JP6626909B2 - 標的タンパク質の可溶化用組成物及びその用途 - Google Patents
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Description
大腸菌XL1−Blue(Stratagene, La Jolla, CA, USA)及びBL21(DE3)(Novagen, Madison, WI, USA)菌株を用いた。XL−1 Blue菌株を全てのクローニングに用い、BL21(DE3)菌株を遺伝子発現のために用いた。公知のP1形質導入(非特許文献2)によりdnaJとdnaK遺伝子を有しない菌株を作製した。単一ノックアウト(ΔdnaJ及びΔdnaK)を有するBW25113菌株をKeio collectionから得て、BL21(DE3)のための供与菌株として用いた。標的遺伝子の周辺にあるプライマー対を用いて欠失菌株をスクリーニングするために、Colony PCRを用いた(表1)。その後、pCP22プラスミド由来FLP組換え酵素により宿主ゲノム内の統合領域からカナマイシン抵抗性カセットを除去した。本発明に用いられたオリゴヌクレオチド(Genotech,大田,韓国)と遺伝子(Bioneer,大田,韓国)を表1に示す。化学薬品はSigma−Aldrich(St. Louis, MO, USA)から購入した。
シャペロンが集積したmRNAスキャフォールド(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS)システムのためにシャペロンとRNA結合ドメインの融合タンパク質又は標的組換えタンパク質をコードする発現ベクターを作製した。
シャペロンが集積したmRNAスキャフォールド(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS)システムのためにRNAスキャフォールドを作製した。具体的には、RNA Designer及びmFoldを用いて、RNAスキャフォールドシステムに用いられるKHドメインのための結合ループの配列を設計した(非特許文献6,非特許文献7)。配列制約(constraint)は次の通りである。
5’−NNNNNNNNACCTAGATCACC(配列番号77)NNNNNNNN−3’
DnaJが第1シストロン又は第2シストロンに配置される2つの異なる配列により、DnaJシャペロンと組換えタンパク質(ScFv、UbiC、Leptin、HIV1−Pr、BMP2及びTliA)のCLEXシステムを作製した。第2シストロン内の遺伝子の翻訳開始を向上させるために、EEVEのアミノ酸配列(EEVE,配列番号78)をコードし、シャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno, SD)配列(下線部分)を含む12ntからなる領域(5’−GAGGAGGTGGAA−3’,配列番号79)を第1シストロン内の遺伝子のC末端に導入した。さらに、翻訳共役(translational coupling)を保障し、DnaJと組換えタンパク質間の相互作用を促進するために、1nt(5’−TAATG−3’)により第1シストロンの終止コドンを第2シストロンの開始コドンにオーバーラップさせた。CLEXシステムを作製するために、DnaJシャペロンと組換えタンパク質をrecombinant PCRにより組み立てた。プライマー配列を表2に示す。PCR産物とpET16bを表2に示す制限酵素により切断し、発現ベクターに連結した。
大腸菌BL2(DE3)をシャペロンのプラスミドと標的組換えタンパク質のプラスミドに同時に形質転換した。その後、最終濃度がそれぞれ50μg/mlと25μg/mlのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した3mlのLB(Lysogenic Broth)培地(10g/lトリプトン、5g/lイースト抽出物及び10g/l塩化ナトリウム)に前記大腸菌を接種し、回転振とう器(200rpm)にて37℃で一晩培養した。その後、最終濃度がそれぞれ50μg/mlと25μg/mlのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した100ml LB培地に1mlの培養物を接種し、200rpm、37℃で培養した。OD600が0.5〜0.6に達したら、0.5mMイソプロピルβ−d−1−チオガラクトピラノシド(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG)を添加してシャペロンと標的タンパク質の発現を誘導し、その後さらに4時間培養(37℃,200rpm)した。その後、OD600値が2になったら、細胞培養液3ml(約,1.6×109cellsを含む)を遠心分離し、10mMTris−EDTA(TE)バッファ(pH7.6)500μlに再懸濁し、超音波処理により溶解した。可溶性及び不溶性画分を遠心分離(21,600×g,15分,4℃)により分離した。不溶性ペレットを1%Triton X−100で2回洗浄し、10mM TEバッファ(pH7.6)に再懸濁し、その後不溶性画分として用いた。標的組換えタンパク質の可溶性をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)を用いて測定した。クマシーブルー(Coomassie Blue)で染色したSDS−PAGEゲル内の細胞溶解物全体及び標的組換えタンパク質の可溶性画分のバンド強度をImageJソフトウェアにより比較し、可溶性標的組換えタンパク質の相対的百分率を計算した。
