JPS62279A - ヒトライノウイルスのウイルス蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトライノウィルス株２　（ＨＲＶ２＞のウィ
ルス蛋白質の全体または部分に相当するベブヂド、これ
らのベブヂドをコードするデオキシリボ核酸分子および
これらの物質の利用に関する。

ライノウィルスはＲＮＡウィルスであって、ウィルスの
慣用分類によれば、ピコルナウィルスＨに属する属を形
成する〔クーパー°ほか（Ｃｏｏｐｅｒ。

Ｐ、Ｄ、、　　八ｇｏｆ、１１．Ｌ、、　　Ｂａｃｈｒ
ａｃｈ、ｔ１、Ｌ、、　　Ｂｒｏｗｎ、Ｆ、。

Ｇｈｅｎｄｏｎ、Ｙ、、　　Ｇｉｂｂｓ、八１．．　　
Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、Ｊ、Ｈ，。

Ｌｏｎｂｅｒｇ−ｌｌｏｌｍ、に、、Ｈａｎｄｅ１、Ｂ
、、Ｈｅ１ｎｉｃｋ、Ｊ、Ｌ、。

Ｈｏｈａｎｔｙ、Ｓ、Ｂ、、　　Ｐｏｖｅｙ、Ｒ，Ｃ，
、Ｒｕｏｃｋｅｒｔ、Ｒ，Ｒ，、。

５ｃｈａｒｆｅｒ、Ｆ、Ｌ、＆　　Ｔｙｒｒｅｌ１、Ｄ
、Ａ、Ｊ、）　　、１９７８　。

インターパイロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　
）　、１旦、１６５〜１８０；マクノー１−ン（Ｈａｃ
Ｎａｕａｈｔｏｎ　）、１９８２、カレント・トビット
クス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イミュノ
ロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐ、　　Ｈｉｃｒｏｂｉ
ｏ１、　　Ｉ＋＋＋ｎ＋ｕｎｏ１．）　、９７　。

１〜２６〕 ライノウィルスは普遍的で、ヒトの上気道を攻撃し、寒
気、咳、声がれ等を伴い通常感冒と呼ばれる急性感染症
を惹起する（ス１−ットほか（ＳＯｔｔ、Ｅ、Ｊ、　　
＆　　にｉ　ｌ　Ｉ　１ｎｏｔｏｎ、Ｒ，八、）１９７
２．　　アニューアル・レビュー・オブ・マイクロバイ
オロジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　）ｌｉｃｒｏｂｉｏ１
、）　、２６　、５０３〜５２４〕。ライノウィルスに
につて起こる感染症はヒトの最も一般的な疾患のひとつ
である。これらの疾患の経過は一般に危険ないが、感冒
は生体の一時的消耗を招く。これが他のウィルスまたは
細菌の二次感染を起こし、これが場合によっては重篤な
疾患を沼くことがある。また、ライノウィルスによって
生じる経演的損失ははかり知れないものがある。アメリ
カ合衆国におけるライノウィルス感染症による１年間の
損失は２偉労働日または登校日以上と計算されている〔
ディビスはか（Ｄａｖｉｓ、Ｂ、Ｄ、、　　ロｕｌｂｅ
ｃｃｏ、Ｒ，，Ｅｉｓｅｎ、Ｈ，Ｎ、　　＆Ｇｉｎｓｂ
ｅｒｇ、１１．ｓ、　）　、１９８０　、マイクロバイ
オロジー（ＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏＱＶ）　、３版、ハー
バ−・アンド◆う１り（Ｈａｒｔ）Ｏｒ　＆　ＲＯＷ、
　ＮｅＷ　Ｙｏｒｋ）刊、１１１４頁〕。さらに、最近
では、ライノウィルス感染症の大規模な集団発生が増加
してきている。他の大部分の感染症はその病原が永久的
なあるいは持続的な免疫を付与するのに対して、ライノ
ウィルスが引き起こす感染症はくり返しくり返し再発す
る。

持続する免疫を欠く理由はライノウィルスに多数の株が
あることである。これまでに１００を超えるライノウィ
ルス株が単離されていて、たがいに免疫学的交差反応を
示すものはないかきわめてわｆかｒある（７オツクス（
Ｆａｘ、Ｊ、Ｐ、）　、１９７６゜アメリカン・ジャー
ナル・オブ・エビデミオロジ−（八ｍ、　　Ｊ、　　［
ｐｉｄｅｍｉｏ１、　　）　　、　　１　０３．　３４
　５〜３５４：メルニツク（Ｈｅｌｎｉｃｋ、Ｊ、Ｌ、
　）　、１９８０、プログレス・イン・メディカルφパ
イロロジ−（Ｐｒｏｇ、　Ｗｅｄ、　Ｖｉｒｏ１、　）
　、２６．２１４〜２３２）。感染を生じたのちには、
特定のウィルス株に対する抗体を検出できるが、これら
は他のライノウィルスに対する防御効果は付与しない。

多数の株が全人類の間を循環しているので、ライノウィ
ルスによる反復感染の可能性はある。

本発明の目的は、したがって、ライノウィルスにより引
き起こされる感症症から防御する薬剤を製造することで
あった。

高度免疫血清を用いて、計９０種のライノウィルス血清
型の５０様が１６群に分類されている〔コニ−ほか（Ｃ
０ｎｎｅＶ、　Ｈ，に、、　ＦＯＸ、Ｊ、Ｐ、＆にｅｎ
ｎｙ。

Ｇ、Ｅ、）　、１９８２、インフエクション・アンド・
イミユニティ−（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）　、
３７．６４２〜６４７）。他の形の分類が細胞レセプタ
ーに対する結合に基いて行われている。実際、その免疫
学的性質においては著しい異原性があるにもかかわらず
、う忙ノウイルスは細胞表面上のレセプターへの結合に
関してはたがいに類似性を有する。

拮抗実験によれば、Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞で検討した２４株
のライノウィルスについでわずか２種の異なるレセプタ
ーしか存在しないことが明らかにされている〔アブラハ
ムはか（Ａｂｒａｈａｍ、　Ｇ、　＆Ｃｏ１ｏｎｎｏ、
Ｒ，Ｊ、　）　、１９８４、ジャーナル・オブ・パイロ
［］ジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏ１、　）　、５ユ、３４０〜
３４４〕。この群は無作為に選ばれた株であることから
、この所見は他のライノウィルスにも拡大できるものと
考えられる。しかしながら、これらの結果はｌ−１ｃ　
Ｌ　ａ　Ｉｆ胞について得られたものであって、必ずし
もヒト上気道の天然宿主細胞におけるレセプターに適用
できるかどうかは不明である。

本発明の他の目的は、ウィルス蛋白質の全体または部分
に相当し、無傷のウィルスに対する免疫応答を刺激する
かまたは細胞レセプターに結合もしくは細胞レセプター
を遮断することができるオリゴペプチドを製造すること
にある。

典型的なピコルナウィルスとして、ライノウィルスは一
本鎖ＤＮＡを含有し、これは４個のＶＰｌ　（ＰＩＤ）
、ＶＰ２　（ＰＩＢ）、ＶＰ３（ＰＩＧ）およびＶＰ４
　（ＰＩＡ）として知られたポリペプチドからなるキＶ
ブシドによって包まれている〔メダパほか（Ｍｅｄａｌ
）Ｉ）ａ、に、Ｃ，、ＨｃＬｅａｎ。

Ｃ，＆　Ｒｕｅｃｋｃｒｔ、Ｒ，Ｒ１）、１９７１．パ
イロロジーＢｉｒｏｌｏｏｙ）　、±４，２５９〜２７
０　：カツコ内の記号はリュカートら（Ｒｕｅｃｋｃｒ
ｔ、Ｒ，Ｒ，＆　　　　　１４１ｍ１ｅｒ、Ｅ、　）　
、１９８４、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　
Ｖｉｒｏ１、　）　、５迫、９５７〜９５９に提案され
た相当する新命名法によるものである〕。１個のウィル
ス粒子はこれらのポリペプチドそれぞれの６０個のコピ
ーを含んでいる。各種ライノウィルスにおける相対質量
は、ＶＰｌで３４．０００〜３６．０００；ＶＰ２で２
７．０００〜３０，０００．ＶＰ３で２４．０００〜２
８゜０００、ＶＰ４で７．０００〜８．０００である（
マクツートン、１９８２、前出）。ライノウィルスのそ
の他の性質としては、０１１５以下で急速に不活性化さ
れること、高濃度の塩溶液に感受性を示すことなどがあ
る。さらに、大部分のライノウィルスの至適生育温度は
３３〜３４℃である〔ラリラほか（Ｌｕｒｉａ、Ｓ、Ｅ
、、　Ｄａｒｎｅｌ１、Ｊｒ、Ｊ、Ｅ、。

Ｂａ１ｔｉｉｉｏｒｅ、Ｄ、　＆　Ｃａｍｐｂｅｌ１、
Ａ　）　、１９７８　、ゼネラル・バイオロジー（Ｇｅ
ｎｅｒａｌ　ＶｉｏｌｏＱＶ　）　、３版、ジョン・ウ
ィリー・アンド・ザンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５
ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、３０８頁以下〕。

１１１１ｕ約７，１００ヌクレオヂドの一重鎖ＲＮＡは
このウィルスのゲノムを構成し、また同時にウィルス蛋
白質の合成のためのマトリックスとして作用する。ヌク
レオチド配列の大部分がまず長鎖のポリ蛋白質に翻訳さ
れ、これから蛋白分解によって最終的なウィルス蛋白質
が形成される（バター’７−ス（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔ
ｈ、Ｂ、Ｅ、）　、１９７３　、パイロロジ−（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）　、５６．４３９〜４５３：マクリーンほ
か（ＨｃＬｅａｎ、Ｃ，＆　Ｒｕｅｃｋｅｒｔ、Ｒ，Ｒ
，）、１９７３、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ
、Ｖｉｒｏ１、）　、１１．３４１〜３４４　：マクリ
ーンほか（ＨｃＬａａｎ、Ｃ，、Ｈａｔｔｈｃｗｓ、Ｔ
、Ｊ、　＆　Ｒｕｅｃｋｅｒｔ、Ｒ。

Ｒ，）、１９７６、ジャーナル・オブ・パイロロジ−（
Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ）　、エユ、９０３〜９１４〕。この
過程での生成物には、ウィルス被覆蛋白質ＶＰ１゜ＶＰ
２．ＶＰ３およびＶＰ４のほかに、多数の蛋白質たとえ
ばＰ３Ｃ，Ｐ３Ｂ、Ｐ３ＣおよびＰ３Ｃがある。Ｐ３Ｂ
　（一般にはＶＰｏとして知られる）はＨＲＶ２−ＲＮ
Ａの５′末端ヌクレオヂドに共有結合する。ポリオウィ
ルスの場合と同様に、Ｐ３Ｃはウィルスポリ蛋白質の処
理に一部関与するプロテアーゼと考えられている（マク
ツートン、１９８２、前出）。Ｐ３ＣはウィルスＲＮＡ
複製のためのポリメラーゼである。Ｐ２Ｇ蛋白質の機能
については、現在（７）ところほとんどわかっていない
。

ウィルスポリ蛋白質の処理過程では、アミノ酸配列の部
分が切り出され、ついて分解される（マクリーンほか、
１９７６、前出）。これらのペプチドが未発見の機能を
有するか否かについては現時点では不明である。

ライノウィルス株ＨＲＶ２の配列に関しては、３′非翻
訳領域、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐ３Ｃ）、ＶＰ（］　（
Ｐ３Ｂ）の配列のみが本発明名らの研究グループによっ
て明らかにされているにすぎない（スカーノほか（５ｋ
ｅｒｎ、　Ｔ、　、　Ｓｏｍｍｅｒｇｒｕｂｅｒ、　Ｈ
，。

Ｂｌａａｓ、Ｄ、、　Ｐｉｅｌｅｒ、Ｃｈ、　＆にｕｅ
ｃｈｌｅｒ、　Ｅ、　）　、１９８４、バイｏｎジー（
ＶｉｒＯＩＯ（ＩＶ）　、１３６．１２５〜１３２；ス
カーノはか（５ｋａｒｎ、　Ｔ、　。

５Ｏ１ｌＯｒＱｒＬｌｂＯｒ、Ｗ、、　　Ｂｌａａｓ、
Ｄ、、　　Ｐｉｅｌｅｒ、Ｃｈ、　　＆°にｕｅｃｈｌ
ｅｒ、Ｅ、　）　、１９８４、第６＠国際ウィルス学会
、仙台、抄録Ｐ８〜２０）。このヌクレオチド配列をポ
リオウィルス（１型）および口蹄疫ウィルス（亜型Ａ１
２）と比較しても、３′非翻訳領域には有意なホモロジ
ーは認められない。

