KR102038876B1

KR102038876B1 - 목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드

Info

Publication number: KR102038876B1
Application number: KR1020180047365A
Authority: KR
Inventors: 성백린; 권순빈; 황범증; 김영석; 이혜민; 양승원
Original assignee: (주)인테라
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2019-11-01

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 사람 유래 LysRS(hLysRS, human lysyl tRNA synthetase)로부터 분리한 N-말단 도메인(hRID, hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain)의 돌연변이 서열을 포함하는 펩타이드 및 이를 이용한 수용성 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돌연변이 hRID 펩타이드는 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 때 목적 단백질의 수용성 발현을 현저히 증진시킬 수 있으며, 그 동안 대장균에서 생산이 어려웠던 다양한 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드{Novel peptides for enhancing soluble expression of target proteins}

본 발명은 목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소(hLysRS, human lysyl tRNA synthetase)로부터 분리한 N-말단 도메인(hRID, hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain)의 돌연변이 서열을 포함하는 펩타이드 및 이를 이용한 수용성 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

현대의 생명공학에 있어서 핵심은 재조합 단백질의 생산이며 그 중에서도 중요한 것은 재조합 단백질의 양을 많이 생산하는 것이다. 많이 생산된 재조합 단백질은 활성 외래 단백질의 생산 및 회수, 기능 연구를 위한 결정화, 산업화 등에 매우 중요하다. 현재까지 대장균을 이용한 많은 재조합 단백질 생산 연구가 진행되어 왔는데, 이는 대장균의 조작이 쉬울 뿐만 아니라, 짧은 성장시간, 안전한 발현, 저비용 특성을 가지며, 생산 규모를 쉽게 바꿀 수 있는 장점이 있기 때문이다. 그러나, 대장균(E. coli)에서 생산된 외래 기원의 재조합 단백질은 발현 레벨이 낮거나, 적절한 "전사 후 샤페론(post-translational chaperons)"이나 "전사 후 과정(posttranslational processing)"이 없기 때문에, 생산된 재조합 단백질의 불가용성 단백질 응집체(inclusion body)로 형성되는 단점이 지적되고 있다(Francois Baneyx. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10:411-421).

이러한 문제들을 해결하기 위하여 종래 기술에서 여러 가지 방법이 알려져 있다. 우선적으로, 단백질 발현 온도 조건을 낮게 잡을수록 단백질의 수용성과 활성이 증가된다고 알려져 있다(Schein, C. H. and Noteborn, M. H. M., 1988. Bio-Technology 6, 291-294). 또한, 재조합 단백질에 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin-related modifier; SUMO), 티오레독신(thioredoxin; Trx) 또는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST) 등과 같은 수용성이 높은 단백질을 융합시켜 발현시키는 것도 효과적인 방법으로 개발되어 있다(Dominic Esposito and Deb K Chatterjee, 2006. Current Opinion in Biotechnology 17:353-358). 이 뿐만 아니라, 단백질 접힘을 도와주는 것으로 알려진 샤페론(chaperone)을 과발현시키는 방법도 개발되었으나, 이는 일부 단백질에서만 효과를 보이는 것으로 알려졌다(Structural Genomics, C. et al., 2008. Nature Methods 5, 135-146).

기존에 알려진 결과에 따르면, RNA 역시 재조합 단백질 생산 시 샤페론적인 기능을 할 수 있다. RNA와 결합하는 단백질을 융합 파트너 단백질로 사용하여 목적 단백질을 대장균에서 발현할 때, 목적 단백질의 수용성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 RNA 결합 단백질로는 대장균의 LysRS(E. coli lysyl tRNA synthetase; eLysRS)가 최초로 개발되었고, eLysRS는 기존의 융합 단백질 중 가장 활용도가 높은 MBP보다 효과가 훨씬 더 좋은 것으로 확인되었다(Choi SI et al., 2008. PLoS ONE 3:e2677).

그러나, LysRS는 약 100 kDa(monomer size = 약 58 kDa)이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 또한, eLysRS는 대장균 유래의 단백질이기 때문에, 포유동물에 단백질 백신 혹은 치료제로서 사용될 경우 과다한 면역반응을 유도하는 문제도 있다.

