DE60318954T2

DE60318954T2 - Inhibitor-resistente hcv-ns3-protease

Info

Publication number: DE60318954T2
Application number: DE60318954T
Authority: DE
Inventors: George Laval KUKOLJ; Lisette Laval LAGACE; Martin Laval MARQUIS; Daniel Terrebonne LAMARRE; Arnim Montreal PAUSE
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-24
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2023-10-25
Also published as: NZ540292A; EP1558730B1; JP2006503584A; MXPA05004276A; ATE385253T1; WO2004039970A1; CA2498653A1; ES2298585T3; EP1558730A1; US20050019753A1; US7208309B2; DE60318954D1; DK1558730T3; CA2498653C; JP4295222B2; AU2003280239B2; IL168254A; AU2003280239A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue HCV-NS3-Protease und insbesondere auf eine Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease, umfassend eine mutierte Aminosäuresequenz. Sie bezieht sich ebenfalls auf Verfahren der Verwendung einer derartigen Inhibitor-resistenten Protease, um Inhibitoren mit Aktivität gegen HCV-Stämme, die Resistenz gegenüber bekannten Behandlungen entwickelt haben, zu identifizieren.
Hintergrund
Der Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein etiologisches Hauptmittel der Nach-Transfusions- und Ambulanterworbener (Community-acquired) Nicht-A-nicht-B-Hepatitis weltweit. Es wird geschätzt, dass über 200 Millionen Menschen weltweit mit dem Virus infiziert sind. Ein hoher Prozentsatz von Trägern wird chronisch infiziert und bei vielen führt dies zu chronischer Lebererkrankung oder sogenannter chronischer Hepatitis C. Diese Gruppe hat ihrerseits ein hohes Risiko für schwerwiegende Lebererkrankungen, wie Leberzirrhose, hepatozelluläre Karzinome und Lebererkrankung im Endstadium, die zum Tod führen.
Der Mechanismus, durch den HCV virale Persistenz aufbaut und eine hohe Rate an chronischen Lebererkrankungen verursacht, wurde weitgehend noch nicht aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Immunsystem des Wirts interagiert und dieses umgeht. Zusätzlich müssen die Funktionen, die die zellularen und humoralen Immunantworten, die gegen HCV-Infektion und Erkrankung schützen, noch festgestellt werden.
HCV ist ein Positivstrang-RNA-Hüllenvirus der Flaviviridae-Familie. Das Einzelstrang-HCV-RNA-Genom ist von positiver Polarität und umfasst ein offenes Leseraster (ORF) mit einer Länge von etwa 9600 Nucleotiden, das ein lineares Polyprotein von etwa 3010 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zellulare und virale Proteasen gespalten, um strukturelle und nicht-strukturelle(NS-)Proteine zu erzeugen. Die strukturellen Proteine (C, E1, E2 und E2-p7) umfassen Polypeptide, die das Viruspartikel bilden. Die nicht-strukturellen Proteine (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) kodieren die Enzyme oder Zugangsfaktoren, die die Replikation des HCV-RNA-Genoms katalysieren und regulieren. Die Verarbeitung der strukturellen Proteine wird durch Wirtszellen-Protease katalysiert. Die Erzeugung der reifen nicht-strukturellen Proteine wird durch zwei viral kodierte Proteasen katalysiert. Die erste ist die Zink-abhängige NS2/3-Protease, die die Freisetzung des NS3-Proteins aus dem Polyprotein autokatalysiert. Das freigesetzte NS3-Protein enthält eine N-terminale Serin-Protease-Domäne und katalysiert die verbleibenden Spaltungen vom Polyprotein. Das freigesetzte NS4A-Protein hat zwei Funktionen. Die erste Funktion ist es, einen stabilen Komplex mit NS3-Protein zu bilden und bei der Membranlokalisierung des NS3/NS4A-Komplexes zu unterstützen. Die zweite Funktion des NS4A-Proteins ist es, als Co-Faktor für die NS3-Protease-Aktivität zu wirken. Dieser Membran-assoziierte Komplex katalysiert selbst die Spaltung der verbliebenen Stellen am Polyprotein und bewirkt damit die Freisetzung von NS4B, NS5A und NS5B. Das C-terminale Segment des NS3-Proteins umfasst ebenfalls die Nucleosidtriphosphatase und RNA-Helicase-Aktivität. Die Funktion des NS4B-Proteins ist unbekannt. NS5A ist ein hochgradig phosphoryliertes Protein, das für die Interferon-Resistenz verschiedener HCV-Gentypen verantwortlich zu sein scheint. NS5B ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp), die bei der Replikation von HCV involviert ist.
Das offene Leseraster des HCV-RNA-Genoms ist an seinem 5'-Ende von einer nicht-translatierten Region (NTR) von etwa 340 Nucleotiden flankiert, die als interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) fungiert, und an seinem 3'-Ende durch ein NTR von etwa 230 Nucleotiden. Sowohl die 5'- als auch 3'-NTRs sind für die RNA-Genom-Replikation wichtig. Die genomische Seequenzvarianz ist nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, und die 5'NTR- und Teile der 3'NTR sind die am besten beibehaltenen Abschnitte.
Die klonierten und charakterisierten partiellen und vollständigen Sequenzen des HCV-Genoms wurden im Hinblick auf geeignete Ziele für in Aussicht stehende antivirale Therapien analysiert. Die nachfolgenden vier viralen Enzym-Aktivitäten liefern mögliche Ziele: (1) Die NS2/3-Protease; (2) der NS3/4A-Protease-Komplex; (3) die NS3-Helicase und (4) die NS5B-RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5B RdRp). Die NS3-Protease wurde ebenfalls kristallisiert, um eine Struktur zu enthüllen, die an andere Serin-Proteasen erinnert (Love et al., 1996; Kim et al., 1996).
