JPS60262595A - レニンによる部位特異性たんぱく質分解 - Google Patents
レニンによる部位特異性たんぱく質分解Info
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- JPS60262595A JPS60262595A JP60110614A JP11061485A JPS60262595A JP S60262595 A JPS60262595 A JP S60262595A JP 60110614 A JP60110614 A JP 60110614A JP 11061485 A JP11061485 A JP 11061485A JP S60262595 A JPS60262595 A JP S60262595A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えＤＮＡ技術の使用により外部からの蛋白質の発現
が、原核及び真核の両宿主において共に可能になった。
が、原核及び真核の両宿主において共に可能になった。
しかし、外部からの蛋白質は、常にいかなる与えられた
宿主細胞の中にも安定して高水準で発現するとはかぎら
ない。この問題を解決した１つの方法は、融合又はハイ
ブリッド蛋白質の生成であって、融合又はハイブリッド
の蛋白質に問題の蛋白質が共有結合で結合しており、そ
の蛋白質は選ばれた宿主の中で安定して発現する。多く
の場合にこれら融合蛋白質は安定であって高水準で発現
する。問題の蛋白質の同定と精製は、融合舐白質（例え
ば、β−ガラクトシダーゼ）の安定に発現した成分の活
性に従ってしば１〜ば容易になる。
宿主細胞の中にも安定して高水準で発現するとはかぎら
ない。この問題を解決した１つの方法は、融合又はハイ
ブリッド蛋白質の生成であって、融合又はハイブリッド
の蛋白質に問題の蛋白質が共有結合で結合しており、そ
の蛋白質は選ばれた宿主の中で安定して発現する。多く
の場合にこれら融合蛋白質は安定であって高水準で発現
する。問題の蛋白質の同定と精製は、融合舐白質（例え
ば、β−ガラクトシダーゼ）の安定に発現した成分の活
性に従ってしば１〜ば容易になる。
融合蛋白質系の主な不利な点は、安定して発現するが最
終生成物の中の所望でない蛋白質から問題の蛋白質を分
離するのが困難な場合がしばしばあることである。
終生成物の中の所望でない蛋白質から問題の蛋白質を分
離するのが困難な場合がしばしばあることである。
ある場合には、問題の蛋白質は化学的（例えばシアノゲ
ン ブロマイド）又は蛋白質分解的（例えば、トリプシ
ン）開裂のための部位を欠いているが、一方安定して発
現した蛋白質がこれらの開裂の部位を有する場合がある
。このとき、融合蛋白質を分解して、安定して発現した
舒白質をほとんど又は全く含まない明白な分子として問
題の蛋白質を産することができる。
ン ブロマイド）又は蛋白質分解的（例えば、トリプシ
ン）開裂のための部位を欠いているが、一方安定して発
現した蛋白質がこれらの開裂の部位を有する場合がある
。このとき、融合蛋白質を分解して、安定して発現した
舒白質をほとんど又は全く含まない明白な分子として問
題の蛋白質を産することができる。
そのような一般的な方法による融合蛋白質の処理によシ
安定して発現する蛋白質と同様に問題の蛋白質を分解さ
せることができる。
安定して発現する蛋白質と同様に問題の蛋白質を分解さ
せることができる。
従って、本発明の目的は、レニンのような高特異性の蛋
白質分解試薬で認識されるアミノ酸の配列をコードする
ユニークなオリゴヌクレオチドを提供することである。
白質分解試薬で認識されるアミノ酸の配列をコードする
ユニークなオリゴヌクレオチドを提供することである。
他の目的は、問題の蛋白質をコードする核酸の配列と安
定して発現する蛋白厨をコードする核酸配列との間にこ
のオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を提供すること
である。さらに別の目的は融合した蛋白質を提供するこ
とであり、その蛋白質は、問題の蛋白質と安定して発現
） する蛋白質との間に高特異性の蛋白質分解試薬で認識さ
れる唯一のアミノ配列を含んでいる。この発明のこれら
の及び他の目的は以下（３） の記述から明らかになる。
定して発現する蛋白厨をコードする核酸配列との間にこ
のオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を提供すること
である。さらに別の目的は融合した蛋白質を提供するこ
とであり、その蛋白質は、問題の蛋白質と安定して発現
） する蛋白質との間に高特異性の蛋白質分解試薬で認識さ
れる唯一のアミノ配列を含んでいる。この発明のこれら
の及び他の目的は以下（３） の記述から明らかになる。
酵素、レニンで認識され、分解されたアミノ酸配列をコ
ードするオリゴヌクレオチドがプラスミド発現ベクター
へ挿入される。このヌクレオチド配列が、二つの異なっ
た領域を含む融合蛋白質をコードする。ＤＮＡの配列内
に挿入されるが、それはこれら二つの領域の正確な接合
部に挿入される。この新しい構成が新規な蛋白質を与え
、その蛋白質は本質的にレニンで裂かれて二つの異なる
蛋白質を与え、その二つの蛋白質が原融合蛋白質の二つ
の領域に対応している。
ードするオリゴヌクレオチドがプラスミド発現ベクター
へ挿入される。このヌクレオチド配列が、二つの異なっ
た領域を含む融合蛋白質をコードする。ＤＮＡの配列内
に挿入されるが、それはこれら二つの領域の正確な接合
部に挿入される。この新しい構成が新規な蛋白質を与え
、その蛋白質は本質的にレニンで裂かれて二つの異なる
蛋白質を与え、その二つの蛋白質が原融合蛋白質の二つ
の領域に対応している。
高特異性エンドペプチターゼであるレニンは天然におい
て作用して、アンギオテンシンＩをブローホルモンであ
るアンギオテンシンから発生させる。
て作用して、アンギオテンシンＩをブローホルモンであ
るアンギオテンシンから発生させる。
血漿の中に、レニンによるアンギオテンシニゲン（ａｎ
ｇｉＯｔｅｎｓｉｎｉｇｅｎ ） Ｉの形成は、血圧の
急速な上昇及び腎臓のナトリウム保持の増加を引き起す
一連の反応において、第１（４） （ｐｒｉｍａｒｙ ）及び律速段階を構成する。レニン
は非常に限定した基質特異性を表わし、通常のプロテア
ーゼ活性を、たとえあったとしてもほとんど示さない。
ｇｉＯｔｅｎｓｉｎｉｇｅｎ ） Ｉの形成は、血圧の
急速な上昇及び腎臓のナトリウム保持の増加を引き起す
一連の反応において、第１（４） （ｐｒｉｍａｒｙ ）及び律速段階を構成する。レニン
は非常に限定した基質特異性を表わし、通常のプロテア
ーゼ活性を、たとえあったとしてもほとんど示さない。
いくつかの合成ペプチドは、その最も小さなものがヘプ
タペプチドであり、それがレニンに対する基質として作
用する。故にレニンのような高特異性蛋白質分解酵素例
えばレニンによって確認された唯一の蛋白質配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、問題の蛋白質をコードす
る。ヌクレオチドと安定して発現する蛋白質をコードす
るヌクレオチドとの間の融合蛋白質をコードする遺伝子
へ導入することは、非常に有利である。それから、融合
蛋白質が発現されると、高特異性蛋白質分解酵素が融合
蛋白質を分解して、自然のままの蛋白質生成物として問
題の蛋白質を生ずる。
タペプチドであり、それがレニンに対する基質として作
用する。故にレニンのような高特異性蛋白質分解酵素例
えばレニンによって確認された唯一の蛋白質配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、問題の蛋白質をコードす
る。ヌクレオチドと安定して発現する蛋白質をコードす
るヌクレオチドとの間の融合蛋白質をコードする遺伝子
へ導入することは、非常に有利である。それから、融合
蛋白質が発現されると、高特異性蛋白質分解酵素が融合
蛋白質を分解して、自然のままの蛋白質生成物として問
題の蛋白質を生ずる。
レニンは、マウスの顎下腺から最も容易に得られ、人を
含める他の哨乳類からも得られて、次のアミノ酸配列を
分解する ７ ８ ９ １．０ １１ １２ １．３ＰｒＯＰｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ一方、人の
レニンもまた、次のアミノ酸配列を分解する Ｐｒ０Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉ
ｓ好ましくは、プロリンのＮ−ターミナル アミノ基が
他のアミノ酸、例えばヒスチジンと結合する。種々な置
換が前述のへブタペプチドの中に存在することができ、
それらは次の表に示される通りである。
含める他の哨乳類からも得られて、次のアミノ酸配列を
分解する ７ ８ ９ １．０ １１ １２ １．３ＰｒＯＰｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ一方、人の
レニンもまた、次のアミノ酸配列を分解する Ｐｒ０Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉ
ｓ好ましくは、プロリンのＮ−ターミナル アミノ基が
他のアミノ酸、例えばヒスチジンと結合する。種々な置
換が前述のへブタペプチドの中に存在することができ、
それらは次の表に示される通りである。
第１表
Ｐｈｅ Ｔｒｐ ＸＴｙｒ ＸＬｅｕ
Ｉ（ｉ ｓ Ｌｅｕ 、 ＴｙｒＸＡｌ ａＸＳｅ ｒ
、 ＬｙｓＬｅｕ （１０） Ｐｈｅ Ｔ、ｅｕ （１１） 、 Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ、 Ａｌａ Ｔｙｒ ＰｈｅＸＴｒｐＸＬｅｕ 所望であれば、より長いアミノ酸配列を使用することが
でき、例えば次のようなものが挙げられる：（７） （８） 人のレニンの場合にもまたよシ長いアミノ酸配列を使用
