JPH08508651A

JPH08508651A - 蛋白質合成用無細胞システムおよびそれにおけるシャペロン蛋白質の利用

Info

Publication number: JPH08508651A
Application number: JP6523319A
Authority: JP
Inventors: クドリッキ，ヴィルズロー; クレイマー，ギーザラ; ハーディスティ，ボイド
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1996-09-17
Also published as: CA2159899A1; KR960701892A; IL109262A0; AU6628894A; NZ265504A; AU693443B2; EP0693131A4; EP0693131A1; WO1994024303A1

Abstract

(57)【要約】本発明は蛋白質の無細胞合成およびリジニアリング用の新しい、高効率の方法を提供する。本発明によるこの新しい方法は、無細胞抽出物を作成するステッブと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、転写／翻訳用培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成される。本発明による方法は結合転写／翻訳システム、翻訳のみシステム、または無細胞継続流システムとして用いることができる。また、蛋白質合成およびシャペロン蛋白質を用いてそれらを正しく組み込む方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称蛋白質合成用無細胞システムおよびそれにおけるシャペロン蛋白質の利用発明の背景発明の分野本発明は一般的には蛋白質合成の分野に関するものである。より具体的には、本発明は望ましい蛋白質の無細胞翻訳、あるいは外部から付加した遺伝子の無細胞結合転写／翻訳のための高効率システムに関するものである。関連技術の説明プラスミドにクローンされたコード配列の無細胞転写は完全な細胞における遺伝子表現で遭遇する多くの問題をうまく回避する。これらの問題には生成物の不溶性、毒性、そして後での精製の難しさなどがある。無細胞蛋白質合成の主たる欠陥は、形成される生成物の量が比較的少量であることであった。この欠陥は、 Science 242：1162（1988）に発表されている、Spirinおよびその共同研究者らによる、比較的高レベルの蛋白質合成が、例えば、24時間あるいはそれ以上という長い期間、リニヤーレイト（linear rate）で維持できる継続流無細胞（ＣＦＣＦ）翻訳および結合転写／翻訳システムの開発によって、かなり克服されたように見える。例えば、大腸菌から導かれた結合転写／翻訳ＣＦＣＦシステムでは、高率の蛋白質合成が24時間維持できる。翻訳に適した大腸菌（Ｓ３０）からの無細胞抽出物はG．Zubay（1973）により開発された（Ann．Rev．Genetics ７： 267−287）。このＳ30抽出物は基本的にＤＮＡを含んでおらず、翻訳条件下での予備培養を行うため、mＲＮＡを含んでいないが、完全な細胞に見られる可溶性蛋白質およびＲＮＡ類のほとんどは保持している。線形化ファージまたはプラスミドＤＮＡおよび線形化ＤＮＡ断片の結合転写／翻訳用にＳ30システムを用いることは発表されている（J．M．Prattら（1981）Nucl．Ac．Res．９：4459−4474 ；およびJ．M．Prattら（1984）Transcription and Translation：A Practical Approach （Hames，B．D.，およびHiggins，S．J.，著ページ179−209，ＩＲＬ発行）。しかしながら、ＣＦＣＦ翻訳を行おうとした多くの研究者は、この技術的に複雑なシステムを確立するために、多くの困難に直面してきている。結合転写／翻訳のための最初のシステムはZubayの方法を用いた未精製Ｓ30フラクションに基づいている。リボゾームに加えて、このフラクションは完全な大腸菌細胞内に存在する可溶性蛋白質のほとんどすべてを含んでいる。これには、多くの、分解可能なプロテアーゼおよびヌグレアーゼが含まれている。この未精製システムがもたらすひとつの特殊な結果は、明らかに、そして少なくとも部分的には、操作中にＳ30フラクション内の可溶性蛋白質から形成される変性蛋白質により、ＣＦＣＦ操作中に反応室のフィルターが目づまりを起こす傾向があることである。第２に、Ｓ30フラクションは線形ＤＮＡをその自由な端末から切り離す非常に活発な可溶性エグゾデオキシリボヌグレアーゼを１種以上含んでいる。第３に、酵素活性蛋白質の無細胞合成用に必要な蛋白質および核酸ファクターの定義と特徴付けとが不十分である。これらのファクターが蛋白質合成中に、相互に、また、リボゾームとどのように反応するかについてはほとんど知られていない。未完成蛋白質の適切な組み込みに関する情報がその遺伝子のコード配列には本質的に備わっているということは一般的に受け入れられている。しかしながら、未完成ポリペプチドは、その媒介物を介しての形成時に、リボゾーム上でそのＮ −端末からＣ−端末間で組み込まれているかどうか、あるいは、その自然のままの立体配座内への組み込みは、その合成が改良した後にのみ行われるのかどうか、つまり、その組み込みが翻訳と同時に新たに形成された、あるいは翻訳後に新たに形成されたポリペプチドの組み込みのいずれなのかといった問題に対しては、まだ、解答が見つかっていない。組み込みプロセスの一部が翻訳過程後に行われ、他の一部がリボゾームからの新しく形成されたポリペプチドの切り離し中、あるいは切り離し後に行われているのかもしれないし、そのプロセスが他の蛋白質とは異なっているのかもしれない。未完成ペプチドの最初の組み込みは、それらがリボゾーム上に広げられた時に行われている可能性がある。これらの組み込みイベントは大型リボゾーム性サブユニットの窪みやトンネル内の保護された場所で起きている可能性もある。シャペロン、ＤnaＪ，ＤnaＫ，ＧrpＥ，ＧrpＥＬおよびＧroＥＳが、リボゾーム上のある蛋白質の部分に組み込まれる。従来の技術は、蛋白質の無細胞エンジニアリングおよび合成用高効率、結合転写／翻訳システムにおいては不十分である。従来技術はまた、蛋白質の無細胞合成のための高効率翻訳システムにおいても不十分である。発明の要約本発明は蛋白質の無細胞エンジニアリングおよび合成用の高効率、結合転写／翻訳システムに対する、必要性の高い、そして長い間の要望に応えるものである。本発明はまた、蛋白質合成のための、高効率、無細胞翻訳システムに対するこの分野での長い間の要望に応えるものである。本発明のひとつの実施例では、無細胞抽出物を作成するステップと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、転写／翻訳培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして、合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成された、高効率、無細胞蛋白質合成方法が提供される。本発明の別の実施例においては、無細胞抽出物を作成するステップと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、シャペロン蛋白質を含む転写／翻訳培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成された高効率、無細胞蛋白質合成のための方法が提供される。本発明のさらに別の実施例においては、大腸菌から無細胞抽出物を調製するステップと、遠心分離によって該抽出物からリボゾームフラグションを分離するステップと、55mMトリス−アセテート（pH7.8），12mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂，36mM ＮＨ₄ＯＡｃ，72mM ＫＯＡｃ，２mM Ｃａ（ＯＡｃ）₂，0.5mM ＥＤＴＡ、２％ポリエチレングリコール−6000、２mM ＤＴＴ，1.2mM ＡＴＰ，0 .8mM ＧＴＰ，0.8mM ＵＴＰ，0.8mM ＣＴＰ，0.4mM ｃＡＭＰ，27mMピルビン酸 −２−リン酸塩（一価カリウム塩、pH7.0）、0.35μｇピルビン酸キナーゼ、１ μｇホリニン酸、83μＭ ¹⁴Ｃ−ロイシン、他の19種類のアミノ酸をそれぞれ330 μＭ，20μｇの大腸菌、0.5μｇのリファムピミシン、0.3mMのグルコース−６− ホフェート、1.2Ａ₂₆₀単位の大腸菌リボゾームフラクション、0.5μｇプラスミドＤＮＡ、および0.5μｇのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含む培地の存在下で該リボゾーム・フラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成された高効率、無細胞蛋白質合成のための方法が提供される。また、シャペロン蛋白質ＤnaＪ，ＤnaＫ，ＧrpＥ，ＧroＥＬ，およびＧroＥＳは、以下に述べるような利点を達成するために、培地に含めることもできる。