Die NS3-Protease-Aktivität ist ein attraktives Ziel für die Arzneimittelentdeckung. Von enzymatischen Studien wurde gezeigt, dass Peptide, basierend auf dem N-terminalen Produkt der NS5A/5B-Spaltungsstelle, kompetitive Inhibitoren des Enzyms darstellen. Diese Peptide dienten als nützlicher Ausgangspunkt in Anstrengungen der medizinischen Chemie, um NS3-Proteasen-Inhibitoren als klinisch wirksame anti-HCV-Verbindungen rationell zu designen.
Chronische Hepatitis C hat sich zu einer bedeutenden klinischen Indikation entwickelt, eine effektive Behandlung hierfür muss aufgrund der geringen Reaktionsraten auf gängige existierende Behandlungen noch gefunden werden. Beispielsweise zeigt eine neu zugelassene Standardbehandlung mit pegyliertem Interferon in Kombination mit Ribavirin eine verzögerte Reaktionsrate von 40 bis 50%. Jedoch wird bei einem Hauptanteil der Patienten nach wie vor keine verzögerte antivirale Reaktion, insbesondere gegen die Interferon-resistenten HCV-Gentypen 1a und lb, ausgelöst.
Die WO 00/09543 , die WO 00/09558 und die WO 00/59929 (sämtliche durch Bezugnahme hier einbezogen) offenbaren bestimmte Typen von Inhibitoren der HCV-NS3-Protease, die hochgradig aktiv und selektiv sind. Diese Verbindungen weisen Potential auf, um die nächste Generation von anti-HCV-Behandlung zu werden. Es kann erwartet werden, dass diese Inhibitoren, genauso wie viele andere antivirale Behandlungen, schließlich Viren zur Folge haben werden, die gegenüber diesen Inhibitoren zumindest partiell resistent sind.
Das Wissen um Mutationen, die HCV gegenüber Inhibitoren resistent machen, liefert die Basis, Inhibitoren zu identifizieren, die gegen derartig resistente Stämme wirksam sind. Trozzi et al., 2003, haben ein resistentes Mutant-Replicon mit drei individuellen Aminosäure-Substitutionen (D168A/Y/V) offenbart, welche die Protease gegenüber einem Inhibitor der NS3-Protease resistent machen.
Demgemäß beschreiben wir in einem Versuch, eine Behandlung mit Langzeit-Wirksamkeit zu entwickeln, die eine anti-HCV-Resistenz unterdrückt oder überwindet, ein Mittel, um anti-HCV-Verbindungen zu identifizieren, die Aktivität gegen Inhibitor-resistente HCV-Stämme zeigen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf einem Verfahren zur Auswahl einer Inhibitor-resistenten HCV-NS3-Mutant-Protease, umfassend die Schritte:

• Herstellen eines Nulceinsäure-Konstrukts, das einen auswählbaren Marker und natürliche HCV-NS3-Protease kodiert und Transinfizieren von Wirtszellen mit dem Konstrukt; und
• Inkubieren der transinfizierten Wirtszellen in Gegenwart eines HCV-NS3-Inhibitors unter Bedingungen, die zur Auswahl von transinfizierten Zellen geeignet sind, worin Kolonien, resultierend aus der Inkubation unter diesen Bedingungen, Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease erzeugen.

Ein weiteres Verfahren ermöglicht die Isolierung von Inhibitor-resistenter HCV-NS3-Mutant-Protease, worin das oben beschriebenen Verfahren weiterhin die Schritte umfasst:

• Lysieren der Zellen, um die RNA freizusetzen, und Verwendung einer derartigen RNA zum Erzeugen der resistenten Mutant-Protease; oder Lysieren der Zellen, um die Inhibitor-resistente NS3-Protease freizusetzen, und Isolieren der Inhibitor-resistenten NS3-Protease.

In dieser Hinsicht liefert die vorliegende Erfindung in einer zweiten Ausführungsform neue, bevorzugt isolierte, Inhibitor-resistente HCV-NS3-Proteasen.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung rekombinante, bevorzugt isolierte, rekombinante Nucleinsäuren, die Inhibitor-resistente HCV-NS3-Proteasen kodieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser dritten Ausführungsform wird eine Nucleotidsonde bereitgestellt, die in der Lage ist, unter strengen Bedingungen an eine mutierten Nucleotidsequenz, wie hier für diagnostische Zwecke definiert, zu hybridisieren.
In einer weiteren Ausführungsform werden Vektoren, die Nucleinsäuren einbeziehen, die Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease kodieren, bereitgestellt.
Wirtszellen, transinifiziert mit diesen Vektoren, und Zelllinien, die hiervon abgeleitet sind, werden in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Bewertung der HCV-NS3-Protease-Aktivität der Inhibitor-resistenten NS3-Proteasen gemäß der Erfindung, umfassend die Schritte:

• Inkubieren von Wirtszellen, transinfiziert mit Nucleinsäure, die eine Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease kodiert, unter Bedingungen, die bewirken, dass die Protease exprimiert wird, und
• Messen der Replikation der Nucleinsäure in den Wirtszellen, worin das Replikationsniveau proportional zur Aktivität der exprimierten Protease ist.

