JP2002335959A - フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法 - Google Patents
フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法Info
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 in vitro翻訳系での標的タンパク質の収量
を、標的タンパク質の凝集を防止することによって高め
ることである。 【解決手段】 フォールディング補助タンパク質をin v
itro翻訳系において共発現させることを特徴とする、in
vitro翻訳系での標的タンパク質の発現方法。
を、標的タンパク質の凝集を防止することによって高め
ることである。 【解決手段】 フォールディング補助タンパク質をin v
itro翻訳系において共発現させることを特徴とする、in
vitro翻訳系での標的タンパク質の発現方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フォールディング
補助タンパク質(folding helper protein)をin vitro翻
訳系において共発現させることを特徴とする、in vitro
翻訳系での標的タンパク質の発現方法に関するものであ
る。共発現されるフォールディング補助タンパク質は、
１以上の次のタンパク質クラス：Hsp70、Hsp60、Hsp9
0、Hsp100タンパク質のファミリー、小さい熱ショック
タンパク質のファミリー、およびイソメラーゼから選択
される。
補助タンパク質(folding helper protein)をin vitro翻
訳系において共発現させることを特徴とする、in vitro
翻訳系での標的タンパク質の発現方法に関するものであ
る。共発現されるフォールディング補助タンパク質は、
１以上の次のタンパク質クラス：Hsp70、Hsp60、Hsp9
0、Hsp100タンパク質のファミリー、小さい熱ショック
タンパク質のファミリー、およびイソメラーゼから選択
される。
【０００２】
【従来の技術】大きいオリゴマータンパク質のin vitro
フォールディング（折りたたみ）は、凝集が起こること
により損なわれる場合が多い(JaenickeおよびRudolph,
1986;Buchner, 1996; Jaenicke, 1997)。凝集は、正常
なフォールディングの他に取りえる経路であって、正し
いフォールディングおよび会合と競合する。凝集が起こ
る理由は、正しくない分子間相互作用が生じることにあ
る(Kiefhaberら, 1991)。これは最終的に不均一な凝集
体の形成へと至らせ、そこに含まれるポリペプチド鎖は
回復せずに失われる。望ましくない副反応としてのin v
itro凝集を、タンパク質濃度、溶媒条件、温度、イオン
強度などの物理化学的パラメーターによって最小限に抑
えることは可能である(JaenickeおよびRudolph, 1986;
Kiefhaberら, 1991; Buchner, 1996; Jaenicke, 199
7)。対照的に、in vivoにおいては、あらゆるタンパク
質の外部条件は一定である。大腸菌細胞は、１分あたり
約60000ものポリペプチド鎖を合成するという、極めて
速い合成速度であるにもかかわらず、見かけ上はほぼ10
0％のフォールディング収率を達成している(Lorimer, 1
996)。タンパク質の誤ったフォールディングや正しくな
い集合はin vivoでも起こるが(HurtleyおよびHelenius,
1989; Pelham, 1989; Heleniusら, 1992)、こうしたこ
とは数種類の内因性細胞因子によって最小限に抑えられ
ている。シャペロンや熱ショックタンパク質は非特異的
な凝集を防止しており(Buchnerら, 1996)、また、誤っ
て折りたたまれたタンパク質やフォールディングが遅す
ぎるタンパク質は分解される(GottesmanおよびMaurizi,
1992)。熱ショック欠損性大腸菌株に関する突然変異誘
発研究から、高い増殖温度ではいわゆる封入体が生じる
ことが示されている(Grangerovら, 1991)。この研究と
は別に、大腸菌での組換えタンパク質の過剰発現から生
じる封入体は、内因性の細胞熱ショックタンパク質を同
時に過剰発現させることで、効率的に抑制できることが
示された(Goloubinoffら, 1989; Daleら, 1994; Amrein
ら, 1995)。また、ミトコンドリアのような細胞区画へ
のタンパク質輸送も、細胞小器官（オルガネラ）に存在
する熱ショックタンパク質に依存している。こうした観
察に基づくと、タンパク質のフォールディングは、フォ
ールディング補助タンパク質により支援される自然の過
程であると見なすことができる(Horwichら, 1993; Hend
rickおよびHartl, 1993; GeorgopoulosおよびWelch, 19
93)。したがって、これらの内因性細胞因子間の正確な
相互作用は、正しくないフォールディング過程を減少さ
せて、ポリペプチドの正しいフォールディングを促進し
ている(Buchner, 1996; BeissingerおよびBuchner, 199
8; Hartl, 1998)。
フォールディング（折りたたみ）は、凝集が起こること
により損なわれる場合が多い(JaenickeおよびRudolph,
1986;Buchner, 1996; Jaenicke, 1997)。凝集は、正常
なフォールディングの他に取りえる経路であって、正し
いフォールディングおよび会合と競合する。凝集が起こ
る理由は、正しくない分子間相互作用が生じることにあ
る(Kiefhaberら, 1991)。これは最終的に不均一な凝集
体の形成へと至らせ、そこに含まれるポリペプチド鎖は
回復せずに失われる。望ましくない副反応としてのin v
itro凝集を、タンパク質濃度、溶媒条件、温度、イオン
強度などの物理化学的パラメーターによって最小限に抑
えることは可能である(JaenickeおよびRudolph, 1986;
Kiefhaberら, 1991; Buchner, 1996; Jaenicke, 199
7)。対照的に、in vivoにおいては、あらゆるタンパク
質の外部条件は一定である。大腸菌細胞は、１分あたり
約60000ものポリペプチド鎖を合成するという、極めて
速い合成速度であるにもかかわらず、見かけ上はほぼ10
0％のフォールディング収率を達成している(Lorimer, 1
996)。タンパク質の誤ったフォールディングや正しくな
い集合はin vivoでも起こるが(HurtleyおよびHelenius,
1989; Pelham, 1989; Heleniusら, 1992)、こうしたこ
とは数種類の内因性細胞因子によって最小限に抑えられ
ている。シャペロンや熱ショックタンパク質は非特異的
な凝集を防止しており(Buchnerら, 1996)、また、誤っ
て折りたたまれたタンパク質やフォールディングが遅す
ぎるタンパク質は分解される(GottesmanおよびMaurizi,
1992)。熱ショック欠損性大腸菌株に関する突然変異誘
発研究から、高い増殖温度ではいわゆる封入体が生じる
ことが示されている(Grangerovら, 1991)。この研究と
は別に、大腸菌での組換えタンパク質の過剰発現から生
じる封入体は、内因性の細胞熱ショックタンパク質を同
時に過剰発現させることで、効率的に抑制できることが
示された(Goloubinoffら, 1989; Daleら, 1994; Amrein
ら, 1995)。また、ミトコンドリアのような細胞区画へ
のタンパク質輸送も、細胞小器官（オルガネラ）に存在
する熱ショックタンパク質に依存している。こうした観
察に基づくと、タンパク質のフォールディングは、フォ
ールディング補助タンパク質により支援される自然の過
程であると見なすことができる(Horwichら, 1993; Hend
rickおよびHartl, 1993; GeorgopoulosおよびWelch, 19
93)。したがって、これらの内因性細胞因子間の正確な
相互作用は、正しくないフォールディング過程を減少さ
せて、ポリペプチドの正しいフォールディングを促進し
ている(Buchner, 1996; BeissingerおよびBuchner, 199
8; Hartl, 1998)。
【０００３】in vitroおよびin vivoフォールディング
間のもう一つの重要な相違点は、細胞内のタンパク質が
そのＮ末端からＣ末端の方向で折りたたまれるという点
である(BergmanおよびKuhl, 1979; Braakmanら, 199
1)。この過程は翻訳またはトランスロケーションの間に
起こる。構造体の形成は、ポリペプチドがまだリボソー
ムに存在している間またはトランスロケーションの間に
すでに始まっている。このことはまた、ポリペプチドの
一部の疎水性領域および他の潜在的相互作用領域が、ま
だ合成されていないそれらの相互作用パートナーを待た
ねばならないことを意味している。しかしながら、この
合成過程で不適切な相互作用（特定の条件下でのみ逆方
向に進行させることができる）が起こって、凝集反応へ
と至らせることがある。一方、免疫グロブリン、血清ア
ルブミン、および赤血球凝集素においては、この状態で
すでにジスルフィド橋を検出することができる(Bergman
およびKuhl, 1979; Peters & Davidson, 1982; Braakma
nら, 1991)。Hsp70シャペロンファミリーのフォールデ
ィング補助タンパク質は、リボソーム上での翻訳中に未
完成のポリペプチド鎖とすでに相互作用しうることが示
されている(Egersら,1997; Frydmanら, 1994; Hansen
ら, 1994; Welchら, 1997)。サイトゾルで合成されたポ
リペプチド鎖のミトコンドリアへの輸送のような他の過
