KR20130020206A

KR20130020206A - 수용성 ｂｍｐ-2를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 수용성 ｂｍｐ-2의 제조방법

Info

Publication number: KR20130020206A
Application number: KR1020110082683A
Authority: KR
Inventors: 성백린; 최성일; 임거흔; 한경심
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2013-02-27
Also published as: KR101360375B1

Abstract

본 발명은 수용성 BMP-2를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 수용성 BMP-2의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조방법을 이용하면 수용성의 생물학적 활성을 띄는 BMP-2를 생산할 수 있고, 이를 통해 골생성과 골재생 등 치료 목적으로 활용될 수 있다.

Description

수용성 ＢＭＰ-2를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 수용성 ＢＭＰ-2의 제조방법 {Recombinant E. coli producing soluble BMP-2 and method for producing soluble BMP-2 using the same}

본 발명은 수용성 BMP-2를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 수용성 BMP-2의 제조방법에 관한 것이다.

골 재생 단백질들은 뼈와 연골의 형성, 치아 형성, 골재생, 배아줄기세포의 발생 등 다양한 생물학적 기능을 유도하는 다기능 성장인자이다. 이들 단백질들은 동물의 일부 뼈의 제거된 부분으로부터의 추출물이 새로운 뼈 형성을 유도한다는 사실에서 처음 알려졌다. 지금까지 20종류의 BMP 단백질이 보고되었으며 분류상으로 TGF-b 군에 속하는 단백질 중에 하나로서 골재생 촉진 단백질-2(BMP-2)는 골재생과 골회복에 큰 효과를 보여 골절치료에 큰 역할을 할 수 있는 잘 알려진 대표적인 골재생 단백질이다(E.H. Riley et al., Bone morphogenetic protein-2: biology and applications, Clin. Orthop. Relat. Res. 324 (1996) 39-46).

골절치료와 관련하여 BMP-2의 치료목적으로의 다양한 도입을 위해서는 양적으로 다량의 생물학적으로 활성을 가지는 형태의 BMP-2가 요구된다. 소의 뼈로부터 추출하여 직접적인 분리로부터 BMP-2를 얻는 방법은 낮은 생산성과 재현성 부족 등의 이유로 문제점을 지닌다. 재조합 BMP-2는 지금까지 담배잎 식물(tobacco plant), CHO(chinese hamster ovary) cell, 대장균(E.coli) 등을 포함한 다양한 발현 시스템을 통하여 발현시켜 왔다(J.M. Wozney et al., Wang, Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities, Science 242 (1988) 1528-1534). 전통적으로 대장균은 저비용 생산, 빠른 성장률, 타겟 단백질의 고효율 발현등과 같은 이점으로 인하여 재조합 발현의 초기적인 테스트에 많이 각광받는 시스템이었다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 대장균에서의 발현된 많은 이종의 단백질들은 불수용성의 응집체(inclusion body) 형태로 발현되는 상황을 보여 기존의 장점을 상쇄시키는 문제점을 지닌다. 따라서 현재는 거의 대장균에서 생산된 응집체를 풀어준 후 다시 재접힘(refolding) 하는 방법을 통해 기능적으로 활성을 가지는 BMP-2는 얻어지고 있다(R. Ruppert et al., Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity, Eur. J. Biochem. 237 (1996) 295-302). 하지만 이러한 재접힘 방법은 재접힘 반응 규모(scale up)를 크게 높일 수 없는 어려움, 많은 시간이 소요되는 것, 경험에 기초한 과정이라는 것 등의 단점을 가지고 있다(L.D. Cabrita et al., Protein expression and refolding-a practical guide to getting the most out of inclusion bodies, Biotechnol. Annu. Rev. (2004) 10:31-50). 이와 같은 대장균에서 응집체 형태의 단백질이 발현되는 문제점을 극복하기 위하여 높은 수용성발현 촉진 단백질의 C-말단에 응집경향성 단백질들을 융합시키는 접근이 이루어지고 있다(P. Braun et al., High throughput protein production for functional proteomics, Trends Biotechnol. 21 (2003) 383-388).

