JPH02501618A - タンパク質の代謝的安定性を調節する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 バクテリアおよび真核生物の細胞に８いて、半減期が細胞の世代時間に近接する かあるいはそれを越える、比較的長く生きるタンパク質は、半減期が細胞の世代 時間の１パーセントより短いことがあるタンパク質と共存する。細胞内タンパク 質の分解（ｄｅｒａｄａｔｉｏｎ）の速度は、細胞の生理学的状態の関数であり 、そして個々のタンパク質について差別的に制御されるように見える。とくに、 損傷したおよびそうでなバク質の分解の特定の機能はほとんどの場合においてな お未知であるが、多くの調節タンパク質は生体内で極端に短い寿命を有する。こ のようなタンパク質の代謝的不安定性は、それらの合成または分解の速度の調節 された変化によって、それらの細胞内濃度の急速な調節を可能とする。

細胞内タンパク質の代謝的不安定性がその機能について必須であることが示され た、わずかの場合は、バタテリオファージラムダのａｌｌタンパク質および酵母 菌サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＯエンドヌクレアーゼを包含する。

正常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の選択的ターンオーバーのほとんどは、 ＡＴＰ依存性および（真核生物において）非すリゾーム的である。最近の生化学 および遺伝学の証拠は、真核生物において、生存が短い細胞内タンパク質へのウ ビクイチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の共有接合がそれらの選択的分解について必 須であることを示す。所定のタンパク質が生体内で代謝的に安定であるかあるい は不安定であるかを決定するルールは、従来知られていない。

発明の要約 本発明は、タンパク質のアミノ末端を操作し、これによってタンパク質の代謝的 安定性および他の性質制御する方法に関する。さらに、本発明は、タンパク質の ７ミノ末端において、２０アミノ酸残品（またはそれらの類似体）のいずれかを もつタンパク質を生体内または生体外で生成する方法を提供する。本発明は、一 部分、細胞内タンパク質の生体内の半減期がアミノ末端アミノ酸残基の関数であ るという顕著な発見に基づき、そして生体内または生体外で特定したアミノ末端 をもつタンパク質を発生させることを可能とする新規な（およびより一般的に応 用可能な）技術に基づく。本発明は、また、新しく同定されたプロテアーゼ、ウ ビクイチン特異的処理プロテアーゼに関し、前記プロテアーゼは、生体内または 生体外で、問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基を露出す ることを可能とする性質を有する。

細胞内タンパク質のアミノ末端において露出されたアミノ酸の性質は、タンパク 質が生体内で長く生きるか、あるいは生存が短いかを特定する、１つの極めて重 要な決定基であることを示した。個々のアミノ酸は、タンパク質のアミン末端に おいて露出されたとき、それらがタンパク質に与える半減期に関して、安定化ま たは脱安走化のアミノ酸として分類することができる。脱安泥化アミノ酸残基は 、膜安定化アミノ酸のあるもについて数分までに少ない、短い半減期を与える。

安定化アミノ酸残基は、多数時間の長い半減期を与える。この顕著な、新しく発 見された、タンパク質の半減期のそのアミノ末端残基への依存性は、ここでＮ− 末端ルールと呼ぶ。

このＮ−末端ルールに基づき、タンパク質のアミノ末端は、こうして、タンパク 質の細胞内の半減期を変化するように、設計または変更することができ、そして 、このようにして、タンパク質の生体内の寿命および／または活性を調節するこ とができる。この能力は、多くの異なる面において合理的なタンパク質の設計の ために利用することができる。天然または野生型のタンパク質は、修飾して、そ れらを生体内の分解に対して多少抵抗性とすることができる。タンパク質の設計 または変更は、タンパク質レベルまたは遺伝子（ＤＮＡ）レベルで実施すること ができる。

例えば、タンパク質はアミノ末端を化学的に変更または操作して、安定化または 脱安泥化クラスのアミノ酸残基のアミノ末端においてを露出することができる。

遺伝子のレベルにおいて、タンパク質をエンコードする遺伝子は、所望のクラス のアミノ酸をアミノ末端においてをエンコードするようにして、発現されたタン パク質が、タンパク質分解のＮ−末端ルールの通路に関してタンパク質を代謝的 に安定または不安定とする、前二て決定したアミノ末端構造を示すようにするこ とができる。さらに、タンパク質は操作したアミノ末端をマスキングする「マス キング」タンパク質配列に発現、融合させ、こうして、アンマスキング（ｕｎｍ ａｓｋｉｎｇ）したとき、タンパク質がそのアミノ末ｔ４歿基の性質に依存する 所望の安定性または他の性質を示すようにすることができる。このような構成体 において、例えば、２つのタンパク質配列の間の接合は、例えば、エンドヌクレ アーゼによって特異的に切断するように設計することができる。融合した配列の 内部のタンパク質分解は、問題のタンパク質の特異的に操作されＩ；アミノ末端 をアンマスキングし、そしてタンパク質をＮ−末端ルールによって支配される分 解に付す。タンパク質のアミノ末端を操作する１つの特定の新しい方法は、本発 明において、ウビクイチン特異的処理プロテアーゼの同定およびその基質特異性 の決定によって提供される。このプロテアーゼを使用して、ウビクイチンと他の タンパク質との融合体は、生体内または生体外で特別に処理して、所望のアミノ 末端残基をもつタンパク質を発生させることができる。

生存が短いタンパク質を特Ｉ１１に操作する、興なる、かつまた、新しい方法は 、本発明において、効率よく脱つビクイチンすることができる、クビクイチンー タンパク質融合体、例えば、タビクイチン−Ｐｒｏ−β−ガラクトシダーゼが代 謝的に不安定であるという発見によって提供される。こうして、アミノ末端のウ ビクイチン部分タンパク質に、その除去を不可能とするか、あるいは非効率的と する方法で、取り付けることによって、Ｎ−末端ルールに直接基づかない、明確 な技術によって脱安走化することができる。

さらに、変異型の細胞を発生させることができ、前記細胞は分解する生存が短い タンパク質を条件的または非条件的に停止する、「Ｎ−末端」分解性プロテアー ゼ中に推定上の突然変異を含有する。これらの細胞を使用して、細胞内で通常生 存が短いタンパク質を過度に生成することが第１図は、タビクイチン−１ａｃＺ 遺伝子融合体の構成を示す。

第２図は、操作したβ−ｇａｌタンパク質の半減期を直接測定する実験を示す。

第３図は、ウビクイチン特異的処理プロテアーゼの新しく発見された性質を使用 するβ−ｇａｌ接合におけるアミノ酸残基（Ａ）および前記接合付近におけるア ミノ酸配列ＣＢ）の変化を示す。

第４図は、代謝的に不安定なβ−ｇａｌタンパク質における多数のウビクイチン 部分の存在を示す。

第５図は、代謝的に不安定なタンパク質におけるウビクイチン含有β−ｇａ１種 の１系列を示す。

第６図は、深核細胞および真核生物の両者の長く生きる細胞内タンパク質がそれ らのアミノ末端に安定化アミノ酸残基を有し、これにに対して分泌されたタンパ ク質が補体のバイアスを示すことを示す。

発明の詳細な説明 Ｎ−末端ルールを下に詳しく解説する。簡単に述べると、タンパク質の分解を支 配するこのルールは、そのアミノ末端に種々のアミノ酸残基を有し、そしてウビ クイチンとの融合タンパク質として生成した、酵素β−ガラクトシダーゼの生体 内の半減期を検査することによって明らかにされた。ウビクイチンーβ−ガラク トシダーゼ融合タンパク質をエンコードするキメラ遺伝子を酵母菌サツカロミセ ス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（以 後、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現するとき、ウビクイチンは発生期の融 合タンパク質を切断して、脱つビクイチンされたβ−ガラクトシダーゼ（βｇａ ｔ）を生成する。１つの例外を除いて、この切断はウビクイチンーβｇａ　］） の接合におけるβｇａｌのアミノ酸残基の性質に無関係に起こり、これによって 選択的に異なる残基をそうでなければ同一のβｇａｌタンパク質のアミノ末端に おいて露出することができる。そのように設計されたβｇａｌタンパク質は、β ｇａｌのアミノ末端におけるアミノ酸の性質に依存して、２０時間以上から３分 より短い範囲の、顕著に異なる生体内の半減期を示した。こうして、アミノ酸は 、そのアミノ末端に存在するとき、βｇａｌにそれらが与える半減期に従って配 列することができる。例えば、アミノ酸、メチオニン、セリン、アラニン、スレ オニン、バリン、グリシンおよびシスティンは２０時間より長い半減期を与える 。フェニルアラニン、ロイシン、アスパルギンおよびリジンは約３分の半減期を 与える。（アミノ酸の完全なリストおよび対応する半減期について下表１参照） 。

原核細胞および真核生物の両者からの長い半減期の非画分化細胞内タンパク質に おいて、現在知られているアミノ末端残基は、事実上もっばら、Ｎ−末端ルール によって正確に予測されるように、アミノ酸の安定化クラスに属する。この結果 は、一般に細胞内タンパク質の選択的分解におけるＮ−末端ルールを強く説明す る。

適当なアミノ末端アミノ酸は、非両分化細胞内タンパク質の代謝的安定性に必須 な（しかし、必ずしも十分ではない）要件であるように思われる。こうして、タ ンパク質が細胞内で比較的安定であるためには、安定化アミノ酸はアミノ末端に 存在すべきである。タンパク質のアミノ末端における脱安走化残基の存在は、頻 繁であるが、その生体内の代謝的膜安定化のために、常に十分であるということ はない。このような脱安の欠如、例えば、タンパク質のアミノ末端領域における セグメントの移動性の欠如を示す。少なくともある場合におけるアミノ末端にお ける安定化アミノ酸の存在（例えば、β−ｇａｌについて観察されるような）は 、安定性をタンパク質に与える。しかしながら、アミノ末端における安定化アミ ノ酸は、長い半減期を常に与えるというわけではない。なぜなら、他の分解的通 路はタンパク質の究極の寿命の決定における含まれ得るからである。例えば、内 部のタンパク質分解の切断（タンパク質の末端領域の外側の切断）は、切断の得 られる生成物のアミノ末端において脱安定化アミノ酸を露出させることができ、 次いでこれはＮ−末端ルールの通路を経て急速に分解する。安定化アミノ酸を使 用するための適当な環境は、実験的に確証することができる。

Ｎ−末端ルールは生体内の選択的タンパク質分解の他の面を包含する、より複雑 な「半減期のルール」の唯一の成分（中央のものにかかわらず）であることがで きるが、Ｎ−末端ルールの通路によって天然の修飾されないタンパク質より分解 に対して多少抵抗性であるタンパク質を生成するために、Ｎ−末端ルールはタン パク質構造を設計または変化させるための合理的な実施可能なアプローチを提供 する。タンパク質は、タンパク質または遺伝子のレベルで設計または修飾して、 安定化または脱安定化のクラスの所望のアミノ酸をそれらのアミノ末端において 提供する。