程も、多くがフォールディング補助タンパク質に依存し
ている(DekkerおよびPfanner, 1999)。これに関連し
て、タンパク質は線状の折りたたまれていない状態でミ
トコンドリア膜の一方または両方を通って輸送される。
この過程では、分子シャペロンが、サイトゾル側のミト
コンドリア膜上での折りたたまれていない状態のアンフ
ォールディング(unfolding)と安定化に、また、ミトコ
ンドリア内への輸送とミトコンドリア内でのフォールデ
ィングに関与している。
間のもう一つの重要な相違点は、細胞内のタンパク質が
そのＮ末端からＣ末端の方向で折りたたまれるという点
である(BergmanおよびKuhl, 1979; Braakmanら, 199
1)。この過程は翻訳またはトランスロケーションの間に
起こる。構造体の形成は、ポリペプチドがまだリボソー
ムに存在している間またはトランスロケーションの間に
すでに始まっている。このことはまた、ポリペプチドの
一部の疎水性領域および他の潜在的相互作用領域が、ま
だ合成されていないそれらの相互作用パートナーを待た
ねばならないことを意味している。しかしながら、この
合成過程で不適切な相互作用（特定の条件下でのみ逆方
向に進行させることができる）が起こって、凝集反応へ
と至らせることがある。一方、免疫グロブリン、血清ア
ルブミン、および赤血球凝集素においては、この状態で
すでにジスルフィド橋を検出することができる(Bergman
およびKuhl, 1979; Peters & Davidson, 1982; Braakma
nら, 1991)。Hsp70シャペロンファミリーのフォールデ
ィング補助タンパク質は、リボソーム上での翻訳中に未
完成のポリペプチド鎖とすでに相互作用しうることが示
されている(Egersら,1997; Frydmanら, 1994; Hansen
ら, 1994; Welchら, 1997)。サイトゾルで合成されたポ
リペプチド鎖のミトコンドリアへの輸送のような他の過
程も、多くがフォールディング補助タンパク質に依存し
ている(DekkerおよびPfanner, 1999)。これに関連し
て、タンパク質は線状の折りたたまれていない状態でミ
トコンドリア膜の一方または両方を通って輸送される。
この過程では、分子シャペロンが、サイトゾル側のミト
コンドリア膜上での折りたたまれていない状態のアンフ
ォールディング(unfolding)と安定化に、また、ミトコ
ンドリア内への輸送とミトコンドリア内でのフォールデ
ィングに関与している。
【０００４】in vitroフォールディングの場合には、特
に、ジスルフィド橋の形成と異性化およびプロリンのシ
ス／トランス異性化がフォールディングの律速段階とな
る。フォールディングのこうした律速段階は細胞内では
フォールディング補助因子により触媒されている。PDI
やDsbAのようなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
は、酸化還元条件に応じて、ポリペプチドのシステイン
およびジスルフィドの酸化還元反応を加速する(Wunderl
ichおよびGlockshuber, 1993; Bardwell, 1997)。この
フォールディング段階の加速により、フォールディング
過程における中間体の濃度が低下する。このことは濃度
に依存した凝集を低減させて、フォールディング収率を
高める(WeissmanおよびKim, 1993; Lillieら, 1994)。
ペプチジル-プロリル-シス／トランス-イソメラーゼ(PP
I)は、ポリペプチド鎖中のプロリン残基の前にあるペプ
チド結合に関する配置のシス／トランス異性化を触媒す
る。天然タンパク質中の他の全てのペプチド結合とは対
照的に、これらはシス立体配置で存在することができる
(Schmid, 1997)。
に、ジスルフィド橋の形成と異性化およびプロリンのシ
ス／トランス異性化がフォールディングの律速段階とな
る。フォールディングのこうした律速段階は細胞内では
フォールディング補助因子により触媒されている。PDI
やDsbAのようなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
は、酸化還元条件に応じて、ポリペプチドのシステイン
およびジスルフィドの酸化還元反応を加速する(Wunderl
ichおよびGlockshuber, 1993; Bardwell, 1997)。この
フォールディング段階の加速により、フォールディング
過程における中間体の濃度が低下する。このことは濃度
に依存した凝集を低減させて、フォールディング収率を
高める(WeissmanおよびKim, 1993; Lillieら, 1994)。
ペプチジル-プロリル-シス／トランス-イソメラーゼ(PP
I)は、ポリペプチド鎖中のプロリン残基の前にあるペプ
チド結合に関する配置のシス／トランス異性化を触媒す
る。天然タンパク質中の他の全てのペプチド結合とは対
照的に、これらはシス立体配置で存在することができる
(Schmid, 1997)。
【０００５】in vitro翻訳系でしばしば用いられる大腸
菌溶解物は、タンパク質のフォールディングに最も適し
た天然の系である。しかし、機能性の細胞とは相違し
て、必要とされるシャペロンの量が翻訳装置の合成出力
に自動的に適応することがない。その結果、多くの場
合、フォールディング機構の過負荷により標的タンパク
質の凝集が生じる。標的タンパク質の如何により、この
非効率的フォールディングにはフォールディング機構の
様々な成分が関与している。
菌溶解物は、タンパク質のフォールディングに最も適し
た天然の系である。しかし、機能性の細胞とは相違し
て、必要とされるシャペロンの量が翻訳装置の合成出力
に自動的に適応することがない。その結果、多くの場
合、フォールディング機構の過負荷により標的タンパク
質の凝集が生じる。標的タンパク質の如何により、この
非効率的フォールディングにはフォールディング機構の
様々な成分が関与している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、in v
itro翻訳系で必要とされるシャペロンを十分な量で供給
することにより、標的タンパク質の凝集を防止すること
によってin vitro翻訳系での標的タンパク質の収量を高
めることである。これは同時にin vitro翻訳系の効率を
向上させるにちがいない。
itro翻訳系で必要とされるシャペロンを十分な量で供給
することにより、標的タンパク質の凝集を防止すること
によってin vitro翻訳系での標的タンパク質の収量を高
めることである。これは同時にin vitro翻訳系の効率を
向上させるにちがいない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明に従
って、フォールディング補助タンパク質をin vitro翻訳
系において共発現させることを特徴とする、in vitro翻
訳系での標的タンパク質の発現方法により解決される。
共発現されるフォールディング補助タンパク質は、１以
上の次のタンパク質クラス：Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp
100タンパク質のファミリー、小さい熱ショックタンパ
ク質のファミリー、およびイソメラーゼから選択され
る。
って、フォールディング補助タンパク質をin vitro翻訳
系において共発現させることを特徴とする、in vitro翻
訳系での標的タンパク質の発現方法により解決される。
共発現されるフォールディング補助タンパク質は、１以
上の次のタンパク質クラス：Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp
100タンパク質のファミリー、小さい熱ショックタンパ
ク質のファミリー、およびイソメラーゼから選択され
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】分子シャペロンは、フォールディ
ングを支援するタンパク質の最大のグループであり、本
発明では、フォールディング補助タンパク質と呼ぶこと
にする(GethingおよびSambrook, 1992; Hartl, 1996; B
uchner, 1996; BeissingerおよびBuchner, 1998)。分子
シャペロンはストレス条件下で過剰発現されるため、大
部分は熱ショックタンパク質のグループに含めることが
でき(GeorgopolousおよびWelch, 1993; Buchner, 199
6)、このグループも本発明ではフォールディング補助タ
ンパク質と呼ばれる。
ングを支援するタンパク質の最大のグループであり、本
発明では、フォールディング補助タンパク質と呼ぶこと
にする(GethingおよびSambrook, 1992; Hartl, 1996; B
uchner, 1996; BeissingerおよびBuchner, 1998)。分子
シャペロンはストレス条件下で過剰発現されるため、大
部分は熱ショックタンパク質のグループに含めることが
でき(GeorgopolousおよびWelch, 1993; Buchner, 199
6)、このグループも本発明ではフォールディング補助タ
ンパク質と呼ばれる。
【０００９】本発明に含まれる重要なフォールディング
補助タンパク質については、以下で詳細に説明する。分
子シャペロンのグループは、配列相同性と分子量に基づ
いて、５つの非関連タンパク質クラス、すなわち、Hsp6
0、Hsp70、Hsp90、Hsp100タンパク質のファミリー、お
よび小さい熱ショックタンパク質のファミリーに分類す
ることができる(GethingおよびSambrook, 1992; Hendri
ckおよびHartl, 1993)。
補助タンパク質については、以下で詳細に説明する。分
子シャペロンのグループは、配列相同性と分子量に基づ
いて、５つの非関連タンパク質クラス、すなわち、Hsp6
0、Hsp70、Hsp90、Hsp100タンパク質のファミリー、お