이에 본 발명자들은 생물학적 활성을 띄는 BMP-2를 다량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 노력한 결과, 대장균에서 다양한 응집경향성 단백질들을 수용성으로 발현시킬 수 있는 강력한 수용성 유도체인 대장균 lysyl tRNA 합성효소(LysRS)에 BMP-2를 융합시킨 재조합 발현벡터를 완성하고 이를 발현시켜 수용성의 생물학적 활성을 띄는 BMP-2를 생산하게 되었다.

본 발명의 목적은

(a) 융합파트너로서 LysRS 유전자 및 외래 단백질로서 BMP-2 유전자를 연결한 발현벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 재조합 단백질에 단백질 절단효소를 처리하여 재조합 융합 단백질로부터 외래 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 외래 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 연결한 발현벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 다른 구체예에서, (a) 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 연결한 발현벡터를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 재조합 융합 단백질에 단백질 절단효소를 처리하여 재조합 융합 단백질로부터 외래 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 외래 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, 수용성 발현 촉진 단백질과 외래 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질 및 상기 재조합 융합 단백질로부터 수용성 발현 촉진 단백질이 절단된 태그를 가지는 외래 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 수용성 발현 촉진 단백질은 LysRS 또는 RBD인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 외래 단백질은 BMP-2인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자와 외래 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 뉴클레오티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 수용성 발현 촉진 단백질은 외래 단백질의 N 말단에 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 융합 단백질 생산용 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "외래 단백질"은 당업자가 다량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "재조합 융합 단백질"은 원래의 외래단백질의 서열의 N 말단 또는 C 말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명에서 사용된 용어 “수용성 발현 촉진 단백질”은 융합 단백질을 수용성 형태로 발현시킬 수 있다고 보고된 펩타이드를 말하고 GST(Glutathione S transferase), 말토오스 결합단백질, 유비퀴틴, 티오레독신 등이 포함되며, 본 발명에서는 이에 한정되지 않고 일반적으로 알려진 수용성 발현 촉진 단백질이면 제한없이 사용된다.

본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조방법을 이용하면 수용성의 생물학적 활성을 띄는 BMP-2를 생산할 수 있고, 이를 통해 골생성과 골재생 등 치료 목적으로 활용될 수 있다.

도 1은 BMP-2 융합 단백질의 모식도(LysRS-BMP-2)를 나타낸 것이다.
도 2는 대장균에서의 BMP-2와 LysRS-BMP-2의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 LysRS-BMP-2의 니켈 친화성(affinity) 크로마토그래피를 이용한 정제 결과를 확인한 것이다.
도 4는 분리된 LysRS-BMP-2의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 TEV의 처리에 의해 LysRS-BMP-2로부터 BMP-2이 효율적으로 분리된 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 세포 용해물 상태에서 TEV의 처리에 의해 BMP-2이 효율적으로 분리된 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 세포 용해물 상태에서 TEV 처리에 의해 분리된 BMP-2를 니켈 친화성 크로마토그래피를 통하여 분리 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 세포 염색법에 기초한 분리된 BMP-2의 ALP 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 스펙트로스코픽 측정법을 이용한 분리된 BMP-2의 ALP 활성을 나타낸 것이다.

재료의 준비

DNA 재조합을 위한 제한효소는 NEB(영국)로부터 구매하였고, 대조군으로 사용하기 위한 재조합 사람 BMP-2는 R&D 시스템(미국)으로부터 구매하였다. 골수아 세포주(C2C12)는 American Type cell culture collection으로부터 얻었다. DMEM과 FBS는 Gibco 로부터 구매하였다.