することができ、例えば次のようなものがある： 第３表 Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈ
ｉｓ ５ｅｒＨｉｓ ＰｒＯＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｉｌｅ ｆ（ｉｓｌｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓｌｌｅ
Ｈｉｓ ＰｒｏＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｉ−Ｕｓ ５ｅｒ（Ｐｒｏ） Ｈｉｓ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ（Ｐ
ｒｏ） Ｈｉｓ ＰｒｏＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｓｅｒ表中のｎは１〜５の整数で
ある。
、 ＬｙｓＬｅｕ （１０） Ｐｈｅ Ｔ、ｅｕ （１１） 、 Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ、 Ａｌａ Ｔｙｒ ＰｈｅＸＴｒｐＸＬｅｕ 所望であれば、より長いアミノ酸配列を使用することが
でき、例えば次のようなものが挙げられる：（７） （８） 人のレニンの場合にもまたよシ長いアミノ酸配列を使用
することができ、例えば次のようなものがある： 第３表 Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈ
ｉｓ ５ｅｒＨｉｓ ＰｒＯＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｉｌｅ ｆ（ｉｓｌｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓｌｌｅ
Ｈｉｓ ＰｒｏＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｉ−Ｕｓ ５ｅｒ（Ｐｒｏ） Ｈｉｓ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ（Ｐ
ｒｏ） Ｈｉｓ ＰｒｏＰｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｓｅｒ表中のｎは１〜５の整数で
ある。
第１表に示した置換基もまた第２表及び第３表のペプチ
ドの対応する配列の中に作られ得る。他の置換がアミノ
酸の中の７位のゾロリンの左へ１．可能である。
ドの対応する配列の中に作られ得る。他の置換がアミノ
酸の中の７位のゾロリンの左へ１．可能である。
本発明を実施するには、まずＤＮＡオリゴヌクレオチド
を製造することが必要であり、そのオリゴヌクレオチド
は、最小限度、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ又は上述の許容できる
同等のもの、若しくはよシ長いアミノ酸配列で上述のよ
うな許容できる同等のものをコードするものであること
が必要である。
を製造することが必要であり、そのオリゴヌクレオチド
は、最小限度、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ又は上述の許容できる
同等のもの、若しくはよシ長いアミノ酸配列で上述のよ
うな許容できる同等のものをコードするものであること
が必要である。
問題の蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、融合蛋
白質として問題の蛋白質の発現に適当な配向で適当なベ
クターへ挿入される。
白質として問題の蛋白質の発現に適当な配向で適当なベ
クターへ挿入される。
そのベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼによって
、予じめ選定した部位で開かれ、また、そのベクターは
適当なりＮＡリガーゼを使用する実施例１のハイブリッ
ド オリゴヌクレオチド リンカ−で結紮される。それ
から、結紮されたベクターを原核又は真核宿主へ挿入し
て、融合蛋白質の発現を行う。発現し・た融合蛋白質は
、次にレニンで処理されて、問題の蛋白質を融合蛋白質
のレスト（ｒｅｓｔ）から分解される。他に、リンカ−
を直接問題の蛋白質をコードしている遺伝子へ結合する
ことができ、そしてその結果生じたＤＮＡ構成体を適当
な発現ベクターへ挿入することができ、その挿入方法に
おいて、問題の蛋白質及びＤＮＡ構成体が融合蛋白質と
して発現されるものである。
、予じめ選定した部位で開かれ、また、そのベクターは
適当なりＮＡリガーゼを使用する実施例１のハイブリッ
ド オリゴヌクレオチド リンカ−で結紮される。それ
から、結紮されたベクターを原核又は真核宿主へ挿入し
て、融合蛋白質の発現を行う。発現し・た融合蛋白質は
、次にレニンで処理されて、問題の蛋白質を融合蛋白質
のレスト（ｒｅｓｔ）から分解される。他に、リンカ−
を直接問題の蛋白質をコードしている遺伝子へ結合する
ことができ、そしてその結果生じたＤＮＡ構成体を適当
な発現ベクターへ挿入することができ、その挿入方法に
おいて、問題の蛋白質及びＤＮＡ構成体が融合蛋白質と
して発現されるものである。
同じ又は異った遺伝子の複数を有するベクターを調製す
ることも本発明の範囲内であり、各々の遺伝子を本発明
のオリゴヌクレオチドリンカーで分離することができる
。そのような遺伝子の複数の例には次のものがある二Ｅ
ＢＶ−リンカー−ＥＢＶ−リンカー−ＥＢＶ −リンカ
ー−β−ガラクトシダーゼ ＥＢＶ−リンカー−Ｈ８Ｖ−リンカー−β−ガラクトシ
ダーゼ ＥＢＶ−リンカー−ＥＢＶ−リンカー−ＶＺＶ −リン
カー−β−ガラクトシダーゼ。
ることも本発明の範囲内であり、各々の遺伝子を本発明
のオリゴヌクレオチドリンカーで分離することができる
。そのような遺伝子の複数の例には次のものがある二Ｅ
ＢＶ−リンカー−ＥＢＶ−リンカー−ＥＢＶ −リンカ
ー−β−ガラクトシダーゼ ＥＢＶ−リンカー−Ｈ８Ｖ−リンカー−β−ガラクトシ
ダーゼ ＥＢＶ−リンカー−ＥＢＶ−リンカー−ＶＺＶ −リン
カー−β−ガラクトシダーゼ。
前記構成体において、Ｈ８ｖは単純ヘルペスのウィルス
であり、ＶｚＶは水痘帯状ヘルペスウィルスである。
であり、ＶｚＶは水痘帯状ヘルペスウィルスである。
次の例は、本発明をエプスタイン・バーウィルス（ＥＢ
Ｖ）から免疫原性フラグメントを有する特別な融合蛋白
質に関して説明するが、本発明が融合蛋白質として形質
転換宿主から発現する問題のいかなる蛋白質へも適（用
できることが理解される。他の蛋白質の例は、ウィルス
抗原、バクテリア抗原、原生動物類の抗原、リケッチア
抗原、ぜん虫抗原、ペプチド及びポリペプチドホルモン
、生長因子、酵素、腫瘍蛋白質、並びに他の生成学的活
性ペプチドを含む。
Ｖ）から免疫原性フラグメントを有する特別な融合蛋白
質に関して説明するが、本発明が融合蛋白質として形質
転換宿主から発現する問題のいかなる蛋白質へも適（用
できることが理解される。他の蛋白質の例は、ウィルス
抗原、バクテリア抗原、原生動物類の抗原、リケッチア
抗原、ぜん虫抗原、ペプチド及びポリペプチドホルモン
、生長因子、酵素、腫瘍蛋白質、並びに他の生成学的活
性ペプチドを含む。
人に又は人以外に由来のレニンによって分解される最小
のアミノ酸配列をコードする特異性ＤＮＡのオリゴヌク
レオチドの例はＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧ
ＴＣＴＡＣであり、一方、人に由来のレニンによって分
解される最小のアミノ酸配列をコードするＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの特異１生の例はＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣ
ＴＧ ＧＴＣＡＴＡ ＣＡＣである。各々の場合に好ま
しくは、本質的ではないが、その５末端にＨｉｓをコー
ドする付 、論的なコドン、例えばＣＡＣを有すること
である。
のアミノ酸配列をコードする特異性ＤＮＡのオリゴヌク
レオチドの例はＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧ
ＴＣＴＡＣであり、一方、人に由来のレニンによって分
解される最小のアミノ酸配列をコードするＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの特異１生の例はＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣ
ＴＧ ＧＴＣＡＴＡ ＣＡＣである。各々の場合に好ま
しくは、本質的ではないが、その５末端にＨｉｓをコー
ドする付 、論的なコドン、例えばＣＡＣを有すること
である。
次の例は本発明を説明するが、それに限定（１１）
されるものではない。
実施例１
次の３２の塩基の相補的ヌクレオチド＝１、 ５’ Ｃ
Ａ ＣＡＣＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧＴＣ
ＴＡＣＣＴＴ ＡＡＣ３’ ２、 ５’ ＧＴ ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＧＡ
ＧＣＡ ＧＧＴＧＧＡ ＡＣＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ３’
はアプライド バイオシステムズ 社 （Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉＢ１０５ｙｓｔｅ Ｉｎｃ、
）のホスホルアミタイトケミストリー（ＰｈＯｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉ ｔｅＣｈｅｍｉ ｓ ｔｒｙ ）を用い
るモデル１１Ｖｌ［１３８０Ａオリゴヌクレオチド シ
