JP2612874B2 - タンパク質の代謝的安定性を調節する方法 - Google Patents
タンパク質の代謝的安定性を調節する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 バクテリアおよび真核生物の細胞において、半減期が
細胞の世代時間に近接するかあるいはそれを越える、比
較的長く生きるタンパク質は、半減期が細胞の世代時間
の１パーセントより短いことがあるタンパク質と共存す
る。細胞内のタンパク質の分解（degradation）の速度
は、細胞の生理学的状態の関数であり、そして個々のタ
ンパク質について差別的に制御されるように見える。と
くに、損傷したおよびそうでなければ異常なタンパク質
は生体内で代謝的に不安定である。選択的タンパク質の
分解の特定の機能はほとんどの場合においてなお未知で
あるが、多くの調節タンパク質は生体内で極端に短い寿
命を有する。このようなタンパク質の代謝的不安定性
は、それらの合成または分解の速度の調節された変化に
よって、それらの細胞内濃度の急速な調節を可能とす
る。細胞内タンパク質の代謝的不安定性がその機能につ
いて必須であることが示された、わずかの場合は、バク
テリオファージラムダのc IIタンパク質及び酵母菌サッ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）のHOエンドヌクレアーゼを包含する。
細胞の世代時間に近接するかあるいはそれを越える、比
較的長く生きるタンパク質は、半減期が細胞の世代時間
の１パーセントより短いことがあるタンパク質と共存す
る。細胞内のタンパク質の分解（degradation）の速度
は、細胞の生理学的状態の関数であり、そして個々のタ
ンパク質について差別的に制御されるように見える。と
くに、損傷したおよびそうでなければ異常なタンパク質
は生体内で代謝的に不安定である。選択的タンパク質の
分解の特定の機能はほとんどの場合においてなお未知で
あるが、多くの調節タンパク質は生体内で極端に短い寿
命を有する。このようなタンパク質の代謝的不安定性
は、それらの合成または分解の速度の調節された変化に
よって、それらの細胞内濃度の急速な調節を可能とす
る。細胞内タンパク質の代謝的不安定性がその機能につ
いて必須であることが示された、わずかの場合は、バク
テリオファージラムダのc IIタンパク質及び酵母菌サッ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）のHOエンドヌクレアーゼを包含する。
正常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の選択的ター
ンオーバーのほとんどは、ATP依存性および（真核生物
において）非リソソーム的である。最近の生化学および
遺伝学の証拠は、真核生物において、生存が短い細胞内
タンパク質へのウビクイチン（ubiquitin）の共有接合
がそれらの選択的分解について必須であることを示す。
所定のタンパク質が生体内で代謝的に安定であるかある
いは不安定であるかを決定するルールは、従来知られて
いない。
ンオーバーのほとんどは、ATP依存性および（真核生物
において）非リソソーム的である。最近の生化学および
遺伝学の証拠は、真核生物において、生存が短い細胞内
タンパク質へのウビクイチン（ubiquitin）の共有接合
がそれらの選択的分解について必須であることを示す。
所定のタンパク質が生体内で代謝的に安定であるかある
いは不安定であるかを決定するルールは、従来知られて
いない。
発明の要約 本発明は、タンパク質のアミノ末端を操作し、これに
よってタンパク質の代謝的安定性および他の性質を制御
する方法に関する。さらに、本発明は、タンパク質のア
ミノ末端において、20アミノ酸残基（またはそれらの類
似体）のいずれかをもつタンパク質を生体内または生体
外で生成する方法を提供する。本発明は、一部分、細胞
内タンパク質の生体内の半減期がアミノ末端アミノ酸残
基の関数であるという顕著な発見に基づき、そして生体
内または生体外で特定したアミノ末端をもつタンパク質
を発生させることを可能とする新規な（およびより一般
的に応用可能な）技術に基づく。本発明は、また、新し
く同定されたプロテアーゼ、ウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼに関し、前記プロテアーゼは、生体内または
生体外で、問題のタンパク質のアミノ末端において所望
のアミノ酸残基を露出することを可能とする性質を有す
る。
よってタンパク質の代謝的安定性および他の性質を制御
する方法に関する。さらに、本発明は、タンパク質のア
ミノ末端において、20アミノ酸残基（またはそれらの類
似体）のいずれかをもつタンパク質を生体内または生体
外で生成する方法を提供する。本発明は、一部分、細胞
内タンパク質の生体内の半減期がアミノ末端アミノ酸残
基の関数であるという顕著な発見に基づき、そして生体
内または生体外で特定したアミノ末端をもつタンパク質
を発生させることを可能とする新規な（およびより一般
的に応用可能な）技術に基づく。本発明は、また、新し
く同定されたプロテアーゼ、ウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼに関し、前記プロテアーゼは、生体内または
生体外で、問題のタンパク質のアミノ末端において所望
のアミノ酸残基を露出することを可能とする性質を有す
る。
細胞内タンパク質のアミノ末端において露出されたア
ミノ酸の性質は、タンパク質が生体内で長く生きるか、
あるいは生存が短いかを特定する、１つの極めて重要な
決定基であることを示した。個々のアミノ酸は、タンパ
ク質のアミノ末端において露出されたとき、それらがタ
ンパク質に与える半減期に関して、安定化または脱安定
化のアミノ酸として分類することができる。脱安定化ア
ミノ酸残基は、脱安定化アミノ酸のあるもについて数分
までに少ない、短い半減期を与える。安定化アミノ酸残
基は、多数時間の長い半減期を与える。この顕著な、新
しく発見された、タンパク質の半減期のそのアミノ末端
残基への依存性は、ここでＮ−末端ルールと呼ぶ。
ミノ酸の性質は、タンパク質が生体内で長く生きるか、
あるいは生存が短いかを特定する、１つの極めて重要な
決定基であることを示した。個々のアミノ酸は、タンパ
ク質のアミノ末端において露出されたとき、それらがタ
ンパク質に与える半減期に関して、安定化または脱安定
化のアミノ酸として分類することができる。脱安定化ア
ミノ酸残基は、脱安定化アミノ酸のあるもについて数分
までに少ない、短い半減期を与える。安定化アミノ酸残
基は、多数時間の長い半減期を与える。この顕著な、新
しく発見された、タンパク質の半減期のそのアミノ末端
残基への依存性は、ここでＮ−末端ルールと呼ぶ。
このＮ−末端ルールに基づき、タンパク質のアミノ末
端は、こうして、タンパク質の細胞内の半減期を変化す
るように、設計または変更することができ、そして、こ
のようにして、タンパク質の生体内の寿命および／また
は活性を調節することができる。この能力は、多くの異
なる面において合理的なタンパク質の設計のために利用
することができる。天然または野生型のタンパク質は、
修飾して、それらを生体内の分解に対して多少抵抗性と
することができる。タンパク質の設計または変更は、タ
ンパク質レベルまたは遺伝子（DNA）レベルで実施する
ことができる。例えば、タンパク質はアミノ末端を化学
的に変更または操作して、安定化または脱安定化クラス
のアミノ酸残基のアミノ末端においてを露出することが
できる。遺伝子のレベルにおいて、タンパク質をエンコ
ードする遺伝子は、所望のクラスのアミノ酸をアミノ末
端においてをエンコードするようにして、発現されたタ
ンパク質が、タンパク質分解のＮ−末端ルールの通路に
関してタンパク質を代謝的に安定または不安定とする、
前以て決定したアミノ末端構造を示すようにすることが
できる。さらに、タンパク質は操作したアミノ末端をマ
スキングする「マスキング」タンパク質配列に発現、融
合させ、こうして、アンマスキング（unmasking）した
とき、タンパク質がそのアミノ末端残基の性質に依存す
る所望の安定性または他の性質を示すようにすることが
できる。このような構成体において、例えば、２つのタ
ンパク質配列の間の接合は、例えば、エンドヌクレアー
ゼによって特異的に切断するように設計することができ
る。融合した配列の内部のタンパク質分解は、問題のタ
ンパク質の特異的に操作されたアミノ末端をアンマスキ
ングし、そしてタンパク質をＮ−末端ルールによって支
配される分解に付す。タンパク質のアミノ末端を操作す
る１つの特定の新しい方法は、本発明において、ウビク
イチン特異的処理プロテアーゼの同定およびその基質特
異性の決定によって提供される。このプロテアーゼを使
用して、ウビクイチンと他のタンパク質との融合体は、
生体内または生体外で特別に処理して、所望のアミノ末
端残基をもつタンパク質を発生させることができる。
端は、こうして、タンパク質の細胞内の半減期を変化す
るように、設計または変更することができ、そして、こ
のようにして、タンパク質の生体内の寿命および／また
は活性を調節することができる。この能力は、多くの異
なる面において合理的なタンパク質の設計のために利用
することができる。天然または野生型のタンパク質は、
修飾して、それらを生体内の分解に対して多少抵抗性と
することができる。タンパク質の設計または変更は、タ
ンパク質レベルまたは遺伝子（DNA）レベルで実施する
ことができる。例えば、タンパク質はアミノ末端を化学
的に変更または操作して、安定化または脱安定化クラス
のアミノ酸残基のアミノ末端においてを露出することが
できる。遺伝子のレベルにおいて、タンパク質をエンコ
ードする遺伝子は、所望のクラスのアミノ酸をアミノ末
端においてをエンコードするようにして、発現されたタ
ンパク質が、タンパク質分解のＮ−末端ルールの通路に
関してタンパク質を代謝的に安定または不安定とする、
前以て決定したアミノ末端構造を示すようにすることが
できる。さらに、タンパク質は操作したアミノ末端をマ
スキングする「マスキング」タンパク質配列に発現、融
合させ、こうして、アンマスキング（unmasking）した
とき、タンパク質がそのアミノ末端残基の性質に依存す
る所望の安定性または他の性質を示すようにすることが
できる。このような構成体において、例えば、２つのタ
ンパク質配列の間の接合は、例えば、エンドヌクレアー
ゼによって特異的に切断するように設計することができ
る。融合した配列の内部のタンパク質分解は、問題のタ
ンパク質の特異的に操作されたアミノ末端をアンマスキ
ングし、そしてタンパク質をＮ−末端ルールによって支
配される分解に付す。タンパク質のアミノ末端を操作す
る１つの特定の新しい方法は、本発明において、ウビク
イチン特異的処理プロテアーゼの同定およびその基質特
異性の決定によって提供される。このプロテアーゼを使
用して、ウビクイチンと他のタンパク質との融合体は、
生体内または生体外で特別に処理して、所望のアミノ末
端残基をもつタンパク質を発生させることができる。
生存が短いタンパク質を特別に操作する、異なる、か
つまた、新しい方法は、本発明において、効率よく脱ウ
ビクイチンすることができる、ウビクイチン−タンパク
質融合体、例えば、ウビクイチン−Pro−β−ガラクト
シダーゼが代謝的に不安定であるという発見によって提
供される。こうして、アミノ末端のウビクイチン部分が
タンパク質に、その除去を不可能とするか、あるいは非
効率的とする方法で、取り付けることによって、Ｎ−末
端ルールに直接基づかない、明確な技術によって脱安定
化することができる。
つまた、新しい方法は、本発明において、効率よく脱ウ
ビクイチンすることができる、ウビクイチン−タンパク
質融合体、例えば、ウビクイチン−Pro−β−ガラクト
シダーゼが代謝的に不安定であるという発見によって提
供される。こうして、アミノ末端のウビクイチン部分が
タンパク質に、その除去を不可能とするか、あるいは非
効率的とする方法で、取り付けることによって、Ｎ−末
端ルールに直接基づかない、明確な技術によって脱安定
化することができる。
さらに変異型の細胞を発生させることができ、前記細
胞は分解する生存が短いタンパク質を条件的または非条
件的に停止する、「Ｎ−末端」の分解性プロテアーゼ中
に推定上の突然変異を含有する。これらの細胞を使用し
て、細胞内で通常生存が短いタンパク質を過度に生成す
ることができる。
胞は分解する生存が短いタンパク質を条件的または非条
件的に停止する、「Ｎ−末端」の分解性プロテアーゼ中
に推定上の突然変異を含有する。これらの細胞を使用し
て、細胞内で通常生存が短いタンパク質を過度に生成す
ることができる。
図面の簡単な説明 第１図は、ウビクイチン−lacZ遺伝子融合体の構成を
示す。
示す。
第２図は、操作したβ−galタンパク質の半減期を直
接測定する実験を示す。
接測定する実験を示す。
第３図は、ウビクイチン特異的処理プロテアーゼの新
しく発見された性質を使用するβ−gal接合におけるア
ミノ酸残基（Ａ）および前記接合付近におけるアミノ酸
配列（Ｂ）の変化を示す。
しく発見された性質を使用するβ−gal接合におけるア
ミノ酸残基（Ａ）および前記接合付近におけるアミノ酸
配列（Ｂ）の変化を示す。
第４図は、代謝的に不安定なβ−galタンパク質にお
ける多数のウビクイチン部分の存在を示す。
ける多数のウビクイチン部分の存在を示す。
第５図は、代謝的に不安定なタンパク質におけるウビ
クイチン含有β−gal種の１系列を示す。
クイチン含有β−gal種の１系列を示す。
第６図は、原核細胞および真核生物の両者の長く生き
る細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端に安定化アミ
ノ酸残基を有し、これに対して分泌されたタンパク質が
補体のバイアスを示すことを示す。
る細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端に安定化アミ
ノ酸残基を有し、これに対して分泌されたタンパク質が
補体のバイアスを示すことを示す。
発明の詳細な説明 Ｎ−末端ルールを以下に詳しく説明する。簡単に述べ
ると、タンパク質の分解を支配するこのルールは、その
アミノ末端に種々のアミノ酸残基を有し、そしてウビク
イチンとの融合タンパク質として生成した、酵素β−ガ
ラクトシダーゼの生体内の半減期を検査することによっ
て明らかにされた。ウビクイチン−β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質をエンコードするキメラ遺伝子を酵母
菌サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（以後、S.cerevisiae）中で発現するとき、ウ
ビクイチンは発生期の融合タンパク質を切断して、脱ウ
ビクイチンされたβ−ガラクトシダーゼ（βgal）を生
成する。１つの例外を除いて、この切断はウビクイチン
−βgal）の接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に
無関係に起こり、これによって選択的に異なる残基をそ
うでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端にお
いて露出することができる。そのように設計されたβga
lタンパク質は、βgalのアミノ末端におけるアミノ酸の
性質に依存して、20時間以上から３分より短い範囲の、
顕著に異なる生体内の半減期を示した。こうして、アミ
ノ酸は、そのアミノ末端に存在するとき、βgalにそれ
らが与える半減期に従って配列することができる。例え
ば、アミノ酸、メチオニン、セリン、アラニン、スレオ
ニン、バリン、グリシンおよびシステインは20時間より
長い半減期を与える。フェニルアラニン、ロイシン、ア
スパルギンおよびリジンは約３分の半減期を与える。
（アミノ酸の完全なリストおよび対応する半減期につい
て下表１参照）。
ると、タンパク質の分解を支配するこのルールは、その
アミノ末端に種々のアミノ酸残基を有し、そしてウビク
イチンとの融合タンパク質として生成した、酵素β−ガ
ラクトシダーゼの生体内の半減期を検査することによっ
て明らかにされた。ウビクイチン−β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質をエンコードするキメラ遺伝子を酵母
菌サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（以後、S.cerevisiae）中で発現するとき、ウ
ビクイチンは発生期の融合タンパク質を切断して、脱ウ
ビクイチンされたβ−ガラクトシダーゼ（βgal）を生
成する。１つの例外を除いて、この切断はウビクイチン
−βgal）の接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に
無関係に起こり、これによって選択的に異なる残基をそ
うでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端にお
いて露出することができる。そのように設計されたβga
lタンパク質は、βgalのアミノ末端におけるアミノ酸の
性質に依存して、20時間以上から３分より短い範囲の、
顕著に異なる生体内の半減期を示した。こうして、アミ
ノ酸は、そのアミノ末端に存在するとき、βgalにそれ
らが与える半減期に従って配列することができる。例え
ば、アミノ酸、メチオニン、セリン、アラニン、スレオ
ニン、バリン、グリシンおよびシステインは20時間より
長い半減期を与える。フェニルアラニン、ロイシン、ア
スパルギンおよびリジンは約３分の半減期を与える。
（アミノ酸の完全なリストおよび対応する半減期につい
て下表１参照）。
原核細胞および真核生物の両者からの長い半減期の非
画分化細胞内タンパク質において、現在知られているア
ミノ末端残基は、事実上もっぱら、Ｎ−末端ルールによ
って正確に予測されるように、アミノ酸の安定化クラス
に属する。この結果は、一般に細胞内タンパク質の選択
的分解におけるＮ−末端ルールを強く説明する。
画分化細胞内タンパク質において、現在知られているア
ミノ末端残基は、事実上もっぱら、Ｎ−末端ルールによ
って正確に予測されるように、アミノ酸の安定化クラス
に属する。この結果は、一般に細胞内タンパク質の選択
的分解におけるＮ−末端ルールを強く説明する。
適当なアミノ末端アミノ酸は、非画分化細胞内タンパ
ク質の代謝的安定性に必須な（しかし、必ずしも十分で
はない）要件であるように思われる。こうして、タンパ
ク質が細胞内で比較的安定であるためには、安定化アミ
ノ酸はアミノ末端に存在すべきである。タンパク質のア
ミノ末端における脱安定化残基の存在は、頻繁である
が、その生体内の代謝的脱安定化のために、常に十分で
あるということはない。このような脱安定化が比較的小
さい程度に起こるとき、それ以上の分析は、アミノ末端
の不十分な接近可能性あるいはアミノ末端付近における
「許容性」配列の欠如、例えば、タンパク質のアミノ末
端領域におけるセグメントの移動性の欠如を示す。少な
くともある場合におけるアミノ末端における安定化アミ
ノ酸の存在（例えば、β−galについて観察されるよう
な）は、安定性をタンパク質に与える。しかしながら、
アミノ末端における安定化アミノ酸は、長い半減期を常
に与えるというわけではない。なぜなら、他の分解的通
路はタンパク質の究極の寿命の決定における含まれ得る
からである。例えば、内部のタンパク質分解の切断（タ
ンパク質の末端領域の外側の切断）は、切断の得られる
生成物のアミノ末端において脱安定化アミノ酸を露出さ
せることができ、次いでこれはＮ−末端ルールの通路を
経て急速に分解する。安定化アミノ酸を使用するための
適当な環境は、実験的に確証することができる。
ク質の代謝的安定性に必須な（しかし、必ずしも十分で
はない）要件であるように思われる。こうして、タンパ
ク質が細胞内で比較的安定であるためには、安定化アミ
ノ酸はアミノ末端に存在すべきである。タンパク質のア
ミノ末端における脱安定化残基の存在は、頻繁である
が、その生体内の代謝的脱安定化のために、常に十分で
あるということはない。このような脱安定化が比較的小
さい程度に起こるとき、それ以上の分析は、アミノ末端
の不十分な接近可能性あるいはアミノ末端付近における
「許容性」配列の欠如、例えば、タンパク質のアミノ末
端領域におけるセグメントの移動性の欠如を示す。少な
くともある場合におけるアミノ末端における安定化アミ
ノ酸の存在（例えば、β−galについて観察されるよう
な）は、安定性をタンパク質に与える。しかしながら、
アミノ末端における安定化アミノ酸は、長い半減期を常
に与えるというわけではない。なぜなら、他の分解的通
路はタンパク質の究極の寿命の決定における含まれ得る
からである。例えば、内部のタンパク質分解の切断（タ
ンパク質の末端領域の外側の切断）は、切断の得られる
生成物のアミノ末端において脱安定化アミノ酸を露出さ
せることができ、次いでこれはＮ−末端ルールの通路を
経て急速に分解する。安定化アミノ酸を使用するための
適当な環境は、実験的に確証することができる。
Ｎ−末端ルールは生体内の選択的タンパク質分解の他
