JP2894357B2 - タンパク質中に所望のアミノ末端残基を発生させる方法 - Google Patents

タンパク質中に所望のアミノ末端残基を発生させる方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 バクテリア細胞及び真核細胞の両方において、半減期
が細胞世代時間に近いか又はそれを越える比較的長い寿
命のタンパク質は、半減期が細胞世代時間の１％未満の
タンパク質と共存する。細胞内タンパク質分解の速度
は、細胞の生理学的状態の関数であり、そして個々のタ
ンパク質について個別的に制御されているようである。
特に、損傷したタンパク質及びその他の異常なタンパク
質は、生体内で代謝的に不安定である。選択的タンパク
質分解の特定の機能は大抵の場合にまだ未知であるが、
多くの調節タンパク質は生体内で非常に短い寿命である
ことは明らかである。このようなタンパク質の代謝不安
定性は、それらの合成又は分解の速度の変化の調節によ
り細胞内濃度の迅速な調節を可能とする。細胞内タンパ
ク質の代謝不安定性がその機能にとって必須であること
が示された少数の例には、バクテリオファージλのcII
タンパク質及び酵母サッカロミセス・セレビシエのHOエ
ンドヌクレアーゼが包含させる。
正常な代謝条件下の細胞内タンパク質の選択的回路
（turnover）の大部分は、ATP依存性でありそして（真
核生物において）非リソソーム性（nonlysosomal）であ
る。最近の生化学的及び遺伝学的証拠は、真核生物にお
いては、短い寿命の細胞内タンパク質にユビキチンが共
有結合して複合体となることが選択的分解に必須である
ことを示している。所定のタンパク質が生体内で代謝安
定性であるか又は不安定性であるを決定する規則はこれ
までのところ知られていない。
発明の要約 本発明は、タンパク質のアミノ末端を工学的に造りだ
し、それによりタンパク質の代謝安定性及び他の性質を
制御する方法に関する。更に、本発明は、タンパク質の
アミノ末端に20種のアミノ酸残基（又はその類似体）の
いずれかを有するタンパク質の生体内又は生体外生産の
方法を提供する。本発明は、一部は、細胞内タンパク質
生体内半減期がアミノ末端アミノ酸残基の関数であると
いうめざましい発見に基づいており、そして生体内又は
生体外で特定のアミノ末端を有するタンパク質を発生さ
せるのを可能とする新規な（且つ更に一般的に適用可能
な）技術に基づいている。本発明は、目的のタンパク質
のアミノ末端において、プロリン以外の所望の任意のア
ミノ酸残基を生体外又は生体内で露出させることを可能
とする性質を有する、新規に同定されたプロテアーゼで
あるユビキチン−特異的プロセッシングプロテアーゼに
も関する。
細胞内タンパク質のアミノ末端に露出したアミノ酸の
性質は、タンパク質が生体内で長い寿命であるか短い寿
命であるかを特定する一つの重要な決定要素であること
が示された。個々のアミノ酸は、タンパク質のアミノ末
端において露出されるときそれらがタンパク質に与える
半減期に関して、安定化アミノ酸又は不安定化アミノ酸
として類別することができる。不安定化アミノ酸残基
は、該不安定化アミノ酸のいくつかについては数分まで
の短い半減期を与える。安定化アミノ酸残基は、多時間
の長い半減期を与える。この顕著な且つ新規に発見され
た、タンパク質の半減期のアミノ末端残基依存性は、本
明細書ではＮ−末端規則（Ｎ−endrule）と呼ぶ。
或るタンパク質では、アミノ末端における不安定化ア
ミノ酸の存在は、不安定化のために必要ではあるが十分
ではない。これは、短い寿命のタンパク質の完全なアミ
ノ末端分解シグナルは、二つの別個の決定要素より成
り、その各々は必要であるが、その各々は、それ自体
は、タンパク質の有効な不安定化には不十分であるとい
う理由による。上記の一つの決定要素は、タンパク質の
アミノ末端残基である。第二の決定要素は、特定の内部
リシン残基である。この重要なリシン残基の第二決定要
素として働く能力は、この残基を取り囲んでいるアミノ
酸配列とはかなりの程度無関係である。その代わりに、
この重要なリシン残基の必須の特徴は、タンパク質のア
ミノ末端に対するその空間的近接が含まれる。
Ｎ−末端規則に基づくと、タンパク質のアミノ末端
は、タンパク質の細胞内半減期を変えるようにデザイン
又は改変することができ、そしてこのようにして生体内
でのタンパク質の寿命及び／又は活性を調節することが
できる。この能力は、多くの異なる情況において合理的
なタンパク質のデザインのために利用することができ
る。天然のタンパク質は、生体内での分解に対して多か
れ少なかれ抵抗性となるように修飾することができる。
タンパク質のデザイン又は改変は、タンパク質レベルで
又は遺伝子（DNA）レベルで行うことができる。例え
ば、タンパク質は、アミノ末端に安定化又は不安定化ク
ラスのアミノ酸残基を露出させるようにアミノ末端を化
学的に改変するか又は工学的に造り出すことにより修飾
することができる。遺伝子レベルでは、タンパク質をコ
ードしている遺伝子をアミノ末端に所望のクラスのアミ
ノ酸をコード化するように造り、発現したタンパク質
が、プロテオリシスによる分解（proteolyticdegradati
on）のＮ−末端規則経路に関して代謝安定性となるか又
は代謝不安定性となる所定のアミノ末端構造を示すよう
にすることができる。不安定化タンパク質を生成するの
に十分にセグメント可動性の（segment ally mobile）
アミノ末端との関係で適当に位置付けられたリシン残基
を与えるように、アミノ末端領域を工学的に造り出すこ
とができる。更に、工学的に造り出されたアミノ末端を
マスクする“マスキング”タンパク質配列に融合させて
発現させて、マスクが取り除かれるとそのタンパク質が
タンパク質のアミノ末端残基の性質に依存する所望の代
謝安定性又は他の性質を示すようにすることができる。
このような構築物においては、例えば、二つのタンパク
質配列間の接合部は、例えばエンドプロテアーゼにより
特異的に切断される（cleaved）ようにデザインするこ
とができる。融合したタンパク質のエンドプロテオリシ
スによる（endoproteolytic）切断は目的のタンパク質
の特定的に工学的に造りだされたアミノ末端を露出さ
せ、そしてタンパク質をＮ−末端規則により支配される
分解に服させる。タンパク質のアミノ末端を造り出す一
つの特定の新規な方法は、ユビキチン−特異的プロセッ
シングプロテアーゼの同定及びその基質特異性の決定に
より本発明により提供される。このプロテアーゼを使用
すると、ユビキチンと他のタンパク質との融合体は、生
体外又は生体内で特異的にプロセッシングされて所望の
アミノ末端残基を有するタンパク質を発生させることが
できる。
本発明においては、有効に脱ユビキチン化することが
できないユビキチン−Pro−β−ガラクトシダーゼの如
きユビキチン−タンパク質融合体は代謝不安定性である
という発見により、短い寿命のタンパク質を特定的に造
り出す種々の新しい方法が提供される。かくして、アミ
ノ末端ユビキチン部分の除去が不可能であるか又は不十
分となるようにアミノ末端ユビキチン部分をタンパク質
に結合させることにより、Ｎ−末端規則に直接基づいて
いない独特の技術によりタンパク質を不安定化させるこ
とができる。
更に、短い寿命のタンパク質の分解を条件的に又は非
条件的に止める“Ｎ−末端”分解プロテアーゼにおける
推定上の突然変異を含む変異体細胞を発生させることが
できる。これらの細胞は、通常は細胞内で短い寿命であ
ろうタンパク質を過剰生産させるのに使用することがで
きる。
図面の簡単な説明 第１図は、ユビキチン−lacZ遺伝子融合体の構築を示
す。
第２図は、工学的に造り出されたβ−galタンパク質
の半減期を直接測定する実験を示す。
第３図は、ユビキチン特異的プロセッシングプロテア
ーゼの新規に発見された性質を利用するユビキチン−β
−gal接合部のアミノ酸残基の変更（Ａ）及び接合部の
付近のアミノ酸配列（Ｂ）を示す。
第４図は、代謝不安定性β−galタンパク質における
多重ユビキチン部分の存在を示す。
第５図は、代謝不安定性β−galタンパク質中にユビ
キチンを含む一連のβ−gal種を示す。
第６図は、原核細胞及び真核細胞の長い寿命の細胞内
タンパク質がそれらのアミノ末端に安定化アミノ酸残基
を有し、これに対して分泌されたタンパク質は相補的バ
イアス（complementary bias）を示すことを示す。
第７図及び第８図は、マウスジヒドロ葉酸レダクター
ゼとのユビキチン融合体の構築を示す。
本発明の詳細な説明 Ｎ−末端規則の解明を以下に詳細に説明する。簡単に
言えば、タンパク質分解を支配するこの規則は、アミノ
末端に種々のアミノ酸残基を有しそしてユビキチンとの
融合タンパク質として製造された酵素β−ガラクトシダ
ーゼの生体内半減期を調べることにより示された。ユビ
キチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコード
化しているキメラ遺伝子を酵母サッカロミセス・セレビ
シエ中で発現させると、ユビキチンは初期融合タンパク
質から切断され、脱ユビキチン化されたβ−ガラクトシ
ダーゼ（βgal）を生じる。一つだけ例外があるが、こ
の切断はユビキチン−βgal接合部のβgalのアミノ酸残
基の性質に関係なく有効に行なわれ、それにより他の点
では同一のβgalタンパク質のアミノ末端に異なる残基
を選択的に露出させることが可能である。そのようにデ
ザインされたβgalタンパク質は、βgalのアミノ末端の
アミノ酸の性質に依存して、20時間以上から３分未満ま
での顕著に異なる生体内半減期を示した。アミノ酸は、
このようにして、アミノ末端に存在するときにβgalに
与える半減期に応じて規定される。例えば、アミノ酸メ
チオニン、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、グ
リシン及びシステインは、20時間以上の半減期を与え
る。フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン及びリ
シンは、約３分の半減期を与える。最も不安定化性アミ
ノ酸であるアルギニンは、約２分の半減期を与える。
（アミノ酸と対応する半減期の完全リストの下表１参
照）。
35S標識タンパク質を大腸菌中で合成し、単離し、そ
して哺乳動物細胞溶解物、特に十分に特性決定されたウ
サギ網状赤血球溶解物系に加える。このような系では、
例えば、下記のアミノ末端残基を不安定化性として特徴
付けることができる。アルギニン、リシン、ヒスチジ
ン、フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、チ
ロシン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン及びアスパ
ラギン。特定のアミノ酸が任意の真核細胞系中で不安定
化性であるかどうかを決定することができる。
これらの検討の過程で、Ｎ−末端規則は階層的構造を
有することが決定された。特に、アミノ末端Glu及びAsp
（及び網状赤血球においてはCysも）は、それらがArgの
如き一次不安定化残基に結合されうる能力により不安定
化性であるという点で、二次不安定化残基である。アミ
ノ末端Gln及びAsnは、選択的脱アミド化を介して二次不
安定化性残基Glu及びAspに転換されうる能力により不安
定化性であるという点で三次不安定化性残基である。
原核細胞及び真核細胞からの長い寿命の非区画化細胞
内タンパク質（noncompartmentalized intracellular p
roteins）中の最近知られたアミノ末端残基は、Ｎ−末
端規則により予想されるように正確に、実質的にもっぱ
ら安定化性クラスのアミノ酸に属する。この結果は、一
般に細胞内タンパク質の選択的分解におけるＮ−末端規
則と深い関係がある。
適当なアミノ末端アミノ酸は、非区画化細胞内タンパ
ク質の代謝安定性に必須の要件である（必ずしも十分で
はないけれども）ようにみえる。かくしてタンパク質が
細胞内で比較的安定であるためには、安定化アミノ酸が
アミノ末端に存在しているべきである。タンパク質のア
ミノ末端における不安定化残基の存在は、常にではない
けれども、しばしば生体内でのその代謝不安定化のため
には十分である。このような不安定化が比較的小さな程
度に起こる場合には、異なる分析は、アミノ末端の不十
分なアクセシビリティ（accessibility）又は完全アミ
ノ末端分解シグナルの第二決定要素の欠如を示す。これ
らの例では、それ自身ではタンパク質を代謝的に不安定
化させないこの第二決定要素は、生体内のタンパク質の
半減期をそのアミノ末端残基の性質に強く依存させるた
めに存在しなければならない。アミノ末端分解シグナル
の第二決定要素は、特異的内部リシン残基であることが
見出だされた。この重要なリシン残基の第二決定要素と
して作用する能力は、該残基を取り囲んでいる独特のア
ミノ酸配列とはかなり無関係であることが示された。そ
の代わりに、重要なリシン残基の必須の特徴は、タンパ
ク質のアミノ末端へのその空間的近接が含まれる。
少なくとも或る場合に（例えばβ−galで見られるよ
うに）アミノ末端における安定化アミノ酸の存在は、タ
ンパク質に安定性を与えるであろう。しかしながら、ア
ミノ末端の安定化アミノ酸は必ずしも長い半減期を与え
るとは限らない。何故ならば、タンパク質の最終的運命
を決定するのに他の分解経路が関与するからである。例
えば、エンドプロテオリシス切断（タンパク質の末端領
域の外側の切断）は、得られる切断生成物のアミノ末端
に不安定化性アミノ酸を露出させることがあり、これは
次いでＮ−末端規則経路により急速に分解される。安定
化アミノ酸を使用するための適当な環境は、経験的に確
かめることができる。
Ｎ−末端規則は、生体内での選択的タンパク質分解の
他の面を包含するより複雑な半減期規則の一成分（とは
いえ中心的規則である）にすぎないかもしれないけれど
も、Ｎ−末端規則は、天然の非修飾タンパク質よりはＮ
−末端規則による分解に対して多かれ少なかれ抵抗性で
あるタンパク質を製造するために、タンパク質構造をデ
ザイン又は変更するための合理的な実際的方法を提供す
る。タンパク質は、タンパク質レベル又は遺伝子レベル
でデザイン又は修飾して、それらのアミノ末端に安定化
性又は不安定化性クラスのいずれかの所望のアミノ酸を
与えることができる。不安定化のために必要ならば、ア
ミノ末端領域に追加の修飾を行って、適当に位置付けら
れたリシン残基を与えることができる。タンパク質の半
減期を調節できることは、タンパク質の細胞内活性を調
節することを可能とする。
タンパク質の代謝安定性を増減させたりタンパク質の
他の性質を調節したりするためにタンパク質を修飾する
わかりやすい方法は、タンパク質レベルでタンパク質の
アミノ末端を直接工学的に造ることがである。所望のア
ミノ末端アミノ酸を得るために、目的のタンパク質のア
ミノ末端を、例えば、適当な化学方法を用いてタンパク
質又はポリペプチドのアミノ末端に安定化性又は不安定
化性のクラスのアミノ酸を付加することにより、化学的
に改変することができる。かくして、例えば、不安定な
タンパク質は、該タンパク質のアミノ末端に安定化アミ
ノ酸残基（例えばメチオニン、セリン、アラニン、トレ
オニン、バリン、グリシン又はシステイン）を付加する
ことによりもっと安定にすることができる。反対に、安
定なタンパク質は、アミノ末端に不安定化アミノ酸を付
加することにより不安定化することができる。タンパク
質のアミノ末端を修飾する一つの独特の方法は、特異的
酵素であるアミノ酸−タンパク質リガーゼを使用するこ
とであり、この酵素は、タンパク質のアミノ末端に単一
のアミノ酸の翻訳後の付加を触媒する。同じタイプの非
遺伝子改変のための他の方法を、当業者は容易に確かめ
ることができる。
或るタンパク質では、アミノ末端端部は、タンパク質
のコンフォーメーション（例えばその三次又は四次構
造）の結果として不明確になる。これらの場合には、タ
ンパク質をＮ−末端規則に服させるためにはより広範な
アミノ末端の改変が必要なことがある。例えば、一つの
アミノ末端残基の一つの付加又は置換では、インアクセ
シブル（inaccessible）なアミノ末端の故に不十分であ
る場合には、幾つかのアミノ酸（リシン、基質タンパク
質に接合するユビキチンの部位、を含む）を初めてアミ
ノ末端に付加して造りだされたアミノ末端のアクセシビ
リティ（accessibility）及び／又はセグメント可動性
（segmental mobility）を増加させることができる。タ
ンパク質のアミノ末端の修飾又はデザインは、遺伝子レ
ベルで達成することもできる。単離又は合成された遺伝
子の５′末端に適当なコドンの付加又は置換のための特
定部位の突然変異誘発（site−directed mutagenesis）
の慣用の技術を使用して、コード化されたタンパク質の
ための所望のアミノ末端構造を得ることができる。例え
ば、発現されたタンパク質がそのアミノ末端に所望のア
ミノ酸を有するように、安定化アミノ酸の適当なコドン
をタンパク質コード化配列のアミノ末端に挿入又は組み
込むことができる。必要ならば、タンパク質のアミノ末
端領域をコード化しているDNA配列を修飾して適当な情
況でリシン残基を導入することができる。これは、“汎
用不安定化セグメント”（universal destabilizing se
gments）をコード化しているDNA構築物を使用すること
