DE4027154A1 - Mutation der hrv2 2a - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide, die für ein modifiziertes aktives Zentrum der HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen die "cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen, vorzugsweise diese inhibieren.

Viele tierische und pflanzliche Viren benötigen während ihres Replikationszyklus den Einsatz von viral-kodierten Proteinasen. Die Picornaviren, eine Familie von bedeutenden human- und animalpathogenen Viren, sind zum Beispiel vollständig von einem proteolytischen Prozessieren abhängig. Die bei der Replikation involvierten proteolytischen Enzyme sind hoch Substrat-spezifisch und erkennen meist eine Spaltregion -also ein strukturell determiniertes Erkennungsmerkmal- und weniger ein genau definiertes Aminosäurepaar, wie es üblicherweise als Erkennungssequenz dient. Einen generellen Überblick zu dieser Thematik geben H.G. Kräusslich und E. Wimmer (1988, Ann. Rev. Biochem. 57, 701-751) und Kay, J. und Dunn, B. M. (1990, Biochim. Biophys. Acta 1048, 1-18) Die viralen Proteinasen stellen aufgrund ihrer Substratspezifität und ihres katalytischen Mechanismus einen guten therapeutischen Angriffspunkt dar (Johnston, M. I. et al., 1989, Trends Pharmacol. Sci. 10, 305-307). Durch die Bereitstellung der dreidimensionalen Struktur der Proteinasen des Rous Sarcoma virus (Leis, J. et al., 1990, ASM-News 56, 77-81) und von HIV I (Navia, M. A. et al., 1989, Nature 337, 615-620; Miller, M. et al., 1989, Science 246 1149-1152) ist es möglich, ein Computer-unterstütztes molekulares "designing" hoch spezifischer Inhibitoren durchzuführen (Meek, T. D. et al., 1990, Nature 343, 90-92). Spezifische Proteinaseinhibitoren könnten somit neue antivirale Substanzen darstellen, welche beispielsweise gegen Viren gerichtet sind, gegen die die Entwicklung eines Vakzins aus rein technischen Gründen nicht möglich ist; z. B. sind bei Rhinoviren derzeit weit über 115 nicht miteinander kreuz reagierende Serotypen bekannt, wovon 90 bereits als definierte Serotypen klassifiziert wurden (Cooney, M. K. et al., 1982, Infect. Immun. 37, 642-647).

Proteolytisches Prozessieren des Polyproteins (Jacobson, M.F. und Baltimore, D., 1968, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 5392) durch viral kodierte Proteinasen ist bevorzugt bei (+)Strang RNA Viren (Hellen, C.U.T. et al., 1989, Biochemistry 28, 9881-9890) und Retroviren anzutreffen (Skalka, A. M., 1989, Cell 56, 911-913). Mit Hilfe von molekularbiologischen Studien, Sequenzvergleichen und Röntgenstrukturanalysen stellte sich heraus, daß die von Viren kodierten Proteinasen zwei Gruppen von proteolytischen Enzymen zugeordnet werden können, nämlich den Pepsin-ähnlichen Aspartat-Proteinasen (Meek, T. D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1841-1845) und den Cystein-Proteinasen mit Trypsin-ähnlicher Proteinkettenfaltung (Bazan, J. F. and Fletterick, R. J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 7872-7876). Nicht immer sind beim proteolytischen Prozessieren des viralen Polyproteins ausschließlich viral-kodierte Proteinasen beteiligt, so z. B. sind bei der Reifungsspaltung des Polyproteins des "Yellow Fever Virus", welches zu den Flaviviridae gehört, zelluläre Proteinasen beteiligt (Ruiz-Linares, A. et al., 1989, J. Virol. 63, 4199-4209).

Die Substratspezifität der viralen Enzyme konnte mittels detaillierter Studien wie Punktmutationsanalysen, Spaltung von Peptidsubstraten "in vitro" und Aminosäure-Sequenzierung der nativen Spaltprodukte näher analysiert werden. Dabei stellte sich heraus, daß, wie oben bereits erwähnt, weniger die Spaltsstelle selbst als einige Positionen "up"- oder "downstream" eine tragende Rolle bei der Spaltstellenerkennung spielen. Jene Sequenz-Heterogenität der Spaltsignale bzw. deren unmittelbarer Umgebung führt jedoch zu einer Art "Hierarchie" der Spaltereignisse im Polyprotein (Kräusslich, H. G. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 807-811; Pichuantes, S. et al., 1989, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 6, 324-337; Darke, P. L. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 2307-2312; Nicklin, M. J. H. et al., 1988, J. Virol. 62, 4586-4593; Libby, R. T. et al., 1988, Biochemistry 27, 6262-6268; Sommergruber, W. et al., 1989, Virology 169, 68-77). Die Variation der einzelnen Spaltregionen im Polyprotein erlaubt so eine genau determinierte Abfolge von kinetisch "günstigen" bis zu kinetisch "ungünstigen" Spaltungen, die in weiterer Folge eine differenzierte Proteolyse der einzelnen Spaltprodukte ermöglicht. Dadurch kommt den viralen Proteinasen eine Art von regulatorischem Potential während des viralen Replikationszyklus zu. Das Prinzip der Erkennung einer spezifischen Sekundärstruktur im Spaltstellenbereich ist nicht auf Picornaviren beschränkt, sondern dürfte ein allgemeines Prinzip der viralen Proteinasen darstellen. So werden diese Eigenschaften z. B. im Adenovirussystem (Webster, A. et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 3225-3234; Webster, A. et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 3215-3223) und in pflanzenviralen Systemen ebenso angetroffen (Carrington, J.C. und Dougherty, W.G., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 3391-3395; Dougherty, W.G. et al., 1988, EMBO J. i, 1281-1288).

Kaum ein anderes virales System ist bei seiner Regulation des Infektionsablaufes dermaßen von einer kontrolliert limitierten Proteolyse abhängig, wie das der Picornaviridae. Diese Virenfamilie läßt sich in 4 verschiedene Genera unterteilen: Entero-, Rhino-, Aphto- und Cardioviren. Rhinoviren sind wie alle anderen Vertreter dieser Virenfamilie einzelsträngige (+)RNA - Viren (Cooper, P. D et al., 1978, Intervirology 10, 165-180; MacNaughton, M. R., 1982, Current Top. Microbiol. Immunol. 97, 1-26). Sie sind weit verbreitet, befallen den oberen respiratorischen Trakt des Menschen und verursachen akute Infektionen, die zu Schnupfen, Husten, Heiserkeit etc. führen und allgemein als Erkältungen bezeichnet werden (Stott, E. J. und Killington, R. A., 1972, Ann. Rev. Microbiol. 26, 503-524). Infektionen durch Rhinoviren zählen zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die Krankheit verläuft zwar meist harmlos, dennoch kommt es - bedingt durch eine vorübergehende Schwächung des Organismus - zu Sekundärinfektionen durch andere Viren oder Bakterien, die dann unter Umständen schwere Erkrankungen zur Folge haben. Von den insgesamt ca. 115 verschiedenen, bekannten Serotypen von humanen Rhinoviren sind bis jetzt 4 Serotypen (HRV 1B, 2, 14 und 89) kloniert und komplett sequenziert worden:. Deutsche Patentanmeldung P 35 05 148.5; Skern; T. et al., 1985; Nucleic Acids Res. 13, 2111-2126; Düchler, M. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2605-2609; Stanway, G. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7859-7877; Callahan, P. L. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 732-736; Hughes, R. et al., 1988, J. Gen Virol. 69, 49-58).

Die genomische einzelsträngige (+)RNA der Rhinoviren wird kurz nach der Infektion durch Abspaltung des an das 5′ Ende gebundenen Oligopeptids VPg modifiziert und dient in der Folge als mRNA für die Synthese eines Polyproteins, das den gesamten durchgehenden Leserahmen der Nukleinsäuresequenz umfaßt (Butterworth, B. E., 1973, Virology 56, 439-453; Mc Lean, C. und Rueckert, R. R., 1973, J. Virol. 11, 341-344; Mc Lean, C. et al., 1976, J. Virol. 19, 903-914; Agol, V.I., 1980, Prog. med. Virol. 26, 119-157; Putnak, J.R. und Phillips, B.A., 1981, Microbiol. Rev. 45, 287-315). Die reifen viralen Proteine entstehen ausschließlich durch proteolytische Spaltung aus diesem Polyprotein, wobei -zumindest bei Entero- und Rhinoviren- die dabei wirksamen Proteinasen selbst Bestandteil dieses Polyproteins sind. Das Prozessieren erfolgt in 3 Stufen (Palmenberg, A., 1987, J. Cell. Biochem. 33, 191-198; Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.):
1. Die Primärspaltung: Trennung der Kapsidvorläufer von der wachsenden Polypeptidkette;
2. die Sekundärspaltung: Prozessieren struktureller und nicht-struktureller Vorläuferproteine und
3. die Reifespaltung des Kapsids.