ＨＲＶ２の３′非翻訳領域は４２個のヌクレオチドから
なり、他のピコルナウィルスに比べて著しく短く、これ
は驚くべきことである。一方、ＲＮ△ポリメラーゼ領域
については、ＨＲＶ２とポリオウィルスの間にアミノ酸
配列のかなりのボモロジーが認められる（５６％）。口
蹄疫ウィルスのＲＮＡポリメラーゼとの間のホモロジー
は２７％にすぎない（スカーノほか、１９８４、バイ１
］［１ジー、前出）。これらのデータはライノウィルス
とエンテロウィルスの間の著しい類似を示している。た
とえば、ポリオウィルスではＲＮＡの５′末端ヌクレオ
チドへの結合はヂロシンによって起コルが、ｔｌ：ｔｔ
はＨＲＶ２（７）ＶＰＱ　（Ｐ３Ｂ）でも保持されてい
る（スカーノはか、１９８４、第６回国際ウィルス学会
抄録、前出）。エンテロウィルスとの類縁性は、）ＩＲ
Ｖ２、ヒトライノウィルス株ＨＲＶ１４（スタンウェー
はか（Ｓｔａｎｗａｙ、Ｇ、、　ｌｌｕｇｈｓ、Ｐ、Ｊ
、、　Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ、Ｒ，Ｃ，。

ｕｔｎｏｒ、ｐ、ｏ、　ａ＾Ｉｏ＋ｏｎｄ、Ｊ、Ｉ４．
）　、１９８４、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃ１、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｃｓ、）、１２１７８５９〜
７８７７）とポリオウィルスの闇の配列比較によっても
明らかにされた。

ウィルス出発原料を得るために、）−１ｅＬａｌｌｌｌ
１ｍを適当な感染培地中でＨＲＶ２に感染させ、至適生
育条件で数時間インキュベートした。

ウィルスは細胞からも、培地からも得ることができた。

各種精製工程を経て、ウィルスプレバレージョンが得ら
れた。その典型的な蛋白質パターンは第１図に示すとお
りである。

ウィルスＲＮＡは、このウィルスプレバレージョンから
、たとえば、フェノール抽出し、精製し、ついでこれを
逆転写酸素とブライマーＣＤＮＡとしてオリゴｄＴを用
いて逆転写することにより得られた。生成したＲＮＡ／
ｃＤＮＡハイブリットを単独重合的に拡大し、適当なプ
ラスミドたとえばＤＢＲ３２２に導入した。

ＲＮＡの逆転写、ＲＮＡ−ｃＤＮＡバイブリドのプラス
ミドへの組込みおよび細菌の形質転換の方法の利用につ
いて多くの文献がある〔キタムラほか　（に１ｔａｌｌ
Ｊｒａ、Ｎ、　　＆　　Ｗｉｉｇ＋ｅｒ、　　Ｅ、）　
、　１９８０　、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ブライマ・オブ・アメリカ（ＰｒＯＣ。

Ｎａｔ１、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　）　
　、　−７二−７９、３１９６〜３２００：ネルソンほ
か（Ｈｅｌｓｏｎ、Ｔ、　＆　Ｂｒｕｔｌａｇ、Ｄ、）
、９７９、メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．）　、５８．４１〜５０
；ゼインほか（Ｚａｉｎ、Ｓ１、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
、Ｊ’、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、。

にｅｌｌｅｒＪ、、　　Ｆｒ１ｅｄ、Ｈ，＆　Ｄｕｎｎ
、Ａ、　　）　　、１９７９、セル（Ｃｅ１１）　、１
支、８５１〜８６１　：ロイチャウドハリーはか（Ｒｏ
ｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、Ｒ，＆　Ｍｕ、Ｒ，）、１９８
０、メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　Ｅｎｚｙｍｏ１、）　、６５　、４２〜６２　；キ
タムラはか（にｉｔａｍｕｒａ、Ｎ、、　５ｅａｌｅｒ
、Ｂ、Ｌ、。

Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、Ｐ、Ｇ、、　Ｌａｒｓｅｎ、Ｇ、Ｒ
，、Ａｄｌｅｒ、Ｃ，Ｊ、。

口ｏｒｎｅｒ、＾、Ｊ、、　　Ｅｎｉｎｉ、Ｅ、Ａ、、
　　１ｌａｎｅｃａｋ、Ｉｔ、、　　Ｌｅｅ、　　Ｊ。

Ｌ、、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、　Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ、Ｃ，Ｊ　＆　Ｗｉｓｅｅｒ。

Ｅ、）、１９８１、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２
９１．５４７〜５５３；パンデルウニＪレフはか（ｖａ
ｎｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、　Ｂｒｅａｃｏｅｒｅ、Ｆ
、、にｏｐｅｃｋａ、ｔ１、。

にｉｔａｍｕｒａ、Ｎ、、　Ｒｏｔｈｂｃｒｇ、Ｐ、Ｇ
、、　Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、Ｐ、。

Ｗｉｓｅｅｒ、Ｅ、　＆　Ｇｉｒａｒｄ、Ｈ，）　、１
９８１　、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ブライマ・オブ・アメリカ（ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）　　、　７　８　
　、５９８３〜５９８７　；ナモトほか（Ｎａｍｏｔｏ
、Ａ、、　Ｏｍａｔａ、Ｔ、、　Ｔｏｙｏｄａ、Ｈ，。

にｕｇｅ、Ｓ、　、　　１ｌｏｓｉｅ、ＩＩ。、　　Ｋ
ａｔａＯｋａ、Ｙ、、　　Ｇｅｎｂａ、＾。

Ｈａｋａｎｏ、Ｙ　＆　Ｉｍｕｒａ、Ｎ、　）　、１９
８２、ブ０シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ブライマ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１
、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、７９．５７９３〜５７９７；ス
タンウエーホか（ｓｔａｎｗａｙ、ａ、、　Ｃａｎｎ、
Ａ１．。

Ｈａｕｐｔｍａｎｎ、Ｒ，、Ｈｕｇｈｃｓ、Ｐ、、　Ｃ
１ａｒｋｅ、Ｌ、Ｄ、。

Ｈｏｕｎｔｒｏｒｄ、Ｒ，Ｃ，、Ｍｉｎｏｒ、Ｐ、Ｄ、
、　５ｃｈｉｌｄ、Ｇ、Ｃ，、＆＾１＋＋ｏｎｄ、Ｊ、
Ｗ、　）　、１９８３、ヌクレイツク・アシズ命リサー
チ（Ｎｕｃ１、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　、１１．５
６２９〜５６４３）。

適当な宿主生物体たとえば大腸菌ＨＢ　１０１の形質転
換後、゛プラスミドミニブレバレージョン法”を用いて
プラスミドＤＮＡを単離し、組換えＤＮＡのサイズを測
定した。このためには、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
ｌを用いて組換えプラスミドを切断し、フラグメントを
電気泳動で分離し、公知（７）Ｉａｍｂｄａ−１−１ｉ
　ｎ　ｄ　Ｉ［ｌ　Ｎ／−カーＤＮＡと比較した。

ＤＮＡをサブクローニングするためには、組換えｐＢＲ
３２２クローンのｐｓｔｌ消化で得られたＤＮＡフラグ
メントを適当なベクター、たとえばプラスミドｐＵＣ９
に導入し、ついで組換えベクターを適当な宿主、たとえ
ば大腸菌ＪＭＩＯＩに形質転換させた。組換えベクター
での形質転換が成功したサブクローンを培養し、そのプ
ラスミドＤＮＡを単離し、精製した。

長さの異なる２個のブライマーフラグメント〔５９ヌク
レオチド（フラグメントＡ）および６８ヌクレオチド（
フラグメントＢ））が２個のサブクローンから単離され
、精製された。この相補的−重鎖ＤＮＡを用いてＨＲＶ
　２−　ＲＮ　Ａの３２ＰＪａ識逆転写体が得られた。

組換えＤＮＡ中のＨＲＶ２配列を調べるために、プラス
ミドＤＮＡをＰＳｔｌで消化し、電気泳動で分析し、Ｄ
ＮＡフラグメントをゲルからニトロセルロースフィルタ
ー上に移し、固定した。これらのＤＮＡ保持フィルター
を放射標識ＨＲＶ２−ＣＤＮＡでハイブリダイズし、つ
いでフィルターをｒＡ露した。この方法で得られたｌ−
Ｉ　ＲＶ　２−ＲＮＡに相補的な組換えＤＮＡフラグメ
ン１−から、制限部位をマツピングし、配列を決定した
。

ＨＲＶ２のゲノムを表わすクローンが得られた。

１（ＲＶ２ゲノムの配列を第４図に示す。これは組換え
ＤＮＡの配列決定から得られたＤＮ’Ａの形で示しであ
る。配列決定のためには１７のクローン（第３図）とさ
らに２５のクローンを用いた。

配列は３′−末端ポリ−Ａを含まないで７１０２のヌク
レオチドからなる。これは鎖長２５０のアミノ酸をもつ
ポリ蛋白質をコードする読み取り枠を含んでいる。この
読み取り枠は６１１位のＡＵＧで始まり、ポリへの開始
前４２ヌクレオヂドのＵＡＡ停止コドンで終わる。

５′末末端列は、クローン番号６１，１００および１０
９から、ブライマーとしてフラグメントＡを用いて得ら
れたく第３図）。配列決定により、この３種のクローン
はすべて、プラスミドへの組込み部位から生じた、オリ
ゴ−Ｇにすぐ隣接する配列Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｃ
を含ｌυでいることが明らかにされた。これから、これ
らのクローンは）−ＩＲＶ２ゲノムの５′末端を構成す
るものと結論された。

この配列は３種類のポリオウィルスの最初の７個のヌク
レオチド、すなわち、コクサラキーウィルス８１（ヒュ
ーレツ１−ほか（Ｉｌｅｗｌｅｔｔ、Ｈ，Ｊ、　＆Ｆｌ
ｏｒｋｉｅｗｉｃｚ、Ｒ，Ｚ、　）　、１９８０、プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナルアカデミ゛−・オ
ブ・サイエンシズ・オ゛ブ・ザ・ユナイテッド・ブライ
マ・オブ・アメリカ（ｐｒｏｃ、　８８口、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　）　、７７．３０３〜３０７；スタンウェーほ
か（Ｓｔａｎｗａｙ、　Ｇ、　、　Ｃａｎｎ、　Ａ、　
Ｊ、　、　ｌｌａｕｐｔｍａｎｎ、　Ｒ，。

Ｈｕｇｈｅｓ、Ｐ、、　Ｃ１ａｒｋｅ、Ｌ、Ｄ、、　Ｈ
ｏｕＭｆｏｒｄ、Ｉｔ、Ｃ。

Ｈｉｎｏｒ、Ｐ、Ｄ、、　５ｃｈｉｌｄ、Ｇ、Ｃ，＆　
Ａｌｍｏｎｄ、Ｊ、Ｗ、　　）　、１９８３、前出〕お
よびＨＲＶ−１４（スタンウェーはか（Ｓｔａｎｗａｙ
、Ｇ、、　ｔｌｕｇｈｅｓ、Ｐ、Ｊ、、　Ｈｏｕｎｔｆ
ｏｒｄ。

Ｒ，Ｃ，、）ｌｉｎｏｒ、Ｐ、Ｄ、　　＆　　八ｌｎ＋
ｏｎｄ、Ｊ、ｌｆ、）、　１９８４　、前出〕に相当す
る。５′末端と長い読み取り枠の間の６１０のヌクレオ
チドを解析したところ、多数の短い読み取り枠の存在が
認められた。

ＨＲＶ２の５′末端領域のヌクレオチド配列をＨＲＶｌ
４およびポリオウィルス１型のそれと比較したところ、
高度なホモロジーがみられる。挿入を考慮してもＨＲＶ
２とＨＲＶｌ　４の間のこの領域にａ３けるホモロジー
は６５％、ＨＲＶ２とポリオウィルス１型の間でのボモ
ロジーは５５％であった。一部の領域ではホモロジーが
とくに大きかった。ＨＲＶ　２とＨＲＶ１４の５′末端
領域には１６またはそれ以上の同じヌクレオチドが順次
連続するブロックが全部で５種類あった。

ＨＲＶ２とポリオウィルス１型の比較でも同一の配列が
５ブロツクみられ、（の中わずか２個がＨＲＶ１４に認
められたものと同じだった。

ＨＲＶ２で、塩基４３６で始まる１６個のヌクレオチド
の配列と、塩基５３１で始まる２３個のヌクレオチド配
列とである。

アミノ酸配列の比較では、ホモ［１ジーの領域がポリ蛋
白質をコードする領域まで続いていることが明らかにな
かった（第５図）。ＨＲＶ２とＨＲＶ　１４の間のホモ
ロジーは多くの場合、Ｎ　ＲＶ　２とポリオウィルス１
型の間のそれよりも大きくないかまたはわずかに大きい
のみであったことはとくに注目に価する。＋」ＲＶ　２
とポリオウィルスの間のＶＰ４領域におけるホモロジー
、また小部分ではポリメラーぜにおけるホモロジーも、
ＨＲＶ２とＨＲＶｌ４の間のホモロジーより大きいこと
は全り驚くべきことである。