により最も便利に達成することができる。汎用不安定化
セグメントは、１個又はそれより多くのリシン残基を含
有する、好ましくはセグメント可動性のポリペプチド構
造をコード化するDNA構築物より成り、リシン残基のコ
ドンは、この構築物が構造遺伝子に挿入されるとき、リ
シン残基が、完全アミノ末端分解シグナルとして作用す
るのに十分に、コード化されたタンパク質のアミノ末端
に空間的に近接しているように、構築物内に配置されて
いる。不安定化セグメントの例は、下記の例示（第７図
及び第８図）に示される。構造遺伝子の５′部分へのこ
のような構築物の挿入は、不安定化のために適当な情況
でリシン残基（１個又は複数）を有するコード化された
タンパク質を与えるであろう。
同時に、発現されたタンパク質は、翻訳後に細胞内で
しばしば天然に修飾される。これらの修飾には、タンパ
ク質のアミノ末端の変更が含まれる。例えば、アミノ末
端は、アミノ末端から一個又は数個のアミノ酸を切断す
るアミノペプチダーゼにより作用を受けることがある。
翻訳後のプロセッシングによりアミノ末端にアミノ酸が
付加されることもある。本発明は、アミノ末端タンパク
質プロセッシングのまだ未知の規則をバイパスして、成
熟したプロセッシングされたタンパク質種のアミノ末端
に所望のアミノ酸を正確に且つ特異的に露出させる方法
を提供する。目的のタンパク質のアミノ末端の最終構造
に対するこのような翻訳後の事象の影響を最小にするた
めに、目的のタンパク質のアミノ末端（所望の安定化構
造又は不安定化構造を有するようにデザインされた）が
アミノ末端に融合した“マスキング”タンパク質配列に
より先行される特異的融合タンパク質をデザインするこ
とができる。この融合タンパク質は、目的のタンパク質
のアミノ末端に融合したマスキングタンパク質配列が両
者の間の接合部で特異的切断を容易に受けるようにデザ
インされる。かくしてこのタンパク質配列を除去する
と、目的のタンパク質のアミノ末端が露出しそして放出
されたタンパク質の半減期は、予めデザインされたアミ
ノ末端により支配される。融合タンパク質は、例えば宿
主細胞エンドプロテアーゼにより生体内で特異的に切断
されるように、又はプロデューサー細胞（以下、生産者
細胞という場合あり）（融合タンパク質を切断する能力
には欠けている）から単離した後切断することができる
生体外の系で特異的に切断されるようにデザインするこ
とができる。
ユビキチンは、目的のタンパク質との融合タンパク質
の構築のために広く有用な融合相手である。人工のユビ
キチン−タンパク質融合体は、ユビキチンが融合するタ
ンパク質に殆ど又は全然依存しないで、細胞質真核細胞
プロテアーゼにより正確に切断されうるという発見は、
タンパク質工学的方法において生体内及び生体外の両方
に適用できそして本発明の主要な面である。例えば、ユ
ビキチン−タンパク質融合方法を使用して、人工的手段
により製造されたタンパク質に真のアミノ末端を人工的
に発生させることができる。かくして、天然真核細胞又
は原核細胞タンパク質のアミノ末端特性を、原核細胞宿
主中で生産されたユビキチン−タンパク質融合体の生体
外切断により発生させることができる。
ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を
製造するための特定の方法は、以下に詳しく説明する。
この方法では任意の他のタンパク質をコード化している
遺伝子をlacZ（β−gal遺伝子）の代わりに替えること
ができる。
一般に、ユビキチン融合タンパク質は、５′−３′方
位において、目的のタンパク質をコード化している遺伝
子に連結されたユビキチン遺伝子を含んで成るキメラ遺
伝子構築物により発現される。目的のタンパク質のアミ
ノ末端アミノ酸のコドンは、ユビキチン遺伝子の３′末
端に直ぐ隣接して位置している。融合遺伝子生産物は、
ユビキチンと目的のタンパク質との接合部において生体
内又は生体外で（本発明で同定された純粋な又は部分的
に精製したユビキチン−特異的プロテアーゼを使用し
て）エンドプロテオリシスにより切断されて、そのアミ
ノ末端に所望のアミノ酸を有する目的のタンパク質を発
生させる。
タンパク質のアミノ末端を特異的に工学的に造りだす
前記の能力は多数の特定的用途を有する。一つのこのよ
うな用途は、放出されたタンパク質の細胞内半減期がＮ
−末端規則の原理により支配されるということにより確
立される。本明細書で述べたタンパク質のアミノ末端を
造り出すための特定の方法の他の用途は、目的のタンパ
ク質の所望の機能的性質の調節からその抗原性の調節、
及び当業者により容易に確かめられる他の用途にわたる
範囲にある。
目的のタンパク質のアミノ末端に所望のアミノ酸残基
を発生させるこの方法は、二つの新規な構成部分を含
む。一つは、ユビキチン−タンパク質融合体の使用であ
り、他は同定されたユビキチン−特異的プロセッシング
プロテアーゼの使用であり、その顕著な基質要求性がこ
の研究で発見された。ユビキチン−特異的プロテアーゼ
の最初の同定は生体内でなされたけれども、この酵素
は、生体外で（抽出物中で）も比較的安定であり且つ活
性であり、そして当業者には知られている方法により均
質となるまで容易に精製されうる。更に、ユビキチン−
特異的プロセッシングプロテアーゼの基質特異性は、進
化において高度に保存されており、これは酵母及び哺乳
動物において同じである。この酵素は、当業者に知られ
た他の方法の中でも、ホスホセルロース、DEAEセルロー
ス及びSH−セファロースでの逐次のクロマトグラフィー
により粗製抽出物からクロマトグラフィーにより精製す
ることができる。別法として、このプロテアーゼの遺伝
子を当業者によりクローニングすることができる。
クローニングされたプロテアーゼ遺伝子は、生体内で
使用することができるか、又はこの遺伝子は適当な宿主
内で過剰発現させることができ、過剰発現したユビキチ
ン−特異的プロテアーゼを、生体外で同じ又は同様な目
的で精製及び使用することができる。この酵素活性の発
見及び本発明における基質特異性の詳細な特性決定は、
この酵素の生体外及び生体内使用を与える。
目的のタンパク質のアミノ末端に所望のアミノ酸残基
を発生させるユビキチン−タンパク質融合体の用途を広
げて、生産者細胞からのこのようなタンパク質の精製を
促進させることができる。上記のユビキチン−タンパク
質融合構築物に連結されたストレプトアビジンの如き便
利なマーカータンパク質をコード化している遺伝子を容
易に構築することができる。得られる（マーカータンパ
ク質）−ユビキチン−タンパク質融合体は、マーカータ
ンパク質の予め選ばれた性質、例えば、ビオチンカラム
でのアフィニティクロマトグラフィーによりストレプト
アビジンが単離できることを利用して生産者細胞から簡
単に単離することができる。かくして精製された（マー
カータンパク質）−ユビキチン−タンパク質融合体は、
次いで本発明で説明したユビキチン−特異的プロテアー
ゼにより特異的に切断されて、最終生成物、即ち、アミ
ノ末端に所望のアミノ酸残基を有する目的のタンパク質
を発生させることができる。
目的のタンパク質のアミノ末端アミノ酸のコドンは、
当業界での最近の標準的な特定部位突然変異誘発技術に
より所望のアミノ酸をコード化するように作ることがで
きる。目的のタンパク質をコード化している遺伝子が合
成遺伝子であるならば、適当な５′コドンを合成プロセ
ス中に組み込むことができる。別法として、特定のコド
ンのヌクレオチドを遺伝子の５′（アミノ末端コード
化）末端への適当なDNA配列の連結により、単離又は合
成された遺伝子の５′末端に付加することができる。適
当に位置付けられたリシン残基をコード化しているDNA
インサート（前記した“汎用不安定化セグメント”の如
き）を、５′領域に挿入して、完全アミノ末端分解の第
二決定要素を与えることができる。
ユビキチン−特異的プロテアーゼにより切断されうる
ユビキチン様融合相手を使用することもできる。更に、
目的のタンパク質のアミノ末端をマスクするためのユビ
キチン以外の融合相手を使用することができる。例え
ば、真核細胞又は原核細胞からのユビキチンの機能的相
同体（functional homologues）を使用することができ
る。適当ならば、融合タンパク質は、一つの標的部位の
みが融合タンパク質において切断されるように、十分に
狭い特異性を有する制限エンドプロテアーゼのプロテオ
リシス切断部位を含むようにデザインすることができ
る。このようなプロテアーゼの重要な性質は、切断部位
のカルボキシ末端側に当接するアミノ酸残基の性質につ
いては十分にゆるい要求でなければならない。切断の標
的部位は、融合相手と目的のタンパク質のアミノ末端と
の接合部であり、かくしてエンドプロテアーゼのための
認識部位は、この位置での切断を与えるように位置付け
られる。市販の入手可能なプロテアーゼ、補因子Xaは、
これらの性質を示し、かくしてアミノ末端の最終位置に
所定のアミノ酸残基を有するタンパク質を直接発生させ
るのに使用することができる［ケイ・ノガイ及びエイチ
・シー・ソガーソン、ネイチャー306:810（1984）参
照］。エンドプロテアーゼのための認識部位は、マスキ
ングタンパク質配列と目的のタンパク質のアミノ末端を
コード化している３′領域との接合部に工学的に作り出
すことができる。
短い寿命のタンパク質を工学的に作り出すための種々
の独特の方法は、有効に脱ユビキチン化できないユビキ
チン−Pro−β−ガラクトシダーゼ融合体（表１）の如
きユビキチン−タンパク質融合体は代謝的に不安定であ
るという発見によって、本発明において提供される。か
くして、アミノ末端ユビキチン部分を、その除去が不可
能であるか又は不十分にするようにしてタンパク質に結
合させることによって、Ｎ−末端規則の要求に従ってタ
ンパク質の所望のアミノ末端を発生させる方法とは性質
が異なる独特の技術によりタンパク質を不安定化させる
ことができる。ユビキチン−タンパク質融合体の有効な
脱ユビキチン化の阻止は、いくつかの方法で、例えば、
表１に示されたようにユビキチン−タンパク質接合部に
プロリン残基を使用することによるか、又は、ユビキチ
ン部分がユビキチン−特異的プロセッシングプロテアー
ゼにより最早認識されないが残りの分解経路により依然
として認識されうるように、ユビキチンのカルボキシ末
端付近のユビキチンのアミノ酸配列を変えることにより
達成することができる。ユビキチン−タンパク質融合体
の脱ユビキチン化の速度を減少させるこれらの方法及び
他の方法は、当業者により容易に確認されうる。
本発明の方法は、中でも、タンパク質の半減期を細胞
内で調節するために使用することができる。この能力が
有用な多くの例がある。例えば、遺伝子を細胞内で発現
させるために細胞に導入するとき、発現される生成物
は、特定の要求に依存して長い又は短い半減期となるよ
うにデザインすることができる。
一般に、短い半減期を有する不安定化されたタンパク
質は、タンパク質の細胞内レベルの調節をより受けやす
い。タンパク質の細胞内レベル及び活性を精密に調節で
きることは、生体外細胞培養による治療又は研究に有用
である。遺伝子治療では、例えば、遺伝子を細胞に導入
して、遺伝子欠陥又は異常を補償することができる。遺
伝子は誘発性プロモータの制御下に導入することができ
る。誘発は、遺伝子生産物の高められた発現をもたら
し、その結果細胞内により高いレベルの生産物をもたら
す。遺伝子が不安定なタンパク質をコード化するように
デザインされているならば、発現されたタンパク質の細
胞内濃度は、その合成の速度の後の減少にもつと迅速に
応答するであろう。その理由は、発現されたタンパク質
が細胞内に接続して残存しないからである。このように
して、挿入された遺伝子によりコード化されたタンパク
質の細胞内レベル及び／又は活性はより精密に制御する
ことができる。
本発明の方法は、表現されるべきマーカーに関連した
表現型に必要な時間を短縮することにより選択可能なマ
ーカーの用途を拡大するのに使用することもできる。こ
のために、マーカーによりコード化された生産物は、Ｎ
−末端規則に従ってそのアミノ末端を改変することによ
り不安定化させることができる。この方法では負の表現
型の選択を促進することができる。何故ならば、マーカ
ー遺伝子の生産物はマーカーをコード化している遺伝子
の機能が廃絶された後はより速く消えるからである。例
はチミジンキナーゼ（tk）遺伝子である。tk遺伝子は、
アミノ末端に適当な不安定化アミノ酸を導入することに
より安定性の低い酵素をコードするように工学的に作り
出すことができる。tk-表現型を生じる遺伝子突然変異
は細胞によってより速く表現されるであろう。何故なら
ば残留のtkはより速く分解するからである。これは、合
成されたtkをtk-型への形質転換の前に“希薄にしてし
まう”（“dilute out"）のにより多くの時間が必要で
ある場合に、ゆっくりと増殖する細胞において特に有用
となる。
Ｎ−末端規則に基づくタンパク質修飾の原理は、細胞
毒素のデザインにも使用することができる。タンパク質
細胞毒素は、それらの毒性作用が標的細胞に及ぼされた
後持続して存在しないようにＮ−末端規則経路により分
解可能な不安定なタンパク質としてデザインすることが
できる。毒素の寿命を減少させることは非標的細胞を殺
す可能性を減少させる。
分解のＮ−末端規則経路の発見は、Ｎ−末端規則経路
の必須の成分をコード化している遺伝子中に突然変異を
有する突然変異体細胞の開発を可能とする。例えば、永
久的に又は条件的に、短い寿命のタンパク質を有効に分
解することができない細胞を製造することができる。こ
れらの細胞は、普通は細胞内で不安定な所望のタンパク
質を製造するのに使用することができる。
本発明をＮ−末端規則の解明の下記の詳細な説明によ
り更に説明する。
方法 タンパク質配列決定 ub−Met−βgal（第3A図）をコード化しているpUB23
（第１図）を有するサッカロミセス・セレビシエ細胞
を、［35S］メチオニンで標識し、続いて抽出物を調製
し、下記の如くしてβgalの免疫沈降及び電気永動を行
った。湿潤ポリアクリルアミドゲルをオートラジオグラ
フィーに付し、βgalのバンドを切り出し、電気溶離し
たβgalをエドマン分解による６サイクルの放射化学配
列決定に付した。配列決定は、ハーバード大学のマイク
ロケミカル設備（MicroChem Facikity of Harvard Univ
ersity）においてダブリュ・レーン（W.Lane）により行
った。
特定部位突然変異誘発 pUB23（第１図）を、AccI、polIのクレノウ断片及びB
amHiで順次に処理した。XhoI部位を含む断片を精製し、
M13mp9ファージDNAの補充された（filled−in）HindIII
部位とBAMHI部位との間に挿入した。［ジェイ・メッシ
ング及びジェイ・ビエイラ、ジェネ19、263（198
2）］。特定部位突然変異誘発［エム・スミス、Ann．Re
v．Genet、19、423（1985）］は、galのMetコドンの
５′側に10個の塩基及び３′側に12個の塩基を含む合成
25残基オリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、ク
ラマー・ダブリュ等、ヌクレイク・アシッド・リサーチ
（Nucl.Acids.Res）．12、9441（1984）により記載され
た如くして行なわれた。総ての４つの塩基を合成中に元
のMetコドンの位置に存在させた。一次ファージプラー
クを、コドン変更の領域にまたがり（spanning）そして
元の配列にハイブリダイゼーションする12残基のオリゴ
ヌクレオチドプローブの使用により、ハイブリダイゼー
ション［ウッド・エヌ・アイ等、PNAS 82、1585（198
5）］によりスクリーニングした。予想されたサイズの
挿入断片（inserts）を含む非ハイブリダイゼーション
プラークをチェインターミネーター法により配列を決定
した。［サンガー・エフ等、PNAS 71 5463（197
7）］。所望の構築物をpUB23バックグラウンドに移入す
るために、突然変異体ファージの複製型分子（replicat
ive form）DNAをXhoI及びBamHIで消化しそしてプラスミ
ドpLGSD5−ATGの同じ消化体（digest）に付加させた
［第１図及びエル・グアランテ、メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods Enzymol）.,101、181（1983）
参照］。連結した混合物を使用して大腸菌株MC1061を形
質転換した。［エム・ジェイ・カサダバン及びエス・エ
ヌ・コーエン、ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオ
ロジー.,138179（1980）］目的のプラスミド（βgalの
オープン読み取り枠が復元されている）を含むコロニー
は、Ｘ−βgalプレート上の淡い青色により認識され
た。
パルス−チェイス実験 目的のプラスミドで形質転換された［エフ・シャーマ
ン等、メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス
（Methods in Yeast Genetics）コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、1981］菌株
BWG−9a−１（MAT his4 ura3 ade6）のサッカロミセス
・セレビシエ細胞を、２％ガラクトース、アミノ酸を含
まない0.67％酵母窒素塩基（ディフコ）、アデニン（10