Darüberhinaus umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung potentieller Inhibitoren der HCV-NS3-Protease-Aktivität der zweiten Generation, umfassend:

• Inkubieren von Wirtszellen, transinifiziert mit Nucleinsäure, die eine Inhibitor-resistente NS3-Protease kodiert, unter Bedingungen, die die Expression hiervon bewirken in Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidat der zweiten Generation;
• Inkubieren von Wirtszellen, transinifiziert mit Nucleinsäure, die eine Inhibitor-resistente NS3-Protease kodiert, unter Bedingungen, die Expression hiervon bewirken, in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; und
• Messen der Replikation der Nucleinsäure in Gegenwart und Abwesenheit des Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation, worin das Replikationsniveau der Nucleinsäure proportional zur Aktivität der exprimierten Protease ist, und worin eine Abnahme der Aktivität der Protease in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation angibt, dass die Verbindung die Protease inhibiert.

Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung potentieller Inhibitoren der HCV-NS3-Protease-Aktivität der zweiten Generation, umfassend:

• Inkubieren eines Inhibitor-resistenten NS3-Protease-Mutanten, wie oben definiert, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; und
• Messen der Protease-Aktivität der Inhibitor-resistenten NS3-Protease in Gegenwart und Abwesenheit des Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation;

Andere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden nicht-beschränkenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen offensichtlich, worin:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 das Verfahren veranschaulicht, durch das HCV-RNA-Replikation in Huh-7-Zellkultur erreicht wird;
2 Neomycin-resistentes Huh-7-Zellwachstum in Gegenwart eines NS3-Protease-Inhibitors bei Konzentrationen im Bereich von 2 nM bis 2000 nM veranschaulicht; und
3 die Clusterbildung mehrerer Aminosäure-Substitutionen, ausgewählt mit den NS3-Protease-Inhibitoren, an Aminosäuren nahe der aktiven Stelle (hellgrau) der NS3-Protease-Domäne vorliegend, veranschaulicht. Die Reste in weiß geben diejenigen an, die in Resistenz-Studien identifiziert wurden und nahe dem gebundenen Inhibitor in der Kristallstruktur vorliegen (Struktur, beschrieben von Y. S. Tsantrizos et al., Angew. Chemie v42, 1356).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Sofern nicht anders definiert, haben wissenschaftliche und technologische Begriffe und Nomenklaturen, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie herkömmlicherweise vom Fachmann im Stand der Technik, an den sich diese Erfindung richtet, verstanden wird. Im Allgemeinen sind die Verfahren für Zellkultur, Infektion, molekularbiologische Verfahren und dergleichen herkömmliche im Stand der Technik verwendete Verfahren. Derartige Standardtechniken können in Referenz-Nachschlagwerken, wie beispielsweise Sambrook et al. (2000) und Ausubel et al. (1994), gefunden werden.
Nucleotidsequenzen werden als Einzelstrang in der 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts unter Verwendung von Ein-Buchstaben-Nucleotidsymbolen, wie herkömmlicherweise im Stand der Technik verwendet, und gemäß den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (1973) empfohlen, dargestellt.
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich auf eine Zahl routinemäßig verwendeter rekombinanter DNA(rDNA)-Technologiebegriffe. Nichtsdestotrotz werden Definitionen ausgewählter Beispiele derartiger rDNA-Begriffe aus Gründen der Klarheit und Konsistenz angegeben.
Der Begriff "rekombinante DNA", "rekombinantes Nucleinsäuremolektil" oder "rekombinantes Plasmid", wie im Stand der Technik bekannt, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, resultierend aus der Verbindung von DNA-Segmenten. Dies wird häufig als Gentechnik bezeichnet.
Der Begriff "Nucleinsäure", wie er im Hinblick auf Segmente, Moleküle oder Sequenzen verwendet wird, bezeichnet eine Einheit, aufgebaut aus Nucleotiden, und umfasst somit sowohl DNA-Moleküle als auch RNA-Moleküle. Diese Segmente, Moleküle oder Sequenzen können aus natürlichen Quellen unter Verwendung von im Stand der Technik etablierten Techniken isoliert werden oder können synthetisch gewonnen werden, ebenfalls unter Verwendung gut etablierter Techniken. Wenn gemäß dem genetischen Code gelesen, können diese Sequenzen eine lineare Kette oder Sequenz von Aminosäuren kodieren, die ein Polypeptid, ein Protein oder ein Proteinfragment definieren.
Der Begriff "DNA", wie hier im Hinblick auf Segmente, Moleküle oder Sequenzen verwendet, wird hier verwendet, um sich auf eine Kette von Nucleotiden zu beziehen, die jeweils die Zucker-Desoxyribose und eine der vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) oder Cytosin (C) enthält. Der Begriff "RNA" bezieht sich auf eine Kette von Nucleotiden, die jeweils die Zucker-Ribose und eine der vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Uracil (U) oder Cytosin (C) enthält. Wie der Fachmann im Stand der Technik schätzen wird, sind die folgenden Bezugnahmen auf DNA ebenfalls allgemein auf RNA anwendbar.
Der Begriff "Derivat" bezeichnet eine Modifikation, die die Addition einer chemischen Einheit umfasst, die der NS3-Mutant-Protease oder der diese kodierenden DNA ein oder mehrere erwünschte Eigenschaften verleiht. Derartige chemische Einheiten können beispielsweise verbesserte Stabilität verleihen (d. h. biologische Halbwertszeit). Diese Einheiten können ebenfalls aus Gründen der Markierung verwendet werden. Einheiten, die dazu in der Lage sind, diese und andere erwünschte Eigenschaften bereitzustellen, können in Remington's The Science and Practice of Pharmacy (1995) gefunden werden. Methodologien zum Koppeln derartiger Einheiten an ein Molekül sind im Stand der Technik gut bekannt.
Der Begriff "Fragment" bezieht sich auf ein Segment einer identifizierten Inhibitor-resistenten NS3-Protease-Mutant-kodierenden DANN-, RNA- oder Aminosäuresequenz und/oder ein Segment irgendeiner Variante oder eines Derivats hiervon, das im Wesentlichen die Fähigkeit aufrechterhält, eine Inhibitor-resistente NS3-Protease zu kodieren. Derartige Fragmente können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 5'- oder 3'-gekürzte Nucleotidsequenzen oder endständig gekürzte Aminosäuresequenzen.