Der erste Schritt dient somit der Abspaltung der Vorstufe der Hüllenproteine und wird (bei Entero- und Rhinoviren) autokatalytisch durch die Proteinase 2A vorgenommen ("cis"-Aktivität). In der Reihenfolge der Gene liegt die Sequenz der Proteinase 2A (in der Folge 2A genannt) unmittelbar hinter dem für die Hüllenproteine kodierenden Abschnitt. 2A ist somit aufgrund ihrer Lokalisation im Polyprotein die erste nachweisbare enzymatische Funktion des Virus. Die Trennung der Hüllenproteinregion von dem für die Replikation verantwortlichen Abschnitt findet bereits während der Translation des Polyproteins "in statu nascendi" statt. Bei Poliovirus kann diese primäre Spaltung an der P1-P2 Region intermolekular d. h. "in trans" von der reifen Proteinase 2A vorgenommen werden (Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.). Das Spaltsignal, welches dabei von der Proteinase 2A erkannt wird, wurde einerseits durch direkte Aminosäuresequenzanalyse des N-Terminus von 2A und/oder des C-Terminus von VPl bestimmt oder andererseits durch Vergleich der Primärstruktur aufgrund von Homologiestudien abgeleitet. Es ist dies bei Polio (Pallansch, M.A. et al., 1984, J. Virol., 49, 873-880), BEV und HRV14 (Callahan, P.L. et al., 1985, loc. cit.) ein Tyr/Gly-, bei HRV2 (Kowalski, H. et al., 1987, J. Gen. Virol. 86, 3197-3200; Sommergruber, W. et al., 1989, Virology 169, 68-77) ein Ala/Gly-, bei HRVlB (Hughes, P.J. et al., 1988, J. Gen. Virol. 69, 49-58) und HRV89 (Düchler, M. et al., 1987, loc. cit.) ein Val/Gly-, sowie bei Cox B1 (Iizuka, N. et al., 1987, Virology 156, 64-73), Cox B3 (Lindberg, A.M. et al., 1987, Virology 156, 50-63) und Cox B4 (Jenkins, O. et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, 1835-1848) ein Thr/Gly-Aminosäurepaar. Dieser Schritt ist für den weiteren Ablauf der viralen Infektion essentiell (Kompartimentierung von Replikation und virus-assembly). Bei Cardio- und Aphtoviren wird, im Gegensatz zu den Polioviren, diese Spaltung von der Proteinase 3C katalysiert (Kräusslich, H.-G. and Wimmer, E., 1988, loc. cit.). Vom Poliovirussystem weiß man, daß wahrscheinlich alle an dieser Reifungsspaltung beteiligten Enzyme viral kodiert sind (Toyoda, H. et al., 1986, Cell 45, 761-770). Im Poliovirus findet man drei Typen von Spaltsignalen; die Aminosäurepaare Q-G, welche von der viralen Proteinase 3C (im folgenden 3C genannt) erkannt werden, das oben erwähnte Y-G Paar, welches als 2A-Erkennungssignal dient und das bei der Reifespaltung des Kapsids verwendete N-S Spaltsignal.

Zunächst rückte die Proteinase 3C in den Mittelpunkt des Interesses bei der Aufklärung des proteolytischen Prozessierens von Picornaviren. Schon sehr früh konnte eine der 3C äquivalente proteolytische Aktivität in EMC beschrieben werden (Pelham, H. R. B. , 1978, Eur. J. Biochem. 85, 457-461; Palmenberg A. C. et al., 1979, J. Virol. 32, 770-778). Im Laufe weiterer Untersuchungen stellte sich heraus, daß das Leaderpeptid (L) von Cardio- (z. B. EMCV) und Aphtoviren (z. B. FMDv), welches bei Rhino- und Enteroviren nicht vorhanden ist, am proteolytischen Prozessieren von Aphto- und Cardioviren beteiligt ist (Palmenberg, A. C., 1987, J. Cell. Biochem. 33, 1191-1198). In weiterer Folge konnte durch die Isolierung von Polio 3C und mit Hilfe von immunologischen Methoden gezeigt werden, daß 3C sich selbst autokatalytisch aus dem Polyprotein herausschneidet, um dann intermolekular ("trans") alle potentiellen Q-G Spaltstellen anzugreifen. Der Einsatz von rekombinanten Systemen, die unter anderem die 3C-Region repräsentierten, ermöglichte die Expression von 3C einiger Entero- und Rhinoviren (Werner, G. et al., 1986, J. virol. 57, 1084-1093) und die genaue Charakterisierung der 3C von Polio (Hanecak, R. et al., 1984, Cell 37, 1037-1073; Korant, B. D. und Towatari, T., 1986, Biomed. Biochim. Acta 45, 1529-1535) sowie der äquivalenten proteolytischen Funktion in FMDV (Klump, W. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3351-3355; Burroughs, J. N. et al., 1984, J. Virol. 50, 878-883). Durch "in vitro" Mutagenesestudien konnte nachgewiesen werden, daß der Austausch der hoch konservierten Aminosäuren Cystein (Positionsnummer 47) und Histidin (Positionsnummer 161) in 3C von Poliovirus zu einem inaktiven Enzym führt, während die Mutation des nicht konservierten Cysteins (Positionsnummer 153) keinen nennenswerten Einfluß auf die proteolytische Aktivität von Polio-3C hat. Diese durch Oligonukleotide bewirkte Mutagenese von rekombinanter 3C und die zusätzlich durchgeführten Inhibitorstudien lassen den Schluß zu, daß Polio-3C zu der Klasse der Cysteinproteasen gehört (Ivanoff, L. A. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5392-5396). Ebenfalls durch "in vitro" Mutagenese von Polio-3C (und zwar durch Austausch des konservierten Valin gegen Alanin in Position 54 der Protease) konnte gezeigt werden, daß diese Mutation in einer "full size" cDNA von Polio nach Transfektion in COS 1 Zellen zu einem Polymerase-defizienten Virus führt (Dewalt, P. G. und Semler, B. L., 1987, J. Virol. 61, 2162-2170).

Auffallend ist, daß die flankierenden Sequenzen der Dipeptidpaare an der Spaltstelle vielfach Helix-brechende Aminosäuren, wie Prolin oder Threonin enthalten. Außerdem befindet sich meistens an der Position P4 neben einer Spaltstelle eine Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette (Nicklin, M.H.J. et al., 1986, Biotechnol. 4, 33-42). Im Fall von Polio (Toyoda, H. et al., 1984, J. Mol. Biol. 174, 561-585) und Coxsackie (Iizuka, N. et al., 1987, Virology 156, 64-73; Lindberg, A.M. et al., 1987, Virology 156, 50-63; Jenkins, O. et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, 1835-1848) kommt ein Ala vor; bei HRV ein Ala, Val oder Leu (Skern, T. et al., 1985, loc. cit.; Duechler, M. et al., 1987, loc. cit.; Hughes, P.J. et al., 1988, loc. cit.; Stanway, G. et al., 1984, loc. cit.); im Fall von Hepatitis A ein Ile, Val und Leu (Paul, A.V. et al., 1987, Virus Res. 6, 153-171; Najarian, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 2627-2631); bei FMDV ein Pro (Forss, S. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 6587-6601) und bei EMCV ein Phe oder Leu (Palmenberg A. C. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 2960-2983).