μg/ml）及びメチオニンを含有するアミノ酸の培地で約
５のA600まで30℃で増殖させた（シャーマン・エフ等、
上記文献）。典型的には、5mlの培養物からの細胞を、
ミリポアマイクロタイター過プレートのウエルを通す
過により回収し、メチオニンに欠けた同じ培地でこの
フィルター上で数回洗浄し、１％ガラクトース0.3ml、5
0mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に再懸濁させた。次
いで［35S］メチオニン（50−100μCi）を30℃で５分間
加え、細胞を過により集めそして0.5mg/mlのシクロヘ
キシミドを含有する増殖培地0.4ml上に再懸濁させた。
資料（0.1ml）を指示された回数抜き取り、ガラスビー
ズ0.4mlに加えてロイペプチン、ペプスタチンＡ、アン
チパイン、アプロチニン及びキモスタチン（シグマ）
（各々20μg/ml）を含有する冷緩衝液Ａ（緩衝剤組成に
ついては下記参照）0.75mlに加えた。その直後、４℃で
約３分間渦巻きさせる（vortexing）ことにより破壊
し、抽出物を12,000gで３分間遠心分離しそして上澄液
中の酸に不溶性35Sの放射能を測定した。等量の酸不溶
性35Sを含む上澄液のアリクォートをβgalに対するモノ
クローナル抗体との免疫沈降のためにプロセッシングし
た。モル過剰の抗体（少なくとも10倍）を含む腹水を各
アリクォートに加え、その後４℃で２時間インキュベー
ションし、次いでタンパク質Ａ−セファロース（ファー
マシア）を加え、懸濁液を４℃で30分間揺動させながら
インキュベーションし、そして12,000gで１分間遠心分
離したタンパク質Ａ−セファロースペレットを0.1％ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む緩衝液Ａ（下記参
照）中で３回洗浄し、SDS、ジチオトレイトール（DTT）
含有電気泳動試料緩衝液［ユー・ケイ・レムリ、ネイチ
ャー227 680（1970）］に再懸濁させ、100℃で３分間加
熱し、そして12,000gで１分間遠心分離した。上澄液の
等しいアリクォートを７％不連続ポリアクリルアミド−
SDSゲル（15×15×0.15cm）中で電気永動に付し、次い
でフルオログラフィーに付した。幾つかの実験では、上
記プロトコルを使用しないで、SDSの存在下に細胞を直
接煮沸することにより抽出物を調製して、本質的に同じ
結果を得た。
大腸菌で製造したub−βgalタンパク質の分析 プラスミドpUB23（第１図及び第３図）を、ミニ細胞
生産性大腸菌株、DS410に導入した。［エヌ・ストーカ
ー等、転写及び翻訳：実際の方法（Transcription and
Translation:A practical Approach）ビー・デイ・ハー
ネス及びエス・ジェイ・ヒギンス編.,IRLプレス、オッ
クスフォード、1984、153頁］。ミニ細胞を製造しそし
てエヌ・ストーカー等の上記文献に記載の如くして［35
S］メチオニン（600Ci/ミリモル、アマーシャム）で36
℃で60分間標識した。
標識したミニ細胞を遠心分離し、２％SDS、10mMDTT、
10mMNa−HEPES（pH7.5）に再懸濁させ、100℃で３分間
加熱した。12,000gで１分間遠心分離の後、上澄液を緩
衝液Ａ（１％トライトンＸ−100、0.15MNaCl、5mMNa−E
DTA、50mMNa−HEPES、pH7.5）で20倍希釈し、続いてフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）及びＮ−
エチルマレイミドをそれぞれ0.5mM及び10mMとなるよう
に加えた。４℃で４時間の後、試料を、0.5mMPMSFを含
む緩衝液Ａに対して４℃で一夜透析しそして免疫沈降
（上記の如き）のために処理した。
酵母で生産したub−βgalタンパク質の分析 目的のプラスミドを有するサッカロミセス・セレビシ
エ細胞をウラシル欠損培地800mlで増殖させ、次いで回
収しそしてロイペプチン、ペプスタチンＡ、アンチパイ
ン、アプロチニン及びキモスタチン（各々３μg/ml）を
含む緩衝液Ａ中でガラスビーズで破壊した。抽出物を1
2,000gで３分間遠心分離した。上澄液に飽和硫酸アンモ
ニウムを57％の最終濃度となるように加えた。４℃で一
夜インキュベーションした後、沈降したタンパク質を2
3,000gで30分間の遠心分離により集めた。ペレットを、
プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液Ａに再溶解し
た。12,000gで３分間の清澄化の後、試料をアフィニテ
ィカラムに通した。このアフィニティカラムは、腹水
（galに対するモノクローナル抗体を含む）からのIgG画
分をAffi−Gel10（バイオラド）に架橋させることによ
り調製されたものである。架橋に使用したIgG画分は、
タンパク質Ａ−セファロースでのアフィニティクロマト
グラフィーにより腹水から精製された。トライトンＸ−
100に欠けた緩衝液Ａで洗浄した、抗体融合タンパク質
を0.25Mグリシン−HCl（pH2.6）で溶離した。溶離液を
直ぐに1MNa−HEPES（pH8.5）でpH7.5に調節し、次いでS
DS中に0.1％とした。試料をセントリコン（Centricon）
30（アミコン）での限外過により濃縮し、そして７％
不連続ポリアクリルアミド−SDSゲルでの電気泳動に付
した［ユー・ケイ・レムリ、ネイチャー（ロンドン）22
7、680（1970）］。タンパク質のニトロセルロースへの
エレクトロブロッティング及びユビキチンに対するペプ
チド媒介抗体（peptide−mediated antibody）によるイ
ムノブロット分析をピー・エス・スワードロウ、デイ・
ファインリー及びエー・ファルシャフスキー、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー（Analyt.Biochem）.156、
147（1986）に記載の如くして行った。エイ・ハース
（A.Haas）（ミルウォーキー医学校の大学）から得られ
たユビキチンに対する異なる抗体によって同じ結果が得
られた。
20種のUb−Ｘ−βgal融合タンパク質をコード化してい
る大腸菌発現ベクターの構築 pKKUb−Ｘ−βgalベクターの４種（Ub−MET−βgal、
Ub−Gln−βgal、Ub−Arg−βgal及びUb−Pro−βgalを
コード化しているベクター）を下記の如くして構築し
た。特定部位突然変異誘発［エム・スミス、Ann.Rev.Ge
net．19、423（1985）；テイ・マニアチス等.,“モレキ
ュラー・クローニング”（“Molecular Cloning”）、
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニ
ューヨーク.,1982;“分子生物学における最近のプロト
コル”（"Current Protocols in Molecular Biolog
y”）、エフ・エム・アウスベル等、（ウイリー・イン
ターサイエンス、ニューヨーク、1987］を使用して、酵
母発現ベクターpUB23（Ub−Met−βgalをコード化して
いるその誘導体（エイ・バチュメイル等、サイエンス
234、179（1986）中のユビキチン読み取り枠の第１コド
ンと第２コドンとの間に配列GTACを挿入した。この挿入
配列は、ベクターがKpnIで切断されそして末端がヤエナ
リ（mung bean）ヌクレアーゼでブラントされるとき、
ユビキチン読み取り枠の第２コドンが正確に上記断片の
末端の１つで開始するように位置付けられたKpnI部位を
作り出した。かくして、KpnI及びTthIIIIにより上記４
種のベクターの各々を消化し、続いてヤエナリヌクレア
ーゼで処理して、対応するUb−Ｘ−βgalコード化配列
を含むがユビキチン読み取り枠の第１（ATG）コドンに
欠けている４種の断片を生じた。これらの断片を、大腸
菌発現ベクターpKK233−２［イー・アマン及びジェイ・
ブロシウス、ジェネ 40、183（198）］中にクローニン
グした。このベークタpKK233−２は、それをNcoIで消化
しそしてPolIのクレノウ断片を使用して付着端（stagge
redends）を補充する（filling in）ことにより調製さ
れた。［エム・スミス、Ann.Rev.Genet．19、423（198
5）；テイ・マニアチス等.,“モレキュラー・クローニ
ング”（“Molecular Cloning”）、（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク.,198
2;“分子生物学における最近のプロトコル”（"Current
Protocols in Molecular Biology”）、エフ・エム・
アウスベル等、（ウイリー・インターサイエンス、ニュ
ーヨーク、1987］。この工程は、ベクターの調節可能な
Ptrcプロモーターの下流に最適に配置された、完全なUb
−Ｘ−βgal配列（この配列においては、ATGコドンはpK
K233−２ベクターにより供給された）を生成した。残り
の16のpKKUb−Ｘ−βgal発現ベクターを構築するため
に、pKKUb−Arg−βgalをSalI及びBamHIで消化した。pK
KUb−Arg−βgal中の二つのBamHI部位の一つは、ユビキ
チンコード化配列とβgalコード化配列との接合部に位
置しており、最初のpKK233−２ベクターに存在している
他方のBamHI部位［イー・アマン及びジェイ・ブロシウ
ス、ジェネ 40、183（1985）］は予備的構築段階で除
去された。小さなSalI/BamHI断片（Ptrcプロモーター、
完全なユビキチンコード化配列及びUb−βgal接合部に
おけるArgコドンを含む）を、M13mp9ベクター中にクロ
ーニングした「［エム・スミス、Ann.Rev.Genet．19、4
23（1985）；テイ・マニアチス等.,“モレキュラー・ク
ローニング”（“Molecular Cloning”）、（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨー
ク.,1982;“分子生物学における最近のプロトコル”
（"Current Protocols in Molecular Biology”）、エ
フ・エム・アウスベル等、（ウイリー・インターサイエ
ンス、ニューヨーク、1987、ェイ・メッシング及びジェ
イ・ビエイラ、ジェネ 19、263（1982）］。ユビキチ
ンコード化配列の一部とUb−βgal接合部のArgコドンを
含んだこの構築物のBstXI/BamHI断片を、16種の他の点
では同一の、そしてUb−Ｘ−βgalにおけるコドンのみ
が異なっているBstXI/BamHI断片［予め製造したM13mp9
をベースとする構築物、エイ・バチュメイル等、サイエ
ンス 234、179（1986）からの）と取り替えた。得られ
る16種のM13mp9をベースとする構築物をSalI及びBamHI
で処理し、そしてユビキチンコード化配列とUb−βgal
接合部における異なった単一のコドンを含む小さなSalI
/BamHI断片をpKKUb−Arg−βgalにクローニングバック
し、元のSalI/BamHI断片に取って替わり、残りの16種の
pKKUb−Ｘ−βgal発現ベクターを生成する。すべての場
合に、最終pKKUb−Ｘ−β構築物のUb−βgal接合部にコ
ード化されたアミノ酸のアイデンテイテイはM13にサブ
クローニングしそしてチェインターミネーター法により
ヌクレオチド配列決定することにより証明された［エム
・スミス、Ann.Rev.Genet．19、423（1985）；テイ・マ
ニアチス等.,“モレキュラー・クローニング”（“Mole
cular Cloning”）、（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、ニューヨーク.,1982;“分子生物学
における最近のプロトコル”（"Current Protocols in
Molecular Biology”）、エフ・エム・アウスベル等、
（ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク、198
7］。
大腸菌からの35S標識Ub−Ｘ−βgalタンパク質の精製 20種のpKKUb−Ｘ−βgal発現ベクターの１つを有する
大腸菌JM101細胞の一夜培養物をアンピシリン40μg/ml
を補充したルリア・ブロス（Luria broth）50ml中に希
釈し、細胞を37℃で約２時間振とうさせながら増殖させ
た。細胞を、4,000gで10分間の遠心分離により回収し、
M9緩衝液で２回洗浄し、グルコース（0.22％w/v）、チ
アミン（18μg/ml）、アンピシリン（40μg/ml）、0.5m
Mイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）及び10.5％（w
/v）メチオニンアッセイ培地（ディフコ）0.15mlを補充
したM9最小培地25mlに再懸濁させた。37℃で１時間振と
うさせながらインキュベーションした後、0.5−1.0MCi
の35S−トランスラベル（ICN:〜85％［35S］メチオニ
ン、〜15％［35S］システイン）を加えそして振とうを
５分間続けた。次いで未標識Ｌ−メチオニンを1mMとな
るように加え、振とうを更に10分間続けた。細胞を回収
し、M9緩衝液で２回洗浄し、25％（w/v）グルコース、5
0mMトリス−HCl（pH8.0）0.5mlに再懸濁させた。然る
後、0.25Mトリス−HCl（pH8.0）中のリゾチーム（10mg/
ml、シグマ）0.1mlを加え、混合物を０℃で５分間イン
キュベーションし、続いて0.5MNa−EDTA（pH8.0）0.1ml
を加えそして０℃で５分間更にインキュベーションし
た。次いで細胞懸濁液を溶菌溶液（H2O0.8ml、1Mトリス
−HCl（pH8.0）50μｌ、0.5MNa−EDTA（pH8.0）125μ
ｌ、10％（w/v）トライトンＸ−10010μｌ）に加え、穏
やかに混合した。溶解物（lysate）を40,000gで１時間
遠心分離し、記載されている［エイ・ウルマン、ジェ
ネ、29、27（1984）］アミノフェニルチオピラノガラク
トシド−アガロース（APTG−アガロース）でのアフィニ
ティクロマトグラフィーにより上澄液からUb−Ｘ−βga
lを精製した。ユビキチン−Ｘ−βgalを、10mM2−メル
カプトエタノール、0.1Mホウ酸ナトリウム（pH10.0）で
APTG−アガロースから溶離し、50％（v/v）グリセロー
ル、0.1mMEDTA、1mMジチオトレイトール（DTT）、40mM
トリス−HCl（pH7.5）に対して４℃で一夜透析し、そし
て同じ緩衝液中に−20℃で貯蔵した。対照実験は、上記
手順により精製したUb−Ｘ−βgalの一時的暴露（trans
ient exposure）は、４−６×104単位/mgの酵素活性及
び１−２×105cpm/μｇの比放射能で、0.5−1mgである
ことを示した。アンピシリンを有するルリア・ブロス中
での２時間の増殖の後、IPTGを0.5mgとなるように加え
そして細胞を回収及び溶菌の１時間以上前に増殖させた
ことを除いては、本質的に上記の如くして、未標識Ub−
Ｘ−βgalを調製した。
網状赤血球溶解物の調製及び試験タンパク質の分解のア
ッセイ フェニルヒドラジン処理したウサギからの洗浄した網
状赤血球をグリーン・ヘクタース（Green Hectares）
（ウィスコンシン州、オレゴン）から購入し、そして０
℃で一夜シッピングした（shipped）。網状赤血球を、
３−４容量の標準リン酸緩衝液（PBS）で３回洗浄した
（1000gで４℃で10分間遠心分離）。細胞内ATPを枯渇さ
せるために［ジェイ・エトリンガー及びエイ・ゴールド
バーグ、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエ
ー、74、54（1977）；、エー・ハーシュコ等、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー 77:1783（198
0）；ハーシュコ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、258、8206（1982）］、細胞を、0.2
mM2,4−ジニトロフェノール及び20mM2−デオキシグルコ
ースを含むクレブス−リンガーリン酸塩緩衝液（Krebs
−Ringerphosphate buffer）中で37℃にて90分間インキ
ュベーションし、次いでPBS中で３回洗浄した。ペレッ
ト化した網状赤血球を、1mMDTT1.5容量に再懸濁させる
ことにより０℃で溶解させた。０℃で〜10分後、試料を
80,000gで４℃で90分間遠心分離した。上澄液を除去
し、アリクォートに分け、液体窒素下に貯蔵した。一度
凍結したアリクォートのみをすべての実験で使用した。
特記しない限り、ATP枯渇網状赤血球抽出物は、解凍直
後に更に処理することなく使用た。いくらかの実験で
は、解凍した抽出物を、最初に、〜3kdの分子量カット
オフを有する透析管において1mMDTT、10mMトリス−HCl
（pH7.5）に対して４℃で一夜透析した。画分IIは、前
記した如きATP枯渇網状赤血球抽出物のDEAEクロマトグ
ラフィーにより調製し［デイ・フィンレイ及びエー・フ
ァルシャフスキー、トレンズ・イン・バイオケミカル・
