JP2023508893A - Ｗｈｅｐドメイン融合による目的タンパク質の水溶性増進方法 - Google Patents

Ｗｈｅｐドメイン融合による目的タンパク質の水溶性増進方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、目的タンパク質の発現効率を増進させるための融合タンパク質に関する。より詳しくは、ｈＥＰＲＳ（Ｇｌｕｔａｍｙｌ－ｐｒｏｌｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ）のＷＨＥＰドメイン（ＥＰＲＳタンパク質の中間部分に位置したＷＨＥＰドメインＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＴＲＳ－３と３つのドメインを連結するリンカーを含む）である。本発明によるｈＥＰＲＳのＷＨＥＰドメインは、目的タンパク質の大腸菌における発現のために融合タンパク質として使用されるとき、目的タンパク質の水溶性が向上した。【選択図】図１

Description

本発明は、目的タンパク質の発現効率を増進させるための融合タンパク質に関する。より詳細には、ｈＥＰＲＳ（Ｇｌｕｔａｍｙｌ－ｐｒｏｌｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ）のＷＨＥＰドメイン（ＥＰＲＳタンパク質の中間部分に位置したＷＨＥＰドメインＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＴＲＳ－３と３つのドメインを連結するリンカーを含む）に関する。本発明によるｈＥＰＲＳのＷＨＥＰドメインは、目的タンパク質の大腸菌での発現のために融合タンパク質として使用されるとき、目的タンパク質の受容性が向上した。
生命工学技術によって生産されるタンパク質では、一般的に、免疫調節及び酵素阻害剤並びにホルモンなどの医薬及び研究用タンパク質と、診断用タンパク質や反応添加酵素などの産業用タンパク質に大別することができ、この２種類のタンパク質を中心に生産工程技術開発及び産業化が推進されている。特に、組換え微生物技術を用いて有用な組換えタンパク質を生産するとき、遺伝情報がよく知られており、様々なベクターシステムを構築しており、比較的安価な培地で早く高濃度で培養できるという長所を持つ大腸菌が研究または商業的目的で多様に使用されている。
大腸菌で組換えタンパク質を生産するにあたり、強力な誘導性(ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ)プロモーターを備えた様々な発現ベクターが開発されて外来タンパク質の生産に用いられてきた。しかし、宿主細胞として大腸菌を用いる場合、製造しようとするタンパク質が大腸菌内のタンパク質分解酵素によって分解されて収率が低くなる場合が多く、特に分子量が１０ｋＤａ以下の小さなサイズのポリペプチドの発現においてこのような傾向が激しいことが知られている。それだけでなく、一般的に大腸菌は、タンパク質の転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）と転移（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）がほぼ同時に起こるため、組換えタンパク質の過剰発現時に不溶性凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成する場合が多く、凝集体として発現したポリペプチドの場合、折りたたみ(ｆｏｌｄｉｎｇ)中間体が分子相互間のジサルファイド結合（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）または疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって宿主細胞の他のタンパク質不純物［シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎ）、リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）、初期因子など］と非選択的に結合することにより、目的ポリペプチドの凝集体内の純度が低下するという短所がある。また、このように発現したタンパク質を活性型にするためには、グアニジン－塩酸塩（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）や尿素（ｕｒｅａ）などの変性体を使用して溶解させた後に希釈する再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程を経なければならないが、このとき、タンパク質が活性型に折りたたまれないなど生産歩留まりが減少するという問題点がある（Ｍａｒｓｔｏｎ ＦＡ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ２４０（１）：１－１２、１９８６）。
本発明者らは、ＷＨＥＰドメインの融合たんぱく質としての水溶性増進能力を確認する研究を行った。優先的に、１つのＷＨＥＰドメインのみを持つＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２と、３つのＷＨＥＰドメイン（ＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＴＲＳ－３）、リンカーを含む多重ＷＨＥＰドメイン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＷＨＥＰ ｄｏｍａｉｎ；ＥＰＲＳと称する）を作製した。そして、３種類の融合たんぱく質の目的タンパク質水溶性増進能力を確認してみた。３つの融合タンパク質のうち多重ＷＨＥＰドメインの水溶性増進能力が最も優れていることを確認し、本発明を完成させた。
