiguientemente con 5 ml de tampón de lavado (Na_{2}HPO_{4}
100 mM, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM, pH 6,8). La citrato sintasa se
eluyó entonces de la columna con 3 ml de tampón de elución
(Na_{2}HPO_{4} 100 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH
7.5).
El coenzima A que se forma como producto
secundario de la condensación de oxaloacetato reduce
estequiométricamente el reactivo de Ellman (DNTB), lo que está
asociado con un aumento de la absorción a 412 nm. La citrato sintasa
activa plegada correctamente puede detectarse con esta reacción.
Para la determinación de la actividad se mezclaron 50 \mul de la
citrato sintasa purificada (fracción de elución), 900 \mul de
tampón TE (Tris/HCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0), 10 \mul de
oxaloacetato (10 mM en Tris 50 mM), 10 ml de DTNB (en tampón TE) y
30 \mul de acetil-coA (en tampón TE), y se
incubaron a 25°C. El cambio en la absorbancia se midió de forma
continua durante un periodo de 5 min y se determinó el cambio en la
absorbancia por minuto. El cambio en la absorbancia de la citrato
sintasa purificada se promedió en cada caso a partir de tres
reacciones RTS diferentes. El promedio del cambio en la absorbancia
en las reacciones RTS sin coexpresión de GroEL/ES se normalizó a
1.
Como se muestra en la figura 1 ambas
aproximaciones dan lugar a rendimientos elevados de citrato sintasa
mitocondrial purificada activa. De forma sorprendente, la
coexpresión del sistema GroEL/ES funcionó igual de bien que la
adición directa de GroEL y GroES purificados. El rendimiento de
proteína diana purificada activa aumentó 5 veces mediante la
coexpresión de GroEL/ES.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La GFP se utilizó como un sustrato modelo para
examinar los efectos de las chaperonas Hsp70 sobre la expresión en
el sistema RTS. Las reacciones se llevaron a cabo durante 24 h a
27°C, 140 rpm utilizando el mini equipo RTS Nº de lote 85869220
(Roche, catálogo). Para asegurar que la GFP se oxidaba durante la
reacción, solo se utilizó la mitad de las cantidades. En cada caso
se utilizaron 5 \mul del plásmido control de GFP que contiene el
miniequipo RTS.
Para examinar los efectos de la Hsp70 sobre el
rendimiento de la expresión en el sistema, se coexpresaron la Hsp70
y la Hsp40 de humano, y por otro lado, se añadieron Hsp70 y Hsp40
purificadas a las reacciones RTS. En cada caso se utilizaron 8
\mug de los plásmidos de expresión de Hsp70 y Hsp40. El plásmido
que expresa la Hsp70 corresponde al vector pET11a (Novagen,
Milwaukee, EEUU), el plásmido que expresa la Hsp40 (Hdj1)
corresponde al vector pET21d (Novagen, Milwaukee, EEUU), y ambos
genes se expresaron bajo el control del promotor T7. Se añadieron al
sistema RTS Hsp70 300 nM y Hdj1 300 nM (Abravaya et al.,
1992).
Tras la finalización de la reacción RTS, las
mezclas de reacción se centrifugaron durante 10 min a 14000 g y 4°C
para separar los agregados de los componentes solubles. La emisión
de fluorescencia de las fracciones solubles se midió a
430-580 nm con una excitación de 395 nm. La
fluorescencia relativa a 503 nm de la mezcla sin adición o
coexpresión de las chaperonas se normalizó a 1 y se comparó con la
fluorescencia de las mezclas que contienen chaperonas. Para excluir
los efectos de la subsiguiente oxidación de la GFP, las muestras se
midieron de nuevo tras 24 horas, aunque no se observó diferencia
alguna.
Como se muestra en la figura 2, ambas
aproximaciones dan lugar a rendimientos elevados de GFP activa. De
forma sorprendente, funcionó tanto la adición como la coexpresión de
las chaperonas Hsp70. El rendimiento de proteína diana activa se
dobló mediante la coexpresión de Hsp70 y Hsp40. La adición directa
dio lugar a un aumento de más de 3 veces el rendimiento.