이러한 eLysRS의 단점을 극복하기 위한 방법으로 eLysRS의 RNA 결합 도메인(RNA binding domain)만을 활용한 기술이 개발되었고, 나아가 대장균 대신 사람 유래의 LysRS(human lysyl tRNA synthetase; hLysRS)를 활용하는 방법이 개발되었다. 특히 대장균과 달리 사람을 포함한 진핵생물(eukaryote)의 LysRS에는 RNA와 결합하는 N-말단 도메인(N terminal appended domain)이 존재하는데, 사람 유래 LysRS로부터 분리한 N-말단 도메인(hLysRS N terminal appended RNA interacting domain; hRID)를 융합 파트너로 활용하는 경우, 목적 단백질의 수용성을 증진시킬 수 있다는 점이 확인되었다 (Yang et al., 2018. FASEB DOI 10.1096/fj.201700747RR; Kwon et al., 2018. Parasitology DOI 10.1017/S0031182018000434).

목적 단백질의 수용성 발현율을 높이기 위한 종래 기술은 RNA와 결합하는 단백질을 목적 단백질과 융합 단백질 형태로 발현시킴으로써 RNA의 샤페론적 기능을 이용하는 것이며, RNA와의 결합력이 수용성 증가 효과와 비례한다고 알려져 있었다. 그러나, 본 발명자들은 hRID 서열 중 RNA와 결합하는 잔기를 변이시켰을 때 RNA와 결합력이 떨어지지만 목적 단백질의 수용성은 현저히 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0890579호 미국등록특허 US7,759,303

Francois Baneyx. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10:411-421 Schein, C. H. and Noteborn, M. H. M., 1988. Bio-Technology 6, 291-294 Dominic Esposito and Deb K Chatterjee, 2006. Current Opinion in Biotechnology 17:353-358 Structural Genomics, C. et al., 2008. Nature Methods 5, 135-146 Choi SI et al., 2008. PLoS ONE 3:e2677 Yang et al., 2018. FASEB DOI 10.1096/fj.201700747RR Kwon et al., 2018. Parasitology DOI 10.1017/S0031182018000434

본 발명의 목적은 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소(hLysRS, human lysyl tRNA synthetase)로부터 분리한 N-말단 도메인(hRID, hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain)의 아미노산 서열 중 하나 이상의 양전하를 띄는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 수용성 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소로부터 분리한 N-말단도메인(hRID)의 아미노산 서열 중 하나 이상의 양전하를 띄는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "펩타이드(peptide)"는 "단백질" 또는 "폴리펩타이드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에서 사용된 용서 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "돌연변이(mutation)"는 아미노산 서열 중 하나 이상의 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 아미노산 서열 중 일부 잔기가 삭제되거나, 특정 아미노산 잔기가 삽입된 것을 의미한다. 본 발명에서 "돌연변이"는 "점 돌연변이(point mutation)" 또는 "위치 지정 돌연변이(site directed mutation)"와 호환성 있게 사용되며, 특정 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 돌연변이를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 hRID의 아미노산 서열 중 하나 이상의 양전하를 띄는 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환됨으로써 생성되는 돌연변이 hRID를 포함한다. 바람직하게 본 발명의 돌연변이가 나타나는 아미노산 잔기는 hRID 서열 중 RNA의 결합에 관여하는 잔기에서 선택될 수 있으며, 돌연변이 서열은 아미노산 잔기 치환에 의해 야생형 hRID 보다 RNA와의 결합력이 감소할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 아미노산 잔기의 치환이 나타나는 양전하를 띄는 아미노산 잔기는 라이신(Lysine, K), 아르기닌(Arginine, R) 또는 히스티딘(Histidine, H)일 수 있으며, 바람직하게 hRID 서열 중 RNA의 결합에 관여하는 잔기에서 선택될 수 있고, 돌연변이 서열은 아미노산 잔기 치환에 의해 야생형 hRID 보다 RNA와의 결합력이 감소할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 양전하를 띄는 아미노산 잔기는 라이신 또는 아르기닌일 수 있다.본 발명의 상기 hRID는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 hRID가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 돌연변이가 나타나는 아미노산 잔기는 RNA와 결합하는 데 관여하는 양전하를 띄는 잔기이며, 바람직하게는 19번째 라이신(K19), 23번째 라이신(K23), 24번째 아르기닌(R24), 27번째 라이신(K27), 30번째 라이신(K30), 31번째 라이신(K31), 35번째 라이신(K35), 38번째 라이신(K38) 및 40번째 라이신(K40) 잔기 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 1로 표시되는 hRID의 돌연변이 위치 및 치환되는 잔기는 K19A, K23A, R24A, K27A, K30A, K31A, K35A, K38A 및 K40A 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 태그(tag) 서열을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 "목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 태그(tag) 서열"이란, 목적 단백질의 N- 또는 C-말단에 결합하거나, 본 발명의 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 결합하여, 목적 단백질과 함께 융합 단백질 형태로 발현됨으로써 목적 단백질의 과발현 또는 수용성 발현을 증진시키는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미한다. 이는 재조합 단백질의 발현 효율을 높일 수 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein; MBP), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA), 수모(small ubiquitin-related modifier; SUMO), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), 이황화물 이성질화효소(protein disulfide isomerase; PDI), 또는 단백질 이황화물 이성질화효소 b'a' 도메인(protein disulfide isomerase b'a' domain; PDIb'a')일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 있어서, 바람직하게 상기 태그 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(mseqhaq)이 선택될 수 있다.