従来知られている大腸菌において水溶性発現が難しいタンパク質を発現するため、融合タンパク質としてＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＥＰＲＳを使用し、目的タンパク質としてＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を使用して水溶性を比較した。確認の結果、ｈＥＰＲＳのＷＨＥＰドメインを含む融合タンパク質の中では、ＥＰＲＳが水溶性の上昇に最も大きく寄与することが確認された。ＥＰＲＳによる水溶性増進効果は、他の目的タンパク質であるＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｅｔａ（ＩＦＮ－ｂ）、Ｔｅｖ ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ（ＬＴＢ）を使用して追加確認された。
本発明の目的は、ＷＨＥＰドメインを融合パートナーとして用いて目的タンパク質の水溶性及び折りたたみを向上させることができるペプチド、組換えタンパク質生産用発現ベクターまたは遺伝子構造体（ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供することにある。
本発明の他の目的は、目的タンパク質の受容性を有意的に増加させることができるＷＨＥＰドメインの構成を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記発現ベクターに形質転換されるか、または遺伝子構造体（ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）が挿入された組換え微生物及びこれを用いた組換えタンパク質の製造方法を提供することにある。
本発明によれば、ヒト由来グルタミル－プロリルｔＲＮＡ合成酵素（ｈＥＰＲＳ、ｈｕｍａｎ Ｇｌｕｔａｍｙｌ－ｐｒｏｌｙｌｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）から分離したドメインの配列を含むことを特徴とする目的タンパク質の発現効率を増進させるためのペプチドが提供される。
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ドメインは、ＴＲＳ－１（配列番号１）及びＴＲＳ－２（配列番号２）を含み、最も好ましくは、前記ドメインは、ＴＲＳ－１（配列番号１）及びＴＲＳ－２（配列番号２）を含んでもよい。
本発明の前記ペプチドは、前記ドメインのそれぞれの配列を連結するため、リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）配列をさらに含んでもよく、前記リンカー配列は、配列番号３で表示されてもよい。
また、前記ペプチドは、目的タンパク質の発現効率を増進させるためのタグ(ｔａｇ)配列をさらに含んでもよい。
本発明において、前記目的タンパク質は、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質からなる群から１種以上選ばれてもよく、前記抗原は、新種コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）及びニパウイルス（Ｎｉｐｈａ ｖｉｒｕｓ）からなる群から１種以上選ばれてもよい。本発明の最も好ましい実施例によれば、前記抗原は、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）である。
本発明は、さらに前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一実施例によれば、目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド、及び前記目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドの５'－末端に結合された第１項～第８項のいずれか１項のペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
本発明の他の実施例によれば、前記発現ベクターに形質転換された宿主細胞が提供され、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。
本発明は、水溶性目的タンパク質の生産方法を提供し、当該方法は（Ａ）目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドの５'－末端に結合された第１項～第５項のいずれか１項のペプチドをコーディングするヌクレオチドを含む発現ベクターを製造する段階、（Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造する段階、及び（Ｃ）前記形質転換体を培養して組換え目的タンパク質の発現を誘導し、これを得る段階を含んでもよい。
本発明によるＷＨＥＰドメインを融合パートナーとして用いた組換えタンパク質の製造方法は、目的タンパク質の水溶性及び発現率を向上させ、様々な目的タンパク質の医療用及び産業用としての開発及び生産に有用である。
図１は、ＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＥＰＲＳを融合タンパク質として使用するようにデザインした発現用プラスミド。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）に目的タンパク質を挿入し、精製のためのｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ（６Ｘ Ｈｉｓ），融合タンパク質と目的タンパク質の切断のためＴｅｖ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ（ＴＥＶ ｓｉｔｅ）を含む。 図２は、ＥＰＲＳによるＧＦＰの受容性発現向上及び活性を測定したイメージである。 図３は、ＥＰＲＳによるＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｂｅｔａ（ＩＦＮ－ｂ）の受容性発現向上及び活性を測定したイメージである。 図４はＥＰＲＳによるＴｅｖ ｐｒｏｔｅａｓｅの受容性発現向上及び活性を測定したイメージである。 図５は、ＥＰＲＳによるｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎの受容性発現向上を確認したイメージである。