In weiteren Arbeiten über die proteolytische Aktivität von 3C konnte gezeigt werden, daß "in vitro" exprimierte Vorläuferproteine, welche strukturelle­ und Teile nicht struktureller Regionen beinhalten, durch exogen zugegebene 3C, welche aus Extrakten von infizierten Zellen stammte, gespalten werden (Nicklin, M. H. J., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4002-4006; Ypma-Wong, M. F. et al., 1988, Virology 166, 265-270). Allerdings stellte sich dabei heraus, daß Vorläuferproteine, denen entweder die 1A- oder die 1D-Region fehlte, sich weniger gut als Substrate eigneten (zur systematischen Nomenklatur der Picornavirus-Proteine siehe: Rueckert, R.R. und Wimmer, E., 1984, J. Virol. 50, 957-959). Dieser Befund weist auf sehr stringente Strukturanforderungen der Proteinase 3C hin. Interessant ist auch die Tatsache, daß in Polioviren zur Spaltung des Kapsidvorläufers P1 in 1ABC und 1D die Anwesenheit von 3C ausreicht, jedoch für eine weitere effiziente Spaltung in 1AB und 1C der 3C-Proteinase-Vorläufer 3CD erforderlich ist (Ypma-Wong, M. F. und Semler, B. L., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 2069-2088; Ypma-Wong, M.F. et al., 1988, loc. cit.). Dabei könnte durch spezifische Wechselwirkungen der 3D-Region (virale Polymerase) mit der P1-Region die Spaltstelle 1B/1C in eine für die 3C günstige Position gebracht werden, wodurch eine Erkennung des Spaltsignals ermöglicht wird. Dieses Ergebnis wurde von Nicklin und Mitarbeitern bestätigt, indem sie zeigen konnten, daß eine im Großmaßstab produzierte und gereinigte, rekombinante Proteinase 3C ausschließlich die Spaltung zwischen 1C und 1D katalysiert und daß möglicherweise für eine weitere Erkennung des Q-G Paares zwischen 1B und 1C eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem größeren Vorläufer und dem P1 Substrat erforderlich ist. Außerdem zeigten sie, daß ein aus 11 Aminosäuren bestehendes Peptid, welches der 2A/2B Spaltstelle und den flankierenden Sequenzen im Polyprotein entspricht, von gereinigter 3C in "trans" spezifisch gespalten werden konnte (Nicklin, M.H.J. et al., 1988, loc. cit.). Durch Klonieren und Exprimieren der Proteinase 3C von HRV14 in einem Maxizellsystem weiß man, daß auch Rhino-3C proteolytisch aktiv ist und daß das Prozessieren von 3C Vorläuferformen durch ZnCl₂ spezifisch inhibiert wird (Keat-Chye, C. et al., 1988, Gene 69, 265-274). Libby et al. konnten ebenfalls die 3C-Proteinase aus HRV14 in E. coli mittels eines periplasmatischen Sekretionsvektors exprimieren und die biologische Aktivität mit Hilfe eines synthetischen Peptidsubstrats, welches die Konsensussequenz aller der in HRV14 vorkommenden 3C spezifischen Schnittstellen beinhaltete, nachweisen (Libby, R.T. et al., 1988, loc. cit.). Schließlich konnte die in E. coli exprimierte HRV14-3C gereinigt und die enzymatische Aktivität auf ein synthetisches "2A/2B" Peptid bewiesen werden (Knott, J.A. et al., 1989, Eur. J. Biochem. 182, 547-555). Ferner konnte die Spaltung von 14-16 Aminosäuren langen Peptiden, welche die für Polio 3C authentischen Spaltstellen repräsentieren, nach Zugabe von gereinigter Polio 3C, demonstriert werden. Außerdem wurde die Effizienz der verschiedenen Spaltungen mittels der Bestimmung von v(max)/Km Werten ermittelt. Die Peptide, welche die 2C/3A Spaltstelle enthielten, wurden äußerst schnell und effizient gespalten, so wie es auch "in vivo" bei den Vorläuferproteinen der Fall ist; z. B. das die 3C/3D-Spaltstelle enthaltende Peptid wurde nur äußerst langsam geschnitten - analog dem Prozessieren dieser Stelle "in vivo". Peptide mit Q-G Paaren, aber sonst willkürlich gewählten flankierenden Sequenzen, wurden auch nach stundenlanger Inkubation mit sehr hohen Konzentrationen an 3C nicht prozessiert (Pallai, P. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 9738-9741). Neueste Arbeiten zeigen, daß eine Serie von kleinen Insertionsmutationen in der 3D-Region, die zur Substitution von Wildtyp Sequenzen in einer infektiösen "full size" cDNA verwendet wurden, zwar keine lebensfähigen Viren hervorbringen, daß aber diese Mutanten-cDNA′s in verschiedenen bakteriellen Expressionssystemen sehr wohl 3CD-vorläufer exprimieren, aus denen durch autokatalytische Spaltung etwa die gleiche Menge an 3C wie im Wildtyp entsteht. Der mutierte Vorläufer 3CD ändert aber seine Spaltungseffizienz gegenüber der P1-Region. Manche Insertionen beeinflußen die Aktivität von 3CD nicht, andere wiederum eliminieren die Katalyse vollständig (Burns, C.C., et al., 1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium). Daraus resultiert, daß Änderungen in der Sequenz bzw. in der Faltung einzelner Regionen im 3D-Protein verschiedene Auswirkungen auf die Effizienz des Prozessierens haben.

Für die Erkennung und Spaltung der potentiellen Schnittstellen ist, wie schon zuvor erwähnt, weniger das Aminosäurepaar unmittelbar an der Spaltstelle maßgebend, sondern im verstärkten Maß die Sekundär­ und Tertiärstruktur in der unmittelbaren Umgebung des Spaltsignals. Die Annahme, daß es noch andere Determinanten geben muß, geht allein schon aus der Tatsache hervor, daß im Poliovirussystem von 3C nur 9 von insgesamt 13 vorhandenen Q-G Paaren gespalten werden und daß in anderen Picornaviren neben Q-G auch noch andere Spaltsignale gefunden werden. Arbeiten von Ypma-Wong zeigen, daß die "β-barrel" Struktur der Kapsidprotein-Vorläufer für die Erkennung und Spezifität der Proteinase 3C bzw. 3CD von großer Relevanz sein dürfte (Ypma-Wong, M. F. et al., 1989, J. Biol. Chem. 263, 17 846-17 856). Durch Insertionen von 4-6 Aminosäuren in die Pl-Region von Polio konnte man zeigen, daß nur diejenigen Mutationen, die zu einer Unterbrechung der "β-barrel" Struktur führen, eine Spaltung durch die Proteinase 3C verhindern. Insertionen in flexiblen "loop"-Regionen zeigen kaum einen Einfluß auf die Aktivität. Eine Deletion bei der Q-G Spaltstelle zwischen 1C und 1D bewirkt zwar eine Inhibierung der Spaltung an dieser Stelle, übt aber keinerlei negative Effekte auf das Prozessieren zwischen 1AB und 1C aus (Blair, W. S. et al., 1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium). Weiterhin zeigte sich auch hier, daß dem aliphatischen Rest in der Position P4, in diesem Fall ein Alanin, gewisse Bedeutung zukommt, indem er eine funktionelle Rolle bei der Enzym-Substrat Wechselwirkung übernehmen dürfte.

Neuere Arbeiten mit chimären Picornavirus- Polyproteinen ergaben, daß für das durch die 3C vermittelte Prozessieren bei verschiedenen Picornaviren gemeinsame strukturelle Determinanten bestehen. Chimäre picornavirale cDNA Klone, bei denen die 3C- bzw. 3CD-Regionen von Poliovirus durch die Proteinase 3C bzw. 3CD von HRV14 und CoxB3 ersetzt wurden, zeigten ein korrektes Prozessieren der P2- und P3-Region, allerdings waren sie nicht in der Lage die Poliovirus spezifischen Spaltsignale im Kapsidvorläufer (P1) zu erkennen (Dewalt, P.G., et al., 1989, J. Virol. 63, 3444-3452) . Obwohl die 3C von HRVl4 eine Q-A und von CoxB3 eine Q-N Spaltstelle zwischen 2B und 2C erkennt (Iizuka, N., et al., 1987, Virology 156, 64-73; Lindberg, A. M. et al., 1987, Virology 156, 50-63), fand eine Spaltung an diesen besagten Stellen statt (in Polio befindet sich an dieser Stelle ein Q-G Signal). Ein weiterer Hinweis dafür, daß neben der speziellen Primärsequenz der Spaltstelle eine bestimmte 3-dimensionale Konformation des Substrats für die Erkennung maßgebend ist. Durch Insertionsmutagenese innerhalb der 3C-Region und Herstellung chimärer 3C-Proteine konnte aufgrund des Ausmaßes des Prozessierens von P1, P2 und P3, welches durch diese mutierten Proteinasen vermittelt wurde, eine Art Hierarchie in derjeweiligen Enzym-Substrat- Erkennung aufgestellt werden (Lawson, M. A. et al., 1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium). Dabei zeigte sich, daß die P3-Region (im Gegensatz zur P2-Region) die geringste Stringenz bezüglich der Wechselwirkung mit der 3C-Proteinase erfordert. Das Prozessieren der P1-Region verlangt den höchsten Grad an spezifischer Enzym-Substrat-Wechselwirkung.

Neueste Untersuchungen ergaben, daß in Polioviren, welche offensichtlich eine strikte Spezifität für das Prozessieren von Q-G Spaltstellen besitzen, auch andere Aminosäurepaare als Spaltsignale akzeptiert werden. Punktmutationen an der 3C/3D Schnittstelle wurden in "full size"-Klonen eingeführt. Im Falle von Q/A, Q/V und Q/S Mutationen zeigten die Viren den Wildtyp-Phänotyp, die Einführung eines Prolins an Stelle des Glycins hingegen erwies sich als lethal (Kean, K.M. und Girard, M., 1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium). Interessanterweise bewirkte das Q-A Paar noch eine zusätzliche alternative Spaltung "downstream" von 3C/3D, die aber den Phänotyp nicht beeinflußte. Auch diese Daten geben ein gutes Beispiel dafür, daß nicht das Spaltsignal selbst, sondern die Struktur der Spaltregion bzw. die dreidimensionale Faltung des Polyproteins den wesentlichsten Beitrag zu einem effizienten Prozessieren leisten.