旧分類では、ライノウィルスはピコルナウィルス科に属
する別個の属と考えられていたことからも、これは全く
意外な事実である。ＨＲＶｌ４とポリオウィルスの間に
もホモロジーが見出されていて、この結果から最近、ラ
イノウィルスとエンテロウィルスはピコルナウィル科内
のひとつの属に一緒に分類すべきことが提案されている
（スタンウェーほか、１９８４、前出）。しかしながら
、ほかに、ＨＲＶ２と）ＨＲＶｌ４の間の類似性が１−
ＬＲＶ　２とポリオウィルスの間の類似性よりもかなり
大きいいくつかの遺伝子たとえばＶＰＩ。

ＶＦ６．ＶＰＱおよびプロテア−ぜがある。

ＶＰＩの領域には最小のホモロジーがみられることも注
目づ−べきである。

実施例に記載したような得らた部分配列をさらに支持す
るために、クローン化ＨＲＶ　８９から得られた遺伝子
フラグメントと比較した。

ＨＲＶ　８９はｌ−Ｉ　ＲＶ　２について述べたと同様
にして生育させた。ｌ−Ｉ　ＲＶ　８９は特異的抗血清
（ＡＴＣＣＶＲ−１１９９ＡＳ／ＧＰ）によって中和さ
れたが、対照血清として用いたＨＲＶ２に対づる抗血清
（ＡＴＣＣＶＲ−１１１２ＡＳ／ＧＰ）は作用しなかっ
た。ウィルスＲＮＡの単離、特性の検問、クローニング
、クローンの単離、１１５　にび配列決定は１−ＩＲＶ
２について述べたと同様に実施した。第８図は明らかに
Ｐ３ＡおよびＰ３Ｂ　（ＶＰｏ）の遺伝子に相する領域
を表わす、１−Ｉ　ＲＶ　８９のクローン３４／１から
得られた部分配列との配列比較を示している。アミノ酸
配列における広範なホモロジーが明らかである。化学的
に近い関係のアミノ酸、たとえばアルギニン（Ｒ）対リ
ジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）対イソロイシン（■）、ロイ
シン（Ｌ）対イソロイシン（Ｉ）等の間の置換が頻繁に
認められる。ホモロジーから明らかなように、Ｐ３Ａと
Ｐ３Ｂ　（ＶＰｇ）の闇の推定切断部位は完全に保持さ
れている。しかしながら、アミノ酸配列が異なる小領域
がある（ＨＲＶ２のヌクレオチド５１０８〜５０２９に
相当する領１ｍり。この意味はまだ明らかではない。

Ｐ３Ａの機能については何もわかっていない。したがっ
て、他の亜型のＨＲＶ２がこの領域でＨＲＶ８９と高度
のホモロジーを示寸可能性は否定できない。この理由か
ら、上述のハイブリダイゼーション条件によって定義さ
れるＪ：うなＨＲＶ２　　ｃＤＮＡとその核酸をハイブ
リダイズして、この領域でＨＲＶ８９と高度なホモロジ
ーを示すようなＨＲＶ２の伯の亜型および／またはライ
ノウィルスも本発明の範囲に包含される。

ウィルス蛋白質はポリ蛋白質から蛋白分解によって得ら
れる。切断部位の決定のためには、ウィルス被覆蛋白質
を単離し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。この方法で
、ウィルス被覆蛋白質の切断部位が明瞭に同定されたの
みでなく、ヌクレオチド配列に由来した読み取り枠も確
認された。そのヌクレオチド配列に由来のアミノ酸配列
と比較することにより、ＶＰ２／ＶＰ３の切断はグルタ
ミンとグリシンの間で、ＶＰ３／ＶＰＩの切断はグルタ
ミンとアスパラギンの間で起こることが明らかである。

本発明はｌ−Ｉ　ＲＶ　２のウィルスＲＮＡに関する情
報を含有するＤＮＡの製造を可能した。

しかしながら、本発明はそのウィルス蛋白質を特異的に
コードする遺伝子配列に関するのみでなく、たとえば突
然変異、分解、転位または付加によって得られた暉飾体
をも包含する。示した配列に比べて退化した各配列が包
含される。示した配列またはその部分と緊縮条件下、た
とえば８５％以上好ましくは９０％以上のホモロジーを
示すように選択された条件下でハイブリダイズし、ウィ
ルス活性スペクトルを有する蛋白質を］−ドする配列も
包含される。ハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ１
５Ｘデンハルト溶液／１％ＳＤＳ中、６５℃で実施する
。緊縮の程度は洗浄工程において決定される。号なわら
、ホモロジー約８５％以上のＤＮＡ配列の選択のために
適当な条件は０．２ＸＳＳＣ１０，０１％ＳＯ８／６５
℃、ホモロジー約９０％以上のＤＮＡ配列の選択のため
に適当な条件は０．ｌＸ５ＳＣ１０，０１％ＳＯ３／６
５℃である。

このＤＮＡは、増殖させるためにも、また適当な宿主生
物の形質転換後にその蛋白質の発現を行うためにも、そ
れ全体またはフラグメントを適当なプラスミドベクター
に導入することができる。

これらの操作に適当な宿主、ベクターおよび条件は、す
でに、本技術分野の熟練者によく知られているとおりで
ある。同様に、遺伝子工学による細菌中での外因性蛋白
質の合成については、多くの研究が報告されている〔通
覧にはハリス（Ｈａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｊ、Ｉ１、　）　、
”遺伝子工学（ＧＯｎｅｔｉＣＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｏ
　）　”　、ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、
Ｉｔ、　）編、１９８３、第４巻、アカデミツク・プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ）
、１２７頁以下参照〕。この目的では、外因性のＤＮＡ
をプラスミドの適当な細菌性ｆｊｌｌｌｌ領域（プロモ
ーター、リポソーム結合部位）の近傍に導入する。これ
によって、この情報を−多くの場合、融合蛋白質の形で
−ｈ収率で発現させ、相当する蛋白質を得ることができ
る。ピコルナウィルスの領域では、すでにウィルス遺伝
子の細菌内発現について記載した多くの報告がある〔キ
ュパーはか（にＩＪＤＤｅｒ、＋１．、　Ｋｅｌｌｅｒ
Ｊ、、にｕｒｚ、Ｃ，、Ｆｏｒｓｓ、Ｓ、。

５ｃｈａ４１ｃｒ、Ｉｔ、、　ｒｒａｎｚｅ１、Ｉ１、
、　５ｔｒｏｈａ＋ａｉｅｒ、に、。

Ｈａｒｑｕａｒｄｔ、Ｏ，、１ａｓｌａｖｓｋＶ、Ｖ、
Ｇ、　＆　Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ。

Ｐ、Ｈ，）、１９８１、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　
、２８旦、５５５〜５５９；クライトはか（にＩｅｉｄ
、　Ｄ。

Ｇ、、　Ｙａｎｓｕｒａ、Ｄ、、　Ｓｍａｌ１、Ｂ、、
　Ｄａｒｂｃｎｋｏ、Ｄ、。

Ｈｏｏｒｅ、Ｄ、）１．、　Ｇｒｕｂｓ＋ａｎ、Ｈ，Ｊ
、、　ＨｃＫｅｒｃｈｅｒ、Ｐ、Ｄ、。

Ｈｏｒｇａｎ、０．０．、　Ｒｏｂｃｒｔｓｏｎ、Ｂ、
Ｈ，＆　Ｂａｃｈｒａｓｈ、１１．Ｌ、）、１９８１、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、２１４．１１２５
〜１１２９　：ワイコウスキーはか（１４ｙｃｈｏｗｓ
ｋｉ、Ｃ，、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、　５ｉ
Ｎｅｒｔ、０．。

Ｃｒａｉｎｉｃ、Ｉｔ、、　Ｂｒｕｎｅａｕ、Ｐ、　＆
　Ｇｉｒａｒｄ、Ｈ，）　、１９８３、イーエムビーオ
ー・ジャーナル（ＥＭＢｏＪ、）、上ユ、２０１９〜２
０２４　：クランプはか（旧ｕｍｐ、１４．．　Ｈａｒ
ｑｕａｒｄｔ、Ｏ，＆　ｌ１ｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、
Ｐ。

１１、）、１９８４、ブＯシーデイングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オプ・アメリカ（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　
、８１．３３５１〜３３５５：Ａネカツクはか（１ｌａ
ｎｅｃａｋ。

Ｒ，、５ｅａｌｅｒ、Ｂ、Ｌ、、　　Ａｒｉｇａ、Ｈ，
、八ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃ，Ｗ、　　＆Ｗｉａ＋ｍｃｒ、
Ｅ、、）　、１９８４、セル（Ｃｅｌｌ）　、３７．１
０６３〜１０７３）。

原核生物は発現にとくに好ましい。たとえば、大鮎菌に
１２、株２９４（ＡＴＣＣＮＱ３１４４６）または大腸
菌Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ順３１５３７）である。上述
の株のほかに、大股内Ｗ３１１０Ｆ’″、１ａｉｂｄａ
−、ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ　（Ａ　Ｔ　ＣＧＮＱ２７３
２５）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｂｔｉｌｉｓ　）および他の腸内細菌たとえばサルモ
ネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐ
ｈｉｌＩｕｒｉｕｍ　）またはセラチア・マ〜ルセセン
ス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｃｓｃｅｎｓ　）およ
び各種プソイドモナス属細菌が使用できる。

一般には、宿主ＩＩＩ胞と適合性のある種に由来のレプ
リコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、こ
れらの宿主と組合せて使用できる。ベクターは通常、レ
プリコン部位に加えて、形質転換細胞を表現型で選択可
能にする認識部位をもっている。たとえば、大腸菌は通
常、大腸菌の種に由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２
で形質転換される〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）ほか
：ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２．９５　（１９７７））。

ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン抵
抗性をコードする遺伝子を含有し、したがって形質転換
細胞を同定する簡単な方法を使用できる。ざらに、ｐＢ
Ｒ３２２プラスミドまたは他のプラスミドはプロモータ
ー自体を含むかあるいは微生物がそれ自身の蛋白質の発
現に使用できるプロモーターを含むように修飾しなけれ
ばならない。組換えＤＮＡの製造にしばしば用いられる
プロモーターはβ−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）と
ラクトースプロモータシステムを包含する（チャン（Ｃ
ｈａｎ（１）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕ’ｒｃ）　、
２旦、６１５　（１９７８）：イタクラ（［ｔａｋｌＪ
ｒａ　）はか：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、１
９８．１０５６　（１９７７）；ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ　）　ホか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、　２８
１．５４４　（１９７９））。また、トリプトファン（
ｔｒｐ）ブロモ−クーシステムを包含する〔ゲデル（Ｇ
ｏｃｄｄｅｌ　）ばか：ヌクレイツク・アシズ・リリー
ーヂ（ＮＵＣＩ。

八ｃｉｄ、　　Ｒｅｓ、）　　、　旦、　４０５７　　
（１９８０）　　、　ＥＰ−Ａ−０，０３６，７７６〕
。これらはもつとも一般に使用されるプロモーターであ
るが、伯の微生物プロモーターもｕｆ１発されている。

本発明の遺伝子配列は、たとえばバタテリオファージラ
ムダの左方プロモーター（Ｐ、）の制御下に使用するこ
とができる。このプロモーターはとくに強力でかつ制御
可能な公知のプロモーターのひとつである。制御はその
隣接制限切断部位がわかっているラムダリプレッサーに
よって可能である。

このリブレツリー遺伝子の温度感受性対立遺伝子は、完
全ウィルスＤＮＡ配列を含むベクター中に挿入できる。

温度が４２℃に上昇すると、リプレツーは不活性化され
、プロモーターはその最高濃度まで発現する。これらの
条件下に産生された全ｍＲＮＡは、その新しい合成リボ
核酸の中で、Ｐ１プロモーター由来の部分を約１０％含
む細胞を得るのに十分でなければならない。この方法で
、官能性ウィルスＤＮＡ配列が、ラムダＰ、プロモータ
ーから様々の距離でリポソーム結合部位の付近に位置す
るクローンバンクを確立することが可能である。これら
のクローンについてチェックし、最高の収率を示すもの
が選ばれる。

ウィルスＤＮＡ配列の発現および翻訳は、その非形質転
換型の微生物に対して相同とみなされる他の調節システ
ムの制御下に実施できる。たとえば、ラクトース依存性
大腸菌からの染色体ＤＮＡは、酵素β−ガラクトシダー
ゼを分泌してラクトースを分解するラクトースまたはＩ
ａｃニーオペロンを含有する。

ｌａｃ制御要素はバクテリオファージラムダ−８ｐｌａ
ｃ５から得られ、これは大腸菌に感染する。

ファージのｒａｃ−オペロンは同一の細菌種から形質で
得ることができる。本発明の方法に使用できる調節シス
テムは、その微生物本来のプラスミドＤＮＡから得るこ
ともできる。ｌａｃニープロモーター・オペレーターシ
ステムはＩ　ＰＴＧによって誘導することもできる。