その他に、ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃタンパク質を大腸菌内で発現し、ＥＰＲＳによるタンパク質の水溶性発現率増加効果をさらに確認した。Ｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎは、ｐｅｎｔａｍｅｒをなすタンパク質で、同様に大腸菌において水溶性の発現が難しいことが知られている。このタンパク質は、ＥＰＲＳと融合して発現確認した結果、ｄｉｒｅｃｔ ｆｏｒｍよりもＥＰＲＳが融合したｆｏｒｍの方がはるかに水溶性発現率を増加させることを確認した。 図６は、ＷＨＥＰドメインとＥＰＲＳの融合形態を示す模式図である。 図７は、本発明の一実施例によってＣＯＶＩＤ－１９のＲＢＤとＳ１とのＥＰＲＳ融合発現を確認したイメージである。 図８は、本発明の一実施例によってＲＳＶ Ｆ－ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎとのＥＰＲＳ融合発現を確認したイメージである。 図９は、本発明の一実施例によってＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３とのＥＰＲＳ融合発現を確認したイメージである。 図１０は、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅを処理したＥＰＲＳ－ＬＴＢのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 図１１は、ＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 図１２は、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅを処理したＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
本発明者らは、ｈＥＰＲＳのＷＨＥＰドメインを含む融合タンパク質の中では、ＥＰＲＳが水溶性の上昇に最も大きく寄与することを確認し、本発明を完成した。
本発明によれば、ＷＨＥＰドメインを融合パートナーとして用いて目的タンパク質の水溶性及び折りたたみを向上させることができるペプチド、組換えタンパク質生産用発現ベクターまたは遺伝子構造体（ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）が提供される。
本発明において「ベクター(ｖｅｃｔｏｒ)」とは、ＤＮＡ組換え実験において目的とするＤＮＡ断片を宿主菌などに導入させて増殖できるＤＮＡを指し、クローニング用運搬体（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅ）とも言うが、ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）ＤＮＡは、制限酵素などで切断して開環し、ここに目的とするＤＮＡ断片を挿入して連結して宿主菌に導入させる。目的とするＤＮＡ断片を連結したベクターＤＮＡは、宿主菌が増殖されることにより、複製して菌の分裂とともに各嚢細胞に分配されて目的とするＤＮＡ断片を代々維持して連結していき、例えば、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、ファージ染色体を使用してもよい。
前記ベクターの選択、作製、形質転換及び組換えタンパク質の発現などの方法は、本願発明が属する技術分野の当業者であれば容易に行うことができ、通常の方法において一部の変形も本発明に含まれる。
本発明において「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、外部から与えられた遺伝物質であるＤＮＡによって個体または細胞の形質が遺伝的に変化することを意味する。
前記ベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用してもよい。前記運搬方法は、例えば、微細注入法、カルシウムホスフェト沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法、遺伝子バンバードメントなどを使用してもよいが、これに限定されるものではない。）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを使用してもよい。
前記形質転換体培養時の培養条件は、宿主細胞によって慣用されるものを適当に選択して用いてもよい。培養時に細胞の生育とタンパク質の大量生産に適合するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適切に調節してもよい。
本発明において宿主細胞は、当業界で通常用いられる宿主細胞を用いてもよく、好ましくは、大腸菌を用いてもよい。
以下、本発明の図面を参照して実施例を詳細に説明する。本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する後述の実施例を参照すれば明確になるだろう。しかし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるのではなく、互い異なる様々な形態で具現されてもよく、単に本実施例は、本発明の開示を完全にするようにし、本発明が属する技術分野で通常の知識を持つ者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。明細書の全体において同じ参考符号は、同じ構成要素を指す。
特に定義のない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術及び科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野で通常の知識を持つ者に共通して理解できる意味で使用できるだろう。また、一般的に使用される事前に定義されている用語は、明らかに特に定義されていない限り、理想的にまたは過度に解釈されない。本明細書において使用される用語は、実施例を説明するためのものであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書において、単数形は文言に特に言及しない限り、複数形も含む。