Der Begriff "Expressionsvektor" definiert einen Vektor ähnlich zu dem oben beschriebenen, der zusätzlich die Elemente einbezieht, die notwendig sind, um die Expression einer eingeführten Sequenz nach Transformation oder Transfektion in einen Wirt zu ermöglichen. Das klonierte Gen (eingeführte Sequenz) wird in der Regel unter Kontrolle von Expressionskontrollelementsequenzen, wie Promotorsequenzen, eingebaut. Derartige Expressionskontrollsequenzen variieren abhängig davon, ob der Vektor ausgelegt ist, die eingeführte Sequenz in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt oder beiden (Shuttle-Vektoren) zu exprimieren, und kann zusätzlich transkriptionale Elemente, wie Verstärkerelemente, Terminationssequenzen, Gewebespezifizitätselemente und/oder translatorische Initiiations- und Terminationsstellen enthalten. DNA/RNA wird hier bezeichnet als "exprimierbar" in einen derartigen Vektor eingeführt und "exprimierbar" in eine Zelle eingeführt, sobald eine erfolgreiche Expression in einer Zelle erreicht wird.
Unter "eukaryotischem Expressionssystem" ist die Kombination eines geeigneten Expressionsvektors und einer eukaryotischen Zelllinie, die verwendet werden kann, um ein interessierendes Gen zu exprimieren, gemeint. In sämtlichen Fällen enthält der Vektor geeignete Kontrollelemente (Promotoren), um das Gen im interessierenden Zell-Typ zu exprimieren. Eukaryotische Zell-Typen, die typischerweise verwendet werden, umfassen Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris), die mit einem Plasmidvektor transinfiziert werden, sowie Säugetierzellen, transinifiziert mit DNA-Vektoren für dauerhafte oder konstitutive Expression. Eine bevorzugte Zelllinie, verwendbar für die Zwecke dieser Erfindung, wird aus Lebergewebe abgeleitet.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "funktionelles Derivat", im Zusammenhang eines funktionellen Derivats einer Sequenz, ob eine Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz, ein Molekül, das eine biologische Aktivität (entweder Funktion oder strukturell) beibehält, die im Wesentlichen ähnlich ist zu derjenigen der ursprünglichen Sequenz. Im vorliegenden Fall bedeutet das funktionelle Derivat, dass die resultierende Aminosäuresequenz mindestens einen Teil der biologischen Aktivität der NS3-Protease beibehält, der ausreicht zu ermöglichen, dass die NS3-Protease mindestens einen Abschnitt, bevorzugt sämtliche ihrer natürlichen Substrate spaltet, d. h. die NS3/4A-, 4A/4B-, 4B/5A- und 5A/5B-Spaltungsstellen. In vivo wird die NS3-Protease-Aktivität beibehalten, wenn die HCV-RNA oder das Virus in der Lage ist, zu replizieren. Dieses fraktionelle Derivat oder Äquivalent kann ein natürliches Derivat sein oder kann synthetisch hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen Aminosäuresequenzen mit Substitutionen, Deletionen oder Additionen von ein oder mehreren Aminosäuren, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität des Proteins beibehalten wird. Dasselbe gilt für Derivate von Nucleinsäuresequenzen, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von ein oder mehreren Nucleotiden aufweisen, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität der Sequenz allgemein beibehalten wird. Mit Bezug auf eine Proteinsequenz weist die substituierende Aminosäure chemophysikalische Eigenschaften auf, die in der Regel, aber nicht notwendigerweise, ähnlich zu denjenigen der substituierten Aminosäure sind. Die ähnlichen chemophysikalischen Eigenschaften umfassen Ähnlichkeiten hinsichtlich Ladung, Sperrigkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und dergleichen. Einige der bekanntesten konservativen Aminosäure-Substitutionen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
Leu oder Val oder Ile; Gly oder Ala; Asp oder Glu; Asp oder Asn oder His; Glu oder Gin; Lys oder Arg; Phe oder Trp oder Tyr; Val oder Ala; Cys oder Ser; Thr oder Ser; und Met oder Leu.
Der Begriff "Hybridisierung unter strikten Bedingungen", wie hierin verwendet, bedeutet Bedingungen, die sich mindestens um eine oder mehrere Nucleotid-Änderungen in der Zielsequenz unterscheiden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Inhibitor-resistent", dass er sich auf eine HCV-NS3-Mutant-Protease bezieht, die im Wesentlichen die Protease-Aktivität in Gegenwart einer Verbindung beibehält, die im Allgemeinen bekannt dafür ist, dass sie die natürliche HCV-NS3-Protease-Aktivität inhibiert. Aus Gründen der Klar heit ist "ein Inhibitor" eine Verbindung, die die Spaltung von einer oder mehreren der NS3-Protease-Spaltungsstellen, ausgewählt aus NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A und NS5A/5B, inhibiert.
Der Begriff "isoliert", wie hier verwendet, bedeutet in einem Zustand, isoliert aus einer Zelle, d. h. irgendeinen zellfreien Extrakt.