タンパク質の半減期を調節する能力は、タンパク質の細胞内の活性の変調を可能 とする。

その代謝的安定性を増加または減少するためにタンパク質を修飾する直接のアプ ローチは、タンパク質のアミノ末端をタンパク質レベルで直接操作することであ る。所望のアミノ末端アミノ酸を提供するために、問題のタンパク質のアミノ末 端は、例えば、安定化または脱安定化のクラスのアミノ酸は、適当な化学を使用 して、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端に付加することによって化学 的に変更することができる。こうして、例えば、不安定なタンパク質は、安定化 アミノ酸残基（例えば、メチオニン、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、 グリシンまたはシスティン）をタンパク質のアミノ末端に付加することによって 、より安定性とすることができる。逆に、安定なタンパク質は脱安定化アミノ酸 をアミノ末端に付加することによって脱安定化することができる。

タンパク質のアミノ末端を修飾する１つの明確な方法は、タンパク質のアミノ末 端への単一のアミノ酸の翻訳後の付加を触媒する、特異的酵素、アミノ酸−タン パク質のりガーゼを使用することである。同一のタイプの非遺伝子的変更のため の他の方法は、当業者によって容易に確認することができる。

あるタンパク質において、アミノ末端の末端はタンパク質のコンホメーシヨン（ すなわち、その第三または第４構造）の結果として観察される。これらの場合に おいて、アミノ末端のより広範な変更はタンパク質をＮ−末端ルールの通路に付 すために必要なことがある。例えば、接近不可能なアミノ末端のために、単一の アミノ末端残基の簡単な付加または置換は不十分である場合、いくつかのアミノ 酸（リジン、基質のタンパク質へのウビクイチンの接合の部位、を包含する）は 、初期のアミノ末端に付加して、操作したアミノ末端の接近可能性および／また はセグメントの移動性を増加することができる。

タンパク質の修飾または設計は、また、遺伝子レベルで達成することができる。

分離したまたは合成した遺伝子の５′末端への適当なコドンの付加または置換の ための部位特異的突然変異発生の普通の技術を使用して、エンコードしたタンパ ク質に所望のアミノ末端構造を提供することができる。例えば、発現されたタン パク質はそのアミノ末端に所望のアミノ酸を有するので、安定化アミノ酸のため に適当なコドンを、タンパク質をエンコードする配列のアミノ末端に挿入するか 、あるいは構成ことができる。

同時に、発現されたタンパク質は翻訳後細胞内でしばしば自然に修飾される。こ れはアミノ末端の修飾を包含することができる。例えば、アミノ末端は、それか らの１つまたは数個のアミノ酸を切断するアミノペプチダーゼによって、作用さ せることができる。アミノ酸は、また、翻訳後の処理によってアミノ末端に付加 することができる。本発明は、アミノ末端のタンパク質の処理のなお明確にされ ないルールを「バイパス」して、成熟した処理されたタンパク質種のアミノ末端 において所望のアミノ末端残基を正確にかつ特異的に露出する方法を提供する。

問題のタンパク質のアミノ末端の究極の構造へのこのような翻訳後の事象の衝撃 を最小にするために、アミノ末端に融合した「マスキング」タンパク質配列が問 題のタンパク質のアミノ末端（所望の安定化または脱安定化の構造を有するよう に設計した）より先行する、特異的融合タンパク質を設計することができる。問 題のマスキングタンパク質のアミノ末端へ融合したタンパク質配列が２つの間の 接合における特異的切断に感受性であるように、融合タンパク質を設計する。こ うして、タンパク質配列を除去すると、問題のタンパク質のアミノ末端はアンマ スキングされ、こうして、解放された半減期は前置てアミノ末端によって支配さ れる。融合タンパク質は、例えば、宿主細胞のエンドヌクレアーゼによって生体 能力を欠く）からの分離後、切断できる生体外系における特異的切断のため、設 計することができる。

ウビクイチンは問題のタンパク質と融合したタンパク質の構成のだめの、広く有 用な融合相手である：ウビクイチンが融合されているタンパク質への依存性をほ とんどまたは全くもたない、細胞質真核生物プロテアーゼによって、人工的ウビ クイチンータンパク質融合体を正確に切断することができるという発見は、生体 内まＩ；は生体外の両者のタンパク質操作方法において応用することができ、そ して本発明の主要な面である。例えば、ウビクイチンータンパク質融合方法を使 用して、人工的手段によって生成されたタンパク質において、真性のアミノ末端 を人工的に発生させることができる。こうして、天然の真核生物または原核生物 のタンパク質のアミン末端の特性は、原核生物の宿主において生成されたウビク イチンータンパク質融合体の生体外切断によって発生させることができる。

ウビクイチンーβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を生成するための特別の方 法を、下において詳述する。他のタンパク質をエンコードする遺伝子を、この方 法において１−ａｃＺ（β−ｇａｌ遺伝子）の代わりに使用することができる。

一般に、ウビクイチン融合タンパク質はキメラの遺伝子構成体によって発現され 、前記遺伝子構成体は、５′から３′への向きにおいて、問題のタンパク質をエ ンコードする遺伝子に結合したウビクイチン遺伝子からなる。問題のタンパク質 のアミン末端アミノ酸のためのコドンは、ウビクイチン遺伝子の３′末端にすぐ に隣接して位置する。融合した遺伝子生成物は、ウビクイチンと問題のタンパク 質との間の接合において生体内または生体外で内部タンパク質分解的に切断して （本発明において同定した純粋なまたは部分的に精製されたウビクイチンー特異 的プロテアーゼを使用して）、そのアミノ末端に所望のアミノ酸を有する問題の タンパク質を発生させることができる。タンパク質のアミノ末端を特異的に操作 する記載する能力について、ある数の用途が存在する。１つのこのような用途は 、解放されたタンパク質の細胞内の半減期がＮ−末端ルールの原理によって支配 されるという事実によって確立される。ここに記載するタンパク質のアミノ末端 を操作するための特定の方法の他の用途は、問題のタンパク質の所望の機能的性 質の調節から、その抗原性の修飾、および再び、当業者によって容易に確証する ことができる他の用途の範囲である。

問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基を発生させるこの方 法は、２つの新規は成分を包含するニ一方、ウビクイチンータンパク質融合体の 使用、および他方、同定されたウビクイチン特異的処理プロテアーゼ。そして、 この研究において、それらの顕著な基質の要件が発見された。ウビクイチン特異 的プロテアーゼの初期の同定は生体内でなされたが、この酵素は、また、生体外 （抽出液中）で比較的安定であり、そして当業者に知られた技術によって等質性 に容易に精製することができる。さらに、ウビクイチン特異的飽理プロテアーゼ の基質の特異性は、進化において保存され、酵母菌および動物において同一であ る。この酵素は、粗製の抽出物から、当業者に知られた方法のなかでも、ホスホ セルロース、ＤＥＡＥセルロースおよびＳＨセフノアースの順次のクロマトグラ フィーによって精製することができる。あるいは、このプロテアーゼのだめの遺 伝子は当業者によってクローニングすることができる。クローニングされたプロ テアーゼ遺伝子は生体内で使用することができるか、あるいは遺伝子は適当な宿 主中で過度に発現することができ、過度に発現されたウビクイチン特異的プロテ アーゼを精製し、そして同一または同様な目的に生体外で使用するととができる 。ここににおけるこの酵素の発見およびその基質特異性の詳細な特性は、この酵 素の生体外および生体内の使用を提供する。

問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基の発生を可能とする ウビクイチンータンパク質融合体の使用は、生成体の細胞からのこのようなタン パク質の精製を促進するために拡張することができる。前述のウビクイチンータ ンパク質融合体に結合した、便利なマーカータンパク質、例えば、ストレプトア ビジン、をエンコードする遺伝子は容易に構成することができる。得られる（マ ーカータンパク質）−ウビクイチンータンパク質融合体は、生成体細胞から、マ ーカータンパク質の前以て選択した性質、例えば、ビオチンカラムの親和クロマ トグラフィーによって分離可能であるストレプトアビジンの既知能力を使用する ことによって分離することができる。こうして、精製された（マーカータンパク 質）−ウビクイチンータンパク質融合体は、次いで、本発明において記載するウ ビクイチン特異的プロテアーゼによって特異的に切断して最終生成物、そのアミ ノ末端に所望のアミノ酸残基を有する問題のタンパク質、を発生することができ る。

例えば、この分野において現在標準の部位特異的突然変異発生技術よる、所望の アミノ酸のアミノ末端アミノ酸のコドン。問題のタンパク質をエンコードする遺 伝子が合成遺伝子である場合、適当な５′コドンを合成方法の間に構成すること ができる。あるいは、特異的コドンのためのヌクレオチドは遺伝子の５″　（ア ミノ末端のエンコーディングド）末端に適当なりＮＡ配列結合することによって 、分離または合成された遺伝子に付加することができる。

ウビクイチン特異的プロテアーゼによって切断されうるウビクイチン用融合相手 は、また、使用することができる。さらに、問題のタンパク質のアミノ末端をマ スキングするためのウビクイチン以外の融合相手を使用することができる。適当 な場合において、融合タンパク質は、十分に狭い特異性を有する制限エンドヌク レアーゼのためのタンパク質分解切断部位を含有するように設計し、こうして唯 一の標的部位が融合タンパク質において切断されるようにすることができる。こ のようなプロテアーゼの極めて重要な性質は、切断部位のカルボキシ末端部位に りんせつするアミノ酸残基について十分に緩和された要件でなくてはならない。

商業的に入手可能なプロテアーゼ、補体因子Ｘ、、はこれらの性質を示し、こう してそれらのアミノ末端の究極的位置において前以て決定したアミノ酸残基をも つタンパク質を直接発生させることができる［Ｋ、ノグチおよびＨ，Ｃ，トゲー ソン（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０９：８１０　 （１９８４）］、エンドプロテアーゼのための認識部位を、マスキングタンパク 質の配列と問題のタンパク質のアミノ末端をエンコードする３″領域との間の接 合中に操作することが生存が短いタンパク質を操作する異なる明確な方法は、本 発明において、効率よく脱つビクイチンできないウビクイチンータンパク質融合 体、例えば、タビクイチン−Ｐｒｏ−β−ガラクトシダーゼ融合体（表１）が代 謝的に不安定であるという発見によって提供される。こうして、アミノ末端ウビ クイチン部分をタンパク質に、その除去が不可能であるか、あるいは非効率的に なされるような方法で、取り付けることによって、Ｎ−末端ルールの要件に従っ てタンパク質の所望のアミノ末端を発生される方法と定性的に区別される、明確 な技術によって、タンパク質を脱安定化することができる。ウビクイチンータン パク質融合体の効率よく脱つビクイチンの防止は、いくつかの方法において、例 えば、表１に示すようなウビクイチンータンパク質の接合においてプロリン残基 を使用することによって、あるいはウビクイチン部分がもはやウビクイチン特異 的処理プロテアーゼによって認識されないが、なお分解的通路の残部によって認 識されうるような方法で、ウビクイチンのアミノ酸配列をそのカルボキシル末端 近くで変化させることによって、達成することができる。ウビクイチンータンパ ク質融合体の脱つビクイチン速度を減少するこれらおよび他の方法は、当業者に よって容易に確証できる。

本発明の方法は、なかでも、タンパク質の半減期を細胞内で調節するために使用 できる。この可能性が使用である多くの場合が存在する。例えば、遺伝子を細胞 中にその中の発現のために導入するとき、発現された生成物は特定の要求に依存 して長い半減期または短い半減期について設計することができる。