の面を包含する、より複雑な「半減期のルール」の唯一
の成分（中央のものにかかわらず）であることができる
が、Ｎ−末端ルールの通路によって天然の修飾されない
タンパク質より分解に対して多少抵抗性であるタンパク
質を生成するために、Ｎ−末端ルールはタンパク質構造
を設計または変化させるための合理的な実施可能なアプ
ローチを提供する。タンパク質は、タンパク質または遺
伝子のレベルで設計または修飾して、安定化または脱安
定化のクラスで所望のアミノ酸をそれらのアミノ末端に
おいて提供する。タンパク質の半減期を調節する能力
は、タンパク質の細胞内の活性の変調を可能とする。
の面を包含する、より複雑な「半減期のルール」の唯一
の成分（中央のものにかかわらず）であることができる
が、Ｎ−末端ルールの通路によって天然の修飾されない
タンパク質より分解に対して多少抵抗性であるタンパク
質を生成するために、Ｎ−末端ルールはタンパク質構造
を設計または変化させるための合理的な実施可能なアプ
ローチを提供する。タンパク質は、タンパク質または遺
伝子のレベルで設計または修飾して、安定化または脱安
定化のクラスで所望のアミノ酸をそれらのアミノ末端に
おいて提供する。タンパク質の半減期を調節する能力
は、タンパク質の細胞内の活性の変調を可能とする。
その代謝的安定性を増加または減少するためにタンパ
ク質を修飾する直接のアプローチは、タンパク質のアミ
ノ末端をタンパク質レベルで直接操作することである。
所望のアミノ末端アミノ酸を提供するために、問題のタ
ンパク質のアミノ末端は、例えば、安定化または脱安定
化のクラスのアミノ酸は、適当な化学を使用して、タン
パク質またはポリペプチドのアミノ末端に付加すること
によって化学的に変更することができる。こうして、例
えば、不安定なタンパク質は、安定化アミノ酸残基（例
えば、メチオニン、セリン、アラニン、スレオニン、バ
リン、グリシンまたはシステイン）をタンパク質のアミ
ノ末端に付加することによって、より安定性とすること
ができる。逆に、安定なタンパク質は脱安定化アミノ酸
をアミノ末端に付加することによって脱安定化すること
ができる。タンパク質のアミノ末端を修飾する１つの明
確な方法は、タンパク質のアミノ末端への単一のアミノ
酸の翻訳後の付加を触媒する、特異的酵素、アミノ酸−
タンパク質のリガーゼを使用することである。同一のタ
イプの非遺伝子的変更のための他の方法は、当業者によ
って容易に確認することができる。
ク質を修飾する直接のアプローチは、タンパク質のアミ
ノ末端をタンパク質レベルで直接操作することである。
所望のアミノ末端アミノ酸を提供するために、問題のタ
ンパク質のアミノ末端は、例えば、安定化または脱安定
化のクラスのアミノ酸は、適当な化学を使用して、タン
パク質またはポリペプチドのアミノ末端に付加すること
によって化学的に変更することができる。こうして、例
えば、不安定なタンパク質は、安定化アミノ酸残基（例
えば、メチオニン、セリン、アラニン、スレオニン、バ
リン、グリシンまたはシステイン）をタンパク質のアミ
ノ末端に付加することによって、より安定性とすること
ができる。逆に、安定なタンパク質は脱安定化アミノ酸
をアミノ末端に付加することによって脱安定化すること
ができる。タンパク質のアミノ末端を修飾する１つの明
確な方法は、タンパク質のアミノ末端への単一のアミノ
酸の翻訳後の付加を触媒する、特異的酵素、アミノ酸−
タンパク質のリガーゼを使用することである。同一のタ
イプの非遺伝子的変更のための他の方法は、当業者によ
って容易に確認することができる。
あるタンパク質において、アミノ末端の末端はタンパ
ク質のコンホメーション（すなわち、その第三または第
４構造）の結果として観察される。これらの場合におい
て、アミノ末端のより広範な変更はタンパク質をＮ−末
端ルールの通路に付すために必要なことがある。例え
ば、接近不可能なアミノ末端のために、単一のアミノ末
端残基の簡単な付加または置換は不十分である場合、い
くつかのアミノ酸（リジン、基質のタンパク質へのウビ
クイチンの接合の部位、を包含する）は、初期のアミノ
末端に付加して、操作したアミノ末端の接近可能性およ
び／またはセグメントの移動性を増加することができ
る。
ク質のコンホメーション（すなわち、その第三または第
４構造）の結果として観察される。これらの場合におい
て、アミノ末端のより広範な変更はタンパク質をＮ−末
端ルールの通路に付すために必要なことがある。例え
ば、接近不可能なアミノ末端のために、単一のアミノ末
端残基の簡単な付加または置換は不十分である場合、い
くつかのアミノ酸（リジン、基質のタンパク質へのウビ
クイチンの接合の部位、を包含する）は、初期のアミノ
末端に付加して、操作したアミノ末端の接近可能性およ
び／またはセグメントの移動性を増加することができ
る。
タンパク質の修飾または設計は、また、遺伝子レベル
で達成することができる。分離したまたは合成した遺伝
子の５′末端への適当なコドンの付加または置換のため
の部位特異的突然変異発生の普通の技術を使用して、エ
ンコードしたタンパク質に所望のアミノ末端構造を提供
することができる。例えば、発現されたタンパク質はそ
のアミノ末端に所望のアミノ酸を有するので、安定化ア
ミノ酸のために適当なコドンを、タンパク質をエンコー
ドする配列のアミノ末端に挿入するか、あるいは構成こ
とができる。
で達成することができる。分離したまたは合成した遺伝
子の５′末端への適当なコドンの付加または置換のため
の部位特異的突然変異発生の普通の技術を使用して、エ
ンコードしたタンパク質に所望のアミノ末端構造を提供
することができる。例えば、発現されたタンパク質はそ
のアミノ末端に所望のアミノ酸を有するので、安定化ア
ミノ酸のために適当なコドンを、タンパク質をエンコー
ドする配列のアミノ末端に挿入するか、あるいは構成こ
とができる。
同時に、発現されたタンパク質は翻訳後細胞内でしば
しば自然に修飾される。これはアミノ末端の修飾を包含
することができる。例えば、アミノ末端は、それからの
１つまたは数個のアミノ酸を切断するアミノペプチダー
ゼによって、作用させることができる。アミノ酸は、ま
た、翻訳後の処理によってアミノ末端に付加することが
できる。本発明は、アミノ末端のタンパク質の処理のな
お明確にされないルールを「バイパス」して、成熟した
処理されたタンパク質種のアミノ末端において所望のア
ミノ末端残基を正確にかつ特異的に露出する方法を提供
する。問題のタンパク質のアミノ末端の究極の構造への
このような翻訳後の事象の衝撃を最小にするために、ア
ミノ末端に融合した「マスキング」タンパク質配列が問
題のタンパク質のアミノ末端（所望の安定化または脱安
定化の構造を有するように設計した）より先行する、特
異的融合タンパク質を設計することができる。問題のマ
スキングタンパク質のアミノ末端へ融合したタンパク質
配列が２つの間の接合における特異的切断に感受性であ
るように、融合タンパク質を設計する。こうして、タン
パク質配列を除去すると、問題のタンパク質のアミノ末
端はアンマスキングされ、こうして、解放された半減期
は前以てアミノ末端によって支配される。融合タンパク
質は、例えば、宿主細胞のエンドヌクレアーゼによって
生体内の特異的切断のために、あるいは生産性細胞（融
合タンパク質を切断する能力を欠く）からの分離後、切
断できる生体外系における特異的切断のため、設計する
ことができる。
しば自然に修飾される。これはアミノ末端の修飾を包含
することができる。例えば、アミノ末端は、それからの
１つまたは数個のアミノ酸を切断するアミノペプチダー
ゼによって、作用させることができる。アミノ酸は、ま
た、翻訳後の処理によってアミノ末端に付加することが
できる。本発明は、アミノ末端のタンパク質の処理のな
お明確にされないルールを「バイパス」して、成熟した
処理されたタンパク質種のアミノ末端において所望のア
ミノ末端残基を正確にかつ特異的に露出する方法を提供
する。問題のタンパク質のアミノ末端の究極の構造への
このような翻訳後の事象の衝撃を最小にするために、ア
ミノ末端に融合した「マスキング」タンパク質配列が問
題のタンパク質のアミノ末端（所望の安定化または脱安
定化の構造を有するように設計した）より先行する、特
異的融合タンパク質を設計することができる。問題のマ
スキングタンパク質のアミノ末端へ融合したタンパク質
配列が２つの間の接合における特異的切断に感受性であ
るように、融合タンパク質を設計する。こうして、タン
パク質配列を除去すると、問題のタンパク質のアミノ末
端はアンマスキングされ、こうして、解放された半減期
は前以てアミノ末端によって支配される。融合タンパク
質は、例えば、宿主細胞のエンドヌクレアーゼによって
生体内の特異的切断のために、あるいは生産性細胞（融
合タンパク質を切断する能力を欠く）からの分離後、切
断できる生体外系における特異的切断のため、設計する
ことができる。
ウビクイチンは問題のタンパク質と融合したタンパク
質の構成のための、広く有用な融合相手である：ウビク
イチンが融合されているタンパク質への依存性をほとん
どまたは全くもたない、細胞質真核生物プロテアーゼに
よって、人工的ウビクイチン−タンパク質融合体を正確
に切断することができるという発見は、生体内または生
体外の両者のタンパク質操作方法において応用すること
ができ、そして本発明の主要な面である。例えば、ウビ
クイチン−タンパク質融合方法を使用して、人工的手段
によって生成されたタンパク質において、真性のアミノ
末端を人工的に発生させることができる。こうして、天
然の真核生物または原核生物のタンパク質のアミノ末端
の特性は、原核生物の宿主において生成されたウビクイ
チン−タンパク質融合体の生体外切断によって発生させ
ることができる。
質の構成のための、広く有用な融合相手である：ウビク
イチンが融合されているタンパク質への依存性をほとん
どまたは全くもたない、細胞質真核生物プロテアーゼに
よって、人工的ウビクイチン−タンパク質融合体を正確
に切断することができるという発見は、生体内または生
体外の両者のタンパク質操作方法において応用すること
ができ、そして本発明の主要な面である。例えば、ウビ
クイチン−タンパク質融合方法を使用して、人工的手段
によって生成されたタンパク質において、真性のアミノ
末端を人工的に発生させることができる。こうして、天
然の真核生物または原核生物のタンパク質のアミノ末端
の特性は、原核生物の宿主において生成されたウビクイ
チン−タンパク質融合体の生体外切断によって発生させ
ることができる。
ウビクイチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質
を生成するための特別の方法を、下において詳述する。
他のタンパク質をエンコードする遺伝子を、この方法に
おいてLacZ（β−gal遺伝子）の代わりに使用すること
ができる。
を生成するための特別の方法を、下において詳述する。
他のタンパク質をエンコードする遺伝子を、この方法に
おいてLacZ（β−gal遺伝子）の代わりに使用すること
ができる。
一般に、ウビクイチン融合タンパク質はキメラの遺伝
子構成体によって発現され、前記遺伝子構成体は、５′
から３′への向きにおいて、問題のタンパク質をエンコ
ードする遺伝子に結合したウビクイチン遺伝子からな
る。問題のタンパク質のアミノ末端アミノ酸のためのコ
ドンは、ウビクイチン遺伝子の３′末端にすぐに隣接し
て位置する。融合した遺伝子生成物は、ウビクイチンと
問題のタンパク質との間の接合において生体内または生
体外で内部タンパク質分解的に切断して、（本発明にお
いて同定した純粋なまたは部分的に精製されたウビクイ
チン−特異的プロテアーゼを使用して）、そのアミノ末
端に所望のアミノ酸を有する問題のタンパク質を発生さ
せることができる。タンパク質のアミノ末端を特異的に
操作する記載する能力について、ある数の用途が存在す
る。１つのこのような用途は、解放されたタンパク質の
細胞内の半減期がＮ−末端ルールの原理によって支配さ
れるという事実によって確立される。ここに記載するタ
ンパク質のアミノ末端を操作するための特定の方法の他
の用途は、問題のタンパク質の所望の機能的性質の調節
から、その抗原性の修飾、および再び、当業者によって
容易に確証することができる他の用途の範囲である。
子構成体によって発現され、前記遺伝子構成体は、５′
から３′への向きにおいて、問題のタンパク質をエンコ
ードする遺伝子に結合したウビクイチン遺伝子からな
る。問題のタンパク質のアミノ末端アミノ酸のためのコ
ドンは、ウビクイチン遺伝子の３′末端にすぐに隣接し
て位置する。融合した遺伝子生成物は、ウビクイチンと
問題のタンパク質との間の接合において生体内または生
体外で内部タンパク質分解的に切断して、（本発明にお
いて同定した純粋なまたは部分的に精製されたウビクイ
チン−特異的プロテアーゼを使用して）、そのアミノ末
端に所望のアミノ酸を有する問題のタンパク質を発生さ
せることができる。タンパク質のアミノ末端を特異的に
操作する記載する能力について、ある数の用途が存在す
る。１つのこのような用途は、解放されたタンパク質の
細胞内の半減期がＮ−末端ルールの原理によって支配さ
れるという事実によって確立される。ここに記載するタ
ンパク質のアミノ末端を操作するための特定の方法の他
の用途は、問題のタンパク質の所望の機能的性質の調節
から、その抗原性の修飾、および再び、当業者によって
容易に確証することができる他の用途の範囲である。
問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ
酸残基を発生させるこの方法は、２つの新規な成分を包
含する：一方、ウビクイチン−タンパク質融合体の使
用、および他方、同定されたウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼ。そして、この研究において、それらの顕著
な基質の要件が発見された。ウビクイチン特異的プロテ
アーゼの初期の同定は生体内でなされたが、この酵素
は、また、生体外（抽出液中）で比較的安定であり、そ
して当業者に知られた技術によって等質性に容易に精製
することができる。さらに、ウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼの基質の特異性は、進化において保存され、
酵母菌および動物において同一である。この酵素は、粗
製の抽出物から、当業者に知られた方法のなかでも、ホ
スホセルロース、DEAEセルロースおよびSHセファロース
の順次クロマトグラフィーによって精製することができ
る。あるいは、このプロテアーゼのための遺伝子は当業
者によってクローニングすることができる。クローニン
グされたプロテアーゼ遺伝子は生体内で使用することが
できるか、あるいは遺伝子は適当な宿主中で過度に発現
することができ、過度に発現されたウビクイチン特異的
プロテアーゼを精製し、そして同一または同様な目的に
生体外で使用することができる。ここににおけるこの酵
素の発見およびその基質特異性の詳細な特性は、この酵
素の生体外および生体内の使用を提供する。
酸残基を発生させるこの方法は、２つの新規な成分を包
含する：一方、ウビクイチン−タンパク質融合体の使
用、および他方、同定されたウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼ。そして、この研究において、それらの顕著
な基質の要件が発見された。ウビクイチン特異的プロテ
アーゼの初期の同定は生体内でなされたが、この酵素
は、また、生体外（抽出液中）で比較的安定であり、そ
して当業者に知られた技術によって等質性に容易に精製
することができる。さらに、ウビクイチン特異的処理プ
ロテアーゼの基質の特異性は、進化において保存され、
酵母菌および動物において同一である。この酵素は、粗
製の抽出物から、当業者に知られた方法のなかでも、ホ
スホセルロース、DEAEセルロースおよびSHセファロース
の順次クロマトグラフィーによって精製することができ
る。あるいは、このプロテアーゼのための遺伝子は当業
者によってクローニングすることができる。クローニン
グされたプロテアーゼ遺伝子は生体内で使用することが
できるか、あるいは遺伝子は適当な宿主中で過度に発現
することができ、過度に発現されたウビクイチン特異的
プロテアーゼを精製し、そして同一または同様な目的に
生体外で使用することができる。ここににおけるこの酵
素の発見およびその基質特異性の詳細な特性は、この酵
素の生体外および生体内の使用を提供する。
問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ
酸残基の発生を可能とするウビクイチン−タンパク質融
合体の使用は、生成体の細胞からこのようなタンパク質
の精製を促進するために拡張することができる。前述の
ウビクイチン−タンパク質融合体に結合した、便利なマ
ーカータンパク質、例えば、ストレプトアジピン、をエ
ンコードする遺伝子は容易に構成することができる。得
られる（マーカータンパク質）−ウビクイチン−タンパ
ク質融合体は、生成体細胞から、マーカータンパク質の
前以て選択した性質、例えば、ビオチンカラムの親和ク
ロマトグラフィーによって分離可能であるストレプトア
ジピンの既知能力を使用することによって分離すること
ができる。こうして、精製された（マーカータンパク
質）−ウビクイチン−タンパク質融合体は、次いで、本
発明において記載するウビクイチン特異的プロテアーゼ
によって特異的に切断して最終生成物、そのアミノ末端
に所望のアミノ酸残基を有する問題のタンパク質を、発
生することができる。
酸残基の発生を可能とするウビクイチン−タンパク質融
合体の使用は、生成体の細胞からこのようなタンパク質
の精製を促進するために拡張することができる。前述の
ウビクイチン−タンパク質融合体に結合した、便利なマ
ーカータンパク質、例えば、ストレプトアジピン、をエ
ンコードする遺伝子は容易に構成することができる。得
られる（マーカータンパク質）−ウビクイチン−タンパ
ク質融合体は、生成体細胞から、マーカータンパク質の
前以て選択した性質、例えば、ビオチンカラムの親和ク
ロマトグラフィーによって分離可能であるストレプトア
ジピンの既知能力を使用することによって分離すること
ができる。こうして、精製された（マーカータンパク
質）−ウビクイチン−タンパク質融合体は、次いで、本
発明において記載するウビクイチン特異的プロテアーゼ
によって特異的に切断して最終生成物、そのアミノ末端
に所望のアミノ酸残基を有する問題のタンパク質を、発
生することができる。
例えば、この分野において現在標準の部位特異的突然
変異発生技術による、所望のアミノ酸のアミノ末端アミ
ノ酸のコドン。問題のタンパク質をエンコードする遺伝
子が合成遺伝子である場合、適当な５′−コドンを合成
方法の間に構成することができる。あるいは、特異的コ
ドンのためのヌクレオチドは遺伝子の５′（アミノ末端
のエンコーディングド）末端に適当なDNA配列結合する
ことによって、分離または合成された遺伝子に付加する
ことができる。
変異発生技術による、所望のアミノ酸のアミノ末端アミ
ノ酸のコドン。問題のタンパク質をエンコードする遺伝
子が合成遺伝子である場合、適当な５′−コドンを合成
方法の間に構成することができる。あるいは、特異的コ
ドンのためのヌクレオチドは遺伝子の５′（アミノ末端
のエンコーディングド）末端に適当なDNA配列結合する
ことによって、分離または合成された遺伝子に付加する
ことができる。
ウビクイチン特異的プロテアーゼによって切断されう
るウビクイチン用融合相手は、また、使用することがで
きる。さらに、問題のタンパク質のアミノ末端をマスキ
ングするためのウビクイチン以外の融合相手を使用する
ことができる。適当な場合において、融合タンパク質
は、十分に狭い特異性を有する制限エンドヌクレアーゼ
のためのタンパク質分解切断部位を含有するように設計
し、こうして唯一の標的部位が融合タンパク質において
切断されるようにすることができる。このようなプロテ
アーゼの極めて重要な性質は、切断部位のカルボキシ末
端部位にりんせつするアミノ酸残基について十分に緩和
された要件でなくてはならない。商業的に入手可能なプ
ロテアーゼ、補体因子Xa、はこれらの性質を示し、こう
してそれらのアミノ末端の究極的位置において前以て決
定したアミノ酸残基をもつタンパク質を直接発生させる
ことができる［K.ノグチおよびH.C.トゲーソン（Thoger
sen）、ネイチャー（Nature）、309、:810（1984）］。
エンドプロテアーゼのための認識部位を、マスキングタ
ンパク質の配列と問題のタンパク質のアミノ末端をエン
コードする３′領域との間の接合中に操作することがで
きる。
るウビクイチン用融合相手は、また、使用することがで
きる。さらに、問題のタンパク質のアミノ末端をマスキ
ングするためのウビクイチン以外の融合相手を使用する
ことができる。適当な場合において、融合タンパク質
は、十分に狭い特異性を有する制限エンドヌクレアーゼ
のためのタンパク質分解切断部位を含有するように設計
し、こうして唯一の標的部位が融合タンパク質において
切断されるようにすることができる。このようなプロテ
アーゼの極めて重要な性質は、切断部位のカルボキシ末
端部位にりんせつするアミノ酸残基について十分に緩和