サイエンス(Trends Biochem.Sci）．10、343（1985）；
エー・ハーシュコ及びエー・シーシャノバー、Progr.Nu
cl.Ac.Res.Mol.Biol．33、19（1986）；エス・ポントレ
モリ及びイー・メロニ、Annu.Rev.Biochem．55、455（1
986）；エム・レクスタイナー、Annu.Rev.Cell.Biol．
3、１（1987）；ジェイ・エス・ボンド及びピー・イー
・バトラー、Annu・Rev.Biochem．56、333（1987）；ジ
ェイ・エフ・ダイス、FASEB J．1、349（1987）；ジェ
イ・エトリンガー及びエイ・ゴールドバーグ、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー、74、54（197
7）；エー・ハーシュコ等、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユーエスエー77:1783（1980）；ハーシュコ
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、258、8206（1982）］、そして液体窒素下に貯蔵し
た。いずれもの画分IIの全網状赤血球抽出物中の試験タ
ンパク質の分解をアッセイスルための反応混合物は、
（最終濃度）５％（v/v）グリセロール、1mMDTT、５mMM
gCl2、50mMトリス−HCl（pH7.5）、70％（v/v）網状赤
血球抽出物（又は6mg/ml全タンパク質における画分I
I）、20mg/mlの［35S］Ub−Ｘ−βgal融合タンパク質、
及び存在する場合には、0.5mMATP及びATP−再生系（10m
Mクレアチンホスフェート、0.1mg/mlクレアチンホスホ
キナーゼ）を含有していた。反応混合物は下記の如くし
て製造した。ATP及びATP再生系を除いて完全な混合物を
37℃で10分間インキュベーションし、Ub−Ｘ−βgal融
合タンパク質の脱ユビキチン化を許容し、ATP及びATP再
生系を次いで加えて抽出物におけるATP依存性反応を開
始させそして37℃インキュベーションを続けた。ATP枯
渇抽出物との対照反応は、ATP及びATP再生系を省くこと
を除いては同じくして行った。125I標識したウシ血清ア
ルブミン、ニワトリリゾチーム及びサッカロミセス・セ
レビシエからのシトクロムｃ（シグマ、ミズーリー州、
サンルイスから購入しそしてクロラミンＴ法（エー・キ
ャノバー等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエ
スエー77、1365（1980））を使用して標識した）のATP
依存性分解を、ATP枯渇網状赤血球抽出物中で37℃で試
験タンパク質を10分間予備インキュベーションするのを
省くことを除いては、上記の如くしてアッセイした。試
験タンパク質の分解を追跡するために、アリクォートを
指示された時間に反応混合物から採取し、そして存在す
る５％TCA可溶性放射能をアッセイするか、又は後のフ
ルオログラフィーを伴ってSDS−PAGE［ユー・ケイ・レ
ムリ、ネイチャー227:680（1970）］（８％ポリアクリ
ルアミド、0.05ビスアクリルアミド、15×15×0.15cmゲ
ル）により分析した。
図面の詳細な説明 第１図は、ユビキチン−lacZ遺伝子融合体の構築を示
す、pUB2、即ち、pBR322をベースとするゲノムDNAクロ
ーン［イー・オズカイナーク等、ネイチャー、312、663
（1984）］は、フランキング領域（flanking regions）
（ぎざぎざの線）と共に酵母ユビキチンコード化配列
（オープンボックス）の６回の反復を含む。pUB2を、第
１ユビキチン反復から６塩基下流にBamHI部位を配置す
ることにより図に示された如く修飾した。これは、一つ
のユビキチン反復（single ubiquitin repeat）を発現
ベターpLGSD5−ATG［エル・ギャランティー、メソッズ
・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol）．101、1
81（1983）においてG2と呼ばれている］のlacZ遺伝子と
フレーム内融合体（in−frame fusion）（ヌクレオチド
配列決定により確かめられた）の構築を可能とした。用
語“２μm"は、２μｍサークルと呼ばれる酵母プラスミ
ドの複製起点及びフランキング配列を含むpLGSD−ATGの
領域を示す［エル・ギャランティー、上記文献参照］。
第3a図は、ユビキチン−βgal接合部付近の融合タンパ
ク質のアミノ酸配列を示す。
第２図は、βgalの生体内半減期がアミノ末端残基の
関数である事を示す。（レーンａ）pUB23を有する大腸
菌から単離されたミニ細胞、最初のub−lacZ融合体（第
１図及び第3B図）を36℃で60分間［35S］メチオニンで
標識し、その後述べられた如くしてβgalを分析した。
標識したミニ細胞SDS抽出物をβgalの免疫沈降の前に未
標識酵母SDS抽出物と一緒にした場合に同じ結果が得ら
れた。（レーンｂ）ub−Met−βgal（第3B図）をコード
化するpUB23（第１図）を有するサッカロミセス・セレ
ビシエ細胞を30℃で５分間［35S］メチオニンで標識
し、その後βgalを分析した。１−30分の［35Sメチオニ
ン標識期間の長さで、及びプロテアーゼインヒビターの
存在下に細胞の機械的破壊により又はSDS含有緩衝液中
で細胞を直接煮沸することにより生成された酵母抽出物
で、同じ結果が得られた。（レーンｃ）レーンａと同じ
であるが、βgalをコード化している対照プラスミドpLG
SD5（エル・ギャランティー、上記文献においてG1と呼
ばれる）を有する大腸菌細胞による。（レーンｄ−ｇ）
ub−Met−βgal（第3A図）をコード化するpUB23（第１
図）を有するサッカロミセス・セレビシエ細胞を、30℃
（レーンｄ）で５分間［35S］メチオニンで標識し、そ
の後10,30及び60分間（レーンｅ−ｇ）シクロヘキシミ
ドの存在下にチェイス（chase）、抽出、免疫沈降及び
βgalの分析を行った。（レーンｈ−ｊ）レーンｄ−ｆ
と同じであるが、ub−Ile−βgal（第3A図参照）によ
る。（レーンｋ−ｍ） レーンｈ−ｊと同じであるが、ub−Gln−βgalによ
る。（レーンｎ−ｑ） レーンｄ−ｇと同じであるが、ub−Leu−βgalによ
る。（レーンｒ−ｎ） レーンｄ−ｇと同じであるが、ub−Arg−βgalによ
る。記号:ori;分離ゲルの起点;ub,ユビキチン；βgal、
特定のアミノ末端残基を含むβgalタンパク質の電気泳
動バンド；この用語法においては、ub−Met−βgalのMe
t−βgal部分はβgalと呼ぶ。矢じり印は、明らかにLeu
−βgal及びArg−βgalのような或る割合の短い寿命のg
alタンパク質の生体内エンドプロテオリシス切断の結果
として形成されるβgalの代謝的に安定な約90kD分解生
産物を示す（レーンｎ−ｕ）。
第３図は、ユビキチン−βgal接合部におけるgalの変
更アミノ酸残基を示す。（Ａ）ub−Met−βgalをコード
化する最初のプラスミド、pUB23（第１図）を、上記の
如くして突然変異誘発させて、ub−gal接合部の元のMet
コドンATGをMet以外の19種類のアミノ酸を特定するコド
ンに転換させた。（第３図に示された突然変異誘発の最
初のラウンドは、可能な19種の代替物の内15種を生成し
た。残りの４種の代替物は後に生成した（表１参
照））。矢じり印はub−Pro−βgalを除く融合タンパク
質のすべてについて存在する発生初期融合タンパク質
（nascentfusion protein）における脱ユビキチン化生
体内切断の部位を示す（本文参照）。示された構築物の
すべては第2gal残基としてHisをコード化している。更
に、構築物のいくらか（ub−Met−His−Gly−βgal、ub
−Met−Gln−Gly−βgal、及びub−Met−Gln−His−Gly
−βgal、この最後の１つは挿入突然変異誘発により生
成された、表第３参照）においては、His又はGlnがユビ
キチン−βgal接合部のMetの後に続いており、対応する
βgalタンパク質の代謝安定性について識別できない結
果を伴う。（Ｂ）最初の融合タンパク質（第１図）であ
るub−Met−βgalの、ub−βgal接合部付近のアミノ酸
配列（一文字略号で表してある）。一文字アミノ酸略号
は以下のとおりである。Ａ、Ala;C、Cys;D、Asp;E、Gl
u;F、Phe;G、Gly;H、His;I、Ile;K、Lys;L、Leu;M、Me
t;N、Asn;P、Pro;Q、Gln;R、Arg;S、Ser;T、Thr;V、Va
l;W、Trp;Y、Tyr。
第４図はユビキチン−βgalは脱ユビキチン化されな
いと短い寿命であることを示す。（レーンａ−ｇ）Ｘが
各レーンの上部に示された残基であるub−Ｘ−βgal融
合タンパク質をコード化しているプラスミドを有するサ
ッカロミセス・セレビシエを、［35S］メチオニンによ
り30℃で５分間標識し、続いて抽出、免疫沈降及びβga
lの分析をおこなつた。これらのレーンのフルオログラ
フィー暴露は、第２図の同様なパターンについてのそれ
らより数倍長く、短い寿命のβgalタンパク質の多重ユ
ビキチン化を示している。（レーンh,i）パルス−チェ
イス実験（それぞれ、０分及び10分のチェイス）におけ
る多重ユビキチン化されたLeu−βgalタンパク質の“ラ
ダー”（ladder）を示し第２図のレーンn,oのフルオロ
グラフィー暴露。（レーンｊ）レーンａ−ｇと同じであ
るが、ub−Pro−βgalによる。（レーンｋ）レーンｊと
同じであるが、ub−Gln−βgalによる。（レーン１）レ
ーンｊと同じ。（レーンｍ−ｐ）ub−Pro−βgalをコー
ド化しているプラスミドを有するサッカロミセス・セレ
ビシエ細胞を、［35S］メチオニンにより30℃で５分間
標識し（レーンｍ）、続いて10,30及び60分間シクロヘ
キシミドの存在下にチェイスを行う（レーンｎ−ｐ）。
レーンｐの右側の上部の小さな矢印は、ub−Pro−βgal
の小さな割合が１時間のチェイスの後に依然として存在
しているub−Pro−βgalを示す。下部の小さな矢印は、
チェイスの間ゆっくりと蓄積しそして代謝的に安定な明
らかに脱ユビキチン化されたPro−βgalを示す。レーン
ｍの左手のドットは、使用された抗体によりいくらかの
実験で沈降される内因性酵母タンパク質を示す。角括弧
は、多重ユビキチン化されたβgal種（第５図参照）を
示す。他の記号は第２図の場合と同じである。
第５図は、ユビキチンを含む“ラダー”βgal種を示
す。（レーンａ）ub−Gln−βgalをコード化しているプ
ラスミドを有するサッカロミセス・セレビシエ細胞を増
殖させそして破壊し、抽出物を処理して、βgalに対す
る固定化抗体を有するカラムでのアフィニティクロマト
グラフィーによりβgalタンパク質を単離した。このよ
うにして得られたβgalタンパク質をポリアクリルアミ
ド−SDSゲル中で電気永動させ、ニトロセルロースに移
し、ユビキチンに対する抗体で探った。（レーンｂ）レ
ーンａと同じであるが、ub−Pro−βgalを用いた。（レ
ーンｃ）ｂと同じであるが、オートラジオグラフィー暴
露をより長くした。（レーンｄ）ub−Leu−βgalをコー
ド化しているプラスミドを有するサッカロミセス・セレ
ビシエ細胞を、［35S］メチオニンで５分間標識し、そ
の後βgalの抽出、免疫沈降及び電気泳動（第４図、レ
ーンｆの場合と同じ試料）を行った。角括弧は、ユビキ
チンに対する抗体で検出された多重ユビキチン化された
Gln−βgal種を示す。矢印は、ub−Pro−βgalのバンド
を示しており、最初の融合タンパク質はレーンｂ及びｃ
で見られる。矢じり印は、ub−Gln−βgal融合タンパク
質由来の脱ユビキチン化βgal（クーマシー染色又は代
謝標識により検出可能であるが、ユビキチンに対する抗
体により検出可能ではない）のバンドの位置を示す。
第６図は、原核細胞及び真核細胞の長い寿命の細胞内
タンパク質の両方共それらのアミノ末端に安定化アミノ
酸残基を有し、これに対して分泌されたタンパク質は相
補的バイアスを示す。
原核細胞（77種のタンパク質）及び真核細胞（131種
のタンパク質）からのブロックされていないアミノ末端
を有する208種の長い寿命の直接配列決定された細胞内
（非区画化）タンパク質は、Ｎ−末端規則により定義さ
れたようにそれらのアミノ末端残基の性質に従って三つ
の群に分配された。検討した長い寿命の細胞内タンパク
質のすべては、それらのアミノ末端に必ず安定化残基を
有する。パネルＢ−Ｄにおいては、243種の分泌された
真核細胞タンパク質（Ｂ）、37種の免疫グロブリンＬ鎖
及びＨ鎖（Ｃ）及び94種の分泌された真核細胞毒素
（Ｄ）について類似した線図が示されている。Ｃ及びＤ
のエントリーはＢのエントリーのサブセット（subset
s）である。Ｂ−Ｄのタンパク質については、列挙され
たアミノ末端は、帰属が可能である場合には、依然とし
て分泌細胞内に所在のタンパク質の最もプロセッシング
された形態に相当する。Ａ−Ｄのデータは、1981年以前
に入手可能な完全タンパク質配列の全体のセットから手
で収集された。最近のナショナル・バイオメディカル・
リサーチ・ファウンデーション（National Biomedical
Research Foundation）データベースを使用してタンパ
ク質アミノ末端をコンピュータの助けにより詳細且つ広
範な一覧表とした後、最近同じ結論に到達した。Asn、C
ys、His及びTrpのアミノ末端残基は収集から排除され
た。その理由は、対応するβgalタンパク質の半減期が
まだ知られていないからである（しかしながら、表１の
説明分参照）。同じタイプの最近の収集に該残基を含ま
せても（表１）、最初の結論は変わらない。アミノ末端
Proも又収集から除外されたけれども、Proはβgalのた
めの安定化残基であると思われるが（表１）、これは、
長い寿命の非区画化タンパク質のアミノ末端にProがし
ばしば存在していることと合致している。
第７図は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼとのユビ
キチン融合体の構築を示す。
第８図は、共通にDHFR部分を有しそしてDHFRに結合し
た特異的アミノ末端延長部のみが異なる、広い範囲の特
異的ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）ベースのタンパ
ク質構築物を示す。構造Ｉは最初のDHFR構築物である。
構造体IIは、βgalのアミノ末端（第３図参照）由来の4
0残基アミノ末端延長部を含む。構造体III−Ｖは、リシ
ン残基の11つ又は両方（一文字コードＫとして表されて
いる、第３図の説明分参照）がアルギニン残基（Ｒとし
て表された）により置き換えられている構造体IIの変異
体である。構造体Ｖ−Ｘは、βgal由来の延長部のカル
ボキシ末端半部において欠失が増加している構造体IIの
変異体である。構造体XI−XIIIは、βgal由来の延長部
のアミノ末端半部において欠失が増加している構造体II
の変異体である。構造体Ｉ−XIIIのアミノ末端の一文字
アミノ酸指示は、アミノ末端残基だけが異なるこれらの
タンパク質構築物の変異体を示す。これらの変異体は、
本明細書で述べたユビキチン−タンパク質融合方法の使
用により得られた（第３図参照）。構造体Ｉ−XIIIの各
々は、特定部位突然変異誘発及び当分野における最近の
標準的組換えDNA技術の他の方法を使用してDNAレベルで
構築された。これらのDNA構築物は、酵母サッカロミセ
ス・セレビシエに導入され、そして対応するタンパク質
Ｉ−XIIIの半減期（第８図の左欄）は、βgalについて
上記した方法及びDHFRに対するモノ特異的抗体を使用し
て直接決定された。
結果及び検討 発生したユビキチン−βgal融合タンパク質の迅速な生
体内脱ユビキチン化 ユビキチン部分のカルボキシ末端グリシンがタンパク
質の内部リシン残基のα−アミノ基にイソペプチド結合
を介して結合している分岐状ユビキチン複合体は、明ら
かに真核細胞中のユビキチン複合体の大半を構成する。
ユビキチンを標的タンパク質のアミノ末端α−アミノ基
に結合させて線状ユビキチン複合体を得ることは、化学
的にも実施可能である。エー・ハーシュコ等、PNAS US
A 81:7021（1984）参照。線状であろうとなかろうと、
ユビキチン−タンパク質融合体は、ユビキチンの翻訳後
の酵素的結合により生体内で合成され、このようなタン
パク質は、適当なキメラ遺伝子を構築しそしてそれらを
生体内で発現することによっても生産することができ
る。大腸菌のβgalに連結された酵母ユビキチンをコー
ド化しているこのような遺伝子の一つが第１図に示され
ている。
この遺伝子が大腸菌中で発現されると、得られるβga
l含有タンパク質は、対照βgalの見かけの分子量（appa
rent molecular mass）より大きい、キメラ遺伝子によ
りコード化されたタンパク質中のユビキチンの存在と合
致している値である約6kDの見かけの分子量を有する。
対照的に、同じ遺伝子が酵母中で発現されると、対応す
るβgalタンパク質は対照βgalから電気泳動により識別
することができる。この結果は、［35S］メチオニン標
識期間（１分乃至30分）の長さに無関係である。更に、
生体内標識されたゲル精製βgal（第２図、レーンｄ）
のエドマン分解により推定上のMet−βgal（半減期、t