본 발명에서 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄)법, 염화칼슘(CaCl₂)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 목적 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 목적 단백질의 생산 방법은:

(A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

(B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및

(C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이 hRID 펩타이드는 재조합 단백질을 대장균에서 생산할 때 목적 단백질의 수용성 발현을 현저히 증진시킬 수 있으며, 그동안 대장균에서 생산이 어려웠던 다양한 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 적용할 수 있다.

도 1은 발현 향상 태그 유무에 따른 hRID의 발현 정도(A), 야생형 hRID(WT)와 돌연변이 hRID(K32A, K27A, K31A, K23A/K27A, K23A/K31A)의 발현 정도(B)를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다(T, total protein; S, soluble protein; P, pellet protein; E, Eluted protein; M, Marker).
도 2는 대장균에서 발현시킨 야생형 hRID(WT)와 돌연변이 hRID(K32A, K27A, K31A, K23A/K27A, K23A/K31A)와 tRNA의 결합을 확인한 결과이다.
도 3은 대장균에서 발현시킨 야생형 hRID(WT) 또는 돌연변이 hRID(K32A; K27A; hRID(2m), K23A-K27A; hRID(6m), K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A; hRID(9m), K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A-K35A-K38A-K40A)와 함께 정제된 RNA를 280 nm에서의 흡광도로 확인한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 야생형 hRID(WT) 또는 돌연변이 hRID(K32A; K27A; hRID(2m); hRID(6m); hRID(9m))의 tRNA와의 결합력을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 돌연변이 hRID(K23A, K27A)를 GFP 단백질의 융합 파트너로서 사용하였을 때 단백질 발현(A), 수용성(B) 및 목적 단백질의 활성(C)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 돌연변이 hRID(2m), hRID(9m)를 EGFP 단백질의 융합 파트너로서 사용하였을 때 단백질 발현(A), 수용성(B) 및 목적 단백질의 활성(C)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 돌연변이 hRID(2m)를 루시퍼라제 단백질의 융합 파트너로서 사용하였을 때 단백질 발현(A), 수용성(B) 및 목적 단백질의 활성(C)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 돌연변이 hRID(2m), hRID(6m), hRID(9m)를 HAgD 단백질의 융합 파트너로서 사용하였을 때 단백질 발현 및 수용성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 돌연변이 hRID(2m), hRID(9m)를 다양한 목적 단백질의 융합 파트너로서 사용하였을 때 단백질 발현 및 수용성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실험 방법>

1. 돌연변이 hRID 서열 제작

서열번호 1로 표시되는 hRID의 양전하를 띄는 아미노산들 중에서, K19, K23, R24, K27, K30, K31, K35, K38, K40 부위에 대해 1개 이상의 돌연변이 서열을 제조하였다. 구체적으로, RNA 결합과 관련된 9개의 아미노산들 중에서 영향력이 클 것으로 보고된 K23, K27, K31을 하나씩 변이 시켰고(K23A, 서열번호 4; K27A, 서열번호 5; K31A, 서열번호 6), 다음으로 9개 아미노산 부위 중에 2 이상의 서열을 변이시켰다(K23A-K27A, 서열번호 7; K23A-K31A, 서열번호 8; K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A, 서열번호 9; K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A-K35A-K38A-K40A, 서열번호 10).

각각의 hRID 단백질 N-말단에는 재조합 단백질 발현 효율 향상을 위한 태그(tag) 서열(서열번호 2)을 융합하였으며, hRID 서열의 돌연변이를 유도하기 위해서는 상업화된 키트(site-directed mutagenesis kit, Elpis, EBT-5001)를 사용하였다.

2. 단백질 발현 벡터의 제작

본 발명의 실시예에서 단백질 발현 벡터로 pGE-LysRS 발현 벡터를 사용하였다(Choi SI et al., 2008. PLoS ONE 3:e2677). pGE-LysRS는 T7 프로모터에 의해 발현이 조절된다. LysRS 유전자를 Nde1과 MCS(Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3)에 있는 절단 위치 중 하나를 사용하여 잘라내고, 그 위치에 hRID 또는 돌연변이 hRID를 삽입하여 pGE-hRID 발현 벡터를 만들었다. 그 다음으로 pGE-hRID 발현 벡터의 hRID C-말단(C-terminal) 위치에 목적 단백질을 삽입하여, hRID 또는 돌연변이 hRID가 융합된 목적 단백질 발현 벡터를 만들었다.