ンセサイザー（ｍｏｄｅＩＮ［ｌ ３８０Ａ Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ）
において別個に合成され、次に保護基を除去し、そして
、製造業者によって説明されているようにセファデック
ス Ｇ５０ カラム クロマトグラフィーを通して精製
された。オリゴヌクレオチドＩは３′の端に６ケの余分
のオリゴヌクレオチドを有する。
Ａ ＣＡＣＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧＴＣ
ＴＡＣＣＴＴ ＡＡＣ３’ ２、 ５’ ＧＴ ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＧＡ
ＧＣＡ ＧＧＴＧＧＡ ＡＣＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ３’
はアプライド バイオシステムズ 社 （Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉＢ１０５ｙｓｔｅ Ｉｎｃ、
）のホスホルアミタイトケミストリー（ＰｈＯｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉ ｔｅＣｈｅｍｉ ｓ ｔｒｙ ）を用い
るモデル１１Ｖｌ［１３８０Ａオリゴヌクレオチド シ
ンセサイザー（ｍｏｄｅＩＮ［ｌ ３８０Ａ Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ）
において別個に合成され、次に保護基を除去し、そして
、製造業者によって説明されているようにセファデック
ス Ｇ５０ カラム クロマトグラフィーを通して精製
された。オリゴヌクレオチドＩは３′の端に６ケの余分
のオリゴヌクレオチドを有する。
（１２）
従ってその相補鎖ヌクレオチド２は、そのＤＮＡが悪い
配向で挿入された場合には、正しい読み取りフレームの
中に停止信号を有することになる。セファデックス カ
ラムのベッド容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ）の４０％
で溶離する分画が保持された。溶離バッファである重炭
酸トリエチルアンモニウムＣＴＥＡＢ ）の０．１Ｍを
蒸留水の中へ再懸濁及び凍結乾燥を３度連続して繰返し
て除去した。試料を１１ｎ９／ｍ７’の濃度で水の中に
再懸濁した。各々合成のオリゴヌクレオチドの１０μｌ
を試験管の中で混合し、６５℃で１５分間加熱し、そし
て９０分間室温に冷却して二本鎖オリゴヌクレオチドを
得た。
配向で挿入された場合には、正しい読み取りフレームの
中に停止信号を有することになる。セファデックス カ
ラムのベッド容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ）の４０％
で溶離する分画が保持された。溶離バッファである重炭
酸トリエチルアンモニウムＣＴＥＡＢ ）の０．１Ｍを
蒸留水の中へ再懸濁及び凍結乾燥を３度連続して繰返し
て除去した。試料を１１ｎ９／ｍ７’の濃度で水の中に
再懸濁した。各々合成のオリゴヌクレオチドの１０μｌ
を試験管の中で混合し、６５℃で１５分間加熱し、そし
て９０分間室温に冷却して二本鎖オリゴヌクレオチドを
得た。
実施例２
ベクターを有するオリゴヌクレオチドの構成ＥＢＶ膜抗
原（ＭＡ）遺伝子の一部をＳｍａｌの部位でβ−ガラク
トシド発現ベクターｐＭＣ１５１１へ挿入したが、その
挿入の手段はＰＮＡＳ旦：５６６５−５６６９．１９８
３、ヘネシー（Ｈｅｎｎｅｓｙ）らによって記述された
手段に類似のものである。この構成を作るために用いた
ＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＶ ＤＮＡのＢａｍＨＩＬ フラ
グメント（Ｂ９５−８系）の内に含まれた長さでＰｓｔ
１フラグメント約１，９００の塩基対であり、そして
それをＢａｌ −３１ヌクレアーゼで処理して各々の末
端で約１６０の塩基を除去した。ＥＢＶフラグメントは
配列 ５’−ＣＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＡ−３’で始まシ、配列
５’−ＴＴＡＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＣＡＡ−３’で終
る。
原（ＭＡ）遺伝子の一部をＳｍａｌの部位でβ−ガラク
トシド発現ベクターｐＭＣ１５１１へ挿入したが、その
挿入の手段はＰＮＡＳ旦：５６６５−５６６９．１９８
３、ヘネシー（Ｈｅｎｎｅｓｙ）らによって記述された
手段に類似のものである。この構成を作るために用いた
ＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＶ ＤＮＡのＢａｍＨＩＬ フラ
グメント（Ｂ９５−８系）の内に含まれた長さでＰｓｔ
１フラグメント約１，９００の塩基対であり、そして
それをＢａｌ −３１ヌクレアーゼで処理して各々の末
端で約１６０の塩基を除去した。ＥＢＶフラグメントは
配列 ５’−ＣＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＡ−３’で始まシ、配列
５’−ＴＴＡＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＣＡＡ−３’で終
る。
上述のＥＢＶ−ＭＡ−β−ｇａ１発現ベクターからのプ
ラスミドＤＮＡは、セル（Ｃｅｌｌ ） １０ ：５２
１−５３６．１９７７、ミーガー（Ｍｅａｇｈ−ｅｒ）
らの方法によって精製され、さらにＣｓＣ１！の平衡密
度勾配における遠心分離（モレキュラー クローニング
、ア ラバラトリー マニュアル（ＭＯｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ＯＣｌ０ｎｉｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ ）、コールド スプリング ハーバ−プレス（Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ ）
、コールド スプリング ハーバ−、ニューヨーク、１
９８２、ｐｐ、９３−９９、マニアテイス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら）によって精製された。これ及び次の反応の
すべてが１．５−のマイクロヒュージ（ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ ）管で行なわれた。プラスミドＤＮＡは制限エン
ドヌクレアーゼ１３ａｍＨＩにューイングランド バイ
オラプス（Ｅｎｇ−１ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ） 、
ビバリー、マサチュセツツ）で３７℃で２時間熟成され
だが、その際１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ ｐｎ７．４．５
０ｍＭＮａα、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ＜、１ｍ、Ｍジチ
オトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ）を
含むバッファの中に０．５酵素単位／ＤＮＡμｇを用い
た。そのＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１：ｌ）
の等量を用いて抽出し、水性相を除去し、そしてクロロ
ホルムの等量を用いて再抽出した。水性相を除去して、
０．３Ｍの酢酸ナトリウムでｐｎ ７へ調整した。その
試別を無水エタノールの２，５容量で希釈し、１５分間
ドライアイスの上で培養して、ＤＮＡで沈澱させた。そ
のＤＮＡを５分間マイクロヒュージ中１２ＫＸｇ（１５
） でペレットにし、そのペレットを７０％エタノールで洗
浄して、減圧下で乾燥した。乾燥ペレットを脱イオン化
蒸留水に溶解して、突出している５′端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■のクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメントを
用いて満した。反応混合物は次のものを含む。それらは
５７ｍＭトリス−ＨαｐＨ７，８，１２ｍＭＭｇＣ１２
，５０ｍＭ Ｎａｃｌ、 １’ Ｏｍ Ｍβ−メルカプ
トエタノール、１０μｇ／−ヌクレアーゼーフリー牛血
清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ ） 、次のデオキシヌクレ
オチドの各々の０．１５ ｍ Ｍ ： ｄＡＴＰ。
ラスミドＤＮＡは、セル（Ｃｅｌｌ ） １０ ：５２
１−５３６．１９７７、ミーガー（Ｍｅａｇｈ−ｅｒ）
らの方法によって精製され、さらにＣｓＣ１！の平衡密
度勾配における遠心分離（モレキュラー クローニング
、ア ラバラトリー マニュアル（ＭＯｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ＯＣｌ０ｎｉｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ ）、コールド スプリング ハーバ−プレス（Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ ）
、コールド スプリング ハーバ−、ニューヨーク、１
９８２、ｐｐ、９３−９９、マニアテイス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら）によって精製された。これ及び次の反応の
すべてが１．５−のマイクロヒュージ（ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ ）管で行なわれた。プラスミドＤＮＡは制限エン