Antikörper, die gegen Polio-3C entwickelt wurden, unterbanden zwar eindeutig sämtliche an Q-G durchgeführten Spaltungen, nicht aber die Spaltung zwischen Y-G (Hanecak, R. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3973-3977). Diese Beobachtung führte zum Schluß, daß das proteolytische Prozessieren an Y-G Stellen einer eigenen Proteinase bedarf. Der Sitz dieser zweiten proteolytischen Aktivität konnte in Poliovirus eindeutig 2A zugeordnet werden. Interessant war der Befund, daß 2A eine alternative Spaltung in der Proteinase-Polymeraseregion (3CD) durchführt, welche ebenfalls an einer Y-G Stelle stattfindet und inaktive Enzyme 3C und 3D liefert. Diese Spaltung dient möglicherweise zur quantitativen Regulation der Enzyme 3C und 3D (Lee, C.K. und Wimmer, E., 1988, Virology 166, 1435-1441).

Da es während der Infektion mit Poliovirus in HeLa-Zellen sehr rasch zu einem Abschalten der Wirtsproteinsynthese kommt, die Translation der Poliovirus-RNA jedoch unbehindert ablaufen kann, nahm man an, daß ein oder mehrere Regulationsfaktoren der Translation während der Infektion verändert werden. Tatsächlich zeigen ältere Befunde, daß der eukaryontische Initiationsfaktor 4F durch proteolytische Spaltung der p220 Komponente während der Poliovirusinfektion in HeLa-Zellen verändert wird (Etchison, D. et al., 1984, J. Virol. 51, 832-837; Etchison, D. et al., 1982, J. Biol. Chem. 257, 14 806-14 810; Etchison, D. und Etchison, J.R., 1987, J. Virol. 61, 2702-2710). In der Folge konnte gezeigt werden, daß 2A indirekt für diese Modifikation von p220 in infizierten Zellen verantwortlich ist (Kräusslich, H. G. et al., 1987, J. Vitology 61, 2711-2718; Lloyd, R.E. et al., 1986, Virology 150, 299-303; Lloyd, R.E. et al., 1987, J. Virol. 61, 2480-2488). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, daß in mit Rhinovirus infizierten Zellen ebenfalls der Abbau von p220 erfolgt (Kräusslich, H.-G. unpublizierte Daten).

Die Frage nach der Transaktivität der Proteinase 2A konnte zunächst im Poliovirussystem positiv beantwortet werden, indem durch Insertionen und Deletionen in 2A eine unprozessierte P1-P2 Region in E. coli exprimiert wurde, die von 2A gespalten werden konnte, die entweder aus mit Poliovirus infizierten Zellen stammte (Nicklin, M. J. H. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4002-4006) oder "in vitro" translatiert wurde (Kräusslich, H.-G. et al., 1987, J. Virol. 61, 2711-2718) oder in E. coli exprimiert wurde, oder aus Poliovirus infizierten Zellen gereinigt wurde (König, R. und Rosenwirth, B., 1988, J. Virol. 62, 1243-1250). Bernstein und Mitarbeiter konnten mit Hilfe einer Poliovirusmutante klar zwischen einer "cis"- und einer "trans"-aktiven Form der Proteinase 2A unterscheiden. Diese 2A-Mutante enthielt ein zusätzliches Leu zwischen der 102. und 103. Aminosäure von 2A. Diese Leu-Insertion führte zwar zu einem wenn auch schlecht replizierendem aber dennoch lebensfähigen Poliovirus. In mit dieser Mutante infizierten HeLa-Zellen konnte dagegen keine Spaltung des zellulären p220 Moleküls beobachtet werden (Bernstein, H.D. et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2913-2923; Bernstein, H.D. et al., 1986, J. Virol. 60, 1040-1049).

Mit Hilfe von rekombinanten Vaccinia Vektoren, die die vollständige P1-Region und den Genabschnitt für eine verkürzte inaktive Form der Proteinase 2A aus Polio enthielten, konnte gezeigt werden, daß nach Koinfektion mit jeweils einem der drei Serotypen von Polio, mit HRV14 oder mit EMCV sowohl in den Fällen von Polio 1,2 und 3 als auch von HRV14 ein korrektes intermolekulares ("trans") Prozessieren an der P1/2A Schnittstelle erfolgte. Nach Koinfektion mit EMCV fand kein Prozessieren des inaktiven Vorläuferproteins von Polio statt (Jewell, J.E. et al., 1990, J. Virol. 64, 1388-1393). Ferner konnte in höheren eukaryontischen Zellen mit Hilfe von Expressionsvektoren, welche unter der Kontrolle der LTR-Region von HIV I stehen und mittels des "tat"-Genprodukts aktiviert werden, der Beweis erbracht werden, daß 2A von Poliovirus das induzierende Agens bei der Proteolyse von p220 ist (Sun, X. H. und Baltimore, D., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 2143-2146) . Weiterhin zeigten Kräusslich und Mitarbeiter eindeutig, daß zwar die Anwesenheit einer aktiven 2A zur proteolytischen Degradation von p220 während des "host cell shut off" unbedingt notwendig ist, dieser Abbau aber nicht direkt von 2A durchgeführt wird (Kräusslich, H.G. et al., 1987, loc. cit.). Man vermutet zur Zeit, daß die Proteinase 2A in der Lage ist, ein zelluläres Enzym zu aktivieren, welches in der Folge die Spaltung von p220 bewirkt. Neuere Untersuchungen geben Anlaß zu Spekulationen, daß möglicherweise die Ca²⁺-abhängige zelluläre Proteinase Calpain für diese "p220-ase" Aktivität in Betracht zu ziehen ist. Nach diesem Modell soll die Proteinase 2A ein inaktives Calpain durch dessen Spaltung in eine aktive Form überführen, die in der Folge das p220 attackiert. Die mögliche Spaltung des Calpains könnte dabei 80 Aminosäuren vom N-Terminus entfernt bei der Sequenz Y-G stattfinden (Wyckoff, E.E. und Ehrenfeld, E., 1989, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium).

Möglicherweise sind die beiden Proteinasen 2A und 3C direkt oder indirekt an der proteolytischen Degradation von weiteren 14 zellulären Proteinen während der Poliovirusinfektion von HeLa-Zellen beteiligt (Urzainqui, A. und Carrasco, L., 1989, J. Virol. 63-, 4729-4735).

Neben der raschen Inhibition der wirtszellspezifischen Translation wird in einigen Picornaviren der wirtszell-spezifische "shut off" der Transkription beobachtet. Falk und Mitarbeiter konnten zeigen, daß in FMDV die Proteinase 3C spezifisch das Histon H3 spaltet. Das modifizierte H3 bleibt dabei Chromatin assoziiert, es fehlt aber der wahrscheinlich für die Regulation der Transkription wichtige Teil und führt so zu einer negativen Beeinflussung der Transkription in Eukaryonten (Falk, M.M. et al., 1990, J. Virol. 64, 748-756). Im Rhinovirussystem wurde ebenfalls eine Transaktivität der Proteinase 2A durch spezifische Spaltung eines Peptidsubstrates, welches die native Spaltregion zwischen VP1 und 2A repräsentiert, nachgewiesen (Sommergruber, W. et al., loc. cit.).

Ein vergleich der Aminosäuresequenzen der einzelnen viralen Proteine zeigt, daß die Polymerase- und Proteinase-Regionen in besonderem Maße konserviert sind. So beträgt etwa die Homologie zwischen der Proteinase 2A von HRV89 und HRV2 85%; bei der Proteinase 3C sind 75% der Aminosäuren identisch (Düchler, M. et al., 1987, loc. cit.). Diese Werte liegen wesentlich über den durchschnittlich im Gesamtprotein beobachteten Prozentsätzen. Man kann daher davon ausgehen, daß gerade die viralen Enzyme in der Evolution besonders gut konserviert sind und in ihren Eigenschaften bei verschiedenen Rhinoviren sehr ähnlich sind. Bemerkenswert ist auch, daß zwei den picornaviralen Proteinasen 3C und 2A ähnliche Proteine in dem pflanzenviralen System der Comoviridae (Cowpea Mosaic Virus) vorkommen (Garcia, J. A. et al., 1987, Virology 159, 67-75; Verver, J. et al., 1987, EMBO 6, 549-554). Diese beiden viralen Proteine sind am proteolytischen Prozessieren von zwei Polyproteinen beteiligt, die durch zwei getrennt verpackte einzelsträngige RNA Moleküle (B und M RNA) kodiert werden. Zudem ist eine große Ähnlichkeit der beiden Cowpea mosaic-Proteinasen in Sequenz und Spaltspezifität zu den Picornaviren festzustellen. Diese bemerkenswerte Homologie von nicht strukturellen Proteinen zwischen Picorna- und Comoviren weist nicht nur auf eine genetische Verwandtschaft zwischen diesen beiden Virusfamilien hin, sondern zeigt auch auf, wie essentiell das virale proteolytische Prozessieren für diese beiden Virusfamilien ist.