본 발명의 하기 실시예에서 목적 단백질은 GFP, EGFP, Luciferase, HAgd, fhaB, NoV VP1, GCSF, MERS RBD-BFR, FMDV VP0, VP3, VP1을 사용하였다.

3. hRID 단백질 및 돌연변이 hRID 단백질 발현 및 정제

제조된 pGE-hRID 및 돌연변이 hRID 발현 벡터를 BL21(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 μg/ml의 암피실린(ampicillin)과 34 μg/ml의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 대장균의 OD₆₀₀ 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 1 mM 수준으로 넣어주었다. 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어준 이후부터 37℃에서 3시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다.

수확된 대장균 수확물에 PBS를 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리를 하여 수용성 분획(soluble fraction)만을 분리한 다음, 니켈 크로마토그래피(Ni² ⁺-chromatography) 법을 이용해 정제하였다. 정제된 단백질은 PBS에 희석한 후 Centrifugal filter device(Centriprep®, Merck Millipore)을 이용해 농축시켰다. 농축한 정제 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였고, 단백질과 결합하여 같이 정제된 RNA는 280 nm의 흡광도와 아가로스겔(Agarose gel)에서 EtBr(ethidium bromise) 염색법으로 확인하였다. 같이 정제된 RNA가 DNA가 아니고 RNA임을 확인하기 위해서, 리보누클레아제(RNaseA) 또는 열(heat)을 처리하여 확인하였다.

5. 목적 단백질 발현 및 SDS-PAGE

상기 제조된 단백질 발현 벡터를 재조합된 목적 단백질에 따라 BL21*(DE3), BL21*(DE3)-pLysS, BL21(DE3)-pLysE, HMS174(DE3), HMS174(DE3)-pLysE, 또는 SHuffle® T7 competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 μg/ml의 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였으며, pLysS 또는 pLysE가 포함된 대장균은 34 μg/ml의 클로람페니콜이 추가되어 있는 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 융합된 목적 단백질에 따라 16 ~ 37℃의 조건에서 배양하였다. 대장균의 OD₆₀₀ 값이 0.5 이상이 되면, T7 프로모터를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0 μM ~ 1 mM 수준으로 넣어주었다. 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어준 이후부터 16 ~ 37℃에서는 3시간, 25에서는 5시간, 16 ~ 24℃에서는 16시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 PBS 0.3 ml을 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물을 만들었다. 그리고 용해물을 원심분리 하여 수용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(pellet fraction)으로 나누었고, 총 용해물(total lysate), 수용성 분획 및 불용성 분획을 구분하여 SDS-PAGE로 분석하였다.

< 실시예 >

실시예 1. hRID 및 돌연변이 hRID의 발현 확인

정제된 hRID 또는 돌연변이 hRID 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과, 재조합된 hRID 유전자(direct)는 대장균에서 발현이 잘되지 않았다. 단백질 발현 수준을 높여주기 위해서, 기존에 알려진 발현 향상 태그(expression enhancing tag) 중 서열번호 2로 표시되는 mseqhaq-를 hRID 유전자 N 말단(N-terminal) 쪽에 추가하여 융합 단백질로 발현시킨 결과 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1A).

또한, 야생형 hRID(WT) 및 1개 또는 2개 아미노산 서열을 변이시킨 돌연변이 hRID(K32A, K27A, K31A, K23A/K27A, K23A/K31A)의 발현을 비교한 결과, 야생형 hRID 단백질과 돌연변이 단백질 모두 발현 향상 태그와 함께 발현시키는 경우 발현 수준이 향상되었고, 수용성 및 정제 효율도 향상되었다(도 1B).

실시예 2. 돌연변이 hRID와 tRNA 사이의 결합력 확인

2-1. hRID와 결합하여 정제된 RNA 양 확인

상기 재조합 hRID 또는 돌연변이 hRID를 대장균에서 발현시킨 후 정제하였을 때 함께 정제되는 RNA의 양을 확인하기 위해 상기 아가로스겔 밴드를 EtBr 염색 또는 260 nm에서의 흡광도 값(A260)으로 확인하였다.

그 결과, 단일 점 변이(K23A, K27A, K31A)에서는 야생형(WT)과 비슷한 수준으로 RNA가 같이 정제되는 것을 확인할 수 있었지만, 이중 점 변이(K23A/K27A, K23A/K31A)에서는 같이 정제되는 RNA의 양이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(도 2A, 2B).