開示のために提供される本発明の現段階での好ましい実施例についての以下の説明と、それに添付する図面を参照すれば、他の、そしてさらなる目的、特徴、そして利点が明らかになるであろう。図面の簡単な説明上に述べた本発明の特徴、利点、および目的、および以下に明らかにされる他の特徴、利点、および目的を達成し、さらに詳しく理解するためには、上に要約して述べた説明に加えて、以下に添付図面と合わせて述べられる一定の実施例を参照するのが有益であろう。これら図面は本明細書の一部を形成する。なお、添付図面は本発明の好ましい実施例を示しているが、その範囲を限定するものではない。これらの図面は必ずしも実寸通りではない。本発明の一定の特徴は、説明を簡潔、明瞭にするために、寸法を誇張して示したり、図式的な形で示されている。図１はジヒドロフォレートレダクターゼ生成物の酵素活性を示している。黒丸と三角形はそれぞれ、付加されたｐＳＰ65 ＤＨＦＲプラスミドを含んだ反応混合物と、それを含んでいない反応混合物を示している。挿入字：ＡおよびＢは、インビトロ蛋白質分析後の同一のアリコットが分析された（Laemmli（1970）N ature 227：680−685の方法によって行われた）15％ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアグリルアミドゲル電気泳動からのオートラジオグラムからのトラックを示している（Ａはプラスミドを含んでいない場合、Ｂはプラスミドを含んでいる場合）。番号１−５は、ゲル上でのマーカー蛋白質の位置を示している。これらの番号はそれぞれ、１はホスフォリラーゼｂ（Ｍ_r 94,000）、２は仔ウシ血清アルブミン（Ｍ_r 65,000）、３は卵蛋白（Ｍ_r 43,000）、４はカルボニックアンヒドラーゼ（Ｍ_r 30,000）、および５はリゾチーム（Ｍ_R 14,000）をそれぞれ示している。図２は継続流無細胞システムにおけるジヒドロホレートレダクターゼの合成を示している。蛋白質合成後、一定の時間をかけて、蛋白質への¹⁴Ｃ−ロイキンの組み込みが行われたかどうかについての判定が行われた。１時間あたり1.5mlのフラクションが集められた。挿入字Ａ：最初の７時間の得られた個々のフラクション（それぞれ100μl）のコオマシー（CoomaSSie）ブルー染色ゲル（15％アシルアミド）。挿入字Ｂ：22時間をかけて集めたサンプルによる、挿入字Ａに示されたものと同様のゲルから作成されたオートラジオグラム。図３は、環状プラスミドとは対照的に線形化されたプラズミドの分解を示している。図４は、上澄み液とリボゾームフラクション内のロダネーゼ・ポリペプチドを示している。ロダネーゼは［¹⁴Ｃ］ロイシン（160Ci/mol）あるいは［³⁵Ｓ］f Met-tＲＮＡ_f（400Ci/mol）の存在下で合成され、次にリボゾームが遠心分離で集められた。上澄み液および再懸濁されたリボゾームフラクションをＳＤＳ− ＰＡＧＥによって分析し、さらに続いてオートラジオグラムによって分析した。トラック１および２は、20μｌの上澄液フラクション；トラック３および４は（ 30μｌに再懸濁させた）リボゾームフラクション20μｌ。トラック１および３：［¹⁴Ｃ］ロイシンによる培養から。トラック２および４：［³⁵Ｓ］fＭet-tＲＮＡ_fによる培養からのもの。左側の矢印は仔ウシの肝臓から精製した天然のロダネーゼの移行を示している。右側の番号は分子量マーカーの位置を示しており、１は仔ウシ血清アルブミン（Ｍ_r 64,000 ）；２は卵蛋白（Ｍ_r 43,000）、３はカルボニックアンヒドラーゼ（Ｍ_r 30,0 00）；４は大豆トリプシン抑制因子（Ｍ_r 22,000）；５はリゾチーム（Ｍ_r 14,4 00）それぞれ示している。図５はシャペロン類によるリボゾームからの全長ロダネーゼの切り離しを示している。ロダネーゼポリペプチドを含んだ再懸濁されたリボゾームを、示されたシャペロン類（表VIIにその量を示す）が存在している状態と、存在していない状態の両方で培養し、遠心分離を行った。この上澄液20μｌのアリコット（各セットの最初のレーン）と、30μｌ内に再懸濁させたリボゾームフラクションの20ulのアリコット（各第２のレーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーで分析した。最初からリボゾームに結合していた全長ロダネーゼの総量に対応する上澄液内に切り離された全長ロダネーゼのフラグションを各トラックの下のパーセンテージとして示してある。全長ロダネーゼの量はゲルからのバンドを切り離し、可溶化して、エコライト（ＩＣＮ）の存在下で放射活性を計量することによって判定された。本発明の詳細な説明定義以下の説明において、『Ｓ30』という用語は、Zubay（1973）の方法によって作成された大腸菌からの無細胞抽出物を意味する。大腸菌からの無細胞抽出物の調製は、先行技術において良く知られており、この研究分野に通常の技術を有している人であれば、誰でも簡単に行うことができる。以下の説明において、『無細胞翻訳』とは、蛋白質のインビトロでの合成を意味している。以下の説明において、『継続流、無細胞あるいはＣＦＣＦシステム』とは、反応室において蛋白質を合成し、Spirinら（1988）が述べたＣＦＣＦシステムと同様に、継続的に生成物をとり出したり、原料溶液を注入したりする反応室内での蛋白質の合成を意味している。要するに、アミノ酸およびヌクレオチドトリフォスフェートを含んだ原料緩衝液の継続流を反応混合物を通じて用いることである。ポリペプチド生成物が継続的に取り除かれる。無核および真核システムの両方のテストが行われた。以下の説明において、『結合転写／翻訳』とはプラスミドからのmＲＮＡの合成、つまり、このmＲＮＡを含む同じ反応混合物における転写および翻訳のことである。以下の説明において、『リボゾームフラクション』という用語は、リボゾームとある種の蛋白質、tＲＮＡおよびその他の細胞性成分を含んだ未生成細胞抽出物から得られるフラクションを意味している。以下の説明において、『静的アッセイおよび静的システム』とは、テスト管内で行われるアッセイを意味しており、継続流システムのことではない。本発明の範囲および精神を逸脱せずに、ここに開示されている発明に対して種々の置き換えや修正が可能であることは、当業者には明らかであろう。本発明は高効率の、無細胞蛋白質合成法を提供するものである。この方法は、（１）無細胞抽出物を調製し、（２）その抽出物からリボゾームフラクションを分離し、（３）培地の存在下でそのリボゾームフラクションを培養し、そして（４）合成された蛋白質の量を測定するステップで構成されている。本発明による方法において用いるために調製される無細胞抽出物は、多数の無核および真核生物から調製することができる。適切な無核生物の代表例は大腸菌である。適切な真核生物の代表例としては小麦胚種、ウサギの網状赤血球などである。本発明による方法においては、リボゾームフラクションはこの技術分野で知られているどんな方法で、リボゾームフラクションを無細胞抽出物から分離してもよい。好ましくは、リボゾームフラクションは遠心分離、またはゲルろ過クロマトグラフイーによって分離される。本発明の方法においては、リボゾームフラクションは適切な培地の存在下で培養される。本発明のひとつの実施例においては、リボゾームフラクションは転写／翻訳培地の存在下で培養される。一般的に、転写／翻訳培地は緩衝液、塩類（一価または二価陽イオン）、アミノ酸、還元剤、ヌクレオチドトリフォスフェート類、細胞抽出物（Ｓ30）またはリボゾーム、プラスミド、ＲＮＡポリメラーゼ、そしてエネルギー再生システムを含んでいる。最も好ましくは、転写／翻訳培地はヘペスまたはトリス緩衝液（pH7.5−7.8）、最適Ｍｇ（ＯＡｃ）₂濃度，最適ＮＨ₄ ⁺および／またはＫ⁺塩濃度、２mM ＤＴＴ，1.2 mM ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＵＰＴおよびＣＴＰをそれぞれ0.8mM，0.5mM ＣＡＭＰ、エネルギー再生システム（エノルピルビン酸２−リン酸塩およびピルビン酸キナーゼ、またはリン酸クリアチンおよびリン酸クリアチンキナーゼ）、１μｇホリニック酸（大腸菌システムの場合のみ）、25−83μM ¹⁴Ｃ−ロイシン、他の19種類のアミノ酸をそれぞれ25−330μM、20−30μｇのtＲＮＡ（大腸菌に対しては無核ｔＲＮΛ、真核システムに対しては真核tＲＮＡ）、0.5μｇリファンピシン、1.2Ａ₂₆₀単位のリボゾームフラクション、プラスミドＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを含んでいる。Ｍｇ（ＯＡｃ）₂，ＮＨ₄ ⁺、およびＫ⁺の最適濃度は、無核生物と真核生物のいずれが用いられるかによって異なってくる。例えば、バクテリアシステムと共に用いられるＫ⁺の濃度は72mMであるが、小麦胚種システム内では112mMである。同様に、Ｍｇ²⁺の濃度は、バクテリアシステム内では14mMであるのに対して、小麦胚種システム内では４mMである。