1/2 20時間）中のアミノ末端残基の決定は、そのアミノ
末端に予想されるMet残基が存在すること（第3A図及び
表ｌ）を直接確証した。ユビキチンの最後のGly残基の
直ぐ後で融合タンパク質のユビキチン切断が起こるとい
う独立した証拠を下記に示す。酵母においては、発生初
期のユビキチン−βgal融合タンパク質を効率良く切断
して、脱ユビキチン化βgalを生じさせると我々は結論
する。大腸菌内に脱ユビキチン化反応が存在しないこと
は、原核細胞が真核細胞ユビキチン及びユビキチン特異
的酵素の両方に欠けていることを示す他のラインの証拠
と合致している。同時に、ユビキチンの機能的均等物が
バクテリア内に存在するが、それは真核細胞ユビキチン
のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なるという可能性
が残る。本発明は、真核細胞に見出だされるアミノ酸相
同体のようなユビキチンの極めて近縁のアミノ酸相同体
に当てはまるのみならず、バクテリア中に存在しうる機
能的相同体のようなユビキチンの機能的相同体にも当て
はまる。
キメラ遺伝子によりコード化されたユビキチン−βga
l接合部、Gly−Met（第１図及び第3B図参照）は、有効
に成熟ユビキチンにプロセッシングされるところのポリ
ユビキチン前駆体タンパク質中の隣接反復ユビキチン間
の接合部と同一である。かくして、まだ生化学的に特徴
付けされていない同じプロテアーゼが、ポリユビキチン
の成熟ユビキチンへの転化及び発生初期のユビキチン−
βgalタンパク質の脱ユビキチン化の両方を受け持って
いるらしい。もしそうであるならば、ユビキチン−βga
lの生体内脱ユビキチン化を抑制す（それによりβgalへ
の安定なユビキチン結合の代謝結果の分析を可能とす
る）１つの可能性のある方法は、ユビキチン−βgal接
合部（第3B図）におけるβgalのMet残基を他のアミノ酸
残基（第3A図）に転化することであろう。このような方
法の予想外の結果を以下に説明する。
βgalの生体内半減期はそのアミノ末端残基の関数で
ある。ユビキチン接合部（第3B図）におけるgalの元のM
et残基を特定するATGコドンを、特定部位突然変異誘発
により、19種の他のアミノ酸（第3A図及び表１参照）を
特定するコドンに転化した。これらの構築物は、ユビキ
チン−βgal接合部（第3A図）におけるβgalの第一コド
ンだけが異なる。このようにしてデザインされた16種の
プラスミドの各々を酵母に導入した後、生体内でパルス
標識した対応するβgalタンパク質を分析して下記の結
果が導かれた（第２図、第４図及び表１）。
１）一つの例外があるが（下記参照）、発生初期のユビ
キチン−galの有効な脱ユビキチン化は、ユビキチン−
βgal接合部におけるβgalのアミノ酸残基の性質に拘わ
りなく起こる。かくして、元のユビキチン−βgalタン
パク質をGly−Met接合部で切断する見掛け上ユビキチン
特異的プロテアーゼは、一般的に、接合部（第3A図及び
表１）におけるβgalの第一残基の性質に非感受性であ
る。この結果は、実際に、生体内で生産された同一のβ
galタンパク質のアミノ末端に異なるアミノ酸残基を露
出させることを可能とする。
２）このようにしてデザインされたβgalタンパク質の
生体内半減期は、βgalのアミノ末端に露出したアミノ
酸残基の性質に依存して、20時間以上から３分未満まで
変わる（第２図、第４図及び表１）。特に、アミノ末端
にMet、Ser,Ala、Thr,Val、Cys又はGlyを有する脱ユビ
キチン化βgalタンパク質は、20時間又はそれ以上の比
較的長い生体内半減期を有し（第２図、レーンｄ−ｇ及
び表１）、これは遺伝子がユビキチンの遺伝子に融合さ
れていない対照βgalの半減期と同様である。顕著に対
照的に、アミノ末端にArg、Lys、Phe、Leu、Asp又はTrp
を有するβgalタンパク質は、Arg−βgalの約２分乃至L
ys−βgal、Phe−βgal,Leu−βgal、Aap−βgal、Asn
−βgal及びTrp−βgalの約３分（第２図、レーンｎ−
ｕ、及び表１）という非常に短い半減期を有する。Gl
n、His又はTyrのアミノ末端残基を有するβgalタンパク
質の半減期は、約10分であるが（第２図、レーンｋ−
ｍ、及び表１）、アミノ末端Ile又はGluは、βgalに約3
0分の半減期を与える（第２図、レーンｈ−ｊ及び表
１）。これらの実験ではパルス−チェイス法と連続標識
法の両方を使用しそして同様な結果を得た。
個々のアミノ酸の組を、βgalのアミノ末端に露出さ
れるときβgalに与える半減期に関して並べることがで
きる。得られる規則（表１）は“Ｎ−末端規則”と呼
ぶ。
表１の説明 Ｎ−末端規則。酵母サッカロミセス・セレビシエ中の
βgalタンパク質の生体内半減期を、パルス−チェイス
法（短い寿命のβgal、下記参照）によるか、又は粗製
抽出物中のβgalの酵素活性を測定することにより決定
した。βgal活性の測定のために、ガラクトース含有培
地中で増殖している細胞を、ガラクトースに欠けており
且つ10％のグルコースを含有する他の点では同一の培地
に移した。30℃で少なくとも５時間更に増殖の後、グル
コースへの移動の前後の細胞当たりのβgal活性の割合
を各βgalタンパク質の各々について決定した。［融合
遺伝子（第１図及び第３図）のGALプロモーター駆動発
現はグルコース培地中では抑制される］。より短い寿命
のβgalタンパク質（t1/2 1時間）については、パルス
−チェイス法も使用した（第２図及び第４図）。パルス
−チェイス実験における［35S］メチオニンで標識した
βgalタンパク質の電気泳動バンドを、第２図及び第４
図のゲルと同様なシンチレーター含浸乾燥ゲルから切り
出し、そしてバンド中の35Sを決定した。短い寿命のβg
alタンパク質の生体内減衰は、チェイスのより後の（１
時間）時点で測定したとき分解の速度がより低いという
点で一次反応速度論から外れており、このより低い速度
は、シクロヘキシミドの時間依存性毒性効果又は生体内
分解プロセスの固有の特性を反映している。［サッカロ
ミセス・セレビシエにおける有効な短時間チェイスのた
めには、この生物における液胞の存在に関係したアミノ
酸プール平衡化の問題の故に、翻訳の阻止が必要であ
る］。下記した半減期の値はチェイスの最初の10分間で
決定された。いくつかのラインの証拠（第４図及び第６
図の説明参照）は、Proが安定化残基であることを示唆
する。記載されたアミノ酸の旋回半径（radii of gyrat
ion）は、エム・レビット、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジー（J.Mol.Biol)、104:59（1976）からのものであ
る。
ATP枯渇網状赤血球抽出物におけるub−Ｘ−βgal融合タ
ンパク質の脱ユビキチン化 上記の如くして大腸菌中で生産した20種の35S−標識U
b−Ｘ−βgalタンパク質の各々を、ATP枯渇ウサギ網状
赤血球から調製した抽出物に加え［エトリンガー等、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー、74、54
（1977）；ハーシュコ等、プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ユーエスエー77:1783（1980）；ハーシュコ等、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、25
8、8206（1982）］、そして加えたタンパク質の運命をS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）に
より追跡した。酵母中で同じユビキチン融合体で生体内
で観察されたように、網状赤血球抽出物中の見掛け上ユ
ビキチン特異的プロテアーゼは、加えたUb−Ｘ−βgal
融合タンパク質を脱ユビキチン化して、対応するＸ−β
gal試験タンパク質を生じさせた。ATP枯渇抽出物中の20
種のUb−Ｘ−βgalタンパク質のうち19種の脱ユビキチ
ン化は、37℃で５時間に90％以上完了した（表２）。酵
母及び網状赤血球の両方における一つの例外はUb−Pro
−βgalであり、これは、他のUb−Ｘ−βgalタンパク質
よりも約20倍以上遅く脱ユビキチン化された。
網状赤血球抽出物又は酵母細胞から再単離した脱ユビ
キチン化βgalタンパク質のアミノ酸配列決定（エドマ
ン分解による）は、試験したすべての場合に、プロテオ
リシス切断は正確にUb−βgal接合部で起こったことを
示した（表２）。配列決定は、いくらかのＸ−βgalタ
ンパク質のアミノ末端が特異的修飾を受けた（表２参
照）ことを示唆したが、これらの修飾はアミノ末端残基
Ｘ以外のプロテオリシス切断を伴わなかった。
脱ユビキチン化Ｘ−βgalタンパク質のすべては、ATP
枯渇網状赤血球抽出物中では、SDS−PAGE分析及び抽出
物中の酸可溶性放射能の無視できる生成から判定して、
代謝的に安定である。かくして、ATP枯渇網状赤血球抽
出物中のUb−Ｘ−βgal融合タンパク質のプレインキュ
ベーションは、アミノ末端残基Ｘだけが異なる20種のＸ
−βgal試験タンパク質を発生させることを可能とす
る。
ATP補充網状赤血球抽出物中のβgalタンパク質の半減期
は、βgalのアミノ末端残基の関数である。
20種のＸ−βgalタンパク質のすべてはATP枯渇網状赤
血球抽出物中では代謝的に安定であったが、それらの大
部分は抽出物にATPを添加すると短い寿命となる（表
２）。我々は、対応するＸ−βgalがATP補充抽出物中で
比較的長い寿命である（37℃で２時間に10％以下の分
解）ならば、アミノ末端残基を安定化性と呼び、抽出物
中での対応するＸ−βgalの分解が同じ条件下に15％を
越える（表２）ならば、不安定化性と呼ぶ。
いくつかのＸ−βgalタンパク質の分解の時間経過
は、再現可能な初期遅れ（initial lags）を示した。し
かしながら、時間経過の半対数プロットは、初期遅れの
後、ATP補充網状赤血球抽出物中のＸ−βgalの分解は、
少なくとも最初の２時間は一次反応速度論に従うことを
示しており、これは、抽出物中の異なるβgalタンパク
質の半減期を比較することにより、異なるＸ−βgalタ
ンパク質の分解を比較することを可能とする（表２）。
網状赤血球抽出物中のβgal半減期の範囲は、Gln−β
galの約50分からVal−βgalの約100時間まで２けた以上
の大きさにわたる（表２）。安定化アミノ末端残基を有
するＸ−βgalタンパク質の半減期は、Ile−βgalの約2
0時間からVal−βgalの約100時間までの範囲にある。網
状赤血球抽出物中の代謝的に不安定なＸ−βgalタンパ
ク質の半減期は同じ抽出物中での他のプロテオリシス基
質（ヨウ素化血清アルブミン、リゾチーム及びシトクロ
ムｃ）の半減期に匹敵しうる。これらの後者の試験タン
パク質は、網状赤血球抽出物中のユビキチン依存性タン
パク質分解の以前の研究に使用されている［フィンレイ
等、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス（Tr
ends Biochem.Sci）．10、343（1985）；エトリンガー
等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー、
74、54（1977）］。最近、これらのタンパク質の少なく
ともいくつかは、Ｎ−末端規則により定義されたよう
な、それらの不安定化アミノ末端残基の媒介による分解
の標的とされることが示された［ライス等、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m）、263:2693（1988）］ アミノ酸のアミノ末端位置付けは、酵母中で試験される
βgal半減期に対するその効果のために必須である。
特定部位突然変異誘発を使用いて、ユビキチン−βga
l接合部におけるβgalの第１コドンの間に“安定化”ア
ミノ酸（この実験では、Met残基）を特定するコドンを
挿入した（表３）。ユビキチン−βgal接合部において
他の安定化残基（Thr）又は種々の不安定化残基（Gln、
Lys及びArg）の前に安定化残基（Met）を挿入すると、
必ず長い寿命の脱ユビキチン化βgalを生じた（表
３）。更に、短い寿命であるのみならず脱ユビキチン化
に対して抵抗性でもある（第４図、レーンｊ−ｐ及び表
１）ユビキチン−Pro−βgalとは対照的に、ユビキチン
−Met−Pro−βgalは、生体内で有効に脱ユビキチン化
されて長い寿命のMet−Pro−βgalを生じる（表３）。
これらの結果は、アミノ酸残基のアイデンテイテイ及び
そのアミノ末端位置付け（多分遊離α−アミノ基の存
在）の両方共、βgal半減期に対するその効果のために
必須であることを示す。更に、これらの結果（表３）
は、融合タンパク質のユビキチン特異的切断がユビキチ
ンの最後のGly残基の直ぐ後で起こることを更に支持す
る（第3A図）。
アミノ酸のアミノ末端位置付けはβgal半減期に対す
るその効果のために必須である。挿入突然変異体は、Me
tコドンの後ろの多義性コドン（ambiguous codon）の
５′側に14塩基及び３′側に15塩基を含む32残基オリゴ
ヌクレオチド を使用したことを除いては、本質的に最初の組の突然変
異体について述べた如くして得られた。括弧内の塩基
は、配列中の位置16及び17における多義性を示す。対応
するβgalタンパク質の半減期は、表１の説明文に記載
の如くして決定した。
βgalの長い寿命の切断生成物は、短い寿命のβgalタン
パク質の減衰中に形成される。
短い寿命の（長い寿命のではない）βgalタンパク質
の電気泳動パターンは、特定の、約90kDのβgalの切断
生成物（第２図、レーンｎ−ｕ）を必ず含んでいる。こ
の切断生成物は、親のβgal種と違って、標識後の（チ
ェイス）期間中に蓄積する（第４図、レーンｍ−ｐ）。
90kDβgal断片は、パルス標識βgalの比較的小さな割合
の初期量を構成する。それにもかかわらず、その存在
は、生体内エンドプロテオリシス切断がタンパク質断片
をその短い寿命の親タンパク質の代謝運命から救助する
ことができることを、示唆している。単一タンパク質種
内の多重半減期が結果として生じる可能性は、天然には
短い寿命のタンパク質のデザインに利用されるかどうか
は後になってみないと分からない。
ユビキチン−βgalは、脱ユビキチン化されないと短い
寿命である。
生体内で脱ユビキチン化されない唯一のユビキチン−
βgal融合体（第４図、レーンｊ−ｐ）であるユビキチ
ン−Pro−βgalは、代謝的に安定なβgalタンパク質の
半減期の１％未満である（表１）約７分の半減期を有す
る（表１）。この結果の一つの解釈は、タンパク質アミ
ノ末端への代謝的に安定なユビキチン結合は受容体タン
パク質の分解をシグナルするのに十分であるということ
である。この解釈は、哺乳動物細胞中の短い寿命のタン
パク質のユビキチン化はそれらの分解のために必須であ
るという以前の生化学的証拠及び包括的証拠と合致す
る。同時に、ユビキチン−Pro−βgal以外のすべてのユ
ビキチン−βgal融合タンパク質は生体内で迅速に脱ユ
ビキチン化される（表１）。かくして、タンパク質の翻
訳後のアミノ末端ユビキチン化は、生体内での分解のた
めにタンパク質を指示する（designate）最初の認識又
はコミットメント工程に関与しない可能性がある。翻訳
後アミノ末端ユビキチン化（もしそれが生体内で実際に
起こっているならば）が分解経路の後の段階のために必
須であるかどうかは、後に決定されるべきことである。
以前に生体外実験は、プロテオリシス基質のアミノ末端
の選択的な（preferential）化学的修飾は、生体外ユビ
キチン依存性プロテオリシス系におけるそれらの分解を
抑制することを示した。これらのデータに基づいて、タ
ンパク質のアミノ末端ユビキチン化はそれらの分解のた
めに必須であることが提唱された。同じ結果の別の解釈
は、タンパク質のアミノ末端の化学的プロッキングが、
初期段階が必ずしもユビキチン依存性ではないところの
“Ｎ−末端規則”経路によるタンパク質のアミノ末端残
基の認識を妨害するということである。
短い寿命のβgalタンパク質の生体内で多重にユビキチ
ン化される パルス−チェイスフルオログラムの過剰暴露（overex
posures）（第２図）は、脱ユビキチン化された短い寿
命のβgalタンパク質の主バンドは、４−7kDの間隔で不
規則に間隔を置いたより大きい分子量のβgal含有バン
ドの“ラダー”と共存している（第４図、レーンｃ−
ｇ）ことを示す。このような大きい種は、長い寿命のβ
galタンパク質のフルオログラムを同様に過剰暴露する
ときには現れない（第４図、レーンａ及びｂ）。βgal
に対する抗体及びユビキチンに対する抗体の両方による
免疫学的分析は、この“ラダー”βgal種がユビキチン
を含有することを示す（第５図）。
選択的分解経路のモデル 天然の又は工学的に作り出されたユビキチン融合タン
パク質（第１図及び表１）を例外として、発生初期のタ
ンパク質は明らかにユビキチン部分に欠けている。発生
初期の非区画化タンパク質の生体内アミノ末端プロセッ
シングは、アミノ末端ペプチダーゼの作用により成熟ア
ミノ末端を発生する。このアミノ末端ペプチダーゼの基
質特異性は部分的に特徴付けされている。［ツナサワ・