EtBr 염색법은 DNA와 RNA를 모두 검출하는 방법이라서, 검출된 밴드가 RNA를 나타내는지 확인하기 위해, 정제된 단백질에 리보뉴클레아제(RNaseA) 또는 열(heat) 처리를 하였다. 그 결과 리보뉴클레아제 또는 열에 의해 단백질 변성(degradation)이 나타나는 것을 확인하였다(도 2C). 또한, 260 nm에서의 흡광도(A260)에 대한 280 nm에서의 흡광도(A280)의 비율(A260/A280)을 확인한 결과 야생형 및 단일 점 돌연변이 밴드에서 A260/A280 값이 2 이상인 것을 알 수 있었다(도 2B). 이로써 hRID 단백질과 결합하여 정제된 것이 DNA가 아니라 RNA라는 것을 알 수 있었다.

2-2. 돌연변이 hRID와 RNA의 결합력

상기와 같이 hRID 단백질 및 RNA의 발현을 확인한 결과, 단일 점 변이(K23A, K27A)에서도 많은 양의 RNA가 같이 정제가 되었지만, EtBr 염색을 통해 확인한 아가로스겔에서 밴드의 위치가 야생형에 비해 돌연변이형이 아래쪽이 위치한 것을 알 수 있었다.

보다 구체적으로 확인하기 위해 정제 단백질에 쿠마시 염색(coomassie staining)을 실시한 결과 야생형 단백질은 RNA와 결합을 잘 유지하고 있었으나, 단일 점 변이 단백질들은 RNA와 해리되었다(도 2D). 이로부터 단일 점 돌연변이의 경우 RNA와의 결합력이 떨어지기 때문에, 겔이 내려가는 중에 단백질과 RNA가 해리되어 RNA의 이동속도가 빨라진 것을 알 수 있었다.

2-3. hRID 변이에 따른 결합 RNA 의 양

본 발명의 상기 정제된 hRID 및 돌연변이 hRID 단백질에 결합되어 같이 정제된 RNA의 양을 280 nm 파장의 빛에 대한 흡광도로 측정하였다. 일반적으로 다른 단백질들도 280 nm 파장의 빛에 대한 흡광도를 가지지만, 본 발명의 hRID와 그 돌연변이들의 경우, 260 nm와 280 nm의 빛을 흡수할 수 있는 아미노산이 없어서, 280 nm 흡광도에 영향을 주지 않기 때문에 결합된 RNA의 양만 확인할 수 있다.

구체적으로, 야생형 hRID(WT)와 단일 점 돌연변이 2종(K32A, K27A), 2 이상의 서열에 대한 점 돌연변이 3종(2m, K23A-K27A; 6m, K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A; 9m, K19A-K23A-R24A-K27A-K30A-K31A-K35A-K38A-K40A)에 대한 흡광도를 측정한 결과, hRID(WT)는 돌연변이형에 비해 많은 양의 RNA와 함께 정제된 것을 확인할 수 있었다(도 3A). 흡광도 피크의 높이는 hRID(WT) > K27A > K23A

hRID(2m) > hRID(6m)

hRID(9m) 순으로 나타났으며, 이는 정제된 RNA의 양을 의미한다. 앞에서 언급했듯이, hRID와 돌연변이 단백질들은 280 nm에서의 흡광도가 없어서, 단백질이 정제가 잘 되었는지 확인하기 위해, SDS-PAGE를 진행하였고, hRID와 돌연변이 hRID 단백질들은 모두 정제가 잘 되었음을 확인할 수 있었다(도3B). 또한, 정제된 단백질에 RNA가 같이 정제된 것이 맞는지 확인하기 위해, Agarose gel을 내리는 실험을 진행하였다(도 3C). hRID(WT)과 K27A에는 RNA가 결합하여 같이 정제된 것을 확인할 수 있었지만, K23A와 hRID(2m)은 정제된 RNA의 양이 적어서 EtBr로 확인할 수는 없었다.

2-3. EMSA ( Electrophoretic mobility shift assay)

상기 정제된 hRID 또는 돌연변이 hRID 단백질과 tRNA(transfer RNA) 사이의 결합을 확인하기 위하여, EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다. 구체적으로, 상기 대장균에서 발현되고 정제된 hRID(WT) 또는 돌연변이 hRID 단백질(K23A, K27A, hRID(2m), hRID(6m), hRID(9m))과, 대장균의 정제된 총 tRNA(total transfer RNA)를 섞어준 뒤, 상온에서 10분 동안 보관하였다. 그 다음으로 1% 아가로스겔에 전기영동을 하고, EtBr 염색법(ethidium bromide staining)으로 tRNA를 염색한 후, hRID 단백질과 결합하여 tRNA의 이동속도가 느려졌는지를 확인하였다.