他のプロモーター−オペレーターシステムまたはその部
分も同様に使用でき良好な結果を与える。

たとえばアラビノース・オペレーター、コリシンＥ１−
オペレーター、ツー−オペレーター、キシロース−Ａオ
ペレーター、ｔａＣ−プロモーター等である。

遺伝子は発現プラスミドｐＥＲ１０３中で発現させるの
が好ましい（ラスル・ドウツーキン（Ｅ。

Ｒａ５ｔｌ−ロｗｏｒｋｉｎ　）ほか：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、２ユ、２３７〜２４８　（１９８３）、およびヨ
ーロッパ特許出願筒８３１１２８１２．９号、ＤＳＭ？
！託番号２７７３．１９８３年１０月２０日〕。これら
のベクターはすべて、クローン化遺伝子に対して高い発
現率を導く調節要素を含んでいる。

原核生物のほかに、真核微生物体たとえば培養酵母も使
用できる。サツカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がｂつとも一
般的な真核生物であるが、他の多くの種も得ることがで
きる。サツカロミセスでの発現の場合、たとえばプラス
ミドＹ王ｐ７（ステインチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
）ほか：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２８２．３９
　（１９７９）：キングスマン（にｉｎｇｓｍａｎ）ほ
か：ジーン（Ｇｅｎｅ）　、７．１４１（１９７９）；
チンヤバ−（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ　）ほか：ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）　、１０．１５７（１９８０））、Ｊ３よびプ
ラスミドＹＥｐ１３（ブワツＡ　（Ｂｗａｃｈ　）ほか
：ジーン（ａｅｎｅ）　、旦、１２１〜１３３（１９７
９））が慣用される。プラスミドＹＲｐ７は、１〜リブ
トフアンを含まない培地中では生育できない酵母変異株
の選択可能マーカーでＴＲＰＩ遺伝子を含んでいる。た
とえばＡＴＣＣＮα４４０７６である。

酵母宿主ゲノムの特性として１−　ＲＰ　１欠陥の存在
は形質転換の検知に有用である。この場合、培養をトリ
プトファンなしで行う。これは酵母遺伝子ＬＥＵ２を含
むプラスミドＹＥｐ１３の場合と同じで、この場合はＬ
ＥＵ−２−マイナス変賃株を補充に使用することができ
る。酵母ベクターに適当なプロモーター配列は、ＡＤＨ
ｌの遺伝子の５′側部領域〔アマツー（Ａｍｍｅｒｅｒ
、　Ｇ、　）　、メソツズ・オブ・エンザイモロジー（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎｏ１、）、１０１．１９２
〜２０１　（１９８３））、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ヒツツエマン（ＩＩ　ｉ　ｔｚｅｍａｎ　）は
かニジＶ−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏ１、　Ｃｂｃ鵬、）、２５旦、２０７３
　（１９８０））　、または他の解糖酵素（力’７”ｔ
−キほか（Ｋａｗａｓａｋｉ　＆　Ｆｒａｅｎｋｅｌ　
）　、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ−］ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎｕｎ、　）　、１０８
．１１０７〜１１１２（１９８２））、たとえばエノラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒド
ロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ビルベートデｈルポキシ
ラーピ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−〇−ホ
スフェートイソメラーゼおよびグルコキナーゼを含有す
る。適当な発現プラスミドの構築により、これらの遺伝
子に伴う末端配列を発現すべき配列の３′末端で発現ベ
クターに挿入し、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結
を確保することもできる。

生育条件によって制御される転写の利点ももつ他のプロ
モーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ−２、イソシ
トクロームＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に結合す
る分解酵素、上述のグリセロアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼおよびマルトースとガラクトース
の処理に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母
接合型遺伝子座によって調節されるプロモーター、たと
えば遺伝子ＢＡＲ１、ＭＦα１．５ＴＥ２．５ＴＥ３お
よび５ＴＥ５のプロモーターも、温度依存性■Ｌ変異体
の使用により温度調節システムに用いることができる（
ライン（Ｒｈｉｎｅ　）　、オレゴン大学（Ｅｕｇｅｎ
ｅ、　Ｏｒｅｇｏｎ）博士論文（１９７９）；ハースコ
ヴイツチはか（ｔｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　＆Ｏｓｈｉｍ
ａ）　、　　”Ｍｍサツカロミセスの分子生物学（Ｔｈ
ｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈ
ｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）″第１部
、１８１〜２０９（１９８１）、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラホラトＩＪ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１ｌａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）。これ
らの突然変異は酵母の静止接合型カセットの発現、した
がって間接的に接合型依存プロモーターに影響する。し
かしながら、一般には、酵母適合性プロモーター、複製
のオリジンおよび末端配列を含む任意のプラスミドベク
ターが適当である。

微生物のほかに、多細胞生物の培養物も宿主生物体とし
て適当である。理論的−には、これらの培養物は、を椎
動物または無を椎動物いずれのものでもよい。しかしな
がら、を椎動物細胞の培地中での増殖（組織培養）は１
ｄ近ではルーチンな方法になっている点で好ましい〔ク
ルーズはか（Ｋｒｕｓｅ　＆　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　）
編、組織培養（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　）　、ア
カデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　）
　、１９７３）。この種類の有用な宿主生物系の例には
、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ１ｌ胞、ハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞ならびにＷ１３８．１３ＨＫ、ＣＯ３−７お
よびＭＤＣＫ［ｌ胞系がある。

これらの細胞の場合の発現ベクターは一般に（必要なと
きは）複製部位、発現すべき遺伝子の上流にあるプロモ
ーター、それとともに必要ならばリポソーム結合部位、
ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および
転写終結配列を含む。

哺乳類動物の細胞を使用する場合、発現ベクタン中の制
御機能はウィルス材料から得ることが多い。たとえば、
通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウ
ィルス、とくにシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）か
ら得られる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは
、いずれもウィルスからＳＶ４０のウィルス複製部位も
含むフラグメントとして容易に得ることができるのでと
くに有用である（ファイアース（Ｆｉｅｒｓ　）ほか：
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７３．１１３（１９
７８））。ＳＶ４０の小または大フラグメントも、それ
がウィルス複製部位においてＨｉｎｄＩ［［切断部位か
ら８０１１切断部位までの約２５０ｂｐの配列を含ｌν
でいる限り使用できる。

さらに、通常所望の遺伝子配列に結合しているプロモー
ターまたはコントロール配列を、それが宿主ＩＩ胞系と
適合性を有する限り、使用することも可能であり、多く
の場合望ましい。

複製部位は外来遺伝子を導入するための相当するベクタ
ーの構築の際、たどえばＳＶ４０または伯ウィルス（た
とえばポリオーマ、アデノ、■Ｓ■等）から与えること
もできるし、また宿主細胞の染色体複製機構を利用して
与えることもできる。ベクターを宿主細胞の染色体に組
み込む場合は、通常、後省の方法で十分である。

細胞のベクターによる形質転換には多くの方法が使用で
きる。たとえばカルシウムを用い、細胞をマグネシウム
中で洗って、カルシウム中に懸濁したｍ胞にＤＮＡを加
えるか、ＩＩＩＩ胞をＤＮＡおよびリン酸カルシウムの
共沈殿に付すことによって達成できる。遺伝子発現後に
、細胞を形質転換細胞を選択するメジウムに移す。

宿主を形質転換後、遺伝子の発現と醗酵または細胞培養
は、本発明の蛋白質が発現する条件下に行い、生成物を
通常、公知のクロマトグラフィー分離法によって抽出し
、リーダー配列およびティリング配列をもつまたはもた
ないウィルス蛋白質を含む材料が得られる。本発明の蛋
白質はＮ末端にリーダー配列をもって発現されるが（ブ
°し蛋白質）、宿主細胞によってはこれを除去Ｊること
ができる。そうでない場合には、リーダーポリペプチド
を切断除去して成熟蛋白質を得る必要がある。

また、プレ蛋白質の代わりに微生物が直接成熟蛋白質を
産生ずるようにクローンを改変することもできる。この
例としては、酵母接合フェロモンＭＦ−α１のプレカー
サーを使用し融合蛋白質の正しいパ成熟″と生成物の生
育メジウムまたは細胞周辺腔への沈殿を起こさせる方法
がある。官能性または成熟蛋白質のＤＮＡ配列はＭＦ−
α１と推定切断部位で結合することができる。

関連蛋白質を細菌または原核生物中で製造するためには
、本発明によるＤＮＡを用いるほかに、そのヌクレオチ
ド配列に由来するアミノ酸配列のすべてまたは一部を合
成的に製造することもできる。

これらのオリゴペプチドも、遺伝子工学で製造した蛋白
質と同様に、無傷ウィルスに対する免疫応答を刺激する
ため、またはｉ胞しセプターへの結合もしくはその遮断
のために使用できる。ポリオウィルスに対する免疫応答
を刺激するためにオリゴペプチドを用いた研究が報告さ
れており〔エミニほか（Ｅｍｉｎｉ、Ｅ、Ａ、、　Ｊａ
ｍｅｓｏｎ、Ｂ、Ａ、　＆　Ｗｉｍｍｅｒ。

Ｅ、、）、１９８３、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、
３０．６９９〜７０３）、また同様なＱ１究が口蹄疫ウ
ィルスについても行われている〔ゼトルほか（Ｂｉｔｌ
ｌｅ、Ｊ、Ｌ、、　ＨＯＬＩＩ）ｈｔｏｎ、Ｒ，Ａ、、
＾Ｉｅｘａｎｄｅｒ、ｔ１．　。

５ｈｉｎｎｉｃｋ、Ｔ、Ｈ，、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ
、Ｇ、、　Ｌｅｒｎｃｒ、Ｒ，Ａ、。

Ｒｏｗｌａｎｄｓ、Ｄ、Ｊ、　＆　Ｂｒｏｗｎ、Ｆ、）
　、１９８２、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２９８
．３０〜３３；ファフほか（Ｐｆａｆｆ、Ｅ、、　Ｈｕ
ｓｓｇａｙ、Ｈ，、Ｂｏｔｖ、Ｈ，０，、５ｃｈｕｌｚ
。

Ｇ、Ｅ、　＆　５ｃｈａｌｌｅｒ、Ｉｆ、　）　、１９
８２、イーエムビーオー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）
、１．８６９〜８７４〕。本発明は、合成の結果としで
あるいは本発明の目的でたとえばワクチンのために他の
オリゴまたはポリペプチドと結合させる１−Ｉ　ＲＶ　
２蛋白質のオリゴおよびポリペチド成分をｂ包含するも
のである。

次に本発明の特徴および性質を以下の実施例によって説
明する。これはまた、本発明の態様を示すものであるが
、これは単に例示の意味であって、本発明を限定するも
のではない。

蛋白質（ポリペプチド）に関連して生物活性といった場
合は、これはその蛋白質（ポリペプチドが生物学的試験
において免疫応答を刺激することおよび／またはライノ
ウィルスの細胞レセプターとの反応に関与することを意
味する。

例１ １−Ｉ　ＲＶ　２の調製 １−１８　Ｌ　ａ　、ｍ胞（株ＨｅＬａ　−０ｈｉｏ、
　０３−１４７、ＦＩＯＷ　Ｉ−ａｂｏｒａｔｏｒｉｃ
ｓ、　ＩＥｎり１ａｎｄ）を３７℃で懸濁培養した。懸
濁培地〔トーマスはか（Ｔｈｏｍａｓ。

Ｄ、Ｃ，、Ｃｏｎａｎｔ、Ｒ，Ｈ，＆　Ｉｌａｍｐａｒ
ｉａｎ、Ｖ、Ｕ、）　、１９７０、プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ソサイアテイ・フォア・エクスベリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Ｐｒｏｃ、　
Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｈｅｄ、）　、１３３．６２〜６５ニスドツトほか（Ｓ
ｔＯｔｔ、Ｅ、Ｊ、　＆　Ｈｅａｔｈ、Ｇ、Ｆ、　）　
、１９７０、ジャーナル・オブ拳ジェネラル・パイロロ
ジー（Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏ１、　）　、６．１５〜
２４〕は、ジョクリク（Ｊｏｋｌｉｋ）改良懸濁用ＭＥ
Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ　０７２−１３００）および７％ウマ
血清（Ｓｅｒｏｍｅｄ　’０１３５）からなる。接種濃
度は５〜１０Ｘ１０’細胞／Ｉｄ、容量は５００ｄとし
た。ＩＩＩ胞濃°度１×１０６細胞／〆で懸濁液を滅菌
条件下３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引ろ
過し、細胞を１００ａｅの感染培地（２％ウマ血清およ
び２ｉＨＭｇＣ１２を含むジョクリク改良懸濁用ＭＥＭ
）に再懸濁した。２０−のピペットで注意深く数回吸引
して、細胞を感染培地中に均一に分散させた。