エス等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem).260 5382（1985）参照；ボイセル
・ジェイ・ピー等、PNAS USA 82、8448（1985）参
照］。我々は、このようにして発生したアミノ末端は
“Ｎ−末端読み取り”酵素により認識されるということ
を示唆する。一つの特定のモデルは、タンパク質分子の
アミノ末端残基が、確率的に作用する酵素により認識さ
れる結果として、タンパク質分子を分解するようにコミ
ットメントがなされ、この酵素がこの標的のアミノ末端
で“クランピングする”（“clamping"）確率はＮ−末
端規則により決定される（表１）ということである。一
度コミットメントがなされると、それに続いて標的タン
パク質の高度にプロセッシブなユビキチン化がなされ、
該標的タンパク質は、βgalの場合には、βgalの分子当
たり15以上のユビキチン部分に結合する（第４図、レー
ンｃ−ｇ及び第５図）。多重ユビキチン化された標的分
子は次いで“下流”酵素（１）により分解される。標的
のユビキチン部分はこの酵素のための認識シグナル又は
変性手段（denaturation or unfolding devices）また
はその両方として作用する。
ユビキチン含有“ラダー”βgal種（第４図、レーン
ｃ−ｌ及び第５図）は、明らかに、βgal中の内部リシ
ン残基のα−アミノ基に結合した分岐状ユビキチン部分
から成る。驚くべきことに、ユビキチン−Pro−βgal由
来の“ラダー”βgal種は、発生初期融合タンパク質か
らアミノ末端ユビキチンが切断されているβgalの類似
種から電気泳動では区別できない（第４図、レーンｊ−
ｉ及び第５図）。電気泳動で区別できないユビキチン化
βgal種が実際に構造的に相同性であるならば、これら
の結果は二つの替わりうるモデルと適合する。即ち、こ
のモデルでは、最初のユビキチンがβgalに分岐状結合
した直後、分岐状ユビキチン化ユビキチン−Pro−βgal
はアミノ末端脱ユビキチン化をうけるか、又はアミノ末
端ユビキチン部分に欠けている類似のβgal種がそれを
再び獲得する。この多義性の実験的解決は、タンパク質
の翻訳後のアミノ末端ユビキチン化（もしそれが生体内
で起こるならば）は選択的タンパク質代謝回転（turnov
er）において重要な役割を果たすかどうかを決定するか
も知れない。
原核細胞及び真核細胞タンパク質の両方共Ｎ−末端規
則に従うようにみえるけれども（下記参照）、バクテリ
アは明らかにユビキチン系を欠いている。かくして、仮
想的Ｎ−末端認識タンパク質が、残りの選択的分解経路
よりも強く原核細胞と真核細胞とに保存されている可能
性がある。興味深いことに、生体外でユビキチン結合化
酵素（ubiquitin−conjugating enzyme）によるプロテ
オリシス基質のユビキチン化のために存在することが必
要な哺乳動物タンパク質E3の性質は、それがＮ−末端認
識タンパク質の成分であることと合致している。
Ｎ−末端規則及び細胞内タンパク質の公知のアミノ末端 原核細胞及び真核細胞の両方からの代謝的に安定な非
区画化タンパク質のブロックされていないアミノ末端残
基は、もっぱら安定化クラス（Met、Ser,Ala、Gly、Th
r、Val）である（第6A図）、即ち、βgalに長い生体内
半減期を与える（表１）クラスである。成熟アミノ末端
が知られている一つの短い寿命の細胞内タンパク質は、
λファージのcIIタンパク質である。このタンパク質
は、λが溶菌的に増殖するか又は感染細胞に溶原化する
かを決定するトリガーの中心成分である。［ワイ・エス
・ホー、デイ・ウルフ、エム・ローゼンバーグ、遺伝子
発現の調節（Regulation of Gene Expression)、アイ・
ブース、及びシー・ヒギンス編、（ケンブリッジ・ユニ
バーシティ・フプレス、ロンドン、1986）79頁；エフメ
バヌエット、エム・エイ・ホイト、エル・マクファーレ
ン、エイチ・エコルス、アイ・ヘルスコビッツ、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l)、187、213（1986）；エム・エー・ホイット、デイ・
エム・ナイト、エー・ダス、エイチ・アイ・ミラー、イ
ー・エコルス、セル31、565（1982）；ケイ・ナスミ
ス、ネイチャー（ロンドン）320、670（1983）］。λ感
染大腸菌中のcIIの半減期は３分以下である。印象深い
ことに、cIIの成熟アミノ末端は、Ｎ−末端規則におけ
る最も不安定化性の残基Arg（表１）で始まる［ホー・
ワイ・ダブリュ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、257、9128（1982）］。
不安定化アミノ酸は疎水性であるか、非荷電親水性で
あるか又は荷電しているが、それらは、Metを除いて安
定化アミノ酸のいずれよりも大きい旋回半径を有する
（表１）という性質を共有している。
区画化されたタンパク質中のアミノ末端残基は、主とし
て不安定化クラスである。
第６図は、長い寿命の非区画化細胞内タンパク質
（Ａ）中のアミノ末端残基の選択と分泌されたタンパク
質（Ｂ）のような区画化されたタンパク質、これらの多
くも又それぞれ細胞外区画において長い寿命である、の
アミノ末端残基の選択との顕著な差を示す。この発見の
一つの含蓄された意味は、Ｎ−末端規則に従って作動す
る一つの細胞内分解経路が、細胞内タンパク質の生体内
半減期の多様性と、細胞内空間に異様に（aberrantly）
導入される区画化タンパク質の選択的破壊の両方を受け
持つことができるということである。いくつかの間違っ
て区画化された（miscompartmetalized）タンパク質
は、他のものよりも細胞に対して有害であることがあ
る。故に、分泌された真核細胞毒素が、分泌されたタン
パク質の一般的母集団（general population）よりもし
ばしば強い不安定化残基（Arg、Lys、Leu,Phe、Asp）を
それらのアミノ末端に含む（第６図、パネルＢ−Ｄ）こ
とは興味深い。
上記の考察は、小胞体及びゴルジ体の内腔及び細胞外
空間のような細胞のトポロジー的外側がＮ−末端規則経
路に類似した分解経路を有するものとするならば、それ
らは、細胞の内側で不安定化性であるアミノ末端残基が
ここでは安定化性残基でありそして又その逆も成り立つ
Ｎ−末端規則の逆転したバージョンに基づくことがあり
うるであろうということも示唆している。かくして、本
発明の方法は、分泌タンパク質を包含する区画化タンパ
ク質の代謝安定性及び他の性質を取り扱うのに有用であ
る。
長い寿命のタンパク質の回転におけるＮ−末端規則経路
の可能な役割 終わりから２番目の不安定化残基（表１）を有する長
い寿命の細胞内タンパク質は、一般に、それらの最初の
アミノ末端メチオニン残基を保持している。アミノ末端
プロセッシングを受ける長い寿命の細胞内タンパク質の
アミノ末端残基は、常に安定化性クラスである（表
１）。長い寿命のタンパク質の回転においてＮ−末端規
則経路が関係する興味ある可能性は、長い寿命のタンパ
ク質の生体内分解が、不安定化残基を露出させる遅いア
ミノペプチダーゼ切断、及びそれに続くＮ−末端規則経
路による迅速な分解である可能があるということであ
る。分解速度の微調整（fine−tuning）は、この場合に
は、Ｎ−末端規則に従う残基の不安定化能力の関数であ
るよりはむしろ、不安定化残基を露出させるアミノペプ
チダーゼ切断の速度の関数であることに留意されたい。
短い寿命の及び損傷されたタンパク質のＮ−末端規則及
び選択的分解 生体内での選択的分解のために長い寿命であるが損傷
したタンパク質を標的とするポリペプチド鎖折りたたみ
パターンの認識又は局部的な化学的特徴の認識は、Ｎ−
末端規則により直接媒介されていそうもない。その代わ
りに、特異的プロテアーゼ（DNAの特定の傷害を認識す
るヌクレアーゼに機能が類似した）が、標的タンパク質
を切断して、切断物の二つの生成物の一つのアミノ末端
に不安定化残基を露出させるということを我々は示唆す
る。このモデルの一つの検証可能な予想は、分解経路の
最初の切断生成物がそれらのＮ−末端に不安定化残基を
有するべきであるということである。初期タンパク質切
断の生成物のアミノ末端における不安定化残基の優先的
な露出は、関与したプロテアーゼの固有の特異性による
か、又は単に大多数のアミノ酸が不安定化性クラスに属
する（表１）ということになる。更に、タンパク質の初
期切断は、その元のコンフォーメイションの様相を不安
定化し、かくして更なる内部切断の確率を増加させると
予想される。タンパク質の初期切断生成物がもっぱらＮ
−末端規則経路により分解されるか又は追加の内部切断
により更にプロセッシングされるかどうかは、初期切断
生成物のアミノ末端における不安定化残基の露出及び内
部切断の導入の相対的速度の如き幾つかのファクターに
依存するであろう。このモデルでは、代謝的に不安定な
タンパク質を、化学的に損傷され、終結が早すぎた、不
適当に折りたたまれた及び間違って区画化されたタンパ
ク質から、本来の多重サブユニットの集合体に組み立て
ることができないタンパク質に、そして最終的には生体
内で短い寿命の他の点では正常なタンパク質に、分解す
るために必須であるべきである。かくして、タンパク質
の代謝不安定性は、そのアミノ末端における不安定化残
基の露出により媒介されるのみならず、切断生成物のア
ミノ末端に不安定化残基を露出させるプロテオリシス切
断をもたらすそのポリペプチド鎖の局部的なコンフォー
メーションの特徴及び化学的特徴によっても媒介されう
る。
所定のタンパク質について、その生体内半減期を調節
するのにＮ−末端規則の他に種々のファクターを組み合
わせることができる。このようなファクターの中でも、
タンパク質のアミノ末端のフレキシビリティ及びアクセ
シビリティ［ソーントン・ジェイ・エム、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー．167、443（198
3）］、アセチル基のような化学的ブロック性のアミノ
末端基の存在、アミノ末端近くのユビキチン化可能なリ
シン残基の分布、及びカルボキシ末端の構造の如き他の
変数がある。多重サブユニットタンパク質のアミノ末端
領域はサブユニット間の境界に関与しているので、［ソ
ーントン・ジェイ・エム、及びシバンダ・ビー・エル、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー．16
7、443（1983）］、タンパク質の四次構造も、生体内で
のタンパク質半減期に対するＮ−末端規則経路の効果を
調節すると予想される他のパラメーターである。最後に
上記に示唆されたように、Ｎ−末端規則経路は、分解の
ための標的としてのその最初の認識がそれらのアミノ末
端における構造とは無関係であるところのタンパク質の
分解のためにも必須でありうる。
タンパク質のアミノ末端へのアミノ酸の翻訳後の付加の
機能的意義 バクテリア及び真核細胞の両方において、異常なクラ
スの酵素、即ち、生体外で受容体タンパク質の成熟アミ
ノ末端への特定のアミノ酸の結合を触媒するアミノアシ
ル−トランスファーRNA−タンパク質トランスフェラー
ゼが存在することは多年にわたり知られてきた［アール
・エル・ソッファー、転位RNA:生物学的面（Transfer R
NA:Biological Aspects）、デイ・ソール、ジェイ・エ
ヌ・アベルソン、ピー・アール・シンメル編（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨー
ク、コールド・スプリング・ハーバー、1980）493頁；
シー・ドイッチ、メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods Enzymol)．106、198（1984）；エー・カジ、
エイチ・カジ、ジー・デー・ノベリ、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー．240、1185（196
5）］。生体内でのタンパク質へのアミノ酸の翻訳後付
加は、例えば、神経細胞の軸索への物理的傷害後の、ス
トレスを受けている組織又は再生組織で劇的に速くなる
［エス・シャイネーアスワル、アール・ブイ・リチオ、
ジー・シャクラボーティ、エヌ・エー・インゴリア、サ
イエンス231、603（1986）；エヌ・エー・インゴリア
等、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J.Neuros
ci）、3、2463（1983）］。Ｎ−末端規則は、この現象
の説明を与える。細胞の生理学的状態の変化により要求
されうる他の点では損傷されていない長い寿命のタンパ
ク質の代謝安定性の選択的変化は、生体内での標的タン
パク質へのアミノ末端への不安定化アミノ酸の翻訳後付
加により引き起こされるということを我々は示唆する。
注意を引くことに、タンパク質へのアミノ酸の翻訳後付
加の公知の反応［アール・エル・ソッファー、転位RNA:
生物学的面（Transfer RNA:Biological Aspects)、デイ
・ソール、ジェイ・エス・アベルソン、ピー・アール・
シンメル編（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバ
ー、1980）493頁；シー・ドイッチ、メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Methods Enzymol)．106、198（198
4）；エー・カジ、エイチ・カジ、ジー・デー・ノベ
リ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー．240、1185（1965）；エス・シャイネーアスワル、
アール・ブイ・リチオ、ジー・シャクラボーティ、エヌ
・エー・インゴリア、サイエンス231、603（1986）；エ
ヌ・エー・インゴリア等、ジャーナル・オブ・ニューロ
サイエンス（J.Neurosci）、3、2463（1983）］は、Ｎ
−末端規則に従って不安定化性である（表１）アミノ酸
（Arg、Lys、Leu、Phe及びTyr）が大きく関与してい
る。タンパク質への不安定化アミノ酸の付加が起こると
予想されうる生理学的状態は、細胞サイクルへの入り口
及び細胞サイルからの出口、化学的又は物理的ストレス
に対する応答、及び赤血球分化及び精子形成の如き特異
的分化現象が包含され、これらにおいては、或る割合の
前以て存在している長い寿命の細胞内タンパク質が選択
的に分解される。
哺乳動物網状赤血球からのユビキチン依存性系におけ
る或るプロテオリシス基質の生体外分解は、或る種のア
ミノアシル−tRNAsの存在に依存することが示された
［フェルバー・エス及びシーシャノバー、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー．2613128（198
6）］。この現象も又プロテオリシス基質のアミノ末端
への特異的不安定化アミノ酸の翻訳後付加の必要を反映
しているということを我々は示唆する。問題の初期プロ
テオリシス基質は、Asp又はGluのアミノ末端残基を有し
ており、これらの両方共Ｎ−末端規則に従って不安定化
性である（表１）。これは、タンパク質中の或るアミノ
末端残基はそれ自体直接不安定化性であるのではなく
て、他の不安定化残基に結合できる能力によってのみ不
安定化性であるという興味深い且つ検証できる可能性を
提起する。
ジヒドロ葉酸とのユビキチン融合体 原子分解能（atomic resolution）でその構造が知ら
れているモノマー〜20−kdタンパク質である、マウスジ
ヒドロ葉酸レダクターゼと共に構築されたUb融合体の組
において、“天然の"DHFRの熟成アミノ末端は、採用し
た構築経路（第７図）により７残基延長される。生体内
で発生初期ユビキチン−DHFR融合タンパク質からUbの切
断の後、脱ユビキチン化DHFRタンパク質は、それらのア
ミノ末端残基だけが異なる。これらの構築物は、βgal
試験タンパク質（第３図）の組に類似している。予想さ
れるように、Ｎ−末端規則（表１）に従って安定化性で
あるこれらのアミノ末端残基を有するDHFRタンパク質
は、酵母中で長い寿命である（第７図及び示されていな
いデータ）。他の点では同一のDHFRタンパク質のアミノ
末端におけるＮ−末端規則に従って不安定化性である残
基の存在は、このタンパク質を生体内で不安定化するけ
れども、不安定化の程度は、類似のデザイン（表１）の
βgalの結果に比較して小さい（第7A図）これらの発見
の機械論的意義を述べるために、βgalの40残基アミノ
末端領域を元のDHFRのアミノ末端の上流に配置した（第
７図）。このβgal由来の延長部が続いている不安定化
残基を有するDHFRタンパク質は、このβgal特異的アミ
ノ末端延長部に欠けている他の点では同一のDHFRタンパ
ク質とは顕著に対照的に、それらの不安定なβgal対応
物とほぼ同じく生体内で短い寿命である（第7B図及び示
されていないデータ；第7A図参照）。更に、アミノ末端
に安定化残基を有する前記延長部を持つDHFRタンパク質
は、生体内で長い寿命である（第7B図）。この後者の結
果は、βgal特異的延長部はそれ自体は、不安定化アミ
ノ末端残基の不存在下では、DHFRに短い半減期を与えな
いことを証明する。これらの発見は、βgal特異的延長
部に欠けているいるか又はそれを含む（そして同一の不
安定化アミノ末端残基を有する）DHFRの半減期間の顕著