Aus Gründen der Klarheit bezieht sich "HCV-NS3-Mutant-Protease" auf HCV-NS3-Protease, enthaltend eine oder mehrere Aminosäure-Mutationen, wie Aminosäure-Modifikationen, -Substitutionen, -Deletionen und -Insertionen, die nicht in der Eliminierung der Protease-Aktivität resultieren. Wie vom Fachmann im Stand der Technik verstanden wird, kann die Aktivität einer HCV-NS3-Mutant-Protease in gewissem Maße gegenüber derjenigen von natürlicher HCV-NS3-Protease variieren. Der Fachmann im Stand der Technik versteht, dass die vorliegende Erfindung so gemeint ist, dass Inhibitor-resistente NS3-Mutant-Protease umfasst, und somit nicht auf spezifische, hier veranschaulichte Aminosäuresequenzen beschränkt ist. Die Erfindung umfasst ebenfalls Derivate oder Varianten der vorliegenden NS3-Mutant-Proteasen oder Fragmente hiervon, die Resistenz gegenüber HCV-NS3-Protease-Inhibitoren zeigen. Wie nachfolgend veranschaulicht, können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nucleotidsequenzen und Polypeptide modifiziert werden, beispielsweise durch in vitro-Mutagenese, um die katalytische und Strukturfunktionsbeziehung hiervon aufzugliedern und ein besseres Design und eine bessere Identifikation der resultierenden Proteine zu erlauben.
Der Begriff "Nucleinsäure-Konstrukt" bezieht sich auf einen Nucleinsäurestrang, aufgebaut aus Nucleinsäuresequenzen, die normalerweise nicht koexistieren. Ein Nucleinsäure-Konstrukt wird im Allgemeinen für einen spezifischen Zweck hergestellt und umfasst somit sämtliche der Komponenten, die notwendig sind, um diesen Zweck zu erreichen. Beispielsweise kann ein Nulceinsäure-Konstrukt, das ein spezifisches Protein kodiert, hergestellt werden, das die Komponenten umfasst, die für die Expression dieses Proteins unter bestimmten Bedingungen notwendig sind. Vektor-DNA, umfassend exogene DNA, wie nachfolgend diskutiert, ist ein Beispiel eines Nucleinsäure-Konstrukts.
Eine Wirtszelle oder eine Indikatorzelle wurde durch exogene oder heterologe DNA oder RNA (z. B. ein DNA-Konstrukt) "transinfiziert", wenn eine derartige RNA oder DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transinfizierte RNA oder DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA integriert (kovalent gebunden) sein, welche das Genom der Zelle ausmacht. In Prokaryoten kann die transinfizierte/transformierte DNA auf einem episomalen Element, wie einem Plasmid, aufrechterhalten werden. Andererseits ist in Eukaryoten eine stabile transinfizierte Zelle eine, in der die transinfizierte DNA in die genomische DNA in Chromosomen integriert ist, und von Tochterzellen durch chromosomale Replikation geerbt wird. Weiterhin kann in Eukaryoten eine stabile transinfizierte Zelle eine sein, in der die transinfizierte RNA als ein episomales Element, wie ein Replikon, erhalten wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der Zelle gezeigt, Zelllinien oder Klone zu etablieren, die aus einer Population von Tochterzellen, enthaltend die transinfizierte DNA, aufgebaut sind. Transinfektions- bzw. Transfektionsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und werden in Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1994, beschrieben.
Der Begriff "Replikon", wie hier verwendet, bedeutet ein RNA-Molekül, das ein oder mehrere Proteinmoleküle kodieren kann und sich über ein komplementäres RNA-Strang-Zwischenprodukt repliziert.
Um ohne Weiteres die Expression eines interessierenden Gens zu beurteilen, kann eine Zelle mit einem Gen transinfiziert werden, das einen detektierbaren Marker oder ein "Reporter"-Protein, zusammen mit dem interessierenden Gen, kodiert, derart, dass die Expression des Reporter-Proteins die Expression des interessierenden Gens angibt. Der Begriff "Reporter-Gen" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die ein derartiges "Reporter-Protein" kodiert. Beispiele von herkömmlicherweise verwendeten Reporter-Genen umfassen sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP), Neomycin, Luciferase, Chloramphenicolaminotransferase (CAT), P-Galactosidase und Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP).
Der Begriff "selektierbarer Marker" bzw. "auswählbarer Marker", wie hier verwendet, bedeutet ein Gen, das, wenn exprimiert, die Zelle gegenüber einem ausgewählten Mittel, wie einem Antibiotikum (ebenfalls bezeichnet als selektiver Druck), resistent macht.
Der Begriff "selektiver Druck" oder "ausgewähltes Mittel" bzw. "Selektionsmittel", wie hier austauschbar verwendet, bedeutet ein Molekül oder eine Verbindung, die, wenn Zellen präsentiert, die den auswählbaren Marker nicht exprimieren, den Zelltod auslöst. Beispielsweise können derartige Selektionsmittel Antibiotika umfassen, wie: G418, Hygromycin, Zeomycin oder Puromycin.
Die Bezeichnung "Variante" bezeichnet im Zusammenhang dieser Erfindung eine NS3-Protease, die Inhibitor-Resistenz zeigt, wie oben dargelegt. Eine Variante kann von derselben oder einer verschiedenen Spezies sein und kann eine natürliche Variante oder eine synthetisch abgeleitete Variante sein. Eine NS3-Protease-Variante gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere Amino-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen einbeziehen, vorausgesetzt, dass die Inhibitor-Resistenz beibehalten wird. Variationen in der Nucleotidsequenz, die die vorliegende NS3-Mutant-Protease kodieren, sind ebenfalls umfasst, und diese können Substitutionen, Deletionen oder Additionen eines oder mehrerer Nucleotide in der Sequenz enthalten, vorausgesetzt, dass die Inhibitor-Resistenz der Protease, die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, beibehalten wird. Varianten, Derivate und Fragmentmoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen sowohl Proteine als auch Nucleinsäuremoleküle und können unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannter Verfahren erhalten werden, einschließlich Techniken der Isolation/Reinigung, chemischer Synthese und rekombinanter DNA-Technologie.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf eine Nucleinsäureverbindung, die zur Einführung exogener Nucleinsäuren in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor umfasst eine Nucleotidsequenz, die ein oder mehrere Proteinmoleküle kodieren kann. Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen im natürlichen Zustand oder solche, die rekombinanten Techniken unterzogen wurden, sind Beispiele herkömmlicherweise verwendeter Vektoren, in die eine exogene genetische Sequenz oder ein Element (entweder DNA oder RNA) eingeführt werden kann, um die Replikation der exogenen Sequenz oder des Elements zu bewirken.