された要件でなくてはならない。商業的に入手可能なプ
ロテアーゼ、補体因子Xa、はこれらの性質を示し、こう
してそれらのアミノ末端の究極的位置において前以て決
定したアミノ酸残基をもつタンパク質を直接発生させる
ことができる［K.ノグチおよびH.C.トゲーソン（Thoger
sen）、ネイチャー（Nature）、309、:810（1984）］。
エンドプロテアーゼのための認識部位を、マスキングタ
ンパク質の配列と問題のタンパク質のアミノ末端をエン
コードする３′領域との間の接合中に操作することがで
きる。
生存が短いタンパク質を操作する異なる明確な方法
は、本発明において、効率よく脱ウビクイチンできない
ウビクイチン−タンパク質融合体、例えばウビクイチン
−Pro−β−ガラクトシダーゼ融合体（表１）が代謝的
に不安定であるという発見によって提供される。こうし
て、アミノ末端ウビクイチン部分をタンパク質に、その
除去が不可能であるか、あるいは非効率的になされるよ
うな方法で、取り付けることによって、Ｎ−末端ルール
の要件に従ってタンパク質の所望のアミノ末端を発生さ
れる方法と定性的に区別される、明確な技術によって、
タンパク質を脱安定化することができる。ウビクイチン
−タンパク質融合体の効率よく脱ウビクイチンの防止
は、いくつかの方法において、例えば、表１に示すよう
なウビクイチン−タンパク質の接合においてプロリン残
基を使用することによって、あるいはウビクイチン部分
がもはやウビクイチン特異的処理プロテアーゼによって
認識されないが、なお分解的通路の残部によって認識さ
れうるような方法で、ウビクイチンのアミノ酸配列をそ
のカルボキシル末端近くで変化させることによって、達
成することができる。ウビクイチン−タンパク質融合体
の脱ウビクイチン速度を減少するこれらおよび他の方法
は、当業者によって容易に確証できる。
は、本発明において、効率よく脱ウビクイチンできない
ウビクイチン−タンパク質融合体、例えばウビクイチン
−Pro−β−ガラクトシダーゼ融合体（表１）が代謝的
に不安定であるという発見によって提供される。こうし
て、アミノ末端ウビクイチン部分をタンパク質に、その
除去が不可能であるか、あるいは非効率的になされるよ
うな方法で、取り付けることによって、Ｎ−末端ルール
の要件に従ってタンパク質の所望のアミノ末端を発生さ
れる方法と定性的に区別される、明確な技術によって、
タンパク質を脱安定化することができる。ウビクイチン
−タンパク質融合体の効率よく脱ウビクイチンの防止
は、いくつかの方法において、例えば、表１に示すよう
なウビクイチン−タンパク質の接合においてプロリン残
基を使用することによって、あるいはウビクイチン部分
がもはやウビクイチン特異的処理プロテアーゼによって
認識されないが、なお分解的通路の残部によって認識さ
れうるような方法で、ウビクイチンのアミノ酸配列をそ
のカルボキシル末端近くで変化させることによって、達
成することができる。ウビクイチン−タンパク質融合体
の脱ウビクイチン速度を減少するこれらおよび他の方法
は、当業者によって容易に確証できる。
本発明の方法は、なかでも、タンパク質の半減期を細
胞内で調節するために使用できる。この可能性が使用で
ある多くの場合が存在する。例えば、遺伝子を細胞中に
その中の発現のために導入するとき、発現された生成物
は特定の要求に依存して長い半減期または短い半減期に
ついて設計することができる。
胞内で調節するために使用できる。この可能性が使用で
ある多くの場合が存在する。例えば、遺伝子を細胞中に
その中の発現のために導入するとき、発現された生成物
は特定の要求に依存して長い半減期または短い半減期に
ついて設計することができる。
一般に、短い半減期をもつ脱ウビクイチンしたタンパ
ク質は、タンパク質の細胞内レベルの調節をいっそうよ
く受けることができる。タンパク質の細胞内レベルおよ
び活性を微細に調節する能力は、治療または生体外細胞
培養物を使用する研究において有用であることがある。
例えば、遺伝子の治療において、遺伝子を細胞中に導入
して、遺伝子の欠乏または異常を補正することができ
る。遺伝子は誘発性プロモーターの制御下に挿入するこ
とができる。誘導は遺伝子生成物の増大した発現および
結局、細胞内のより高いレベルを生ずる。遺伝子を不安
定なタンパク質をエンコードするように設計する場合、
発現されたタンパク質の細胞内濃度は、細胞内で持続し
ないので、その合成速度の後の減少に対していっそう急
速に応答的である。このようにして、挿入された遺伝子
によってエンコードされたタンパク質の細胞内レベルお
よび／または活性は、いっそう微細に調節調節すること
ができる。
ク質は、タンパク質の細胞内レベルの調節をいっそうよ
く受けることができる。タンパク質の細胞内レベルおよ
び活性を微細に調節する能力は、治療または生体外細胞
培養物を使用する研究において有用であることがある。
例えば、遺伝子の治療において、遺伝子を細胞中に導入
して、遺伝子の欠乏または異常を補正することができ
る。遺伝子は誘発性プロモーターの制御下に挿入するこ
とができる。誘導は遺伝子生成物の増大した発現および
結局、細胞内のより高いレベルを生ずる。遺伝子を不安
定なタンパク質をエンコードするように設計する場合、
発現されたタンパク質の細胞内濃度は、細胞内で持続し
ないので、その合成速度の後の減少に対していっそう急
速に応答的である。このようにして、挿入された遺伝子
によってエンコードされたタンパク質の細胞内レベルお
よび／または活性は、いっそう微細に調節調節すること
ができる。
本発明の方法は、また、マーカーに関する表現型に必
要な時間を短縮することによって、選択可能なマーカー
の使用を拡張するために使用できる。この目的に対し
て、マーカー遺伝子によってエンコードされる生成物
は、Ｎ−末端ルールに従いそのアミノ末端を変更するこ
とによって脱安定化することができる。このようにし
て、ネガティブ表現型についての選択は促進することが
できる。なぜなら、マーカーをエンコードする機能が消
滅した後、マーカーの生成物はより急速に絶滅するであ
ろうからである。１つの例はチミジンキナーゼ（tk）遺
伝子である。tk遺伝子は、アミノ末端において適当な脱
安定化アミノ酸を導入することによって、安定性が低い
酵素をエンコードするように操作することができる。tk
-表現型を生ずる遺伝子の突然変異は、残留するtkがよ
り急速に分解するので、細胞によっていっそう急速に現
れるであろう。これは、tk-型への形質転換前に合成さ
れたtkを「希釈」するためにより多くの時間が要求され
る場合、増殖の遅い細胞においてことに有用である。
要な時間を短縮することによって、選択可能なマーカー
の使用を拡張するために使用できる。この目的に対し
て、マーカー遺伝子によってエンコードされる生成物
は、Ｎ−末端ルールに従いそのアミノ末端を変更するこ
とによって脱安定化することができる。このようにし
て、ネガティブ表現型についての選択は促進することが
できる。なぜなら、マーカーをエンコードする機能が消
滅した後、マーカーの生成物はより急速に絶滅するであ
ろうからである。１つの例はチミジンキナーゼ（tk）遺
伝子である。tk遺伝子は、アミノ末端において適当な脱
安定化アミノ酸を導入することによって、安定性が低い
酵素をエンコードするように操作することができる。tk
-表現型を生ずる遺伝子の突然変異は、残留するtkがよ
り急速に分解するので、細胞によっていっそう急速に現
れるであろう。これは、tk-型への形質転換前に合成さ
れたtkを「希釈」するためにより多くの時間が要求され
る場合、増殖の遅い細胞においてことに有用である。
Ｎ−末端ルールに基づくタンパク質の修飾の原理は、
また、細胞毒素の設計において使用できる。タンパク質
の細胞毒素はＮ−末端ルールの通路によって分解可能な
不安定なタンパク質として設計することができるので、
それらの毒性作用が標的細胞上で発揮された後、それら
は持続しない。毒素の寿命を減少すると、非標的細胞を
殺す可能性は減少する。
また、細胞毒素の設計において使用できる。タンパク質
の細胞毒素はＮ−末端ルールの通路によって分解可能な
不安定なタンパク質として設計することができるので、
それらの毒性作用が標的細胞上で発揮された後、それら
は持続しない。毒素の寿命を減少すると、非標的細胞を
殺す可能性は減少する。
分解のＮ−末端ルールの通路の発見は、Ｎ−末端ルー
ルの通路の必須成分をエンコードする遺伝子中に突然変
異体を有する突然変異体細胞の発生を可能とする。例え
ば、そうでなければ生存が短いタンパク質を効率よく分
解することが永久にあるいは条件的に不可能である、細
胞を生成することができる。これらの細胞は、通常細胞
内で不安定である所望のタンパク質を生成するために使
用できる。
ルの通路の必須成分をエンコードする遺伝子中に突然変
異体を有する突然変異体細胞の発生を可能とする。例え
ば、そうでなければ生存が短いタンパク質を効率よく分
解することが永久にあるいは条件的に不可能である、細
胞を生成することができる。これらの細胞は、通常細胞
内で不安定である所望のタンパク質を生成するために使
用できる。
本発明のＮ−末端ルールの解釈の次の詳細な説明によ
ってさらに例示する。
ってさらに例示する。
方法 タンパク質の配列決定 ub−Met−βgal（第3A図）をエンコードする、pUB23
を有するS.cerevisiae細胞を、後述するように、
［35S］メチオニンで標識し、次いで抽出調製し、βgal
を免疫沈澱し、そして電気泳動する。湿ったポリアクリ
ルアミドゲルをオートラジオグラフィーにかけ、βgal
の帯びを切除し、そして電気溶離したβgalをエドマン
（Edman）分解による６サイクルの放射線化学の配列決
定にかけた。配列決定はハーバード大学の微生物化学設
備（Micro Chem Facility）においてW.レン（Lane）に
よって実施された。
を有するS.cerevisiae細胞を、後述するように、
［35S］メチオニンで標識し、次いで抽出調製し、βgal
を免疫沈澱し、そして電気泳動する。湿ったポリアクリ
ルアミドゲルをオートラジオグラフィーにかけ、βgal
の帯びを切除し、そして電気溶離したβgalをエドマン
（Edman）分解による６サイクルの放射線化学の配列決
定にかけた。配列決定はハーバード大学の微生物化学設
備（Micro Chem Facility）においてW.レン（Lane）に
よって実施された。
部位特異的突然変異誘発 pUB23（第１図）を、順次に、Acc I、pol Iのクレノ
ー断片、およびBamH Iで処理した。Xho I部位を含有す
る断片を精製し、そしてM13mp9ファージDNAの充填したH
ae III部位およびBAMH I部位の間に挿入した（J.メッシ
ングおよJ.ビエラ、遺伝子（Gene）19、263（198
2））。部位特異的突然変異誘発［M.スミス、アニュア
ル・レウビュー・イン・ジェネティックス（Annu.Rev.G
enet.）、19、423（1985）］を、クレイマー、W.ら、核
酸の研究（Nucleic Acids Research）、129441（1984）
によって記載されるように、βgalのMetコドンの５′側
に10塩基および３′側に12塩基を含有する、合成25残基
のオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して実施し
た。すべての４塩基を合成の間にもとのMetコドン位置
において発生させた。一次のファージのプラークは、コ
ドンの変化の領域にまたがる12残基のオリゴヌクレオチ
ドプローブを使用して交雜し［ウッド、N.I.ら、PNAS、
82、1585（1985）］、そしてもとの配列に交雜すること
によってスクリーニングした。期待したプラークのイン
サートを含有する非交雜プラークは、連鎖停止方法によ
って配列決定した。［サンガー、F.ら、PNAS、71、5463
（1977）］。所望の構成体をpUB23バックグラウン中に
移すために、突然変異ファージの複製形態のDNAをXho I
およびBamH Iで消化し、そしてプラスミドpLGS5−ATGの
同一消化物に加えた［参照、第１図およびL.グアレン
テ、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzymo
l.）、101、181（1983）］。結合した混合物を使用して
E.coli菌株MC1061を形質転換した。［M.J.カサダバンお
よびS.N.コウヘン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol.）、138、179（1980）］。
問題のプラスミドを含有するコロニー（ここでβgalの
オープンリーディングフレームが修復されている）は、
Ｘ−gal平板上でそれらの青色によって認識された。
ー断片、およびBamH Iで処理した。Xho I部位を含有す
る断片を精製し、そしてM13mp9ファージDNAの充填したH
ae III部位およびBAMH I部位の間に挿入した（J.メッシ
ングおよJ.ビエラ、遺伝子（Gene）19、263（198
2））。部位特異的突然変異誘発［M.スミス、アニュア
ル・レウビュー・イン・ジェネティックス（Annu.Rev.G
enet.）、19、423（1985）］を、クレイマー、W.ら、核
酸の研究（Nucleic Acids Research）、129441（1984）
によって記載されるように、βgalのMetコドンの５′側
に10塩基および３′側に12塩基を含有する、合成25残基
のオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して実施し
た。すべての４塩基を合成の間にもとのMetコドン位置
において発生させた。一次のファージのプラークは、コ
ドンの変化の領域にまたがる12残基のオリゴヌクレオチ
ドプローブを使用して交雜し［ウッド、N.I.ら、PNAS、
82、1585（1985）］、そしてもとの配列に交雜すること
によってスクリーニングした。期待したプラークのイン
サートを含有する非交雜プラークは、連鎖停止方法によ
って配列決定した。［サンガー、F.ら、PNAS、71、5463
（1977）］。所望の構成体をpUB23バックグラウン中に
移すために、突然変異ファージの複製形態のDNAをXho I
およびBamH Iで消化し、そしてプラスミドpLGS5−ATGの
同一消化物に加えた［参照、第１図およびL.グアレン
テ、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzymo
l.）、101、181（1983）］。結合した混合物を使用して
E.coli菌株MC1061を形質転換した。［M.J.カサダバンお
よびS.N.コウヘン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol.）、138、179（1980）］。
問題のプラスミドを含有するコロニー（ここでβgalの
オープンリーディングフレームが修復されている）は、
Ｘ−gal平板上でそれらの青色によって認識された。
パルス−チェース実験 問題のプラスミドで形質転換した［F.シャーマンら、
メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（Method
s in Yeast Genetics）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）ニューヨークー、1981］菌株BWG
−9a−１（MAT his ura3 ade6）のS.cerevisiae細胞
を、２％のガラクトース、アミノ酸を含まない0.67％の
酵母菌窒素塩基（DIFCO）、アデニン（10μg/ml）およ
びメチオニンを含むアミノ酸の培地中で、30℃において
ほぼ５のA600に増殖させた。典型的には、5mlの培養物
をミリポア（Millipore）マイクロタイター濾過プレー
トのウェルを通して濾過することによって収穫し、フィ
ルター上でメチオニンを欠く同一培地で数回洗浄し、そ
して0.3mlの１％のガラクトース、50ミリモルのリン酸
カリウム緩衝液（pH7.4）中に最懸濁させた。次いで、
［35S］メチオニン（50〜100μCi）を30℃において５分
間加えた；細胞を濾過によって集め、そして0.5mg/mlの
シクロヘキシルイミドを含有する増殖培地の0.4ml上に
最懸濁させた。試料（0.1ml）を示した時間に抜き出
し、そして0.4mlのガラスに加えてビーズレウペプチ
ン、ペプスタチンＡ、アンチペイン、アプロチニンおよ
びキモスタチンを含有する0.5mlの冷緩衝液Ａ［シグマ
（Sigma）］に添加した。その直後、細胞を４℃におい
てほぼ３分間渦形成することによって破壊した；抽出物
を12,000gで３分間遠心し、そして上澄み液中の酸不溶
性35Sの放射能を決定した。等量の合計の酸不溶性35Sを
含有する上澄み液のアリコートを、galに対するモノク
ローナル抗体で免疫沈澱するために処理した。モル過剰
量（少なくとも10倍）の抗体を含有する腹水を各アリコ
ートに添加し、引き続いて４℃において２時間インキュ
ベーションした；次いで、プロテインＡ−セファローズ
（Sepharose）［ファーマシア（Pharmacia）］を添加、
懸濁液を揺動しながら４℃において30分間インキュベー
ションし、そして12,000gで１分間遠心した。プロテイ
ンＡ−セファローズのペレットを0.1％のドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）を含有する緩衝剤Ａ（下を参照）中
で３回洗浄し、ジチオスレイトール（DTT）含有電気泳
動試料緩衝液中に再懸濁させ［U.K.ラエルミ、ネイチャ
ー（Nature）、227、680（1970）］。100℃に３分間加
熱し、そして12,000gで１分間遠心した。上澄み液の等
しいアリコートを７％の不連続のポリアクリルアミド−
SDSゲル（15×15×0.15cm）中で電気泳動させ、次いで
フルオログラフィーにかけた。いくつかの実験におい
て、上のプロトコルを使用せず、抽出物はSDSの存在下
に直接細胞を沸騰させることによって調製し、本質的に
同一の結果を得た。
メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（Method
s in Yeast Genetics）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）ニューヨークー、1981］菌株BWG
−9a−１（MAT his ura3 ade6）のS.cerevisiae細胞
を、２％のガラクトース、アミノ酸を含まない0.67％の
酵母菌窒素塩基（DIFCO）、アデニン（10μg/ml）およ
びメチオニンを含むアミノ酸の培地中で、30℃において
ほぼ５のA600に増殖させた。典型的には、5mlの培養物
をミリポア（Millipore）マイクロタイター濾過プレー
トのウェルを通して濾過することによって収穫し、フィ
ルター上でメチオニンを欠く同一培地で数回洗浄し、そ
して0.3mlの１％のガラクトース、50ミリモルのリン酸
カリウム緩衝液（pH7.4）中に最懸濁させた。次いで、
［35S］メチオニン（50〜100μCi）を30℃において５分
間加えた；細胞を濾過によって集め、そして0.5mg/mlの
シクロヘキシルイミドを含有する増殖培地の0.4ml上に
最懸濁させた。試料（0.1ml）を示した時間に抜き出
し、そして0.4mlのガラスに加えてビーズレウペプチ
ン、ペプスタチンＡ、アンチペイン、アプロチニンおよ
びキモスタチンを含有する0.5mlの冷緩衝液Ａ［シグマ
（Sigma）］に添加した。その直後、細胞を４℃におい
てほぼ３分間渦形成することによって破壊した；抽出物
を12,000gで３分間遠心し、そして上澄み液中の酸不溶
性35Sの放射能を決定した。等量の合計の酸不溶性35Sを
含有する上澄み液のアリコートを、galに対するモノク
ローナル抗体で免疫沈澱するために処理した。モル過剰
量（少なくとも10倍）の抗体を含有する腹水を各アリコ
ートに添加し、引き続いて４℃において２時間インキュ
ベーションした；次いで、プロテインＡ−セファローズ
（Sepharose）［ファーマシア（Pharmacia）］を添加、
懸濁液を揺動しながら４℃において30分間インキュベー
ションし、そして12,000gで１分間遠心した。プロテイ
ンＡ−セファローズのペレットを0.1％のドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）を含有する緩衝剤Ａ（下を参照）中
で３回洗浄し、ジチオスレイトール（DTT）含有電気泳
動試料緩衝液中に再懸濁させ［U.K.ラエルミ、ネイチャ
ー（Nature）、227、680（1970）］。100℃に３分間加
熱し、そして12,000gで１分間遠心した。上澄み液の等
しいアリコートを７％の不連続のポリアクリルアミド−
SDSゲル（15×15×0.15cm）中で電気泳動させ、次いで
フルオログラフィーにかけた。いくつかの実験におい
て、上のプロトコルを使用せず、抽出物はSDSの存在下
に直接細胞を沸騰させることによって調製し、本質的に
同一の結果を得た。
E.coli中で生成したub−βgalタンパク質の分析 プラスミドpUB23（第１図および第３図）をDS410、E.