ついで容量を５００１ｄｌとした。細胞懸濁液を３４℃
とし、ＨＲＶ２　（２回プラーク精製）を細胞あたり０
．１ウイルスの多重度で感染させた。

ＨＲＶ２株はチレル（Ｔｙｒｒｅｌ１、Ｄ、）博士（コ
モン会コールドΦセンター（ＣＯＩＩｌＯｎ　Ｃｏ１ｄ
　ｃｅｎｔｒｅ）、サリスバリー、英国）より恵与され
たが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣＶＲ−４８２おにびＡＴｃｃ　　ＶＲ−１１
１２）からも入手できる。使用した株はＨＲＶ２　（ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コＬ／’）ジョン、Ａ
ＴＣＣＶＲ−１１１２Ａｓ／ＧＰ）に対する抗血清で中
和された。使用した対照血清はＨＲＶ７（ＡＴＣＣＶＲ
−１１１７ＡＳ／ＧＰ）に対する抗血清で、中和を示さ
なかった。３４℃に４０時間放置したのち、ウィルスを
収穫した。

ウィルスは細胞からもＩＩ飽フラグメントからも、また
培地からも得られた。この目的では、１０分間１５００
ｇで遠心分離し、メジウムを感染細胞および細胞フラグ
メントから分離し、ついで吸引濾過した。沈殿は一７０
℃に凍結した。

懸濁培養液１２１からの細胞沈殿を合し、ＴＭ１１１ｉ
ｉ液（２０１ＨＴｒｉＳ／ｌ（ＣＩ　、ｐ１１７　、５
．２１ＨｒｖｌＣ１２）４０ｄに再懸濁し、１５分間氷
上に置き、ついでダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモゲナ
イザーで破壊し、混合物を６０００ｔｊで３０分間遠心
分離した。次に沈殿をもう一度、７Ｍ緩衝液で洗浄した
。２つの上清を合し、５０００ｇで３時間遠心分離して
ウィルスをベレット化した。ウィルスベレットを１０ｄ
のＫＴＭＰ緩酉液（５０１８８ＫＣＩ、５０１８　　Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ７，５，５＋ａＨＭＱＣＩ　　、
２ｍＨメルカプトエタノール、１ｍＨビニＯマイシン、
０．５ｍＨＧＴＰ）を取り、１５Ｑ　ａ＋ｃｇのＤＮａ
Ｓｅｌ　（シグマ、リボヌクレアーゼを含まない）を添
加後、氷上で１時間インキュベートした。

４℃でポリエチレンゲルコール（ＰＥＧ６０００、メル
ク＞ｍ度７％および４５０ｍＨＮａＣｊ！と攪拌し、感
染培地からウィルスを沈殿させた〔コラントはか（にｏ
ｒａｎｔ、　Ｂ、　Ｄ、　、　Ｌｏｎｂｅｒａ−１１ｏ
１ｍ。

に６．　Ｎｏｂｌｅ、Ｊ、　＆　５ｔａｎｓｙ、Ｊ、Ｔ
、）　、１９７２、パイ０ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｏｙ）
　、４８．７１〜８６）、４時間冷却したのち、ウィル
スを１５００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿を７５＋１
ｃｇのＤＮａｓｅｌ含有ＫＴＭＰ［ｉ？Ｔ１１０＃！ｅ
にＭＩｌｍし、ｔ−１７）　混合物を氷上で１時間イン
キュベートし、ついで−７０℃で凍結した。

細胞から得られたウィルス懸濁液とメジウムから得られ
た懸濁液を合し、３７℃で５分間インキュベートし、６
０１ｄｌの冷ＴＥＭ衝液（１ＯｉＨＴｒｉｓ／　ＨＣｊ
！　、ｆｌｌ１７　、４．１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）
を加えて冷却し、ついで水浴中で５分間超音波処理した
。ついで６０００９で３０分間遠心分離した。

７％ＰＥＧ６００および４５０ｍＨＮａＣＪ含有ＴＥｌ
ｌｖｆＩ液９２０ａｅヲＪｊｌｔｋニアＪＯ，ｔ、４℃
で４時間注意深く攪拌し、生成した沈殿を３０分間、６
０００ｇでベレット化した。沈殿を再びＴＭ！ｌ衝液１
００ａｌ！に取り、上述のようにしてＰＥＧ６０００と
ＮａＣｊ！を加えて沈殿させ、ついでベレット化した。

沈殿を４０ｄの７Ｍ緩衝液に再懸濁し、懸濁液を６００
０ｇで３０分間遠心分離し、ウィルスを８５０００９で
３時間ベレット化した。沈殿を１ｄの７Ｍ緩衝液に溶解
し、５０１１１Ｃ（ｌのＤＮａｓｅｌを加えたのち４℃
で１時間インキュベートし、ついで１１ｄのＴＥ［ｉ液
を加えた。さらに精製するため、ウィルス懸濁液を蔗糖
勾配（ＴＥ緩衝液中１０〜３０Ｗ／Ｗ％）上、４℃、８
５０００９で４時間遠心分離した。ウィルスを含むフラ
クションを２６０　ｎｍの吸収で決定し、蔗糖の最終濃
度が１０％になるようにＴＭＭ衝液で希釈した。次に８
５０００ｇで８時間遠心分離した。ウィルスベレットを
Ｉｄの７Ｍ緩衝液に取り、−７０℃で保存した。ウィル
スプレバレージョンの純度のチェックのため、１２．５
％ポリアクリルアミドゲル上、０．１％ドデシル硫酸ナ
トリウムの存在下に電気泳動を行って〔レムリ（Ｌａｅ
ｌｌｌｉｌｌｉ、Ｕ、に、）　、１９７０．ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７７．６８０〜６８５〕、蛋白
質バンドをクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色し
た。ＨＲＶ２プレバレージョンの蛋白質パターンの典型
的な像を第１図に示す。

例２ ｃＤＮＡ−ＲＮＡバイブリドのクローニングＨＲＶ２プ
レバレージョンからのＲＮＡ抽出ウィルスを１１ＩＪ１
のＮＴＦＳ緩衝液（１００ｍＨＮａＣｊ！、１０　＋ａ
ＨＴｒｉｓ／　ｌ−Ｉ　ＣＩ　、ｐＨ９，１ｍＨＥＤＴ
Ａ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、フェ
ノールで抽出した。相分離を改善するためにクロロホル
ムを加えた。水相に２０１ＣＩの５Ｍ　　ＮａＣ１と２
０ｍｃｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ＥＩＨ５，６，）を加
え、ウィルスＲＮＡを２倍容のエタノールで沈殿した。

ウィルスＲＮＡの５′末端に共有結合しているＶＰａを
除去するため、ＲＮＡを次にＮＴＦＳ緩衝液中１１１ｇ
／ＩｄのプロテアーゼＫ（メルク）により３７℃で１５
分間消化した。リボヌクレアーゼにより夾雑物を除くた
めに、プロテアーゼに株溶Ｉ（５０■／ｄ）はあらかじ
め３７℃で１５分間インキュベートした。プロテアーゼ
に消化終了後、溶液を上述したと同様にフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、エタノールを添加してＲＮＡを沈
殿させた。このＲＮＡの小部分を、０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム含有ＴＡＥ緩衝液（１０１１ＨＮａＡｃ、
　４０ｉＨＴｒｉｓ／アセテート、Ｄ１１８．２．２　
ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）中、２％アガロースゲル上で電
気泳動に付して分離した。エチジウムプロミドと攪拌し
たのち、完全なＨＲＶ２−ＲＮＡのバンドが観察された
。その下部の弱い広がったバンドはＨＲＶ　２−　ＲＮ
　Ａのわずかな分解を示している。

１−Ｉ　ＲＶ　２−　ＲＮ　Ａを１ＱＩＩｃＩの水に溶
解し、５ｍｃｌの１０ｘＲＴ緩衝？ＴＥ　（１ｘＲＴ緩
衝液＝１０ＱｍＨＫＣｊ、１０ｍＭ　　ＭＱＣｊ！　　
、’５０ｉＨＴｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８，３）　、５＋
ａｃａオリゴ−ｄＴ（１２〜　１　８　　）　　　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　　Ｐ−＋　Ｂｉｏｃｈｃｏ＋１ｃａ
ｌｓ）　　、１０ｍｃＣｉ　（ｃｒ３２Ｐ）−ｄＣＴＰ
　（３０００Ｃｉ　／１１０１、Ａ１１ｅｒＳｈａｌｌ
　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。

Ｅｎｇｌａｎｄ　）　、１００　ｔＪの逆転写酵素（Ａ
ｎａｌｉａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ１．　
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）および２０　ｎｍｏｌのｄΔＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加え、全体、総容５
１５０＋ｃｌを４２℃で２時間インキュベートした。２
ＩＣＩの２５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ（Ｄ１１８）を添加し
たのち、フェノール／り０ロホルムによる抽出を行い、
水相をパスツールピペット中バイオゲル（Ｂｉｏａｅｌ
）　Ｐ　３０またはセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ
）　Ｇ　−２５カラムに適用した。

ＴＥ緩ＷＪ液を溶出に用いた。生成したｃＤＮＡ−ＲＮ
Ａバイブリドをこの方法で過剰の（α３２Ｐ〕ｄＣＴＰ
から分離し、１／１０容母部の３°Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ１５，６）と２容量部のエタノールを添加して沈殿
させた。

ｔ（ＲＶ２　　ＲＮＡ−ｃＤＮＡの延長はＯイチャウド
ハリーら（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　＆　Ｗｕ、　１
９８０、前出）の方法を用いて実施した。ＨＲＶ２　　
ＲＮＡ−ＣＤＮＡバイブリドを、ＴＴ緩衝液（２００ｍ
Ｈカコジル酸カリウム、２５＋ａＨＴｒｉｓ／ＨＣｊ！
　、ｐＨ６，９，０，５ｍＭ　　ＣｏＣｊ！　　、２ｍ
Ｈジチオスレイトール）５０ｍｃｌ中、２　ｎｍｏｌ　
（ａ　３”Ｐ　）ｄＣＴＰ　（５０ｉ／ｍｍｏｌ）の存
在下、２５Ｕのターミナルトランスフエラーぜ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ）と
、３７℃で５分間インキュベートした。０．２５Ｍ　　
ＥＤＴＡ　（＋）１１８）２ｍｃｌを添加後、フェノー
ル／クロロホルムで抽出を行い、ついで反応混合物を上
述したと同様にしてバイオゲルＰ３０カラム上りＯマド
グラフィーに付し、オルゴーｄＣ付加ＲＮＡ−ｃＤＮＡ
バイブリドをエタノールで沈殿ざＶた。

軌遺 オリゴ−ｄＣ付加ｒ（ＮＡ−ＣＤＮＡバイブリドを１０
０＋＋ｃｌのＮＴＥ！ｉｉｉ液（１００ｍＭＮａＣ１，
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／　１−ＩＣＩ　、ｐＨ７、６，
１１Ｎ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　’）に加え、Ｑ、３ｐｉｏ
ｌのｐＢＲ３２２プラスミド（ＰＳｔＩで切断し、オリ
ゴ−ｄＧ残基と重合させたもの、ａｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合して
、はじめ６５℃に５分間、ついで４２℃に２時間加熱し
、−夜で徐々に室温まで冷却し、４℃に保存した。

細胞形質転換のためには、株１−Ｉ　８１０１（ＤＳＭ
ｌ　６０７）を５０ａｌ！のＬＢメジウム（１１中トリ
プトン１０ｇ、酵母抽出物５ｊ、ＮａＣ１１０ｇ＞中で
培養した〔マンデルほか（Ｈａｎｄｅ１、Ｈ，＆　１ｌ
ｉｑａ、＾、）、１９７０、ジャーナル・オブ・モルキ
ュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｈｏｔ、Ｂ１１１．）　、呈ユ、１５９〜１６２）。形
質転換に適した細胞（コンピテント細胞）を得るために
、細菌をベレツ１〜化し、２５ｄのＴ　Ｒ緩衝液（１５
０ｍＨＫＣｊ！、５０＋ａＨＣａＣｊ！　　、１ｍＨＴ
ｒｉｓ／　ｌ−Ｉ　ＣＩ　、ＯＨ７，３ＩＩＨＭｇＣｊ
！２）に取り、３０分間氷上に置き、再び遠心分離し、
もう一度２ｍｌ！のＴＲｕｉ液に再懸濁し、氷上に１時
間置いた。ＨＲＶＩ　　ＲＮＡ−ｃＤＮＡバーｉ’ブリ
ドが挿入されたｐＢＲ３２２を含むこの混合物１００ｍ
ｃｌを２００ｍｃｌの細胞懸濁液に加え、また５ｍｃｌ
の１Ｍ　ＣａＣｌ２を加え、生成した混合物を０℃で１
時間インキュベートし、ついで４２℃で９０分間インキ
ュベートした。次に２ｄのＬＢメジウムを加え、混合物
を３７℃で１時間イキュべ一トした。細胞懸濁液を１０
ｍｃｏ／−のテトラサイクリン（シグマ）を含むＬＢア
ガール板（ＬＢメジウム中１．５％アガール）に適用し
、−夜インキユベートした。テトラサイクリン抵抗性ク
ローンをアンビシリンアガール板（アンピシリン１００
１１ＣＩ）　／ｘｉ！、シグマ）上アンピシリン抵抗性
について試験した。