［実施例１］
実施例１－１．タンパク質発現ベクターの作製
タンパク質発現ベクターとしてｐＧＥ－ＬｙｓＲＳ発現ベクターを使用した（Ｃｈｏｉ ＳＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＮＡ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２００８），３：ｅ２６７７）。ｐＧＥ－ＬｙｓＲＳは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒによって発現が調節され、ＬｙｓＲＳ遺伝子をＮｄｅ１とＭＣＳ（Ｋｐｎ１－ＢａｍＨ１－ＥｃｏＲＶ－Ｓａｌ１－Ｈｉｎｄ３）にある切断位置のいずれかを使用して切り取り、その位置にＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、またはＥＰＲＳを挿入してｐＧＥ－ＴＲＳ－１、ｐＧＥ－ＴＲＳ－２、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ発現ベクターを作製した。そして、各発現ベクターのＣ末端位置に目的タンパク質を挿入し、ＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＥＰＲＳが融合した目的タンパク質発現ベクターを作製した（図１）。目的タンパク質としては、ＧＦＰ、ＩＦＮ－ｂ、Ｔｅｖプロテアーゼ、ＬＴＢが使用された。このように作製された発現ベクターは、ｐＧＥ－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＴＲＳ－１－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＴＲＳ－２－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＩＦＮ－ｂ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＩＦＮ－ｂ、ｐＧＥ－Ｔｅｖ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－Ｔｅｖ、ｐＧＥ－ＬＴＢ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＬＴＢである。
実施例１－２．タンパク質発現及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製様相を確認
製造されたタンパク質発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳまたはＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標） Ｔ７ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換させて培養した。すべての形質転換された大腸菌は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で培養し、ｐＬｙｓＳが含まれた大腸菌は、３４ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが追加されている培地で培養した。培養温度は、タンパク質ごとに異なり、１６－３７℃の条件で培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０．５以上になると、Ｔ７プロモーターを活性化させるためにＩＰＴＧを０ｕＭ～１ｍＭレベルで入れ、タンパク質が十分に生産されるように、ＩＰＴＧを入れてから、１６－３７℃では３時間、２５℃では５時間、１６－２４℃では１６時間程度を培養した。十分に培養された大腸菌は、遠心分離して上清液を除去した後に保管した。次に、ＬＢ培地の５ｍｌに該当する大腸菌収穫物にＰＢＳ０．３ｍｌを入れて超音波粉砕を行って溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を作製した。そして、溶解物を遠心分離して水溶性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶性分画（ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分け、総溶解物、水溶性分画、不溶性分画を区分してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
実施例１－３．タンパク質発現及び精製
製造されたｐＧＥ－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＴＲＳ－１－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＴＲＳ－２－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＧＦＰ、ｐＧＥ－ＩＦＮ－ｂ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＩＦＮ－ｂ、ｐＧＥ－Ｔｅｖ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－Ｔｅｖ発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ水溶性細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させて培養した。すべての形質転換された大腸菌は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンと３４ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＬＢで培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０.５以上になると、Ｔ７プロモーターを活性化させるためにＩＰＴＧを１ｍＭレベルで入れ、タンパク質が十分に生産されるように、ＩＰＴＧを入れてから３０℃で６時間程度を培養した。十分に培養された大腸菌は遠心分離して上清液を除去した後に保管した。