よび小さい熱ショックタンパク質のファミリーに分類す
ることができる(GethingおよびSambrook, 1992; Hendri
ckおよびHartl, 1993)。
【００１０】Hsp60 分子全体にわたって最も研究されているシャペロンはGr
oELであって、これは大腸菌由来のHsp60ファミリーのメ
ンバーである。Hsp60ファミリーのメンバーはシャペロ
ニンとも呼ばれており、２つのグループに大別される。
GroELとそのコシャペロンであるGroES、ならびに他の細
菌、ミトコンドリア、葉緑体由来のその高度に相同性の
類縁体が、グループＩシャペロニンを形成している(Sig
lerら,1998; FentonおよびHorwich, 1994)。真核細胞の
サイトゾル由来のHsp60タンパク質は、古細胞由来のも
のと共に、グループIIシャペロニンを形成している(Gut
scheら, 1999)。両グループのHsp60タンパク質は同様の
オリゴマー構造をしている。GroELと他のグループＩシ
ャペロニンの場合には、14のGroELサブユニットが会合
して２つの七量体の環から成る円筒構造を形成してお
り、一方、古細胞由来のグループIIシャペロニンの七量
体環構造は通常２つの異なるサブユニットから構成され
ている。対照的に、真核細胞のサイトゾルからのグルー
プIIシャペロニンのメンバー（例えば、酵母由来のCCT
複合体）は、正確に規定された組織機構を有する８つの
異なるサブユニットから構成されている(LiouおよびWil
lison, 1997)。未完成の非天然(non-native)タンパク質
はこの円筒構造体の中心腔にインターカレートして、そ
こに結合することができる。また、コシャペロンである
GroESも七量体の環を形成し、この形態でGroEL円筒構造
体の極(pole)に結合する。しかし、このGroES結合は基
質結合をそのサイズ10〜55kDaに応じて制限している(Ew
altら, 1997)。かかる基質結合はATP結合と加水分解に
よって調節されている。
oELであって、これは大腸菌由来のHsp60ファミリーのメ
ンバーである。Hsp60ファミリーのメンバーはシャペロ
ニンとも呼ばれており、２つのグループに大別される。
GroELとそのコシャペロンであるGroES、ならびに他の細
菌、ミトコンドリア、葉緑体由来のその高度に相同性の
類縁体が、グループＩシャペロニンを形成している(Sig
lerら,1998; FentonおよびHorwich, 1994)。真核細胞の
サイトゾル由来のHsp60タンパク質は、古細胞由来のも
のと共に、グループIIシャペロニンを形成している(Gut
scheら, 1999)。両グループのHsp60タンパク質は同様の
オリゴマー構造をしている。GroELと他のグループＩシ
ャペロニンの場合には、14のGroELサブユニットが会合
して２つの七量体の環から成る円筒構造を形成してお
り、一方、古細胞由来のグループIIシャペロニンの七量
体環構造は通常２つの異なるサブユニットから構成され
ている。対照的に、真核細胞のサイトゾルからのグルー
プIIシャペロニンのメンバー（例えば、酵母由来のCCT
複合体）は、正確に規定された組織機構を有する８つの
異なるサブユニットから構成されている(LiouおよびWil
lison, 1997)。未完成の非天然(non-native)タンパク質
はこの円筒構造体の中心腔にインターカレートして、そ
こに結合することができる。また、コシャペロンである
GroESも七量体の環を形成し、この形態でGroEL円筒構造
体の極(pole)に結合する。しかし、このGroES結合は基
質結合をそのサイズ10〜55kDaに応じて制限している(Ew
altら, 1997)。かかる基質結合はATP結合と加水分解に
よって調節されている。
【００１１】Hsp70 Hsp60ファミリーのメンバーに加えて、Hsp70タンパク質
も未完成のポリペプチド鎖と結合する(Beckmanら, 199
0; Welchら, 1997)。通常は、真核細胞のみならず原核
細胞にも、構成的に発現していてストレスで誘導される
Hsp70ファミリーのメンバーが数種類存在している(Vick
eryら, 1997; Welchら, 1997)。これらのタンパク質
は、リボソーム上でタンパク質のフォールディングに直
接係わっていることのほかに、細胞および細胞小器官の
膜からのタンパク質のトランスロケーションにも関与し
ている(Schatz & Doberstein, 1996)。タンパク質は折
りたたまれていない状態または部分的に折りたたまれた
状態でしか膜を通って輸送され得ないことが示されてい
る(Hannavyら, 1993)。細胞小器官でのトランスロケー
ション過程の間、サイトゾル側でのアンフォールディン
グと安定化に、そして細胞小器官側でのリフォールディ
ングに関与しているのは、とりわけ、Hsp70ファミリー
のメンバーである(HaukeおよびSchatz, 1997)。これら
の全過程において、Hsp70タンパク質が機能するには、H
sp70のATPアーゼ活性が不可欠である。Hsp70系の特徴は
コシャペロン(Hsp40; DnaJ)による該活性の制御であ
り、ここで、基質結合および放出の平衡は、ATPアーゼ
活性の特異的モジュレーションによって影響されている
(BukauおよびHorwich, 1998)。
も未完成のポリペプチド鎖と結合する(Beckmanら, 199
0; Welchら, 1997)。通常は、真核細胞のみならず原核
細胞にも、構成的に発現していてストレスで誘導される
Hsp70ファミリーのメンバーが数種類存在している(Vick
eryら, 1997; Welchら, 1997)。これらのタンパク質
は、リボソーム上でタンパク質のフォールディングに直
接係わっていることのほかに、細胞および細胞小器官の
膜からのタンパク質のトランスロケーションにも関与し
ている(Schatz & Doberstein, 1996)。タンパク質は折
りたたまれていない状態または部分的に折りたたまれた
状態でしか膜を通って輸送され得ないことが示されてい
る(Hannavyら, 1993)。細胞小器官でのトランスロケー
ション過程の間、サイトゾル側でのアンフォールディン
グと安定化に、そして細胞小器官側でのリフォールディ
ングに関与しているのは、とりわけ、Hsp70ファミリー
のメンバーである(HaukeおよびSchatz, 1997)。これら
の全過程において、Hsp70タンパク質が機能するには、H
sp70のATPアーゼ活性が不可欠である。Hsp70系の特徴は
コシャペロン(Hsp40; DnaJ)による該活性の制御であ
り、ここで、基質結合および放出の平衡は、ATPアーゼ
活性の特異的モジュレーションによって影響されている
(BukauおよびHorwich, 1998)。
【００１２】Hsp90 真核細胞のサイトゾル中に存在する可溶性タンパク質の
約１％はHsp90であり、したがって、Hsp90は最も高度に
発現しているタンパク質の一つである(WelchおよびFera
misco, 1982)。このファミリーのメンバーは主としてマ
ルチマー複合体の形で作用し、それらは天然タンパク質
と類似した構造をもつ多数の重要なシグナル伝達タンパ
ク質を認識する。Hsp90とそのパートナータンパク質と
の結合はそれらの構造を安定化させ、ひいてはリガンド
のシグナルタンパク質への結合を促進する。このように
して、基質はそれらの活性なコンホメーションを達成す
ることができる(Sullivanら, 1997; Bohenら, 1995; Bu
chner, 1999)。
約１％はHsp90であり、したがって、Hsp90は最も高度に
発現しているタンパク質の一つである(WelchおよびFera
misco, 1982)。このファミリーのメンバーは主としてマ
ルチマー複合体の形で作用し、それらは天然タンパク質
と類似した構造をもつ多数の重要なシグナル伝達タンパ
ク質を認識する。Hsp90とそのパートナータンパク質と
の結合はそれらの構造を安定化させ、ひいてはリガンド
のシグナルタンパク質への結合を促進する。このように
して、基質はそれらの活性なコンホメーションを達成す
ることができる(Sullivanら, 1997; Bohenら, 1995; Bu
chner, 1999)。
【００１３】Hsp100 最近、Hsp100シャペロンは、Hsp70シャペロンと共同し
て、すでに形成された凝集物を解離するその能力によっ
て、特に区別されている(Parsellら, 1994; Goloubinof
fら, 1999; Mogkら, 1999)。それらの主な機能は耐熱性
の媒介であるように見えるが(Schirmerら, 1994; Kruge
rら, 1994)、ClpAやClpBのような一部のメンバーは、プ
ロテアーゼサブユニットClpPと一緒になって、タンパク
質の加水分解を媒介している(Gottesmanら, 1997)。
て、すでに形成された凝集物を解離するその能力によっ
て、特に区別されている(Parsellら, 1994; Goloubinof
fら, 1999; Mogkら, 1999)。それらの主な機能は耐熱性
の媒介であるように見えるが(Schirmerら, 1994; Kruge
rら, 1994)、ClpAやClpBのような一部のメンバーは、プ
ロテアーゼサブユニットClpPと一緒になって、タンパク
質の加水分解を媒介している(Gottesmanら, 1997)。
【００１４】sHsp シャペロンの５番目のクラスにあたる、小さい熱ショッ
クタンパク質(sHsp)は、ほとんど全ての生物に見られる
熱ショックタンパク質の非常に分岐したファミリーであ
る。このファミリーのシャペロンをこのように名付けて
いる理由は、それらの分子量が15〜40kDaという比較的
小さな単量体の分子量であることにある。しかし、通
常、sHspは最大50のサブユニットを含む高オリゴマー複
合体として細胞中に存在しており、かかる複合体は125k