組換えＤＮＡ分子の特性とその１１離”テトラサイクリ
ン抵抗性、アンピシリン感受性細菌のクローンをＬＢメ
ジウム（１０ｍｃｇテトラサイクリン／〆）ＧＩｄ中で
一夜培養し、プラスミドミニブレバレージョン法〔バー
ンボイムはが（Ｂｉｒｎｂｏｉｉ、１１．ｃ、　＆口ｏ
ｌｙ、　Ｊ、）−１１９７９、ヌクレイツク・アシズ・
リサーチ（Ｎｕｃ１、　Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、）、７，１１９５〜１２０４）を用いてプラス
ミドＤＮＡを単離し、組換えＤＮＡのサイズを制限酵素
ＰＳｔｌ消化により測定した。プラスミドＤＮＡを２５
ｍｃｉのＲＥ緩衝液０６ｍＮＭｑＣｊ！　　、１０ａ＋
ＨＴｒｉｓ／ＨＣＪ！、ｐＨ７、５、６ＩｌｌＨメルカ
プトエタノール）中、５（１＋ＨＮａＣｆとともに２Ｕ
の制限酵素Ｐｓｔｌ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＞と５　ｍｃｇのリボ
ヌクレアーゼＡの存在下、３７℃で２峙間インギュベー
ｈした。ついでプローブを１．４％アガロースゲル上電
気泳動に付して分離した。挿入体のサイズは、エチジウ
ムプロミド染色およびラムダｌ」１ｎｄｌｌマーカーＤ
ＮＡとの比較によって決定した。サイズは３００〜２０
００塩基対であった。

大量のＤＮＡ挿入体を単離するために、テトラサイクリ
ン抵抗性、アンピシリン感受性細菌クローンの２００ｍ
培養液から上述のようにしてプラスミドを得、Ｐｓｔｌ
で消化した。組換えＤＮＡフラグメントを上述のように
して、プレパラティブアガロースゲル上に分離し、その
バンドを切り出し、ＤＮＡを０．０５ＸＴＢＥ緩衝液（
１×ＴＢＥ緩衝液＝１００ｍＨＴｒｉｓ／ホＬｚ−ｔ−
１ｌ）Ｈ８，３，２ｔｎＨＥＤＴＡ）中電気溶出し、エ
タノールで沈殿さＵた。

大腸菌株ＪＭ１０１細胞中、ＤＩＪＣ９ベクターを用い
たサブクローニング プラスミドｐＵｃ９　（ビアイサほか（ＶｉｅｉＳａＪ
、　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｇ、　）　、１９８２、
ジーン（Ｇｅｎｅ）　、１旦、２５９〜２６８）は、ア
ンピシリン抵抗性に関する遺伝子、プラスミドｐＢＲ３
２２山来の複製開始領域、および大腸菌のＩａｃｚ遺伝
子を含有する。多くの制限部位を有する小ＤＮＡフラグ
メントはこのｌ　ａＣＺ領域に存在し、したがって、こ
れらの切断部位のひとつにおけるＤＮＡのクローニング
はＩａＣＺｉｆｉ伝子領域を中転子る。したがってＤＮ
Ａ挿入体を含有するコロニーはＸ−Ｇａ　Ｉ　（Ｘ−Ｇ
ａ　Ｉ　＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシド、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）インディケータ−
板上に白色コロニーとして現れるが、挿入体のないコロ
ニーは青色を示寸〔リュサー（Ｒ′Ｌｉｔｈｅｒ）　、
１９８０、モルキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Ｈｏｔ、　Ｇｃｎ。

ｃｅｎｅｔ、）、１７８．４７５〜４７８）、ＤＮＡ挿
入体をｐｔＪＣＱ中にサブクローニングするためには、
組換えｐＢＲ３２２クローン（約７１１ＣＱ）をＰＳｔ
ｌで消イヒし、アガロースゲル（１，２％〜１．４％）
上に分離したのち、ＤＮＡ挿入体をベクターＤＮＡから
分離した。ＤＮＡを上述のように電気溶出によってゲル
から分離し、エタノールで沈殿させて回収した。単離さ
れたＤＮＡ挿入体を２１１１ＣＩのＲＥ！！！！衝液中
、ｐＵＣ９ベタター（Ｐｓｔで切断し、細菌性アルカリ
ホスファターゼで前処理＞０．４ｇ＋ｃｇとともに、１
ｍＨＡＴＰおよび３ＵのＴ４−リガーゼ（Ｂｅｔｈ１３
ＳｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）の存在下に、１５℃で１時間インキニーベートし、４
℃に保存した〔ビアイリはか（Ｖｉｃｉｓａ、Ｊ、　＆
　Ｈｅ５ｓｉｎａ、Ｊ、Ｇ、）　、１９８２、前出〕。

同時に、形質転換にコンビテン１〜な、大腸菌株ＪＭ１
０１細胞（Ｎｅｗ　［ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）
を上述したと同様にして調製した。コンビテン１〜細胞
懸濁液２００ｍｃｌをｐＵＣ９リガーぜ反応混合物２０
１ＤＣＩ　と混合し、得ら机だ混合物を０℃で１時間イ
ンキュベートした。

熱ショック（９０秒、４２℃）後、細胞を１０ｍｃｉの
２００　ｍＭ　　イソプロピルチオガラクトシド（ジグ
ｖ）　、５０ｍｃｌのＸ−Ｇａ１２ＱＩｎｇジメチルホ
ルムアミド１ｄ溶液およびＬＢメジウム１ｒｄと混合し
、１ワられた混合物を３７℃で１時間インキュベートし
た。この細胞懸濁液２００ｍｃｌをアンピシリンＬＢ−
アガール板（１００ｍｃＯ／ｍｅ）上に移し、インキュ
ベーター中゛３７℃で一夜インキユベートした。陽性の
形質転換体はプラスミドミニプレバレージョン法を用い
てＤＮＡ挿入体について検討した白色のコロニーとして
同定された。

組換えＤＮＡの挿入されたρＵＣ９プラスミドの調製 得られたｐＵｃ９で形質転換芒れＤＮＡ挿入体を含有す
る大腸菌ＪＭ１０１のサブクローンをＬＢメジウム（１
００ｍｃｏアンピシリン１１ｄ含有）２００ｄ中で培養
し、プラスミドＤＮＡを単離した〔バーンボイムほか（
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、１１．ｃ、　＆　Ｄｏｌｙ。

Ｊ、）、１９７９、前出〕。ついでブーラスミドＤＮＡ
を１００ａ＋ｃｌのＴＥ！１衝液に溶解し、この溶液を
セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　）　−１０００カ
ラム（１×２０ＣｒＲ）上、ＴＥ緩衝液を用い、クロマ
トグラフィーに付した。精製プラスミドを含有するフラ
クションを吸収によって決定し、それらを合して凍結乾
燥した。プラスミドを５００ｉｃｌのＴＥ１１ｍ液に取
り、６５℃で５分間インキュベートし、再びフェノール
／クロロボルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。

相当するＤＮＡ挿入体を含むクローン７７３および８７
をｐＵＣ９中にサブクローニングし、２００ｄのＬＢメ
ジウム（１００ＩＩＩＣ（１７ンピシリン／Ｉｄ含有）
中で培養し、プラスミドを上述のようにして単離した。

クローン７７３から制限酵素△ｈａｌＩおよびＥＣ０Ｆ
？、Ｉ消化によりブライマーフラグメント（５９ヌクレ
Ａチド）が得られた。

（このブライマーフラグメントは第３図においてフラグ
メントＡと命名されている）。

この目的では、クローン７７３からの精製プラスミドを
２００＋ｎｃｌのＲ６１１ｍ液中、５０ｍＨのＮａＣ１
の存在下、３０Ｌｌ（７）ＥｃｏＲ（（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と
、３７℃で１５時間インキュベートした。反応終了後、
エタノールで沈殿させ、切断したプラスミドを１００ｎ
＋ｃｌ（７）ＲＥ緩函液中、５０ｍＨＮａＣ１の存在下
、４０ＵのＡ　ｈ　ａ　ＩＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎａｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）と、３７℃で１５時間インキ
ュベートした。制限酵素での消化パターンを１．４％ア
ガロースゲル上電気泳動によってチェックした。Ｅｃｏ
ＲＩ／八へａｌｌフラグメントを１００ｉｃｌのＯＧ溶
液（１％フイコル、１ｍＨＥＤＴＡｌｏ、０１％オレン
ジＧ）に取り、ＤＮＡを１ｘＴＢＥ緩衝液中緩衝液中プ
レパラティブリ５クリルアミドゲル（アクリルアミド／
ビスアクリルアミド＝１９：１、ゲル厚１．２ＩＩＲ＞
上で分離した。５９塩基対ＥｃｏＲＩ／Ａｈａｌ［［フ
ラグメントに相当するバンドをエチジウムプロミド染色
後に切り出し、このフラグメントを０．０５ｘＴＢＥ！
＄１液中で電気泳動し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ
た。っいでＤＮＡフラグメントを５０ｉｃｌの１００＋
ａＨＴｒｉｓ／トＩＣｊ！、Ｄ１１８中、２００Ｕの細
菌アルカリホスファターゼ（Ｂｃｔｈｃｓｄａ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、６５℃で
１時間インキュベートした。反応後、２．５１ＣＩの０
．５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８を加え、水相を２回フェノール
／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ
た。ＤＮＡを水に溶かし、５ＱＩＩＣＩのに緩衝液（１
０ｉＨＭＱＣ；１　．５０＋ｅＨＴｒｉｓ／Ｈ（１！、
０１１８．５ｇＨジヂＡエリスリトール）中、２０ｍｃ
Ｃｉ　　Ｔ　−（３２Ｐ）−ＡＴＰ　（比活性５００Ｑ
　Ｃｉ　／■ｏ１、　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ）および５Ｕのポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＰＬＬａｂｏｒａｔｏｒ　ｉ
ｅｓ　）と、３７℃で３０分間インキュベー］−シた。

３２Ｐで標識されたフラグメントを沈殿させ、１１１Ｈ
ＥＤＴＡおよび０．０１％キシレンシアノ−ルーブロモ
フェノールブルーを含む３０％ジメチルスルホキシド３
Ｑｍｃｌ中に取った。この溶液を９０℃で２分間インキ
ュベートし、氷上で冷却し、ＴＢＥ！ＩＩ！ｉ液中１５
％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアク
リルアミド＝５９：１、ゲル厚１．２Ｍ）に適用し、２
個のＤＮＡ鎖を電気泳動によってたがいに分離した（１
５時間、２００ボルト）。オートラジオグラムを用いて
２個の０ＮＡＩの位置を調べ、切り出し、電気溶出した
。ＨＲＶ２−ＲＮＡとハイブリダイズした鎖をドットー
ブＯツｌ〜実験によって決定した。すなわち、２Ｘ２Ｃ
Ｉ＋の２個のニトロセルロースストＩＪ　’／ブ（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌ１、ＢＡ　　８５．
０．４５１ｃｍ）を水で湿らせ、１日２０×ＳＳＣ（１
ｘＳＳＣ−１５０ｍｔ４　　ＮａＣｊ！、１５１１４ク
エン酸ナトリウム、ｐＨ７，４）で洗浄し、風乾した。

各ストリップに約１１１Ｃ（］のＨＲＶ２−ＲＮＡを点
滴し、乾燥し、８０℃で２時間インキュベートした。つ
いでストリップを２ＸＳＳＣで湿めらせ、１ｒｄの１４
緩衝液（４００＋ａＨＮａＣ１，４０ｉＨＰ　Ｉ　ＰＥ
５１０１１６．４．１ｍＨＥＤＴＡ。

８０％ホルムアミド）中、プラスチルックフィルム内で
、４１ｃ（ｌの変性サケ精子ＤＮＡ　（シグマ、１００
℃で２分間インキュベートし、０℃に冷１Ｊ］）と、−
Ｈにインキュベートした。ついで２個のニトロセルロー
スストリツプを別個に、プラスチックフィルム中に入れ
、それぞれに０．５ｄのｌ」緩衝液、４１１１ｃＱの変
性サケ精子ＤＮＡおよび単離鎖の一部＜２００００ＣＤ
Ｉ）を加え、４２℃で一部ハイブリダイズした。このイ
ンキュベーション後に、フィルターを２ＸＳＳＣで５０
℃において１０分間、２回、次に０．ｌＸ５ＳＣ１０，
１％ドデシル硫酸ナトリウムで５０℃において３０分間
洗浄し、放射能を測定した。Ｄト日ＩＶ２−８７からの
ブライマーフラグメントも同様にして単離した。このフ
ラグメントは２１１！ａｇ）ＲｓａＩ制限部位の間に存
在しく６８ヌクレオチド）、このｆｌｉｌｌ限酔索ぐ消
化して得られた。Ｒｓａｌフラグメントは第３図におい
てフラグメントＢと命名されている。鎖の分離およびハ
イブリダイゼーションｔま上述のようにして実施した。