Die dritte Art der viralen Reifungsspaltung, nämlich die von 1AB (Vorläuferprotein von 1A und 1B) konnte bei Mengo und Rhinovirus mit Hilfe von Röntgenstrukturdaten beschrieben werden. Dieses letzte proteolytische Ereignis bei der viralen Maturation scheint auf einem ungewöhnlichen autokatalytischen Serinprotease Typ zu beruhen, bei welchem basische Gruppen der viralen RNA an der Ausbildung des katalytischen Zentrums beteiligt sind, wobei diese basischen Gruppen als Protonenakzeptor fungieren (Arnold, E. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 21-25). Die Kristallstruktur von FMDV (Acharya, R. et al., 1989, Nature 337, 709-716) schließt einen solchen Mechanismus bei Aphtoviren aus.

Die Spaltstellenspezifität der viralen Proteasen wurde im Poliovirussystem durch N-terminales Sequenzieren der meisten Proteine ermittelt (Pallansch, M. A. et al., 1984, loc. cit.). Durch das Klonieren und Sequenzieren von HRV2 (Skern, T. et al., 1985, loc. cit.) konnten anhand von Sequenzvergleichen mit Poliovirus und HRV14 die meisten Spaltstellen abgeleitet werden. Außerdem konnte die Lage der Schnittstellen zwischen 1A/1B, 1B/1C sowie 1C/1D durch N-terminales Sequenzieren von 1B, 1C und 1D bestimmt werden. Das Spaltsignal zwischen 1D und 2A wurde, wie bereits eingangs erwähnt, einerseits durch C-terminales Sequenzieren von 1D (Kowalski, H. et al., 1987, loc. cit.) andererseits durch N-terminale Sequenzanalyse von 2A bestimmt (Sommergruber, W., et al. 1989, loc. cit.). So konnten in HRV2 fünf verschiedene Spaltsignale gefunden werden: Q-S, Q-G, Q-N, A-G und E-S.

Experimentelle Daten über den katalytischen Mechanismus von Poliovirus 3C zeigten, daß die Protease 3C durch Inhibitoren für Thiolproteasen wie z. B. N-Ethylmaleimid oder Jodacetamid blockiert werden können (Pelham, H.R.B., 1978, Eur. J. Biochem. 85, 457-462; Gorbalenya, A.E. und Svitkin, Y.V., 1983, Biochemistry USSR 48, 442-453). Aufgrund von Vergleichen der 3C Sequenzen von Picornaviren (Argos, P. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7251-7267) und Punktmutationsexperimenten (Ivanoff,L. et al., 1986, loc. cit.) wurde ein Cystein-Histidin Paar als vermutetes aktives Zentrum definiert. Alle diese Befunde lassen den Schluß zu, daß Polio-3C ein Cystein im katalytischen Zentrum besitzt und der Klasse der Cysteinproteinasen zuzuordnen ist, oder genauer gesagt, als ein Mitglied einer neuen "Superfamilie" von Cysteinproteinasen ohne typische Homologien zur Cysteinproteinase Papain anzusehen ist. Zu den Mitgliedern dieser Familie dürften auch die Proteinase 2A sowie die zwei im pflanzenviralen System der Comoviridae (Cowpea Mosaic Virus) gefundenen Proteinasen (Argos, P. et al., 1984, loc. cit.) und die 49-kDa Proteinase des "Tobacco Etch Virus", ein Vertreter der Potyviren, zählen (Dougherty, W.G. et al., 1989, Virology 172, 302-310).

Neuere Arbeiten von Cheah, K.C. et al. (Cheah, K.C. et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 7180-7187) erbrachten einen weiteren experimentellen Beweis der funktionellen Verwandtschaft zwischen HRV14 3C und zellulären Trypsin-ähnlichen Serin-Proteinasen. Mit Hilfe von Punktmutationen und Immunpräzipitationsdaten konnten sie zeigen, daß bei Punktmutation der Reste His-40, Asp-85 und Cys-146 von HRV14 3C, welche äquivalent der katalytischen Triade von Trypsin (His-57, Asp-102 und Ser-195) sind, die katalytische Aktivität inhibiert wird. Auch bei Mutation der Reste, die der spezifischen "pocket"-Region von Trypsin entsprechen (Thr-141, Gly-158, His-160 und Gly-162) konnte die proteolytische Aktivität inhibiert werden, nur bei einem konservativen Austausch von Thr-141 zu Ser kann eine, wenn auch deutlich reduzierte, Restaktivität beobachtet werden. Zusätzlich zeigten Immunpräzipitationsdaten, daß zumindest die Reste Asp-85, Thr-141 und Cys-146 in Analogie zu Trypsin in einer leicht zugänglichen Oberflächenregion lokalisiert sind.

Durch Vergleich mit anderen Picornaviren und weiteren Inhibitorstudien (Parks, G.D. et al., 1986, J. Virol. 60, 376-384; König, H. und Rosenwirth, B., 1988, J. Virol. 62, 1243-1250) sowie direkte Mutagenese des vermuteten aktiven Zentrums der Protease 2A von HRV2 dürfte auch 2A ein Cystein als Nukleophil besitzt. Ein Austausch des Cysteins 106 von HRV2 2A gegen ein Serin im vermuteten aktiven Zentrum des Enzyms zerstört die Aktivität (Sommergruber, W. et al., loc. cit.).

Außerdem konnte gezeigt werden, daß:

• - 2A von HRV2 als Substratenzym bestehend aus einem Fusionsanteil der MS2 Polymerase (98 Aminosäuren) C-terminale Teile von 1C, der Region für das virale Hüllenprotein VP1 und der Proteinase 2A selbst bei Expression in E. coli seinen eigenen N-Terminus erkennt und sich vom Vorläuferprotein abspaltet;
• - E. coli Extrakte, welche die aktive Proteinase 2A (ohne C-terminale Fusionsanteile) enthalten, spezifisch ein 16 Aminosäuren langes Peptid, das die native Spaltregion zwischen P1 und P2 in symmetrischer Art darstellt, in "trans" spalten können;
• - durch Deletion der letzten 10 C-terminalen Aminosäuren von 2A die proteolytische Funktion zerstört wird;
• - die minimale Länge eines Peptidsubstrats 12 Aminosäuren beträgt, wobei jeweils 6 Aminosäuren der "up"- und 6 Aminosäuren der "downstream"- Region vorhanden sein müssen;
• - ein Spaltsignal Tyr-Gly (wie es in Polio zw. P1 und 2A vorliegt) ebenfalls von HRV2 2A als Spaltsignal in Peptidsubstraten akzeptiert wird, daß aber andererseits ein die gesamte Poliospaltregion repräsentierendes Peptid von HRV2 2A nicht gespalten werden kann;
• - Detergentien die proteolytische Aktivität von 2A stark negativ beeinflussen, während hohe Salzkonzentrationen (z. B. 2,5 M NaCl) einen stabilisierenden Einfluß auf die Transaktivität von 2A ausüben;
• - ein gegen die letzten 20 C-terminalen Aminosäuren von 2A gerichtetes Peptidantiserum die Transaktivität "in vitro" nicht unterbindet;
• - Punktmutationen in der P1-Stelle generell einen geringen negativen Einfluß auf die Cisaktivität von 2A ausüben, mit der Ausnahme von verzweigten Aminosäuren Val und Ile, welche zu einer Reduzierung der proteolytischen Aktivität führen;
• - durch Austausch des hochkonservierten Arg 134 gegen Gln im C-Terminus von 2A ebenfalls die proteolytische Funktion unterbunden wird;
• - Deletions- und Mutationsstudien im vermutlich aktivem Zentrum von 2A die proteolytische Aktivität inhibieren;
• - HRV2 2A in "cis" nur sehr schlecht die P1-2A Spaltstelle von HRV89 prozessiert;
• - überhaupt keine "cis"-Spaltung von HRV2 2A durchgeführt werden kann, wenn die P -Regionen von Polio oder HRV14 vorliegen;
• - in "cis" 2A von HRV89 die Spaltstelle von HRV2 gegenüber ihrer eigenen bevorzugt spaltet.

(Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.; volkmann, P. et al., 1989, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium; Sommergruber, W. et al., ebendort; Skern, T. et al., Gordon Conference/USA, 1990).

Diese Fakten weisen auf die überraschende "Hierarchie" einer Spaltstelle hin; d. h. daß die Spaltstellen eine Art Regulationspotential darstellen, das nicht eine maximale Spaltung durch 2A ermöglicht, sondern die Spalteffizienz dem Vermehrungszyklus des jeweiligen Virussystem optimal anpaßt (z. B. könnte dadurch die Geschwindigkeit der viralen Replikation des jeweiligen Virustyp gesteuert werden).