coli菌株を生成するミニ細胞、中に導入した。［N.スト
ウカーら、転写および翻訳：実際的アプローチ（Transc
ription and Translation:A practical Approach）、B.
D.ハーンスおよびS.J.ヒギンス編、IRLプレス、オクス
フォード、1984p.153］。上のN.ストウカーらの文献に
記載されているように、ミニ細胞を調製し、そして［35
S］メチオニン［600Ci/ミリモル、アマーシャム（Amers
ham）］で36℃において60分間標識した。
coli菌株を生成するミニ細胞、中に導入した。［N.スト
ウカーら、転写および翻訳：実際的アプローチ（Transc
ription and Translation:A practical Approach）、B.
D.ハーンスおよびS.J.ヒギンス編、IRLプレス、オクス
フォード、1984p.153］。上のN.ストウカーらの文献に
記載されているように、ミニ細胞を調製し、そして［35
S］メチオニン［600Ci/ミリモル、アマーシャム（Amers
ham）］で36℃において60分間標識した。
標識したミニ細胞を遠心し、２％のSDS、10ミリモル
のDTT、10ミリモルのNa−HEPES（pH7.5）中に再懸濁さ
せ、そして100℃で３分間加熱した。12,000gにおいて１
分間遠心した後、上澄み液を20倍に緩衝液Ａ（１％のト
リトンＸ−100、0.1モルのNaCl、５ミリモルのNa−EDT
A、50ミリモルのNa−HEPES、pH7.5）で希釈し、次いで
フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）および
Ｎ−エチルマレイミドを、それぞれ、0.5ミリモルおよ
び10ミリモルに添加した。４℃において４時間後、試料
を0.5ミリモルのPMSFを含有する緩衝液Ａに対して４℃
において一夜透析し、そして免疫沈澱のために処理した
（上の記載のように）。
のDTT、10ミリモルのNa−HEPES（pH7.5）中に再懸濁さ
せ、そして100℃で３分間加熱した。12,000gにおいて１
分間遠心した後、上澄み液を20倍に緩衝液Ａ（１％のト
リトンＸ−100、0.1モルのNaCl、５ミリモルのNa−EDT
A、50ミリモルのNa−HEPES、pH7.5）で希釈し、次いで
フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）および
Ｎ−エチルマレイミドを、それぞれ、0.5ミリモルおよ
び10ミリモルに添加した。４℃において４時間後、試料
を0.5ミリモルのPMSFを含有する緩衝液Ａに対して４℃
において一夜透析し、そして免疫沈澱のために処理した
（上の記載のように）。
酵母菌中で生成したub−βgalタンパク質の分析 問題のプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を800ml
のウラシル欠乏培地中で増殖させ、次いで収穫し、そし
てレウペプチン、ペプスタチンＡ、アンチペイン、アプ
ロチニンおよびクミスタチン（各々３μg/ml）を含有す
る緩衝液Ａ中でガラスビーズで破壊した。抽出物を12,0
00gで３分間遠心した。飽和した硫酸アンモニウムを上
澄み液に57％の最終濃度に添加した。４℃において一夜
経過した後、沈澱したタンパク質を23,000gで30分間遠
心することによって集めた。ペレットをプロテアーゼ阻
害剤を含有する緩衝液Ａ中に再溶解した。12,000gで３
分間遠心後、腹水からのIgG分画（galに対するモノクロ
ーナル抗体を含有する）をAffi−Gel［バイオ−ラド（B
io−Rad）］に架橋することによって調製した親和カラ
ムに試料を通過させた。架橋のために使用したIgG分画
は、プロテインＡ−セファローズの親和クロマトグラフ
ィーによって腹水から精製した。トリトンＸ−100を欠
く緩衝液Ａで洗浄後、抗体結合したタンパク質を0.25モ
ルのグリシン−HCl（pH2.6）で溶離した。溶離液を直ち
に１モルのNa−HEPES（pH8.5）でpH7.5に調節し、その
後SDS中で0.1％にした。試料をセントリコン（Centrico
n）30［アミコン（Amicon）］中の限外濾過によって濃
縮し、そして７％の不連続のポリアクリルアミド−SDS
ゲル中で電気泳動させた［U.K.ラエルミ、ネイチャー
（Nature）（London）、227、680（1970）］。ニトロセ
ルロースへのタンパク質の電気ブロッティング、および
ウビクイチンに対するペプチド仲介抗体を使用するイム
ノブロッティング分析を、P.S.スウェルドロウ、D.フィ
ンレイおよびA.バルシャウスキー、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Analyt.Biochem.）、156、147（198
6）に記載されているように実施した。A.ハース（ミル
ウォーキーのメディカル・スクールの大学）から入手し
たウビクイチンに対する異なる抗体を使用して、同一の
結果を得た。
のウラシル欠乏培地中で増殖させ、次いで収穫し、そし
てレウペプチン、ペプスタチンＡ、アンチペイン、アプ
ロチニンおよびクミスタチン（各々３μg/ml）を含有す
る緩衝液Ａ中でガラスビーズで破壊した。抽出物を12,0
00gで３分間遠心した。飽和した硫酸アンモニウムを上
澄み液に57％の最終濃度に添加した。４℃において一夜
経過した後、沈澱したタンパク質を23,000gで30分間遠
心することによって集めた。ペレットをプロテアーゼ阻
害剤を含有する緩衝液Ａ中に再溶解した。12,000gで３
分間遠心後、腹水からのIgG分画（galに対するモノクロ
ーナル抗体を含有する）をAffi−Gel［バイオ−ラド（B
io−Rad）］に架橋することによって調製した親和カラ
ムに試料を通過させた。架橋のために使用したIgG分画
は、プロテインＡ−セファローズの親和クロマトグラフ
ィーによって腹水から精製した。トリトンＸ−100を欠
く緩衝液Ａで洗浄後、抗体結合したタンパク質を0.25モ
ルのグリシン−HCl（pH2.6）で溶離した。溶離液を直ち
に１モルのNa−HEPES（pH8.5）でpH7.5に調節し、その
後SDS中で0.1％にした。試料をセントリコン（Centrico
n）30［アミコン（Amicon）］中の限外濾過によって濃
縮し、そして７％の不連続のポリアクリルアミド−SDS
ゲル中で電気泳動させた［U.K.ラエルミ、ネイチャー
（Nature）（London）、227、680（1970）］。ニトロセ
ルロースへのタンパク質の電気ブロッティング、および
ウビクイチンに対するペプチド仲介抗体を使用するイム
ノブロッティング分析を、P.S.スウェルドロウ、D.フィ
ンレイおよびA.バルシャウスキー、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Analyt.Biochem.）、156、147（198
6）に記載されているように実施した。A.ハース（ミル
ウォーキーのメディカル・スクールの大学）から入手し
たウビクイチンに対する異なる抗体を使用して、同一の
結果を得た。
図面の詳細な説明 第１図は、ウビクイチン−lacZ遺伝子融合体の構成を
示す。pUB2、pBR322に基づくゲノムDNAクローン［E.オ
ズカイナク、ら、ネイチャー（Nature）、312、663（19
84）は、フランキング領域（ジグザグの線）と一緒に酵
母菌ウビクイチン解読配列の６つの反復（開いたボック
ス）を含有する。pUB2を、線図に示すように、最初のウ
ビクイチン反復から下流にBamH I部位の６塩基を配置す
ることによって修飾した。これにより、単一のウビクイ
チン反復と発現ベクターpLGSD5−ANTGん；ゾーンゲノム
との間フレーム内融合するの構成（ヌクレオチドの配列
決定によって確証された）が可能であった［G2と呼ばれ
る、L.グアレンテ、メソッズ・イン・エンジモロジー
（Methods Enzymol.）、101、181（1983）］。用語［２
μｍ］は、２μｍの円と呼ぶ酵母菌プラスミドの複製起
源およびフランキング配列を含有するpLGSD−ATGの領域
を意味する（上のL.グアレンテの文献を参照）。第3B図
は、ウビクイチン−βgal接合の付近における融合タン
パク質のアミノ酸配列を示す。
示す。pUB2、pBR322に基づくゲノムDNAクローン［E.オ
ズカイナク、ら、ネイチャー（Nature）、312、663（19
84）は、フランキング領域（ジグザグの線）と一緒に酵
母菌ウビクイチン解読配列の６つの反復（開いたボック
ス）を含有する。pUB2を、線図に示すように、最初のウ
ビクイチン反復から下流にBamH I部位の６塩基を配置す
ることによって修飾した。これにより、単一のウビクイ
チン反復と発現ベクターpLGSD5−ANTGん；ゾーンゲノム
との間フレーム内融合するの構成（ヌクレオチドの配列
決定によって確証された）が可能であった［G2と呼ばれ
る、L.グアレンテ、メソッズ・イン・エンジモロジー
（Methods Enzymol.）、101、181（1983）］。用語［２
μｍ］は、２μｍの円と呼ぶ酵母菌プラスミドの複製起
源およびフランキング配列を含有するpLGSD−ATGの領域
を意味する（上のL.グアレンテの文献を参照）。第3B図
は、ウビクイチン−βgal接合の付近における融合タン
パク質のアミノ酸配列を示す。
第２図は、galの生体内で半減期がそのアミノ末端残
基の関数であることを示す。（レーンａ）pUB23、最初
のub−lacZ融合、を有するE.coli菌株から分離したミニ
細胞（第１図および第３図）を［35S］メチオニンで36
℃で60分間標識し、次いで記載するようにβgalを分析
した。galの免疫沈澱前に、標識したミニ細胞SDS抽出物
を標識しない酵母菌SDS抽出物と一緒にしたとき、同一
の結果が得られた。（レーンｂ）ub−Met−βgal（第3B
図）をエンコードするpUB23を有するS.cerevisiae細胞
（第１図）を、［35S］メチオニンで30℃において５分
間標識し、次いでβgalを分析した。１〜30分の［35S］
メチオニン標識期間の長さ、およびプロテアーゼ阻害剤
の存在下の細胞の機械的破壊によって、あるいはSDS含
有緩衝液中細胞を直接沸騰することによって生成された
酵母菌抽出物を使用して、同一の結果が得られた。（レ
ーンｃ）レーンａと同一であるが、galをエンコードす
る対照プラスミドpLGSD65（G1と呼ぶ、L.グアレンテの
上の文献）E.coli細胞を使用した。（レーンｄ〜ｇ）ub
−Met−βgal（第3A図）をエンコードするpUB23を有す
るS.cerevisiae細胞（第１図）を30℃において５分間［
35S］メチオニンで標識し、次いでシクロヘキシイミド
の存在下に10、30および６分間チェースし（レーンえ〜
ｇ）、抽出し、免疫沈澱し、そしてβgalを分析した。
（レーンｈ〜ｊ）レーンｄ〜ｆと同一であるが、ub−Il
e−βgalを使用した（参照、第3A図）。（レーンｋ〜
ｍ）レーンｈ〜ｊと同一であるが、ub−Gln−βgalを使
用した。（レーンｎ〜ｑ）レーンｄ〜ｇと同一である
が、ub−Leu−βgalを使用した。（レーンｒ〜ｕ）レー
ンｄ〜ｇと同一であるが、ub−Arg−βgalを使用した。
表示:ori;分離ゲルの由来;ub、ウビクイチン；βgal、
特定したアミノ末端残基を含有するβgalタンパク質の
電気泳動の帯び；この用語において、ub−Met−βgalの
Met−βgal部分はβgalと表示する。矢印はβgalの代謝
的に安定な、約90kDの消化生成物を示し、これはある比
率の生存が短いβgal代謝的に部分、例えば、Leu−βga
lおよびArg−βgalの生体内で内部タンパク質分解的切
断の結果として明らかに形成する（レーンｎ〜ｕ）。
基の関数であることを示す。（レーンａ）pUB23、最初
のub−lacZ融合、を有するE.coli菌株から分離したミニ
細胞（第１図および第３図）を［35S］メチオニンで36
℃で60分間標識し、次いで記載するようにβgalを分析
した。galの免疫沈澱前に、標識したミニ細胞SDS抽出物
を標識しない酵母菌SDS抽出物と一緒にしたとき、同一
の結果が得られた。（レーンｂ）ub−Met−βgal（第3B
図）をエンコードするpUB23を有するS.cerevisiae細胞
（第１図）を、［35S］メチオニンで30℃において５分
間標識し、次いでβgalを分析した。１〜30分の［35S］
メチオニン標識期間の長さ、およびプロテアーゼ阻害剤
の存在下の細胞の機械的破壊によって、あるいはSDS含
有緩衝液中細胞を直接沸騰することによって生成された
酵母菌抽出物を使用して、同一の結果が得られた。（レ
ーンｃ）レーンａと同一であるが、galをエンコードす
る対照プラスミドpLGSD65（G1と呼ぶ、L.グアレンテの
上の文献）E.coli細胞を使用した。（レーンｄ〜ｇ）ub
−Met−βgal（第3A図）をエンコードするpUB23を有す
るS.cerevisiae細胞（第１図）を30℃において５分間［
35S］メチオニンで標識し、次いでシクロヘキシイミド
の存在下に10、30および６分間チェースし（レーンえ〜
ｇ）、抽出し、免疫沈澱し、そしてβgalを分析した。
（レーンｈ〜ｊ）レーンｄ〜ｆと同一であるが、ub−Il
e−βgalを使用した（参照、第3A図）。（レーンｋ〜
ｍ）レーンｈ〜ｊと同一であるが、ub−Gln−βgalを使
用した。（レーンｎ〜ｑ）レーンｄ〜ｇと同一である
が、ub−Leu−βgalを使用した。（レーンｒ〜ｕ）レー
ンｄ〜ｇと同一であるが、ub−Arg−βgalを使用した。
表示:ori;分離ゲルの由来;ub、ウビクイチン；βgal、
特定したアミノ末端残基を含有するβgalタンパク質の
電気泳動の帯び；この用語において、ub−Met−βgalの
Met−βgal部分はβgalと表示する。矢印はβgalの代謝
的に安定な、約90kDの消化生成物を示し、これはある比
率の生存が短いβgal代謝的に部分、例えば、Leu−βga
lおよびArg−βgalの生体内で内部タンパク質分解的切
断の結果として明らかに形成する（レーンｎ〜ｕ）。
第３図は、ウビクイチン−gal接合におけるgalの変化
するアミノ酸残基を示す。（Ａ）ub−Met−βgalをエン
コードする、最初のプラスミド、pUB23（第１図）を、
上に記載するように、突然変異誘発して、ub−βgal接
合におけるもとのMetコドンATGをMet以外の19アミノ酸
を特定するコドンに転化した。（第３図中に示す突然変
異誘発のもとのラウンドは19のうちから15の可能な置換
を生成した。残りの４つの置換は後に生成した（参照、
表１））。矢印は、ub−Pro−galを除外した融合タンパ
ク質のすべてを用いて起こる、発生期の融合タンパク質
における脱ウビクイチン生体内で切断の部位を示す（参
照、テキスト）。示した構成体のすべては、第2gal残基
としてHisをエンコードする。さらに、構成体のあるも
の（ub−Met−His−Gly−βgal、ub−Met−Gln−Gly−
βgal、およびub−Met−Gln−His−Gly−βgal、最後の
ものは挿入突然変異によって生成した、参照、表２）に
おいて、HisあるいはGlnはub−βgal接合においてMetよ
り後に存在し、対応するgalタンパク質の代謝的安定性
について区別不可能な結果を与えた。（Ｂ）ub−Met−
βgalのアミノ酸配列（単一の文字の略号）、初期の融
合タンパク質（第１図）、ub−βgal接合付近。単一の
文字のアミノ酸の略号:A、Ala;C、Cys;D、Asp;E、Glu、
Ｆ、PHe;G、Gly;H、His;I、Ile;K、Lys、Ｌ、Leu;M、Me
t;N、Asn;P、Pro;Q、Gln;R、Arg;S、Ser;T、Thr;V、Va
l;W、Trp、Ｙ、Tyr。
するアミノ酸残基を示す。（Ａ）ub−Met−βgalをエン
コードする、最初のプラスミド、pUB23（第１図）を、
上に記載するように、突然変異誘発して、ub−βgal接
合におけるもとのMetコドンATGをMet以外の19アミノ酸
を特定するコドンに転化した。（第３図中に示す突然変
異誘発のもとのラウンドは19のうちから15の可能な置換
を生成した。残りの４つの置換は後に生成した（参照、
表１））。矢印は、ub−Pro−galを除外した融合タンパ
ク質のすべてを用いて起こる、発生期の融合タンパク質
における脱ウビクイチン生体内で切断の部位を示す（参
照、テキスト）。示した構成体のすべては、第2gal残基
としてHisをエンコードする。さらに、構成体のあるも
の（ub−Met−His−Gly−βgal、ub−Met−Gln−Gly−
βgal、およびub−Met−Gln−His−Gly−βgal、最後の
ものは挿入突然変異によって生成した、参照、表２）に
おいて、HisあるいはGlnはub−βgal接合においてMetよ
り後に存在し、対応するgalタンパク質の代謝的安定性
について区別不可能な結果を与えた。（Ｂ）ub−Met−
βgalのアミノ酸配列（単一の文字の略号）、初期の融
合タンパク質（第１図）、ub−βgal接合付近。単一の
文字のアミノ酸の略号:A、Ala;C、Cys;D、Asp;E、Glu、
Ｆ、PHe;G、Gly;H、His;I、Ile;K、Lys、Ｌ、Leu;M、Me
t;N、Asn;P、Pro;Q、Gln;R、Arg;S、Ser;T、Thr;V、Va
l;W、Trp、Ｙ、Tyr。
第４図は、脱ウビクイチンしない場合、ウビクイチン
−galが生存が短いことを示す。（レーンａ〜ｇ）Ｘが
各レーンの上部に示す残基である、ub−Ｘ−βgal融合
タンパク質をエンコードするプラスミドを有するS.cere
visiae細胞を、30℃において５分間標識し、抽出し、免
疫沈澱させ、そしてβgalを分析した。これらのレーン
についてのフルオログラフィーの露出は、第２図におけ
る同様なパターンをもつものより数倍長く、生存が短い
βgalタンパク質の多数のウビクイチン化を明らかにし
た。（レーンｈ、ｉ）パルス−チェース露出における多
数のウビクイチン化Leu−βgalタンパク質の「ラダー
（ladder）」を明らかにするために、第２図においてレ
ーンｎ、ｏのフルオログラフィーの過度の露出（それぞ
れ、０および10分のチェース）。（レーンｊ）レーンａ
〜ｇと同一であるが、ub−Pro−βgalを使用した。（レ
ーンｋ）レーンｊと同一であるが、ub−Gln−βgalを使