Da〜2Mdaの分子量をもつことが観察されている(Spector
ら, 1971; Arrigoら, 1988; Andreasi-Bassiら, 1995;
Ehrnspergerら, 1997)。他のシャペロンと同様に、sHsp
はin vitroでタンパク質の凝集を抑制することができる
(Horwitz, 1992; Jakobら, 1993; Merckら, 1993; Jako
bおよびBuchner, 1994; Leeら, 1995; Ehrnspergerら,
1997b)。この過程において、sHspはサブユニットあたり
１つまでの基質分子を結合し、それゆえ、モデルシャペ
ロンGroELよりも効率がよい(JaenickeおよびCreighton,
1993; GaneaおよびHarding, 1995; Leeら, 1997; Ehrn
spergerら, 1998a)。ストレス条件のもとでは、未完成
非天然タンパク質のsHspへの結合が該タンパク質の不可
逆的な凝集を防止している。sHspへの結合によって、タ
ンパク質は可溶性のフォールディング適格状態に保持さ
れる。生理的条件を元にもどすと、非天然タンパク質
は、Hsp70のようなATP依存性シャペロンによりsHspとの
複合体から分離され、再活性化される。
クタンパク質(sHsp)は、ほとんど全ての生物に見られる
熱ショックタンパク質の非常に分岐したファミリーであ
る。このファミリーのシャペロンをこのように名付けて
いる理由は、それらの分子量が15〜40kDaという比較的
小さな単量体の分子量であることにある。しかし、通
常、sHspは最大50のサブユニットを含む高オリゴマー複
合体として細胞中に存在しており、かかる複合体は125k
Da〜2Mdaの分子量をもつことが観察されている(Spector
ら, 1971; Arrigoら, 1988; Andreasi-Bassiら, 1995;
Ehrnspergerら, 1997)。他のシャペロンと同様に、sHsp
はin vitroでタンパク質の凝集を抑制することができる
(Horwitz, 1992; Jakobら, 1993; Merckら, 1993; Jako
bおよびBuchner, 1994; Leeら, 1995; Ehrnspergerら,
1997b)。この過程において、sHspはサブユニットあたり
１つまでの基質分子を結合し、それゆえ、モデルシャペ
ロンGroELよりも効率がよい(JaenickeおよびCreighton,
1993; GaneaおよびHarding, 1995; Leeら, 1997; Ehrn
spergerら, 1998a)。ストレス条件のもとでは、未完成
非天然タンパク質のsHspへの結合が該タンパク質の不可
逆的な凝集を防止している。sHspへの結合によって、タ
ンパク質は可溶性のフォールディング適格状態に保持さ
れる。生理的条件を元にもどすと、非天然タンパク質
は、Hsp70のようなATP依存性シャペロンによりsHspとの
複合体から分離され、再活性化される。
【００１５】イソメラーゼ 本発明の方法のためのイソメラーゼとしては、例えば、
ペプチジル-プロリル-シス／トランス-イソメラーゼの
クラスからのフォールディング触媒、およびジスルフィ
ドイソメラーゼのメンバーが考えられる。
ペプチジル-プロリル-シス／トランス-イソメラーゼの
クラスからのフォールディング触媒、およびジスルフィ
ドイソメラーゼのメンバーが考えられる。
【００１６】また、上記のフォールディング補助タンパ
ク質と同じ様式または類似した様式で機能するフォール
ディング補助タンパク質も、本発明において使用するこ
とができる。
ク質と同じ様式または類似した様式で機能するフォール
ディング補助タンパク質も、本発明において使用するこ
とができる。
【００１７】本発明によれば、共発現されるフォールデ
ィング補助タンパク質はHsp60タンパク質ファミリーの
メンバーであることが好適である。さらに、コシャペロ
ン(co-chaperone)を追加的に共発現させることが好まし
い。本発明の方法に従うと、フォールディング補助タン
パク質としてHsp60を、コシャペロンとしてHsp10を共発
現させることが特に好適である。共発現されるフォール
ディング補助タンパク質はGroELであることが特に好ま
しい。GroEL/GroESを共発現させる方法が最も有利であ
る。
ィング補助タンパク質はHsp60タンパク質ファミリーの
メンバーであることが好適である。さらに、コシャペロ
ン(co-chaperone)を追加的に共発現させることが好まし
い。本発明の方法に従うと、フォールディング補助タン
パク質としてHsp60を、コシャペロンとしてHsp10を共発
現させることが特に好適である。共発現されるフォール
ディング補助タンパク質はGroELであることが特に好ま
しい。GroEL/GroESを共発現させる方法が最も有利であ
る。
【００１８】本方法の別の好ましい実施形態は、共発現
されるフォールディング補助タンパク質がHsp70タンパ
ク質ファミリーのメンバーであるものである。さらに、
コシャペロンを追加的に共発現させることが好ましい。
この実施形態において、共発現されるフォールディング
補助タンパク質は、ヒトHsp70タンパク質であることが
特に好適である。とりわけ、フォールディング補助タン
パク質としてHsp70を、コシャペロンとしてHsp40を共発
現させることが好適である。本発明の方法に従うと、こ
の実施形態ではヒト由来のHsp70とHdj1（ヒト由来のHsp
40）を共発現させることが最も有利である。
されるフォールディング補助タンパク質がHsp70タンパ
ク質ファミリーのメンバーであるものである。さらに、
コシャペロンを追加的に共発現させることが好ましい。
この実施形態において、共発現されるフォールディング
補助タンパク質は、ヒトHsp70タンパク質であることが
特に好適である。とりわけ、フォールディング補助タン
パク質としてHsp70を、コシャペロンとしてHsp40を共発
現させることが好適である。本発明の方法に従うと、こ
の実施形態ではヒト由来のHsp70とHdj1（ヒト由来のHsp
40）を共発現させることが最も有利である。
【００１９】本発明によれば、標的タンパク質はあらゆ
るタイプの原核生物および真核生物のタンパク質であっ
てよく、古細菌のタンパク質であってもよい。分泌タン
パク質と膜タンパク質をin vitro転写／翻訳系で発現さ
せることは、特にフォールディング補助タンパク質が十
分な量で存在しない場合、これまで問題が多かった。リ
ポタンパク質および膜タンパク質の成功した発現が先行
技術に報じられているが、相当の制限を受けるものであ
る(HuppaおよびPloegh, 1997; Falkら, 1997)。本発明
による方法は特に、リポタンパク質、膜タンパク質およ
び分泌タンパク質を標的タンパク質として発現させるこ
とに適している。なぜなら、フォールディング補助タン
パク質を、共発現によって十分な量で供給できるからで
ある。
るタイプの原核生物および真核生物のタンパク質であっ
てよく、古細菌のタンパク質であってもよい。分泌タン
パク質と膜タンパク質をin vitro転写／翻訳系で発現さ
せることは、特にフォールディング補助タンパク質が十
分な量で存在しない場合、これまで問題が多かった。リ
ポタンパク質および膜タンパク質の成功した発現が先行
技術に報じられているが、相当の制限を受けるものであ
る(HuppaおよびPloegh, 1997; Falkら, 1997)。本発明
による方法は特に、リポタンパク質、膜タンパク質およ
び分泌タンパク質を標的タンパク質として発現させるこ
とに適している。なぜなら、フォールディング補助タン
パク質を、共発現によって十分な量で供給できるからで
ある。
【００２０】本発明による方法の効果は、特に、in vit
ro転写／翻訳系での標的タンパク質の体積収量の増加が
調製的規模で起こることである。
ro転写／翻訳系での標的タンパク質の体積収量の増加が
調製的規模で起こることである。
【００２１】本発明の基礎でありうるin vitro翻訳系、
特に共役したin vitro転写／翻訳系については、以下で
より詳細に説明する。現在、最も効率のよい系は、大腸
菌、ウサギ網状赤血球、またはコムギ胚芽溶解物に基づ
くものである(Spirin, 1990;StiegeおよびErdman, 199
5)。通常、それらは反応体積が限定されたバッチ式反応
系として使用される。大腸菌に基づく反応系は24〜38℃
の温度範囲で使用できる。これらのバッチ法では通常、
大腸菌溶解物の30S上清を用いるが、かかる上清は内因
性mRNAの含有量が高いため、それをin vitro翻訳系で使
用する前にRNアーゼで処理する必要がある(Zubay, 197
3)。コムギ胚芽溶解物に基づく反応系は通常、20〜27℃
の温度範囲で使用できるにすぎないが(Tulinら, 199
5)、内因性mRNAのレベルが低いため、外因性の発現鋳型
を発現させるために直接使用できるという点で、大腸菌
溶解物に比して利点がある。網状赤血球溶解物は、内因
性mRNAをRNアーゼ処理により除去した貧血ウサギ血液の
直接溶解により調製される。通常、これらの系は30〜38
℃の温度範囲で使用する(PelhamおよびJackson, 197
6)。しかし、実施温度は翻訳過程に影響を及ぼすだけで
なく、標的タンパク質のフォールディングがそれぞれの
実施温度に大きく左右されることに留意すべきである。
特に共役したin vitro転写／翻訳系については、以下で
より詳細に説明する。現在、最も効率のよい系は、大腸
菌、ウサギ網状赤血球、またはコムギ胚芽溶解物に基づ
くものである(Spirin, 1990;StiegeおよびErdman, 199
5)。通常、それらは反応体積が限定されたバッチ式反応
系として使用される。大腸菌に基づく反応系は24〜38℃
の温度範囲で使用できる。これらのバッチ法では通常、
大腸菌溶解物の30S上清を用いるが、かかる上清は内因
性mRNAの含有量が高いため、それをin vitro翻訳系で使