Bevorzugte Ausführungsformen
Verfahren zur Selektion und Isolation von Inhibitor-resistenter NS3-Mutant-Protease
In einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Inhibitor-resistenten HCV-NS3-Mutant-Protease bereitgestellt.
Das Verfahren umfasst die Schritte des Herstellens eines Nucleinsäure-Konstrukts, das einen auswählbaren Marker und native HCV-NS3-Protease kodiert, worin die Replikation und Expression des auswählbaren Markers von der HCV-NS3-Protease-Aktivität abhängig ist. Ein Beispiel ist das HCV-Replikon. Wirtszellen werden mit diesem Konstrukt transinfiziert und in Gegenwart eines NS3-Inhibitors unter selektivem Druck unter Bedingungen, geeignet zur Selektion von erfolgreich transinfizierten Zellen, inkubiert. Beispiele von auswählbaren Marker sind oben angegeben. Der geeignete auswählbare Marker trägt bei erfolgreich transinfizierten Zellen zu einem Wachstumsvorteil unter den Wachstumsbedingungen, denen die Zellen ausgesetzt sind, bei. Kolonien, die aus der Inkubation unter diesen Bedingungen resultieren, beziehen die Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease ein.
Verfahren zur Lyse der Zellen und Isolierung der Mutant-Nucleinsäure oder schließlich Isolieren der Mutant-Protease sind im Fachwissen gut bekannt, oder sind wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Die Art der Mutationen, welche die NS3-Mutant-Proteasen gegenüber dem ausgewählten Inhibitor resistent machen, können ohne Weiteres unter Verwendung von Standardsequenztechniken, die dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt sind, identifiziert werden.
Gemäß der ersten Identifikation der relevanten Mutanten kann eine Validierung durch weitere Erzeugung ähnlicher Mutant-Nucleinsäuren oder -Proteasen durch stellengerichtete Mutagenese durch dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannte Techniken erreicht werden, oder ist wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Mutant-Proteasen
Die vorliegende Erfindung liefert in einer zweiten Ausführungsform eine neue Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease.
Ohne an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, resultieren in einem Aspekt dieser Ausführungsform die Mutationen an der nativen NS3-Protease in einer Änderung, möglicherweise Konformations- oder sterischer Art, welche die Protease-Inhibitorbindung verhindert oder zumindest reduziert, derart, dass die Protease-Aktivität im Wesentlichen beibehalten bleibt. Insbesondere können Mutationen in und um die Aminosäuren 1 bis 180 der Protease derart mutiert werden, dass die Inhibitorbindung abnimmt. Noch spezieller können Mutationen in und um die aktive Stelle oder nahe der Inhibitorbindungsstelle derart mutiert werden, dass die Inhibitorbindung abnimmt.
Die Inhibitor-resistente Protease kann bei mindestens einer der Aminosäure-Positionen entsprechend den Aminosäuren 155, 156 oder 168 der nativen HCV-NS3-Protease-Sequenz mutiert werden. Die native Aminosäure an Position 155 ist Arginin (Arg155 oder R155), an Position 156 ist Alanin (Ala156 oder A156) und an Position 168 ist am häufigsten im Gentyp 1 eine Aspartinsäure (Asp168 oder D168), doch Glutaminsäure (Glu oder E) wird ebenfalls in einigen Gentyp 1-Viren gefunden oder Glutamin (Gln oder Q) wird in Gentyp 3-Viren gefunden. Ein Beispiel der nativen Aminosäuresequenz der HCV-1b-NS3-Protease-Domäne wird in SEQ ID Nr: 2 gezeigt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung weist die Inhibitor-resistente NS3-Protease mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen 155, 156 und 168 auf, die durch eine Aminosäure ersetzt wird, die in der HCV-NS3-Protease an diesen Positionen nicht natürlich auftritt.
Die native Aminosäure an Position 155 ist Arginin (Arg¹⁵⁵ oder R¹⁵⁵). Gemäß eines bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist das Arginin an Position 155 der Inhibitor-resistenten NS3-Protease ersetzt durch eine nicht-basische Aminosäure. Die Ersetzung von Arg¹⁵⁶, im Allgemeinen durch nicht-basische Aminosäuren, wie Glutamin (Q) oder Tryptophan (W), resultiert in einer Inhibitor-resistenten NS3-Protease.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Alanin an Position 156 der Inhibitor-resistenten NS3-Protease durch irgendeine andere Aminosäure ersetzt. In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform wird die Inhibitor-resistente Protease bei Ala156 im Allgemeinen mit nicht geladenen Aminosäuren, wie Glycin (G), Threonin (T) oder Valin (V), mutiert, resultierend in einer Inhibitor-resistenten NS3-Protease. Alternativ wird die Inhibitor-resistente Protease bei Ala156 im Allgemeinen mit nicht geladenen Aminosäuren mit etwas größeren Seitenketten, wie Threonin (T) oder Valin (V), mutiert, resultierend in einer Inhibitor-resistenten NS3-Protease.