得られた大腸菌収穫物にＰＢＳを入れて超音波粉砕し、溶解物を作製した。そして、溶解物を遠心分離して水溶性分画のみを得た後、Ｎｉ２＋－クロマトグラフィー法を用いて精製し、精製されたタンパク質は、ＰＢＳに透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐを活用して濃縮させた。
実施例１－４．ＧＦＰ活性測定
単位細胞あたり作製されたＧＦＰタンパク質の活性を測定するための実験を行った。タンパク質発現完了後、遠心分離して上清液が除去された大腸菌培養体をＰＢＳに入れて超音波粉砕して溶解物を作製した。その後、溶解物を遠心分離して水溶性分画のみを得た後、分光光度計で蛍光を測定し、ＧＦＰの実際の活性を測定した（図２）。
Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）は、大腸菌内で単独発現時に不溶性で作製されるタンパク質として知られている。融合タンパク質なしに単独発現されたｄｉｒｅｃｔ ＧＦＰとＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＥＰＲＳが融合した融合タンパク質を大腸菌で発現後、発現様相を確認した結果、すべての融合タンパク質においてｄｉｒｅｃｔ ＧＦＰより水溶性発現率が増加する様相を示し、特にＥＰＲＳが融合したＧＦＰの水溶性発現率が非常に高く増加する結果を確認した。
培養容量あたり発現されたＧＦＰ活性を測定した結果、ＴＲＳ－２が融合したＧＦＰは、ｄｉｒｅｃｔ ＧＦＰと類似したレベルの蛍光活性を示し、ＴＲＳ－１、ＥＰＲＳが融合したＧＦＰは、さらに高いレベルの蛍光活性を示した。
これを通じてＴＲＳ－１、ＴＲＳ－２、ＥＰＲＳによって目的タンパク質であるＧＦＰの水溶性発現量が増加することを確認し、作製されたタンパク質の活性があることを確認した。
実施例１－５．ＩＦＮ－ｂｅｔａ活性測定
大腸菌で発現されたＩＦＮ－ｂｅｔａ活性は、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＦＮ－α／βＣｅｌｌｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて測定した。実験は、販売者のｐｒｏｔｏｃｏｌに合わせて行い、簡単にまとめると、次の通りである。９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＩＦＮ－ｂｅｔａによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙを観察できるように変形されたＨＥＫ－ｂｌｕｅＴＭＩＦＮ－α／βＣｅｌｌｓ浮遊液１８０ｕｌとＩＦＮ－ｂｅｔａｓａｍｐｌｅ２０ｕｌを入れて３７℃５％ＣＯ２培養器でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養する。翌日、ＨＥＫ－ｂｌｕｅＴＭＩＦＮ－α／βＣｅｌｌｓで反応が現れたｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ２０ｕｌとＱｕａｎｔｉＢｌｕｅＴＭｓｏｌｕｔｉｏｎ１８０ｕｌを混合し、３７℃で３０分～３時間ほど反応させた。反応が完了すれば、６２０－６５５ｎｍの波長でｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでレベルを測定した（図３）。
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｅｔａ（ＩＦＮ－ｂ）も大腸菌で不溶性として発現されるタンパク質で、融合タンパク質のないｄｉｒｅｃｔ ＩＦＮ－ｂは、大腸菌で水溶性発現率が非常に低い特徴を示す。ＥＰＲＳを融合タンパク質として使用したとき、融合タンパク質は、高い水溶性発現率を示した。
精製されたＩＦＮ－ｂの活性をＨＥＫ－ｂｌｕｅＴＭＩＦＮ－α／βＣｅｌｌｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で測定したとき、ＣＨＯ ｃｅｌｌで発現及び精製されたｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ＩＦＮ－ｂが最も活性が高く、ＥＰＲＳが融合したＩＦＮ－ｂ融合タンパク質の活性がその次に高く現れた。ＤｉｒｅｃｔＩＦＮ－ｂの場合、最も低い活性を示した。
これを通じて、ＥＰＲＳによってＩＦＮ－ｂの水溶性及び活性型の発現が促進されることを確認した。
実施例１－６．Ｔｅｖ ｐｒｏｔｅａｓｅ活性測定
大腸菌で発現されたＴｅｖプロテアーゼの活性測定のためにＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）５２０ＴＥＶ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ＊Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ＊キットを使用した。実験は、販売者のプロトコルに合わせて行い、簡単にまとめると、次の通りである。実験用Ｔｅｖプロテアーゼと５－ＦＡＭ／ＱＸＬ（登録商標）５２０ＴＥＶ基質を９６ｗｅｌｌに入れ、蛍光を１分ごと測定した。このときに測定する蛍光は、Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２０ｎｍとする。Ｔｅｖプロテアーゼによって基質が切られて蛍光が増加することになるが、これを用いてＴｅｖプロテアーゼの活性を測定した（図４）。
Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）のプロテアーゼは、商業的需要が高いタンパク質で、大腸菌内で組換えタンパク質として得にくいタンパク質の一種である。融合タンパク質がないとき、ｄｉｒｅｃｔ Ｔｅｖプロテアーゼは、大腸菌で低い水溶性発現率を示し、ＥＰＲＳを融合したときに水溶性発現率上昇効果を示した。大腸菌培養時に発現温度を下げたとき（２０℃）ｄｉｒｅｃｔ ＴｅｖプロテアーゼとＥＰＲＳ－Ｔｅｖプロテアーゼ双方で水溶性発現率が増加し、特にＥＰＲＳ－Ｔｅｖプロテアーゼの場合、９０％以上の水溶性発現率を示した。