Ein Vergleich der letzten 50 Aminosäuren mit dem aktiven Zentrum von 2A mit der SWISSPROT Sequenzdatenbank ergibt große Ähnlichkeiten des 2A Proteins mit Serinproteasen und nicht mit Cysteinproteasen. Das Cystein agiert offenbar im aktiven Zentrum einer Serinprotease. Der Austausch des Serins durch ein Cystein in Subtilisin (Philipp, M. et al., 1971, Methods in Enzymology, 19, "Proteolytic Enzymes", Colowick, S.P. und Kaplan, N. O.) zum Thiosubtilisin durch chemische Modifikation erhält die Esteraseaktivität; bei Trypsin wird durch gerichtete Mutagenese des Serins in ein Cystein die Aktivität um einen Faktor 100 000 gesenkt (Higaki, J. N. et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 615-621). Zu einem ähnlichen Ergebnis, wenn auch weniger signifikant, führt ein Vergleich des 3C Proteins mit anderen Proteasen (Gorbalenya, A. E. et al., 1986, FEBS Lett. 194, 253-257). Es wird sogar ein gemeinsamer Vorläufer für Serin- und Cysteinproteasen postuliert, dem die viralen Proteasen noch sehr ähnlich sind (Gorbalenya, A. E. et al., 1989, FEBS Lett. 243, 103-114). Möglicherweise stellt die Proteinase 3C ein evolutionäres Bindeglied zwischen Serin- und Cysteinproteinasen dar. Alle 3 könnten Abkömmlinge einer einzigen "Urproteinase" sein (Gorbalenya, A.E. et al., 1986, 1oc.cit.). virale 3C-Proteinasen mit einem Cystein im aktiven Zentrum wurden in allen 4 Gruppen der Picornaviridae identifiziert. Eine klare Unterscheidung zwischen den beiden viralen Proteasen 2A und 3C treffen Bazan und Fletterick. Sie finden eine starke Strukturhomologie der 3C verschiedener Picornaviren und verwandter Pflanzenviren mit der Chymotrypsinfamilie der Serinproteasen bei Vergleich von Kristallstrukturen von Chymotrypsin mit Vorhersagen über die Sekundärstruktur der viralen Enzyme. Die für die Struktur entscheidenden β-Faltblattkonformationen sind konserviert, Insertionen und Deletionen treten nur in den verbindenden Schleifen auf (Bazan, J. F. und Fletterick, R. J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7872-7876). Das Protein 2A weist strukturelle Gemeinsamkeiten mit der Subtilisinfamilie der Serinproteasen auf. Die Proteine mit der höchsten Ähnlichkeit mit den letzten 50 Aminosäuren von 2A waren: Thaumatin I und II von Thaumatococcus daniellii Benth, der Frucht einer einkeimblättrigen westafrikanischen Buschpflanze (Van der Wel, H., 1972, FEBS Lett. 21, 88-90; Iyengar, R. B. et al., 1979, Eur. J. Biochem. 90, 195-204), von denen in der Literatur ihre außerordentliche Süßkraft bekannt ist. Bei der Reinigung eines verwandten Proteins, Monellin, wird eine proteolytische Aktivität beschrieben (Morris, J. A. und Cagan, R. H., 1972, Biochem. Biophys. Acta 261, 114-122; Van der Wel, H., 1972, Europ. J. Biochem. 31, 221-225), die möglicherweise integraler Bestandteil dieser süßen Proteine ist. Vor kurzem wurde die ausgeprägte Ähnlichkeit dieser Proteine mit einem Proteaseinhibitor beschrieben (Richardson, M. et al., 1987, Nature 327, 432-434), der zu einer Gruppe von Proteinen gehört, die bei Befall einer Pflanze durch Insekten, Mikroorganismen oder Viren induziert wird. Einige dieser in Pflanzen induzierten Proteine haben ebenfalls die Funktion eines Proteinaseinhibitors bzw. einer Protease (Cornelissen, B. J. C. et al., 1986, Nature 321, 531-532).

Cysteinproteasen sind in der Natur weit verbreitet (z. B. Papain, Cathepsin B, H und S) und ihre Charakterisierung und Inhibierung ist von großem wissenschaftlichen und therapeutischen Wert (zur Übersicht siehe Turk, V., 1986, "Cysteine Proteinases and their Inhibitors", Walter de Gruyter; Barrett, A. J. und Salvesen, G., 1986, "Proteinase Inhibitors", Elsevier). Wie bereits dargelegt wurde, ist der Infektionsablauf bei Picornaviren entscheidend von den viralen Enzymen abhängig. Da gerade diese Enzyme besonders gut konserviert und in ihren Eigenschaften bei verschiedenen Rhinoviren sehr ähnlich sind, bieten sie sich geradezu als Ziel eines chemotherapeutischen Eingriffs an. Bevorzugtes Ziel könnte z. B. das virale Enzym 2A sein. Der chemotherapeutische Ansatz ist die Inhibierung der enzymatischen Aktivität durch spezifische Inhibitoren. Inhibiert man die erste proteolytische Aktivität, die 2A-Aktivität, so unterbindet man jeden weiteren Reifungsprozeß des viralen Systems. Überraschenderweise weist die 2A-Region von HRV2 nicht nur zu anderen Rhinoviren, sondern auch zu Vertretern anderer Gruppen der Picornaviridae eine ausgeprägte Homologie auf. Ein Inhibitor gegen HRV2 2A könnte daher auch auf andere Picornaviren anwendbar sein.

Die generelle Bedeutung der Inhibierung von viral kodierten Proteinasen wurde nicht zuletzt durch Arbeiten mit der Proteinase des humanen Immundefizienz Virus 1 (HIV I) wieder in den Blickpunkt von möglichen antiviralen Therapieansätzen gerückt. Durch Deletions­ und Punktmutationen in der Proteinaseregion dieser Art von Retroviren konnte die essentielle Rolle der Proteinase bei der Reifung dieser Virenklasse erkannt werden (Katoh, I. et al., 1985, Virol. 145, 280-292; Kohl, N. E. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4686-4690; Crowford, S. and Goff, S.P., 1985, J. Virol. 53, 899-907). Durch Röntgenstrukturanalysen und molekularbiologische Studien konnte weiterhin gezeigt werden, daß die Proteinase von HIV I dem Asp-Typ angehört, sich selbst am Vorläuferprotein prozessieren kann (auch in rekombinanten prokaryontischen Systemen), "in trans" spezifisch Peptide spalten kann und als aktive Proteinase in einer homodimeren Form vorliegt (Navia, M. A. et al., 1989, loc. cit.; Meek, T.D. et al., 1989, loc. cit.; Katoh, I. et al., 1985, loc. cit.). Aufgrund der Tatsache, daß die Proteinase von HIV I in ihrer aktiven Form als Dimer vorliegt, wurde von Wlodawer und Mitarbeitern auch die Entwicklung spezifischer Dimerisierungs-Inhibitoren vorgeschlagen (Wlodawer, A. et al., 1989, Science 245, 616-621). Die Entwicklung von hochspezifischen kompetitiven Inhibitoren gegen die Proteinase von HIV I auf der Basis von modifizierten Peptidsubstraten wurde erst kürzlich von Tomasselli, und Mitarbeitern beschrieben (Tomasselli, A.G. et al., 1990, Biochem. 29, 264-269). Von einem fungiziden Antibiotikum, dem Cerulenin, war schon länger bekannt, daß es eine antiretrovirale Aktivität gegen Rous Sarcoma Virus und Murine Leukemia Virus besitzt (Goldfine, H. et al., 1978, Biochem. Biophys. Acad. 512, 229-240; Katoh, I. et al., 1986, Virus Res. 5, 265-276; ). Im Fall des HIV I konnte die inhibitorische Wirkung von Cerulenin eindeutig mit der Inhibierung beim proteolytischen Prozessieren des Polyproteins von HIV I in Zusammenhang gebracht werden (Pal, R. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 9283-9286). Ausgehend von dieser Tatsache konnten Blumenstein und Mitarbeiter ein sehr schönes Beispiel bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren gegen die Proteinase HIV I auf der Basis von synthetischen Nicht-Peptid Inhibitoren liefern. Sie konnten nämlich die inhibitorische Wirkung des Cerulenin auf die Wechselwirkung des elektrophilen Epoxidrestes mit nukleophilen Regionen der Proteinase zurückführen. Außerdem konnte durch die Entwicklung von synthetischen Derivaten die ursprüngliche Toxizität des Cerulenin vermindert werden (Blumenstein, J.J. et al., 1989, Biochem Biophys. Res. Commun. 163, 980-987).