一般に、短い半減期をもつ脱つビクイチンしたタンパク質は、タンパク質の細胞 内レベルの調節をいっそうよく受けることができる。タンパク質の細胞内レベル および活性を微細に調節する能力は、治療または生体外細胞培養物を使用する研 究において有用であることがある。例えば、遺伝子の治療において、遺伝子を細 胞中に導入して、遺伝子の欠乏または異常を補正することができる。遺伝子は誘 発性プロモーターの制御下に挿入することができる。誘導は遺伝子生成物の増大 した発現および結局、細胞内のより高いレベルを生ずる。遺伝子を不安定なタン パク質をエンコードするように設計する場合、欠現されたタンパク質の細胞内濃 度は、細胞内で持続しないので、その合成速度の後の減少に対していっそう急速 に応答的である。このようにして、挿入された遺伝子によってエンコードされた タンパク質の細胞内レベルおよび／または活性は、いっそう微細に調節調節する ことができる。

本発明の方法は、また、マーカーに関する表現型に必要な時間を短縮することに よって、選択可能なマーカーの使用を拡張するために使用できる。この目的に対 して、マーカー遺伝子によってエンコードされる生成物は、Ｎ−末端ルールに従 いそのアミノ末端を変更することによって脱安定化することができる。このよう にして、ネガティブ表現型についての選択は促進することができる。なぜなら、 マーカーをエンコードする機能が消滅した後、マーカーの生成物はより急速に絶 滅するであろうからである。１つの例はチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子である 。ｔｋ遺伝子は、アミン末端において適当な脱安定化アミノ酸を導入することに よって、安定性が低い酵素をエンコードするように操作することができる。ｔｋ −表現型を生ずる遺伝子の突然変異は、残留するｔｋがより急速に分解するので 、細胞によっていっそう急速に現れるであろう。これは、ｔｋ−型への形質転換 前に合成されたｔｋを「希釈」するためにより多くの時間が要求される場合、増 殖の遅い細胞においてことに有用である。

Ｎ−末端ルールに基づくタンパク質の修飾の原理は、また、細胞毒素の設計にお いて使用できる。タンパク質の細胞毒素はＮ−末端ルールの通路によって分解可 能な不安定なタンパク質として設計することができるので、それらの毒性作用が 標的細胞上で発揮された後、それらは持続しない、＠素の寿命を減少すると、非 標的細胞を殺す可能性は減少する。

分解のＮ−末端ルールの通路の発見は、Ｎ−末端ルールの通路の必須成分をエン コードする遺伝子中に突然変異体を有する突然変異体細胞の発生を可能とする。

例えば、そうでなければ生存が短いタンパク質を効率よく分解することが永久に あるいは条件的に不可能である、細胞を生成することができる。これらの細胞は 、通常細胞内で不安定である所望のタンパク質を生成するために使用できる。

本発明をＮ−末端ルールの解釈の次の詳細な説明によってさらに例示する。

ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ（第３Ａ図）をエンコードする、ｐＵＢ２３を有するＳ 、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、後述するように、　［３Ｓｓ］メチオニンで標 識し、次いで抽出調製し、βｇａｌを免疫沈澱し、そして電気泳動する。湿った ポリアクリルアミドゲルをオートラジオグラフィーにかけ、βｇａｌの帯びを切 除し、そして電気溶離したβｇａｌをエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解による６サイ クルの放射線化学の配列決定にかけた。配列決定はバーバード大学の微生物化学 設備（Ｍｉｃｒ。

Ｃｈｅｍ　Ｆａｃｉｌｔｙ）においてＷ、レン（Ｌｉｎｅ）によって実施された 。

部位特異的突然変異誘発 ｐＵＢ２３（ｔ＄１図）を、順次に、Ａｃｃｌ、ｐｏｌｌのクレノー断片、およ びＢａｍＨＩで処理した。Ｘｈｏ１部位を含をする断片を精製し、そしてＭ１３ ｍｐ９ファージＤＮＡの充填したＨａｅ１１１部位およびＢＡＭＨ１部位の間に 挿入した（Ｊ、メッシングおよびＪ、ビエラ、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９．２６３ 　（１９８２）’）、部位特異的突然変異誘発［Ｍ、スミス、アニュアル・レウ ビュー・イン・ジェネティックス（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）、１９． ４２３　（１９８５）］　を、クレイマー、Ｗ、ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅに、βｇａｌのＭｅｔコドンの５′側にｌＯ塩基および３ ′側に１２塩基を含有する、合成２５残基のオリゴデオキシリボヌクレオチドを 使用して実施した。すべての４塩基を合成の間にもとのＭｅｔコドン位置におい て発生させた。−次のファージのプラークは、コドンの変化の領域にまたがる１ ２残基のオリゴヌクレオチドグローブを使用して交雑し［ウッド、Ｎ、１．　ら 、ＰＮＡＳｌ　８２％　１５８５　（１９８５）］　、そしてもとの配列に交雑 することによってスクリーニングした。期待したプラークのインサートを含有す る非交雑プラークは、連鎖停止方法によって配列決定した。［サンガー、Ｆ、ら 、ＰＮＡＳ、７上、５４６３（１９７７）］。所望の構成体をｐＵＢ２３バック グラウン中に移すために、突然変異ファージの複製形態のＤＮＡをＸｈｏＩおよ びＢａｍＨＩで消化し、そしてプラスミドｐＬＧＳ５−ＡＴＧの同一消化物に加 えた［参照、第１図およびり、グアレンチ、メソッズ・イン・エンジモロジー（ Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、−口Ｕ−１１８１（１９８３）］。

結合した混合物を使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１を形質転換した。［Ｍ 、Ｊ、カサダバンおよびＳ、Ｎ、コラヘン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、±３８，１７９　（１９８０）ｉ。

問題のプラスミドを含有するコロニー（ここでβｇａｌのオープンリーディング フレームが修復されている）は、Ｘ−ｇａ）平板上でそれらの青色によって認識 された。

パルス−チェース実験 問題のプラスミドで形質転換した［Ｆ、ジャーマンら、メソッズ・イン侮イース トφジェ不ティックス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＣｙｅｎｅｔｉｃｓ ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ニューヨーク、 １９８１］菌株ＢＷＧ−９８−１（ＭＡＴ　ｈｉｓ　ｕｒａ３　ａｄｅ６）のＳ 、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｍ胞を、２％のガラクトース、アミノ酸を含まない０． ６７％の酵母菌窒素塩基（ＤＩＦＣＯ）　、アデニン（１０μｇ／ｍ４）および メチオニンを含むアミノ酸の培地中で、３０℃においてほぼ５のＡ、。。に増殖 させた。典型的には、５ｍＱの培養物をミリポア（Ｍｉ　ｌ　］　ｉ　ｐｏ　ｒ ｅ）マイクロタイター濾過プレートのウェルを通して濾過することによって収穫 し、フィルター上でメチオニンを欠く同一培地で数回洗浄し、そして０．３ｍＱ の１％のガラクトース、５０ミリモルのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中 に最懸濁させた。次いで　［３Ｓｓ］　メチオニン（５０〜１００μＣ４）を３ ０℃において５分間加えた：細胞を濾過によって集め、そして（Ｌ　５ｍｇ／ｍ （ｌのシクロヘキシルイミドを含有する増殖培地の０．４ｍｒｌ上に最懸濁させ た。試料（０，１ｍｆｆ）を示した時間に抜き出し、モしてＯ−４ｍＱのガラス に加えてビーズレウペプチン、ペプスタチンＡ１アンチペイン、アプロチニンお よびキモスタチンを含有する０−５ｍＱの冷緩衝液Ａ［シグマ（Ｓｉｇｍａ）コ に添加しｔ；。

その直後、細胞を４℃においてほぼ３分間渦形成することによって破壊した；抽 出物を１２，０００ｇで３分間遠心し、そして上澄み液中の酸不溶性３１５の放 射能を決定した。等量の合計の酸不溶性ｓ′Ｓを含有する上澄み液のアリコート を、ｇａｌに対するモノクローナル抗体で免疫沈澱するために処理した。モル過 剰量（少なくとも１０倍）の抗体を含有する腹水を各アリコートに添加し、引き 統いて４℃において２時間インキュベーションした；次いで、プロティンＡ−セ ファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）［７ｙ−マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］を 添加、懸濁液を揺動しながら４℃において３０分間インキュベージＨンし、モし て１２．０００ｇで１分間遠心した。プロティンＡ−セファローズのペレットを ０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する緩衝剤Ａ（下を参照） 中で３回洗浄し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有電気泳動試料緩衝液中に再 懸濁させ［ｔＪ、に、ラエルミ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７，６８０ 　（１９７０）３．１００℃に３分間加熱し、そして１２．０００ｇで１分間遠 心した。上澄み液の等しいアリコートを７％の不連続のポリアクリルアミド−５ ＤＳゲル（１５Ｘ１５Ｘｏ。

１５ｃｍ）中で電気泳動させ、次いでフルオログラフィーにかけた。いくつかの 実験において、上のプロトコルを使用せず、抽出物はＳＤＳの存在下に直接細胞 を沸騰させることによって調製し、本質的に同一の結果を得た。

Ｅ、ｃｏｌｉ中で生成したｕｂ−βｇａｌタンパク質の分析プラスミドｐＵＢ２ ３　（第１図および第３図）をＤＳ４１０、Ｅ。

ｃｏｌｉ菌株を生成するミニ細胞、中に導入した。［Ｎ、ストツカーら、転写お よび翻訳：寅際的アプローチ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄ　Ｔｒａｎｓ ｌａｔｉｏｎ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ＡｐｐｒｏａｃｈＬ　Ｂ、Ｄ、　ハー ンスおよびＳ、Ｊ、ヒギンス編、ｒＲＬプレス、オフスフオード、１９８４ｐ、 １５３］。上のＮ、ストツカーらの文献に記載されているように、ミニ細胞を調 製し、そして［３Ｓｓｌメチオニン［６００Ｃｉ／ミリモル、アマ−ジャム（Ａ ｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　］で３６℃において６０分間標識した。

標識したミニ細胞を遠心し、２％のＳＤＳ、１０ミリモルのＤＴＴ。

１０４９モルのＮａ−ＨＥＰＥＳ　ＣｐＨ７−５）中に再懸濁させ、そして１０ ０℃で３分間加熱した。１２．０００ｇにおいて１分間遠心した後、上澄み液を ２０倍に緩衝液Ａ（１％のトリトンＸ−１００，０，１モルのＮａＣ１１５ミリ モルのＮａ−ＥＤＴＡ、５０ミリモルのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５）で希釈 し、次いでフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＦＭＳＦ）およびＮ−エチ ルマレイミドを、それぞれ、０．５ミリモルおよびｌＯミリモルに添加した。４ ℃において４時間後、試料を０．５ミリモルのＰＭＳＦを含有する緩衝液Ａに対 して４℃において一夜透析し、そして免疫沈澱のために処理した（上の記載よう に）。