この技術分野の通常の技術と経験を有する人であれば、種々の塩の濃度が実験室によって多少異なることはすぐ認識するであろう。本発明の別の実施例においては、リボゾームフラクションは翻訳メディアの存在下で培養される。一般的に、翻訳メディアは緩衝液、塩類、例えばＡＴＰおよびＧＴＰなどのエネルギー源、例えばエノルピルビン酸２−リン酸塩、ピルビン酸キナーゼなどのエネルギー再生システム、アミノ酸、ｔＲＮＡ，および単離 mＲＮＡを含んでいる。本発明のさらに別の実施例においては、無細胞抽出物を作成するステップと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、シャペロン蛋白質を含んでいる転写／翻訳培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成された、蛋白質の無細胞合成のための効率の高い方法が提供される。一般的に、この培地に含まれていることが好ましいシャペロン類はＤnaＪ，ＤnaＫ，ＧrpＥ，ＧroＥＬおよびＧroＥＳである。本発明の方法においては、無細胞抽出物のリボゾーム・フラクションは、37℃ 程度の温度下で、20分から60分程度、培地内で培養される。好ましくは、培養時間は37℃の温度下で30分程度である。本発明による方法で合成された蛋白質の判定は、公知のいずれの技術で行ってもよい。好ましくは、蛋白質の測定は、トリクロロ酢酸沈殿を行い、次に、蛋白質に組み込まれたアミノ酸の量を定量するか、あるいは硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、その後でオートラジオグラフィーを行うことによって測定される。また、可能な場合は（酵素活性）などの生物学的活性を判定して、特殊な抗体（それらがあれば）との反応を行ってもよい。いくつかの場合、合成された蛋白質の生物学的活性を測定することによって、蛋白質レベルの判定を行うことが必要で有ったり、あるいは望ましいかもしれない。言い換えれば、蛋白質の自然な立体配座は、その蛋白質の生物学的活性を測定することによって判定してもよい。蛋白質の生物学的活性を調べることで測定できる蛋白質の代表例としては、ロダネーゼ、クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ、そしてジヒドロホレートレダクターゼなどがある。Ｓ30 大腸菌抽出物から分離されたリボゾームは適切なプロモータの存在下で暗号配列を含んだプラスミドからの結合転写／翻訳の行うために必要なすべての成分を保持している。非線形化プラスミドからはかなり多量の合成量が得られ、過去に最も多く用いられた線形化形態はこのシステムでは急速に分解された。このシステムの有用性は無核蛋白質と真核蛋白質の両方に対して示された。本発明は先行技術に基づくどのようなシステムよりも重要な利点を有している。プラスミド調製は、ＣｓＣｌ遠心分離ステップの代わりにＱカートリッジ（Bio-Rad）クロマトグラフィーを用いたことを除けば、標準的な手順（J．Sambrookら（1989）、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab oratory発行）によってつくられた。ＳＰ６およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼは市販されている。用いられたプラスミドは以下の文献に示されている。（１）コード配列：β−ラクタマーゼ／ＤＨＦＲ；プラスミドｐＤＦ34−ＤＨＦＲ（Bara novら（1989）Gene 84：463−466）；（２）コード配列：ＤＨＦＲ；プラスミドＳＰ65−ＤＨＦＲ；（MurzinaおよびGudkov（1990）Prot．Engineering３：709 −712）；（３）コード配列：ＣＡＴ；プラスミドＳＰ65−ＣＡＴ；A．Spirinおよびその共同研究者らから提供；（４）コード配列：ＰＰＩ−Ｃ；プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＰ１−Ｃ；（Baiら，（1988）ＦＡＳＥＢＪ．２：3010−301 6；（５）コード配列；ＳＴＮＶ、プラスミドｐＴＺ19Ｒ−ＳＴＮＶ、（Brownin gら（1988）J．Biol．Chem．263：8380−8383）；（６）コード配列：ロダネーゼ；プラスミドｐＥＴlld−rho，（Millerら（1991）J．Biol．Chem．266：46 86−4691）；（７）コード配列：ｈＴＦＩＩＤ−180Ｃ，プラスミドｐＡＲ−1 80Ｃ，（Petersonら（1991）、Science 248：1625−1630）；（８）コード配列；β−グロブイリン；プラスミドｐＵＣ18，（Fletcherら（1990）J．Biol．C hem．265：19582−19587）実施例１リボゾーム・フラクションの分離結合転写／翻訳に用いられるリボゾームフラグションはG．Zubayの方法に従って大腸菌K12（Ａ19）から分離された。細胞はＬＢ（Sigma）ブロス内で37℃で培養され、20％グルコース（２リットル培地あたり10ml）が加えられた。細胞は37 ℃でmid-logフェーズで採取され、圧力セル内で溶解させた。次にこれらのセルを30,000×ｇで30分遠心分離にかけ、Ｓ30抽出物を作成した。プロターゼ抑制因子であるフッ化フェニルメチルスルホニルを溶解緩衝液に加えて、最終的な濃度を0.5mMとした。Ｓ30のアリコット（各９ml）をBeckmanTi 50ローター内で、47, 000rpmで４時間遠心分離にかけた。分離したリボゾームを1.0mlの20mMトリス− ＨＣｌ（pH7.5）、10mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂、および１mM ＤＴＴ内に再懸濁させ、 1200Ａ₂₆₀単位/ml程度の懸濁液を得た。このリボゾーム・フラクションは−70℃ の温度下、小さなアリコットで保存された。実施例２合成システム結合転写／翻訳を実施するために用いられたシステムは、全体としてで30μｌで、50mMトリス−アセテート（pH7.8）、14mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂，36mM ＮＨ₄ ＯＡｃ，72mM ＫＯＡｃ，２mM Ｃａ（ＯＡｃ）₂，0.5mM ＥＤＴＡ、２％ポリエチレングリコール−6000、２mM ＤＴＴ，1.2mM ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰおよびＣＴＰをそれぞれ0.8mM、0.5mM cＡＭＰ，27mMエノルピルビン酸２ −リン酸塩、0.35μｇピルベート・キナーゼ、１μｇホリニッグ酸、83μM ¹⁴Ｃ −ロイシン、他の19種類のアミノ酸をそれぞれ330μM、20μｇの大腸菌（Boehri ng）、0.5μｇリファムピシン、0.3mMグルコース−６−フォスフエート、1.2Ａ₂ ₆₀ 単位の大腸菌リボゾームフラクション、0.5μｇプラスミドＤＮＡ、および0 .5μｇＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含んでいた。¹⁴Ｃ−ロイシンは静的テスト管アッセイのために40Ci/moleに希釈され、また、継続流無細胞システムのためには10Ci/moleに希釈された。培養は37℃の温度下で30分間行われた。継続流無細胞システムのために、このフラグション混合物を1.0mlに拡大した。合成はＹＭ100（amicon）メンブレンを有する反応室内で、その上部で生成物を1.5ml/hr の割合で底部から頂部までくみ上げて実施した。溶出物を、反応混合物のすべての低分子量とtＲＮＡを含んだ原料溶液と３μｇ/mlの割合で交換した。培養はそれぞれ指定された時間、37℃の温度で行われた。実施例３蛋白質生成物の分析形成された生成物は以下の方法のいずれかによって分析された。30−μｌテスト管アッセイでの、あるいは継続流システムから集めたフラクションの100−μl からの¹⁴Ｃでラベルされた生成物をトリクロロ酢酸沈殿させ、さらに、前に述べた手順（W．Kudlickiら（1987）J．Biol．Chem．262：9695 −9701）で判定した。放射活性は液体シンチレーションカウンティングによって測定した。また、反応混合物、あるいは溶出物のアリコットはＳＤＳ内でポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その後、オートラジオグラフィー（W．K udlickiら（1987）J．Biol．Chem．262：9695−9701）によって分析を行った。ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の酵素活性はBaccanariら（1981 ）Biochemistry 20：1710−1716の方法に従って、340nmでの吸光度低下によって示されるＮＡＤＰＨの酸化によって行われた。ＤＨＦＲ活性の１単位は、12.3× 10³のＮＡＤＰＨに関して、モル吸光係数に基づいてジヒドロホレートを１μmol /minの割合で減少させるのに必要な酵素の量と定義されている（B．