ドヌクレアーゼ１３ａｍＨＩにューイングランド バイ
オラプス（Ｅｎｇ−１ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ） 、
ビバリー、マサチュセツツ）で３７℃で２時間熟成され
だが、その際１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ ｐｎ７．４．５
０ｍＭＮａα、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ＜、１ｍ、Ｍジチ
オトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ）を
含むバッファの中に０．５酵素単位／ＤＮＡμｇを用い
た。そのＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１：ｌ）
の等量を用いて抽出し、水性相を除去し、そしてクロロ
ホルムの等量を用いて再抽出した。水性相を除去して、
０．３Ｍの酢酸ナトリウムでｐｎ ７へ調整した。その
試別を無水エタノールの２，５容量で希釈し、１５分間
ドライアイスの上で培養して、ＤＮＡで沈澱させた。そ
のＤＮＡを５分間マイクロヒュージ中１２ＫＸｇ（１５
） でペレットにし、そのペレットを７０％エタノールで洗
浄して、減圧下で乾燥した。乾燥ペレットを脱イオン化
蒸留水に溶解して、突出している５′端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■のクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメントを
用いて満した。反応混合物は次のものを含む。それらは
５７ｍＭトリス−ＨαｐＨ７，８，１２ｍＭＭｇＣ１２
，５０ｍＭ Ｎａｃｌ、 １’ Ｏｍ Ｍβ−メルカプ
トエタノール、１０μｇ／−ヌクレアーゼーフリー牛血
清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ ） 、次のデオキシヌクレ
オチドの各々の０．１５ ｍ Ｍ ： ｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰＸｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ 、ならびにＤＮＡの
μＩ当りＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー マンハ
イム、インディアナポリス、インディアナ）のクレノー
フラグメントの０．１単位である。混合物は室温（約２
０℃）で２０分間培養された。そのＤＮＡを上述のよう
に抽出して、沈澱させた。減圧下で乾燥したＤＮＡペレ
ットを脱イオン化蒸留水に溶解した。
μＩ当りＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー マンハ
イム、インディアナポリス、インディアナ）のクレノー
フラグメントの０．１単位である。混合物は室温（約２
０℃）で２０分間培養された。そのＤＮＡを上述のよう
に抽出して、沈澱させた。減圧下で乾燥したＤＮＡペレ
ットを脱イオン化蒸留水に溶解した。
結紮混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍ１ｘｔｕｒｅ ）が
つくられ、（１６） その混合物は上で処理されたＤＮＡの約４μｙ１実施例
１で述べたハイブリッドオリゴヌクレオチドの７．５μ
Ｆ１ ％ ｏ、 ｌ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ ％４００単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド バイオラ
プス）、５０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ ｐｎ ７．５．１０
ｍ 、Ｍ Ｍｇ Ｃ１２，１０ｍＭジチオトレイトー
ル、１ｍＭスペルミジン及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）を含まないヌクレアーゼの０．１μ９／−を含んでい
た。この反応混合物を室温（約２０℃）で３時間培養し
た。
つくられ、（１６） その混合物は上で処理されたＤＮＡの約４μｙ１実施例
１で述べたハイブリッドオリゴヌクレオチドの７．５μ
Ｆ１ ％ ｏ、 ｌ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ ％４００単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド バイオラ
プス）、５０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ ｐｎ ７．５．１０
ｍ 、Ｍ Ｍｇ Ｃ１２，１０ｍＭジチオトレイトー
ル、１ｍＭスペルミジン及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）を含まないヌクレアーゼの０．１μ９／−を含んでい
た。この反応混合物を室温（約２０℃）で３時間培養し
た。
実施列３
列の発現
冷凍した要求にかなう大腸菌株ＡＭＡ１００４（ｌａｃ
Ｙ＋、１ａｃＺ ）をダジャー（Ｄａｇｅｒら）（遺伝
子、Ｃ：２３−２８．１９７９ ）の手段で調製した。
Ｙ＋、１ａｃＺ ）をダジャー（Ｄａｇｅｒら）（遺伝
子、Ｃ：２３−２８．１９７９ ）の手段で調製した。
２００μｌのアリコート（ａｌｉｑｕＯｔ ）を−７０
℃で使用するまで保存した。１つのアリコートを氷上で
溶解し、実施例２で記した結紮□混合物の半分を氷上の
細胞に加え、１時間培養した。そのとき形質転換混合物
を含む管は９０秒間４５℃の水の中に置かれ、次に室温
で５分間置かれる。Ｌ−ブイヨン（バクト（Ｂａｃｔｏ
） トリプトン１．０ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、及び
Ｎａα５ｇ、蒸留水で１１にした）の１−をその管へ加
え、混合物を３７℃で３０分間培養した。形質転換混合
物を分割して、アムピシリンの１００μｇ７．１ ヲ含
む４ケのマツコンキー（ＭａｃＣＯｎｋｅｙ ）寒天プ
レートの上に置いた。そのプレートをホットエア イン
キュベーターの中で一晩３７℃で培養した。約５−１０
の明光色（β−Ｇａｌ ）及び約２０−３０の暗赤色（
β−Ｇａｌ”）コロニーが各々のプレートに成長した。
℃で使用するまで保存した。１つのアリコートを氷上で
溶解し、実施例２で記した結紮□混合物の半分を氷上の
細胞に加え、１時間培養した。そのとき形質転換混合物
を含む管は９０秒間４５℃の水の中に置かれ、次に室温
で５分間置かれる。Ｌ−ブイヨン（バクト（Ｂａｃｔｏ
） トリプトン１．０ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、及び
Ｎａα５ｇ、蒸留水で１１にした）の１−をその管へ加
え、混合物を３７℃で３０分間培養した。形質転換混合
物を分割して、アムピシリンの１００μｇ７．１ ヲ含
む４ケのマツコンキー（ＭａｃＣＯｎｋｅｙ ）寒天プ
レートの上に置いた。そのプレートをホットエア イン
キュベーターの中で一晩３７℃で培養した。約５−１０
の明光色（β−Ｇａｌ ）及び約２０−３０の暗赤色（
β−Ｇａｌ”）コロニーが各々のプレートに成長した。
バクテリアのコロニーをマニアチス（Ｍａｎｊａｔｉｓ
）らの上記の３１３−３１４ページに記載された手段
によってオリゴヌクレオチド配列の存在についてスクリ
ーニングした。あらましを述べれば、１０４のコロニー
を任意にマスタープレート及びニトロセルロースフィル
ターに取り出して、３７℃で４時間成長させた。次にフ
ィルタニを上記マニアチスらの手段１に従って処理し、
バクテリアを溶かして、溶は出したＤＮＡを集めた。そ
の際の処理において例外は、２０ＸＳＳＣ（３Ｍ塩化ナ
トリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を２０ＸＳＳ
ＰＥの代りに使用しただけである。
）らの上記の３１３−３１４ページに記載された手段
によってオリゴヌクレオチド配列の存在についてスクリ
ーニングした。あらましを述べれば、１０４のコロニー
を任意にマスタープレート及びニトロセルロースフィル
ターに取り出して、３７℃で４時間成長させた。次にフ
ィルタニを上記マニアチスらの手段１に従って処理し、
バクテリアを溶かして、溶は出したＤＮＡを集めた。そ
の際の処理において例外は、２０ＸＳＳＣ（３Ｍ塩化ナ
トリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を２０ＸＳＳ
ＰＥの代りに使用しただけである。
実施例１に記したオリゴヌクレオチドＮｌｌの１μｇを
バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ（
１２ユニツト、ロフト番号３５、ニューイングランド
バイオラプス）及び３０ｔｔｌｊの総量中のＣ−３２ｐ
） −ＡＴＰ（アデノシン トリホスフェイト、０．３
ｍＣ４；３０００ Ｃｉ／ｍＭ 、アメルシエイム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ）コープ、 （Ｃｏｒｐ−） 、アー
リントンハイツ、イリノイ）を使用してラベルした（上
記、１２２ページ、マニアチス等）。ラベルしたプロー
ブは組込まれていないＡＴＰからＣ−１８樹脂（５５−
１０５ミクロン ミクロボンダパ（１９） ツク（ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ ）、ウォーターズ
／ミリポア コープ、）のクロマトグラフィーによって
次のように分離した：ＲＴ−２０μｌのピペット チッ