酵母菌中で生成したｕｂ−βｇａｌタンパク質の分析問題のプラスミドを有する Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を８００ｍＱのウラシル欠乏培地中で増殖させ、 次いで収穫し、そしてレウペプチン、ペプスタチンＡ１アンチペイン、アプロチ ニンおよびクミスタチン（各々３μｇ／ｍＱ）を含有する緩衝液Ａ中でガラスピ ーズで破壊した。抽出物を１２．０００ｇで３分間遠心した。飽和した硫酸アン モニウムを上澄み液に５７％の最終濃度に添加した。４℃において一夜経過した 後、沈澱したタンパク質を２３．０００ｇで３０分間遠心することによフて集め た。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液Ａ中に再溶解した。１２． ０００ｇで３分間遠心後、腹水からのＩｇＧ分画（ｇａｌに対するモノクローナ ル抗体を含有する）をＡｆ　ｆ　ｉ　−Ｇｅ　１［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ）］に架橋することによって調製した親和カラムに試料を通過させた。架橋の ために使用したＩｇＧ分画は、プロティンＡ−セファローズの親和クロマトグラ フィーによって腹水かたタンパク質を０．２５モルのグリシン−ＭＣＩ　（ｐＨ ２，６）で溶離した。溶離液を直ちに１モルのＮａ−ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ８，５ ）でｐＨ７，５に調節し、その後ＳＤＳ中でＯ，１％にした。試料をセントリコ ン（Ｃａｎｔｒｉｃｏｎ）３０　［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）］中の限外濾過に よって濃縮し、そして７％の不連続のポリアクリルアミド−３ＤＳゲル中で電気 泳動させｔ：、［Ｕ、に、ラエルミ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏ ｎ）、２２７，６８０　（１９７０）］、　二）ロセルロースへのタンパク質の 電気プロッティング、およびウビクイチンに対するペプチド仲介抗体を使用する イムノブロッティング分析を、ｐ、ｓ。

スウェルドロウ、Ｄ、フィンレイおよびＡ、パルシャウスキー、アナリティカル ・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５６．２４７　 （１９８δ）ｌ；記載されているように実施した。Ａ、ハース（ミルウォーキー のメディカル・スクールの大学）から入手したウビクイチンに対する異なる抗体 を使用して、同一の結果を得た。

Ｂ２、ｐＢＲ３２２に基づくゲノムＤＮＡクローン［Ｅ、オズヵイナク、ら、ネ イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３上（，６６３（１９８４）は、フランキング領域 （ジグザグの線）と−緒に酵母菌ウビクィチン解読配列の６つの反復（開いたボ ックス）を含有する。＄）’ＵＢ２を、線図に示すように、最初のウビクィチン 反復から下流にＢａｍＨ１部位の６塩基を配置することによって修飾した。これ により、単一のウビクィチン反復と発現ベクターｐＬＧＳＤ５−ＡＴＧん；ゾー ンゲノムとの間フレーム内融合するの構成（ヌクレオチドの配列決定によって確 証された）が可能であった［Ｇ２と呼ばれる、Ｌ、グアレンチ、メソッズ・イン ・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１立上、１８１（１ ９８３）］。用語「２μｍ」は、２μｍの円と呼ぶ酵母菌プラスミドの複製起源 およびフランキング配列を含有するｐＬＧＳＤ−ＡＴＧの領域を意味する（上の し、グアレンチの文献を参照）。第３Ｂ図は、ウビクイチンーβｇａｌ接合の付 近における融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。

第２図は、ｇａｌの生体内で半減期がそのアミノ末端残基の関数であ“ることを 示す。（レーンａ）ｐＵＢ２３、最初のｕｂ−ＩＬＬＣＺ融合、を有するＥ、ｃ ｏｌｉ菌株から分離したミニ細胞（第１図および第３図）を［３８Ｓ］メチオニ ンで３６℃で６０分間標識し、次いで記載するようにβｇａｌを分析した。ｇａ ｌの免疫沈澱前に、標識したミニ細胞ＳＤＳ抽出物を標識しない酵母菌ＳＤＳ抽 出物と一緒にしたとき、同一の結果が得られた。（レーンｂ）ｕｂ−Ｍｅｔ−β ｇａｌ（第３Ｂ図）をエンフードするｐＵＢ２３を有するＳ、ｃｅ　ｒｅｖ　ｉ 　ｓ’ｉ　ａｅ細胞（第１図）を　［ＳＩｓ］メチオニンで３０℃において５分 間標識し、次いでβｇａｌを分析した。１〜３０分の［１！ｓ］　メチオニン標 識期間の長さ、およびプロテアーゼ阻害剤の存在下の細胞の機械的破壊によって 、あるいはＳＤＳ含有緩衝液中細胞を直接沸騰することによって生成された酵母 菌抽出物を使用して、同一の結果が得られた。（レーンＣ）レーンａと同一であ るが、ｇａｌをエンコードする対照プラスミドｐＬＧＳＤ５（Ｇｌと呼ぶ、Ｌ、 グアレンチの上の文献）Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を使用した。（レーンｄ　Ａ−ｇ）　 ｕ　ｂ−Ｍｅ　ｔ−βｇａｌ（第３Ａ図）をエンコードするｐＵＢ２３を有する Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓ　ｉａｅ細胞（第１図）を３０°Ｃにおいて５分間［３Ｓｓ ｌ　メチオニンで標識し、次いでシクロヘキシイミドの存在下に１０．３（ｌよ び６ｅ分間チェースしくレーンえ〜ｇ）、抽出し、免疫沈澱し、そしてβｇａｌ を分析した。（レーンｈ〜ｊ）レーンｄ−ｆと同一であるが、ｕｂ　ｌ１ｅ−β ｇａｌを使用した（参照、第３Ａ図）。（レーンｋ　−ｍ　）レーンｈ−ｊと同 一であるが、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌを使用した。（レーンｎ−ｑ）レーンｄ− ｇと同一であるが、ｕｂ−Ｌｅｕ−βｇａｌを使用した。（レーンｒ　−ｕ　） レーンｄ−ｇと同一であるが、ｕｂ−Ａｒｇ−βｇａｌを使用した。表示：ｏｒ ｉ；分離ゲルの由来；ｕｂ、ウビクィチン；βｇａｌ、特定したアミノ末端残基 を含有するβｇａｌタンパク質の電気泳動の帯び：この用語において、ｕｂ−Ｍ ｅｔ−βｇａｌのＭｅｔ−βｇａ１部分はβｇａｌと表示する。矢印はβｇａｌ の代謝的に安定な、約９０ｋＤの消化生成物を示し、これはある比率の生存が短 いβｇａ１代謝的に部分、例えば、Ｌｅｕ−βｇａｌおよびＡｒｇ−βｇａｌの 生体内で内部タンパク質分解的切断の結果として明らかに形成する（レーンｎ　 −ｕ　）。

第３図は、ウビクィチンーｇａｌ接合におけるｇａｌの変化するアミノ酸残基を 示す。（Ａ）　ｕ　ｂ−Ｍｅ　を−βｇａｌをエンコードする、最初のプラスミ ド、ｐＵＢ２３　（第１図）を、上に記載するように、突然変異誘発して、ｕｂ −βｇａｌ接合におけるもとのＭｅｔコドンＡＴＧをＭｅｔ以外の１９アミノ酸 を特定するコドンに転化した。（第３図中に示す突然変異誘発のもとのラウンド は１９のうちから１５の可能な置換を生成した。残りの４つの置換は後に生成し た（参照、表１））。矢印はｓ　ｕｂ−Ｐｒｏ−ｇａｌを除外した融合タンパク 質のすべてを用いて起こる、発生期の融合タンパク質における脱つビクイチン生 体内で切断の部位を示す（参照、テキスト）。示した構成体のすべては、第２ｇ ａｔ残基としてＨｉｓをエンコードする。さらに、構成体のあるもの（Ｕｂ−Ｍ ｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−βｇａｌ、ｕｂ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−βｇａｌ、 およびｕｂ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−βｇａ１１最後のものは挿入突 然変異によって生成した、参照、表２）において、ＨｉｓあるいはＧｉｎはｕｂ −βｇａｌ接合においてＭｅｔより後に存在し、対応するｇａｌタンパク質の代 謝的安定性について区別不可能な結果を与えた。（Ｂ）　ｕ　ｂ　−Ｍｅ　を− βｇａｌのアミノ酸配列（単一の文字の略号）、初期の融合タンパク質（第１図 ）、ｕｂ−βｇａｌ接合付近。単一の文字のアミノ酸の略号：Ａ、Ａｌａ；Ｃ％ Ｃｙｓ；Ｄ。

Ａｓｐ；Ｅ％Ｇｌｕ　；Ｆ、Ｐｈｅ　；Ｇ％　Ｇｌｙ；Ｈｓ　Ｈｉｓ　；　Ｌ　 Ｉ　ｌｅ；Ｋｓ　Ｌｙｓ；Ｌｔ　Ｌｅｕ；Ｍ、Ｍｅｔ；Ｎ、Ａｓｎ；Ｐ％Ｐｒｏ ；Ｑ、Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ％Ｓｅｒ；ＴＳＴｈｒ；Ｖ、Ｖａｌ；Ｗ。

Ｔｒｐ；Ｙ、Ｔｙｒａ 第４図は、脱つビクイチンしない場合、ウビクィチンーｇａｌが生存が短いこと を示す。（レーンａ−ｇ）Ｘが各レーンの上部に示す残基である、ｕｂ−Ｘ−β ｇａｌ融合タンパク質をエンコードするプラスミドを有するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ細胞を、３０℃において５分間標識し、抽出し、免疫沈澱させ、モしてβ ｇａｌを分析した。これらのレーンについてのフルオログラフィーの露出は、第 ２図における同様なパターンをもつものより数倍長く、生存が短いβｇａｌタン パク質の多数のウビクイチン化を明らかにした。（レーンｈ、ｉ）パルス−チェ ース露出における多数のウビクイチン化Ｌｅｕ−βｇａｌタンパク質の「ラダー （ｌａｄｄｅｒ）Ｊを明らかにするために、第２図においてレーンｎ１０のフル オログラフィーの過度の露出（それぞれ、０および１０分のチェース）。（レー ンｊ）レーンａ　−ｇと同一であるが、ｕｂ　Ｐｒｏ−βｇａｌを使用した。（ レーンｋ）レーンｊと同一であるが、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌを使用しｔ；。（ レーンｌ）レーンｊと同一である。（レーンｍ”ｐ）ｕｂ　Ｐｒｏ−βｇａｌを エンコードするプラスミドを有するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を３０℃にお いて５分間［３６ｓ］　メチオニンで標識しくレーンｍ）、次いでシクロヘキシ イミドの存在下に１Ｏ１３０および６０分間チェースした（レーンｎ−ｐ）。レ ーンｐの右への上の小さい矢印は、ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌを示し、その小さい 比率は１時間のチェース後なお存在する。下の小さい矢印は、チェースの間ゆっ くり蓄積し、そして代謝的に安定である、明らかに脱つビクイチンされたＰｒｏ −１１ｇａＩを示す。レーンｍの左への点は、使用した抗体によっである実験に おいて沈澱した、内因性酵母菌タンパク質を示す。正方形のカッコは多数のウビ クイチン化βｇａ１種を意味する（参照、第５図）。他の表示は第２図における 通りである。