L．Hillcoat ら（1967）Anal．Biochem．21：178-189）。ロダネーゼの酵素活性は、Sorbo（1953）、Acta Chem．Scand．７：1137−114 5の方法に従って、カロリメトリックアッセイで判定された。このアッセイでは、基質としてＳ₂Ｏ₃ ^2-を用いて、酵素によるＣＮ^-のＳＣＮ^-への転換の測定が行われる。形成されたＳＣＮ^-は、この生成物と鉄イオンとの間の複合体の、460nm での吸光を測定して検出、定量が行われた。１単位はこのアッセイシステムで、37℃の温度下で生成物を１μmol/分の割り合で発生させるのに必要な酵素の量と定義されている。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性はアセチル−ＣoＡからの［³Ｈ］アセチルがアガロースビーズに取りついたクロラムフェニコールに転移することによって測定された。酵素反応後のビーズに関連した放射活性の定量も行われた。１単位は１pmol ³Ｈ−アセチルのクロラムフェニコールへの転移と定義された。実施例４これらの実験で用いられたリボゾームフラクションは、大腸菌Ｓ30フラクションから得られたものであった。特に他の指定がない場合、Ｓ30、あるいはリボゾームフラクションの培養は、ＳＰ６またはＰ７プロモータの存在下で暗号配列を含んだプラズミドを用いて行った。それぞれのプロモータからの転写を行うために、ＳＰ６あるいはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを添加した。30μｌの転写／翻訳反応混合物にはtＲＮＡおよびＲＮＡおよび蛋白質合成を行うのに必要な低分子量成分も加えられた。静的アッセイが用いられた場合、培養は37℃の温度下で30分間行われた。蛋白質合成は以下のように行われた。反応混合物は10μｌのＳ30、あるいは１ μｌのリボゾームフラクションを含んでいた。表１の２−４行に示されている遺伝子が得られたプラスミド２，３および４の転写が行われ、それぞれのコード配列はＳＰ６プロモータの下である。これらの場合，ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼおよびリファムピシンが加えられた。プラスミド５では、ＤＨＦＲ fol Ａ遺伝子がプラスミド（pＤＦ34−（V．I．Baranovら（1989）、Gene 84：463−466））に挿入された。この遺伝子およびβ−ラクタマーゼの転写は大腸菌プロモータによって行われるので、ＲＮＡポリメラーゼ、あるいはリファムピシンの添加は行われなかった。６−８行に記載されている遺伝子を有するプラスミドはＴ７プロモータの下でのコード配列を有している。これらの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびリファムピシンの添加が行われた。合成された蛋白質の量は¹⁴Ｃ−ロイシンの取り込みによって分析された。静的システムで合成されたＤＨＦＲ蛋白質を（蛋白質内に組み込まれた¹⁴Ｃ− ロイシンの量から判定して）50ng含有している反応混合物のアリコットを用いて、酵素活性を測定した。平行培養混合物から等しい分量のアリコットを取り出し、それからプラスミドを取り除いた。酵素活性を判定するために、このアッセイ混合物は総量で1.0ml，100mMのイミダゾール−ＨＣｌ（pH7.6）、10mMの２−メルカプトエタノール、75μMのジヒドロホレート、および80μMのＮＡＤＰＨで構成されていた。30℃で反応を行った後、キュベットで340nmでの吸光度の低下を調べた。ロダネーゼは合成された反応混合物のアリコットを用いてその活性を調べた。（蛋白質内に組み込まれた¹⁴Ｃ−ロイシンの量から判定して）150ng程度のロダネーゼを0.15Ｍのチオサルフェート、0.15ＭＫＣＮおよび0.12ＭＫＨ₂ＰＯ₄（ pH５）の１：１：１混合物（最終体積0.5ml）に添加した。反応は37℃の温度下で行われた。反応は0.25mlの18％ホルムアルデヒドを添加して終了した。かくして得られた生成物を 33％ＨＮＯ₃中0.75ml 0.15ＭＦｅ（ＮＯ₃）₃と混合し後判定した。最終反応混合物の460nmでの吸光度を用いて、その活性を判定した。［³Ｈ］アセチル−Ｃo Ａ（3000Ci／mol）とアガロースビーズに結合したグロラムフェニコールを含んだ混合物に（蛋白質内に組み込まれた¹⁴Ｃ−ロイシンの量から判定して）約30 ng ＣＡＴを添加した。このアッセイを25℃で行った。ビーズを洗浄して、その放射活性を判定した。また、Sleighらによって述べられた条件下で、37℃で１時間培養した後、¹⁴Ｃアセチル−ＣoＡのクロラムフェニコールへの移転を測定するために、Sleighらによる、Analyt．Biochem．156：251−256（1986）の方法を用いた。実施例５蛋白質への¹⁴Ｃ−ロイシンの組み込みは、培養の全期間を通じてほぼ直線的に行われたが、30分程度で急激に停止し、その時聞をもって最大、あるいはほぼ最大合成とした。反応速度が急激に低下する理由は分からない。Ｓ30またはリボゾームフラクションのいずれかで、異なったプラスミドから、この期間中に合成された蛋白質の量を表Ｉに示す。分画された（fractionated）システムでは、バックグラウンド合成は、テストされたほとんどすべてのプラスミドで低かった。以下のコード配列を挿入されたプラスミドのデータを表Ｉに大腸菌ジヒドロホレートダクターゼ（ＤＨＦＲ）、大腸菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、およびウサギ骨格筋ホスファターゼ（タイプ１ホスホプロテインホスフォターゼ、ＰＰ１−Ｃの触媒サブ単位）。これら３つの蛋白質の暗号配列は異なったプラスミドにグローンされていたが、これらはすべてＳＰ６プロモータの下で行われる。これらプラスミドに、転写のためにＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを添加した。これらの場合、内因性大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの発生を抑制するために、リファムピシンを反応混合物に加えた。また、表Ｉには大腸菌プロモータの下でＤＨＦＲ遺伝子を挿入したプラスミドによる結果も示されている。この場合、転写はＲＮＡポリメラーゼの添加なしで行われた。ＤＨＦＲと、分子量が30,000ドルトンで、β−ラクタマーゼのように見えるポリペプチドの２つの生成物が合成された。後者の生成物は、他のＳＰ65プラスミドがリファンピシンの不在下で転写、翻訳された場合にも得られた。表Ｉに示すＴ７プロモータの存在下で挿入されたコード配列を有するプラスミドは、仔ウシローダネーゼ、先端を切った形のヒトＴＡＴＡボックス結合蛋白質（ＴＦＩＩＤ −180Ｃ）、およびSatellite Tobacco Necrosis Virus（ＳＴＮＶ）からの植物ウィルス性ＲＮＡである。これらのプラスミドに、転写のためＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびリファムピシンを添加した。実施例６最も重要なことは、表１の実験で用いられたプラスミドはＳＰ６、あるいはＴ７ポリメラーゼ、または内因性大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの添加による転写のための線形化が行われなかったことである。プラスミドの３′を適切な制限酵素を用いて切断した場合には、低いレベルの、ある場合にはかなり低いレベルの転写が行われた（表II）。（切断されなかったプラスミドとは対照的に）線形化されたプラスミドの場合、（図１に示すような）アガロースゲル電気泳動による分析で、培養時間中に分解が観察された。蛋白質は分画されたシステム内で合成された。ＰＰ１−ＣはNot Ｉ（制限箇所はBaiら（1988）が述べているように、停止コドンから約240塩基対下側であった）によって線形化された。ＤＨＦＲ（短い）とＤＨＦＲ（長い）の両方ともHind IIIで線形化された。転写された配列の３′未翻訳領域の影響も認められた。ＤＨＦＲ“Short”プラスミドは停止コドンと線形化のために用いられた制限箇所（Hind III）との間に165塩基対しか含んでいなかった。ＤＨＦＲ“long”プラスミドの方は、この３′未翻訳領域に350塩基対（全部で515）を有している。翻訳レベルが低いのは、プラスミドを分解させ、リボゾームフラクションにも存在している３′エグゾヌクレオリティック（Exonucleolytic）活性によるものかも知れない。実施例７本発明による方法は、真核生物から得られた無細胞抽出物を用いても実施することができる。Ｓ30かからＳ30抽出物（表III）のリボゾーム・フラクションか、あるいはウサギ網状赤血球溶解物（表IV）のいずれかから、蛋白質が合成された。結合転写／翻訳を実施するために用いられた小麦胚種は総量が50μｌで、25mM Hepes−ＫＯＨ（pH7.6）、2.4mM ＤＴＴ，0.1mMスペルミン、1.2mM ＡＴＰ，1. 