用する前にRNアーゼで処理する必要がある(Zubay, 197
3)。コムギ胚芽溶解物に基づく反応系は通常、20〜27℃
の温度範囲で使用できるにすぎないが(Tulinら, 199
5)、内因性mRNAのレベルが低いため、外因性の発現鋳型
を発現させるために直接使用できるという点で、大腸菌
溶解物に比して利点がある。網状赤血球溶解物は、内因
性mRNAをRNアーゼ処理により除去した貧血ウサギ血液の
直接溶解により調製される。通常、これらの系は30〜38
℃の温度範囲で使用する(PelhamおよびJackson, 197
6)。しかし、実施温度は翻訳過程に影響を及ぼすだけで
なく、標的タンパク質のフォールディングがそれぞれの
実施温度に大きく左右されることに留意すべきである。
【００２２】このようなバッチ式反応でのタンパク質合
成は、最初の重要な成分が分解、阻害またはエネルギー
消失のためにもはや機能しなくなるまで維持できるにす
ぎない。これに関連した最大の問題は、タンパク質合成
のためのエネルギー供給であり(Yaoら, 1997; Matveev
ら, 1996)、何故にこれらのバッチ式反応では比較的短
い合成時間、ひいては比較的低い標的タンパク質収量
（平均で0.1〜20μg/ml）しか達成できないのか、であ
る(Moscaら, 1983)。
成は、最初の重要な成分が分解、阻害またはエネルギー
消失のためにもはや機能しなくなるまで維持できるにす
ぎない。これに関連した最大の問題は、タンパク質合成
のためのエネルギー供給であり(Yaoら, 1997; Matveev
ら, 1996)、何故にこれらのバッチ式反応では比較的短
い合成時間、ひいては比較的低い標的タンパク質収量
（平均で0.1〜20μg/ml）しか達成できないのか、であ
る(Moscaら, 1983)。
【００２３】しかし、タンパク質合成に必要とされるmR
NAは、発現系で直接調製することもできる。これらのい
わゆる共役した転写／翻訳系では、大腸菌溶解物に基づ
く系でmRNAを調製するために、外因性のファージRNAポ
リメラーゼだけでなく内因性のRNAポリメラーゼも使用
することが可能である(ChenおよびZubay, 1983; Kohrer
ら, 1996)。これに対して、真核細胞系では外因性のフ
ァージRNAポリメラーゼが用いられる(Craigら, 1992; B
aranovおよびSpirin, 1993)。しかし、こうした真核細
胞系ではもちろん、その後に、適切なDNA鋳型が対応す
るプロモーターエレメントと共に必要となる。
NAは、発現系で直接調製することもできる。これらのい
わゆる共役した転写／翻訳系では、大腸菌溶解物に基づ
く系でmRNAを調製するために、外因性のファージRNAポ
リメラーゼだけでなく内因性のRNAポリメラーゼも使用
することが可能である(ChenおよびZubay, 1983; Kohrer
ら, 1996)。これに対して、真核細胞系では外因性のフ
ァージRNAポリメラーゼが用いられる(Craigら, 1992; B
aranovおよびSpirin, 1993)。しかし、こうした真核細
胞系ではもちろん、その後に、適切なDNA鋳型が対応す
るプロモーターエレメントと共に必要となる。
【００２４】短い発現時間および系へのエネルギー供給
の問題は、連続交換無細胞翻訳装置(CECF)または連続流
無細胞翻訳装置(CFCF)を用いることで解決されてきた(S
pirinら, 1988; Spirin, 1991)。その基本となる考え方
は、エネルギーおよび低分子成分の反応系への連続供給
ならびに低分子副産物の連続除去に基づいている。これ
に関連して、反応物は別の供給コンパートメントから半
透膜を通して供給される。
の問題は、連続交換無細胞翻訳装置(CECF)または連続流
無細胞翻訳装置(CFCF)を用いることで解決されてきた(S
pirinら, 1988; Spirin, 1991)。その基本となる考え方
は、エネルギーおよび低分子成分の反応系への連続供給
ならびに低分子副産物の連続除去に基づいている。これ
に関連して、反応物は別の供給コンパートメントから半
透膜を通して供給される。
【００２５】in vitro翻訳系は共役したin vitro転写／
翻訳系であることが好ましい。また、共役したin vitro
転写／翻訳系をCFCFまたはCECF反応器で行なうことが有
利である。
翻訳系であることが好ましい。また、共役したin vitro
転写／翻訳系をCFCFまたはCECF反応器で行なうことが有
利である。
【００２６】in vitro転写／翻訳系での共発現のために
は、その構造が標的タンパク質の発現ベクターに一致す
るベクターまたはDNA鋳型を使用することができる。大
腸菌溶解物に基づく系では、内因性の大腸菌RNAポリメ
ラーゼのプロモーターならびに外因性のウイルスポリメ
ラーゼのプロモーターを含むベクターを使用してもよ
い。これに関連して、ベクターはプロモーター領域に加
えてリボソーム結合部位と適当なターミネーター領域も
含むべきである。原則的には、線状DNA発現鋳型（例え
ば、PCR産物）を用いることもできる。実験で使用する
前に予めin vivo増幅が必要な環状発現ベクターを使用
する場合には、該ベクターは適当な複製起点と少なくと
も１つの選択マーカーを含むべきである。それぞれの基
質タンパク質について、シャペロンの共発現時間および
共発現強度を最適化することができる(Lottspeichおよ
びZorbas, 1998)。
は、その構造が標的タンパク質の発現ベクターに一致す
るベクターまたはDNA鋳型を使用することができる。大
腸菌溶解物に基づく系では、内因性の大腸菌RNAポリメ
ラーゼのプロモーターならびに外因性のウイルスポリメ
ラーゼのプロモーターを含むベクターを使用してもよ
い。これに関連して、ベクターはプロモーター領域に加
えてリボソーム結合部位と適当なターミネーター領域も
含むべきである。原則的には、線状DNA発現鋳型（例え
ば、PCR産物）を用いることもできる。実験で使用する
前に予めin vivo増幅が必要な環状発現ベクターを使用
する場合には、該ベクターは適当な複製起点と少なくと
も１つの選択マーカーを含むべきである。それぞれの基
質タンパク質について、シャペロンの共発現時間および
共発現強度を最適化することができる(Lottspeichおよ
びZorbas, 1998)。
【００２７】合成反応中のシャペロン機構の効率を確実
に最大とするためには、共発現を調節すべきである。適
切な調節は、一方では、共発現ベクターの計量添加によ
って、他方では、発現の誘導および強度を調節しうるベ
クターのプロモーター領域にある調節配列によって達成
できる。かかる調節のために、IPTG誘導性lacオペレー
ター配列、テトラサイクリンリプレッサーの結合配列、
またはカタボライト誘導性調節配列（例えば、アラビノ
ースオペレーター）を使用できる。しかし、標的タンパ
ク質発現とシャペロン共発現を別々に誘導することも考
慮しなければならない。
に最大とするためには、共発現を調節すべきである。適
切な調節は、一方では、共発現ベクターの計量添加によ
って、他方では、発現の誘導および強度を調節しうるベ
クターのプロモーター領域にある調節配列によって達成
できる。かかる調節のために、IPTG誘導性lacオペレー
ター配列、テトラサイクリンリプレッサーの結合配列、
またはカタボライト誘導性調節配列（例えば、アラビノ
ースオペレーター）を使用できる。しかし、標的タンパ
ク質発現とシャペロン共発現を別々に誘導することも考
慮しなければならない。
【００２８】したがって、フォールディング補助タンパ
ク質またはシャペロンの共発現を調節することが好まし
い。特に、フォールディング補助タンパク質またはシャ
ペロンの共発現とは別に、標的タンパク質の発現を誘導
できることが好適である。
ク質またはシャペロンの共発現を調節することが好まし
い。特に、フォールディング補助タンパク質またはシャ
ペロンの共発現とは別に、標的タンパク質の発現を誘導
できることが好適である。
【００２９】真核細胞系のためのDNA鋳型はさらに、ウ
イルスRNAポリメラーゼの適切なプロモーター領域、翻
訳開始に必要な真核細胞配列、および適切なターミネー
ターを含むべきである。実験で使用するために大腸菌内
で増幅する必要がある環状発現ベクターはまた、大腸菌
用の複製起点と少なくとも１つの選択マーカーを含むべ
きである。その場合、ウイルスプロモーターの適切な調
節配列によりシャペロン共発現を調節することもできる
(LottspeichおよびZorbas, 1998)。
イルスRNAポリメラーゼの適切なプロモーター領域、翻
訳開始に必要な真核細胞配列、および適切なターミネー
ターを含むべきである。実験で使用するために大腸菌内
で増幅する必要がある環状発現ベクターはまた、大腸菌
用の複製起点と少なくとも１つの選択マーカーを含むべ
きである。その場合、ウイルスプロモーターの適切な調
節配列によりシャペロン共発現を調節することもできる
(LottspeichおよびZorbas, 1998)。
【００３０】シャペロン機構の過負荷はそれぞれの標的
タンパク質とその標的タンパク質の発現速度に依存する
ので、必要となるシャペロンの量は標的タンパク質に強
く左右される。したがって、それぞれの場合に両方の発
現鋳型の発現速度を最適化することが重要である。かか
る最適化は、プロモーターによる発現の直接調節に加え
て、発現鋳型の使用量を変えることによって達成でき
る。標的タンパク質が非常に凝集しやすい場合には、実
際、大過剰のシャペロンを使用する必要があるが、その
他の標的タンパク質の場合にはシャペロンの強い共発現
が標的タンパク質の発現を妨げることさえある。標的タ
ンパク質に応じて、その機能的発現には、１種のシャペ
ロンの共発現または数種のシャペロンの共発現が必要と
なろう。これに関連して、ほとんどのシャペロンは対応
するコシャペロンとの複合体系としてしか効率よく働か
ないことにも留意すべきである。かくして、シャペロン
と適切なコシャペロンとの共発現が特に好適である。