な差の理由は、これらのタンパク質中のアミノ末端標的
化要素の差によるものであり、DHFRとβgalの全体の構
造間の差によるものではないことも示す。
DHFRが、元の40残基の延長部の代わりに26残基のβga
l由来のアミノ末端延長部とぴったり合う場合には、得
られるタンパク質のアミノ末端残基の性質に対する該得
られるタンパク質の生体内半減期の依存性は、元のDHFR
のそれと36残基のβgal由来の延長部を有するDHFRのそ
れとの中間である（第7C図；第7C図参照）。かくして、
元のβgal特異的延長部の効果に必要な配列は、延長部
内の短い範囲（short stretch）に制限されるのではな
くて、延長部の全長にわたり分布している。これらの洞
察は、完全なアミノ末端分解シグナルは、アミノ末端ア
ミノ酸残基により表される決定要素に加えて別個の決定
要素を含むことを示す。この第二決定要素をより詳細に
述べるために、βgal由来の延長部の種々の変異体及び
安定化又は不安定化アミノ末端残基を有する、多数の他
の点では同一のDHFRベースのタンパク質を酵母サッカロ
ミセス・セレビシエ中で発現させそしてそれらの半減期
を決定した（第８図）。第８図に示されたデータからの
第一の結論は、βgal延長部に存在する２個のリシン
（Ｋ）残基は、それ自身はタンパク質を代謝不安定化性
としないけれども、試験タンパク質に対してＮ−末端規
則に対する感受性を与えるためには絶対に必須であると
いうことである。実際に、２個のリシン残基の丁度１個
を同様に荷電したアルギニン（Ｒ）残基に転換すると、
半減期がアミノ末端残基の強い関数であるタンパク質が
依然として得られるが（第８図の構造体II−IV参照）、
両方のリシン残基アルギニン残基に転換すると、半減期
がアミノ末端残基の性質に本質的に非感受性である長い
寿命のタンパク質が得られる（第８図の構造体Ｖ参
照）。同時に、リシン残基は、ユビキチンのカルボキシ
末端に翻訳後に結合されうるタンパク質中の唯一のアミ
ノ酸残基であり、この結合により分岐状ユビキチン−タ
ンパク質結合体が形成される。印象深いことに、第８図
に示されたタイプ多重ユビキチン化された短い寿命のタ
ンパク質中のユビキチン部分の位置の我々が行った直後
の決定によれば、試験タンパク質の所与の分子に結合し
た多重ユビキチン部分のすべては、完全アミノ末端分解
シグナルの必須の構成部分であることが遺伝子的方法に
より上記に同定された２個のリシン残基の一つに結合し
た分岐状Ub−Ub構造に存在しているということが示され
た。それでは、残りのDHFR試験タンパク質中の多数の他
のリシン残基から上記のリシン残基（構造体II−IV）を
何が識別するか？。アミノ末端分解シグナルの第二決定
要素としてのリシン残基の独特な役割に対する解決の糸
口は、我々の研究で使用した元の発現ベクターのデザイ
ンにより（第１図参照）、我々のβgal試験タンパク質
は、lacI遺伝子によりコード化されたlacリプレッサー
の内部配列由来の45残基アミノ末端延長部を有するとい
うことにより与えられる。かくして、上記した“βgal
由来の”アミノ末端延長部（第７図及び第８図）は、野
性型βgalのアミノ末端配列由来のものではなくて、我
々のβgal試験タンパク質のアミノ末端に存在する無関
係の配列由来のものである。これらのβgalのアミノ末
端におけるlacリプレッサー特異的延長部は、野性型βg
alのアミノ末端領域よりは無秩序である（セグメント可
動性）らしい。もしそうであるとするならば、この延長
部は、それ自体はβgalを代謝的に不安定化しないが、
βgalの半減期のそのアミノ末端残基の性質に対する観
察された極度の依存性（表１）を可能とし、そしてそれ
により、後からの考察では、Ｎ−末端規則の発見を大い
に促進した。βgal延長部の無秩序の（セグメント可動
性）状態は、試験タンパク質（第８図）の空間的に整然
とした（ordered）DHFR部分中のリシン残基に対する延
長部内のリシン残基の独特の性質に対する説明を与え
る。かくして、これ及び関連した証拠の最も簡単な解釈
は、完全なアミノ末端分解シグナルは、一つではなくて
二つの別個の決定要素より成り、その各々はタンパク質
を代謝的に不安定化するのに必要ではあるが、それ自体
十分ではないということでる。本願の最初の部分で述べ
た一つの決定要素は、タンパク質のアミノ末端残基であ
る。直ぐ上で述べた第二の決定要素は、特定の内部リシ
ン残基である。第８図のデータ及び上記の考察により示
されたように、この重要なリシン残基の第二決定要素と
して作用する能力は、リシン残基を取り囲んでいる独特
のアミノ酸配列とは相当な程度に無関係である。その代
わりに、重要なリシン残基の必須の特徴には、タンパク
質のアミノ末端へのその空間的近接が包含される。
均等物 当業者は、本明細書で述べた本発明の特定の態様に対
して多くの均等物をルーチンな実験を行うだけで認識又
は確認することができるであろう。このような均等物は
下記の請求の範囲に包含されることを意図するものであ
る。
なお、本発明の主たる特徴及び態様を示せば、次のと
おりである。
1.タンパク質分解のＮ−末端規則に従って安定化クラス
又は不安定化クラスのメチオニン以外の所定のアミノ酸
のアミノ末端に有しているタンパク質を、生体内で生成
させることを特徴とする細胞内タンパク質の代謝安定性
を調節する方法。
2.不安定化クラスのメチオニン以外の所定のアミノ末端
アミノ酸を有するタンパク質を、生体内で生成させるこ
とを特徴とする細胞内タンパク質を代謝不安定化させる
方法。
3.不安定化クラスのアミノ酸が、イソロイシン、グルタ
ミン酸、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、ロ
イシン、アスパラギン酸、リシン又はアルギニンから成
る群より選ばれる上記第２項記載の方法。
4.哺乳動物細胞中の不安定化クラスのアミノ酸が、アル
ギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ロイ
シン、トリプトファン、アラニン、セリン、トレオニ
ン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、シス
テイン又はアスパラギンから成る群より選ばれる上記第
２項記載の方法。
5.タンパク質のアミノ末端領域が、タンパク質分解のＮ
−末端規則に従う完全なアミノ末端分解シグナルの第二
決定要素を与えるのに十分に該タンパク質のアミノ末端
に空間的に近接している１個又はそれより多くのリシン
残基を有する構造を含んで成る上記第３項記載の方法。
6.野性型対応タンパク質よりも多かれ少なかれ代謝安定
性であるタンパク質を生成させる方法であって、該野性
型タンパク質のアミノ末端に、タンパク質分解のＮ−末
端規則に従って安定化クラス又は不安定化クラスのメチ
オニン以外の所定のアミノ酸を生体内で導入して、該タ
ンパク質のアミノ末端に安定化アミノ酸又は不安定化ア
ミノ酸を有する修飾されたタンパク質を生成させること
を特徴とする方法。
7.該タンパク質を、そのアミノ末端に結合したマスキン
グタンパク質を含有する融合タンパク質として生成さ
せ、該マスキングタンパク質が、該修飾されたタンパク
質のアミノ末端との接合部においてプロテオリシスによ
り切断可能である上記第６項記載の方法。
8.マスキングタンパク質がユビキチンである上記第７項
記載の方法。
9.ユビキチン特異的プロテアーゼを使用して、生体内又
は生体外で、ユビキチン−タンパク質接合部で融合タン
パク質からユビキチンを切断する上記第８項記載の方
法。
10.マスキングタンパク質が、エンドプロテアーゼによ
る認識部位を含んで成るアミノ酸配列を会してタンパク
質のアミノ末端に接合されている上記第７項記載の方
法。
11.タンパク質が生体内で生成され、その後にエンドプ
ロテアーゼ因子Ｘにより生体外で切断される上記第10項
記載の方法。
12.代謝不安定タンパク質を生成させる方法であって、
該タンパク質を、ユビキチンが該タンパク質のアミノ末
端に結合している融合タンパク質として生成させ、その
際該融合タンパク質が有効に脱ユビキチン化できないよ
うにされていることを特徴とする方法。
13.融合タンパク質がユビキチン−プロリン−タンパク
質より成る上記第12項記載の方法。
14.融合タンパク質が、ユビキチン特異的プロセッシン
グプロテアーゼによる融合タンパク質の脱ユビキチン化
の効率を減少させるように、該ユビキチン特異的プロセ
ッシングプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列中
の修飾を有するユビキチンを含有する上記第12項記載の
方法。
15.融合タンパク質をコード化している遺伝子構築物で
あって、アミノ末端に代謝安定化クラス又は不安定化ク
ラスの所定のアミノ酸を有する目的のタンパク質をコー
ド化しているDNA配列に結合した、マスキングタンパク
質をコード化しているDNA配列を含んで成り、該マスキ
ングタンパク質は、目的のタンパク質のアミノ末端との
接合部でプロテオリシスにより切断可能であり、この切
断により目的のタンパク質のアミノ末端が露出されるよ
うになっていることを特徴とする遺伝子構築物。
16.目的のタンパク質をコード化しているDNA配列が、１
個又はそれより多くのリシン残基を有する構造体をコー
ド化しているDNA配列を５′領域に含有しており、該DNA
配列は、該リシン残基が完全なアミノ末端分解シグナル
の第二決定要素を与えるのに十分に該アミノ末端に空間
的に近接しているように、位置付けられている上記第15
項記載の遺伝子構築物。
17.マスキングタンパク質がユビキチンである上記第15
項記載の遺伝子構築物。
18.所定のアミノ末端アミノ酸を有するタンパク質を生
成させる方法であって、該タンパク質のアミノ末端が、
該タンパク質のアミノ末端アミノ酸との接合部で生体内
又は生体外で特異的にプロテオリシスにより切断可能で
あるマスキングタンパク質に融合されている、融合タン
パク質として該タンパク質を発現させることを特徴とす
る方法。
19.マスキングタンパク質がエンドプロテアーゼにより
切断可能である上記第18項記載の方法。
20.マスキングタンパク質がユビキチンであり、切断エ
ンドプロテアーゼがユビキチン特異的プロテアーゼであ
る上記第19項記載の方法。
21.所定のアミノ末端アミノ酸を有するタンパク質を生
成させる方法であって、 a.i）該タンパク質の所定のアミノ末端アミノ酸をコー
ド化している配列を５′末端に有している、該タンパク
質をコード化している構造遺伝子と、 ii）該タンパク質のアミノ末端との接合部において生体
内又は生体外で特異的にプロテオリシスにより切断可能
なマスキングタンパク質をコード化しており、そして前
記タンパク質の構造遺伝子の５′末端に連結されている
DNA、 とを含んで成る融合タンパク質をコード化しているDNA
構築物を製造し、 ｂ）該DNA構築物を宿主細胞中で発現させて、該DNA構築
物によりコード化されている融合タンパク質を生成さ
せ、該融合タンパク質をプロテオリシスにより特異的に
切断して、所定のアミノ末端アミノ酸を有するタンパク
質を得る、 ことを特徴とする方法。
22.融合タンパク質を宿主細胞内で切断して、所定のア
ミノ末端構造を有するタンパク質を放出させる上記第21
項記載の方法。
23.融合タンパク質を、マスキングタンパク質をプロテ
オリシスにより切断する酵素に欠けている細胞内で生成
させ、該融合タンパク質を、その後に生体外でプロテオ
リシスにより切断して、所定のアミノ末端構造を有する
タンパク質を放出させる上記第21項記載の方法。
24.マスキングタンパク質がユビキチンである上記第21
項記載の方法。
25.所定のアミノ末端アミノ酸を有するタンパク質を生
成させるためのDNA構築物であって、 a.該タンパク質の所定のアミノ末端構造をコード化して
いる配列を５′末端に有している、該タンパク質をコー
ド化している構造遺伝子と、 b.該タンパク質のアミノ末端との接合部において生体内
又は生体外で特異的にプロテオリシスにより切断可能な
マスキングタンパク質をコード化しており、そして前記
タンパク質をコード化している構造遺伝子の５′末端に
連結されているDNA、 とを含んで成ることを特徴とするDNA構築物。
26.マスキングタンパク質がユビキチンである上記第25
項記載の方法。
27.ユビキチンを、該ユビキチンが結合しているタンパ
ク質のアミノ末端から、該ユビキチンと該タンパク質の
アミノ末端との接合部において切断することができる、
単離されたユビキチン特異的プロテアーゼ。
28.上記第27項記載のユビキチン特異的プロテアーゼを
コード化している、単離されたDNA配列。
29.N−末端規則分解経路に関与した１種又は１種より多
くのプロテアーゼを条件的に又は非条件的に合成するこ
とができる突然変異体細胞系。
30.構造遺伝子の５′領域に挿入するためのDNA構築物で
あって、１個又はそれより多くのリシン残基を含むポリ
ペプチド構造体をコード化している配列を含んで成り、
該リシン残基のコドンは、該構築物が該構造遺伝子内に
挿入されるとき、該リシン残基が、完全なアミノ末端分
解シグナルの第二決定要素として作用するのに十分に、
コード化されたタンパク質のアミノ末端に空間的に近接
しているように該構築物内に配置されていることを特徴
とするDNA構築物。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 バルシヤブスキイ，アレクサンダー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02115 ボストン・コモンウエルスアベニユーナ ンバー30 311 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ 234（1986）ｐ．179 −185 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】網状赤血球抽出物中で目的のタンパク質の
    安定性を調節する方法であって、 ａ）網状赤血球抽出物に特定の、アルギニン、リシン、
    ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、
    トリプトファン、アラニン、セリン、トレオニン、アス
    パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、システイン及
    びアスパラギンからなるアミノ酸残基の不安定化クラ
    ス、あるいはグリシン、プロリン、イソロイシン、バリ
    ン及びメチオニンからなるアミノ酸残基の安定化クラス
    のいずれかよりアミノ酸残基を選択する工程、並びに ｂ）工程ａ）で選択されたアミノ酸残基が目的のタンパ
    ク質のＮ−末端アミノ酸となるように該タンパク質のＮ
    −末端を工学的に操作する工程、 を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】目的のタンパク質のＮ−末端が、 ａ）目的のタンパク質のＮ−末端に融合したマスキング
    タンパク質を含有する融合タンパク質として目的のタン
    パク質を生産し、そして ｂ）タンパク質分解によるマスキングタンパク質の除去
    により、目的のタンパク質のＮ−末端アミノ酸として前
    記の選択されたアミノ酸残基を露出する、 ことにより工学的に操作されたものである請求項１記載
    の方法。
  3. 【請求項３】網状赤血球溶解物により所定の安定性を有
    する目的のタンパク質を生産する方法であって、 ａ）網状赤血球抽出物に特定の、アルギニン、リシン、
    ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、
    トリプトファン、アラニン、セリン、トレオニン、アス
    パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、システイン及
    びアスパラギンからなるアミノ酸残基の不安定化クラ
    ス、あるいはグリシン、プロリン、イソロイシン、バリ
    ン及びメチオニンからなるアミノ酸残基の安定化クラス
    のいずれかよりアミノ酸残基を選択する工程、 ｂ）目的のタンパク質のＮ−末端アミノ酸として、工程
    ａ）で選択されたアミノ酸を有する目的のタンパク質を
    コードするDNAを含むDNA構築物を提供する工程、並びに ｃ）該DNA構築物を発現させて、目的のタンパク質のＮ
    −末端アミノ酸として、工程ａ）で選択されたアミノ酸
    を有する目的のタンパク質を生産する工程、 を含んでなる方法。
  4. 【請求項４】DNA構築物が、 ａ）目的のタンパク質をコードし、かつ、その５′末端
    に前記の選択されたアミノ酸をコードする配列を有する
    遺伝子、並びに ｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子の５′末端に
    連結したマスキングタンパク質をコードするDNAを含ん
    でなる融合タンパク質をコードする請求項３記載の方
    法。
  5. 【請求項５】哺乳類細胞において、目的のタンパク質の
    安定性を調節する方法であって、 ａ）網状赤血球抽出物に特定の、アルギニン、リシン、
    ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、