用した。（レーンｌ）レーンｊと同一である。（レーン
ｍ〜ｐ）ub−Pro−βgalをエンコードするプラスミドを
有するS.cerevisiae細胞を30℃において５分間［35S］
メチオニンで標識し（レーンｍ）、次いでシクロヘキシ
イミドの存在下に10、30および60分間チェースした（レ
ーンｎ〜ｐ）。レーンｐの右への上の小さい矢印は、ub
−Pro−βgalを示し、その小さい比率は１時間のチェー
ス後なお存在する。下の小さい矢印は、チェースの間ゆ
っくり蓄積し、そして代謝的に安定である、明らかに脱
ウビクイチンされたPro−βgalを示す。レーンｍの左へ
の点は、使用した抗体によってある実験において沈澱し
た。内因性酵母菌タンパク質を示す。正方形のカッコは
多数のウビクイチン化βgal種を意味する（参照、第５
図）。他の表示は第２図における通りである。
−galが生存が短いことを示す。（レーンａ〜ｇ）Ｘが
各レーンの上部に示す残基である、ub−Ｘ−βgal融合
タンパク質をエンコードするプラスミドを有するS.cere
visiae細胞を、30℃において５分間標識し、抽出し、免
疫沈澱させ、そしてβgalを分析した。これらのレーン
についてのフルオログラフィーの露出は、第２図におけ
る同様なパターンをもつものより数倍長く、生存が短い
βgalタンパク質の多数のウビクイチン化を明らかにし
た。（レーンｈ、ｉ）パルス−チェース露出における多
数のウビクイチン化Leu−βgalタンパク質の「ラダー
（ladder）」を明らかにするために、第２図においてレ
ーンｎ、ｏのフルオログラフィーの過度の露出（それぞ
れ、０および10分のチェース）。（レーンｊ）レーンａ
〜ｇと同一であるが、ub−Pro−βgalを使用した。（レ
ーンｋ）レーンｊと同一であるが、ub−Gln−βgalを使
用した。（レーンｌ）レーンｊと同一である。（レーン
ｍ〜ｐ）ub−Pro−βgalをエンコードするプラスミドを
有するS.cerevisiae細胞を30℃において５分間［35S］
メチオニンで標識し（レーンｍ）、次いでシクロヘキシ
イミドの存在下に10、30および60分間チェースした（レ
ーンｎ〜ｐ）。レーンｐの右への上の小さい矢印は、ub
−Pro−βgalを示し、その小さい比率は１時間のチェー
ス後なお存在する。下の小さい矢印は、チェースの間ゆ
っくり蓄積し、そして代謝的に安定である、明らかに脱
ウビクイチンされたPro−βgalを示す。レーンｍの左へ
の点は、使用した抗体によってある実験において沈澱し
た。内因性酵母菌タンパク質を示す。正方形のカッコは
多数のウビクイチン化βgal種を意味する（参照、第５
図）。他の表示は第２図における通りである。
第５図は、ウビクイチンを含有する「ラダー」gel種
を示す。（レーンａ）ub−Gln−βgalをエンコードする
プラスミドを有するS.cerevisiae細胞を、増殖し、そし
て破壊し、そしてβgalに対する固定化した抗体を有す
るカラムの親和クロマトグラフィーによって、抽出物を
βgalタンパク質の分離のために処理した。このように
して得られたβgalタンパク質をポリアクリルアミド−S
DSゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、そ
してウビクイチンに対する抗体でプロービングした。
（レーンｂ）レーンａと同一であるが、ub−Pro−βgal
を使用した。（レーンｃ）ｂと同一であるが、より長い
オートラジオグラフィーの露出。（レーンｃ）ub−Leu
−βgalをエンコードするプラスミドを有するS.cerevis
iae細胞を［35S］メチオニンで５分間標識し、次いで抽
出し、免疫沈澱し、そしてβgalの電気泳動させた（第
４図、レーンｆと同一の試料）。正方形のカッコは、ウ
ビクイチンに対する抗体で検出された多数のウビクイチ
ン化Gln−βgal種を示す。矢印はub−Pro−βgalの帯
び、レーンｂおよびｃにおいて見られる初期の融合タン
パク質を示す。矢印の頭は、ub−Gln−βgal融合タンパ
ク質から誘導された脱ウビクイチンしたβgal［クーマ
ッシー（Coomassie）の着色または代謝的に標識つけに
よるが、ウビクイチンに対する抗体を使用しないで検出
可能である］の帯の位置を示す。
を示す。（レーンａ）ub−Gln−βgalをエンコードする
プラスミドを有するS.cerevisiae細胞を、増殖し、そし
て破壊し、そしてβgalに対する固定化した抗体を有す
るカラムの親和クロマトグラフィーによって、抽出物を
βgalタンパク質の分離のために処理した。このように
して得られたβgalタンパク質をポリアクリルアミド−S
DSゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、そ
してウビクイチンに対する抗体でプロービングした。
（レーンｂ）レーンａと同一であるが、ub−Pro−βgal
を使用した。（レーンｃ）ｂと同一であるが、より長い
オートラジオグラフィーの露出。（レーンｃ）ub−Leu
−βgalをエンコードするプラスミドを有するS.cerevis
iae細胞を［35S］メチオニンで５分間標識し、次いで抽
出し、免疫沈澱し、そしてβgalの電気泳動させた（第
４図、レーンｆと同一の試料）。正方形のカッコは、ウ
ビクイチンに対する抗体で検出された多数のウビクイチ
ン化Gln−βgal種を示す。矢印はub−Pro−βgalの帯
び、レーンｂおよびｃにおいて見られる初期の融合タン
パク質を示す。矢印の頭は、ub−Gln−βgal融合タンパ
ク質から誘導された脱ウビクイチンしたβgal［クーマ
ッシー（Coomassie）の着色または代謝的に標識つけに
よるが、ウビクイチンに対する抗体を使用しないで検出
可能である］の帯の位置を示す。
第６図は、原核細胞および真核生物の両者の長く生き
る細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端において安定
化アミノ酸残基を有するが、これに対して分泌されたタ
ンパク質が相補的バイアスを示すことを示す。
る細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端において安定
化アミノ酸残基を有するが、これに対して分泌されたタ
ンパク質が相補的バイアスを示すことを示す。
（Ａ）原核細胞（77のタンパク質）および真核生物
（131のタンパク質）の両者からのブロッキングされな
いアミノ末端をもつ208の長く生きる、直接に配列決定
した、細胞内（非画分非）タンパク質を、Ｎ−末端ルー
ルによって定められた、それらのアミノ末端残基の性質
に従って、３つの群に分配した。検査した細胞内タンパ
ク質のすべては、広範に安定化性の残基をそれらのアミ
ノ末端において有する。パネルＢ〜Ｄにおいて、類似の
線図が243の分泌された真核生物のタンパク質（Ｂ）に
ついて、37の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖（Ｃ）に
ついて、および94の分泌された真核生物のトキシン
（Ｄ）について表されている。ＣおよびＤにおけるエン
トリーはＢにおけるエントリーのサブセットである。Ｂ
〜Ｄにおけるタンパク質について、集めたアミノ末端
は、割り当てが可能であるときはいつでも、分泌する細
胞内にない位置するタンパク質の最も処理された形態に
相当する。Ａ〜Ｄにおけるデータは、1981年以前に入手
可能であった完全なタンパク質配列の全体組みから相互
に集めた。同一の結論は、現在のナショナル・バイオメ
ディカル・リサーチ・ファンデンションのデータベース
を使用して、いっそう詳細なかつ広範な、コンピュータ
に助けられるタンパク質のアミノ末端の表作成後に、最
近到達された。Asn、Cys、HisおよびTrpのアミノ末端残
基残基は、対応するgalタンパク質の生体内半減期がま
だ未知であるので、収集から排除した（しかしながら、
表１の凡例を参照）。同一のタイプの最近の収集中への
残基（表１）の包含は、もとの結論を変化させなかっ
た。アミノ末端Proは、また、収集から排除したが、Pro
は、長く生きる非画分化タンパク質のアミノ末端におけ
るProの頻繁な存在と一致するβgalについて安定化残基
であるように思われる（表１）。
（131のタンパク質）の両者からのブロッキングされな
いアミノ末端をもつ208の長く生きる、直接に配列決定
した、細胞内（非画分非）タンパク質を、Ｎ−末端ルー
ルによって定められた、それらのアミノ末端残基の性質
に従って、３つの群に分配した。検査した細胞内タンパ
ク質のすべては、広範に安定化性の残基をそれらのアミ
ノ末端において有する。パネルＢ〜Ｄにおいて、類似の
線図が243の分泌された真核生物のタンパク質（Ｂ）に
ついて、37の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖（Ｃ）に
ついて、および94の分泌された真核生物のトキシン
（Ｄ）について表されている。ＣおよびＤにおけるエン
トリーはＢにおけるエントリーのサブセットである。Ｂ
〜Ｄにおけるタンパク質について、集めたアミノ末端
は、割り当てが可能であるときはいつでも、分泌する細
胞内にない位置するタンパク質の最も処理された形態に
相当する。Ａ〜Ｄにおけるデータは、1981年以前に入手
可能であった完全なタンパク質配列の全体組みから相互
に集めた。同一の結論は、現在のナショナル・バイオメ
ディカル・リサーチ・ファンデンションのデータベース
を使用して、いっそう詳細なかつ広範な、コンピュータ
に助けられるタンパク質のアミノ末端の表作成後に、最
近到達された。Asn、Cys、HisおよびTrpのアミノ末端残
基残基は、対応するgalタンパク質の生体内半減期がま
だ未知であるので、収集から排除した（しかしながら、
表１の凡例を参照）。同一のタイプの最近の収集中への
残基（表１）の包含は、もとの結論を変化させなかっ
た。アミノ末端Proは、また、収集から排除したが、Pro
は、長く生きる非画分化タンパク質のアミノ末端におけ
るProの頻繁な存在と一致するβgalについて安定化残基
であるように思われる（表１）。
結果および説明 発生期のウビクイチン−βgal融合タンパク質の急速な
生体内脱ウビクイチン ウビクイチン部分のカルボキシル末端のグリシンがイ
ソペプチド結合を経てタンパク質中の内部のリジン残期
のε−アミノ基へ結合する、枝分かれしたウビクイチン
接合体は、明らかに、真核生物の細胞中の多くのウビク
イチン接合体からなる。標的タンパク質のアミノ末端α
−アミノ基へウビクイチンを接合して、線状のウビクイ
チン接合体を生成することは、また、化学的に可能であ
る。参照、A.ヘルコら、PNAS USA、81:7021（1984）。
線状ウビクイチン−タンパク質融合体がウビクイチンの
タンパク質のアミノ末端への翻訳後の酵素的接合によっ
て生体内で実際に合成されるか否かにかかわらず、この
ようなタンパク質は、また、適当なキメラ遺伝子を構成
し、そしてそれらを生体内で発現させることによって生
成することができる。Escherichia coliのgalへ結合し
た酵母菌ウビクイチンをエンコードする、１つのこのよ
うな遺伝子の構成は、第１図にしめされている。
生体内脱ウビクイチン ウビクイチン部分のカルボキシル末端のグリシンがイ
ソペプチド結合を経てタンパク質中の内部のリジン残期
のε−アミノ基へ結合する、枝分かれしたウビクイチン
接合体は、明らかに、真核生物の細胞中の多くのウビク
イチン接合体からなる。標的タンパク質のアミノ末端α
−アミノ基へウビクイチンを接合して、線状のウビクイ
チン接合体を生成することは、また、化学的に可能であ
る。参照、A.ヘルコら、PNAS USA、81:7021（1984）。
線状ウビクイチン−タンパク質融合体がウビクイチンの
タンパク質のアミノ末端への翻訳後の酵素的接合によっ
て生体内で実際に合成されるか否かにかかわらず、この
ようなタンパク質は、また、適当なキメラ遺伝子を構成
し、そしてそれらを生体内で発現させることによって生
成することができる。Escherichia coliのgalへ結合し
た酵母菌ウビクイチンをエンコードする、１つのこのよ
うな遺伝子の構成は、第１図にしめされている。
この遺伝子がE.coli中で発現されるとき、得られるβ
gal含有タンパク質は見掛けの分子質量を有し、これは
対照βgalのそれより大きく、ほぼ6kDであり、キメラ遺
伝子によってエンコードされるタンパク質中のウビクイ
チンの存在と一致する値である。対照的に、同一遺伝子
を酵母菌中で発現するとき、対応するβgalタンパク質
は対照βgalと電気泳動的に区別可能である。この結果
は、［35S］メチオニン標識期間（１〜30分）に対して
独立である。さらに、生体内標識したゲル精製βgalの
エドマン分解による、推定のMet−βgal（半減期、ｔ
1/2 20時間）におけるアミノ末端残基の決定（第２図、
レーンｄ）は、そのアミノ末端における期待するMet残
基の存在（第3A図および表１）を確証した。ウビクイチ
ンが融合タンパク質を切断するという独立の証拠は、ウ
ビクイチンの最後のGly残基が下に存在した直後に、起
こる。酵母菌において、ウビクイチンは発生期のウビク
イチン−融合タンパク質を効率よく切断して、脱ウビク
イチンされたβgalを生成すると、われわれは結論す
る。［E.coli中の脱ウビクイチン反応の不存在は、原核
細胞がウビクイチンおよびウビクイチン特異的酵素の両
者を欠くことをしめす他の証拠と一致する］。
gal含有タンパク質は見掛けの分子質量を有し、これは
対照βgalのそれより大きく、ほぼ6kDであり、キメラ遺
伝子によってエンコードされるタンパク質中のウビクイ
チンの存在と一致する値である。対照的に、同一遺伝子
を酵母菌中で発現するとき、対応するβgalタンパク質
は対照βgalと電気泳動的に区別可能である。この結果
は、［35S］メチオニン標識期間（１〜30分）に対して
独立である。さらに、生体内標識したゲル精製βgalの
エドマン分解による、推定のMet−βgal（半減期、ｔ
1/2 20時間）におけるアミノ末端残基の決定（第２図、
レーンｄ）は、そのアミノ末端における期待するMet残
基の存在（第3A図および表１）を確証した。ウビクイチ
ンが融合タンパク質を切断するという独立の証拠は、ウ
ビクイチンの最後のGly残基が下に存在した直後に、起
こる。酵母菌において、ウビクイチンは発生期のウビク
イチン−融合タンパク質を効率よく切断して、脱ウビク
イチンされたβgalを生成すると、われわれは結論す
る。［E.coli中の脱ウビクイチン反応の不存在は、原核
細胞がウビクイチンおよびウビクイチン特異的酵素の両
者を欠くことをしめす他の証拠と一致する］。
キメラ遺伝子、Gly−Metによってエンコードされるウ
ビクイチン−β−gal接合（第１図および第3B図）は、
成熟ウビクイチン中に効率よく処理される、ポリウビク
イチン前駆体タンパク質中の隣接する反復の間の接合と
同一である。こうして、まだ生化学的に特性づけられな
いが、同一のプロテアーゼは、成熟ウビクイチンへのポ
リウビクイチンの転化、および発生期のウビクイチン−
βgalタンパク質の脱ウビクイチンのための原因となる
ように思われる。そうである場合、ウビクイチン−βga
lの生体内脱ウビクイチンを阻害する（これによってβg
alへの安定なウビクイチンの結合の代謝的結果の分析を
可能とする）１つの潜在的方法は、ウビクイチン−βga
l接合におけるβgalのMet残基（第3B図）を他のアミノ
酸残基（第3A図）に転化することである。このようなア
プローチの予期されない結果は下に説明する。
ビクイチン−β−gal接合（第１図および第3B図）は、
成熟ウビクイチン中に効率よく処理される、ポリウビク
イチン前駆体タンパク質中の隣接する反復の間の接合と
同一である。こうして、まだ生化学的に特性づけられな
いが、同一のプロテアーゼは、成熟ウビクイチンへのポ
リウビクイチンの転化、および発生期のウビクイチン−
βgalタンパク質の脱ウビクイチンのための原因となる
ように思われる。そうである場合、ウビクイチン−βga
lの生体内脱ウビクイチンを阻害する（これによってβg
alへの安定なウビクイチンの結合の代謝的結果の分析を
可能とする）１つの潜在的方法は、ウビクイチン−βga
l接合におけるβgalのMet残基（第3B図）を他のアミノ
酸残基（第3A図）に転化することである。このようなア
プローチの予期されない結果は下に説明する。
βgalの生体内半減期はそのアミノ末端残基の関数であ
る。ウビクイチン接合におけるgalのもとのMet残基を特
定するATGコドン（第3B図）を、部位特異的突然変異誘
発によって、19の他のアミノ酸を特定するコドンに転化
した（参照、第3A図および表１）。これらの構成体は、
もっぱらウビクイチン接合におけるβgalの第１コドン
において異なる（第3A図）。このように設計された16プ
ラスミドの各々が酵母菌中に導入された後、生体内でパ
ルス標識された対応するgalタンパク質の分析は、次の
結果に導いた（第２図、第４図および表１）： １）１つの例外（下を参照）を除いて、発生期のウビク
イチン−βgalの効率よい脱ウビクイチンは、ウビクイ
チン−βgal接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に
無関係に起こる。こうして、もとのウビクイチン−βga
lタンパク質をGly−Met接合において切断する、明らか
にウビクイチン特異的のプロテアーゼは、一般に、接合
におけるβgalの第１残基の性質に無関係である（第3A
図および表１）。この結果は、事実、生体内で生成され
たそうでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端
において、異なるアミノ酸残基を露出することを可能と
する。
る。ウビクイチン接合におけるgalのもとのMet残基を特
定するATGコドン（第3B図）を、部位特異的突然変異誘
発によって、19の他のアミノ酸を特定するコドンに転化
した（参照、第3A図および表１）。これらの構成体は、
もっぱらウビクイチン接合におけるβgalの第１コドン
において異なる（第3A図）。このように設計された16プ
ラスミドの各々が酵母菌中に導入された後、生体内でパ
ルス標識された対応するgalタンパク質の分析は、次の
結果に導いた（第２図、第４図および表１）： １）１つの例外（下を参照）を除いて、発生期のウビク