第５図は、ウビクィチンを含有する「ラダーＪｇｅ１種を示す、、（レーンａ） ｕｂ−Ｇｉｎ〜βｇａｌをエンコードするプラスミドを有するＳ、ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ細胞を、増殖し、そして破壊し、モしてβｇａｌに対する固定化した抗 体を有するカラムの親和クロマトグラフィーによって、抽出物をβｇａｌタンパ ク質の分離のために処理した。このようにして得られたβｇａｌタンパク質をポ リアクリルアミド−５ＤＳゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、そ してウビクィチンに対する抗体でグローピングした。（レーンｂ）レーンａと同 一であるが、ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌを使用した。（レーンｃ）ｂと同一である が、より長いオートラジオグラフィーのＷ出。（レーンｃ）ｕｂ−ＬｅＵ−βｇ ａｌをエンコードするプラスミドを有するＳ、ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ細胞を［１ ！ｓｌメチオニンで５分間標識し、次いで抽出し、免疫沈澱し、モしてβｇａｌ の電気泳動させた（第４図、レーンｆと同一の試料）。正方形のカッコは、ウビ クィチンに対する抗体で検出された多数のウビクィチン化Ｇ１ｎ−βｇａ１種を 示す。矢印はｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの帯び、レーンｂ６よびＣにおいて見られ る初期の融合タンパク質を示す。矢印の頭は、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌ融合タン パク質から誘導された脱つビクィチンしたβｇａｌ［クーマッシ＝（Ｃｏｏｍａ ｓｓ　ｉ　ｅ）の着色または代謝的に標識っけによるが、ウビクィチンに対する 抗体を使用しないで検出可能である］の帯の位置を示す。

第６図は、原核細胞および真核生物の両者の長Ｘ生きる細胞内タンパク質がそれ らのアミノ末端において安定化アミノ酸残基を有するが、これに対して分泌され たタンパク質が相補的バイアスを示すことを示す。

（Ａ）　ｌｌ！核細胞（７７のタンパク質）および真核生物（１３１のタンパク 質）の両者からのブロッキングされないアミン末端をもつ２０８の長く生きる、 直接に配列決定した、細胞内（非画分化）タンパク質を、Ｎ−末端ルールによっ て定められた、それらのアミノ末端残基の性質に従って、３つの群に分配した。

検査した細胞内タンパク質のすべては、広範に安定化性の残基をそれらのアミノ 末端において有する。パネルＢ〜Ｄにおいて、類似の線図が２４３の分泌された 真核生物のタンパク質（Ｂ）について、３７の免疫グロブリンの軽鎖および重鎮 （Ｃ）についセットである。Ｂ−Ｄにおけるタンパク質について、集めたアミノ 末端は、割り当てが可能であるときはいつでも、分泌する細胞内にない位置する タンパク質の最も処理された形態に相当する。Ａ−Ｄにおけるデータは、１９８ １年以前に入手可能であった完全なタンパク質配列の全体組みから相互に集めた 。同一の結論は、現在のナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデン ションのデータベースを使用して、いっそう詳細なかつ広範な、コンピュータに 助けられるタンパク質のアミノ末端の表作成後に、最近到達されたｅ　Ａ　ｓ　 ｎ　、、Ｃｙ　ｓ　ｓ　Ｈｉｓ　ｂよびＴｒｐのアミノ末端残基残基は、対応す るｇａｌタンパク質の生体内半減期がまだ未知であるので、収集から排除した（ しかしながら、表１の凡例を参照）。同一のタイプの最近の収集中への残基（表 １）の包含は、もとの結論を変化させなかった。アミノ末端Ｐｒｏは、また、収 集がら排除したが、Ｐｒｏは、長く生きる非画分化タンパク質のアミノ末端にお けるＰｒｏの頻繁な存在と一致するβｇａ＋について安定化残基であるように思 われる（表１）。

結果および説明 発生期のウビクイチンーβｇａｌ融合タンパク質の急速な生体自脱ウビクイチン クビクイチン部分のカルボキシル末端のグリシンがイソペプチド結合を経てタン パク質中の内部のりジン残基のＣ−アミノ基へ結合する、枝分かれしたウビクイ チン接合体は、明らかに、真核生物の細胞中の多くのウビクイチン接合体からな る。標的タンパク質のアミノ末端ミーアミノ基へウビクイチンを接合して、線状 のウビクイチン接合体を生成することは、また、化学的に可能である。参照、Ａ 、ヘルフら、ＰＮＡＳＩＪＳＡ、８上ニア０２１　（１９８４）。線状ウビクイ チンータンパク質融合体がクビクイチンのタンパク質のアミノ末端への翻訳後の 酵素的接合Ｉ；よって生体内で実際に合成されるか否かにかかわらず、このよう なタンパク質は、また、適岩なキメラ遺伝子を構成し、そしてそれらを生体内で 発現させることによって生成することができる。Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉのｇａｌへ結合した酵母菌ウビクイチンをエンコードする、１つのこのよう な遺伝子の構成は、第１図にしめされている。

この遺伝子がＥ、ｃｏｌｉ中で発現されるとき、得られるβｇａｌ含有タンパク 質は見掛けの分子質量を有し、これは対照βｇａｌのそれより大きく、はぼ６ｋ Ｄであり、キメラ遺伝子によってエンコードされるタンパク質中のウビクイチン の存在と一致する値である。対照的に、同一遺伝子を酵母菌中で発現するとき、 対応するβｇａｌタンパク質は対照βｇａｌと電気泳動的に区別可能である。こ の結果は　［３Ｓｓ］メチオニン標識期間（１〜３０分）に対して独立である。

さらに、生体内標識したゲル精製βｇａｌのエドヤン分解による、推定のＭｅｔ −βｇａｌ　（半減期、ｔ＋ｚ＊　２０時間）におけるアミノ末端残基の決定（ 第２図、レーンｄ）は、そのアミノ末端における期待するＭｅｔ残基の存在（第 ３Ａ図および表１）を確証した。ウビクィチンが融合タンパク質を切断するとい う独立の証拠は、ウビクィチンの最後のＧｌｙ残基が下に存在した直後に、起こ る。酵母菌において、ウビクィチンは発生期のウビクイチンー融合タンパク質を 効率よく切断して、脱つビクイチンされＩ；βｇａｌを生成すると、われわれは 結論する。［Ｅ−ｃｏｌｉ中の脱つビクイチン反応の不存在は、原核細胞がウビ クィチンおよびウビクィチン特異的酵素の両者を欠くことをしめず他の証拠と一 致する］。

キメラ遺伝子、Ｇｌｙ−Ｍｅｔによってエンコードされるウビクイチンーβ−ｇ ａｌ接合（第１図および第３Ｂ図）は、成熟タビクイチン中に効率よく処理され る、ポリタビクイチン前駆体タンパク質中の隣接する反復の間の接合と同一であ る。こうして、まだ生化学的に特性づけられないが、同一のプロテアーゼは、成 熟ウビクィチンへのポリウビクイチンの転化、および発生期のウビクィチンーβ ｇａｌタンパク質の脱つビクイチンのための原因となるように思われる。そうで ある場合、ウビクイチンーβｇａｌの生体自脱ウビクイチンを阻害する（これに よってβｇａｌへの安定なウビクィチンの結合の代謝的結果の分析を可能とする ）１つの潜在的方法は、ウビクィチンーβｇａｌ接合におけるβｇａｌのＭｅｔ 残基（第３Ｂ図）を他のアミノ酸残基（第３Ａ図）に転化することである。この ようなアプローチの予期されない結果は下に説明する。

βｇａｌの生体内半減期はそのアミノ末端残基の関数である。ウビクィチン接合 におけるｇａｌのもとのＭｅｔ残基を特定するＡＴＧコドン（第３Ｂ図）を、部 位特異的突然変異誘発によって、１９の他のアミノ酸を特定するコドンに転化し た（参照、第３Ａ図および表１）。これらの構成体は、もっばらウビクイチン接 合におけるβｇａｌの第１コドンにおいて異なる（第３Ａ図）。このように設計 された１６プラスミドの各々が酵母菌中に導入された後、生体内でパルス標識さ れた対応するｇａｌタンパク質の分析は、次の結果に導いた（第２図、第４図お よび表１）：１）１つの例外（下を参照）を除いて、発生期のウビクイチン−β ｇａｌの効率よい脱つビクイチンは、ウビクイチンーβｇａｌ接合におけるβｇ 　ａ’　］のアミノ酸残基の性質に無関係に起こる。こうして、もとのウビクイ チンーβｇａｌタンパク質をＧｌｙ−Ｍｅｔ接合において切断する、明らかにウ ビクイチン特異的のプロテアーゼは、一般に、接合におけるβｇａｌの第１残基 の性質に無関係である（第３Ａ図および表１）。

この結果は、事実、生体内で生成されたそうでなければ同一のβｇａｌタンパク 質のアミノ末端において、異なるアミノ酸残基を露出することを可能とする。

２）こうして設計されたβｇａｌタンパク質の生体内の半減期は、βｇａｌのア ミノ末端において露出されたアミノ酸残基の性質に依存して、２０時間以上から ３分より小に変化する（第２図、第４図および表１）。

詳しくは、アミノ末端にＭｅ　ｔ％Ｓｅ　ｒｓ　Ａ　Ｉ　ａｓ　Ｔｈ　ｒｓ　Ｖ ａ　ｌ５ＣｙｓまたはＧｌｙをもつ脱つビクイチンされたβｇａｌタンパク質は 、遺伝子がウビクイチンのそれに融合されていない対照の半減期に類似して、２ ０時間の比較的長い生体内半減期を有する（第２図、レーンｄ〜ｇ１および表１ ）。顕著に対照的に、アミノ末端にＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＬｅｕｌＡｓｐま たはＴｒｐをもつβｇａｌタンパク質は、Ａｒｇ−βｇａｌについてほぼ２分お よびＬｙｓ−βｇａｌ、Ｐｈｅ−βｇａｌ、Ｌｅｕ−βｇａｌ、Ａｓｐ−βｇａ １％Ａｓｎ−βｇａ　１８よびＴｒｐ−βｇａｌについてほぼ３分の間の非常に 短い半減期を有する（第２図、レーンｎ−ｕ　、および表１）　ｏ　Ｇ　１　ｎ ％Ｈｉ　ｓまたはＴｙｒのアミノ末端残基をもつβｇａｌタンパク質の半減期は ほぼ１０分であり（第２図、レーンに−ｍ、および表１）、これに対してアミノ 末端のｌｉｅまたはＧｌｕはβｇａｌにほぼ１０分の半減期を与える（第２図、 レーンｈ　−Ｊ　ｓおよび表１）。パルス−チェースおよび連続的標識技術の両 者を、これらの実験において使用し、そして同様な結果を得た。

個々のアミノ酸の組みを、それらがそのアミノ末端において露出されるときｇａ ｌに与える半減期に関して配列することができる。得られるルール（表１）を「 Ｎ−末端ルール」と呼ぶ。