Claims (20)
1. Un método para la expresión de proteínas
diana en sistemas de traducción in vitro, que se
caracterizan porque se coexpresan proteínas de ayuda al
plegamiento en este sistema.
2. Un método como el que se reivindica en la
reivindicación 1, que se caracteriza porque las proteínas
coexpresadas de ayuda al plegamiento se seleccionan de entre una o
varias de las siguientes clases de proteínas: las familia de
proteínas Hsp60, Hsp70, Hsp90 y Hsp100, la familia de proteínas de
choque por calor pequeñas y las isomerasas.
3. Un método como el que se reivindica en las
reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza porque las
proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento son miembros de la
familia de proteínas Hsp60.
4. Un método como el que se reivindica en la
reivindicación 3, que se caracteriza porque se coexpresan
cochaperonas de forma adicional.
5. Un método como el que se reivindica en la
reivindicación 4, que se caracteriza porque la Hsp60 se
coexpresa como la proteína de ayuda al plegamiento y Hsp10 se
coexpresa como la cochaperona.
6. Un método como el que se reivindica en una
de las reivindicaciones 3-5, que se
caracteriza porque la proteína coexpresada de ayuda al
plegamiento es GroEL.
7. Un método como el que se reivindica en una
de las reivindicaciones 4-6, que se
caracteriza porque se coexpresan GroEL y GroES.
8. Un método como el que se reivindica en las
reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza porque las
proteínas coexpresadas de ayuda al plegamiento son miembros de la
familia de proteínas Hsp70.
9. Un método como el que se reivindica en la
reivindicación 8, que se caracteriza porque se coexpresan
cochaperonas de forma adicional.
10. Un método como el que se reivindica en las
reivindicaciones 8 o 9, que se caracteriza porque la proteína
coexpresada de ayuda al plegamiento es una proteína humana
Hsp70.
11. Un método como el que se reivindica en las
reivindicaciones 9 o 10, que se caracteriza porque la Hsp70
se coexpresa como la proteína de ayuda al plegamiento y Hsp40 se
coexpresa como la cochaperona.
12. Un método como el que se reivindica en las
reivindicaciones 10-11, que se caracteriza
porque se coexpresan la Hsp70 de humano y la Hdj1 (Hsp40 de
humano).
13. Un método como el que se reivindica en
alguna de las reivindicaciones 1-12, que se
caracteriza porque el sistema de traducción in vitro
es un sistema acoplado de transcripción/traducción in
vitro.
14. Un método como el que se reivindica en
alguna de las reivindicaciones 1-13, que se
caracteriza porque la coexpresión de las proteínas de ayuda
al plegamiento y/o de las cochaperonas está regulada.
15. Un método como el que se reivindica en la
reivindicación 14, que se caracteriza porque la expresión de
las proteínas diana puede inducirse de forma separada de la
coexpresión de las proteínas de ayuda al plegamiento o de las
cochaperonas.
16. Un método como el que se reivindica en
alguna de las reivindicaciones 1-15, que se
caracteriza porque la transcripción/traducción acoplada in
vitro ocurre en un reactor CFCF o CEFC.
17. La utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una proteína de ayuda al plegamiento para un
método como el que se reivindica en alguna de las reivindicaciones
1-16.
18. La utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una cochaperona para un método como el que se
reivindica en alguna de las reivindicaciones
1-16.
19. La utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una proteína de ayuda al plegamiento y que
contiene de forma adicional una región promotora, un lugar de unión
de ribosomas y una región terminadora para un método como el que se
reivindica en alguna de las reivindicaciones
1-16.
20. La utilización de un vector que contiene un
gen que codifica para una cochaperona y que contiene de forma
adicional una región promotora, un lugar de unión de ribosomas y una
región terminadora para un método como el que se reivindica en
alguna de las reivindicaciones 1-16.
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