그 결과, hRID(WT)는 해리 상수 값이 10.0 μM 로 tRNA와 결합을 잘하는 것으로 확인되었다(도 4A). 단일 점 돌연변이인 K23A와 K27A는 결합력이 많이 약해지긴 했지만 여전히 tRNA와 상호작용(interaction) 하는 것으로 확인되었고, 해리 상수 값은 각각 304 μM, 60.6 μM 로 나타났다(도 4B, C). 그러나 두 개 이상의 변이를 포함한 hRID(2m), hRID(6m), hRID(9m)은 단백질의 농도를 최대로 사용하여도 tRNA와의 결합이 확인되지 않았고, 정확한 해리상수의 값은 구할 수 없었지만, hRID의 해리상수보다 60배 이상 높은 것으로 나타났다(도 4D).

실시예 3. 목적 단백질로 GFP를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

녹색형광단백질(GFP, green fluorescent protein)은 리포터 단백질로서 광범위하게 사용되며, 활용가치가 아주 높은 단백질이다. 대장균에서 수용성 발현이 잘 이루어지지 않는 것으로 알려진 GFP 단백질의 N-말단에, hRID 또는 K23A, K27A 변이가 적용된 돌연변이 hRID를 융합한 후, 대장균[BL21*(DE3)-pLysS]에서 GFP를 발현시키고 수용성 및 단백질 활성을 비교하였다.

그 결과, 야생형 hRID가 융합되었을 때 보다 돌연변이 hRID가 융합되었을 때 단백질의 수용성이 향상됨(도 5A, B)과 동시에, 단백질의 활성은 유지(도 5C)되는 것을 확인하였다. 이로부터 단일 점 변이에 의해 hRID와 RNA의 결합력이 약해졌을 때, GFP 활성에 영향을 미치지 않으면서 수용성이 더 향상된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 목적 단백질로 EGFP를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

EGFP(enhanced GFP) 단백질은 대장균에서 수용성 발현이 용이하지 않은 GFP의 개량형 단백질로서 GFP처럼 활용가치가 아주 높은 단백질이다. EGFP의 N-말단에 hRID 또는 hRID(2m), hRID(9m)를 융합한 후, 대장균[BL21(DE3)-pLysE]에서 발현시키고 수용성 및 단백질 활성을 비교하였다.

그 결과, hRID를 융합시키지 않고 EGFP 단독으로 재조합하였을 때(direct) 보다 hRID를 융합시킨 단백질들이 전반적으로 높은 수용성을 나타내었다(도 6A).

한편, RNA의 샤페론(chaperone) 기능을 고려하였을 때 RNA와의 결합력이 현저히 감소된 돌연변이 hRID(2m) 및 hRID(9m)은 야생형 hRID에 비해 융합 단백질로서의 효과가 감소할 것으로 예상하였으나, 오히려 야생형 hRID를 융합하였을 때보다 수용성 및 단백질 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 돌연변이 서열 수가 증가할수록 단백질 활성도 증가하는 것을 알 수 있었다(도 6B, C).

실시예 5. 목적 단백질로 루시퍼라제를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

루시퍼라제(Luciferase) 단백질 역시 활성 측정이 간단하여 다방면에서 사용되는 활용 가치가 높은 단백질이지만, 대장균에서 수용성 발현이 어려운 것으로 알려져 있다. 루시퍼라제 단백질 N-말단에 hRID 또는 hRID(2m)를 융합한 후, 대장균[BL21*(DE3)-pLysS]에서 발현시키고 수용성 및 단백질 활성을 비교하였다.

그 결과, hRID(2m)는 RNA와의 결합력이 감소했음에도 불구하고 수용성 및단백질 활성이 함께 향상되는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 6. 목적 단백질로 HAgD 를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

HAgD(hemagglutinin globular Domain) 단백질은 인플루엔자가 세포 내로 침입하는데 중요한 역할을 하는 헤마글루티닌의 구형의 표면 단백질로 면역원성을 나타내며 대장균에서는 수용성 발현이 어려운 것으로 알려져 있다. 이 단백질이 대장균에서 쉽고 값싸게 생산될 수 있다면, 인플루엔자 백신 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 본 실시예에서는 HAgD 단백질 N-말단에 hRID, hRID(2m), hRID(6m) 또는 hRID(9m)을 융합한 후, 대장균 [BL21*(DE3)-pLysS]에서 발현시키고 수용성을 확인하였다.

종래 기술에서 단백질의 수용성을 높이기 위해 발현 온도를 낮추는 방법이 가장 쉽게 활용된다. 이에 HAgD와 융합 단백질을 37℃ 또는 20℃ 조건에서 배양하여 수용성 발현 효율을 확인하였다.