上述のようにクローン７７３（フラグメントＡ）および
８７（フラグメントＢ）から単離された制限フラグメン
トからＨＲＶ２−ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ５ｐｍ
ｏｌをＨＲＶ２−ＲＮＡ０．２５Ｐｍｏ　ｌと一緒に、
水溶液からエタノールで沈殿させた。沈殿を２Ｑｍｃｌ
のト１緩衝液に取り、キャピラリーにｌ１人して７２℃
で１０分間インキュベートし、５０℃に移し、徐々に３
５℃まで冷却し、ついで氷上に置いた。ついで溶液を１
００１１１ＣＩのＲＴ緩暫液中、１４０Ｕの逆転写酵素
（ＡｎｇｌｉａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ、
、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　）　、８（ＪのリボヌクＬ／７
−ゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　１ｌ
ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、０．２
ｍＨｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ。

（ｊＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３０ｍｃＣｉ　（α”２Ｐ
）ｄ　ＣＴ　Ｐおよび５ｍＭジチオエリスリトールの存
在下、４２℃で２時間インキュベートした。得られた逆
転写体は上述のように処理した。

組換え体からのプラスミドＤＮＡを３ｄの培養液から単
離した〔バーンボイムほか（ＢｉｒｎｂＯｉｌｌｌ。

１１、Ｃ１＆　ＤｏｌＶ、Ｊ、）　、１９７９、前出）
、ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔｌとインキュベートし、プロ
ーブを１．４％アガロースゲル上電気泳動によって解析
した。ゲルはエチジウムプロミドで染色した。

ついでＤＮＡをゲルからニトロセルロースフィルターに
移して（サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｈ，）　、
１９７５、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ１、　）　、１８，５０
３〜５１７）、８０℃で２時間インキュベートしてニト
ロセルロース上に固定した。このフィルターを５０％ホ
ルムアミド、１Ｘデンハルト溶液〔デンハルト（Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ、Ｄ、Ｔ、　）　、１９６６、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミコニケ
ーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ
ｓ。

Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　）　、２３．６４１〜６４６）、、
９００１１８ＮａＣ１，５０−Ｈリン酸すｌ−リウム、
ｐＨ７，４，５ｍＷ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中、８０ｍｃｏ
／ｍｌ！の変性サケ精子ＤＮＡと、プラスチックフィル
ム内で４２℃において２時間ブレインキュベートした。

放射性ＨＲＶ２−ｃＤＮＡは、５０ｍｃＣｉ　（ｃｒ３
２ｐ）ｄＣＴＰを反応混合物に加えたほかは上述と同様
にして調製した。ｃＤＮＡ−ＨＲＶ２−ＲＮＡハイブリ
ットは１００℃で９０分間処理して変性させた。ハイブ
リダイゼーションのために、フィルターを放射性−ｃＤ
ＮＡと４２℃において１８時聞、上述したと同様にイン
キュベートし、２×ＳＳＣ中で２回、０．１％ドデシル
ｔａ酸ナトリウム中５０℃で３０分間２回、洗浄し、風
乾し、−７０℃で露出した（にｏｄａｋＸＡＲ−５、増
感フィルムで１８〜４０時間）。放射性バンドの存在は
、ＨＲＶ２−ＲＮＡに相補的な組換えＤＮＡ（７）存在
を示す。

ｉｌｌ限酵素地図の作成には、ＣＩＡ挿入体を制限酵素
（ＮｅＷ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ａｎｄ　
ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　）を用い、製造業者が特定した条件で消化を
行った。制限酵素作成の結果は第３図に示すとおりであ
る。プラスミドｐＨＲＶ２−１およびｐＨＲＶ２−２４
は、）（ＲＶ２−ＲＮＡの３′末端ポリ−への部分を形
成するＡｒＡ基の長配列を含有する（ターミナルトラン
スフェラーゼ反応によって生じる鎖の延長に対してトレ
ースできるＡリボ−Ｃに直接隣接）。

他のプラスミドは各制限酵素の特徴的切断部位を利用し
ＴｐＨＲＶ２−１およびｐＨＲＶ２−２４に関して配列
した。５００塩基対以下のＤＮＡｌｒｌｉ人体は制限酵
素マツピングによって分類しなかったが、そのままｐＵ
ｃＱ中にサブクローニングし、配列を決定した（第３図
参照）。

残ったクローンの同定は、グルンシュタイら〔グルンシ
ュタインほか（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｈ，＆ｔｌｏｇｎ
ｅｓｓ、Ｄ、Ｓ、）　、１９７５　、プロシーデイング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・サイエンシズ
・Ａブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔ
ｌｓ八）　、７２．３９６１〜３９６５）の方法を用い
、ニックトランスレーションプローブによりすでにマツ
ピングを行ったＤＮＡｌｉ人体を使ったコロニーハイブ
リダイゼーションによった。３２Ｐ−標識ＤＮＡプロー
ブはＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製
ニックトランレ−ショ’：ｚキット（Ａｎｃｒｓｈａｍ
　Ｋｉｔ　Ｎｏ　５　Ｑ　ＯＯ）を用い、〔α−”２Ｐ
）ｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ　）により製
造業者の指示書に従って得られた。

Ｉａ識ＤＮＡはＴＥ！Ｉｉｉ液中、パスツールピペット
内でＢｉｏｇｅｌＰ　３０カラムを用いて分離した。排
除容量に相当するフラクションを合し、１００℃に２分
間加熱し、直ちに氷水中に置いた。ハイブリダイゼーシ
ョンは上述したと同様に行った。陽性のハイブリダイゼ
ーションシグナルを示したコロニーから５０ｍ１！の培
養液を調製しくＬＢメジウム中、１０■Ｃ（１／ｄのテ
トラサイクリンと一部インキュベート）、ＤＮＡ挿入体
をプラスミドＤＮＡからＰｓｔＩで単離した。これらの
挿入体を各種制限酵素で消化し、配列決定に付して特性
を調べた。この方法で、ｌ−Ｉ　ＲＶ　２のゲノムであ
るクローンが得られた。

例３ ＤＮＡ配列決定 ＨＲＶ２のｃＤＮ△クローンの大部分はＨａＸａｌＲら
の方法の改良法を用いて配列決定を行った（マキリ゛ム
ほか（Ｈａｘａａ＋、Ａ、　＆　Ｇ１１ｂｃｒｔ、Ｗ、
　）　、１９８０、メソツズ・イン・エンザイモロジー
＜Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ１、）、６５．４９９
〜５６０）。

一部の配列についてはサンガーらのＭ−１３１ｆｉ分解
法によっても決定した〔サンガー他（Ｓａｎｇｃｒ。

Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｅｎ、
＾、Ｉｔ、）、１９７７、プロシーデイングズ・Ａブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ｐ
ｒｏｃ。

Ｈａｌ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７４，
５４６３〜５４６７〕。マキサムらの方法では、ＤＮＡ
挿入体を上述のようにｐｔＪＣＱ中にサブクローニング
し、それでコンピテント大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転
換した。陽性の形質転換体は白色コロニーとしてＩｌｉ
離され、これをＬＢメジウム（１００ｎｌｃ（１／ｄの
アンピシリン含有）中でインキュベートした。

１０〜２０ｒａＣｇのＤＮＡを１００Ｉｌｌｃｌ中、プ
ラスミド中、たとえばｐＵｃ９のポリリンカー領域中に
明所部位を有する制限Ｍ素（たとえば、ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、Ａｃｃ　Ｉ、Ｈｉ　ｎｄＩ［［）により標準
反応条件下で一夜消化した。ついで制限フラグメントを
脱リン酸化した。制限酵素消化には、５ｍｃｌの２Ｍ　
　Ｔｒｉｓ／ＨＣＪ！、ｐＨ８、および細菌アルカリホ
スファターゼ（ａｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を加え、６５℃で３時間イ
ンキュベートした。ＥＤＴＡを２ＱｍＨになるように加
えたのら、混合物をフェノール／クロロボルムで２回抽
出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させＩコ。次にＤＮＡ
を、５０ｉｃｌの５０ｉＨＴｒｉｓ／Ｈ（、ｉ、＋１１
１８．１０Ｉｌｔ４　　ＭにＪＣＩ　　　、５ｍＨジチ
オエリスリトール中、２５ｍｃＣｉの（ｒ−３”Ｐ）Ａ
ＴＰ　（５０００Ｃｉ　／ｍｍｏ１、Ａｎ＋ｅｒｓｈａ
ｎ＋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　）および４ＵのＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｌａｃｉａ−Ｐ
、−Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と、３７℃で３
０分間インキュベートし、標識ＤＮＡをエタノＬルで沈
殿させた。３２Ｐで標識された一本鎖の組換えＤＮＡは
ｐｔＪｃ９のポリリンカー領域を切断する他の制限酵素
を用いて得られた。

マキサムらの方法の改良法によるＤＮＡ配列決定 配列決定反応はマキサムらの以下の改良法によって実施
した〔マキサムほか（Ｈａｘａｍ、　Ａ、　＆Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ、１４．　）　、１９８０　、メソツズ・イン・
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎＺＶＩｎＯ１
、　）　、６５．４９９〜５６０）： 非担体ＤＮＡを加えた。

ＤＮＡ溶液を次の７リコツトに分けたニゲアニン（Ｇ）
特異性反応７．５ｍｃｌ　、グアニンＪ３よびアデニン
（Ｇ／Ａ）特異性反応１０ｎ＋ｃ１、シトシンおよびヂ
ミン（Ｃ／Ｔ）特異性反応１０ｍｃ１、シ１〜シン（Ｃ
）特異性反応５ｍｃ１ ９６％ギＭ２５ｍｃｌを（Ｇ／Ａ）反応混合物に加え、
１９℃で４．２５分インキュベートした。

反応の停止には２０Ｏｎ＋ｃｌのコドラジン停止溶液お
よび７５０ｍｃｌの９６％エタノールを添加した。

ついで、（Ｇ／Ａ）反応液を他の３種の反応液と全く同
様に処理した。

（Ｃ／Ｔ）および（Ｃ）反応の場合は、ヒドラジンの代
わりにヒドラジニウムヒドロキシド（メルク）を用いた
。反応時間は７．５分とした。

ヒベリジン反応液は９５℃で３０分間インキュベートし
た。凍結乾燥後、フラグメン１−を３〜２０ｎ＋ｃｌの
Ｍ衝液（８０％脱イオン化ホルムアミド、ＩＸＴＢＥ、
０．０５％ブＯモフエニールブルー１１３よび０．０５
％キシレンシアツール）中９５℃に９０秒間加熱し、直
ちに０℃に冷却した。

配列決定には、プローブの適用前に５０ワツトで１時間
電気泳動を行った６％ポリアクリルアミドゲル（４０ｎ
Ｘ２０Ｃ！ＡＸ０．４Ｍ＞を８Ｍ尿素および１ＸＴＢＥ
とともに用いた。各反応混合物１ｍｃｌ〜３ｍｃｌをゲ
ルに適用した。通常、時間かえて２回のゲルチャージを
行った。

反応混合物の第一のゲル通路はブロモフェノールブルー
マーカーがゲルの末端に到達するまで行い、第二のゲル
通路はキシレンシアツールマーカーがゲルの末端に到達
するまで行った。ついでゲルを１０％酢酸および１０％
メタノール中（約２１）２０分間処理して固定し、３８
Ｍ−ろ紙に移し、ゲルドライＸ７−十８０℃で乾燥した
。次にゲルを一７０℃で増感していないＸＡＲ−Ｏｍａ
ｔフイルム（Ｋｏｄａｋ）を用いて露出させた（約１８
〜３６時間）。

Ｍ１３配列決定 組換えＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａ　ｌで切断し、配列
決定パック（Ｎｅｗ　Ｅｎｏｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
　１カタログＮ（１４０９）を用いてＭ１３ｗ＋ｐ９の
Ｂａｍ−Ｈ１切断部位にクローニングした。配列決定は
、鎖切断法〔サンガーほか（Ｓａｎｏｅｒ、ｒ、、　Ｎ
１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、　＆Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｓ、）　
、１９７７、プロシーデイングズ・Ａブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・ザイエンシズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、７ｉ　５４６３〜５４６７）を用いて実施し
た。

配列決定データの解析 配列決定実験結果の解析にはＣｙｂｅｒ　１７０コンピ
ユーターを用いた。使用したプログラムは、５ｔａｄＱ
ｎプログラム〔ステイドン（５ｔａｄｅｎ、　Ｒ，）、
１９８０、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃ１
、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　、旦、３６７３〜３６９
４）と、Ｔｓｏｎｏ改良プログラム（イソメ（ｌ５ｏｎ
ｏ、　Ｋ、　）、１９８２、ヌクレイツク・アシズ・リ
サーチ（ＮｕＣ１、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、１旦、８
５〜８９〕である。