0mM ＧＴＰ，0.8mM ＣＴＰ，0.8mM ＵＴＰ，1.0mM ＧＭＰ，６mM硫酸グレアチン、28Ｕクレアチンホスホキナーゼ、215μMの各アミノ酸（ロイシンを除く）、 15μｇ小麦胚種tＲＮＡ、112mM ＫＯＡｃ，４mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂、50Ｕヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制因子、0.1μｇの各プロターゼ抑制剤（アブロチニン、ロイペチン、およびペプスタチン）、２−2.2μｇのプラスミド、27Ｕ（−0.5μ ｇ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、40Ci/molに希釈された25μM［¹⁴Ｃ］ロイシン、 12μｌの小麦胚種Ｓ30または1.5Ａ₂₆₀単位のリボゾームで構成されていた。マイクロコッカルヌクレアーゼで措置したウサギ網状赤血球溶解物は、Pelh amおよびJackson（1976）Eur．J．Biochem．67：247−256の記載により調製された。４時間の超遠心分離を行った後、リボゾームを20mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5 ）、1.2mM ＭｇＣｌ₂，100mM ＫＣｌ、および１mM ＤＴＥに再懸濁させた。25μ ｌの反応混合物は約50％（V/V）のヌクレアーゼで処理した溶解物、あるいはその溶解物から分離された1.5Ａ₂₆₀単位のリボゾーム、および以下の濃度の添加物を含んでいた：10mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5）、1.0mM ＡＴＰ，0.8mM ＧＴＰ，ＣＴＰおよびＵＴＰ，５mM硫酸クレアチン、75μｇ/mlのグレアチンホスホキナーゼ、0.05mMのラベルしていない各アミノ酸（ロイシンを除く）、3.3mM ＭｇＣｌ₂，80mM ＫＣｌ，500単位/ml Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、15μｇ/mlプラスミドＤＮＡ、［¹⁴Ｃ］ロイシン（10−40Ci/mol）、50Ｕヒト胎盤リボヌタレアーゼ抑制剤。培養は35℃の温度で 30−60分間行われた。表IV 表IIIおよびIVの結果は、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚種から得られるリボゾームフラクションから合成される蛋白質の量がＳ30抽出物から合成される蛋白質と比較して、多少量的に少ないことを示している。しかしながら、本発明の方法では、いくつかの理由から真核システムでリボゾームフラクションを用いるのが望ましい。まず最初に、本発明による方法でリボゾームフラクションを用いると、蛋白質のイン・ビトロでの合成のための『よりクリーン』なシステムが提供される。つまり、そのシステムは蛋白質を含んだＳ30抽出物による汚染されていない。したがって、リボゾームフラクションの使用は、ＣＦＣＦシステムにおける本発明の方法を大幅に改善してくれる。第２に、この技術分野で通常の技術と経験を有する人であれば、真核生物からのリボゾームフラクションの使用における諸要素は合成される蛋白質の量によって変更可能であることはすぐ分かるであろう。実施例８『短い』ＤＨＦＲを含んでいるプラスミドは、以下の実験では切断されない形状で用いられた。結合転写／翻訳は静的システム内で¹⁴Ｃ−ロイシンの存在下で行われた。反応混合物のアリコットはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、その後のオートラジオグラフィーで分析された。別のアリコットは、翻訳生成物の酵素活性を判定するために用いられた。その結果を図２に示す。インサートは、オートラジオグラムで認められた唯一の放射活性帯としての全長生成物を示している。酵素活性はＮＡＤＰＨの酸化による、340nmでの吸光度の低下によって判定した。一定時間における翻訳生成物の酵素活性を図２に示す。他の実験から、インビトロで合成したＤＨＦＲの特異活性が約55単位/mg蛋白質程度と計算され、これは分離された均一なＤＨＦＲとほぼ同様である。背景ＤＨＦＲ活性は分画された転写／翻訳システムでは低く、それに対し元のＳ30抽出物では10倍も高かった。このレベルでは、インビトロで合成されたＤＨＦＲの酵素活性の測定は困難であった。これらの実験は30μｌの静的転写／翻訳システムで行われた。表Ｖは、インビトロで合成されたロダネーゼとＣＡＴの酵素活性に関するデータを示している。両方のケースで、蛋白質合成システムがそれぞれのアッセイに干渉するような活性を含んでいないことを示すために、バックグランド値を示してある。実施例９ＣＦＣＦシステム内での非線形化ＳＰ６プラスミドからのＤＨＦＲの合成を図３に示す。用いられたセルの反応室は、生成物および使われた反応物質が、通常 1.5ml/hrの速度でポンピングされ、ヌクレオチドトリホスフェート、アミノ酸、tＲＮＡ、および適切な濃度の塩を含む原料溶液と継続的に交換されるようになっている。反応混合物は体積が１mlであることを除けば、30 μｌ静的アッセイにおいて用いられたものと同じである。図３は、¹⁴Ｃ−ロイシンの総蛋白質への取り込みを基準として判断した場合、テストの全期間（22時間）を通じて蛋白質合成が継続されたことを示している。この期間に採取されたアリコットのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグラフィーによる分析を、図２のインサートＡおよびＢとして示す。このゲルをコオマシー（Coomassie）ブルー染色すると、リボゾームフラクション内に残留しているＳ30からの大腸菌蛋白質の高い割合が３時間の培養期間中に反応室から取り除かれる。オートラジオグラムでも分かる通り、その後の培養期間中にほとんど純粋な生成物が得られる。本発明は、蛋白質のリボゾーム性合成はＣＦＣＦシステム内でかなり長い培養期間中、リニヤーレイト（linear rate）線形速度での維持が可能であることを示している。本発明で行われているZubayによる古典的な大腸菌Ｓ30の修正は、静的システムとＣＦＣＦシステムのいずれでも結合転写／翻訳による遺伝子表現にとって２つの大きな利点を有している。Ｓ30の分画化によって、その後に行われる生成物の生成またはアッセイを複雑化してしまう大腸菌抽出物の可溶性成分の大部分を取り除いてくれる。また、転写または翻訳を直接抑制する可能性もある。分画されたシステムは、Ｓ30抽出物より粘性がかなり低い。この反応物混合物内の変性蛋白質による濁りは、ＣＦＣＦ反応室において長時間培養を行った後でも、分画されたシステムで大幅に低くなる。ＣＦＣＦシステムにおいては、変性蛋白質および分解した核酸によるメンブレンの詰まりも大幅に低下する。第２に、環状プラスミドによって、転写システムの安定性が大幅に向上する。プラスミドを線形化するために制限酵素を使用する必要性がなくなる。大腸菌から得られた結合システムはテストされた真核蛋白質に対してはうまく機能する。真核蛋白質にmＲＮＡ２をキャッピングすることは、大腸菌システムの場合には不必要なように思われる。さらに、真核細胞を含まないシステムは、小麦胚種抽出物あるいは網状赤血球溶解物からのリボゾームフラクションの分離によって同様の方法で調製することができる。つまり、これらの真核細胞から得られたリボゾームフラクション（表IIIおよびIV）は、結合転写／翻訳合成に必要なすべての必要成分を含んでいる。大腸菌から得られたシステムとは対照的に、真核細胞抽出物あるいはそれらから得られたリボゾーム・フラクションを用いることによって、反応混合物に直接添加したmＲＮＡによって、つまり、結合転写を行わなくても、効率的な翻訳ができる（表VI）。表VIの小麦胚種翻訳システムを用いる場合、反応混合物は総量で50μｌとして、25mM Hepes−ＫＯＨ（pH7.6）；2.4mM ＤＴＴ；0.1mMスペルミン、1.2mM ＡＴＰ，1.0mM ＧＴＰ；６mM硫酸クレアチン；28Ｕタレアチンホスホキナーゼ；25 uMアミノ酸（ロイシンを除く）；15μｇ小麦胚種tＲＮＡ、112mM ＫＣｌ；２mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂；２−2.5μｇ mＲＮＡ；および12μｌ小麦胚種Ｓ30または1.5 −1.7Ａ₂₆₀単位のリボゾームによって構成されている。培養は27℃の温度下で、 30分間行われた。表VIの網状赤血球転写システムを用いる場合、反応混合物は10mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5）；1.2mM ＭｇＣｌ₂；90mMＫＣｌ；５mM ＤＴＴ；0.5mM ＡＴＰ；0.2 mM ＧＴＰ；50μMの各アミノ酸（ロイシンを除く）；３mM硫酸クリアチン；0.2m g/mlクレアチンホスホキナーゼ；8.5pmol mＲＮＡ；12.5μｌ網状赤血球溶解物、あるいは1.7Ａ₂₆₀単位のリボゾームを含んでいる。