그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, HAgD만 단독으로 발현시킨 경우 수용성 발현율이 37℃에서는 5.3%, 20℃에서는 7.6%로 나타나, 저온에서 발현시켜도 수용성 발현이 매우 어려운 것을 알 수 있었다. 야생형 hRID를 융합시킨 경우 37℃에서는 수용성 발현율이 5.4%로 거의 변화가 없었으나, 20℃에서는 33.6%로 조금 증가하였다.

그러나 돌연변이 hRID(2m)을 융합하여 발현시킨 경우 저온으로 발현시키지않더라도 수용성 발현율이 66.4%로 현저히 상승하였으며, 20℃에서 발현시킨 경우 84.5%로 더욱 증가하였다. 또한, 37℃에서 hRID(6m)-HAgD는 85.4 %, hRID(9m)-HAgD는 84.7 %의 수용성 발현이 나타남을 확인함으로써 돌연변이 hRID를 융합 단백질로 사용하는 경우 저온 발현을 하지 않고도 현저히 향상된 수용성 발현 효과를 얻을 수 있다는 점을 알 수 있었다.

실시예 7. 목적 단백질로 fhaB를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

fhaB(Filamentous hemagglutinin)는 백일해균의 막단백질로서 숙주세포에 결합하는 기능을 갖고 있어 감염에 필수적인 단백질이다. fhaB 단백질을 효과적으로 생산할 수 있는 기술이 있다면, 백일해균 감염의 분자 메커니즘 연구에 활용할 수 있고, fhaB에 대한 항체를 생산하여 치료제 혹은 단백질 백신으로 활용할 수 있다. 본 실시예에서는 fhaB 단백질 N-말단에 hRID 및 hRID(2m)을 융합한 후 대장균 [BL21*(DE3)]에서 발현(37℃, 20℃) 시키고 수용성을 확인하였다.

그 결과, hRID 융합으로는 수용성이 크게 변하지 않았지만, RNA 결합력이 약해진 hRID(2m)를 융합한 경우 수용성이 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다(도 9).

실시예 8. 목적 단백질로 NoV VP1를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

노로바이러스(NoV, Norovirus)는 급성 장염을 유발하는 바이러스로 VP1 단백질이 180개가 모여 하나의 바이러스 캡시드(virus capsid)를 형성한다. 현재까지 개발된 백신은 없으며 세포배양이 불가능하다는 특징으로 인하여 VLP(virus-like particle) 형태의 백신만이 유일한 대안으로 알려져 있다. 현재 곤충 세포와 효모를 이용하여 노로바이러스 VLP를 생산한 보고는 있으나 대장균을 이용하여 생산했다는 보고는 없다.

본 실시예에서는 대장균 발현 숙주를 이용하여 노로바이러스 구조 단백질을 수용성으로 발현하고 더 나아가 VLP를 생산하기 위하여, VP1 단백질의 N-말단에 hRID 또는 hRID(2m)을 융합한 후, 대장균 [HMS174(DE3)]에서 발현시키고 수용성을 확인하였다. 그 결과, hRID가 융합된 VP1에 비해 hRID(2m)가 융합된 VP1의 수용성이 현저히 높게 나오는 것을 확인하였다(도 9).

실시예 9. 목적 단백질로 GCSF를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

GCSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 단백질은 세포 치료제로써 사용될 수 있지만, 대장균에서 수용성 발현은 어려운 것으로 알려져 있다. GCSF는 종래 RNA 결합 단백질인 대장균의 LysRS와 융합하여 수용성으로 발현될 수 있다는 것이 보고되었다(Choi SI et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677).

본 실시예에서는 GCSF의 N-말단에 LysRS 대신 hRID 또는 hRID(2m)을 융합한 후, 대장균 [BL21*(DE3)-pLysS]에서 발현시키고 수용성을 확인하였다. 그 결과, hRID(2m)의 RNA 결합력이 떨어짐에도 불구하고 hRID에 비해 hRID(2m)가 융합되었을 때 수용성이 현저히 높게 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

실시예 10. 목적 단백질로 MERS RBD - BFR를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus)의 스파이크 단백질(spike protein)은 당단백질(glycoprotein)로 바이러스 표면(virion surface)에 삼합체(trimer) 형태로 존재한다. MERS-CoV의 도메인 중에 RBD(receptor binding domain)는 삼합체 형태로 인간 숙주세포에 있는 DPP4 수용체(human dipeptidyl peptidase-4 (hDPP4) receptor)에 결합하면서 바이러스-세포 융합을 유도하여 감염을 돕는 중요한 역할을 한다. 따라서, MERS RBD를 생산할 수 있는 기술은 MERS 감염 기전 연구, 치료제 또는 백신 개발에 아주 중요하다.