桝」− ウィルス蛋白質はポリ蛋白質から蛋白開裂によって得ら
れる。開裂部位を同定するために、ウィルス被覆蛋白質
を単離し、Ｎ末端アミノ酸を決定した。この目的にはＨ
ＲＶ２　２Ｉ＋Ｉ！ｊからの蛋白質を１２．５％ポリア
クリルアミドゲル上、電気泳動によって分離した（レム
リ、’ｌ　９７０１．前出）。

ケルを５０ｍＨＴｒｉｓ／　ｔ−Ｉ　ＣＩ　、１）１１
７　、４中飽和クーマシー・ブリリアント・ブルー溶液
で染色し、蛋白質バンドを切り出した。各蛋白質をｌ５
ＣＯ溶出装置により５０Ｖで電気溶出し、トリクロロ酢
酸で沈殿させた。Ｎ末端アミノ酸−をＡＢ−４７ＯＡプ
ロテインシクエンサ−（八ｐｐ、ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、　Ｉｎｃ１、　ＦＯ３ｔＱｒ　ｃｔｔｙ、　Ｃ
＾、　ＵＳＡ）を用いて決定した。配列決定には２ｎｍ
ｏｌのＰＶＩおよびＰＶ２ならびに１　ｔｖｏｌのＶＰ
３を用いた。各蛋白質のＮ末端配列を第６図に示す。

健ゑ ウサギに２５ｍｃｇのＨＲＶ２を５００ｍｃｌの完全フ
ロインドアジュバントに取って皮下注射した。

２１日および３５日後に１．５ｄ不完全フロインドアジ
ユバント中２５　ｍｃｇのＨＲＶ２でさらに免疫処置を
行った。最初の免疫処置から５０日後に血漿交換によっ
て血清を集め、−２０℃に保存した。抗体形成の検出に
は、ウィルス２１ｃＩＪを１５％ポリアクリルアミドゲ
ル（レムリ、１９７０、前出）に適用し、蛋白質を電気
泳動で分離した。

蛋白質をゲルから電気移送により、ウェスタンプロット
法でニトロセルロースフィルター膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ　＆　５ｃｈｉｉ１１，８＾８５．０．４５ｍｃｍ
）移した〔バーネツｌ−（Ｂｕｒｎｃｔｔｅ、Ｗ、Ｎ、
　）　、１９８１、アナリテイカル・バイオケミス１−
り一（Ａｎａ１、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１２，１
９５〜２０３）　　。

蛋白質が結合したフィルターを３％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）および３％ツイーン２０含有ＰＢＳ（１３７
ｍＨＮａＣ１，２，７ｍＨＫＣｆ、６．６ｗ＋ＨＮａ　
　ＨＰｏ　　、１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４）２０ｍＩｌ中
に１６時間浸漬した。２時開抗血清（ＰＢＳ／１％ＢＳ
Ａ／１％ツイーン２０で１：２００に希釈）と２時間イ
ンキュベートしたのち、フィルターを１％ＢＳＡと１％
ツイーン２０を含むＰＢＳ　（ＰＢＳＢＴ）２０ｄ中で
２０分間、３回洗浄し、ついでスタヒロコツカスオーレ
ウスからの　　ＩｖＡ識蛋白質（約１ｍＣ１／ＩＩＩｇ
）　１０ｍｃＱ　ｉとＰＢＳＢＴ２Ｃｌｄ中で２時間イ
ンキュベートし、ＰＢＳＢＴで２０分間３回、ＰＢＳ中
３×５分間洗浄し、手早く水で２回すすぎ、ろ紙を数枚
重ねた間に入れて一定乾燥させた。

ろ紙に結合した放射能をＫｏｄａｋＸＡＲ５Ｘ線フィル
ム上（２０時間／−７０℃）オートラジオグラフィーに
より測定した。第２図から明らかなように、この抗血清
はとくにＶＰｌに対する抗体を含む。

例６ 前述の例に述べたようにして得られた配列の部分をさら
にＷ１認するために、りＯ−ン化）−ＩＲＶ８９から得
られた遺伝子フラグメントとの比較を行った。アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから得たＨＲＶ
８９　（ＡＴＣＣＶＲ−１１９９）をＨＲＶ２１．：つ
いｒ述べたと同様に生育させた。ｌ−Ｉ　ＲＶ　８９は
特異的抗血清（ＡＴＣＣＶＲ−１１９９ＡＳ／ＧＰ）に
よって中和されたが、対照血清として用いた）−ＩＲＶ
２に対１６抗血ｒＰｉ（ＡＴＣＣＶＲ−１１１２ΔＳ／
ＧＰ）は全く作用を示さなかった。このウィルスＲＮへ
の単離、性質の検討、クローニング、クローンの単離お
よび配列決定はＨＲＶ２について述べたと同様に実施し
た。第８図にはＨＲＶ８９のクローン３４／１から得ら
れた部分配列との配列比較を示す。これは明らかにＰ３
ＡおよびＰ３Ｂ　（ＶＰｏ）に対する遺伝子に相当する
領域である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＲＶ　２の被覆蛋白質の、１２．５％ポリア
クリルアミドゲル上、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下
における電気泳動分離を示す分離図である。ＶＰ４は上
方、ゲル外に移動してしまって観察されない。 第２図は、ＨＲＶ２−ＲＮＡの２％アガロースゲル上、
ドデシル硫酸ナトリウムの存在下における電気泳動を示
す。リポソームＲＮＡマーカーの位置は右側に示す。 第３図はＨＲＶ２ゲノムの制限酵素地図である。 配列決定に用いた１７のオーバーラツプクローンを示す
。一部の制限酵素の特徴的切断部位を指示する。矢印（
Ａ、Ｂ）は逆転写にプライマーとして用いた制限フラグ
メントである。− 第４図は、クローン化１−（ＲＶ２の配列およびそれか
ら誘導されるアミノ酸配列を示す配列図である。ポリ蛋
白質の開裂部位は矢印で示す。黒い矢印（↓）は実験的
に決定された開裂部位で、白い矢印（冬）は他のど］ル
ナウィルスとのホモロジーに基づいて予想されるポリ蛋
白質の開裂部位である。 第５図は、ＨＲＶ２、ＨＲＶ　１４１１５ｉ　に　ヒホ
ＩＪ　；４−ウィルス１型の各遺伝子のアミノ酸配列の
比較図である（％）。 第６図は、ＨＲＶ２の被覆蛋白質のＮ末端アミノ酸配列
図である。 第７［ｉ！ｌは、ウィルスカプシド蛋白質ｖＰ１のＨＲ
Ｖ２の強力な抗原としての、ウサギにおける確認結果を
示す図である。 第８図は、ＨＲＶ２＋７）Ｐ３Ａ＃よびＰ３Ｂ（ＶＰ（
７）−とＨＲＶ　８９に対する遺伝子の領域におけるア
ミノ酸−およびヌクレオチド配列の比較図である。白い
矢印は他のピコルナウィルスとの比較から予測される開
裂部位である。 第９図はＨＲＶ　２の全ヌクレオチド配列図である。 第１０図はポリペプチドＨＲＶ２のアミノ酸配列図であ
る。 第１１図は、Ａニボリペブチド■Ｐ１のヌクレオチド配
列図、Ｂ：ポリペプチドＶＰ１のアミノ酸配列図、Ｃ：
ポリペプチドＶＰ１の推定ヌクレオチド配列図である。 第１２図は、Ａ：ポリペプチドＶＰ２のヌクレオチド配
列図、Ｂ；ポリペプチドＶＰ２のアミノ酸配列図、Ｃ：
ポリペプチドＶＰＩの推定ヌクレオチド配列図である。 第１３図は、Ａ：ポリペプチドＶＰ３のヌクレオチド配
列図、Ｂ：ポリペプチドＶＰ３のアミノ酸配列図、Ｃ：
ポリペプチドＶＰ３の推定ヌクレオチド配列図である。 第１４図は、Ａ：ポリペプチドＶＰ４のヌクレオチド配
列図、Ｂ：ポリペプチドＶＰ４のアミノ酸配列図、Ｃ：
ポリペプチドＶＰ４の推定ヌクレオチド配列図である。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）ライノウィルス株ＨＲＶ２の少なくとも１種のウ
   ィルス蛋白質をコードするＤＮＡ分子
2. （２）ライノウィルス株ＨＲＶ２の全ウィルスＲＮＡま
   たはウィルスＲＮＡの部分に相当する特許請求の範囲第
   １項記載のＤＮＡ分子
3. （３）ウィルス蛋白質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４
   、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３ＡおよびＰ３Ｃから構
   成されたウィルス蛋白質または上記ウィルス蛋白質の特
   定の少なくとも２種が任意所望の組合せで結合したウィ
   ルス蛋白質をコードする特許請求の範囲１項記載のＤＮ
   Ａ分子
4. （４）第４図に記載の配列またはその部分を含む特許請
   求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子
5. （５）ウィルス蛋白質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４
   、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３ＡまたはＰ３Ｃをコー
   ドする特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子
6. （６）ウィルス蛋白質の少なくとも１種に相当する蛋白
   質の生物活性を有する特許請求の範囲１項に記載のウィ
   ルス蛋白質の部分をコードするＤＮＡ分子
7. （７）コーディング配列を、特許請求の範囲第３項もし
   くは第６項のいずれかに記載のＤＮＡ分子またはこれら
   の分子の縮重変種と、８５％以上のホモロジーが認めら
   れるような緊縮条件下にハイブリダイズした特許請求の
   範囲第１項記載のＤＮＡ分子
8. （８）微生物中好ましくは原核生物もしくは真核生物中
   または哺乳類動物細胞中で複製できるように適当な発現
   ビークルたとえばプラスミド中に導入された特許請求の
   範囲第１項から第７項までのいずれかに記載のＤＮＡ分
   子
9. （９）特許請求の範囲第１項に記載のウィルス蛋白質を
   コードし、好ましくは宿主生物体中で複製できるビーク
   ル中に含まれている遺伝情報を含有する形質転換宿主生
   物体好ましくは原核生物もしくは真核生物、哺乳類動物
   細胞系とくに大腸菌
10. （１０）ライノウィルス株ＨＲＶ２のウィルス蛋白質の
    少なくとも１種の生物活性を有し、特許請求の範囲第１
    項から第７項までのいずれかに記載のＤＮＡ分子によつ
    てコードされ、ライノウィルス株ＨＲＶ２のウィルス蛋
    白質の少なくとも１種の一部もしくは全体に相当するか
    またはウィルス蛋白質もしくはウィルス蛋白質の部分少
    なくとも２種がたがいに任意所望の組合せおよび順序で
    結合しているポリペプチド
11. （１１）第４図に記載のアミノ酸配列またはその一部を
    含む特許請求の範囲第１０項記載のポリペプチド
12. （１２）ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、Ｐ２Ａ、Ｐ
    ２Ｂ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３ＡまたはＰ３Ｃのアミノ酸配列を含
    む特許請求の範囲１０項記載のポリペプチド
13. （１３）ライノウィルス株ＨＲＶ２の細胞リセプターに
    対して結合および（または）遮断能を有する、特許請求
    の範囲第１０項記載のアミノ酸配列から誘導されたポリ
    ペプチド
14. （１４）ａ）ライノウィルス株ＨＲＶ２のウィルスＲＮ
    Ａを単離し、 ｂ）ウィルスＲＮＡに相補的なＤＮＡを調製し、 ｃ）ウィルスｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリットを適当な複
    製可能ベクターに導入し、 ｄ）ｃで調製したベクターで適当な宿主生物体を形質転
    換する特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか
    に記載のＤＮＡ分子の製造方法
15. （１５）適当な宿主生物好ましくは特許請求の範囲第９
    項に記載の宿主生物体を特許請求の範囲第１０項から第
    １３項までのいずれかに記載のウィルスポリペプチドを
    コードする遺伝情報好ましくは特許請求の範囲第１項か
    ら第８項までのいずれかに記載のＤＮＡ分子に含まれる
    遺伝情報で形質転換し、宿主生物体中に特許請求の範囲
    第１０項から第１３項までのいずれかに記載のウィルス
    ポリペプチドを産生させるためにその遺伝情報を発現さ
    せ、特許請求の範囲１０項から第１３項までのいずれか
    に記載のウィルスポリペチドを単離する特許請求の範囲
    第１０項から第１３項までのいずれかに記載のポリペプ
    チドの製造方法
16. （１６）ライノウィルス株ＨＲＶ２に対する治療的処置
    および／または免疫系の賦活および／または細胞レセプ
    ターの遮断のための特許請求の範囲第１０項から第１３
    項までのいずれかに記載のポリペチドの利用
17. （１７）特許請求の範囲第１０項から第１３項までのい
    ずれかに記載のポリペプチド少なくとも１種の有効量と
    医薬用不活性アジユバントまたはビークルを含有する特
    許請求の範囲第１６項に記載の利用に適した医薬組成物