精製したＴｅｖプロテアーゼの活性をＴｅｖプロテアーゼ活性分析キット（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）５２０ ＴＥＶ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）で確認した結果、ｄｉｒｅｃｔ Ｔｅｖプロテアーゼは、同量であるにもかかわらず活性が低く測定され、最も急速に酵素活性を示す構造は、ＥＰＲＳが融合したＥＰＲＳ－ＴＥＶであった。
これを通じて、ＥＰＲＳによるＴｅｖプロテアーゼの水溶性及び活性型の発現を確認した。
［実施例２］
実施例２－１．タンパク質の発現及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる水溶性確認
目的タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）と相対的にサイズが大きいｓｐｉｋｅ ｓｕｂｕｎｉｔ１（Ｓ１）を使用して作製されたベクターは、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＲＢＤ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－Ｓ１である。
製造されたタンパク質発現ベクターをそれぞれＢＬ２１またはＨＭＳ１７４ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換させて培養した。すべての形質転換された大腸菌は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０.５以上になると、Ｔ７プロモーターを活性化させるためにＩＰＴＧを０.５ｍＭで入れた後、１６℃で１６時間程度を培養した。培養された大腸菌は、遠心分離して上清液を除去した後、－８０℃で保管した。次に、ＬＢ培地の５ｍｌに該当する大腸菌収穫物にｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭ ｂｅｔａ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０.１％ｔｗｅｅｎ－２０]０．３ｍｌを入れて超音波粉砕して溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を作製した。また、溶解物を遠心分離して水溶性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶性分画（ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分け、総溶解物、水溶性分画、不溶性分画を区分してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＲＢＤとＳ１のサイズは、それぞれ２７ｋＤａと７３ｋＤａであり、ＥＰＲＳと融合したサイズは、それぞれ４９ｋＤａと９５ｋＤａである（図７参照）。
目的タンパク質としてＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）Ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）とｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅのためのｓｃａｆｆｏｌｄタンパク質としてｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎを使用して作製されたベクターは、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＲＳＶＦ－ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎである。
製造されたタンパク質発現ベクターをＳｈｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換させて培養した。すべての形質転換された大腸菌は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０.５以上になると、Ｔ７プロモーターを活性化させるためにＩＰＴＧを０.５ｍＭで入れた後、２０℃で６時間程度を培養した。培養された大腸菌は、遠心分離して上清液を除去した後、－８０℃で保管した。次に、ＬＢ培地の５ｍｌに該当する大腸菌収穫物にｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０.１％ｔｗｅｅｎ－２０]０.３ｍｌを入れて超音波粉砕して溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を作製した。また、溶解物を遠心分離して水溶性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶性分画（ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分け、総溶解物、水溶性分画、不溶性分画を区分してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＲＳＶＦ－ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎのサイズは、７０ｋＤａであり、ＥＰＲＳと融合したサイズは、９２ｋＤａである（図８参照）。
目的タンパク質として日本脳炎ウイルス構造内の５倍軸にｐｅｎｔａｍｅｒで存在し、免疫誘導に重要な役割を果たすことが知られているｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎのｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ（ＥＤ３）とｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄとしてｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＬＴＢ）を使用して作製されたベクターは、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３である。