培養は35℃の温度下、30分間行われた。 uMアミノ酸（ロイシンを除く）；15μｇ小麦胚種tＲＮＡ、112mM ＫＣｌ；２mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂；２−2.5μｇmＲＮＡ；および12μｌ小麦胚種Ｓ30または1.5− 1.7Ａ₂₆₀単位のリボゾームによって構成されている。培養は27℃の温度下で、30 分間行われた。表VIの網状赤血球転写システムを用いる場合、反応混合物は10mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5）；1.2mM ＭｇＣｌ₂；90mM ＫＣｌ；５mM ＤＴＴ；0.5mM ＡＴＰ；0. 2mM ＧＴＰ；50μMの各アミノ酸（ロイシンを除く）；３mM硫酸クリアチン；0.2 mg/mlクレアチンホスホキナーゼ；8.5pmol mＲＮＡ；12.5μｌ網状赤血球溶解物、あるいは1.7Ａ₂₆₀単位のリボゾームを含んでいる。培養は35℃の温度下、30分間行われた。訳はロダネーゼ・ポリペプチド類に限られていた。結合転写／翻訳のために非線形形態で用いられた場合は、このプラスミドからβ−ラクタマーゼを合成することができる。分析を目的として、ロダネーゼの合成は５mM Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃を含む30μｌの反応混合物内で行われた。大規模に調製するために、反応混合物は0.9mlに拡大された。これらの反応混合物は約60Ａ₂₆₀単位の未精製大腸菌リボゾームおよび約10 −15μｇの非線形化プラスミドを含んでいた。［¹⁴Ｃ］ロイシンは40Ci/molまたは160Ci/molで用いられた。培養は37℃の温度下で40分間行われた。ある実験（図４）では、放射性前駆物資として、予め付加されたホルミレート化［³⁵Ｓ］Ｍ et−tＲＮＡ_f（400Ci/mol）が用いられた。この場合、ギ酸は用いられなかった。培養後、反応混合物を結合転写／翻訳で用いられたのと同じ濃度の塩を含んだ 0.6ml緩衝蔗糖溶液に付加し、その後、Ti50ロータ（Beckman）で45,000rpmの回転速度で45分間遠心分離にかけた。遠心分離後、上澄液（0.9ml）を取り出し、蔗糖層を排除した後、同じ溶液でリボゾーム性ペレットをすすいだ後、その溶液内に再懸濁させた（この溶液は、60μｌの20mMトリス−ＨＣｌ、pH7.5，10mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂，30mM ＮＨ₄ＯＡｃ，１mM ＤＴＴ，５mM Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃で構成される溶液Ａ）。この上澄液から25μｌおよび再懸濁されたペレットから２μｌのアリコットを取り出して、蛋白質への［¹⁴Ｃ］ロイシンの取り込みの判定と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによる分析を行った。また、上澄液から15μｌおよびリボゾーム・フラクションから1.5μｌを取り出して、酵素活性の判定を行った。実例11 再懸濁させたリボゾームフラクションの活性化および／または結合ロダネーゼの放出について、以下の方法でテストを行った。30μｌの反応混合物、55mMトリスアセテート（pH7.8）、２mM ＤＴＴ，1.2mM ＡＴＰ，0.8mM ＧＴＰ，36mM ＮＨ₄ＯＡｃ、72mM ＫＯＡｃ、12mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂、２mM Ｃａ（ＯＡｃ）₂ 、５mM Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃，1.9％ポリエチレングリコール（Ｍ_r：6,000）、27mMエノルピルビン酸−２−リン酸塩（一価カリウム塩）、0.33mMグルコース−６−ホスフェート、0.5mM ＥＤＴＡ，0.3μｇピルビン酸キナーゼ、および３μｌの再懸濁させたリボゾームを含んでいた。シャペロン類あるいは抗生物質は以下のように添加された。GroEL−2.１μｇ、 GroES−0.8μｇ、Dnaｋ−1.5μｇ、DnaJ− 0.5μｇ，GrpE−１μｇ。仔ウシの肝臓から分離した自然のロダネーゼの特異酵素活性は684単位/mg蛋白質であった。培養は37℃の温度下で30分間行われ、次に同じサンプルを、エアフュージ（Beckman）内で、104,000rpmの回転速度で30分間遠心分離にかけた。遠心分離後、上澄液を慎重に取り出し、リボゾーム性ペレットをすすいだ後、30μｌの溶液Ａに再懸濁させた。この上澄液とリボゾーム・フラクションのアリコットをそれぞれ分析して、ロダネーゼの量については［¹⁴ Ｃ］ロイシンの蛋白質への取り込みを判定することによって、ローゼのサイズについてはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで、さらに酵素活性をそれぞれ求めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは12％ゲル内で実行された。乾燥されたゲルはハイパーフィルム（Amersham）に48時間程度露出した。ロダネーゼの酵素活性は、前に述べたのと同様の方法（Tsalkovaら、1993）によって判定された。基本的に、定量は生成物、チオシアネート、および鉄イオンとの間で形成される複合体からの460nm （＝4200）での吸光度によって行われた。酵素活性の１単位は、25℃で１分間あたりに形成される１μmolの生成物と定義された。培養は25℃で10分間行われた。活性化および放出についての分析、あるいはプラスミドを除外した結合転写／翻訳用の反応混合物を含んだブランクは、460nmで0.03−0.04の吸光度を示した。混合無水活性化法を用いて、予め、Ｎ−カルボベンゾキシフェニルアラニンをプロミシンアミノヌクレオシドと反応させることによって、プロミシンのフェニルアラニンアナログを作成した。フェニルアラニンのアミノ酸を保護するためにカルボベンゾキシではなくフルオレニルメチル−オキシカルボニル（ＦＭＯＣ）部を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて、更に後にカルボキシル基をサクシンイミジルエステルに転換することによって活性化させた。前に述べたのと同様の方法で（CarpinoおよびHan、1972，J．Org．Chem．37：3404 −3409）、（³Ｈ）−Ｌ−フェニルアラニンをＦＭＯＣ誘導体に転換した。最終的な生成物の純度は、クロロホルム：メタノール（９：１）のシリカゲルでの薄膜クロマトグラフィーによって約95％程度を推定された。この溶媒内の主要生成物のＲ_fは0.55程度で、プロミシンのそれとほぼ同じであり、プロミシンアミノヌクレオチドのそれのほぼ２倍であった。この生成物は274nmで最大吸光度を示し、プロミシンに対して認められたものと同じである。プロミシンについて報告されている分子死滅係数（molar extinctioncoefficient）を用いれば、生成物の収率は、フェニルアラニンをベースとして約50％であった。実例12 リボゾーム結合ロダネーゼは酵素的に不活性である。ロダネーゼを、上に述べた結合転写／翻訳によって無細胞システムで、大腸菌リボゾーム上で合成した。その結果を表VIIを示す。37℃で30分間培養を行った後、反応混合物のアリコットを取り出して、合成された蛋白質の量を定量すると同時に、その酵素活性の判定を行った。後者のパラメータは１分間あたりに形成されるチオシアネートのμmolを基準とした酵素単位で表現される。用いられた条件の下で、たったひとつだけの暗号配列，つまりロダネーゼに対するmＲＮＡだけがプラスミド（ｐＳＰ65）から転写された。プラスミドを取り除いた反応混合物内でのペプチドへの［¹⁴Ｃ］ロイシンの取り込みは、プラスミドの存在下での取り込みの５％以下であり、ブランクとして、差し引かれた。したがって、ロダネーゼのアミノ酸配列（１鎖あたり24のロイシン残基）、分子量（33,000）および全長生成物（上澄みフラクションのほぼ100％：図４）に関する知識に基づいて、合成された全長蛋白質の分子量が取り込まれた［¹⁴Ｃ］ロイシンから計算された。この値を用いて、ロダネーゼの酵素活性、酵素単位/m gを計算した。培養後、反応混合物を遠心分離にかけて、可溶性フラクションからリボゾームを分離した。ポリペプチド内に組み込まれた［¹⁴Ｃ］ロイシンの約50％がリボゾーム・フラクション内に回収された。上澄みフラクションでは、酵素活性のすべてが認められた。この上澄液フラクションの酵素活性はロダネーゼ１mgあたり56 4単位で（表VII Ａ、シャペロン蛋白質の添加なし）、予め他によって仔ウシ肝臓から分離された自然の酵素に対するものと同じ条件の下で判定された値（特異活性：684単位/mg）の82％であった。表VII Ａおよび図４は、新たに形成されたポリペプチドのほぼ半分が30分間培養した後、リボゾームと結合したままであった。