最終濃度25μg/mlのクロラムフェニコールを補充したLB培地にて、pAMT7−DnaJ−KHを有する大腸菌BL21(DE3)を培養した。前記大腸菌を回転振とう器(200rpm)にて37℃で一晩培養した。その後、最終濃度25μg/mlのクロラムフェニコールを補充した100ml LB培地に1ml培養物を接種し、200rpm、37℃で培養した。OD600が0.6に達したら、DnaJ−KHタンパク質の発現を誘導するために0.5mM IPTGを添加し、さらに4時間培養した(37℃,200rpm)。その後、20mlの細胞を遠心分離により収穫し、1×Native IMAC溶解バッファ(Biorad, Hercules, CA, USA)に再懸濁し、超音波処理により溶解した。透明になった細胞溶解物を再び遠心分離した(21,600×g,15分,4℃)。自動化されたProfiniaTMタンパク質精製システム(Biorad, Hercules, CA, USA)のNative IMAC法を用いて、可溶性画分からDnaJ−KHを精製した。その後、リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4と5mM DTT、100mM NaCl及び10%のグリセロールを含有する25mM Tris−HClバッファ(pH8.8)を用いて、精製したDnaJ−KHを透析した。
公知のGFP相補性分析法(非特許文献8)を一部変形して、CRASシステムにおける組換えタンパク質の正確なフォールディングを評価した。最終濃度がそれぞれ50μg/mlと25μg/mlのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充したLB培地に、pAMT7−DnaJK−KH及びpET16b−sfGFP/pET16b−CsfGFP−NsfGFP/pET16b−CsfGFP−NsfGFP3Lを有する大腸菌BL21(DE3)を接種し、回転振とう器(200rpm)にて37℃で一晩培養した。その後、最終濃度がそれぞれ50μg/mlと25μg/mlのアンピシリンとクロラムフェニコールを補充した100ml LB培地に1mlの培養物を接種し、200rpm、37℃で培養した。OD600が0.6に達したら、0.5mM IPTGを添加してDnaJK−KHと標的タンパク質の発現を誘導し、その後さらに4時間培養(37℃,200rpm)した。その後、1mlの細胞を遠心分離により収穫し、500μl PBS(pH7.4)に再懸濁し、OD600が1に達するまで希釈した。その後、96ウェルのblack plate(SPL Life Sciences,抱川,韓国)にローディングした。Tecan Infinite F200 PRO instrument(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)を用いて、各ウェルの蛍光強度を測定した(λexc=488nm/λem=530nm)。
HiScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolab, Beverly, MA)を用いて、ループがないか、1つ又は3つのループを有するanti p21ras−ScFvdmlのmRNAを作製した。0.1nM mRNAを含有するPBS(pH7.4)と200μMの精製されたDnaJ−KHを混合した。その後、混合物を25℃で30分間培養し、2%アガロースゲルを含有するTris−boric acid−EDTAバッファを用いて、電気泳動により分析を行った。電気泳動は50Vで20分間行った。その後、Gel−Doc gel documentation system(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、ゲルを視覚化した。
最終濃度50μg/mlのアンピシリンを補充したLB培地において、pET16b−DnaJLep又はpET16b−Lepを有する大腸菌BL21(DE3)を回転振とう器(200rpm)にて37℃で一晩培養した。その後、最終濃度50μg/mlのアンピシリンを補充した100ml LB培地に1ml培養物を接種し、200rpm、37℃で培養した。OD600が0.6に達したら、0.5mM IPTGを添加し、その後さらに4時間培養することにより(37℃,200rpm)、DnaJとレプチンの発現を誘導した。その後、20mlの細胞を遠心分離により収穫し、1×PBS(pH7.4)に再懸濁し、超音波処理により溶解した。透明になった細胞溶解物を再び遠心分離した(21,600×g,15分,4℃)。精製されたレプチンの活性をELISAにより分析した。透明になった細胞溶解物(8mg/ml)の40μgの可溶性画分を96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)に炭酸塩−重炭酸塩バッファと共に37℃で1時間ローディングした。その後、プレートを1×PBS−T(0.5%Tween−20を含有する1×PBS)で3回洗浄し、各ウェルをボビンセラムアルブミン(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)で1時間ブロックした。その後、抗レプチン抗体(Abcam, Cambridge, UK)を各ウェルに添加し、常温で1時間培養した。プレートを洗浄し、その後horseradish peroxide−conjugated anti−rabbit monoclonal antibody(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)と共に常温で1時間培養した。その後、プレートを1×PBS−Tで4回洗浄し、ペルオキシダーゼ反応を開始するために、100μlのTMB(3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine)ペルオキシダーゼ基質(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)を添加した。反応を停止させるために、50μlの2M H2SO4を各ウェルに添加した。ELISA reader(Infinite M200 PRO; Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)を用いて、各ウェルの450nm吸光度を測定した。