단백질 발현 플라즈미드의 제작

BMP-2와 LysRS-BMP-2 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 pGE-BMP-2, pGE-LysRS-BMP-2 발현 백터를 각각 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제작하였다. BMP-2 직접의 형태를 위한 프라이머 셋트는 다음과 같다. 5'-GTCA ATT AAT ATG ATG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CG-3' (앞부분 프라이머), 5'-GTC ACT AAG CTT GCG ACA CCC ACA ACC CTC C-3' (뒷부분 primer). PCR 결과물은 AseI/Hind III로 절단하였고 이 DNA 조각을 pGEMEX-1(promega)로부터 유래된 pGE-lysRS(S.I. Choi et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE 3 (2008) e2677)에 NdeI/HindIII 사이트로 넣어 pGE-BMP-2형태의 플라즈미드를 만들었다. LysRS-BMP-2의 경우는 앞부분 프라이머로 5'-GTC ACT GGT ACC CAA GCC AAA CAC AAA CAG CG-3'를 사용하였고, 뒷부분 프라이머는 직접적인 BMP-2와 같은 것을 사용하였다. PCR 결과물은 KpnI/Hind III로 절단하였고 이렇게 얻은 DNA 조각을 pGE-lysRS-3에 KpnII/HindIII 사이트로 넣어 pGE-LysRS-BMP-2형태의 플라즈미드를 만들었다. pGE-lysRS-3플라즈미드는 pGE-lysRS를 변형시킨 것으로 LysRS-단백질 절단 효소 TEV 절단 사이트-히스티딘꼬리(histidine tag)-MCS의 카세트의 형태를 띠고, MCS는 KpnI-BamHI-EcoRV-Sal I-HindIII로서 구성되었다. 이러한 플라즈미드의 단백질 발현은 T7 프로모터(promoter)에 의하여 조절 받는다.

단백질 발현과 분리정제

각각의 플라즈미드로 형질전환된 대장균 HMS174(DE3)plysE (Novagen) 균주의 단일 콜로니(colony)를 50μg/ml 농도의 클로람페니콜(chloramphenicol)과 30μg/ml 농도의 엠피실린(ampicillin) 항생제가 포함되어 있는 2ml LB에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액의 1ml을 같은 농도의 항생제가 들어있는 새로운 20ml의 LB에 희석시켰다. BMP-2 단백질의 발현은 OD600에서의 세포의 밀도 0.5 값에서 1mM IPTG를 넣고 3시간 동안 배양시킴으로써 유도되었다. 10ml의 세포들을 원심분리법을 통하여 수확하였고 0.3ml PBS에 섞어서 풀어주었다. 세포의 초음파 분쇄(sonication)후, 4℃, 12000g 조건에서 10분간의 원심분리를 통해 단백질을 total(전체), soluble(수용성), insolublec(불수용성) 부분으로 나누었고 SDS-PAGE를 통해 분석하였다(S.I. Choi et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE 3 (2008) e2677).

LysRS-BMP-2와 LysRS-BMP-2로부터 단백질절단 효소 TEV처리에 의해 분리된 BMP-2는 니켈 크로마토그래피에 의해 분리, 정제되었다. 다음 [50mM Tris-HCl (pH 8.0), 500mM NaCl 및 10% glycerol] 조건의 버퍼로 니켈 컬럼(column)을 미리 적셔 균등하게 해준 후 같은 버퍼 조건의 단백질 수용액을 적용시켰다. 34.5mM의 이미다졸(imidazole)이 포함되어 있는 위 버퍼를 이용하여 세척을 진행한 후 이미다졸을 123mM부터 300mM까지 점진적으로 증가시킨 버퍼를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 모아서 다음의 저장버퍼[50mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA, 2mM β-mercaptoethanol 및 0.1% Tween-20]를 이용하여 투석하였다.

타바코 이치 바이러스(TEV) 단백질 절단효소를 통한 융합단백질의 절단

분리된 LysRS-BMP-2나, LysRS-BMP-2가 포함되어 있는 세포 용해체(cell lysate)에 재조합 단백질 절단효소 TEV(invitrogen)을 제조회사의 방법을 따라 다음의 버퍼 및 온도 조건 [50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 30도]에서 두 시간 동안 처리하였다.