Auch im picornaviralen System sind derzeit verschiedenste anorganische und organische Verbindungen, sowie Peptidderivate und Proteine bekannt, die eine inhibitorische Wirkung auf das proteolytische Prozessieren dieser Viren besitzen. Der Effekt dieser Substanzen beruht auf der direkten Wechselwirkung mit den Proteinasen (Kettner, C. A. et al., 1987, US Patent Nr.: 46 52 552; Korant, B. D. et al., 1986, J. Cell. Biochem. 32, 91-95) und/oder auf dem indirekten Weg der Wechselwirkung mit Substraten dieser Proteinasen (Geist, F. C. et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31, 622-624; Perrin, D. D. und Stünzi, H., 1984, Viral Chemotherapy 1, 288-189). Das Problem bei den meisten dieser Substanzen ist die relativ hohe Konzentration, die zur Inhibierung nötig ist und die zum Teil große Toxizität dieser Verbindungen. Die bereits erfolgreiche Anwendung von modifizierten Peptiden und Peptidomimetica als Therapeutika in nicht-viralen Gebieten (Fauchere, J. L., 1986, Advanc. Drug Res. 15, 29-69) und das "inhibitor designing" ausgehend von bekannten Strukturen (DesJarlais, R.L. et al., 1989, "Viral Proteinases as Targets for Chemotherapy", in Curr. Commun. Mol. Biol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 203-210) sowie die Zunahme an molekularbiologischen und physikalischen Daten über picornavirale Proteasen erweitert das Verständnis von Struktur und Funktion dieser viralen Enzyme und ermöglicht so ein schrittweises rationales "designing" -ausgehend von modifizierten Peptidsubstraten- bis hin zu hochspezifischen und nicht toxischen Peptidomimetica.

Aufgrund von Vergleichen mit anderen Serinproteasen könnten die Aminosäuren His 18, Asp 35 und Cys 106 das aktive Zentrum, bzw. die am "charge relay system" beteiligten Reste der katalytischen Triade von HRV2-2A bilden.

Die Bedeutung der Reste (His 18 und Asp 35) und der in der näheren Umgebung hochkonservierten Aminosäuren für den Aufbau der katalytischen Triade wurde durch Oligonukleotid gesteuerte Punktmutation einerseits des His 18 und dessen unmittelbarer Umgebung, sowie des Asp 35 ermittelt.

Der HRV2 2A verwandte Proteinasen verwenden für den katalytischen Mechanismus ein "charge relay system" ähnlich dem, wie es bei Chymotrypsin angetroffen wird. Läge ein solches "charge relay sytem" auch bei der HRV2 2A vor, so müßte insbesondere der Asparginsäurerest 35 hierbei eine bedeutende Rolle spielen. Überraschenderweise führte der Austausch von Asp 35 durch Glutaminsäure, die aus sterischen Gründen (CH₂-Gruppe) zu einer Inhibierung der Aktivität führen sollte, lediglich zu einer gewissen Reduktion der Aktivität. Von entscheidener Bedeutung für die Aktivität scheint jedoch die funktionelle Gruppe, die -COOH-Gruppe zu sein. Bei Austausch des Asp 35 gegen Ala kommt es zu einer vollständigen Inhibierung der Aktivität.

Es erscheint daher möglich, daß eine Substanz, die eine Wechselwirkung mit der funktionellen Gruppe des Asp 35 eingehen kann, beispielsweise durch eine basische funktionelle Gruppe, die proteolytische Aktivität der HRV2 2A beeinflussen, vorzugsweise inhibieren kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindungen sind im einzelnen: Oligonukleotide, die für ein modifiziertes aktives Zentrum der HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen die "cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen, vorzugsweise diese inhibieren.

Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen die Aminosäure 18 und/oder die Aminosäure 35 betreffen:
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch His 18→Tyr oder His 18→Ala und/oder zu einem Austausch Asp 35→Glu oder Asp 35→Ala führen.
Oligunukleotide, die für eine modifizierte HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen in dem Bereich für die hochkonservierten Aminosäuren Asn 16 und Leu 19 liegen.
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch Asa 16→Ala und/oder Leu 19→Ser führen.
Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die erfindungsgemäßen Oligonukleotide enthält.
Expressionsplasmid, daß es das pEX2A/II(His 18→Ala), pEx2A/II(His18→Tyr), pEx2A/II(Ans16→Ala), pEx2A/II(Leu19→Ser), pEx2A/II(Asp35→Glu) oder pEx2A/II(Asp35→Ala) ist.
Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der Carboxylgruppe des Asp 35 von HRV2 2A in Wechselwirkung treten kann und dadurch die proteolytische Aktivität beeinflußt, vorzugsweise inhibiert.

Inhibitor bei dem die Wechselwirkung durch eine basische funktionelle Gruppe ausgelöst wird.

Legende zu den Figuren

Fig. 1 zeigt die Sequenz der Oligonukleotide wie sie zur Mutagenese der einzelnen Aminosäuren von HRv2 2A verwendet wurden. Kleinbuchstaben geben die native Sequenz der cDNA von HRV2 wieder, bzw. die Sequenz des Expressionsplasmids pEx2A/II, einer Restriktionsenzym-modifizierten Variante von pEx2A. Großbuchstaben weisen auf die jeweilige Mutation hin. Ebenfalls angeführt sind die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme, die bei der Konstruktion der Mutanten verwendet wurden. X weist auf kompatible, überhängende Enden der doppelsträngigen Oligonukleotide hin, wie sie zur Konstruktion der Mutanten verwendet wurden, die aber keine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz darstellen.

Fig. 2 zeigt die Western blot Analyse der Expressionsprodukte der Mutagenese der katalytischen Triade von 2A. Am linken Bildrand sind die relativen Molmassen in kD angeführt.

65kD: unprozessiertes Expressionsprodukt des Wildtyps und der Mutanten
50kD: prozessiertes Expressionsprodukt der Mutanten und des Wildtyps; entspricht dem Fusionsanteil (98 Aminosäuren der MS2-Polymerase), dem C-terminalen Ende von VP3 und dem gesamten VP1
15kD: HRV2 2A

Spur 1: Restriktionsenzym-modifizierte Variante (pEx2A/II); entspricht der Aminosäuresequenz des Wildtyps
Spur 2: pEx2A/II(His18→Ala)
Spur 3: pEx2A/II(His18→Tyr)
Spur 4: pEx2A/II(Asn16→Ala)
Spur 5: pEx2A/II(Leu19→Ser)
Spur 6: pEx2A/II(Asp35→Glu)
Spur 7: pEx2A/II(Asp35→Ala)

Bild A: Western blot eines 12,5% Polyacrylamidgels mit anti-MS2 Pol Antikörper.
Bild B: Western blot eines 12,5% Polyacrylamidgels mit dem anti-PC20 Antiserum

Fig. 3 zeigt schematisch die Neuschaffung von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme um die Spaltstelle von HRV2-2A und im kodierenden Teil von HRV2-2A.

Nicht fett gedruckte Restriktionsenzyme geben die ursprünglich schon in pEx2A vorhandenen Erkennungssequenzen wieder; eingerahmte, fettgedruckte weisen auf die neu eingeführten Erkennungssequenzen in pEx2A/II hin. AS bedeutet Aminosäuren.

Beispiel 1

Mutationsanalyse der Aminosäuren Asn 16, His 18, Leu 19 und Asp 35 von HRV2 2A.

1. Mutationsanalyse der hochkonservierten Reste Asn 16, His 18 und Leu 19.

Ein Derivat des Vektors pEx2A, nämlich pEx2A/II (siehe Beispiel 2), welches eine neu generierte Bgl II Erkennungssequenz an Position 3263 und eine neu eingeführte SnaB I Restriktionsstelle an Position 3333 der HRV2-cDNA enthält, wurde dazu verwendet, um mit Hilfe doppelsträngiger Oligonukleotide (siehe Fig. 1) das Leucin 19 in ein Serin, das Histidin 18 in ein Tyrosin respektive in ein Alanin und das Asparagin 16 in ein Alanin umzuwandeln. Bei dieser Mutationsanalyse wurde die neu geschaffene Restriktionsstelle Bgl II (3263) und die bereits in der nativen cDNA vorhandene Erkennungssequenz für BstE II (Positionsnummer 3189) verwendet. Für die Konstruktion wurden die verschiedenen doppelsträngigen Mutationsoligonukleotide (siehe Fig. 1) mit dem BstE II/Bgl II Fragment von pEx2A/II ausgetauscht. Die Präparation der Vektor-DNA, die Synthese, Reinigung und Einbau der Oligonukleotide, sowie die DNA-Sequenzierung wurden nach Standardmethoden durchgeführt. Die Klonierung und Propagation der Vektor-DNA wurde in E. coli W6 (lambda), die Expression der mutierten Proteine in E. coli 537 vorgenommen. Die Expressionsprodukte wurden auf reduzierenden SDS-Polyacrylamiden aufgetrennt und identische Gele wurden einer Western-blot Analyse unterworfen, wobei jeweils 2 verschiedene Antisera verwendet wurden, nämlich ein monoklonaler Mausantikörper, der gegen den N-terminalen Teil der MS2-Polymerase gerichtet ist (Hansen, J., 1988, et al., loc. cit) und ein polyklonales Kaninchenantiserum, das ein Peptid erkennt, welches aus den letzten 20 Aminosäuren der nätiven HRV2 2A besteht (im folgenden PC20 genannt; Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.; siehe Beispiel 3). Die Analyse der mutierten Expressionsprodukte ergab, daß ein Austausch des His 18 gegen Ala respektive gegen Tyr in beiden Fällen zu einer vollständig inaktiven Proteinase 2A führt (Fig. 2A und 2B jeweils Spur 2 und 3). Die Mutation des hochkonservierten Asn 16 zu Ala führt ebenfalls zu einer inaktiven HRV2 2A und zeigt damit die Bedeutung dieses Restes für den Aufbau eines intakten katalytischen Zentrums auf (Fig. 2A, 2B; jeweils Spur 4), während überraschenderweise eine Mutation des ebenfalls hochkonservierten Leu 19 zu Ser kaum einen negativen Einfluß auf die proteolytische Funktion ausübt (siehe Fig. 2A, 2B; jeweils Spur 5).