タンパク質とその標的タンパク質の発現速度に依存する
ので、必要となるシャペロンの量は標的タンパク質に強
く左右される。したがって、それぞれの場合に両方の発
現鋳型の発現速度を最適化することが重要である。かか
る最適化は、プロモーターによる発現の直接調節に加え
て、発現鋳型の使用量を変えることによって達成でき
る。標的タンパク質が非常に凝集しやすい場合には、実
際、大過剰のシャペロンを使用する必要があるが、その
他の標的タンパク質の場合にはシャペロンの強い共発現
が標的タンパク質の発現を妨げることさえある。標的タ
ンパク質に応じて、その機能的発現には、１種のシャペ
ロンの共発現または数種のシャペロンの共発現が必要と
なろう。これに関連して、ほとんどのシャペロンは対応
するコシャペロンとの複合体系としてしか効率よく働か
ないことにも留意すべきである。かくして、シャペロン
と適切なコシャペロンとの共発現が特に好適である。
【００３１】本発明による課題はまた、精製したシャペ
ロンとコシャペロンを必要な量で添加することによって
も達成される。しかし、この方法は比較的費用がかか
る。
ロンとコシャペロンを必要な量で添加することによって
も達成される。しかし、この方法は比較的費用がかか
る。
【００３２】本発明のさらなる主題は、フォールディン
グ補助タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター
の、本発明による方法のための使用である。本発明の別
の主題は、コシャペロンをコードする遺伝子を含むベク
ターの、本発明による方法のための使用である。
グ補助タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター
の、本発明による方法のための使用である。本発明の別
の主題は、コシャペロンをコードする遺伝子を含むベク
ターの、本発明による方法のための使用である。
【００３３】本発明の特定の主題は、フォールディング
補助タンパク質をコードする遺伝子と、さらにプロモー
ター領域、リボソーム結合部位およびターミネーター領
域を含むベクターの、本発明による方法のための使用で
ある。また、コシャペロンをコードする遺伝子と、さら
にプロモーター領域、リボソーム結合部位およびターミ
ネーター領域を含むベクターを、本発明による方法のた
めに使用することも特に好適である。
補助タンパク質をコードする遺伝子と、さらにプロモー
ター領域、リボソーム結合部位およびターミネーター領
域を含むベクターの、本発明による方法のための使用で
ある。また、コシャペロンをコードする遺伝子と、さら
にプロモーター領域、リボソーム結合部位およびターミ
ネーター領域を含むベクターを、本発明による方法のた
めに使用することも特に好適である。
【００３４】以下の実施例においては、標的タンパク質
としてミトコンドリアのクエン酸シンターゼ（ブタ心
臓；EC 4.1.3.7）を用いて高速翻訳系（RTS系）で本発
明の方法を実施する。もう一つの標的タンパク質として
GFPを使用した。予期せざることに、GroEL/ESの添加と
同様に、RTS系でのGroEL/ESの共発現により、調製的規
模での発現量を向上させることができた。
としてミトコンドリアのクエン酸シンターゼ（ブタ心
臓；EC 4.1.3.7）を用いて高速翻訳系（RTS系）で本発
明の方法を実施する。もう一つの標的タンパク質として
GFPを使用した。予期せざることに、GroEL/ESの添加と
同様に、RTS系でのGroEL/ESの共発現により、調製的規
模での発現量を向上させることができた。
【００３５】
【実施例】実施例１ RTS系において発現させるためにクエン酸シンターゼ遺
伝子を含有するpIVEX2.4bベクター(Roche, Molecular B
iochemicals)を用いたが、これはHisタグがＮ末端に融
合したクエン酸シンターゼ遺伝子を発現する。この反応
は、ロット番号85869220 (Roche, Molecular Biochemic
als)のRTSミニキットを使って、27℃、140rpmで24時間
行なった。
伝子を含有するpIVEX2.4bベクター(Roche, Molecular B
iochemicals)を用いたが、これはHisタグがＮ末端に融
合したクエン酸シンターゼ遺伝子を発現する。この反応
は、ロット番号85869220 (Roche, Molecular Biochemic
als)のRTSミニキットを使って、27℃、140rpmで24時間
行なった。
【００３６】発現したクエン酸シンターゼの凝集を防止
するために、一方では、GroEL/ESを共発現させ、他方で
は、精製したGroEL/ESをRTS反応混合物に添加した。
するために、一方では、GroEL/ESを共発現させ、他方で
は、精製したGroEL/ESをRTS反応混合物に添加した。
【００３７】それぞれの場合に、8μgのpIVEX2.4bおよ
び8μgのGroEL/ES発現プラスミドを使用した。このGroE
L/ES発現プラスミドは、GroEL/ESオペロンをT7プロモー
ターの制御下で発現する改変型pETベクター(Novagen, M
ilwaukee, USA)に相当する(Ishii Yasuhawaら, 1995)。
SDS-PAGEおよびイムノブロットにより３種のタンパク質
の発現を調べた。これらのタンパク質はすべて、ほぼ等
量で発現されていた。
び8μgのGroEL/ES発現プラスミドを使用した。このGroE
L/ES発現プラスミドは、GroEL/ESオペロンをT7プロモー
ターの制御下で発現する改変型pETベクター(Novagen, M
ilwaukee, USA)に相当する(Ishii Yasuhawaら, 1995)。
SDS-PAGEおよびイムノブロットにより３種のタンパク質
の発現を調べた。これらのタンパク質はすべて、ほぼ等
量で発現されていた。
【００３８】添加用のGroEL/ESは、Schmidtら(1994)に
記載されるとおりに精製した。150nMのGroELと300nMのG
roESをRTS系に添加した。
記載されるとおりに精製した。150nMのGroELと300nMのG
roESをRTS系に添加した。
【００３９】RTS反応の完了後、凝集物を可溶性成分か
ら分離するために、反応混合物を14000g、4℃で10分間
遠心した。可溶性画分をNi-NTA平衡バッファー(100mM N
a2HPO4, 300mM NaCl, pH7.4)で1:10に希釈し、１mlのNi
-NTA Superflowカラム(Quiagen)に0.5ml/分の連続した
流量で添加した。このカラムを、最初に５mlの平衡バッ
ファーで洗浄し、続いて５mlの洗浄バッファー(100mM N
a2HPO4, 300mM NaCl, 30mMイミダゾール, pH6.8)で洗浄
した。その後、カラムから３mlの溶出バッファー(100mM
Na2HPO4, 300mM NaCl, 300mM イミダゾール, pH7.5)を
用いてクエン酸シンターゼを溶出した。
ら分離するために、反応混合物を14000g、4℃で10分間
遠心した。可溶性画分をNi-NTA平衡バッファー(100mM N
a2HPO4, 300mM NaCl, pH7.4)で1:10に希釈し、１mlのNi
-NTA Superflowカラム(Quiagen)に0.5ml/分の連続した
流量で添加した。このカラムを、最初に５mlの平衡バッ
ファーで洗浄し、続いて５mlの洗浄バッファー(100mM N
a2HPO4, 300mM NaCl, 30mMイミダゾール, pH6.8)で洗浄
した。その後、カラムから３mlの溶出バッファー(100mM
Na2HPO4, 300mM NaCl, 300mM イミダゾール, pH7.5)を
用いてクエン酸シンターゼを溶出した。
【００４０】オキサロ酢酸の縮合の副生成物として化学
量論的に形成される補酵素Ａ(CoA)は、412nmでの吸収増
加に関係するEllman試薬(DNTB)を減少させる。正確に折
りたたまれたクエン酸シンターゼはこの反応により検出
することができる。活性を測定するために、50μlの精
製クエン酸シンターゼ（溶出画分）、900μlのTEバッフ
ァー(50mM Tris/HCl, 2mM EDTA, pH8.0)、10μlのオキ
サロ酢酸(50mM Tris中に10mM)、10mlのDTNB(TEバッファ
ー中)、および30μlのアセチルCoA(TEバッファー中)を
混合し、25℃でインキュベートした。吸収の変化を５分
間かけて連続的に測定し、１分あたりの吸収の変化を求
めた。３つの異なるRTS反応からそれぞれに、精製クエ
ン酸シンターゼの吸収変化の平均を出した。GroEL/ESの
共発現も添加も行なわなかったRTS反応での平均吸収変
化を１に正規化した。
量論的に形成される補酵素Ａ(CoA)は、412nmでの吸収増
加に関係するEllman試薬(DNTB)を減少させる。正確に折
りたたまれたクエン酸シンターゼはこの反応により検出
することができる。活性を測定するために、50μlの精
製クエン酸シンターゼ（溶出画分）、900μlのTEバッフ
ァー(50mM Tris/HCl, 2mM EDTA, pH8.0)、10μlのオキ
サロ酢酸(50mM Tris中に10mM)、10mlのDTNB(TEバッファ
ー中)、および30μlのアセチルCoA(TEバッファー中)を
混合し、25℃でインキュベートした。吸収の変化を５分
間かけて連続的に測定し、１分あたりの吸収の変化を求
めた。３つの異なるRTS反応からそれぞれに、精製クエ
ン酸シンターゼの吸収変化の平均を出した。GroEL/ESの
共発現も添加も行なわなかったRTS反応での平均吸収変
化を１に正規化した。
【００４１】結果：図１に示すように、両方のアプロー
チとも、活性のある精製ミトコンドリア・クエン酸シン
ターゼの収量を向上させた。驚いたことに、精製したGr
oELとGroESの直接添加と同様に、GroEL/ES系の共発現も
効果的に働いた。活性のある精製標的タンパク質の収量
はGroEL/ES系の共発現によって５倍増加した。