この時間は用いられた条件の下でポリペプチドへのロイシンの線形的な取り込みの時期の終わりの頃であった。こうした結果は、それらリボゾーム上で見かけ上全長であるが、不活性なロダネーゼの蓄積が行われるのかどうかという問題を提起する。また、可溶性フラクション中に放出された全長ペブチド類の約15％程度は酵素的に不活性である。生成されたシャペロン類のシステムへの添加影響をテストし、表VII Ｂに示す結果が得られた。新たに形成された物質のより多くの部分（シャペロン類が添加されない場合の55％に比べて、76％）が可溶性フラクションに放出され、放出された物質（681単位/mg）の比活性は実験的には肝臓から分離されたロダネーゼのそれとほぼ等価であった。しかしながら、総合成量は、取り込まれたロイシンが98pmolから57pmolに減少した。上澄液と再懸濁されたリボゾームの両方で回収された新たに形成されたポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥと、オートジオグラフィーで分析した。図４は両方のフラクションとも、自然のロダネーゼ（Ｍｒ＝33,000）にほぼ対応するシングルバンドとして移行する新たに形成された物質のかなりの割合を含んでいることを示している。上澄液フラクションから得られたバンドの位置は仔ウシの肝臓から得られたロダネーゼとは区別できなかった。しかしながら、オートラジオグラムの結果では、リボゾームフラクションからの対応する、35,000分子量のポリペプシドに対応するバンドの移行速度はやや遅いことが示されている。新しく形成されたより短いペプチドの数は、リボゾームフラクションのレーンに認められた。そして、ゆっくり移動するバンドの部分をカウントして、リボゾームフラクション内に存在する取り込まれた［¹⁴Ｃ］ロイシンの60％程度を含んでいると判定された。残りの40％は多数のより小さなペプチド類の間に分散して存在しており、その一部は、かすかな、あるいは曖昧なバンドとして認めることができた。上澄液フラクションは、仔ウシの肝臓から分離されたロダネーゼではなく、ほとんど全長ロダネーゼのみを含んでいる。上澄液フラクションとリボゾームフラクションにおける全長ロダネーゼの移行速度になぜ違いがあるのかについては、分かっていない。自然のロダネーゼの処理、移送、および組み込みのためのＮ−端末単一シーケンスの取り出しはインビトロでは行われない。Ｎ−端末メチオニンがインビトロで加水分解されないということは、ラベルされたアミノ酸の唯一の供給源としての［³⁵Ｓ］fＭet−tＲＮＡからラベルされたポリペプチドが形成されたことによって確認された。（図４に比較のために示してある）結果は［¹⁴Ｃ］ロイシン−ラベルしたロダネーゼで得られた結果と同様であった。上澄液内で活性を示す、移行速度がより速い形状のロダネーゼはそのＮ−端末に［³⁵Ｓ］メチオニンを保持している。それは同じ電気泳動移動性を有しており、仔ウシの肝臓から分離された自然のロダネーゼのそれと比較して区別がつかなかった。図４に示されているサイズ上の違いを説明し得る恐らくは唯一の理由は、大腸菌における弱いターミネータであるＵＧＡが読み込まれたからであろう。ロダネーゼmＲＮＡのコード配列は、その後に13のコドンが続き、さらにイン−フェーズＵＡＧ−末端コドンが続いているＵＧＡ末端コドンを含んでいる。ここでは、ポリペプチドが大腸菌リボゾームから放出される際、16個のアミノ酸が蛋白質分解的に放出されるのではないかと想定する。実例13リボゾーム結合ロダネーゼの活性化添加シャペロン類（表VII Ａ参照）が存在しない条件の下で合成された反応混合物から遠心分離で分離されたリボゾームを、活性化プロセスを特徴づける目的で、蛋白質合成に必要な成分を欠いた第２の反応混合物内で培養した。培養後、これらの反応混合物を再び遠心分離にかけて、可溶性フラクションからリボゾームを分離した。上澄液フラクションでは、最初の培養後に観察されたすべての酵素活性が認められた。表VIIIに示されている明瞭な、しかし驚くべき結果は、シャペロン類がリボゾームに結合したポリペプチドの放出を促進し、活性酵素がこれら不活性ロダネーゼポリペプチドから発生できることを示している。すべての条件下で、ＡＴＰが存在しない場合、放出も活性化も遅い。これらシャペロン類のすべてが存在している下で放出される物質の特異酵素活性は、ほとんどすべてのロダネーゼ分子が酵素的に活性を持っていることを示している。遊離アミノ酸、tＲＮＡおよび活性化酵素とペプチド延長ファクターを含んでいる酵素フラクションは、この反応混合物には加えられなかった。これら構成要素の痕跡はリボゾームフラクション内に存在している可能性もあるが、ペプチド延長は第２の培養中観察できなかった。結合転写／翻訳（『方法』の項参照）後に分離されたリボゾーム性フラクション（３μｌ、蛋白質中に60pmol［¹⁴Ｃ］ロイシン）のアリコットを、示されている添加物を用いて（添加量は上に示す通り）と、同様に上に示した低分子量成分を用いて培養した。特に示してある場合、プロマイシンを１mM、そしてスパルソマイシンを４μM添加した。すべての混合物は、特に注記している場合を除いて、ＡＴＰとＧＴＰを含んでいた。この反応混合物には、アミノ酸を含む蛋白質合成に必要な他の化合物は加えられなかった。30分間培養した後、遠心分離で上澄液からリボゾームを分離した。上澄液内に放出されたロダネーゼの量とその酵素活性の判定を行った。個々のシャペロン類のテストは図５に示されているような異なった濃度と、表 VIIIに示されているような組み合わせで行った。ＧroＥＳまたはＤnaｋを用いた培養中、高い割合の全長ロダネーゼ分子がリボゾームから放出されて、より移行速度が速い形態に転化されたが、ＤnaＪはその放出を抑制した。しかしながら、ＧroＥＳまたはＤnaＫだけで放出された物質は、それが移行速度の速い形態であっても酵素的には不活性であった。したがって、活性化と、そして恐らくは自然の立体配座中への組み込みを遂行するために、すべてのシャペロン類が必要であった。図５に示されているすべての状況で、可溶性フラクション内の分子は図４との関連で述べたように、より移行速度の速い形態である。しかしながら、酵素活性はすべてのシャペロン類の存在下で培養されたアンブルでだけ検出された。したがって、移行速度が速いポリペプチド種の発生は酵素活性の発生とは関連性が認められなかった。上記条件のいずれにおいても移行速度の遅い種では酵素活性は観察されなかった。実例14プロマイシンおよびスパルソマイシンによる活性化の抑制本発明は、移行速度の遅い、見かけ上の全長のロダネーゼポリペプチドがなぜリボゾーム上に蓄積するのか、そして、それらがどのようにリボゾームと結合するのかなど、いくつかの問題を提起する。それらの放出には通常の末端が必要なのであろうか？翻訳がペプチド延長中に、放出コドンのすぐ前の休止部位で遅らせられるのであれば、それらはペプチジル−tＲＮＡとして存在するはずである。リボゾームのＰ部位にペプチドが存在しているのであれば、それらはＡ部位アミノアシル−tＲＮＡを模倣する抗生物質であるプロマイシンと反応して、ペプチジルトランスフェラーゼ反応中に純粋のペプチドと共有結合をする筈である。放出と活性化がペプチジルトランスフェラーゼ反応に依存しているのであれば、その場合、これらのプロセスは大型のリボゾームサブ単位と結合してこれらの反応を阻止するスパスロマイシンなどの抗生物質による抑制作用の影響を受ける筈である。放出および活性化に対するプロマイシンおよびスパスロマイシンの影響をテストしたところ、表VIIIに示す結果が得られた。ポリペプチドが結合したリボゾームを抗生物質と共に培養し、シャペロン類を時間的に遅らせて添加した場合とそうでない場合とに分け、さらに上に述べたような遠心分離にかけた。結合転写／翻訳後にリボゾームと共に分離されたロダネーゼポリペプチドの40 ％程度は、プロマイシンによって培養を行った後、可溶性フラクション内で分離された。放出された大型のポリペプチドは移行速度が速いタイプであったが、これらは酵素活性を有していなかった（表VIII）。リボゾーム・フラクションでは酵素活性は認められなかった。すべてのシャペロン類とＡＴＰとを用いて、放出されたポリペプチドをプロマイシンと共に更に培養したところ、活性酵素はつくりだされなかった。放射能でラベルしたプロマイシンの類似物を化学的に分析して（上記参照）、リボゾームに結合したぺプチドの反応性を直接調べた。³Ｈでラベルしたプロマイシンのペブチドへの取り込みについて判定し、上に述べた手順で平行サンプル内に取り込まれた放射性ロイシンから計算して、存在しているペブチドのモル量と比較した。最初の培養を行い、遠心分離で処理した後、リボゾームに結合した全長ポリペプチドの89％はプロマイシンとの反応性を示し、この物質はリボゾーム上ではペピチジル−tＲＮＡとして存在していた。プロマイシンとの反応後、可溶性フラグションにはこれらペプチドの36％だけが見いだされたが、これはプロマイシンを放出したポリペプチドが団粒化するのか、あるいは遠心分離中、リボゾームと結合したままであることを示している。プロマイシンで得られた結果とは対照的に、スパスロマイシンを用いた場合、放出はいちじるしく抑制された。