バクテリアの分子シャペロンシステムの必須要素であるDnaJは、翻訳された、又は誤ってフォールディングされたタンパク質と相互作用し、正しくフォールディングされたタンパク質を生産するために、DnaKやGroESLなどのフォルダーゼ(foldase)シャペロンとタンパク質の相互作用を促進する。翻訳直後の速いフォールディングのために、DnaJを標的タンパク質の翻訳終結部位に配置することにより、DnaJと標的タンパク質間の空間近接性を増加させた。固定(anchoring)のために、ヒトNova−1タンパク質に由来する配列特異的RNA結合ドメイン(KH)とDnaJを結合させた(図1のa)。DnaJ−KH(DnaJとKHの結合体)と3’UTRヘアピンループの相互作用をゲル遅延度アッセイ(gel retardation assay)により確認した。抗Ras ScFv(single chain variable fragment)、ScFvと抗菌ペプチドBR2の結合体(BR2-ScFv)、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼ(UDP-glucose 6-dehydrogenase, UGD)、UbiC(pyruvate chorismate lyase)、BMP2(bone morphogenetic protein 2)、レプチン、Adh1p(alcohol dehydrogenase 1p)、大腸菌のHIV−1プロテアーゼ(HIV1−Pr)などの不溶性組換えタンパク質の溶解度を増加させるために、前記タンパク質をCRAS(chaperone recruiting mRNA scaffold)システムに適用した。
しかし、CRASシステムは、Adh1p、HIV1−Pr、UbiC、Leptin及びBMP2の溶解度を増加させることができなかった(図1のb)。これを解決するために、3’UTRヘアピンループの数を増加した。まず、複数の3’UTRヘアピンループを所望の構造にするために、コンピュータシミュレーションにより設計及び検証した(図1のc)。
DnaKシャペロンシステムは大腸菌に自然に存在し、本発明のシステムはDnaJシャペロンを翻訳部位に固定するものであるので、大腸菌のゲノムからdnaJ又はdnaKを欠損させ、その後CRASシステムを用いてScFvの溶解度が増加するか否かを測定した。mRNAを標的とするDnaJのみがScFvと効率的に相互作用することができ、ΔdnaK菌株においてはフォルダーゼシャペロンの欠乏によりCRASシステムの機能が減少するため、ΔdnaJ菌株における溶解度増加効率は同一であろうと予想した。しかし、ΔdnaJ菌株は予想と一致したものの、ΔdnaK菌株はScFvの溶解度が若干増加した(図4)。これは、DnaJが単独で組換えタンパク質の溶解度を増加させるシャペロンとして機能することができるように、CRASシステムがDnaJのフォルダーゼ活性を増加させることを示唆するものである。
シャペロンタンパク質の空間範囲を制限する方法と各シャペロンの回転数(turnover number)を増加する方法により、CRASシステムの効率を向上させようとした。このために、DnaJ、DnaK及びKHの結合体であるキメラシャペロンDnaJ−DnaK−KH(DnaJK−KH)を作製し、CRASシステムに適用した。
In vivoで標的タンパク質の機能的フォールディングを観察するために、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(sfGFP)をN末端(N−sfGFP)とC末端(C−sfGFP)に分けて、GFP相補性分析法を設計した(図1のe)。N−sfGFPは溶解度が低いので、CRASシステムの機能を証明する標的タンパク質として選択した。蛍光のレベルは可溶化された機能性N−sfGFPのレベルを示す。DnaJK−KH及びそれと相互作用するN−sfGFPを発現させると共にC−sfGFPを発現させると、2つのフラグメントを共に発現する細胞の蛍光強度を2倍に増加させるのに対して、DnaJ−KHと相互作用するN−sfGFPの3’UTRに3つのループを導入すると、蛍光強度が約8倍に増加した。これは、sfGFPの全長タンパク質により放出される蛍光強度の90%に相当する数値である。これは、CRASシステムが溶解度だけでなく、機能的活性タンパク質の発現も増加させることができるのを意味するものである(図1のf)。
翻訳機序に近接するシャペロンの数を制限せず、シャペロンと基質に対する空間制約の重要性を証明するために、不溶性が非常に強いタンパク質を可溶化することができる、翻訳共役された2つのシストロン発現システム(translationally coupled two-cistron expression system)であるCLEX(chaperone-substrate co-localized expression)システムを作製した(図5のa)。第1シストロンと第2シストロンの終止コドンと開始コドンのオーバーラップ(5’−TAATG−3’)により、リボソーム複合体が転写物から外れることなく、第2シストロンを翻訳できるようにした。また、CLEXシステムにおいて、DnaJは第1シストロン又は第2シストロンの標的タンパク質をコードする遺伝子に連結されており、第1シストロンは第2シストロンのためにリボソーム結合部位(RBS)を含む、5’−GAGGAGGTGGAA−3’配列(配列番号79)を有するように設計した(下線を付した配列:RBS又はShine-Dalgarno sequence)。2つのシストロン間の統合配列に関して、オーバーラップされた2つのシストロン、タンデム形態の2つのシストロン、及びnbpの距離を有する2つのシストロンを設計した(図5のb)。
CLEXシステムの組換えタンパク質の可溶化において、DnaKの役割を確認するためにΔdnaK菌株を用いた(図6)。