イチン−βgalの効率よい脱ウビクイチンは、ウビクイ
チン−βgal接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に
無関係に起こる。こうして、もとのウビクイチン−βga
lタンパク質をGly−Met接合において切断する、明らか
にウビクイチン特異的のプロテアーゼは、一般に、接合
におけるβgalの第１残基の性質に無関係である（第3A
図および表１）。この結果は、事実、生体内で生成され
たそうでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端
において、異なるアミノ酸残基を露出することを可能と
する。
２）こうして設計されたβgalタンパク質の生体内の半
減期は、βgalアミノ末端において露出されたアミノ酸
残基の性質に依存して、20時間以上から３分より小に変
化する（第２図、第４図および表１）。詳しくは、アミ
ノ末端にMet、Ser、Ala、Thr、Val、CysまたはGlyをも
つ脱ウビクイチンされたβgalタンパク質は、遺伝子が
ウビクイチンのそれに融合されていない対照の半減期に
類似して、20時間の比較的長い生体内半減期を有する
（第２図、レーンｄ〜ｇ、および表１）。顕著に対照的
に、アミノ末端にArg、Lys、Phe、Leu、AspまたはTrpを
もつβgalタンパク質は、Arg−βgalについてほぼ２分
およびLys−βgal、Phe−βgal、Leu−βgal、Asp−βg
al、Asn−βgalおよびTrp−βgalについてほぼ３分の間
の非常に短い半減期を有する（第２図、レーンｎ〜ｕ、
および表１）。Gln、HisまたはTryのアミノ末端残基を
もつβgalタンパク質の半減期はほぼ10分であり（第２
図、レーンｋ〜ｍ、および表１）、これに対してアミノ
末端のIleまたはGluはβgalにほぼ10分の半減期を与え
る（第２図、レーンｈ〜ｉ、および表１）。パルス−チ
ェースおよび連続的標識技術の両者を、これらの実験に
おいて使用し、そして同様な結果を得た。
減期は、βgalアミノ末端において露出されたアミノ酸
残基の性質に依存して、20時間以上から３分より小に変
化する（第２図、第４図および表１）。詳しくは、アミ
ノ末端にMet、Ser、Ala、Thr、Val、CysまたはGlyをも
つ脱ウビクイチンされたβgalタンパク質は、遺伝子が
ウビクイチンのそれに融合されていない対照の半減期に
類似して、20時間の比較的長い生体内半減期を有する
（第２図、レーンｄ〜ｇ、および表１）。顕著に対照的
に、アミノ末端にArg、Lys、Phe、Leu、AspまたはTrpを
もつβgalタンパク質は、Arg−βgalについてほぼ２分
およびLys−βgal、Phe−βgal、Leu−βgal、Asp−βg
al、Asn−βgalおよびTrp−βgalについてほぼ３分の間
の非常に短い半減期を有する（第２図、レーンｎ〜ｕ、
および表１）。Gln、HisまたはTryのアミノ末端残基を
もつβgalタンパク質の半減期はほぼ10分であり（第２
図、レーンｋ〜ｍ、および表１）、これに対してアミノ
末端のIleまたはGluはβgalにほぼ10分の半減期を与え
る（第２図、レーンｈ〜ｉ、および表１）。パルス−チ
ェースおよび連続的標識技術の両者を、これらの実験に
おいて使用し、そして同様な結果を得た。
個々のアミノ酸の組みを、それらがそのアミノ末端に
おいて露出されるときgalに与える半減期に関して配列
することができる。得られるルール（表１）を「Ｎ−末
端ルール」と呼ぶ。
おいて露出されるときgalに与える半減期に関して配列
することができる。得られるルール（表１）を「Ｎ−末
端ルール」と呼ぶ。
表１に対する凡例 Ｎ−末端ルール。酵母菌S.cerevisiae中のβgalタン
パク質の生体内半減期は、パルス−チェース技術（短い
半減期のgalについて；下を参照）によって、あるいは
粗製抽出物中のgalの酵素活性を測定によって測定し
た。βgalの活性を測定するため、ガラクトース含有培
地中で増殖する細胞を、ガラクトースを欠かつ10％のグ
ルコースを含有する、そうでなければ同一の培地に移し
た。30℃において少なくとも５時間さらに増殖させた
後、グルコースへのシフトの前および後の細胞当たりの
βgal活性の比を、βgalタンパク質の各々について決定
した。［融合遺伝子のGALプロモーター推進発現（第１
図および第２図）はグルコース培地中で再び発現させ
る］。生存が短い（ｔ1/2＜１時間）βgalタンパク質に
ついて、パルス−チェース技術を同様によく使用された
（第２図および第４図）。パルス−チェース実験におい
て［35S］メチオニンで標識されたβgalタンパク質の電
気泳動の帯びを第２図および第４図のそれらと同様にシ
ンチラント含浸、乾燥ゲルから切り取り、そして帯び中
の35Sを決定した。生存が短いgalの生体内の崩壊は一次
の動力学から誘導し、ここで分解の速度はチェースのよ
り遅い（１時間）時間の期間において測定するとき低
く、より遅い速度はシクロヘキシイミドの時間依存性の
毒性作用あるいは生体内分解過程の固有の特性を反映す
る。［翻訳の抑制はS.cerevisiae中の効率よい短時間の
チェースのために必要である。なぜなら、アミノ酸プー
ルの平衡化の問題はこの有機体中で液胞の存在に関係す
るからである］。下に列挙する半減期の値は、チェース
の最初の10の間に決定した。いくつかの証拠（参照、第
４図および第６図の説明）は、Proが安定化残基である
ことを示唆する。列挙したアミノ酸の旋回の半径はM.レ
ビット、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（J.Mol.Biol.）、104:59（1976）からのものであ
る。
パク質の生体内半減期は、パルス−チェース技術（短い
半減期のgalについて；下を参照）によって、あるいは
粗製抽出物中のgalの酵素活性を測定によって測定し
た。βgalの活性を測定するため、ガラクトース含有培
地中で増殖する細胞を、ガラクトースを欠かつ10％のグ
ルコースを含有する、そうでなければ同一の培地に移し
た。30℃において少なくとも５時間さらに増殖させた
後、グルコースへのシフトの前および後の細胞当たりの
βgal活性の比を、βgalタンパク質の各々について決定
した。［融合遺伝子のGALプロモーター推進発現（第１
図および第２図）はグルコース培地中で再び発現させ
る］。生存が短い（ｔ1/2＜１時間）βgalタンパク質に
ついて、パルス−チェース技術を同様によく使用された
（第２図および第４図）。パルス−チェース実験におい
て［35S］メチオニンで標識されたβgalタンパク質の電
気泳動の帯びを第２図および第４図のそれらと同様にシ
ンチラント含浸、乾燥ゲルから切り取り、そして帯び中
の35Sを決定した。生存が短いgalの生体内の崩壊は一次
の動力学から誘導し、ここで分解の速度はチェースのよ
り遅い（１時間）時間の期間において測定するとき低
く、より遅い速度はシクロヘキシイミドの時間依存性の
毒性作用あるいは生体内分解過程の固有の特性を反映す
る。［翻訳の抑制はS.cerevisiae中の効率よい短時間の
チェースのために必要である。なぜなら、アミノ酸プー
ルの平衡化の問題はこの有機体中で液胞の存在に関係す
るからである］。下に列挙する半減期の値は、チェース
の最初の10の間に決定した。いくつかの証拠（参照、第
４図および第６図の説明）は、Proが安定化残基である
ことを示唆する。列挙したアミノ酸の旋回の半径はM.レ
ビット、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（J.Mol.Biol.）、104:59（1976）からのものであ
る。
アミノ酸のアミノ末端の位置はgalの半減期へのその作
用について必須である 部位特異的突然変異誘発を用いて、「安定化」アミノ
酸（この実験において、Met残基）を特定するコドン
を、ウビクイチン−βgal接合におけるβgalの最初のコ
ドンの前に挿入した（表２）。他の安定化残基（Thr）
あるいはウビクイチン−βgal接合における種々の脱安
定化残基（Gln、LysおよびArg）の前における安定化残
基（Met）の挿入は、長く生きる脱ウビクイチンされた
βgalを必ず生ずる（表２）。さらに、生存が短いばか
りでなく、かつまた脱ウビクイチンに対して抵抗性であ
るウビクイチン−Pro−βgal（第４図、レーンｊ〜ｐ、
および表１）と対照的に、ウビクイチン−Met−Pro−β
galは生体内で効率よく脱ウビクイチンされて長く生き
るMet−Pro−βgalを生成する（表２）。これらの結果
が示すように、アミノ酸残基の同一性およびそのアミノ
末端の位置（多分遊離ａ−アミノ基の存在）の両者はβ
galの半減期へのその作用について必須である。さら
に、これらの結果が支持するように、融合タンパク質の
切断はウビクイチンの最後のGly残基の直後に起こる
（第3A図）。
用について必須である 部位特異的突然変異誘発を用いて、「安定化」アミノ
酸（この実験において、Met残基）を特定するコドン
を、ウビクイチン−βgal接合におけるβgalの最初のコ
ドンの前に挿入した（表２）。他の安定化残基（Thr）
あるいはウビクイチン−βgal接合における種々の脱安
定化残基（Gln、LysおよびArg）の前における安定化残
基（Met）の挿入は、長く生きる脱ウビクイチンされた
βgalを必ず生ずる（表２）。さらに、生存が短いばか
りでなく、かつまた脱ウビクイチンに対して抵抗性であ
るウビクイチン−Pro−βgal（第４図、レーンｊ〜ｐ、
および表１）と対照的に、ウビクイチン−Met−Pro−β
galは生体内で効率よく脱ウビクイチンされて長く生き
るMet−Pro−βgalを生成する（表２）。これらの結果
が示すように、アミノ酸残基の同一性およびそのアミノ
末端の位置（多分遊離ａ−アミノ基の存在）の両者はβ
galの半減期へのその作用について必須である。さら
に、これらの結果が支持するように、融合タンパク質の
切断はウビクイチンの最後のGly残基の直後に起こる
（第3A図）。
アミノ酸のアミノ末端の位置は、βgalのその作用に
ついて必須である。挿入突然変異体は本質的に突然変異
体の初期の組みについて記載したように得たが、ただし
Metコドンの背後に挿入された不明瞭のコドンの５′側
に14塩基および32−残基をを含有する、32−塩基のオリ
ゴヌクレオチド、５′−CCCGGGATCCGTGC（G/C/T/）（G/
T）CATACCACCTCTTAGを使用した。カッコ内の塩基は、配
列中の位置16および17における不明瞭を意味する。対応
するβgalタンパク質の半減期は、表１に対する凡例中
に記載ように決定した。
ついて必須である。挿入突然変異体は本質的に突然変異
体の初期の組みについて記載したように得たが、ただし
Metコドンの背後に挿入された不明瞭のコドンの５′側
に14塩基および32−残基をを含有する、32−塩基のオリ
ゴヌクレオチド、５′−CCCGGGATCCGTGC（G/C/T/）（G/
T）CATACCACCTCTTAGを使用した。カッコ内の塩基は、配
列中の位置16および17における不明瞭を意味する。対応
するβgalタンパク質の半減期は、表１に対する凡例中
に記載ように決定した。
galの長く生きる切断生成物は、生存が短いβgalタンパ
ク質の崩壊の間に形成される。
ク質の崩壊の間に形成される。
生存が短い（長く生きるものでない）の電気泳動のパ
ターンは、βgalの特異的な、約90kDの切断生成物を必
ず含有し（第２図、レーンｎ〜ｕ）、この生成物は、親
のβgal種と異なり、標識後（チェース）期間の間に蓄
積する（第４図、レーンｍ〜ｐ）。90kDのβgal断片
は、比較的小さい比率の初期量のパルス標識されたβga
lを構成する。それにもかかわらず、その存在は、生体
内の電気泳動切断がその生存が短い親のタンパク質の代
謝的寿命からタンパク質断片を救済する。単一のタンパ
ク質種内の多数の半減期の得られる可能性が天然の生存
が短いタンパク質の設計において利用されるかどうかに
ついての理解が残る。
ターンは、βgalの特異的な、約90kDの切断生成物を必
ず含有し（第２図、レーンｎ〜ｕ）、この生成物は、親
のβgal種と異なり、標識後（チェース）期間の間に蓄
積する（第４図、レーンｍ〜ｐ）。90kDのβgal断片
は、比較的小さい比率の初期量のパルス標識されたβga
lを構成する。それにもかかわらず、その存在は、生体
内の電気泳動切断がその生存が短い親のタンパク質の代
謝的寿命からタンパク質断片を救済する。単一のタンパ
ク質種内の多数の半減期の得られる可能性が天然の生存
が短いタンパク質の設計において利用されるかどうかに
ついての理解が残る。
ウビクイチン−βgalは、脱ウビクイチンされないと
き、生存が短い。
き、生存が短い。
ウビクイチン−Pro−βgal、生体内で脱ウビクイチン
されない唯一のウビクイチン−βgal（第４図、レーン
ｊ〜ｐ）は、代謝的に安定なβgalタンパク質の半減期
（表１）の１％より短い、ほぼ７分の半減期（表１）を
有する。この結果の１つの解釈は、タンパク質のアミノ
末端への代謝的に安定なウビクイチンの結合が需要体タ
ンパク質の分解のシグナルを与えるために十分であると
いうことである。この解釈は、哺乳動物の細胞における
生存が短いタンパク質のウビクイチン化がそれらの分解
に必須であるという、早期の生化学的および遺伝学的証
拠と一致する。同時に、ウビクイチン−Pro−βgal以外
のすべてのウビクイチン−βgal融合タンパク質は生体
内で急速に脱ウビクイチンされる。（表１）。こうし
て、タンパク質の翻訳後のアミノ末端ウビクイチン化
は、生体内の分解のためのタンパク質を表示する、初期
の認識またはコミットメント（commitment）工程におい
て含まれないことがある。翻訳後のアミノ末端のウビク
イチン化（それが生体内で実際に起こる場合）が分解通
路の後の階段のために必須であるかどうかは、まだ、決
定することができない。早期の生体内の実験により、タ
ンパク質分解の基質のアミノ末端の優先的化学的修飾は
生体内ウビクイチン依存性のタンパク質分解系における
それらの分解を阻止することが示された。これらのデー
タに基づき、タンパク質のアミノ末端のウビクイチン化
はそれらの分解のために必須であることが提案された。
同一の結果の別の解釈は、タンパク質のアミノ末端の化
学的ブロッキングが、その初期の段階が必ずしもウビク
イチン依存性でない、「Ｎ−末端ルール」によって、そ
れらのアミノ末端の認識を防止するということである。
されない唯一のウビクイチン−βgal（第４図、レーン
ｊ〜ｐ）は、代謝的に安定なβgalタンパク質の半減期
（表１）の１％より短い、ほぼ７分の半減期（表１）を
有する。この結果の１つの解釈は、タンパク質のアミノ
末端への代謝的に安定なウビクイチンの結合が需要体タ
ンパク質の分解のシグナルを与えるために十分であると
いうことである。この解釈は、哺乳動物の細胞における
生存が短いタンパク質のウビクイチン化がそれらの分解
に必須であるという、早期の生化学的および遺伝学的証
拠と一致する。同時に、ウビクイチン−Pro−βgal以外
のすべてのウビクイチン−βgal融合タンパク質は生体
内で急速に脱ウビクイチンされる。（表１）。こうし
て、タンパク質の翻訳後のアミノ末端ウビクイチン化
は、生体内の分解のためのタンパク質を表示する、初期
の認識またはコミットメント（commitment）工程におい
て含まれないことがある。翻訳後のアミノ末端のウビク
イチン化（それが生体内で実際に起こる場合）が分解通
路の後の階段のために必須であるかどうかは、まだ、決
定することができない。早期の生体内の実験により、タ
ンパク質分解の基質のアミノ末端の優先的化学的修飾は
生体内ウビクイチン依存性のタンパク質分解系における
それらの分解を阻止することが示された。これらのデー
タに基づき、タンパク質のアミノ末端のウビクイチン化
はそれらの分解のために必須であることが提案された。
同一の結果の別の解釈は、タンパク質のアミノ末端の化
学的ブロッキングが、その初期の段階が必ずしもウビク
イチン依存性でない、「Ｎ−末端ルール」によって、そ
れらのアミノ末端の認識を防止するということである。
生存が短いβgalタンパク質は生体内で多数的にウビク
イチン化される。
イチン化される。
パルス−チェースのフルオログラムの過剰露出（第２
図）は、脱ウビクイチンされた、生存が短いβgalタン
パク質の主要な帯びが、４〜7kDの間隔で不規則的に間
隔をもって位置する帯びを含有する、大きい分子量のβ
galの「ラダー」と共存することを明らかにする（第４
図、レーンｃ〜ｇ）。長く生きるβgalタンパク質のフ
ルオログラムを同様に過度に露出するとき、このような
大きい種は現れない。βgalに対する抗体およびウビク
イチンに対する抗体の両者を使用する免疫学的分析は、
「ラダー」βgal種がウビクイチンを含有することを立
証する（第５図）。
図）は、脱ウビクイチンされた、生存が短いβgalタン
パク質の主要な帯びが、４〜7kDの間隔で不規則的に間
隔をもって位置する帯びを含有する、大きい分子量のβ
galの「ラダー」と共存することを明らかにする（第４
図、レーンｃ〜ｇ）。長く生きるβgalタンパク質のフ
ルオログラムを同様に過度に露出するとき、このような
大きい種は現れない。βgalに対する抗体およびウビク
イチンに対する抗体の両者を使用する免疫学的分析は、
「ラダー」βgal種がウビクイチンを含有することを立
証する（第５図）。
選択的分解の通路のためのモデル 天然のまたは操作したウビクイチン融合タンパク質
（第１図および表１）を除外して、発生期のタンパク質
はウビクイチン部分を明らかに欠く。発生期の非画分化
タンパク質の生体内アミノ末端処理は、その基質特異性
が部分的に特徴づけられる、アミノ末端ペプチダーゼの
作用を経て、それらの成熟アミノ末端を発生させる。
［参照、ツナサワ、S.ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、260、5382（1
985）；ボイセル、J.P.ら、PNAS USA、82、8448（198
5）］。こうして発生したアミノ末端は、「Ｎ−末端の
読み」によって認識されることを、われわれは示唆す
る。１つの特定のモデルは、タンパク質分子を分解する
コミットメントを、酵素を確率的に操作することによっ