알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase (ALP)) 실험

BMP-2의 생물학적인 활성은 C2C12세포에 BMP-2를 처리한 후에 세포염색법과 스펙트로스코픽(spectroscopic)방법을 이용하여 ALP 활성을 측정하는 방법을 이용하여 평가되었다. ALP 키트는 세포 염색법을 이용하여 사용되었다. 간단히 1X0⁵ C2C12 세포를 24 well 플레이트에 접종하여 하루 동안 배양하였다. PBS를 통해 세척한 후 세포에 BMP-2(본 발명에 따른 재조합 BMP-2 또는 대조군으로 사용하기 위한 상업적으로 파는 BMP-2)를 DMEM 배양액(FBS 최종농도 5%) 상태에서 처리하였다. 이틀 뒤 C2C12 세포를 Citrate-Acetone-Formaldehyde 고정 용액을 이용하여 고정하였고 알칼라인 용액을 이용하여 어두운 곳, 실온에서 30분 동안 염색시켰다. 염색된 세포는 사진을 통해 확인하였다.

제조회사의 방법에 따라 TRACP & ALP 키트(Takara)를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 스펙트로스코픽(spectroscopic)방법을 위하여 4X0³ C2C12 세포를 96 well 플레이트에 접종한 후 하루 동안 배양하였다. PBS 세척 후 BMP-2 혼합물을 처리하였다. 이틀 뒤 세포에 4℃에서 5분 동안 추출 버퍼를 처리해 주었고 그 다음 pNPP(p-nitro-phenyl phosphate) 기질이 포함되어 있는 ALP 버퍼를 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반응을 0.9N NaOH를 통해 정지시켰고 405nm에서 흡광도를 측정하였다

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

BMP-2 융합단백질의 대장균에서의 발현과 정제

대장균 세포질에서의 BMP-2 단백질의 수용성 발현을 위하여 LysRS의 C-말단에 BMP-2를 융합시켜 LysRS-BMP-2 형태로 만들었다. 추가적으로 단백질 절단효소 TEV 가 인식하는 사이트와 6개 히스티딘 꼬리표(histidine tag)를 LysRS와 BMP-2 사이에 연결 펩타이드 형태로 도입하여 도 1과 같이 디자인하였다. 이런 연결 펩타이드는 니켈 친화성(affinity) 크로마토그래피를 이용한 한 번의 정제와 그 이후의 단백질 절단효소 TEV의 절단을 통한 LysRS로부터의 BMP-2 분리를 위해 도입되었다. BMP-2와 LysRS-BMP-2는 37℃에서 발현되었다. 발현된 BMP-2와 LysRS-BMP-2 단백질의 수용성 정도는 SDS-PAGE를 통해 분석되었다. 직접적인 형태의 BMP-2가 거의 완전히 불수용성으로 발현한 것에 비하여 LysRS-BMP-2 융합 단백질은 90% 이상 수용성이었다(도 2). 이러한 결과는 LysRS가 높은 발현 정도를 유지시키는 동안 융합형태로 되어있는 BMP-2의 수용성을 극적으로 증가시킴을 나타낸다. 또한 이는 LysRS에 BMP-2를 융합시키는 방법이 대장균 시스템에서 BMP-2를 수용성으로 발현시킬 수 있는 효과적인 방법임을 의미한다.

수용성 발현의 확인 후, LysRS-BMP-2 융합 단백질은 1L 배양을 통해 발현되었고 점진적인 이미다졸(imidazole) 농도 (123mM~300mM) 상황에서 단일단계 니켈 친화성(affinity) 크로마토그래피를 통하여 정제되었다(도 3). 분리정제 형태는 SDS-PAGE를 통해 분석되었고 #24~#35 분리 단편(fraction)을 모아 농축 및 저장 수용액(storage buffer)을 이용하여 투석하였다. 도 4와 같이 SDS-PAGE를 통해 확인해 본 결과 LysRS-BMP-2의 순도는 대략 90%였고, 전체적인 분리정제 효율은 대략 9.6mg/L였다.