Ｍｅｔ　１．８０　＋ Ｓｅｔ　１．０８　＋ Ａｌａ　Ｏ，７７＋ Ｔｈｒ　Ｌ、２４　＋　２０時間 Ｇｌｕ　１．７７　＋　３０分 子ｙｒ　２．１３　＋ Ｇｌｎ　１．７５　＋　１０分 １Ｓ Ｐｈｅ　１．９０　＋ Ｌｅｕ　１．５４　＋　３分 子ｒｐ　＋ Ａｓｐ　１．４３　＋ Ｌｙｓ　２．０８　＋ Ａｒｇ　２．３８　＋　２分 Ｐｒｏ　１．２５　−＊　７分 ＊ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの生体内税ウビクィチン速度はきわめて低い。

示すｔ１７．は初期のｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌ融合タ融合タンパ上質である（参 照、第４図、レーンｊ−ｐ）。

表１に対する凡例 Ｎ−末端ルール。酵母菌Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のβｇａ＋タンパク質の生 体内半減期は、パルス−チェース技術（短い半減期のｇａｌについて；下を参照 ）によって、あるいは粗製抽出物中のｇａｌの酵素活性を測定によって決定した 。βｇａ＋の活性を測定するため、ガラクトース含有培地中で増殖する細胞を、 ガラクトースを欠かつ１０％のグルコースを含有する、そうでなければ同一の培 地に移した。３０’０において少なくとも５時間さらに増殖させた後、グルコー スへのシフトの前および後の細胞光たりのβｇａｌ活性の比を、βｇａｌタンパ ク質の各々について決定した。［融合遺伝子のＧＡＬプロモーター推進発現（第 １図および第２図）はグルコース培地中で再び発現させる］。生存が短い（ｔ　 、／−＜　ｌ　Ｂｅ間）βｇａｌタンパク質について、パルス−チェース技術を 同様によく使用された（第２図および第４図）。パルス−チェース実験において ［３１ｓ］　メチオニンで標識されたβｇａｌタンパク質の電気泳動の帯びを第 ２図および第４図のそれらと同様にシンチラント含浸、乾燥ゲルから切り取り、 そして帯び中の１５Ｓを決定した。生存が短いｇａｌの生体内の崩壊は一次の動 力学から誘導し、ここで分解の速度はチェースのより遅い（１時間）時間の期間 において測定するとき低く、より遅い速度はシクロヘキシイミドの時間依存性の 毒性作用あるいは生体内分解過程の固有の特性を反映する。［翻訳の抑制はＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の効率よい短時間のチェースのために必要である。なぜ なら、アミノ酸プールの平衡化の問題はこの有機体中で液胞の存在に関係するか らである］。下に列挙する半減期の値は、チェースの最初の１０分の間に決定し た。いくつかの証拠（参照、第４図および第６図の説明）は、Ｐｒｏが安定化残 基であることを示唆する。列挙したアミノ酸の旋回の半径はＭ、レビット、ジャ ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、上吏 土：　５９　（１９７６）からのも部位特異的突然変異誘発を用いて、「安定化 」アミノ酸（この実験において、Ｍｅｔ残基）を特定するコドンを、ウビクイチ ンーβｇａｌ接合におけるβｇａｌの最初のコドンの前に挿入しｔ；（表２）。

他の安定膜安定化残基（Ｇ］ｎ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の前における安定化残基 （Ｍｅｔ）の挿入は、長く生きる脱つビクイチンされｔ；βｇａｌを必ず生ずる （表２）。さらに、生存が短いばかりでなく、かつまた脱つビクィチンに対して 抵抗性であるウビクイチンーＰｒｏ−βｇａｌ（第４ＥＵ、レーンＪ−ｐ％およ び表１）と対照的に、ウビクイチン−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−βｇａｌは生体内で効率 よく脱つビクイチンされて長く生きるＭｅｔ−Ｐｒｏ−βｇａｌを生成する（表 ２）。これらの結果が示すように、アミノ酸残基の同一性およびそのアミノ末端 の位置（多分遊離ａ−アミノ基の存在）の両者はβｇａｌの半減期へのその作用 について必須である。さらに、これらの結果が支持するように、融合タンパク質 の切断はウビクイチンの最後Ｇ１ｙ残基の直後に起こる（第３Ａ図）。

アミノ酸のアミノ末端の位置は、βｇａｌのその作用について必須である。挿入 突然変異体は本質的に突然変異体の初期の組みについて記載したように得たが、 ただしＭｅｔコドンの背後に挿入された不明瞭のコドンの５′側に１４塩基およ び３２−残基をを含有する、３２−塩基のオリゴヌクレオチド、５’　−ＣＣＣ ＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣ（Ｇ／Ｃ／ＴＩ）（Ｇ／Ｔ）ＣＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＴ ＴＡＧを使用した。カッコ内の塩基は、配列中の位置１６および１７における不 明瞭を意味する。対応するβｇａｌタンパク質の半減期は、表１に対する凡例中 に記載ように決定した。

ｇａｌの長く生きる切断生成物は、生存が短いβｇａｌタンパク質の崩壊の間に 形成される。

生存が短い（長く生きるものでない）の電気泳動のパターンは、βｇａｌの′特 異的な、約９０ｋＤの切断生成物を必ず含有しく第２図、レーンｎ　””　ｕ　 ）　、この生成物は、親のβｇａ１種と異なり、標識後（チェース）期間の間に 蓄積する（第４図、レーンｍ−ｐ）。９０ｋＤのβｇａ１断片は、比較的小さい 比率の初期量のパルス標識されＩ；βｇａｌを構成する。それにもかかわらず、 その存在は、生体内の電気泳動的切断がその生存が短い親のタンパク質の代謝的 寿命からタンパク質断片を救済する。単一のタンパク質権内の多数の半減期の得 られる可能性が天然の生存が短いタンパク質の設計において利用されるかどうか についての理解が残る。

ウビクイチンーβｇａｌは、脱つビクィチンされないとき、生存が短い。

ウビクイチンーＰｒｏ−βｇａｌ、生体内で脱つビクィチンされない唯一のウビ クィチンーβｇａｌ　（ｔｉｃ４図、レーンｊ−ｐ）は、代謝的に安定なβｇａ ｌタンパク質の半減期（表１）の１％より短い、はぼ７分の半減期（表１）を有 する。この結果の１つの解釈は、タンパク質のアミノ末端への代謝的に安定なウ ビクィチンの結合が需要体タンパク質の分解のシグナルを与えるために十分であ るということである。この解釈は、哺乳動物の細胞における生存が短いタンパク 質のウビクイチン化がそれらの分解に必須であるという、早期の生化学的および 遺伝学的証拠と一致する。同時に、ウビクイチンーＰｒｏ−βｇａｌ以外のすべ てのウビクイチンーβｇａｌ融合タンパク質は生体内で急速に脱つビクイチンさ れる。（表１）。こうして、タンパク質の翻訳後のアミノ末端ウビクイチン化は 、生体内の分解のためのタンパク質を表示する、初期の認識まＩ；はコミットメ ント（ｃ　ｏｍｍ　ｉ　ｔｍｅ　ｎ　ｔ）工程において含まれないことがある。

翻訳後のアミノ末端のクビクイチン化（それが生体内で実際に起こる場合）が分 解通路の後の段階のために必須であるかどうかは、まだ、決定することができな い。早期の生体内の実験により、タンパク質分解の基質のアミノ末端の優先的化 学的修飾は生体内ウビクイチン依存性のタンパク質分解系におけるそれらの分解 を阻止することが示された。これらのデータに基づき、タンパク質のアミノ末端 のウビクイチン化はそれらの分解のために必須であることが提案された。同一の 結果の別の解釈は、タンパク質のアミノ末端の化学的ブロッキングが、その初期 の段階が必ずしもウビクイチン依存性でない、「Ｎ−末端ルールＪによって、そ れらのアミノ末端の認識を防止するということである。

生存が短いβｇａｌタンパク質は生体内で多数的にウビクイチン化される。

パルス−チェースのフルオログラムの過剰露出（第２図）は、脱つビクイチンさ れた、生存が短いβｇａｌタンパク質の主要な帯びが、４〜７ｋＤの間隔で不規 則的に間隔をもって位置する帯びを含有する、大きい分子量のβｇａｌの「ラダ ー」と共存することを明らかにする（第４図、レーンｃ−ｇ）。長く生きるβｇ ａｌタンパク質のフルオログラムを同様に過度に露出するとき、このような大き い種は現れない。βｇａ１に対する抗体およびウビクイチンに対する抗体の両者 を使用する免疫学的分析は、「ラダー」βｇａ１種がウビクイチンを含有するこ とを立証する（第５図）。

選択的分解の通路のためのモデル 天然のまたは操作したウビクイチン融合タンパク質（第１図および表１）を除外 して、発生期のタンパク質はウビクイチン部分を明らかに欠く。発生期の非画分 化タンパク質の生体内アミノ末端処理は、その基質特異性が部分的に特性づけら れる、アミノ末端ペプチダーゼの作用を経て、それらの成熟アミノ末端を発生さ せる。［参照、ツナサワ、Ｓ、ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃアミノ末端は、「Ｎ−末端の読み」によって認識され ることを、われわれは示嗅する。１つの特定のモデルは、タンパク質分子を分解 するコミットメントを、酵素を確率的に操作することによって、そのアミノ末端 残基を認識する結果としてなされるものであり、その標的アミノ末端における「 クランピング」の確立はＮ−末端ルールによって決定される（表１）。いったん コミットメントがなされると、標的タンパク質の高度に処理されやすいウビクイ チン化が起こり、これはβｇａｌの場合において、ｇａｌの分子光たり１５より 多いウビクイチン部分に接合する（第４図、レーンＣ”−ｇ　ｓおよび第５図） 。次いで、多数でウビクイチン化された「下流」の酵素（１）によって分解され 、そのために標的のウビクイチン部分は、認識シグナルまたは変性［アン７オル デイング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）］装置として、あるいは両者として働く。

ウビクイチン含有「ラダー」βｇａ１種（第４図、レーンｃ−１、および第５図 ）は、βｇａｌにおいて内部リジン残基の（−アミ７基に接合した、明らかに枝 分かれのウビクイチン部分から成る。驚くべきことには、ウビクイチンーＰｒｏ −βｇａｌから誘導した「ラダー」βｇａ１種は、βｇａｌの類似の種から電気 泳動的に区別可能であり、その類似の種のアミノ末端ウビクイチンは発生期の融 合タンパク質を切断する（第４図、レーンｊ〜］、および第５図）。電気泳動的 に区別可能なウビクイチン化したβｇａ１種が、事実、構造的に相同性である場 合、これらの結果は別の２つのモデルと適合し、ここで、第１のウビクイチンが βｇａｌに枝分かれ接合した直後に、枝分かれウビクイチン化−Ｐｒｏ−βｇａ ｌはアミノ末端の脱つビクイチン化するか、あるいはアミノ末端ウビクイチン部 分を欠く類似のβｇａ１種はそれを再び獲得する。

この不明瞭されの実験的解明は、タンパク質の翻訳後のアミノ末端のウビクイチ ン化（それが生体内で起こる場合）選択的タンパク質のターンオーバーにおいで ある役割を演するかどうかに拘らず、達成することができる。