様々な組換えタンパク質の可溶化に成功したものの、TliA(52kDa脂肪分解酵素)などの高分子タンパク質の溶解度増加においては僅かな増加しか得られなかった。これは、高分子タンパク質は誤ってフォールディングされやすい複数のドメインを有する傾向があり、本発明のシステムが非可逆的な誤ったフォールディングの前にシャペロンと複数の基質との相互作用を促進させるのに十分でないからであると判断される。これを確認するために、tliA遺伝子を2つのフラグメント(tliA1,tliA2)に切断し、その後本発明のシステムに適用した。
Claims (16)
- プロモーターと、シャペロンとRNA結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、標的タンパク質の可溶化用組成物であって、
前記シャペロンが、DnaJ及びDnaKであり、
前記標的タンパク質が、HIV−1プロテアーゼ、UbiC(pyruvate chorismate lyase)又はレプチンである、組成物。 - 前記RNA結合ドメインは、KH(K Homology)ドメイン、バクテリオファージMS2コートタンパク質、バクテリオファージPP7コートタンパク質、SAM(sterile alpha motif)又はRRM(RNA recognition motif)である、請求項1に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記融合タンパク質は、シャペロンがRNA結合ドメインのN末端又はC末端に結合されたものである、請求項1に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記融合タンパク質は、シャペロン及びRNA結合ドメインがリンカーを介して結合されたものである、請求項1に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記組成物は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その3’末端にヘアピン(hairpin)構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項1に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記発現カセット又は発現ベクターは、リボソーム結合部位(Ribosome binding site, RBS)をさらに含むものである、請求項1又は5に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記発現カセット又は発現ベクターは、標的タンパク質をコードする遺伝子とヘアピン構造の遺伝子間にスペーサー(spacer)遺伝子をさらに含むものである、請求項5に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記ヘアピン構造の遺伝子は、一つ以上のヘアピン構造の遺伝子を有するものである、請求項5に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記ヘアピン構造は、ヘアピン構造とヘアピン構造間にスペーサー遺伝子を含む、請求項8に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- 前記ヘアピン構造の遺伝子は、シャペロンに連結されたRNA結合ドメインが結合する、RNA部位を転写する配列を含む、請求項5に記載の標的タンパク質の可溶化用組成物。
- プロモーターと、シャペロンとRNA結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む、形質転換体であって、
前記シャペロンが、DnaJ及びDnaKである、形質転換体。 - 前記形質転換体は、植物、バクテリア、菌類、酵母又は動物細胞から選択されるものである、請求項11に記載の形質転換体。
- 前記形質転換体は、プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その3’末端にヘアピン構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターをさらに含み、
前記標的タンパク質が、HIV−1プロテアーゼ、UbiC(pyruvate chorismate lyase)又はレプチンである、請求項11に記載の形質転換体。 - 請求項1もしくは5に記載の組成物、又は請求項11もしくは13に記載の形質転換体を含む、標的タンパク質生産用キットであって、
前記標的タンパク質が、HIV−1プロテアーゼ、UbiC(pyruvate chorismate lyase)又はレプチンである、キット。 - (i)(a)プロモーターと、シャペロンとRNA結合ドメインの融合タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクター、及び
(b)プロモーターと、標的タンパク質をコードする遺伝子と、その3’末端にヘアピン(hairpin)構造を有する遺伝子とを含む発現カセット、又は前記発現カセットを含む発現ベクターを含む形質転換体を準備するステップと、
(ii)前記形質転換体を培養するステップとを含む、標的タンパク質の生産方法であって、
前記シャペロンが、DnaJ及びDnaKであり、
前記標的タンパク質が、HIV−1プロテアーゼ、UbiC(pyruvate chorismate lyase)又はレプチンである、生産方法。 - 前記方法は、(iii)形質転換体又はその培養物から標的タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項15に記載の標的タンパク質の生産方法。
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