융합단백질로부터 분리된 BMP-2의 정제

예비실험 결과, 분리된 LysRS-BMP-2 융합 단백질은 활성을 보이지 않았는데 이는 아마도 융합형태에서 55 kDa 크기의 큰 LysRS의 구조가 기능적 활성이나, 생물학적 활성을 위해 요구되는 BMP-2의 이합체(dimer) 형성에 있어 부정적인 영향을 주었을 것이라 추정하였다. 이에 단백질 절단효소 TEV가 분리 정제된 LysRS-BMP-2 융합 단백질을 특이적이고 효율적으로 절단할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 도 5를 통해 14.4 kDa의 BMP-2이 단백질 절단효소 TEV의 처리에 의해 융합단백질로부터 효율적으로 분리됨을 확인할 수 있었다. 추가적으로 LysRS-BMP-2 융합단백질이 단백질 분리정제 단계 전에 그대로의 세포 용해물(cell lysate, cell extract) 상태에서도 단백질 절단 효소 TEV가 작용하여 절단할 수 있는지 검증해 보았다. 그 결과, TEV 효소는 세포 용해물 상태에서도 효율적으로 융합단백질을 절단시켰다(도 6). 다음으로 세포 용해물 상태에서의 TEV 효소 처리를 통해 떨어져 나온 BMP-2를 도 7과 같이 한 번의 단계로 니켈 친화성 크로마토그래피를 통하여 분리 정제하였다. 분리 정제한 BMP-2 단백질은 활성테스트에 이용하였다. SDS-PAGE 분석을 통하여 단백질의 순도는 대략 50%라는 것을 알 수 있었고, 이는 65kDa 사이즈의 단백질이 섞여 있기 때문이라는 것을 확인하였다(도 7).

재조합 BMP-2의 기능적 활성

BMP-2는 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase: ALP; orthophosphoric monoester phosphohydrolyase)의 발현을 촉진시킨다고 잘 알려져 있으며 ALP 활성 또한 골형성의 전형적인 표지로 잘 이용되어 왔다. 이에 ALP 활성은 BMP-2의 적절한 접힘(folding)을 통해 얻어지는 생물학적 활성을 검정하는데 중요한 테스트가 될 수 있기에, 본 발명에 따른 재조합 BMP-2의 활성을 대장균에서의 응집체(inclusion body)를 인위적으로 재접힘(refolding) 시켜 얻어진 상업적으로 파는 BMP-2(편의상 std-BMP-2로 표기)와 비교하였다.

C2C12 세포에 std-BMP-2와 재조합 BMP-2를 각각 7.3, 14.6, 29.3, 58.6, 117.2, 234.4 nM 농도로 처리하여 배양하였다. 세포염색을 적용해 본 결과 ALP 활성은 도 8과 같이 BMP-2농도에 비례하여 나타났다. 본 발명에 따른 재조합 BMP-2는 비록 std-BMP-2에 비하여 대략 2~4배 낮긴 하였지만 분명한 활성을 나타내었다. 단백질의 전체적은 순도를 고려했을 때, 재조합 BMP-2단백질의 생물학적인 활성은 대조군 std-BMP-2에 비하여 50~100% 범위에 해당하는 것으로 보인다(도 7). 대조군으로 세포에 물만 처리한 것, 저장 용액(storage buffer)만 처리한 것, 수용성 파트너인 LysRS만 처리한 것 등을 도입하였고 여기서는 ALP 활성을 찾아볼 수 없었다. 이러한 결과는 LysRS에 융합시킨 방법에서 얻어진 최종의 BMP-2 단백질이 생물학적으로 활성을 가진 형태로 올바르게 폴딩(folding) 되었음을 나타낸다.