製造されたタンパク質発現ベクターをＳｈｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換させて培養した。すべての形質転換された大腸菌は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０.５以上になると、Ｔ７プロモーターを活性化させるためにＩＰＴＧを１ｍＭで入れた後、２０℃で６時間程度を培養した。培養された大腸菌は、遠心分離して上清液を除去した後、－８０℃で保管した。次に、ＬＢ培地の５ｍｌに該当する大腸菌収穫物にｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ]０.３ｍｌを入れて超音波粉砕し、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を作製した。また、溶解物を遠心分離して水溶性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶性分画（ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分け、総溶解物、水溶性分画、不溶性分画を区分してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３のサイズは、２４ｋＤａであり、ＥＰＲＳと融合したサイズは、４６ｋＤａである（図９参照）。
実施例２－２．タンパク質の精製
Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換されたｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＬＴＢ、ｐＧＥ－ＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３発現ベクターは、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で培養した。大腸菌のＯＤ６００値が０.５以上になると、ＩＰＴＧを１ｍＭレベルで入れた後、２０℃で６時間程度を培養した。十分に培養された大腸菌は、遠心分離して上清液を除去した後、－８０℃で保管した。
収穫された大腸菌にＡ ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ]を入れて超音波粉砕して溶解物を作製した。また、溶解物を遠心分離して水溶性分画のみを得た後、ニッケルクロマトグラフィー法を用いて精製し、精製されたタンパク質は、ｓｔｏｒａｇｅ ｂｕｆｆｅｒ[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ]に透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）し、ａｍｉｃｏｎを活用して濃縮した。
実施例２－３．サイズ排除クロマトグラフィーによる五量体確認
精製されたＥＰＲＳ－ＬＴＢとＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３タンパク質が五量体構造を形成するか検証するため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）を行い、サイズが既知のマーカータンパク質でｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎをしてタンパク質のサイズを測定した。このときに使用されたバッファの組成は、[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７.５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ]である。タンパク質は、ＥＰＲＳが融合したものとＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅを処理してＥＰＲＳと目的タンパク質の間にあるｔｅｖ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅが切断されてＥＰＲＳが除去されたタンパク質をすべて検証した。五量体のサイズにおいてピーク（ｐｅａｋ)の立ち上がった分画は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで再び検証した。
その結果、それぞれのタンパク質は、五量体予測サイズにおいてピークを示し（図１０～１２参照、左パネル）、そのピークの分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにＤＴＴのあるｒｅｄｕｃｅｄ状態とＤＴＴのないｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｅｄ状態で見下ろした時、似たサイズでバンドが現れることを確認した（図１０～１２参照、右パネル）。五量体をなしたとき、それぞれのサイズは、ＬＴＢは、約６０ｋＤａ、ＥＰＲＳ－ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３は、約２３０ｋＤａ、ＬＴＢ－ＪＥＶＥＤ３は、約１２５ｋＤａである。したがって、ＥＰＲＳの融合により大腸菌で目的タンパク質の水溶性を高めることができるだけでなく、タンパク質の適切な折りたたみを誘導することにより、多量体への組み立てが可能であることを確認した。
配列表のフリーテキスト
配列番号１
ＴＲＳ１
ＬＹＮＲＶＡＶＱＧＤＶＶＲＥＬＫＡＫＫＡＰＫＥＤＶＤＡＡＶＫＱＬＬＳＬＫＡＥＹＫＥＫＴＧＱＥＹＫＰＧＮＰＰ
配列番号２
ＴＲＳ１
ＬＹＤＥＶＡＡＱＧＥＶＶＲＫＬＫＡＥＫＳＰＫＡＫＩＮＥＡＶＥＣＬＬＳＬＫＡＱＹＫＥＫＴＧＫＥＹＩＰＧＱＰＰ
配列番号３
ＴＲＳ３
ＬＦＤＫＶＡＳＱＧＥＶＶＲＫＬＫＴＥＫＡＰＫＤＱＶＤＩＡＶＱＥＬＬＱＬＫＡＱＹＫＳＬＩＧＶＥＹＫＰ
配列番号４
ＡＥＩＧＱＮＩＳＳＮＳＳＡＳＩＬＥＳＫＳ
配列番号５
ＬＳＱＳＳＤＳＳＰＴＲＮＳＥＰＡＧＬＥＴＰＥＡＫＶ
配列番号６
ＥＰＲＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＬＹＮＲＶＡＶＱＧＤＶＶＲＥＬＫＡＫＫＡＰＫＥＤＶＤＡＡＶＫＱＬＬＳＬＫＡＥＹＫＥＫＴＧＱＥＹＫＰＧＮＰＰＡＥＩＧＱＮＩＳＳＮＳＳＡＳＩＬＥＳＫＳＬＹＤＥＶＡＡＱＧＥＶＶＲＫＬＫＡＥＫＳＰＫＡＫＩＮＥＡＶＥＣＬＬＳＬＫＡＱＹＫＥＫＴＧＫＥＹＩＰＧＱＰＰＬＳＱＳＳＤＳＳＰＴＲＮＳＥＰＡＧＬＥＴＰＥＡＫＶＬＦＤＫＶＡＳＱＧＥＶＶＲＫＬＫＴＥＫＡＰＫＤＱＶＤＩＡＶＱＥＬＬＱＬＫＡＱＹＫＳＬＩＧＶＥＹＫＰ
配列番号７
ＣＯＶＩＤ－１９ＲＢＤ
ＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦ
配列番号８
ＣＯＶＩＤ－１９Ｓ１
ＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧ
配列番号９
Ｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＬＴＢ）
ＡＰＱＴＩＴＥＬＣＳＥＹＲＮＴＱＩＹＴＩＮＤＫＩＬＳＹＴＥＳＭＡＧＫＲＥＭＶＩＩＴＦＫＳＧＥＴＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＴＹＬＴＥＴＫＩＤＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＮＳＩＡＡＩＳＭＫＮ
配列番号１０
Ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎ
ＭＫＧＤＴＫＶＩＮＹＬＮＫＬＬＧＮＥＬＶＡＩＮＱＹＦＬＨＡＲＭＦＫＮＷＧＬＫＲＬＮＤＶＥＹＨＥＳＩＤＥＭＫＨＡＤＲＹＩＥＲＩＬＦＬＥＧＬＰＮＬＱＤＬＧＫＬＮＩＧＥＤＶＥＥＭＬＲＳＤＬＡＬＥＬＤＧＡＫＮＬＲＥＡＩＧＹＡＤＳＶＨＤＹＶＳＲＤＭＭＩＥＩＬＲＤＥＥＧＨＩＤＷＬＥＴＥＬＤＬＩＱＫＭＧＬＱＮＹＬＱＡＱＩＲＥＥＧ
配列番号１１
ＲＳＶＦ
ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＰＴＮＮＲＡＲＲＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＩＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＭＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬ
配列番号１２
ＪＥＶ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ（ＥＤ３）
ＫＧＴＴＹＧＭＣＴＥＫＦＳＦＡＫＮＰＡＤＴＧＨＧＴＶＶＩＥＬＳＹＳＧＳＤＧＰＣＫＩＰＩＶＳＶＡＳＬＮＤＭＴＰＶＧＲＬＶＴＶＮＰＦＶＡＴＳＳＡＮＳＫＶＬＶＥＭＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＶＧＲＧＤＫＱＩＮＨＨＷＨＫＡＧ

Claims (13)

  1. ヒト由来グルタミル－プロリルｔＲＮＡ合成酵素（ｈＥＰＲＳ、ｈｕｍａｎ Ｇｌｕｔａｍｙｌ－ｐｒｏｌｙｌｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）から分離したドメインの配列を含むことを特徴とする、目的タンパク質の発現効率を増進させるためのペプチド。
  2. 前記ドメインは、ＴＲＳ－１（配列番号１）及びＴＲＳ－２（配列番号２）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  3. 前記ドメインは、ＴＲＳ－３（配列番号３）をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
  4. 前記ペプチドは、前記ドメインのそれぞれの配列を連結するためのリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  5. 前記リンカー配列は、配列番号４または５で表示されるものである、請求項４に記載のペプチド。
  6. 前記ペプチドは、目的タンパク質の発現効率を増進させるためのタグ(ｔａｇ)配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  7. 前記目的タンパク質は、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清及び細胞タンパク質からなる群から１種以上選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  8. 前記抗原は、新種コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）及びニパウイルス（Ｎｉｐｈａ ｖｉｒｕｓ）からなる群から１種以上選ばれることを特徴とする、請求項７に記載のペプチド。
  9. 請求項１～８のいずれか１項によるペプチドをコーディングするポリヌクレオチド。
  10. 目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと、
    前記目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドの５'－末端に結合された請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドをコーディングするポリヌクレオチドと、を含む発現ベクター。
  11. 請求項１０に記載の発現ベクターに形質転換された宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. （Ａ）目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドの５'－末端に結合された請求項１～５のいずれか１項のペプチドをコーディングするヌクレオチドを含む発現ベクターを製造する段階と、
    （Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造する段階と、
    （Ｃ）前記形質転換体を培養して組換え目的タンパク質の発現を誘導し、これを得る段階と、を含む水溶性目的タンパク質の生産方法。
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