プ（レイコン コープ０、ウオバーン、マサチューセッ
ツ（Ｒａｉｎｉｎ Ｃｏｒｐ、。
バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ（
１２ユニツト、ロフト番号３５、ニューイングランド
バイオラプス）及び３０ｔｔｌｊの総量中のＣ−３２ｐ
） −ＡＴＰ（アデノシン トリホスフェイト、０．３
ｍＣ４；３０００ Ｃｉ／ｍＭ 、アメルシエイム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ ）コープ、 （Ｃｏｒｐ−） 、アー
リントンハイツ、イリノイ）を使用してラベルした（上
記、１２２ページ、マニアチス等）。ラベルしたプロー
ブは組込まれていないＡＴＰからＣ−１８樹脂（５５−
１０５ミクロン ミクロボンダパ（１９） ツク（ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ ）、ウォーターズ
／ミリポア コープ、）のクロマトグラフィーによって
次のように分離した：ＲＴ−２０μｌのピペット チッ
プ（レイコン コープ０、ウオバーン、マサチューセッ
ツ（Ｒａｉｎｉｎ Ｃｏｒｐ、。
ＷＯｂｕｒｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ））を
シリコーン処理したグラスウールで栓をした（上記、ｐ
、４３７マニアチスら）。栓の頂上にＣ−１８樹脂の数
ｍ９を加えた。もう１つのグラスウールの栓を挿入して
、グラスウール−樹脂−グラスウールのサンドイッチを
作った。０．１Ｍ酢酸ナトリウムの数−１ｐＨ４，９、
をカラムへ緩やかなＮ２の圧力（１−３ｐｓｉｇ）でカ
ラムへ挿入し、次に２５％アセトニトリル（ＵＶグレイ
ド、バルデイク及びジャクソン、ムスケゴン、ミシガン
）の１９０μｌ及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，
９、の１９０μｌをそれぞれ３回加えた。前もって０．
１ Ｍ酢酸ナトリウムで０、６１ｎｌへ希釈した反応混
合物を再びＮ２圧の下で２度カラムを通過させた。次に
そのカラ（２０） ムを１９０μｌのＮ２０を３度加えて洗った。
シリコーン処理したグラスウールで栓をした（上記、ｐ
、４３７マニアチスら）。栓の頂上にＣ−１８樹脂の数
ｍ９を加えた。もう１つのグラスウールの栓を挿入して
、グラスウール−樹脂−グラスウールのサンドイッチを
作った。０．１Ｍ酢酸ナトリウムの数−１ｐＨ４，９、
をカラムへ緩やかなＮ２の圧力（１−３ｐｓｉｇ）でカ
ラムへ挿入し、次に２５％アセトニトリル（ＵＶグレイ
ド、バルデイク及びジャクソン、ムスケゴン、ミシガン
）の１９０μｌ及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，
９、の１９０μｌをそれぞれ３回加えた。前もって０．
１ Ｍ酢酸ナトリウムで０、６１ｎｌへ希釈した反応混
合物を再びＮ２圧の下で２度カラムを通過させた。次に
そのカラ（２０） ムを１９０μｌのＮ２０を３度加えて洗った。
プローブの溶出を２５％アセトニトリルの２ｘ１００ｔ
ｉｉｌアリコー） （ａｌｉｑｕｏｔｓ ）を通過させ
て行った。ラベルしたプローブは使用するまで一７０℃
でこの溶媒の中に保存された。
ｉｉｌアリコー） （ａｌｉｑｕｏｔｓ ）を通過させ
て行った。ラベルしたプローブは使用するまで一７０℃
でこの溶媒の中に保存された。
そのプローブは２００ Ｋｃｐｍ／μｌをもっていた。
上述のように調製したフィルター（４ヶ全部）をＩＭＮ
ａα、５０ｍＭトリス−ＨＣ１Ｘｐｎ８．１ｍＭエチレ
ンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、
０，１チドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の２５０ｄ
中で、撹拌しながら４２℃で２時間洗った。次にそれら
は１０Ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｔｓ ）溶液（上記
ｐ。
ａα、５０ｍＭトリス−ＨＣ１Ｘｐｎ８．１ｍＭエチレ
ンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、
０，１チドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の２５０ｄ
中で、撹拌しながら４２℃で２時間洗った。次にそれら
は１０Ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｔｓ ）溶液（上記
ｐ。
４４８マニアチスら）、１００μｌ／−の変性サーモン
スペルマ（Ｓａｌｍｏｎｓｐｅｒｍ ） ＤＮＡ （上
記９．３２７マニアチスら）６ＸＮＥＴ（０，９Ｎａα
、９０ｍＭトリス−ＨαｐｌＴ ８．３．６ｍＭＮＩＬ
２ＥＤＴＡ ） 、Ｏ１１％ＳＤＳを含む溶液１０〇−
中で、５９℃で１時間撹拌しなから予じめハイブリッド
化された。そのハイブリッド混合物をデカントして、６
×ＮＥＴの２０−１０、］、％ＳＤＳ、２５０μｆｌ／
Ｔｎｌの大腸菌ｔ −ＲＮＡ（ベーリンガー マンハイ
ム）及びラベルしたオリゴヌクレオチドの２００μｌで
置き換えだ。この混合物は２時間５９℃に保たれ、その
際一定の撹拌を行った（サッグス等、。
スペルマ（Ｓａｌｍｏｎｓｐｅｒｍ ） ＤＮＡ （上
記９．３２７マニアチスら）６ＸＮＥＴ（０，９Ｎａα
、９０ｍＭトリス−ＨαｐｌＴ ８．３．６ｍＭＮＩＬ
２ＥＤＴＡ ） 、Ｏ１１％ＳＤＳを含む溶液１０〇−
中で、５９℃で１時間撹拌しなから予じめハイブリッド
化された。そのハイブリッド混合物をデカントして、６
×ＮＥＴの２０−１０、］、％ＳＤＳ、２５０μｆｌ／
Ｔｎｌの大腸菌ｔ −ＲＮＡ（ベーリンガー マンハイ
ム）及びラベルしたオリゴヌクレオチドの２００μｌで
置き換えだ。この混合物は２時間５９℃に保たれ、その
際一定の撹拌を行った（サッグス等、。
１９８１、ｐ６８３イン：デベロップメンタル バイオ
ロジー ユージング ビューリファイド ジーンズ；Ｄ
、ブラウン著、アカデミツク プレス、ニューヨーク（
Ｓｕｇｇｓ呂１．。
ロジー ユージング ビューリファイド ジーンズ；Ｄ
、ブラウン著、アカデミツク プレス、ニューヨーク（
Ｓｕｇｇｓ呂１．。
１９８１、ｐ、 ６８３ ｉｎ ： ＤｅｖｅｌＯｐｍ
ｅｎｔ ＢｊＯＩＯｇｙＵｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ
Ｇｅｎｅｓ ； Ｄ、 ＢｒＯｗｎ、 ｅｄｉｔＯｒ
。
ｅｎｔ ＢｊＯＩＯｇｙＵｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ
Ｇｅｎｅｓ ； Ｄ、 ＢｒＯｗｎ、 ｅｄｉｔＯｒ
。
Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓＸＮｅｗ ＹＯｒｋ ）
）。
）。
次にフィルターを４５℃で５分間２００−６ＸＮＥＴで
洗い、その溶液をデカントして４５℃で新鮮な６ＸＮＥ
Ｔの２００ｍＡ！によって置き換えて、温度をゆっくり
と２０分間にわたって５９℃まで上昇させた。フィルタ
ーを５９℃に５分間保って、その溶液をデカントした。
洗い、その溶液をデカントして４５℃で新鮮な６ＸＮＥ
Ｔの２００ｍＡ！によって置き換えて、温度をゆっくり
と２０分間にわたって５９℃まで上昇させた。フィルタ
ーを５９℃に５分間保って、その溶液をデカントした。
湿ったフィルターを、−７０℃でコロネックスミ光及び
強化スクリーン（デュポン、ウイルミントン、プラウエ
ア）により、ＸＡＲフィルム（コダック、ロチニスター
、ニューヨーク）へ１晩さらした。約４５の゛′プロッ
トしたコロニー′”はハイブリッドのラベルしたプロー
ブを保持したが、一方それらの近くにあるものは保持し
なかった。これらの゛ホット″プロットしたコロニーに
対応した原暗赤色コロニーの六コがアムビシリン（１０
０μｊ；ｌ／ｍｌ ）を含むマツコンキー（Ｍａｃ−Ｃ
ｏｎｋｅｙ ）プレートの上に再び条はんをつけられて
、１晩中３７℃で培養された。次の日内コの条はんの各
々からよく分離した１つのコロニーを選択し、アムピシ
リン（１００μＬ賃）を含むＬ−ブイヨンの１０−へ接
種し、３７℃で７時間成長させた。 １ １つの培養物の内の２ ｍｌの播種物（表示“’Ａｔ”
′）をアムピシリン（１００μｉ／、ｅ）を含むＬ−ブ
イヨンの５００ ｍｌの中へ置いて、３７（２３） ℃で１晩培養した。次の日、プラスミドＤＮＡがバーン
バオム（Ｂｊｒｎｂａｕｍ ）等、ｌヌクレイツク ア
シッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＲｅｓｅ
ａｒｃｈ）７ ： １５１３−１５２３．１９７９の実
験計画案に従って培養物から抽出された。
強化スクリーン（デュポン、ウイルミントン、プラウエ
ア）により、ＸＡＲフィルム（コダック、ロチニスター
、ニューヨーク）へ１晩さらした。約４５の゛′プロッ
トしたコロニー′”はハイブリッドのラベルしたプロー
ブを保持したが、一方それらの近くにあるものは保持し
なかった。これらの゛ホット″プロットしたコロニーに
対応した原暗赤色コロニーの六コがアムビシリン（１０
０μｊ；ｌ／ｍｌ ）を含むマツコンキー（Ｍａｃ−Ｃ
ｏｎｋｅｙ ）プレートの上に再び条はんをつけられて
、１晩中３７℃で培養された。次の日内コの条はんの各
々からよく分離した１つのコロニーを選択し、アムピシ
リン（１００μＬ賃）を含むＬ−ブイヨンの１０−へ接
種し、３７℃で７時間成長させた。 １ １つの培養物の内の２ ｍｌの播種物（表示“’Ａｔ”
′）をアムピシリン（１００μｉ／、ｅ）を含むＬ−ブ
イヨンの５００ ｍｌの中へ置いて、３７（２３） ℃で１晩培養した。次の日、プラスミドＤＮＡがバーン
バオム（Ｂｊｒｎｂａｕｍ ）等、ｌヌクレイツク ア
シッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＲｅｓｅ
ａｒｃｈ）７ ： １５１３−１５２３．１９７９の実
験計画案に従って培養物から抽出された。
６ケの培養物の各々について１．５−の試料をマイクロ
ヒュージ管へ移して、１分間マイクロヒュージの中で１
２ＫＸｇでペレットにした。上澄み液を除去し、バクテ
リアペレットを試料バッファの１．０−で溶菌して、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。そのバッファ
は２％５ＤＳＸ ０．１Ｍジチオトレイトール、８０ｍ
Ｍトリス−Ｈαｐｎ ６．８．１０チグリセロール及び
０．００２％ブロム フェノール ブルー染料を含んで
いた。試料を一７０℃で一晩保存した。次の日その試料
は５分間ボイルされハイネ（Ｈｅｉｎｅ）等、、ジャー
ナル オブ ピロロシイ＝（ＪＯｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒＯ−１ｏｇｙＮ ４ ： ６４０−６５１．１９７
４ に記された手段に従って調製した８、５％ポリアク
リル（２４） アミド ゲルへ詰めた。電気泳動の後そのゲルをフェア
バンクス（Ｆ、ａｉｒｂａｎｋａ ）等、、生化学（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １０ ： ２６０６−２６
１７．１９７１、の実験計画案に従ってコーマシー（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアント ブルーで着色し、ホ
ワットマン３ＭＭＦ紙の上で乾燥した。この蛋白質の分
析は、分析した６ケの試料の内５ヶに約２００にダルト
ンの融合蛋白質の発現を確認した。そして、その中には
“Ａｔ””と表示した培養物を含んでいた。この蛋白質
は出発ベクターの中に発現したものと同じ大きさであっ
た。
ヒュージ管へ移して、１分間マイクロヒュージの中で１
２ＫＸｇでペレットにした。上澄み液を除去し、バクテ
リアペレットを試料バッファの１．０−で溶菌して、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。そのバッファ
は２％５ＤＳＸ ０．１Ｍジチオトレイトール、８０ｍ
Ｍトリス−Ｈαｐｎ ６．８．１０チグリセロール及び
０．００２％ブロム フェノール ブルー染料を含んで
いた。試料を一７０℃で一晩保存した。次の日その試料
は５分間ボイルされハイネ（Ｈｅｉｎｅ）等、、ジャー
ナル オブ ピロロシイ＝（ＪＯｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒＯ−１ｏｇｙＮ ４ ： ６４０−６５１．１９７
４ に記された手段に従って調製した８、５％ポリアク
リル（２４） アミド ゲルへ詰めた。電気泳動の後そのゲルをフェア
バンクス（Ｆ、ａｉｒｂａｎｋａ ）等、、生化学（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １０ ： ２６０６−２６
１７．１９７１、の実験計画案に従ってコーマシー（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアント ブルーで着色し、ホ
ワットマン３ＭＭＦ紙の上で乾燥した。この蛋白質の分
析は、分析した６ケの試料の内５ヶに約２００にダルト
ンの融合蛋白質の発現を確認した。そして、その中には
“Ａｔ””と表示した培養物を含んでいた。この蛋白質
は出発ベクターの中に発現したものと同じ大きさであっ
た。
クローン〃からのプラスミドＤＮＡの２０μｇの試料を
制限エンドヌクレアーゼＢｓ ｔＥ／にューイングラン
ド バイオラプスで実施例２で記述した制限バッファ中
のＤＮＡの５．０ユニツト／μＩを用いて消化した。そ
の試料は３７℃で９０分培養され、そのとき０．３Ｍ酢
酸ナトリウムで調整し１．核酸を無水アルコールの２．
５容量を加えて沈澱させドライアイス上で１５分間培養
した。その沈澱しだＤＮＡをマイクロヒュージの中で５
分間、１２ＫＸｇ、４℃でペレットにし、７０％のエタ
ノールで洗浄し、真空下で乾燥した。次に消化したＤＮ
Ａのその３′末端をＤＮＡポリマラーゼＩＣベーリンガ
ー マンハイム）のクレノー フラグメントでＤＮＡの
１８ｇ当り酵素の２ユニツト、７ｍＭトリス−ＨＣｌ！
ｐＨ７，８を含むバッファの中の１００μＣｉ”’Ｐ−
ｄＧＴＰ（アマ ジャム ４００Ｃｉ／ミリモル）、７
ｍ Ｍ 、Ｍｇα２及び５０ｍＭＮａαを用いてラベ
ルした。培養は室温（２０℃）で１５分間行った。反応
混合物は２．０Ｍ酢酸アンモニウムで調許し、核酸を、
エタノールの２．５容量を加えて沈澱させ、次にドライ
アイス上で１５分間培養した。そのＤＮＡを５分間マイ
クロヒュージの中で１２ＫＸＪ、４℃でペレットにし、
７０％エタノールで洗浄して、真空下で乾燥した。その
ＤＮＡを０．３ Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁し、上記
のように再沈澱した。乾燥したＤＮＡペレットを脱イオ
ンした蒸留水に再懸濁し、制限エンドヌクレアーゼＭａ
ｔｌｌにューイングランド バイオラプス）で実施例２
で述べた制限バッファ中のＤＮＡ１μｇ当り酵素３−４
単位を用いて消化した。その試料を３７℃で２時間培養
した。
制限エンドヌクレアーゼＢｓ ｔＥ／にューイングラン
ド バイオラプスで実施例２で記述した制限バッファ中
のＤＮＡの５．０ユニツト／μＩを用いて消化した。そ
の試料は３７℃で９０分培養され、そのとき０．３Ｍ酢
酸ナトリウムで調整し１．核酸を無水アルコールの２．
５容量を加えて沈澱させドライアイス上で１５分間培養
した。その沈澱しだＤＮＡをマイクロヒュージの中で５
分間、１２ＫＸｇ、４℃でペレットにし、７０％のエタ
ノールで洗浄し、真空下で乾燥した。次に消化したＤＮ
Ａのその３′末端をＤＮＡポリマラーゼＩＣベーリンガ
ー マンハイム）のクレノー フラグメントでＤＮＡの
１８ｇ当り酵素の２ユニツト、７ｍＭトリス−ＨＣｌ！
ｐＨ７，８を含むバッファの中の１００μＣｉ”’Ｐ−
ｄＧＴＰ（アマ ジャム ４００Ｃｉ／ミリモル）、７
ｍ Ｍ 、Ｍｇα２及び５０ｍＭＮａαを用いてラベ
ルした。培養は室温（２０℃）で１５分間行った。反応
混合物は２．０Ｍ酢酸アンモニウムで調許し、核酸を、
エタノールの２．５容量を加えて沈澱させ、次にドライ
アイス上で１５分間培養した。そのＤＮＡを５分間マイ
クロヒュージの中で１２ＫＸＪ、４℃でペレットにし、
７０％エタノールで洗浄して、真空下で乾燥した。その
ＤＮＡを０．３ Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁し、上記
のように再沈澱した。乾燥したＤＮＡペレットを脱イオ
ンした蒸留水に再懸濁し、制限エンドヌクレアーゼＭａ
ｔｌｌにューイングランド バイオラプス）で実施例２
で述べた制限バッファ中のＤＮＡ１μｇ当り酵素３−４
単位を用いて消化した。その試料を３７℃で２時間培養
した。
次に、その混合物は１．２ ％ ＦＩＣＯＬＬ、サッカ
ロースの非イオン合成ポリマー、１０ｍＭのトリス−Ｈ
αｐｎ ７．５．１０ｍＭのＥＤＴＡ、 ０．２％フロ
ム フェノール ブルー染料、０．２％キシレン シア
ツール染料、０．２％７マリンス（ａｍａｒｉｎｔｈ
）染料有するように調製され、２％の低ゲル化温度の７
ガロース ゲル（ＥＭＣコーポレイション、マリン コ
ロイド デビジョン、ロックランド マイン（Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎＭａｒｉｎｅ Ｃ０１ｌＯｉｄｓ Ｄｉ
ｖｉｓｉＯｎ、 ＲＯｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ））を
通して１晩３０ボルトで、４．０ｍＭのトリス−Ｈの２
０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭ 。
ロースの非イオン合成ポリマー、１０ｍＭのトリス−Ｈ
αｐｎ ７．５．１０ｍＭのＥＤＴＡ、 ０．２％フロ
ム フェノール ブルー染料、０．２％キシレン シア
ツール染料、０．２％７マリンス（ａｍａｒｉｎｔｈ
）染料有するように調製され、２％の低ゲル化温度の７
ガロース ゲル（ＥＭＣコーポレイション、マリン コ
ロイド デビジョン、ロックランド マイン（Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎＭａｒｉｎｅ Ｃ０１ｌＯｉｄｓ Ｄｉ
ｖｉｓｉＯｎ、 ＲＯｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ））を
通して１晩３０ボルトで、４．０ｍＭのトリス−Ｈの２
０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭ 。
のＥＤＴＡを含むバッファ中ｐＨ７，２で電気泳動させ
た。放射性同位元素でラベルしたフラグメントの約３０
０の塩基対鎖長（］Ｏｎｇ）が、（２７） 使用中のバッファに１ｇｇ／−のエチジウムブロマイド
を入れてそのゲルを染色し、Ｕｖ透視でＤＮＡを視覚化
した後ゲルから削られた。そのＤＮＡを含むゲルのスラ
イスをマイクロヒュージ管中に置いて、６５℃で溶解し
、１／２倍容量の３７℃に予熱したフェノールで抽出し
た。水性相を除去し、フェノールの等量で再抽出した。
た。放射性同位元素でラベルしたフラグメントの約３０
０の塩基対鎖長（］Ｏｎｇ）が、（２７） 使用中のバッファに１ｇｇ／−のエチジウムブロマイド
を入れてそのゲルを染色し、Ｕｖ透視でＤＮＡを視覚化
した後ゲルから削られた。そのＤＮＡを含むゲルのスラ
イスをマイクロヒュージ管中に置いて、６５℃で溶解し
、１／２倍容量の３７℃に予熱したフェノールで抽出し
た。水性相を除去し、フェノールの等量で再抽出した。
このようにして出来た水性相を除去し、５ＭＮａＣｌの
１／１０容量を加え、この試料を２分間マイクロヒュー