原核細胞および真核生物の両者はＮ−末端ルールに従うように思われるが（下を 参照）、バクテリアは明らかにウビクイチン系を欠く。こうして、仮定のＮ−末 端認識タンパク質が、選択的分解通路の残部であるより、原核細胞および真核生 物の間でいっそう強く保存されることが可能である。興味あることには、その存 在が生体外のウビクイチン接合酵素によるタンパク質分解基質のウビクイチン化 のために要求される、哺乳動物のタンパク質Ｅ３の性質は、Ｎ−末端認識タンパ ク質のＬ成分であるということと一致する。

Ｎ−末端ルー壷しおよび細胞内タンパク質の既知のアミノ末端原核細胞および真 核生物の両者からの代謝的に安定な、非両分化タンパク質における、ブロッキン グされないアミノ末端残基は、安定化クラス（Ｍｅｔ％５ｅｒｓ　Ａｌａｑ　Ｇ ｔｙ、Ｔｈｒ、Ｖａｔ）、すなわち、ｇａｌに生体内の長く生きる与えるクラス 、から排除される（第６Ａ図）。

それについての成熟アミン末端が知られている、１つの生存が短い細胞内タンパ ク質は、ファージラムダのａｌｌタンパク質であり、これはλが溶菌的に増殖す るか、あるいは感染した細胞を溶原菌化するかどうかを決定するトリガーの中央 成分である。［Ｙ、Ｓ、ＨＯ，Ｄ、ウルツ、Ｍ、ロウゼンパーグ、遺伝子の発現 の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、１． ブースおよびＣ，ヒギンス編（ケンブリッジ大学、プレス、ロンドン、１９８６ ）、ｐ、７９：Ｆ、バヌエット、Ｍ、Ａ、　、ホイト、Ｌ、マク７アーレン、Ｈ ，エコールス、■、ヘルスコウィッツ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ オロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、−目ロー、２］３　（１９８６）；Ｈ， ｘコールス、細胞（Ｃｅｌｌ）、３１．５６５　（１９８２）：Ｋ。

ナスミス、ネイチａｔ−（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏｎ）、３２０．６７０（ １９８３）］。ラムダ感染したＥ、ｃｏｌｉにおけるｃＩＩの半減期は、３分よ り短い。顕著には、ｃＩＩの成熟アミノ末端はＡｒｇで開始し【ホウ、ｙ、ｗ、 ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、）、９１２３　（１９８２）］　、この残基はＮ−末端ルールにおける最も 脱安走化残基である（表１）。

脱安泥化アミノ酸は疎水性であり、帯電しない親水性であるか、あるいは帯電し ていことができるが、それらはＭｅｔを除外する安定化アミノ酸のいずれよりも 大きい旋回半径を有するという性質を共有する。

画分化タンパク質におけるアミノ末端残基は大部分膜安定化クラスである。

第６図は、長く生きる非画分化細胞内タンパク質（Ａ）および分泌されたタンパ ク質（Ｂ）の間のアミン末端残基の選択における顕著な差を示し、分泌されたタ ンパク質の多くはそれらのそれぞれの細胞外画分において長く生きる。この発見 の１つの解釈は、Ｎ−末端ルールに従って操作する、単一の細胞内分解の通路が 細胞内タンパク質の生体内半減期の多様性および細胞内空間中に異常に導入され る、画分化タンパク質の選択的分解の両者について原因となりうるということで ある。ある誤って画分化されたタンパク質は他のものよりも細胞に有害であり得 る。したがって、分泌された真核生物トキシンは、分泌されたタンパク質の一般 の集団よりも頻繁に、それらのアミノ末端に、強く脱安穴化性の残基（Ａｒｇ、 Ｌｙｓ、Ｌｅｕｓ　Ｐｈｅｓ　Ａｓｐ）を含有するということは、興味あること である（第６図、パネルＢ−Ｄ）。

上の考察が、また、示唆するように、細胞の位相的外側、例えば、内質の網状構 造の内腔およびゴルジ、および細胞外空間がＮ−末端ルールの通路に類似する分 解通路を有する場合、それらはＮ−末端ルールの「逆転したｊ型に基づくことが でき、ここで細胞の内側で脱安走化されるアミノ末ｔ＠残基は、今度は、安定化 残基であるか、あるいはその逆である。

こうして、本発明の方法は、また、分泌されたものを包含する、画分化タンパク 質の代謝的安定性および他の性質の操作に有用であろう。

路の可能な役割。

脱安定化（表１）終わりから２番目の残基をもつ長く生きる細胞内タンパク質は 、それらの初期のアミノ末端メチオニン残基を一般に保持する。アミノ末端の処 理を行わない、長く生きる細胞内タンパク質におけるアミノ末端残基は、必ず安 定化クラスに属する（表１）。長く生きるタンパク質ターンオーバーにおけるＮ −末端ルールの通路を包含するであろう興味ある可能性は、長く生きるタンパク 質の生体内分解における速度制限段階が膜安定化残基を露出する、Ｊｕ％アミノ ペプチダーゼ切断および引き続くＮ−末端ルールの通路を経る象産β分解である ことができるということである。分解速度の微細な調整は、この場合において、 Ｎ−末端ルールに従う残基の脱安走化能力の機能であるよりはむしろ、膜安定化 残基を露出するアミノペプチダーゼ切断の速度の機能であることに注意すべきで ある。

Ｎ−末端ルールおよび生存が短い損傷されたタンパク質の選択的分解生体内の選 択的分解のためのそうでなければ長く生きるが、損傷されたタンパク質を標的す る、ポリペプチド鎖の折り畳みパターンまたは局所的化学的特徴の認識は、Ｎ− 末端ルールの通路によって直接仲介されるように思われる。その代わり、特異的 プロテアーゼ（機能がＤＮＡにおける特異的障害を認識するヌクレアーゼに類似 する）は、標的されｔ；タンパク質を切断して、切断の２つの生成物の一方のア ミノ末端において膜安定化残基を露出することを、われわれは示唆する。このモ デルの１つの試験可能な予測は、分解通路の初期の切断生成物がそれらのＮ−末 端に膜安定化残基をを有することでである。初期のタンパク質の切断の生成物の アミン末端における膜安定化残基の優先的露出は、含まれるプロテアーゼの固有 の特異性のためであるか、あるいはアミノ酸の大部分が脱安定化クラスに属する （表１）という単なる事実のためであろう。

さらに、タンパク質の初期の切断は、パのもとのコンホメーションの面を脱安泥 化市、こうしてそれ以上の内部の切断の可能性を増加することが期待されるであ ろう。タンパク質の初期の切断生成物が、もっばらＮ−末端ルールの通路を経て 分解するか、あるいは追加の内部の切断によってさらに処理されなければならな かどうかは、いくつかの因子、例えば、初期の切断生成物のアミノ末端における 膜安定化残基の露出、および内部の切断の導入に依存するであろう。このモデル において、Ｎ−末端ルールの通路は、化学的に損傷され、永久に停止され、不適 切に折り畳まれ、そして誤って画分化されたものから、天然のマルチサブユニッ トの凝集体にアセンブリング不可能なものに、および最後に生体内で生存が短い そうでなければ正常のものに及ぶ、代謝的に不安定なタンパク質の大部分の分解 のために必須であろう。こうして、タンパク質の代謝的不安定性は、そのアミノ 末端における膜安定化残基の露出によってばかりでなく、かつまた切断生成物の アミノ末端において膜安定化残基を露出するタンパク質分解的切断を生ずる、そ のポリペプチド鎖のコンホメーションのおよび化学的特徴によって仲介されるこ とができる。

いずれの所定のタンパク質についても、Ｎ−末端ルールに加えて種々の因子は一 緒になってその生体内の半減期を変調することができる。このような因子の例は 、次のとおりである：タンパク質のアミノ末端の柔軟性および接近可能性［トル ントン、Ｊ、Ｍ、およびシバンダ、Ｂ、Ｌ、、ジャーナル・オプ・モレキュラー ・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ｂ　ｉ　。

ッキングする基、例えば、アセチル基の存在、アミノ末端付近におけるウビクイ チン化可能なリジンの分布、および他の変数、例えば、カルボキシル末端の構造 。マルチサブユニットのタンパク質のアミン末端領域は普通にサブユニットの界 面に含まれる［トルントン、Ｊ、Ｍ、およびシバンダ、Ｂ、Ｌ、　、ジャーナル ・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、上６７．４ ４３（１９８３））ので、タンパク質の第４構造は、生体内のタンパク質の半減 期へのＮ−末端ルールの通路の衝撃を変調することが期待される、なお他のパラ メーターである。さらに、上に示唆したように、Ｎ−末端ルールの通路は、また 、その分解のための標的として初期の認識がそれらのアミノ末端における構造に 対して独立である、タンパク質の分解に必須である。

タンパク　のアミノ末端へのアミノ酸の翻訳後の付加の機能的意味バクテリアお よび真核生物の両者において、生体外の受容体成熟アミノ末端への特異的アミノ 酸の翻訳後の接合を触媒する、酵素の異常なりラス、アミノアシル−転移ＤＮＡ −タンパク質トランスフェラーゼが存在することが、多年にわたって、知られて いる［Ｒ，Ｌ、ンノア＋、トランスファー、ＲＮＡ：バイオロジカル・アスペク ツ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＲＮＡ：Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ）、Ｄ、 ツル、Ｊ。

Ｎ、７ベルソン、Ｐ、Ｒ，シムメル編（コールド・スフリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−、コールド・ハーバ−、ニューヨーク、ｌ　９８０）、ｐ４９３；Ｃ， デウチ、メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１旦」−１１９８（１９８４）：Ａ、カシ、Ｈ，カ シ、Ｇ、Ｄ、ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ生体内のタンパ ク質へのアミノ酸の翻訳後付加は、抑圧されたまたは再生の組織、例えば、神経 細胞の軸索への物理的損傷後の組織、において劇的に促進する［Ｓ、シネーアス ワル、Ｒ，Ｖ、　リッシオ、Ｇ、チャクラポルティ、Ｎ−Ａ、インボリア、サイ エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２−■、６０３　（１９８６）；Ｎ、Ａ、インボリ ア、ジャーナル・オブ・不つロサイエンス（ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、３．２４ ６３（１９８３）］。

Ｎ−末端ルールは、この現象についてのせつめいを提供する。細胞の変化した生 理学的状態によって要求される、そうでなければ損傷されない、長く生きるタン パク質の代謝的安定性が、生体内で標的タンパク質のアミノ末端への脱安定化ア ミノ酸の翻訳後の付加によって発生することを、われわれは示唆する。、顕著に は、タンパク質へのアミノ酸の既知の翻訳後の付加［Ｒ，Ｌ、ソファ−１ＲＮＡ ：バイオロジカル・アスベクツ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＲＮＡ：Ｂｉｌｏｇｉｃａ ｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ）、Ｄ。

ツル、Ｊ、Ｎ、アベルソン、Ｐ、Ｒ，シムメル編（コールド・スプリング・ハー バ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−、ニューヨーク、１９８０）、ｐ４９ ３；Ｃ，デウチ、ノソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、）、上則旦、１９８　（１９８４）：Ａ。

カシ、Ｈ，カシ、Ｇ、Ｄ、ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４０．１１８５（１９６５）；Ｓ、シ ネーアスワル、Ｒ，Ｖ、　リッシオ、Ｇ、チャクラポルテ＜、Ｎ、Ａ、インボリ ア、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３土、６０３　（１９８６）；Ｎ、ｐ、 、インボリア、ジャーナル・オブ・不つロサイエンス（ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃ　ｉ ）、３，２４６３　（１９８３）］は、Ｎ−末端ルールに従って脱安定化される 、はとんどのアミノ酸（Ａ　ｒ　ｇ。