チとも、活性のある精製ミトコンドリア・クエン酸シン
ターゼの収量を向上させた。驚いたことに、精製したGr
oELとGroESの直接添加と同様に、GroEL/ES系の共発現も
効果的に働いた。活性のある精製標的タンパク質の収量
はGroEL/ES系の共発現によって５倍増加した。
【００４２】実施例２ モデル基質としてGFPを用いて、RTS系におけるその発現
にHsp70シャペロンが及ぼす影響を調べた。この反応
は、ロット番号85869220（Roche, カタログ）のRTSミニ
キットを使って、27℃、140rpmで24時間行なった。GFP
が反応中に確実に酸化されるようにするために、半量だ
けを使用した。それぞれの場合に、RTSミニキット中に
含まれるGFP対照プラスミドは５μgを使用した。
にHsp70シャペロンが及ぼす影響を調べた。この反応
は、ロット番号85869220（Roche, カタログ）のRTSミニ
キットを使って、27℃、140rpmで24時間行なった。GFP
が反応中に確実に酸化されるようにするために、半量だ
けを使用した。それぞれの場合に、RTSミニキット中に
含まれるGFP対照プラスミドは５μgを使用した。
【００４３】この系においてHsp70が発現量に及ぼす効
果を調べるために、一方では、ヒトHsp70とHsp40を共発
現させ、他方では、精製したHsp70とHsp40をRTS反応に
添加した。
果を調べるために、一方では、ヒトHsp70とHsp40を共発
現させ、他方では、精製したHsp70とHsp40をRTS反応に
添加した。
【００４４】それぞれの場合に、８μgのHsp70またはHs
p40発現プラスミドを使用した。Hsp70発現プラスミドは
pET11aベクター(Novagen, Milwaukee, USA)に相当し、H
sp40(Hdj1)発現プラスミドはpET21dベクター(Novagen,
Milwaukee, USA)に相当した。両遺伝子ともT7プロモー
ターの制御下で発現させた。RTS系に300nMのHsp70およ
び300nMのHdj1を添加した(Abravayaら, 1992)。
p40発現プラスミドを使用した。Hsp70発現プラスミドは
pET11aベクター(Novagen, Milwaukee, USA)に相当し、H
sp40(Hdj1)発現プラスミドはpET21dベクター(Novagen,
Milwaukee, USA)に相当した。両遺伝子ともT7プロモー
ターの制御下で発現させた。RTS系に300nMのHsp70およ
び300nMのHdj1を添加した(Abravayaら, 1992)。
【００４５】RTS反応の完了後、凝集物を可溶性成分か
ら分離するために、反応混合物を14000g、4℃で10分間
遠心した。可溶性画分の蛍光発光を、395nmで励起し
て、430〜580nmで測定した。シャペロンの添加も共発現
も行なわなかった混合物の503nmでの相対蛍光を１に正
規化し、シャペロンを含む混合物の蛍光と比較した。GF
Pのその後の酸化の影響を排除するために、24時間後に
サンプルを再度測定したが、差は認められなかった。
ら分離するために、反応混合物を14000g、4℃で10分間
遠心した。可溶性画分の蛍光発光を、395nmで励起し
て、430〜580nmで測定した。シャペロンの添加も共発現
も行なわなかった混合物の503nmでの相対蛍光を１に正
規化し、シャペロンを含む混合物の蛍光と比較した。GF
Pのその後の酸化の影響を排除するために、24時間後に
サンプルを再度測定したが、差は認められなかった。
【００４６】結果：図２に示すように、両方のアプロー
チとも、活性のあるGFPの収量を向上させた。驚いたこ
とに、Hsp70シャペロンの共発現ならびに添加は効果的
に働いた。活性のある標的タンパク質の収量は、Hsp70
とHsp40の共発現によって２倍となり、直接添加によっ
て３倍以上増加した。
チとも、活性のあるGFPの収量を向上させた。驚いたこ
とに、Hsp70シャペロンの共発現ならびに添加は効果的
に働いた。活性のある標的タンパク質の収量は、Hsp70
とHsp40の共発現によって２倍となり、直接添加によっ
て３倍以上増加した。
【００４７】参考文献
【図１】RTS系における活性のある精製クエン酸シンタ
ーゼ(CS)の収量に及ぼすGroEL/ESの影響、すなわち、Gr
oEL/ESの非存在下でのpIVEX 2.4bのCS発現、GroEL/ESを
共発現させたpIVEX 2.4bのCS発現、150nMの精製GroELお
よび300nMのGroESを添加したpIVEX 2.4bのCS発現を示し
た図である。
ーゼ(CS)の収量に及ぼすGroEL/ESの影響、すなわち、Gr
oEL/ESの非存在下でのpIVEX 2.4bのCS発現、GroEL/ESを
共発現させたpIVEX 2.4bのCS発現、150nMの精製GroELお
よび300nMのGroESを添加したpIVEX 2.4bのCS発現を示し
た図である。
【図２】RTS系におけるGFPの収量に及ぼすHsp70とHsp40
の影響、すなわち、Hsp70（ヒト由来）およびHdj1（ヒ
ト由来のHsp40）の非存在下でのGFP発現、Hsp70およびH
dj1を共発現させたGFP発現、300nMのHsp70および300nM
のHdj1を添加したGFP発現を示した図である。
の影響、すなわち、Hsp70（ヒト由来）およびHdj1（ヒ
ト由来のHsp40）の非存在下でのGFP発現、Hsp70およびH
dj1を共発現させたGFP発現、300nMのHsp70および300nM
のHdj1を添加したGFP発現を示した図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月２６日（２００２．４．２
６）
６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA02 EA04 FA02 FA07 FA08
Claims (20)
- 【請求項１】 フォールディング補助タンパク質をin v
itro翻訳系において共発現させることを特徴とする、in
vitro翻訳系での標的タンパク質の発現方法。 - 【請求項２】 共発現されるフォールディング補助タン
パク質が、１以上の次のタンパク質クラス：Hsp60、Hsp
70、Hsp90、Hsp100タンパク質のファミリー、小さい熱
ショックタンパク質のファミリー、およびイソメラーゼ
から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 共発現されるフォールディング補助タン
パク質が、Hsp60タンパク質ファミリーのメンバーであ
ることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 コシャペロンがさらに共発現されること
を特徴とする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 Hsp60がフォールディング補助タンパク
質として共発現され、かつHsp10がコシャペロンとして
共発現されることを特徴とする、請求項４に記載の方
法。 - 【請求項６】 共発現されるフォールディング補助タン
パク質がGroELであることを特徴とする、請求項３〜５
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 GroEL／ESが共発現されることを特徴と
する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 共発現されるフォールディング補助タン
パク質が、Hsp70タンパク質ファミリーのメンバーであ
ることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項９】 コシャペロンがさらに共発現されること
を特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 共発現されるフォールディング補助タ
ンパク質が、ヒトHsp70タンパク質であることを特徴と
する、請求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１１】 Hsp70がフォールディング補助タンパ
ク質として共発現され、かつHsp40がコシャペロンとし
て共発現されることを特徴とする、請求項９または１０
に記載の方法。 - 【請求項１２】 ヒト由来のHsp70およびHdj1（ヒト由
来のHsp40）が共発現されることを特徴とする、請求項
１０または１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 in vitro翻訳系が共役したin vitro転
写／翻訳系であることを特徴とする、請求項１〜１２の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 フォールディング補助タンパク質およ
び／またはコシャペロンの共発現が調節されることを特
徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１５】 フォールディング補助タンパク質また
はコシャペロンの共発現とは別個に、標的タンパク質の
発現を誘導することができることを特徴とする、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 共役したin vitro転写／翻訳がCFCFま
たはCEFC反応器において行なわれることを特徴とする、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の方法のための、フォールディング補助タンパク質をコ
ードする遺伝子を含有するベクターの使用。 - 【請求項１８】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の方法のための、コシャペロンをコードする遺伝子を含