보다 정량적인 분석을 위하여 추가적으로 BMP-2를 각각 4.9, 9.8, 19.5, 39.1, 78.1, 156.3nM로 처리한 C2C12 세포에서의 ALP 활성을 스펙트로스코픽 측정법 (spectroscopic measurement)을 이용하여 확인하였다. 도 9를 통해 알 수 있듯이 결과는 세포염색 분석법에서 얻어진 결과와 일치하는 모습을 보였다. 이 모든 결과를 통해 LysRS 융합 방법에서 얻어진 재조합 BMP-2가 중요하게 기능적 활성을 보임을 알 수 있었고, LysRS 융합하는 방법을 통해 생물학적으로 활성을 가진 BMP-2를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[비교실험예 1]

1-1: IL20-BMP-2 융합단백질의 발현 및 BMP-2의 활성 측정

BMP-2를 IL20(secretion enhancer)에 융합시켜 효모에서 발현 및 분리 정제한 다음, BMP-2의 생물학적 활성을 상기 실시예 3과 같이 측정한 결과, BMP-2는 활성을 거의 찾아볼 수 없었다(도 10).

1-2: DsbA-BMP-2 융합단백질 및 IL1RA-BMP-2 융합단백질의 발현 및 BMP-2의 활성 측정

DsbA-BMP-2 융합단백질 및 IL1RA-BMP-2 융합단백질을 발현 및 분리 정제한 다음. BMP-2의 생물학적 활성을 상기 실시예 3과 같이 측정한 결과, BMP-2는 활성을 거의 찾아볼 수 없었다(도 11).

[비교실험예 2]

RBD-BMP-2 융합단백질의 발현 및 활성 측정

BMP-2를 인간 lysyl tRNA 합성효소 N 말단 도메인(RBD)에 융합시켜 발현 및 분리 정제한 다음. BMP-2의 생물학적 활성을 측정하였다. 그 결과, 분리된 BMP-2의 수용성 정도는 LysRS를 이용한 경우에 비해서는 조금 떨어지나 분명한 수용성 증진 효과를 나타내었고(도 12), 분리된 BMP-2는 LysRS를 이용한 경우와 마찬가지로 생물학적 활성을 나타내었다(도 13). 또한 BMP-2는 disulfide가 많은 단백질이기에 기존 disulfide bond 형성을 촉진 한다고 알려진 PDI를 RBD와 함께 융합하는 시도도 실시하였다. 그 결과 RBD와 함께 PDI를 융합시킨 경우에도 PDI에 상관없이 RBD에 의하여 BMP-2는 활성을 나타냄을 확인하였다(도 14).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 연결한 발현벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 수용성 발현 촉진 단백질은 LysRS 또는 RBD인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 외래 단백질은 BMP-2인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 발현벡터는 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자와 외래 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 뉴클레오티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 수용성 발현 촉진 단백질은 외래 단백질의 N 말단에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질의 제조방법.
(a) 수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 연결한 발현벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및
(d) 상기 재조합 융합 단백질에 단백질 절단효소를 처리하여 재조합 융합 단백질로부터 외래 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 외래 단백질의 제조방법.
수용성 발현 촉진 단백질을 코딩하는 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 융합 단백질 생산용 발현벡터.
제 8항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
수용성 발현 촉진 단백질과 외래 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질.
제 10항에 있어서,
상기 수용성 발현 촉진 단백질은 LysRS 또는 RBD인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
제 10항에 있어서,
상기 외래 단백질은 BMP-2인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
제 10항에 있어서,
상기 재조합 융합 단백질은 수용성 발현 촉진 단백질과 외래 단백질 사이에 단백질 절단효소 인식 부위가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
수용성 발현 촉진 단백질과 외래 단백질이 융합된 재조합 융합 단백질로부터 수용성 발현 촉진 단백질이 절단된 태그를 가지는 외래 단백질.