Ｌｙｓ％Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、およびＴｙ　ｒ）を包含する。タンパク質への脱安定 住アミノ酸の付加が起こることが期待される生理学的状態は、前置て存在する、 そうでなければ長く生きる細胞内タンパク質のある比率が選択的に分解される、 細胞サイクルへの出入り、化学的または物理学的ストレスへの応答、および特定 の分化の事象、例えば、赤血球の分化および精子形成を包含する。

哺乳動物の赤血球からのウビクイチン依存性系におけるあるタンパク質分解的基 質の生体内の分解は、最近、ある種のアミノアシル−ｔＲＮＡの存在に依存する ことが示された［フェルバー、Ｓ、およびタレチャツバ−１Ａ０、ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂ　ｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、）、２６１，３１２８　（１９８６）］、この現象 は、また、タンパク質分解の基質のアミン末端への特定の脱安定住アミノ酸の翻 訳後の付加のための要件を反映することを、われわれは示唆する。問題の初期の タンパク質分解の基質は、ＡｓｐまたはＧｌｕのアミノ酸残基を有し、それらの 両者はＮ−末端ルールに従って膜安定化可能である（表１）。これは、タンパク 質中のある種のアミノ末端残基がそのままで直接税安定化されないで、他の脱安 泥化残基へ接合するそれらの能力によってのみ膜安定化されうるという、興味あ るかつ試験可能な可能性を発生させる。

同等の実施態様 当業者は認識するか、あるいは日常実験を用いて確証することができるように、 ここに記載する本発明の特定の実施態様について、多くの同範囲に包含されるこ とを意図する。

ＦＩＧＵＲＥ　１ ′Ｏ０ ＦＩＧＵＲＥ　３ａ ｅｒ ａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ ＦＩＧＵＲＥ　３ｂ （７６ｏａ）　（１０４５ａａ） と　−＃：′：ａ、、？９τＳ；＝１　℃Ａ　−Ｈ＠ｐ？ウセぎつ　０ Ｆ／Ｇ／ＪＲＥ　５ ｂｃｄ ＦＩＧＵＲＥ　６σ ＦＩＧＵＲＥ　６ｂ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年４月１日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２５２２ ２、発明の名称 タンパク質の代謝的安定性を調節する方法３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 請求の範囲 １１タンパク質分解のＮ−末端ルールに従い、タンパク質のアミノ末端を生体内 で修飾して、安定化または脱安定化のクラスの、メチオニンまたはプロリン以外 の、前以て決定したアミノ酸のアミノ末端において露出させることからなる、Ｎ −末端ルールを適用する細胞内タンパク質の代謝的安定性を調節する方法。

２、タンパク質分解のＮ−末端ルールに従い、タンパク質を生体内で以て決定し たアミノ酸のアミノ末端において露出させることからなる、Ｎ−末端ルールを適 用する細胞内タンパク質の代謝的膜安定化する方法。

３、脱安定化クラスのアミノ酸は、インロイシン、グルタミン酸、チロシン、グ ルタミン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、リジンまたはアルギ ニンから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の方法。

４、タンパク質分解のＮ−末端ルールに従い、生体内細胞中で野生型タンパク質 のアミノ末端を修飾して、安定化または脱安定化のクラスの、メチオニンまｔ； はプロリン以外の、アミノ酸の前以て決定した露出して、そのアミノ末端におい て安定化または脱安定化アミノ酸を有する修飾されたタンパク質を生成すること からなる、その野生型の相手より代謝的に安定である、Ｎ−末端ルールを適用す る細胞内タンパク質を生成する方法。

１ｍ融合タンパク質はウビクイチンープロリンータンノくり質からなる請求の範 囲第１Ｏ項記載の方法。

１２、融合タンパク質は、プロアアーゼによる融合タン／＜り質の脱つビクイチ ンの効率を減少するために、ウビクイチン特異的処理プロテアーゼによって認識 されたアミノ酸配列中に修飾を有する、請求の範囲第１Ｏ項記載の方法。

１３、融合タンパク質をエンコードする遺伝子構成体であって、前記遺伝子構成 体はそのアミノ末端に代謝的に安定化または脱安定化のクラスの、プロリン以外 の、前以て決定したアミノ酸を有する、Ｎ−末端ルールを適用する問題のタンパ ク質をエンコードするＤＮＡ配列に接合したマスキングタンパク質をエンコード するＤＮＡ配列からなり、切断が問題のタンパク質のアミノ末端を露出するよう に、前記マスキングタンパク質は問題のタンパク質のアミノ末端において切断可 能である、遺伝子構成体。

１４、マスキングタンパク質はウビクイチンである請求の範囲第１３項記載の方 法。

国際調査報告 ＋ｍｓ＋ｖｔ、ｅ工、Ａ、、工、、、、、、、　ＰＣＴ／ＩＪＳ　８７１０２５ ２２ＩＨＩｎ＜ｐ自ｔ−１＋１自ム＃ｉ欄ｌｌｌ−〜囃ＰＣＴ／ｌ；５８７１０ ２５２２ＳＡ　１９１８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質分解のＮ−末端ルールに従い、タンパク質のアミノ末端を修飾し て、安定化または脱安定化のクラスの所望のアミノ酸のアミノ末端において露出 させることからなる、細胞内タンパク質の安定性を輝節する方法。 ２、タンパク質を修飾して脱安定化クラスのアミノ末端アミノ酸を得ることから なる細胞内タンパク質を脱安定化する方法。 ３、脱安定化クラスのアミノ酸は、イソロイシン、グルタミン酸、チロシン、グ ルタミン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパルギニン、リジンまたはアルギ ニンから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の方法。 ４、野生型タンパク質のアミノ末端中に、タンパク質分解のＮ−末端ルールに従 い、安定化または脱安定化のクラスの所望のアミノ酸を導入して、そのアミノ末 端において安定化または脱安定化アミノ酸を有する修飾されたタンパク質を生成 することからなる、その野生型の相手より分解に対して多少抵抗性のタンパク質 を生成する方法。 ５、修飾されたタンパク質はそのアミノ末端に接合したマスキングタンパク質含 有する融合タンパク質として生成され、前記マスキングタンパク質は修飾された タンパク質のアミノ末端との接合において切断可能である、請求の範囲第４項記 載の方法。 ６、マスキングタンパク質はウビクイチンである請求の範囲第５項記載の方法。 ７、ウビクイチン特異的プロテアーゼを使用して生体内または生体外のいずれか において、ウビクイチン−タンパク質の接合において、融合タンパク質からウビ クイチンを切断する、請求の範囲第６項記載の方法。 ８、マスキングタンパク質を、エンドプロテアーゼによって認識される部位から なるタンパク質配列を通して、修飾されたタンパク質のアミノ末端に接合させる 、請求の範囲第４項記載の方法。 ９、エンドプロテアーゼは補体因子Ｘ■である請求の範囲第８項記載の方法。 １０、融合タンパク質が効率よく脱ウビクイチンされえないような方法で、ウビ クイチンをタンパク質のアミノ末端に接合させる、タンパク質を融合タンパク質 として生成することからなる、代謝的に不安定なタンパク質を生成する方法。 １１、融合タンパク質はウビクイチン−プロリン−タンパク質からなる請求の範 囲第１０項記載の方法。 １２、融合タンパク質は、プロテアーゼによる融合タンパク質の脱ウビクイチン の効率を減少するために、ウビクイチン特異的処理プロテアーゼによって認識さ れたアミノ酸配列中に修飾を有する、請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、融合タンパク質をエンコードする遺伝子構成体であって、前記遺伝子構成 体はそのアミノ末端に安定化または脱安定化のクラスの前以て決定したアミノ酸 を有する問題のタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列に接合したマスキングタ ンパク質をエンコードするＤＮＡ配列からなり、切断が問題のタンパク質のアミ ノ末端を露出するように、前記マスキングタンパク質は問題のタンパク質のアミ ノ末端において切断可能である、遺伝子構成体。 １４、マスキングタンパク質はウビクイチンである請求の範囲第１３項記載の方 法。 １５、タンパク質を融合タンパク質として発現することからなり、前記タンパク 質のアミノ末端をマスキングタンパク質に融合し、前記マスキングタンパク質は 前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸との接合において生体内または生体外で特 異的に切断可能である、前以て決定したアミノ末端構造を有するタンパク質を生 成する方法。 １６、マスキングタンパク質はエンドプロテアーゼによって切断可能である請求 の範囲第１５項記載の方法。 １７、マスキングタンパク質はウビクイチンであり、そして切断エンドプロテア ーゼはウビクイチン特異的プロテアーゼである請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、工程： ａ、ｉ）融合タンパク質をエンコードする構造遺伝子、前記遺伝子はタンパク質 の前以て決定したアミノ末端構造をエンコードする配列をその５′末端に有する 、およびｉｉ）前記タンパク質をエンコードする構造遺伝子の５′末端に結合し たマスキングタンパク質をエンコードするＤＮＡ、前記マスキングタンパク質は 前記タンパク質のアミノ末端とのその接合において生体内または生体外で特異的 に切断可能である、 からなる融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ構成体を調製し、そして ｂ、宿主細胞中で前記ＤＮＡ構成体を発現して、前記ＤＮＡ構成体によってエン コードされた融合タンパク質を生成する、からなる、前以て決定したアミノ末端 構造を有するタンパク質を生成する方法。 １９、融合タンパク質を宿主細胞内で切断して、前以て決定したアミノ末端構造 を有するタンパク質を解放する、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、融合タンパク質を細胞中で生成し、前記細胞はマスキングタンパク質を切 断する能力を欠き、そして融合タンパク質を生体外で切断して前以て決定したア ミノ末端構造を有するタンパク質を解放する、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、前記マスキングタンパク質はウビクイチンである、請求の範囲第１８項記 載の方法。 ２２、構成成分： ａ、タンパク質をエンコードする構造遺伝子、前記遺伝子はタンパク質の前以て 決定したアミノ末端構造をエンコードする配列をその５′末端に有する、および ｂ、前記タンパク質をエンコードする構造遺伝子の５′末端に結合したマスキン グタンパク質をエンコードするＤＮＡ、前記マスキングタンパク質は前記タンパ ク質のアミノ末端とのその接合において生体内または生体外で特異的に切断可能 である、からなる、前以て決定したアミノ末端構造を有するタンパク質を生成す るためのＤＮＡ構成体。 ２３、マスキングタンパク質はウビクイチンである、請求の範囲第２２項記載の 方法。 ２４、ウビクイチンとタンパク質のアミノ末端との間の接合においてウビクイチ ンが接合しているタンパク質のアミノ末端からウビクイチンを切断することがで きる、分離されたウビクイチン特異的プロテアーゼ。 ２５、請求の範囲第２４項記載のウビクイチン特異的プロテアーゼをエンコード する分離されたＤＮＡ配列。 ２６、Ｎ−末端ルールの分解通路において含まれる１種または２種以上のプロテ アーゼ条件的または非条件的に合成できない、突然変異体細胞系。