MERS RBD는 면역원성 에피토프(immunogenic epitopes)가 삼합체 형태이기 때문에, 중화항체(neutralizing antibodies)가 형성되는 것이 중요하다. 그래서 종래 연구에서는 헬리코박터 파이로리의 페리틴(H. pylori ferritin) 또는 인간의 페리틴(human ferritin)을 사용하였다. 그러나 본 발명에서는 대장균에서 목적 단백질의 대량 생산을 하기 위해 박테리오페리틴(bacterioferritin)을 나노입자 구조로 사용하였다. 박테리오페리틴을 이용한 나노입자 백신은 병원체 관련 분자 패턴 모티프(PAMPs, pathogen-associated molecular pattern motifs)로 톨유사수용체(TLRs, Toll-like receptors), 패턴인식수용체(PRRs, pattern-recognition receptors)와 같은 선천성 면역반응 및 다양한 후천성 면역반응을 증가시켜 준다. 따라서 MERS RBD-BFR은 진단 및 백신용 항원으로서 활용 가치가 아주 높은 단백질 이다.

수용성 발현율이 매우 낮아서 대장균에서 수용성 발현이 한번도 시도되지 않은 MERS-CoV RBD의 N-말단에 hRID, hRID(2m) 또는 hRID(9m)을 융합한 후, 대장균 [SHuffle® T7]에서 발현시키고 수용성을 확인하였다. 그 결과, 융합 단백질을 결합시키지 않은 경우와 비교하여 수용성 발현이 증가하였다. hRID를 융합한 경우 수용성이 60.1%로 나타났고, 돌연변이 hRID를 융합한 경우 모두 수용성이 더욱 증가하였다. 또한, hRID(2m)에서 수용성이 75.4%, hRID(9m)에서는 93.5%로 나타나, RNA 결합력이 떨어지는 돌연변이가 융합되었을 때 수용성이 더 증가한다는 것을 알 수 있었다(도 9).

실시예 11. 목적 단백질로 FMDV VP0, VP3, VP1를 사용한 경우 수용성 증진 효과 확인

FMDV(Foot and mouth disease virus)는 소, 돼지 등에 구제역을 유발하는 바이러스로 VP0, VP3, VP1 단백질이 캡시드(capsid)를 형성한다. 낮은 단가를 요구하는 동물 백신의 특성상 방어 효과는 우수하지만 생산 단가가 높은 단점을 가지고 있는 VLP(virus-like particle) 형태의 백신은 구제역 백신의 형태로 적합하지 않다고 알려져 있다.

대장균 발현 숙주를 이용하여 구제역 바이러스 구조 단백질을 수용성으로 발현시키기 위하여, VP0, VP3, VP1 각각의 단백질 N-말단에 hRID 또는 hRID(9m)을 융합한 후, 대장균 [HMS174(DE3)-pLysE]에서 발현시키고 수용성을 확인하였다. 그 결과, hRID가 융합된 VP0, VP3, VP1에 비해 hRID(9m)가 융합된 VP0, VP3, VP1의 수용성이 훨씬 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel peptides for enhancing soluble expression of target proteins <130> 1063689 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID wt <400> 1 Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val 20 25 30 Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser 35 40 45 Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly 50 55 60 Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression enhancing tag <400> 2 Met Ser Glu Gln His Ala Gln 1 5 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID with tag <400> 3 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 4 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID K23A <400> 4 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ala Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 5 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID K27A <400> 5 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 6 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID K31A <400> 6 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Ala Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 7 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID(2m) (K23A/K27A) <400> 7 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ala Arg Arg 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 8 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID K23A/K31A <400> 8 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ala Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Ala Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID(6m) <400> 9 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Ala Asn Glu Leu Ala Ala Arg 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 10 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID(9m) <400> 10 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Ala Asn Glu Leu Ala Ala Arg 20 25 30 Leu Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala Glu Ala Ala Gln Ala Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75

Claims

사람 유래 라이실 tRNA 합성효소(hLysRS, human lysyl tRNA synthetase)로부터 분리한 N-말단 도메인(hRID, hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain)의 아미노산 서열 중 하나 이상의 양전하를 띄는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 서열을 포함하고,
상기 hRID는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
상기 서열번호 1의 돌연변이 위치 및 치환되는 잔기는 K19A, K23A, R24A, K27A, K30A, K31A, K35A, K38A 및 K40A 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 태그(tag) 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제6항에 있어서,
상기 태그 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 제1항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
를 포함하는 발현벡터.
제11항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제12항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
(A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 제1항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
(C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.