In einem weiteren Aspekt dieser Ausführungsform wird die Inhibitor-resistente Protease an der Aminosäure-Position 168 mutiert. Die native Aminosäure an Position 168 ist Aspartinsäure (Asp¹⁶⁸ oder D¹⁶⁸), Glutaminsäure (Glu oder E) oder Glutamin (Gln oder Q). Gemäß eines bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist Aspartamsäure/Glutaminsäure/Glutamin an Position 168 der Inhibitor-resistenten NS3-Protease durch irgendeine andere Aminosäure ersetzt. Die Ersetzung von Asp¹⁶⁸, im Allgemeinen mit Aminosäuren, wie Glycin (G), Alanin (A), Asparagin (N), Histidin (H) oder Valin (V), resultiert in einer Inhibitor-resistenten NS3-Protease. Bevorzugt ist Aspartamsäure/Glutaminsäure/Glutamin an Position 168 der Inhibitor-resistenten NS3-Protease durch ungeladene Aminosäuren mit kleinen Seitenketten, wie Glycin (G), Alanin (A), Asparagin (N) oder Valin (V), ersetzt, resultierend in einer Inhibitor-resistenten NS3-Protease. Noch bevorzugter wird das Asp/Glu/Gln168 mutiert zu Alanin (A) oder Valin (V). Alternativ wird in einer weiter bevorzugten Ausführungsform das native Asp/Glu/Gln¹⁶⁸ der NS3-Protease durch Glycin (G), Asparagin (N) oder Histidin (H) ersetzt.
In einem weiterhin bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform wird das native Arg¹⁵⁵ der NS3-Protease durch Glutaminsäure ersetzt.
In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform wird das native Ala¹⁵⁸ der NS3-Protease durch Valin ersetzt.
In einer weiteren Mutation wird das native Asp¹⁶⁸ der NS3-Protease durch Valin ersetzt.
In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform wird mindestens das native Ala¹⁵⁸ der NS3-Protease durch Valin ersetzt.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform werden sowohl das native Ala¹⁵⁶ als auch das Asp¹⁶⁸ der NS3-Protease durch Valin ersetzt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung deckt eine NS3-Protease-Domäne ab, umfassend eine Sequenz mit 90% Identität zur Sequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, worin die Aminosäuresequenz wie oben definiert mutiert ist.
Alternativ kann irgendeine der in den Tabellen 1, 2, 3 oder 4 dargestellten Mutationen zu einer Inhibitor-resistenten HCV-NS3-Mutant-Protease führen.
Rekombinante Nucleinsäuremoleküle
Die Erfindung umfasst rekombinante Nucleinsäuremoleküle, einschließlich sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle, die Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Proteasen, wie oben definiert, kodieren. Ein Beispiel der Nucleotidsequenz, die eine native HCV-NS3-Protease-Domäne kodiert, wird in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt. Modifikationen in dieser Sequenz, die die Inhibitor-resistente NS3-Mutant-Proteasen kodieren, wie unter Verwendung von dem Fachmann im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt, z. B. Tests auf Zellbasis, die in den spezifischen Beispielen hier beschrieben sind, sind umfasst, einschließlich Varianten, Derivaten und Fragmenten hiervon. Diese Sequenzmodifikationen können selbstverständlich auch Modifikationen enthalten, die aus der Degeneration des Nucleinsäure-Codes resultieren.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert das Nucleinsäuremolekül eine Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease, die an mindestens einer der Aminosäuren, wie oben definiert, modifiziert ist.
Nucleinsäure-Konstrukte, Vektoren, Replikon und Viren
Die Erfindung umfasst Nucleinsäure-Konstrukte, Vektoren, Replikon und Viren, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das eine Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease, wie oben beschrieben, kodiert.
In einem Aspekt dieser Ausführungsform werden Nucleinsäure-Konstrukte, die Inhibitor-resistente NS3-Protease kodieren, hergestellt, in der die Nucleinäure, die die Mutant-Protease kodiert, an Nucleinsäure gebunden ist, die einen auswählbaren Marker kodiert.
In einem speziellen Aspekt dieser Ausführungsform wird die Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease-kodierende Nucleinäure "exprimierbar" in ein Konstrukt oder einen Vektor einbezogen. Um Expression zu erreichen, wird die Protease-kodierende Nucleinsäure an Elemente im Konstrukt oder Vektor gebunden, die geeigneterweise die Expression der Protease-kodierenden Nucleinäure bei Transinfektion in einer Wirtszelle stabil oder vorübergehend ermöglichen. Expressionskonstrukte und Vektoren, wie oben beschrieben, sind dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt.
Transinfizierte Wirtszellen
Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor oder Replikon transinfiziert sind, umfassen ein Nucleinäuremolekül, das eine Inhibitor-resistente HCV-NS3-Mutant-Protease kodiert, werden bereitgestellt, genauso wie Zelllinien, abgeleitet von derartigen Wirtszellen.
In einem Aspekt der bevorzugten Ausführungsform werden geeignete Expressionssysteme und prokaryotische oder eukaryotische Zellen zur Expression der HCV-NS3-Mutant-Protease bereitgestellt.
Bevorzugte Aspekte dieser Ausführungsform liefern Expressionssysteme in E. coli, Baculovirus, Hefe, genauso wie Säugetierzellen, wie Huh-7-Zellen.
In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform wird eine Säugetier-Wirtszelle, transinfiziert mit einem Vektor oder einem Replikon oder infiziert mit einem Virus, bereitgestellt, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das eine Inhibitor-resistente NS3-Mutant-Protease entweder stabil oder vorübergehend kodiert. Nicht beschränkende Beispiele geeigneter Säugetier-Wirtszellen und Zelllinien umfassen primäre Hepatozyten, Leberzelllinien, Fibroplasten, Lymphozyten und Nierenzelllinien.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt wird eine Human-Wirtszelllinie bereitgestellt, die in einer Inhibitor-resistenten NS3-Mutant-Protease kodierenden Nucleinsäure transinfiziert ist. In einem noch bevorzugteren Aspekt wird die transinfizierte Human-Wirtszelllinie aus einer Leber- oder Nierenzelllinie ausgewählt. Beispiele von bevorzugten Wirtszellen umfassen Human-Embryo-Nierenzellen der 293-Linie (ATCC CRL 1573), Human-Karzinomzellen, enthaltend jene der HeLa-Linie (ATCC CCL 2) und Neuroblastomazellen der Linien IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) und SK-N-SH (ATCC HTB 11), Huh-7-Zellen, WRL68-Zellen, HepG2-Zellen und Chang-Zellen.