    トリプトファン、アラニン、セリン、トレオニン、アス
    パラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、システイン及
    びアスパラギンからなるアミノ酸残基の不安定化クラ
    ス、あるいはグリシン、プロリン、イソロイシン、バリ
    ン及びメチオニンからなるアミノ酸残基の安定化クラス
    のいずれかよりアミノ酸残基を選択する工程、並びに ｂ）工程ａ）で選択されたアミノ酸残基が目的のタンパ
    ク質のＮ−末端アミノ酸となるように該タンパク質のＮ
    −末端を工学的に操作する工程、 を含んでなる方法。
  6. 【請求項６】目的のタンパク質のＮ−末端が、 ａ）目的のタンパク質のＮ−末端に融合したマスキング
    タンパク質を含有する融合タンパク質として目的のタン
    パク質を生産し、そして ｂ）タンパク質分解によるマスキングタンパク質の除去
    により、目的のタンパク質のＮ−末端アミノ酸として前
    記の選択されたアミノ酸残基を露出する、 ことにより工学的に操作されたものである請求項５記載
    の方法。
JP1505018A 1988-04-07 1989-04-07 タンパク質中に所望のアミノ末端残基を発生させる方法 Expired - Fee Related JP2894357B2 (ja)

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US178,924 1988-04-07
US07/178,924 US5132213A (en) 1986-10-02 1988-04-07 Method for producing proteins and polypeptides using ubiquitin fusions

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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020146764A1 (en) * 1985-03-28 2002-10-10 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US5196321A (en) * 1986-10-02 1993-03-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods for in vitro cleavage of ubiquitin fusion proteins
AU5963290A (en) * 1989-06-30 1991-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Inhibition of the n-end rule pathway in living cells
US6068994A (en) * 1989-08-07 2000-05-30 Chiron Corporation Ubiquitin expression system
US5620923A (en) * 1989-10-12 1997-04-15 The University Of Utah Synthesis of peptides as cloned ubiquitin extensions
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5652122A (en) * 1989-12-21 1997-07-29 Frankel; Alan Nucleic acids encoding and methods of making tat-derived transport polypeptides
US5804604A (en) * 1989-12-21 1998-09-08 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US6194140B1 (en) * 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
US5212058A (en) * 1990-05-09 1993-05-18 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases
US5122463A (en) * 1990-05-17 1992-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for trans-destabilization of specific proteins in vivo and dna molecules useful therefor
US5955573A (en) * 1993-06-04 1999-09-21 Demegen, Inc. Ubiquitin-lytic peptide fusion gene constructs, protein products deriving therefrom, and methods of making and using same
US5914254A (en) * 1993-08-02 1999-06-22 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Expression of fusion polypeptides transported out of the cytoplasm without leader sequences
US5563046A (en) * 1993-08-02 1996-10-08 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides and proteins
US5565352A (en) * 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
US5981699A (en) * 1994-01-04 1999-11-09 Mitotix, Inc. Human ubiquitin conjugating enzyme
DE69517010T2 (de) * 1994-01-04 2000-12-21 Mitotix, Inc. Ubiquitin-konjugierende enzyme
US5744343A (en) * 1994-01-04 1998-04-28 Mitotix, Inc. Ubiquitin conjugating enzymes
US5763212A (en) * 1994-02-04 1998-06-09 California Institute Of Technology Inhibiting degradation of a degron-bearing protein
US5538862A (en) * 1994-02-04 1996-07-23 California Institute Of Technology Heat-inducible N-degron module
IL114697A0 (en) 1994-07-22 1995-11-27 Demeter Biotech Ltd Polypeptides comprising ubiquitin-lytic peptide fusion protein products deriving therefrom their preparation and use
EP0812204A4 (en) * 1995-03-01 2000-05-03 Alexander Varshavsky CODOMINANCE CONTROLLED TOXINS
WO1997006247A2 (en) 1995-08-09 1997-02-20 Dana Farber Cancer Institute Deubiquitinating enzymes that regulate cell growth
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
US6001619A (en) * 1995-10-04 1999-12-14 Cold Spring Harbor Laboratory Ubiquitin ligases, and uses related thereto
US5861483A (en) * 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
US7811803B2 (en) * 1997-06-19 2010-10-12 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods and compositions for rapid purification of proteasomes and methods of use of components thereof
US6294363B1 (en) * 1997-06-19 2001-09-25 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Rapid method of proteasome purification using proteins having sequence homology to ubiquitin
US6747128B2 (en) 1997-08-20 2004-06-08 Gpc Biotech, Inc. Components of ubiquitin ligase complexes, and uses related thereto
US6576469B1 (en) 1997-09-10 2003-06-10 President And Fellows Of Harvard College Inducible methods for repressing gene function
AU1818299A (en) 1997-12-10 1999-06-28 Washington University Anti-pathogen system and methods of use thereof
US20030138808A1 (en) * 1998-02-19 2003-07-24 Simard John J.L. Expression vectors encoding epitopes of target-associated antigens
AU5204199A (en) * 1998-06-12 1999-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Compositions and methods for modulating proteolytic degradation of intracellulartargets
BR9912019A (pt) 1998-07-10 2002-02-19 Calgene Llc Expressão de peptìdeos de eucarióticos em plastìdeos de plantas
US6512162B2 (en) 1998-07-10 2003-01-28 Calgene Llc Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
AU2605600A (en) * 1999-01-11 2000-08-01 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Inc. Methods for regulating the stability of recombinant proteins and products usefultherein
US7262005B1 (en) * 2000-02-04 2007-08-28 Aurora Biosciences Corporation Methods of protein destabilization and uses thereof
SE0001530D0 (sv) * 2000-04-27 2000-04-27 Accuro Immunology Ab A reporter protein
US20030215425A1 (en) * 2001-12-07 2003-11-20 Simard John J. L. Epitope synchronization in antigen presenting cells
WO2001082963A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Ctl Immunotherapies Corp. Method of identifying and producing antigen peptides and use thereof as vaccines
US6861234B1 (en) 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
DE60238532D1 (de) * 2001-05-04 2011-01-20 Cornell Res Foundation Inc Schnell spaltbares sumofusionsprotein-expressionssystem für schwer zu exprimierende proteine
ATE494387T1 (de) * 2001-11-07 2011-01-15 Mannkind Corp Für epitope von antigenen kodierende expressionsvektoren und verfahren zu deren konzeption
PL1841862T3 (pl) 2005-01-10 2013-10-31 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Mutant proteazy UBP1 i jego sekwencja kodująca, ich zastosowania oraz system ekspresji białka heterologicznego
US8173792B2 (en) * 2007-02-09 2012-05-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells using synthetic small molecules
WO2009050266A2 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Pronota N.V. Use of n-terminal and c-terminal proteomics technology to enhance protein therapeutics and diagnostics
US8088601B2 (en) * 2007-11-15 2012-01-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Expression systems for functional membrane polypeptides
US8530636B2 (en) * 2008-05-07 2013-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells in vivo using synthetic small molecules
US9212359B2 (en) 2011-06-23 2015-12-15 Sanford Jay Silverman Systems for induction of gene expression and protein depletion in yeast
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6041697A (ja) * 1983-08-15 1985-03-05 Asahi Chem Ind Co Ltd 活性蛋白質誘導体の新規合成法
EP0324789B1 (en) * 1986-10-02 2003-08-20 Massachusetts Institute Of Technology Methods of regulating metabolic stability of proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４（１９８６）ｐ．１７９−１８５

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Publication number Publication date
US5132213A (en) 1992-07-21
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CA1339842C (en) 1998-04-28
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WO1989009829A2 (en) 1989-10-19

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