ジ中で１２ＫＸｇで遠心分離した。水性相を除去しＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させて、洗浄し、上記のように乾
燥した。この乾燥したＤＮＡを水の５０μｌ中に溶解し
て、約１０６カウント／分を有することが分った。次に
このＤＮＡをマキシム等、、メソッド インエンザイモ
ロジ−（ＭｅｔｂＯｄ ｉｎ ＥｎｚｙｍＯＩＯｇｙ）
６５ ：４９９−５６０．１９７７によって配列した。
１／１０容量を加え、この試料を２分間マイクロヒュー
ジ中で１２ＫＸｇで遠心分離した。水性相を除去しＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させて、洗浄し、上記のように乾
燥した。この乾燥したＤＮＡを水の５０μｌ中に溶解し
て、約１０６カウント／分を有することが分った。次に
このＤＮＡをマキシム等、、メソッド インエンザイモ
ロジ−（ＭｅｔｂＯｄ ｉｎ ＥｎｚｙｍＯＩＯｇｙ）
６５ ：４９９−５６０．１９７７によって配列した。
次のヌクレオチド配列が得られだ：
（２８）
ＡＣＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧＧＣＡ
ＧＣ−５’上下線の配列は出発ベクターへ挿入したオリ
ゴヌクレオチドＮＯ２の配列である。従って、記された
ように、その左の配列はＥＢＶ−ＭＡをコードする配列
の部分であり、そして、記されたように、その右の配列
はβ−ガラクトシダーゼをコードする配列の部分である
。完全に結合されたＤＮＡのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃ
ｈ）がＥＢＶ−ＭＡとβ−ガラクトシダーゼ蛋白質の領
域との間にエンドペプチターゼのレニンによって認識さ
れるアミノ配列を有する融合蛋白質をコードする。
ＧＣ−５’上下線の配列は出発ベクターへ挿入したオリ
ゴヌクレオチドＮＯ２の配列である。従って、記された
ように、その左の配列はＥＢＶ−ＭＡをコードする配列
の部分であり、そして、記されたように、その右の配列
はβ−ガラクトシダーゼをコードする配列の部分である
。完全に結合されたＤＮＡのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃ
ｈ）がＥＢＶ−ＭＡとβ−ガラクトシダーゼ蛋白質の領
域との間にエンドペプチターゼのレニンによって認識さ
れるアミノ配列を有する融合蛋白質をコードする。
実施例４
Ｅ Ｂ Ｖ−ＭＡ−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の
単離 すべての作業がことわりのない限り４℃で行、ｂれた。
単離 すべての作業がことわりのない限り４℃で行、ｂれた。
大腸菌株ＡＭＡ１００４、クローンＡｔ。
からの細胞ペースト９．４ｇを５０ｍＭ燐酸ナトリウム
、ｐｎ ７．１及び５ｍＭのジチオスレイトール中に懸
濁して１００−の１０％懸濁液（ｗｔ／ＶＯＩ）を作成
した。細胞が裂ける直前に２−プロパツール中の１００
ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロライド（ＰＭＳ
Ｆ ）の２−を加えてセリン プロテアーゼを抑制した
。
、ｐｎ ７．１及び５ｍＭのジチオスレイトール中に懸
濁して１００−の１０％懸濁液（ｗｔ／ＶＯＩ）を作成
した。細胞が裂ける直前に２−プロパツール中の１００
ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロライド（ＰＭＳ
Ｆ ）の２−を加えてセリン プロテアーゼを抑制した
。
細胞を８０ ｐｓｉｇ、 １２ ｐｓｉｇの背圧でスタ
ンステッド プレッシャー セル（５ｔａｎｓｔｅｄｔ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ ）を２度通して破裂した
。破壊した細胞の懸濁液を１０，０ＯＯＸ、９で３０分
間浄化して、上澄み液（１１７ｍｌ）へ４０％ストレプ
トマイシンサルフェート（ｗｔ／ｗｔ ）の１６．７ｍ
ｌを加え核酸を沈澱させた。混合物を、１０、ＯＯＯＸ
ｇで３０分間遠心分離し浄化した。
ンステッド プレッシャー セル（５ｔａｎｓｔｅｄｔ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ ）を２度通して破裂した
。破壊した細胞の懸濁液を１０，０ＯＯＸ、９で３０分
間浄化して、上澄み液（１１７ｍｌ）へ４０％ストレプ
トマイシンサルフェート（ｗｔ／ｗｔ ）の１６．７ｍ
ｌを加え核酸を沈澱させた。混合物を、１０、ＯＯＯＸ
ｇで３０分間遠心分離し浄化した。
上澄み液を含むストレプトマイシンサルフェートの１１
７−へ３．８Ｍ硫酸アンモニウムの４．１ ｒｎＩ！ｐ
Ｈ７を撹拌しながら３０分間にわたって加えた。混合物
をさらに２時間撹拌して、１０．０ＯＯＸ、９で遠心分
離した。上澄み溶液をデカントして、３０分浸沈澱をＰ
ＢＳの２０−に溶解し、ＰＢＳの２Ｘ２００容量に対し
て各々８時間透析した。
７−へ３．８Ｍ硫酸アンモニウムの４．１ ｒｎＩ！ｐ
Ｈ７を撹拌しながら３０分間にわたって加えた。混合物
をさらに２時間撹拌して、１０．０ＯＯＸ、９で遠心分
離した。上澄み溶液をデカントして、３０分浸沈澱をＰ
ＢＳの２０−に溶解し、ＰＢＳの２Ｘ２００容量に対し
て各々８時間透析した。
実施例５
融合蛋白質の分解
実施例４からの生成物は３ ｍ９ ／ ｍｌの蛋白質を
含むことがローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）の分析によって分
った。この物質をＰＢＳ中で３６２μに旬の濃度まで希
釈した。
含むことがローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）の分析によって分
った。この物質をＰＢＳ中で３６２μに旬の濃度まで希
釈した。
精製したレニン４５６μｇ／−を活性（ポー等、、Ｊ、
バイオルケム（Ｐｏｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂ１０
１゜Ｃｈｅｍ、 ）、 ２５８ ：２２０９−２２１６
．１９８３ ）についてアッセイした、そして１：１，
０００，０００希釈でアンギオテン シノーゲンの３６
ｎ９／−７時間をアンギオテンシン■へ転換すること
ができることが分った。この酵素をＰＢＳで３．６２μ
ｇ／ｍｌへ希釈した。融合蛋白質は３７℃で４時間３．
６２μ９／ｍｌでレニンの１０μｌと共に培養してβ−
ガラクトシダーゼをＥＢＶ−ＭＡ融合蛋白質から分解し
た。上述の生成物参 を与える融合蛋白質の分解はポリアクリルアミド ゲル
の電気泳動、銀でそのゲルを染色すること（モリセイ、
アナル、バイオケム。
バイオルケム（Ｐｏｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂ１０
１゜Ｃｈｅｍ、 ）、 ２５８ ：２２０９−２２１６
．１９８３ ）についてアッセイした、そして１：１，
０００，０００希釈でアンギオテン シノーゲンの３６
ｎ９／−７時間をアンギオテンシン■へ転換すること
ができることが分った。この酵素をＰＢＳで３．６２μ
ｇ／ｍｌへ希釈した。融合蛋白質は３７℃で４時間３．
６２μ９／ｍｌでレニンの１０μｌと共に培養してβ−
ガラクトシダーゼをＥＢＶ−ＭＡ融合蛋白質から分解し
た。上述の生成物参 を与える融合蛋白質の分解はポリアクリルアミド ゲル
の電気泳動、銀でそのゲルを染色すること（モリセイ、
アナル、バイオケム。
（３１）
（ＭｏｒｒｉｓｓｅｙＸＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）１
１７ ： ３０７−３１０．１９８１）、及びＥＢＶ高
度免疫人血清を用いてそのゲルをイムノブロッティング
すること（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ） （バーネ
ット、アナル、バイオケム、（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、Ａｎ
ａｌ、Ｂｉ〇−ｃｈｅｍ、）１１２：１９５−２０３．
１９８１ ）によって確認した。
１７ ： ３０７−３１０．１９８１）、及びＥＢＶ高
度免疫人血清を用いてそのゲルをイムノブロッティング
すること（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ） （バーネ
ット、アナル、バイオケム、（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、Ａｎ
ａｌ、Ｂｉ〇−ｃｈｅｍ、）１１２：１９５−２０３．
１９８１ ）によって確認した。
とのＥＶＢ−ＭＡはチオガラクトシターゼアフイニテイ
ー力ラム クロマトグラフィー（ゲルミノ（Ｇｅｒｍｉ
ｎｏ）等、、 ＰＮＡＳ ８０ ：６８４８−６８５２
．１９８３）又はフェニル セファロースにおける疎水
性相互作用クロマトグラフィー（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ）、アブサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウ
ェーデン）によってβ−ガラクトシダーゼから分離精製
した。フェニルセファロース カラムをＰＢＳで平衡さ
せて、レニンで分離した融合蛋白質にカラムによるクロ
マグラフを行い、そしてこのＥＢＶ−ＭＡを非吸着分画
中に回収した。
ー力ラム クロマトグラフィー（ゲルミノ（Ｇｅｒｍｉ
ｎｏ）等、、 ＰＮＡＳ ８０ ：６８４８−６８５２
．１９８３）又はフェニル セファロースにおける疎水
性相互作用クロマトグラフィー（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ）、アブサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウ
ェーデン）によってβ−ガラクトシダーゼから分離精製
した。フェニルセファロース カラムをＰＢＳで平衡さ
せて、レニンで分離した融合蛋白質にカラムによるクロ
マグラフを行い、そしてこのＥＢＶ−ＭＡを非吸着分画
中に回収した。
（３２）
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号 庁内整理番号０発 明
者 ニドワード エム、ス アメリカ合衆国。
者 ニドワード エム、ス アメリカ合衆国。
コルニク ド、ウイツクフイ
１９０９６ ペンシルヴアニア、ウインウツールド ロ
ード ８１１ ６４０−
ード ８１１ ６４０−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 エンドペプチターゼ、レニンによって開裂可能な
アミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ配列
。 ２、 ＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧＴＣＴＡ
Ｃ。 ＣＡＣＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＧＴＣＴＡ
Ｃ。 ＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＧＴＣＡＴＡ ＣＡＣ，
若しくはＣＡＣＣＣＧ ＴＴＣＣＡＣＣＴＧ ＧＴＣＡ
ＴＡ ＣＡＣ又はこれと同じアミノ酸配列をコードする
等価なヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配
列を含む特許請求の範囲第１項のＤＮＡオリゴヌクレオ
チド。 ３、アミノ酸配列 Ｐｒ０Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ 。 Ｈｉｓ Ｐｒ０Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ、又はＰｒｏＰｈａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｈｉｓ 。 Ｈｉｓ Ｐｒ０Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｈｉｓｏを含むペプチドをコードするオリゴヌクレ
オチド。 ４、複数の異なった領域を含む蛋白質をコードする複数
の遺伝子を有するベクターであって、各々の領域の間に
挿入した特許請求の範囲第２項のオリゴヌクレオチドを
有するベクター。 ５、二つの異なった領域を含む蛋白質をコードする二つ
の遺伝子を有する特許請求の範囲第４項のベクター。 ６、オリゴヌクレオチドが二つの領域の正確な接合部で
挿入される特許請求の範囲第４項のベクター。 ７、特許請求の範囲第４項のベクターを有する原核宿主
又は真核宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61408584A | 1984-05-24 | 1984-05-24 | |
| US614085 | 1984-05-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60262595A true JPS60262595A (ja) | 1985-12-25 |
Family
ID=24459802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60110614A Pending JPS60262595A (ja) | 1984-05-24 | 1985-05-24 | レニンによる部位特異性たんぱく質分解 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0163573B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60262595A (ja) |
| AT (1) | ATE46188T1 (ja) |
| DE (1) | DE3572843D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02501618A (ja) * | 1986-10-02 | 1990-06-07 | マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー | タンパク質の代謝的安定性を調節する方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707358A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | The University Of Chicago | Vaccine against Epstein-Barr Virus |
| EP0244147A3 (en) * | 1986-04-28 | 1989-04-05 | Merck & Co. Inc. | Purification process for hybrid proteins |
| DE3706233A1 (de) * | 1987-02-26 | 1988-09-08 | Behringwerke Ag | Immunogene fusionsproteine, die epstein-barr-virusproteine enthalten |
| US5013653A (en) * | 1987-03-20 | 1991-05-07 | Creative Biomolecules, Inc. | Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage |
| US5215896A (en) * | 1987-03-20 | 1993-06-01 | Creative Biomolecules, Inc. | Leader sequences for the production of recombinant proteins |
| WO1991011454A1 (en) * | 1990-01-24 | 1991-08-08 | The Upjohn Company | Method of purifying recombinant polypeptides |
| US5594115A (en) * | 1990-04-09 | 1997-01-14 | Pharmacia & Upjohn Company | Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process |
| WO1996033288A1 (en) * | 1995-04-17 | 1996-10-24 | Dekalb Swine Breeders, Inc. | Gene marker associated with swine proliferacy |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0035384A2 (en) * | 1980-02-29 | 1981-09-09 | The Regents Of The University Of California | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned DNA coding sequence |
| EP0089626A2 (en) * | 1982-03-19 | 1983-09-28 | G.D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
-
1985
- 1985-05-20 EP EP85400985A patent/EP0163573B1/en not_active Expired
- 1985-05-20 DE DE8585400985T patent/DE3572843D1/de not_active Expired
- 1985-05-20 AT AT85400985T patent/ATE46188T1/de active
- 1985-05-24 JP JP60110614A patent/JPS60262595A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0035384A2 (en) * | 1980-02-29 | 1981-09-09 | The Regents Of The University Of California | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned DNA coding sequence |
| EP0089626A2 (en) * | 1982-03-19 | 1983-09-28 | G.D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02501618A (ja) * | 1986-10-02 | 1990-06-07 | マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー | タンパク質の代謝的安定性を調節する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0163573B1 (en) | 1989-09-06 |
| DE3572843D1 (en) | 1989-10-12 |
| EP0163573A1 (en) | 1985-12-04 |
| ATE46188T1 (de) | 1989-09-15 |
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