Die katalytische Bedeutung, die dem His 18 zukommt, nämlich wie oben beschrieben, am Aufbau einer katalytischen Triade beteiligt zu sein, wird deutlich, wenn die Primärsequenz der HRV2 2A den bereits ermittelten Röntgenstrukturdaten von verwandten Serinproteasen zugeordnet wird. Die räumlich an dieser Stelle durchaus tolerierbaren Aminosäuren Alanin und Tyrosin können überraschenderweise die katalytische Funktion nicht erfüllen.

2. Einfluß der Mutation des Restes Asp 35 auf die proteolytische Aktivität von HRV2 2A.

Um das Vorliegen eines möglichen "charge relay system" bei HRV2 2A zu untermauern, wurde der für diese Funktion in Frage kommende Asparaginsäure­ rest 35 ausgetauscht. Für die Mutation dieses Asp- Restes wurde wiederum das oben erwähnte pEx2A-Derivat, nämlich pEx2A/II verwendet. Über die native Erkennungssequenz für BstE II (Positionsnummer 3189) und die neu generierte Erkenungssequenz für SnaB I (Positionsnummer 3333) wurde mit Hilfe von doppelsträngigen Oligonukleotiden (siehe Fig. 1) die Mutationen durchgeführt. Dazu wurden die beiden doppelsträngigen Oligonukleotide Asp 35 → Ala bzw. Asp 35 → Glu jeweils mit dem Verbindungsoligonukleotid 3/4 an den kompatiblen überhängenden Enden (in Fig. 1 mit X bezeichnet) , die keine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz darstellen, ligiert und in den mit BstE II und SnaBI geschnittenen Vektor pEx2A/II insertiert. Die in pEx2A/II neu generierte Spaltstelle für Bgl II geht bei diesen beiden Mutationen verloren, da der Austausch exakt in der für Bgl II kodierenden Region stattfindet. Im Fall der Mutation Asp 35 zu Glu bleibt zwar die funktionelle Gruppe (-COOH) erhalten, jedoch ist aus sterischen Gründen (zusätzliche CH₂-Gruppe) eine Inhibierung der proteolytischen Aktivität zu erwarten. Interessanterweise zeigten Expressionsstudien mit dieser Mutante zwar eine Reduktion gegenüber dem Wildtyp, nicht aber eine Inhibierung der proteolytischen Aktivität (siehe Fig. 2A und 2B; jeweils Spur 6). Wenn Asp 35 am "charge relay system" beteiligt ist, so sollte im Fall des Austauschs Asp 35 zu Ala keine proteolytische Funktion mehr nachweisbar sein. Tatsächlich zeigten Expressionsstudien mit dieser Mutante eine vollständige Inhibierung der proteolytischen Aktivität (Fig. 2A und 28; jeweils Spur 7).

Zusammenfassend lassen die oben beschriebenen Mutationsanalysen den Schluß zu, daß His 18 und Asp 35 am Aufbau des katalytischen Zentrums beteiligt sind.

Beispiel 2

Einführung singulärer Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme in dem für die C-terminale Region von VPl und die HRV2-2A kodierenden Abschnitt des Expressionsvektors pEx2A.

Um geeignete neue singuläre Restriktionsschnitt­ stellen in den mittleren für die HRV2-2A kodierenden Bereich von pEx2A (Sommergruber, W. et al, 1989, Virology 169, 68-77) zu erhalten, wurde zunächst die Vektor-DNA von pEx2A mit BstEII und ApaI verdaut und vom entstandenen BstEII/ApaI- Fragment (ca. 270 bp) auf Agarosegelen abgetrennt. Sowohl ApaI als auch BstEII sind Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme, welche ursprünglich in der cDNA von HRV2 anzutreffen sind (Positionsnummer 3458 für ApaI und 3188 für BstEII siehe deutsche Patentanmeldung P 35 05 148.5). Parallel dazu wurden 3 doppelsträngige Oligonukleotide (2A-1512AB, 2A-1600AB und 2A-1728AB), die die Region zwischen der ApaI und der BstEII Stelle von HRV2-2A repräsentieren (siehe Fig. 3), ligiert, mit ApaI/BstEII nachgeschnitten und in den mit ApaI und BstEII linearisierten pEx2A-Vektor eingebaut. Dieser modifizierte pEx2A-Vektor wurde verwendet, um kompetente E. coli W6(1) zu transformieren. Von einigen 100 Klonen wurden 4 aufgrund des Restriktionsmusters ausgewählt, sequenziert und damit kompetente E. coli 537 transformiert. Das Expressionsmuster eines Klons (pEx2A/II) zeigte identes Verhalten wie das von pEx2A Das neu eingebrachte BstEII/ApaI-Fragment weist singuläre Schnittstellen für BglII und SnaBI auf.

Beispiel 3 Produktion des Peptidantikörpers PC2O

Die letzten 20 Aminosäuren der Protease 2A stellen eine potentielle antigene Determinante dar. Ein Peptid (PC20), welches genau diese Aminosäuresequenz aufwies, wurde synthetisiert und zur Induktion von Antikörpern in Kaninchen verwendet: 570 µg dieses Peptids wurden in 0,4 ml PBS Lösung aufgenommen und in einer 5 ml Spritze aufgezogen. In einer zweiten 5 ml Spritze wurden 0,5 ml Freund′sches Adjuvans (CAF; GIBCO) aufgezogen und die beiden Komponenten wurden anschließend mit Hilfe eines Dreiweg-Sperrhahnventils vermischt, bis eine Emulsion gebildet wurde. Das Kaninchen wurde im Ohr arteriell punktiert, um ein Pre-Serum für die Negativkontrolle zu erhalten. Die Immunisierung erfolgte durch subkutane Injektion der Peptid/CFA Mischung an 4 verschiedenen Stellen (0,2 ml/Injektionsstelle) des Rückenbereiches. Nach 5 Wochen wurde mit 1,2 ml Peptidlösung durch Injektion von jeweils 0,2 ml intramuskulär in den Rückenteil "geboostet". Acht Tage später wurde das Blut durch Herzpunktion entnommen. Das Blut ließ man bei Zimmertemperatur gerinnen,

Fibrin und geformte Bestandteile wurden mit einem sterilen Stäbchen entfernt und das Blut bei 2000 rpm zentrifugiert. Das Serum wurde aliquotisiert und bei -18°C gelagert.

Claims (9)

1. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein modifiziertes aktives Zentrum der HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen die "cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen, vorzugsweise diese inhibieren.

2. Oligonukleotide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikationen die Aminosäure 18 und/oder die Aminosäure 35 betreffen.

3. Oligonukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikationen zu einem Austausch His 18 → Tyr oder His 18 → Ala und/oder zu einem Austausch Asp 35 → Glu oder Asp 35 → Ala führen.

4. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine modifizierte HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen in dem Bereich für die hochkonservierten Aminosäuren Asn 16 und Leu 19 liegen.

5. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikationen zu einem Austausch Asa 16 → Ala und/oder Leu 19 → Ser führen.

6. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Expressionsplasmid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es das pEX2A/II(His 18 → Ala), pEx2A/II(His18 → Tyr), pEx2A/II(Asn16 → Ala), pEx2A/II(Leu19 → Ser), pEx2A/II(Asp35 → Glu) oder pEx2A/II(Asp35 → Ala) ist.

8. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der- Carboxylgruppe des Asp 35 von HRV2 2A in Wechselwirkung treten kann und dadurch die proteolytische Aktivität beeinflußt, vorzugsweise inhibiert.

9. Inhibitor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung durch eine basische funktionelle Gruppe ausgelöst wird.