て、そのアミノ末端残基を認識する結果としてなされる
ものであり、その標的アミノ末端における「クランピン
グ」の確立はＮ−末端ルールによって決定される（表
１）。いったんコミットメントがなされると、標的タン
パク質の高度に処理されやすいウビクイチン化が起こ
り、これはβgalの場合において、galの分子当たり15よ
り多いウビクイチン部分に接合する（第４図、レーンｃ
〜ｇ、および第５図）。次いで、多数でウビクイチン化
された「下流」の酵素（１）によって分解され、そのた
めに標的のウビクイチン部分は、認識シグナルまたは変
性［アンフォルディング（unfolding）］装置として、
あるいは両者として働く。
（第１図および表１）を除外して、発生期のタンパク質
はウビクイチン部分を明らかに欠く。発生期の非画分化
タンパク質の生体内アミノ末端処理は、その基質特異性
が部分的に特徴づけられる、アミノ末端ペプチダーゼの
作用を経て、それらの成熟アミノ末端を発生させる。
［参照、ツナサワ、S.ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、260、5382（1
985）；ボイセル、J.P.ら、PNAS USA、82、8448（198
5）］。こうして発生したアミノ末端は、「Ｎ−末端の
読み」によって認識されることを、われわれは示唆す
る。１つの特定のモデルは、タンパク質分子を分解する
コミットメントを、酵素を確率的に操作することによっ
て、そのアミノ末端残基を認識する結果としてなされる
ものであり、その標的アミノ末端における「クランピン
グ」の確立はＮ−末端ルールによって決定される（表
１）。いったんコミットメントがなされると、標的タン
パク質の高度に処理されやすいウビクイチン化が起こ
り、これはβgalの場合において、galの分子当たり15よ
り多いウビクイチン部分に接合する（第４図、レーンｃ
〜ｇ、および第５図）。次いで、多数でウビクイチン化
された「下流」の酵素（１）によって分解され、そのた
めに標的のウビクイチン部分は、認識シグナルまたは変
性［アンフォルディング（unfolding）］装置として、
あるいは両者として働く。
ウビクイチン含有「ラダー」βgal種（第４図、レー
ンｃ〜ｌ、および第５図）は、βgalにおいて内部リジ
ン残基のε−アミノ基に接合した、明らかに枝分かれの
ウビクイチン部分から成る。驚くべきことには、ウビク
イチン−Pro−βgalから誘導した「ラダー」βgal種
は、βgalの類似の種から電気泳動的に区別可能であ
り、その類似の種アミノ末端ウビクイチンは発生基の融
合タンパク質を切断する（第４図、レーンｊ〜ｌ、およ
び第５図）。電気泳動的に区別可能なウビクイチン化し
たβgal種が、事実、構造的に相同性である場合、これ
らの結果は別の２つのモデルと適合し、ここで、第１の
ウビクイチンがβgalに枝分かれ接合した直後に、枝分
かれウビクイチン化−Pro−βgalはアミノ末端の脱ウビ
クイチン化するか、あるいはアミノ末端ウビクイチン部
分を欠く類似のβgal種はそれを再び獲得する。この不
明瞭されの実験的解明は、タンパク質の翻訳後のアミノ
末端のウビクイチン化（それが生体内で起こる場合）選
択的タンパク質のターンオーバーにおいてある役割を演
ずるかどうかに拘らず、達成することができる。
ンｃ〜ｌ、および第５図）は、βgalにおいて内部リジ
ン残基のε−アミノ基に接合した、明らかに枝分かれの
ウビクイチン部分から成る。驚くべきことには、ウビク
イチン−Pro−βgalから誘導した「ラダー」βgal種
は、βgalの類似の種から電気泳動的に区別可能であ
り、その類似の種アミノ末端ウビクイチンは発生基の融
合タンパク質を切断する（第４図、レーンｊ〜ｌ、およ
び第５図）。電気泳動的に区別可能なウビクイチン化し
たβgal種が、事実、構造的に相同性である場合、これ
らの結果は別の２つのモデルと適合し、ここで、第１の
ウビクイチンがβgalに枝分かれ接合した直後に、枝分
かれウビクイチン化−Pro−βgalはアミノ末端の脱ウビ
クイチン化するか、あるいはアミノ末端ウビクイチン部
分を欠く類似のβgal種はそれを再び獲得する。この不
明瞭されの実験的解明は、タンパク質の翻訳後のアミノ
末端のウビクイチン化（それが生体内で起こる場合）選
択的タンパク質のターンオーバーにおいてある役割を演
ずるかどうかに拘らず、達成することができる。
原核細胞および真核生物の両者はＮ−末端ルールに従
うように思われるが（下を参照）、バクテリアは明らか
にウビクイチン系を欠く。こうして、仮定のＮ−末端認
識タンパク質が、選択的分解通路の残部であるより、原
核細胞および真核生物の間でいっそう強く保存されるこ
とが可能である。興味あることには、その存在が生体外
のウビクイチン接合酵素によるタンパク質分解基質のウ
ビクイチン化のために要求される、哺乳動物のタンパク
質E3の性質は、Ｎ−末端認識タンパク質の１成分である
ということと一致する。
うように思われるが（下を参照）、バクテリアは明らか
にウビクイチン系を欠く。こうして、仮定のＮ−末端認
識タンパク質が、選択的分解通路の残部であるより、原
核細胞および真核生物の間でいっそう強く保存されるこ
とが可能である。興味あることには、その存在が生体外
のウビクイチン接合酵素によるタンパク質分解基質のウ
ビクイチン化のために要求される、哺乳動物のタンパク
質E3の性質は、Ｎ−末端認識タンパク質の１成分である
ということと一致する。
Ｎ−末端ルールおよび細胞内タンパク質の既知のアミノ
末端 原核細胞および真核生物の両者からの代謝的に安定
な、非画分化タンパク質における、ブロッキングされな
いアミノ末端残基は、安定化クラス（Met、Ser、Ala、G
ly、Thr、Val）、すなわち、galに生体内の長く生きる
与えるクラス、から排除される（第6A図）。それについ
ての成熟アミノ末端が知られている。１つの生存が短い
細胞内タンパク質は、ファージラムダのc IIタンパク質
であり、これはλが溶菌的に増殖するか、あるいは感染
した細胞を溶原菌化するかどうかを決定するトリガーの
中央成分である。［Y.S.HO、D.ウルフ、M.ロウゼンバー
グ、遺伝子の発現の調節（Regulation of Gene Express
ion）、I.ブースおよびC.ヒギンス編（ケンブリッジ大
学、プレス、ロンドン、1986）、p.79;F.バヌエット、
M.A.、ホイト、L.マクファーレン、H.エコールス、I.ヘ
ルスコウィッツ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（J.Mol.Biol）、187、213（1986）;H.エコ
ールス、細胞（Cell）、31、565（1982）;K.ナスミス、
ネイチャー（Nature）（London）、320、670（198
3）］。ラムダ感染したE.coliにおけるc IIの半減期
は、３分より短い。顕著には、c IIの成熟アミノ末端は
Argで開始し［ホウ、Y.W.ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、9123（19
82）］、この残差はＮ−末端ルールにおける最も脱安定
化残基である（表１）。
末端 原核細胞および真核生物の両者からの代謝的に安定
な、非画分化タンパク質における、ブロッキングされな
いアミノ末端残基は、安定化クラス（Met、Ser、Ala、G
ly、Thr、Val）、すなわち、galに生体内の長く生きる
与えるクラス、から排除される（第6A図）。それについ
ての成熟アミノ末端が知られている。１つの生存が短い
細胞内タンパク質は、ファージラムダのc IIタンパク質
であり、これはλが溶菌的に増殖するか、あるいは感染
した細胞を溶原菌化するかどうかを決定するトリガーの
中央成分である。［Y.S.HO、D.ウルフ、M.ロウゼンバー
グ、遺伝子の発現の調節（Regulation of Gene Express
ion）、I.ブースおよびC.ヒギンス編（ケンブリッジ大
学、プレス、ロンドン、1986）、p.79;F.バヌエット、
M.A.、ホイト、L.マクファーレン、H.エコールス、I.ヘ
ルスコウィッツ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（J.Mol.Biol）、187、213（1986）;H.エコ
ールス、細胞（Cell）、31、565（1982）;K.ナスミス、
ネイチャー（Nature）（London）、320、670（198
3）］。ラムダ感染したE.coliにおけるc IIの半減期
は、３分より短い。顕著には、c IIの成熟アミノ末端は
Argで開始し［ホウ、Y.W.ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、9123（19
82）］、この残差はＮ−末端ルールにおける最も脱安定
化残基である（表１）。
脱安定化アミノ酸は疎水性であり、帯電しない親水性
であるか、あるいは帯電していることができるが、それ
らはMetを除外する安定化アミノ酸のいずれよりも大き
い旋回半径を有するという性質を共有する。
であるか、あるいは帯電していることができるが、それ
らはMetを除外する安定化アミノ酸のいずれよりも大き
い旋回半径を有するという性質を共有する。
画分化タンパク質におけるアミノ末端残基は大部分安定
化クラスである。
化クラスである。
第６図は、長く生きる非画分化細胞内タンパク質
（Ａ）および分泌されたタンパク質（Ｂ）の間のアミノ
末端残基の選択における顕著な差を示し、分泌されたタ
ンパク質の多くはそれらのそれぞれの細胞外画分におい
て長く生きる。この発見の１つの解釈は、Ｎ−末端ルー
ルに従って操作する、単一の細胞内分解の通路が細胞内
タンパク質の生体内半減期の多様性および細胞内空間中
に異常に導入される、画分化タンパク質の選択的分解の
両者について原因となりうるということである。ある誤
って画分化されたタンパク質は他のものよりも細胞に有
害であり得る。したがって、分泌された真核生物トキシ
ンは、分泌されたタンパク質の一般の集団よりも頻繁
に、それらのアミノ末端に、強く脱安定化性の残基（Ar
g、Lys、Leu、Phe、Asp）を含有するということは、興
味あることである（第６図、パネルＢ〜Ｄ）。
（Ａ）および分泌されたタンパク質（Ｂ）の間のアミノ
末端残基の選択における顕著な差を示し、分泌されたタ
ンパク質の多くはそれらのそれぞれの細胞外画分におい
て長く生きる。この発見の１つの解釈は、Ｎ−末端ルー
ルに従って操作する、単一の細胞内分解の通路が細胞内
タンパク質の生体内半減期の多様性および細胞内空間中
に異常に導入される、画分化タンパク質の選択的分解の
両者について原因となりうるということである。ある誤
って画分化されたタンパク質は他のものよりも細胞に有
害であり得る。したがって、分泌された真核生物トキシ
ンは、分泌されたタンパク質の一般の集団よりも頻繁
に、それらのアミノ末端に、強く脱安定化性の残基（Ar
g、Lys、Leu、Phe、Asp）を含有するということは、興
味あることである（第６図、パネルＢ〜Ｄ）。
上の考察が、また、示唆するように、細胞の位相的外
側、例えば、内質の網状構造の内腔およびゴルジ、およ
び細胞外空間がＮ−末端ルールの通路に類似する分解通
路を有する場合、それらはＮ−末端ルールの「逆転し
た」型に基づくことができ、ここで細胞の内側で脱安定
化されるアミノ末端残基は、今度は、安定化残基である
か、あるいはその逆である。こうして、本発明の方法
は、また、分泌されたものを包含する、画分化タンパク
質の代謝的安定性および他の性質の操作に有用であろ
う。
側、例えば、内質の網状構造の内腔およびゴルジ、およ
び細胞外空間がＮ−末端ルールの通路に類似する分解通
路を有する場合、それらはＮ−末端ルールの「逆転し
た」型に基づくことができ、ここで細胞の内側で脱安定
化されるアミノ末端残基は、今度は、安定化残基である
か、あるいはその逆である。こうして、本発明の方法
は、また、分泌されたものを包含する、画分化タンパク
質の代謝的安定性および他の性質の操作に有用であろ
う。
長く生きるタンパク質のターンオーバーにおけるＮ−末
端ルールの通路の可能な役割。
端ルールの通路の可能な役割。
脱安定化（表１）終わりから２番目の残基をもつ長く
生きる細胞内タンパク質は、それらの初期のアミノ末端
メチオニン残基を一般に保持する。アミノ末端の処理を
行わない、長く生きる細胞内タンパク質におけるアミノ
末端残基は、必ず安定化クラスに属する（表１）。長く
生きるタンパク質ターンオーバーにおけるＮ−末端ルー
ルの通路を包含するであろう興味ある可能性は、長く生
きるタンパク質の生体内分解における速度制限段階が脱
安定化残基を露出する、遅いアミノペプチダーゼ切断お
よび引き続くＮ−末端ルールの通路を経る急速な分解で
あることができるということである。分解速度の微細な
調整は、この場合において、Ｎ−末端ルールに従う残基
の脱安定化能力の機能であるよりはむしろ、脱安定化残
基を露出するアミノペプチダーゼ切断の速度の機能であ
ることに注意すべきである。
生きる細胞内タンパク質は、それらの初期のアミノ末端
メチオニン残基を一般に保持する。アミノ末端の処理を
行わない、長く生きる細胞内タンパク質におけるアミノ
末端残基は、必ず安定化クラスに属する（表１）。長く
生きるタンパク質ターンオーバーにおけるＮ−末端ルー
ルの通路を包含するであろう興味ある可能性は、長く生
きるタンパク質の生体内分解における速度制限段階が脱
安定化残基を露出する、遅いアミノペプチダーゼ切断お
よび引き続くＮ−末端ルールの通路を経る急速な分解で
あることができるということである。分解速度の微細な
調整は、この場合において、Ｎ−末端ルールに従う残基
の脱安定化能力の機能であるよりはむしろ、脱安定化残
基を露出するアミノペプチダーゼ切断の速度の機能であ
ることに注意すべきである。
Ｎ−末端ルールおよび生存が短い損傷されたタンパク質
の選択的分解 生体内の選択的分解のためのそうでなければ長く生き
るが、損傷されたタンパク質を標的する、ポリペプチド
鎖の折り畳みパターンまたは局所的化学的特徴の認識
は、Ｎ−末端ルールの通路によって直接仲介されるよう
に思われる。その代わり、特異的プロテアーゼ（機能が
DNAにおける特異的障害を認識するヌクレアーゼに類似
する）は、標的されたタンパク質を切断して、切断の２
つの生成物の一方のアミノ末端において脱安定化残基を
露出することを、われわれは示唆する。このモデルの１
つの試験可能な予測は、分解通路の初期の切断生成物が
それらのＮ−末端に脱安定化残基をを有することであ
る。初期のタンパク質の切断の生成物のアミノ末端にお
ける脱安定化残基の優先的露出は、含まれるプロテアー
ゼの固有の特異性のためであるか、あるいはアミノ酸の
大部分が脱安定化クラスに属する（表１）という単なる
事実のためであろう。さらに、タンパク質の初期の切断
は、そのもとのコンホメーションの面を脱安定化市、こ
うしてそれ以上の内部の切断の可能性を増加することが
期待されるであろう。タンパク質の初期の切断生成物
が、もっぱらＮ−末端ルールの通路を経て分解するか、
あるいは追加の内部の切断によってさらに処理されなけ
ればならかどうかは、いくつかの因子、例えば、初期の
切断生成物のアミノ末端における脱安定化残基の露出、
および内部の切断の導入に依存するであろう。このモデ
ルにおいて、Ｎ−末端ルールの通路は、化学的に損傷さ
れ、永久に停止され、不適切に折り畳まれ、そして誤っ
て画分化されたものから、天然のマルチサブユニットの
凝集体にアセンブリング不可能なものに、および最後に
生体内で生存が短いそうでなければ正常のものに及ぶ、
代謝的に不安定なタンパク質の大部分の分解のために必
須であろう。こうして、タンパク質の代謝的不安定性
は、そのアミノ末端における脱安定化残基の露出によっ
てばかりでなく、かつまた切断生成物のアミノ末端にお
いて脱安定化残基を露出するタンパク質分解的切断を生
ずる、そのポリペプチド鎖のコンホメーションのおよび
化学的特徴によって仲介されることができる。
の選択的分解 生体内の選択的分解のためのそうでなければ長く生き
るが、損傷されたタンパク質を標的する、ポリペプチド
鎖の折り畳みパターンまたは局所的化学的特徴の認識
は、Ｎ−末端ルールの通路によって直接仲介されるよう
に思われる。その代わり、特異的プロテアーゼ（機能が
DNAにおける特異的障害を認識するヌクレアーゼに類似
する）は、標的されたタンパク質を切断して、切断の２
つの生成物の一方のアミノ末端において脱安定化残基を
露出することを、われわれは示唆する。このモデルの１
つの試験可能な予測は、分解通路の初期の切断生成物が
それらのＮ−末端に脱安定化残基をを有することであ
る。初期のタンパク質の切断の生成物のアミノ末端にお
ける脱安定化残基の優先的露出は、含まれるプロテアー
ゼの固有の特異性のためであるか、あるいはアミノ酸の
大部分が脱安定化クラスに属する（表１）という単なる
事実のためであろう。さらに、タンパク質の初期の切断
は、そのもとのコンホメーションの面を脱安定化市、こ
うしてそれ以上の内部の切断の可能性を増加することが
期待されるであろう。タンパク質の初期の切断生成物
が、もっぱらＮ−末端ルールの通路を経て分解するか、
あるいは追加の内部の切断によってさらに処理されなけ
ればならかどうかは、いくつかの因子、例えば、初期の
切断生成物のアミノ末端における脱安定化残基の露出、
および内部の切断の導入に依存するであろう。このモデ
ルにおいて、Ｎ−末端ルールの通路は、化学的に損傷さ
れ、永久に停止され、不適切に折り畳まれ、そして誤っ
て画分化されたものから、天然のマルチサブユニットの
凝集体にアセンブリング不可能なものに、および最後に
生体内で生存が短いそうでなければ正常のものに及ぶ、
代謝的に不安定なタンパク質の大部分の分解のために必
須であろう。こうして、タンパク質の代謝的不安定性
は、そのアミノ末端における脱安定化残基の露出によっ
てばかりでなく、かつまた切断生成物のアミノ末端にお
いて脱安定化残基を露出するタンパク質分解的切断を生
ずる、そのポリペプチド鎖のコンホメーションのおよび
化学的特徴によって仲介されることができる。
いずれの所定のタンパク質についても、Ｎ−末端ルー
ルに加えて種々の因子は一緒になってその生体内の半減
期を変調することができる。このような因子の例は、次
のとおりである：タンパク質のアミノ末端の柔軟性およ
び接近可能性［トルントン、J.M.およびシバンダ、B.