有するベクターの使用。 - 【請求項１９】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の方法のための、フォールディング補助タンパク質をコ
ードする遺伝子を含みかつプロモーター領域、リボソー
ム結合部位およびターミネーター領域をさらに含むベク
ターの使用。 - 【請求項２０】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の方法のための、コシャペロンをコードする遺伝子を含
みかつプロモーター領域、リボソーム結合部位およびタ
ーミネーター領域をさらに含むベクターの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10121235A DE10121235A1 (de) | 2001-04-30 | 2001-04-30 | Verfahren zur Expression von Proteinen in in vitro Translations-Systemen unter Ko-Expression von Faltungshelferproteinen |
| DE10121235.6 | 2001-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335959A true JP2002335959A (ja) | 2002-11-26 |
Family
ID=7683311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002121041A Pending JP2002335959A (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-23 | フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6929929B2 (ja) |
| EP (1) | EP1254962B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002335959A (ja) |
| AT (1) | ATE335834T1 (ja) |
| DE (2) | DE10121235A1 (ja) |
| ES (1) | ES2269547T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006061080A (ja) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 無細胞タンパク質合成系のための媒体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10145694A1 (de) * | 2001-09-17 | 2003-04-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit, der Expressionsrate und der Aktivität von Proteinen während der rekombinanten Herstellung |
| AU2002349296A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-10 | Novozymes A/S | Method for generating a site-specific library of variants |
| CA2463719A1 (en) | 2003-04-05 | 2004-10-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide analogs with six membered rings |
| GB0329681D0 (en) * | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
| AU2005317828A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Novozymes Delta Limited | Gene expression technique |
| GB0512707D0 (en) * | 2005-06-22 | 2005-07-27 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08508651A (ja) * | 1993-04-08 | 1996-09-17 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | 蛋白質合成用無細胞システムおよびそれにおけるシャペロン蛋白質の利用 |
| JPH09173078A (ja) * | 1995-09-14 | 1997-07-08 | Tadayuki Imanaka | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 |
| JPH119274A (ja) * | 1997-06-20 | 1999-01-19 | H S P Kenkyusho:Kk | シャペロン発現プラスミド |
| WO2000008135A1 (en) * | 1998-08-09 | 2000-02-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for inhibiting or stimulating telomerase assembly |
| JP2000189163A (ja) * | 1998-12-28 | 2000-07-11 | Hsp Kenkyusho:Kk | トリガ―ファクタ―発現プラスミド |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993025681A1 (en) | 1992-06-11 | 1993-12-23 | New York University | A cytoplasmic chaperonin and methods of making and using it |
| US6495360B1 (en) * | 1999-05-28 | 2002-12-17 | Photogen, Inc. | Method for enhanced protein stabilization and for production of cell lines useful for production of such stabilized proteins |
-
2001
- 2001-04-30 DE DE10121235A patent/DE10121235A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-04-23 JP JP2002121041A patent/JP2002335959A/ja active Pending
- 2002-04-26 US US10/133,534 patent/US6929929B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-27 DE DE60213703T patent/DE60213703T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-27 ES ES02009650T patent/ES2269547T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-27 AT AT02009650T patent/ATE335834T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-27 EP EP02009650A patent/EP1254962B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08508651A (ja) * | 1993-04-08 | 1996-09-17 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | 蛋白質合成用無細胞システムおよびそれにおけるシャペロン蛋白質の利用 |
| JPH09173078A (ja) * | 1995-09-14 | 1997-07-08 | Tadayuki Imanaka | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 |
| JPH119274A (ja) * | 1997-06-20 | 1999-01-19 | H S P Kenkyusho:Kk | シャペロン発現プラスミド |
| WO2000008135A1 (en) * | 1998-08-09 | 2000-02-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for inhibiting or stimulating telomerase assembly |
| JP2000189163A (ja) * | 1998-12-28 | 2000-07-11 | Hsp Kenkyusho:Kk | トリガ―ファクタ―発現プラスミド |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006061080A (ja) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 無細胞タンパク質合成系のための媒体 |
| JP4561243B2 (ja) * | 2004-08-27 | 2010-10-13 | 株式会社豊田中央研究所 | 無細胞タンパク質合成系のための媒体 |
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