この抗生物質が存在している場合、上澄液フラグション内では酵素活性は検出されず、すべてのシャペロン類とＡＴＰ（表VIII）の存在下で培養を行った後でも、リボゾームフラクション内のロダネーゼポリペプチドは酵素的に不活性なままであった。実例15シャペロン効果に対する温度の影響シャペロン類によるリボゾームに結合したロダネーゼの活性化および放出に関する温度上の必要条件を表IXに示す。４pmol程度のリボゾームに結合したロダネーゼを、シャペロン類の存在する条件と存在しない条件の両方で、非翻訳条件下で（ただしＡＴＰおよびＧＴＰの存在下で）総量30ul内で培養した。その後、これらの培養から得られた20ulのアリコットを用いて、酵素活性を判定した。ロダネーゼは上記の方法で判定した。添加されたシャペロンは以下の通りである：Ｄ naＪ＝１μｇ；ＤnaＫ＝２μｇ；ＧrpＥ＝1.5μｇ；ＧroＥＬ＝3.2μｇ；およびＧroＥＳ＝0.9μｇ。表IXが示すように、リボゾームをすべてのシャペロン類を用い、ＡＴＰの存在下で培養した場合だけ、活性化が起きる。そして、この反応には25℃あるいは37℃の温度が必要である。本発明は、新たに形成されるロダネーゼポリペプチドが組み込まれ、酵素活性的な状態に転化されるプロセスの少なくとも一部がリボゾーム上で起きることを示している。このプロセスには、５種類のシャペロン：ＤnaＫ，ＤnaＪ，ＧrpＥ，ＧroＥＬ、およびＧroＥＳと、ＡＴＰを必要とし、それが形成されるリボゾーム上でのペプチジル−tＲＮＡからの純粋な蛋白質の放出と一時的に関連性を持つ。プロマイシンとの反応は、リボゾームに結合した新たに形成されるペプチドはリボゾーム内の翻訳装置内のＰ部位にペプチジル−ｔＲＮＡとして存在している。スパスロマイシンによるその放出の抑制がこのことを裏づけており、ペプチジルトランスフェラーゼ反応が、十分に特徴づけが行われている放出ダクターによるコドン指示末端の場合と同様、その放出に関与していることを示している。リボゾームに結合した物質とそのプロマイシン放出対応物の両方が検出できるレベルの酵素活性を持っていないということは、組み込みおよび活性化プロセスの一部がリボゾーム上に蓄積される全長ポリペプチドによって遂行されるのではないことを示唆している。本発明は、その生成物の高い特異酵素活性が追加アミノ酸の取り込みなしで、転化シャペロンの存在下で放出されるという事実によって裏付けられている。したがって、本発明は、リボゾーム上での全長ポリペプチドの蓄積が酵素の最終的な組み込みおよび活性化に結合した終止および放出メカニズムの一部の失敗から発生するものであることを示している。ペブチド類の終止および放出は精製ＤnaＪの、ＡＴＰを含んだ反応システムへの添加によって抑制され、反対に、ＧroＥＳあるいはＤnaＫのいずれかは放出を促進したので、シャペロン類による組み込みの最後の段階とその上で形成されるリボゾームからの純粋な蛋白質の終止−放出との間には密接な関係が存在している。本明細書で触れたすべての特許および出版物は、本発明が関連する技術分野に通じている人々が理解できるレベルのものである。ここに取り上げたすべての特許および出版物は、各個々の出版物が個別、具体的に引例として組み入れられているのと同じレベルで、引例として組み入れられている。本発明がここに述べられている目的を達成し、また、ここに述べられている、またそれに本質的に関連している課題と利点を獲得するのによく適合していることは当業者なら、すぐ分かるであろう。ここに示されている実例は、その方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物は、現段階で好ましい実施例の代表的なものであり、例示として示されるものであって、本発明の範囲の限定を意図したものではない。特許請求の範囲に定義されるような精神内に含まれる技術分野に通じたものであれば、その変更や他の利用法は容易に想到するであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年９月６日【補正内容】１．無細胞抽出物を作成するステップと、該抽出物からリボゾームフラグションを分離するステップと、蛋白質および核酸を分解させる可溶性酵素を基本的に含んでいない該リボゾームフラグションを、転写／翻訳用培地の存在下で培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成される、無細胞蛋白質合成の効率の高い方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＵＳ (72)発明者クレイマー，ギーザラアメリカ合衆国 78756 テクサス，オースティン，ロウザヴァルトアヴァニユー 5404 (72)発明者ハーディスティ，ボイドアメリカ合衆国 78757 テクサス，オースティン，ハーバーヴィユロウド 1502

Claims

【特許請求の範囲】１．無細胞抽出物を調製するステップと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、転写／翻訳培地の存在下で、基本的に蛋白質および核酸を分解させない可溶性酵素を含まない該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成された、蛋白質の無細胞合成のための効率の高い方法。２．上記無細胞抽出物が大腸菌、小麦胚種および網状赤血球で構成されるグループから選択される請求項１の方法。３．該リボゾームフラクションが、遠心分離、およびゲルろ過クロマトグラフィーによって構成される方法によって該無細胞抽出物から分離されることを特徴とする請求項１の方法。４．該培地が結合転写／翻訳用培地であることを特徴とする請求項１の方法。５．該転写／翻訳用培地がプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシドトリフォスフェート、エネルギー再生システム、およびアミノ酸を緩衝食塩水内に含んでいることを特徴とする請求項４の方法。６．該プラスミドＤＮＡが線形化されていないことを特徴とする請求項５の方法。７．該培養が約37℃の温度下で30分間程度行われることを特徴とする請求項１の方法。８．該培地が翻訳用培地であることを特徴とする請求項１の方法。９．該翻訳用培地がmＲＮＡ，ＡＴＰ，ＧＴＰ，エネルギー再生システム、およびアミノ酸を緩衝食塩水内に含んでいることを特徴とする請求項８の方法。 10．該蛋白質が、トリクロロ酢酸沈殿とそれに続いて行われる蛋白質に取り込まれたアミノ酸の定量化、および硫酸ドデシルナトリウム−ポリアグリルアミドゲル電気泳動とそれに続いて行われるオートラジオグラフィーによって構成されるグループから選択される方法によって測定される請求項１の方法。 11．該蛋白質の自然の立体配座がその蛋白質の生物学的活性の測定によって判定される請求項１の方法。 12．該無細胞抽出物が初期ログフェーズで収穫された細胞から作成される請求項１の方法。 13．該培養混合物が継続流システムの一部であることを特徴とする請求項１の方法。 14．大腸菌から無細胞抽出物を作成するステップと、該抽出物から遠心分離によってリボゾームフラクションを分離するステップと、 55mMトリスーアセテート（pH7.8），14mM Ｍｇ（ＯＡｃ）₂，36mM ＮＨ₄ＯＡｃ，72mM ＫＯＡｃ，２mM Ｃａ（ＯＡｃ）₂，0.5mM ＥＤＴＡ，２％ポリエチレングリコール−6000，2mM ＤＴＴ，1.2mM ＡＴＰ，0.8mM ＧＴＰ，0.8mM ＵＴＰ，0.8mM ＣＴＰ，0.4mM ｃＡＭＰ，27mMエノルピルビン酸−２−リン酸塩、0.35μｇピルビン酸キナーゼ、１μ ｇホリン酸、83μｇ¹⁴Ｃ−ロイシン、他の19種類のアミノ酸のそれぞれを330μM ，20μｇの大腸菌tＲＮＡ、0.5μｇリファアムピシン、0.3mMグルコース−６− フォスフェート、1.2Ａ₂₆₀の大腸菌リボゾーム・フラクション、0.5μｇプラスミドＤＮＡ、および0.5μｇＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで構成される培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量およびその生物学的活性を測定するステップとで構成される、蛋白質無細胞合成のための効率の高い方法。 15．無細胞抽出物を作成するためのステップと、該抽出物からリボゾームフラクションを分離するステップと、シャペロン蛋白質類を含んでいる転写／翻訳用培地の存在下で該リボゾームフラクションを培養するステップと、そして合成された蛋白質の量を測定するステップとで構成される、蛋白質無細胞合成用の効率の高い方法。 16．該シャペロン類が、ＤnaＪ，ＤnaＫ，ＧrpＥ，ＧroＥＬ、およびＧroＥＳで構成されるグループから選択される請求項15の方法。 17．該翻訳用培地が、さらにシャペロン蛋白質を含んでいることを特徴とする請求項９の方法。 18．該シャペロン類がＤnaＪ，ＤnaＫ，ＧrpＥ，ＧroＥＬ、およびＧroＥＳで構成されるグループから選択される請求項17の方法。