L.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）、167、443（1983）］、アミノ末端基
を化学的にブロッキングする基、例えば、アセチル基の
存在、アミノ末端付近におけるウビクイチン化可能なリ
ジンの分布、および他の変数、例えば、カルボキシル末
端の構造。マルチサブユニットのタンパク質のアミノ末
端領域は普通にサブユニットの含まに含まれる［トルン
トン、J.M.およびシバンダ、B.L.、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、167、44
3（1983）］ので、タンパク質の第４構造は、生体内の
タンパク質の半減期へのＮ−末端ルールの通路の衝撃を
変調することが期待される、なお他のパラメーターであ
る。さらに、上に示唆したように、Ｎ−末端ルールの通
路は、また、その分解のための標的として初期の認識が
それらのアミノ末端における構造に対して独立である、
タンパク質の分解に必須である。
ルに加えて種々の因子は一緒になってその生体内の半減
期を変調することができる。このような因子の例は、次
のとおりである：タンパク質のアミノ末端の柔軟性およ
び接近可能性［トルントン、J.M.およびシバンダ、B.
L.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）、167、443（1983）］、アミノ末端基
を化学的にブロッキングする基、例えば、アセチル基の
存在、アミノ末端付近におけるウビクイチン化可能なリ
ジンの分布、および他の変数、例えば、カルボキシル末
端の構造。マルチサブユニットのタンパク質のアミノ末
端領域は普通にサブユニットの含まに含まれる［トルン
トン、J.M.およびシバンダ、B.L.、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、167、44
3（1983）］ので、タンパク質の第４構造は、生体内の
タンパク質の半減期へのＮ−末端ルールの通路の衝撃を
変調することが期待される、なお他のパラメーターであ
る。さらに、上に示唆したように、Ｎ−末端ルールの通
路は、また、その分解のための標的として初期の認識が
それらのアミノ末端における構造に対して独立である、
タンパク質の分解に必須である。
タンパク質のアミノ末端へのアミノ酸の翻訳後の付加の
機能的意味 バクテリアおよび真核生物の両者において、生体外の
受容体成熟アミノ末端への特異的アミノ酸の翻訳後の接
合を触媒する、酵素の異常なクラス、アミノアシル−転
移DNA−タンパク質トランスフェラーゼが存在すること
が、多年にわたって、知られている［R.L.ソファー、ト
ランスファー、RNA:バイオロジカル・アスペクツ（Tran
sfer RNA:Bilogical Aspects）、D.ソル、J.N.アベルソ
ン、P.R.シムメル編（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、
1980）、p493;C.デウチ、メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Methods Enzymol.）、106、198（1984）:A.カ
ジ、H.カジ、G.D.ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、240、1185（1
965）］。生体内のタンパク質へのアミノ酸の翻訳後付
加は、抑圧されたまたは再生の組織、例えば、神経細胞
の軸索への物理的損傷後の組織、において劇的に促進す
る［S.シネ−アスワル、R.V.リッシオ、G.チャクラボル
ティ、N.A.インゴリア、サイエンス（Science）、231、
603（1986）;N.A.インゴリア、ジャーナル・オブ・ネウ
ロサイエンス（j.Neurosci）、３、2463（1983）］。Ｎ
−末端ルールは、この現象についてのせつめいを提供す
る。細胞の変化した生理学的状態によって要求される、
そうでなければ損傷されない、長く生きるタンパク質の
代謝的安定性が、生体内で標識タンパク質のアミノ末端
への脱安定化アミノ酸の翻訳後の付加によって発生する
ことを、われわれは示唆する。顕著には、タンパク質へ
のアミノ酸の既知の翻訳後の付加［R.L.ソファー、RNA:
バイオロジカル・アスペクツ（Transfer RNA:Bilogical
Aspects）、D.ソル、J.N.アベルソン、P.R.シムメル編
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コ
ールド・ハーバー、ニューヨーク、1980）、p493;C.デ
ウチ、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzy
mol.）、106、198（1984）:A.カジ、H.カジ、G.D.ノベ
リ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、240、1185（1965）;S.シネ−アスワ
ル、R.V.リッシオ、G.チャクラボルティ、N.A.インゴリ
ア、サイエンス（Science）、231、603（1986）;N.A.イ
ンゴリア、ジャーナル・オブ・ネウロサイエンス（j.Ne
urosci）、３、2463（1983）］は、Ｎ−末端ルールに従
って脱安定化される、ほとんどのアミノ酸（Arg、Lys、
Leu、Phe、およびTry）を包含する。タンパク質への脱
安定化アミノ酸の付加が起こることが期待される生理学
的状態は、前以て存在する、そうでなければ長く生きる
細胞内タンパク質のある比率が選択的に分解される、細
胞サイクルへの出入り、化学的または物理学的ストレス
への応答、および特定の分化の事象、例えば、赤血球の
分化および精子形成を包含する。
機能的意味 バクテリアおよび真核生物の両者において、生体外の
受容体成熟アミノ末端への特異的アミノ酸の翻訳後の接
合を触媒する、酵素の異常なクラス、アミノアシル−転
移DNA−タンパク質トランスフェラーゼが存在すること
が、多年にわたって、知られている［R.L.ソファー、ト
ランスファー、RNA:バイオロジカル・アスペクツ（Tran
sfer RNA:Bilogical Aspects）、D.ソル、J.N.アベルソ
ン、P.R.シムメル編（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、
1980）、p493;C.デウチ、メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Methods Enzymol.）、106、198（1984）:A.カ
ジ、H.カジ、G.D.ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、240、1185（1
965）］。生体内のタンパク質へのアミノ酸の翻訳後付
加は、抑圧されたまたは再生の組織、例えば、神経細胞
の軸索への物理的損傷後の組織、において劇的に促進す
る［S.シネ−アスワル、R.V.リッシオ、G.チャクラボル
ティ、N.A.インゴリア、サイエンス（Science）、231、
603（1986）;N.A.インゴリア、ジャーナル・オブ・ネウ
ロサイエンス（j.Neurosci）、３、2463（1983）］。Ｎ
−末端ルールは、この現象についてのせつめいを提供す
る。細胞の変化した生理学的状態によって要求される、
そうでなければ損傷されない、長く生きるタンパク質の
代謝的安定性が、生体内で標識タンパク質のアミノ末端
への脱安定化アミノ酸の翻訳後の付加によって発生する
ことを、われわれは示唆する。顕著には、タンパク質へ
のアミノ酸の既知の翻訳後の付加［R.L.ソファー、RNA:
バイオロジカル・アスペクツ（Transfer RNA:Bilogical
Aspects）、D.ソル、J.N.アベルソン、P.R.シムメル編
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コ
ールド・ハーバー、ニューヨーク、1980）、p493;C.デ
ウチ、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzy
mol.）、106、198（1984）:A.カジ、H.カジ、G.D.ノベ
リ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、240、1185（1965）;S.シネ−アスワ
ル、R.V.リッシオ、G.チャクラボルティ、N.A.インゴリ
ア、サイエンス（Science）、231、603（1986）;N.A.イ
ンゴリア、ジャーナル・オブ・ネウロサイエンス（j.Ne
urosci）、３、2463（1983）］は、Ｎ−末端ルールに従
って脱安定化される、ほとんどのアミノ酸（Arg、Lys、
Leu、Phe、およびTry）を包含する。タンパク質への脱
安定化アミノ酸の付加が起こることが期待される生理学
的状態は、前以て存在する、そうでなければ長く生きる
細胞内タンパク質のある比率が選択的に分解される、細
胞サイクルへの出入り、化学的または物理学的ストレス
への応答、および特定の分化の事象、例えば、赤血球の
分化および精子形成を包含する。
哺乳動物の赤血球からのウビクイチン依存性系におけ
るあるタンパク質分解的基質の生体内の分解は、最近、
ある種のアミノアシル−tRNAの存在に依存することが示
された［フェルバー、S.およびクレチャノバー、A.、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）、261、3128（1986）］。この現象は、ま
た、タンパク質分解の基質のアミノ末端への特定の脱安
定化アミノ酸の翻訳後の付加のための用件を反映するこ
とを、われわれは示唆する。問題の初期のタンパク質分
解の基質は、AspまたはGluのアミノ酸残基を有し、それ
らの両者はＮ−末端ルールに従って脱安定化可能である
（表１）。これは、タンパク質中のある種のアミノ末端
残基がそのままで直接安定化されないで、他の脱安定化
残基へ接合するそれらの能力によってのみ脱安定化され
うるという、興味あるかつ試験可能な可能性を発生させ
る。
るあるタンパク質分解的基質の生体内の分解は、最近、
ある種のアミノアシル−tRNAの存在に依存することが示
された［フェルバー、S.およびクレチャノバー、A.、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）、261、3128（1986）］。この現象は、ま
た、タンパク質分解の基質のアミノ末端への特定の脱安
定化アミノ酸の翻訳後の付加のための用件を反映するこ
とを、われわれは示唆する。問題の初期のタンパク質分
解の基質は、AspまたはGluのアミノ酸残基を有し、それ
らの両者はＮ−末端ルールに従って脱安定化可能である
（表１）。これは、タンパク質中のある種のアミノ末端
残基がそのままで直接安定化されないで、他の脱安定化
残基へ接合するそれらの能力によってのみ脱安定化され
うるという、興味あるかつ試験可能な可能性を発生させ
る。
同等の実施態様 当業者は認識するか、あるいは日常実験を用いて確証
することができるように、ここに記載する本発明の特定
の実施態様について、多くの同等の実施態様が可能であ
る。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲に包
含されることを意図する。
することができるように、ここに記載する本発明の特定
の実施態様について、多くの同等の実施態様が可能であ
る。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲に包
含されることを意図する。
フロントページの続き (72)発明者 バルシヤブスキー，アレクサンダー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02115 ボストン・コモンウエルスアベニユーナ ンバー30 311 (56)参考文献 特開 昭60−262595（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−135500（ＪＰ，Ａ)
Claims (16)
- 【請求項１】融合タンパク質をコードする遺伝子構築物
であって、所期のタンパク質又はポリペプチドをコード
するDNA配列に結合されたユビキチンをコードするDNAを
含んで成り、該融合タンパク質は、ユビキチンのカルボ
キシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はポリペ
プチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性エ
ンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解に
より切断可能であることを特徴とする遺伝子構築物。 - 【請求項２】所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末
端残基がメチオニン以外の所定のアミノ酸残基である請
求の範囲第１項に記載の遺伝子構築物。 - 【請求項３】所期のタンパク質又はペプチドがそのアミ
ノ末端に不安定化クラスの所定のアミノ酸残基を有し、
該アミノ酸残基がイソロイシン、グルタミン酸、チロシ
ン、グルタミン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパ
ラギン、リシン及びアルギニンよりなる群から選ばれる
請求の範囲第１項に記載の遺伝子構築物。 - 【請求項４】融合タンパク質をコードする遺伝子構築物
であって、所期のタンパク質又はポリペプチドをコード
するDNA配列に結合されたユビキチンをコードするDNAを
含んで成り、該融合タンパク質は、ユビキチンのカルボ
キシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はポリペ
プチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性エ
ンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解に
より切断可能である遺伝子構築物を含有する宿主細胞。 - 【請求項５】所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末
端残基がメチオニン以外の所定のアミノ酸残基である請
求の範囲第４項に記載の宿主細胞。 - 【請求項６】真核細胞である請求の範囲第４項に記載の
宿主細胞。 - 【請求項７】哺乳類細胞である請求の範囲第６項に記載
の宿主細胞。 - 【請求項８】原核細胞である請求の範囲第４項に記載の
宿主細胞。 - 【請求項９】バクテリア細胞である請求の範囲第８項に
記載の宿主細胞。 - 【請求項１０】大腸菌（E.coli）である請求の範囲第９
項に記載の宿主細胞。 - 【請求項１１】融合タンパク質をコードする遺伝子構築
物であって、所期のタンパク質又はポリペプチドをコー
ドするDNA配列に結合されたユビキチンをコードするDNA
を含んで成り、該融合タンパク質は、ユビキチンのカル
ボキシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はポリ
ペプチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性
エンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解
により切断可能であり、該所期のタンパク質又はペプチ
ドがそのアミノ末端に不安定化クラスの所定のアミノ酸
残基を有し、該アミノ酸残基がイソロイシン、グルタミ
ン酸、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、ロイ
シン、アスパラギン、リシン及びアルギニンよりなる群
から選ばれる遺伝子構築物を含有する請求の範囲第４項
に記載の宿主細胞。 - 【請求項１２】真核細胞である請求の範囲第11項に記載
の宿主細胞。 - 【請求項１３】哺乳類細胞である請求の範囲第12項に記
載の宿主細胞。 - 【請求項１４】原核細胞である請求の範囲第11項に記載
の宿主細胞。 - 【請求項１５】バクテリア細胞である請求の範囲第14項
に記載の宿主細胞。 - 【請求項１６】大腸菌（E.coli）である請求の範囲第15
項に記載の宿主細胞。
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|---|---|---|---|
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| JP8045655A Expired - Lifetime JP2776414B2 (ja) | 1986-10-02 | 1996-02-08 | タンパク質の代謝的安定性の調節方法 |
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|---|---|---|---|
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| JP9149916A Expired - Lifetime JP2883594B2 (ja) | 1986-10-02 | 1997-05-26 | タンパク質の代謝的安定性の調節方法 |
| JP10299072A Expired - Lifetime JP3038193B2 (ja) | 1986-10-02 | 1998-10-07 | タンパク質の代謝的安定性の調節方法 |
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|---|---|
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| JP (4) | JP2612874B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1313831C (ja) |
| DE (1) | DE3752372T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988002406A2 (ja) |
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| US5108919A (en) * | 1988-06-24 | 1992-04-28 | Genentech, Inc. | Dna sequences encoding yeast ubiquitin hydrolase |
| US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
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| US6068994A (en) * | 1989-08-07 | 2000-05-30 | Chiron Corporation | Ubiquitin expression system |
| US5620923A (en) * | 1989-10-12 | 1997-04-15 | The University Of Utah | Synthesis of peptides as cloned ubiquitin extensions |
| ES2071315T3 (es) * | 1990-05-09 | 1995-06-16 | Massachusetts Inst Technology | Proteasa especifica de ubiquitina. |
| US5212058A (en) * | 1990-05-09 | 1993-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases |
| DK0574402T3 (da) | 1990-11-26 | 1998-05-18 | Chiron Corp | Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| GB2272443B (en) * | 1991-06-10 | 1995-10-25 | Lucky Ltd | Nucleotide and amino acid sequences of Korean hepatitis C virus |
| NZ255041A (en) * | 1992-07-13 | 1996-11-26 | Bionebraska Inc | Preparation of a recombinant single copy polypeptide or portion thereof modified with a terminal alpha amino carbon reactive group and reactive side chain groups involving biologically added protective groups |
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