Verfahren zur Bewertung der Protease-Aktivität
Es wird ein Verfahren zur Bewertung der NS3-Protease-Aktivität einer HCV-NS3-Mutant-Protease gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Das Verfahren umfasst die Schritte des Inkubierens von Wirtszellen, transinfiziert mit Nulceinsäure, die eine Inhibitor-resistente NS3-Protease kodiert, unter Bedingungen, die bewirken, dass die Protease exprimiert wird, und Messen der Replikation der Nucleinsäure, worin das Replikationsniveau proportional zur Aktivität der exprimierten Protease ist. Wie vom Fachmann im Stand der Technik geschätzt wird, kann das Replikationsniveau, genauso wie die Protease-Aktivität (direkt oder indirekt), unter Verwendung von Standardtests, die für diesen Zweck eingeführt sind, gemessen werden, wie die im Detail in den folgenden spezifischen Beispielen beschriebenen Tests.
Verfahren zur Bewertung der Protease-Aktivität umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Replikon-Tests, Surrogat-Zell-basierte Tests oder enzymatische Tests von gereinigter NS3-Protease in vitro.
Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Klassifizieren von Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation auf die Fähigkeit, die Aktivität von HCV-NS3-Mutant-Protease gemäß der vorliegenden Erfindung zu inhibieren, bereitgestellt.
In einer achten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Klassifizieren von Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation auf die Fähigkeit, die Aktivität von HCV-NS3-Mutant-Protease gemäß der vorliegenden Erfindung zu inhibieren, bereitgestellt.
In einem Aspekt umfasst das Verfahren der Identifizierung potentieller Inhibitorverbindungen der zweiten Generation von HCV-NS3-Protease das Inkubieren eines isolierten Inhibitor-resistenten NS3-Protease-Mutanten, wie oben definiert, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation, und Messen der Protease-Aktivität der Inhibitor-resistenten NS3-Protease in Gegenwart und Abwesenheit des Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation. Eine Abnahme der Aktivität in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation gibt an, dass die Verbindung die Inhibitor-resistente NS3-Protease inhibiert.
In einem weiteren Aspekt umfasst das Verfahren der Identifizierung potentieller Inhibitorverbindungen der zweiten Generation eine HCV-NS3-Protease, das Inkubieren von Wirtszellen, transinfiziert mit Nucleinsäure, die eine Inhibitor-resistente NS3-Protease in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation kodiert, unter Bedingungen, die deren Expression bewirken; Inkubieren von Wirtszellen, transinfiziert mit Nuclein säure, die eine Inhibitor-resistente NS3-Protease in Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation kodiert, unter Bedingungen, die deren Expression bewirken, und dann Messen der Replikation der Nucleinsäure, worin das Replikationsniveau der Nucleinsäure in jedem Fall proportional zur Protease-Aktivität ist. Eine Abnahme der Protease-Aktivität in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation gibt an, dass der Verbindungskandidat die Protease inhibiert.
Die Zell-basierten Tests und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden unter Bedingungen für Säugetier-Zellwuchs durchgeführt, die dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt sind, d. h. physiologischem pH-Wert, Salzkonzentrationen unter Verwendung von Puffer, wie PBS, Temperaturen zwischen 30 und 42°C, geeignete Zellkulturmedien, und Bereitstellen ausreichender Zeit für den Zellwuchs. Noch spezieller werden die transinfizierten Wirtszellen für eine ausreichende Zeit inkubiert, um die Expression der Inhibitor-resistenten NS3-Mutant-Protease zu ermöglichen, beispielsweise mit einer Inkubationszeit von mindestens 1 Stunde, aber bevorzugter mit einer Inkubationszeit von 10 Stunden bis etwa 24 Stunden.
Die Tests und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden unter Bedingungen zum Messen der NS3-Protease-Aktivität durchgeführt, die einem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt sind, d. h. physiologischem pH-Wert, Salzkonzentration unter Verwendung von Puffer, wie Tris, HEPES, Temperaturen zwischen 15 und 37°C (bevorzugt bei Raumtemperatur), geeigneten Inkubation- und Detektionstechniken.
Bevorzugte Aspekte von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den nachfolgenden spezifischen Beispielen beschrieben, die nicht als begrenzend verstanden werden sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Identifikation von HCV-NS3-Mutanten, resistent gegenüber makrocyclischem Peptid-HCV-Inhibitor
Das Verfahren von Lohmann et al. (1999, Science 285:110) wurde verwendet, um die Replikation von subgenomischer HCV-RNA in einem System zu imitieren, das von der Funktion von nicht-strukturellen HCV-Proteinen und Enzymen abhängt. Dieses HCV-RNA-Replikon-System umfasst zwei Cistrone: eines, das die nicht-strukturelle HCV-Region kodiert, und das zweite, das einen auswählbaren Neomycin-Resistenzmarker kodiert (d. h. ein Gen, das die Neomycinphosphotransferase kodiert). Wie der Fachmann im Stand der Technik schätzen wird, kann das zweite Cistron irgendeinen Marker, der für die Auswahlzwecke geeignet ist, kodieren. Die Zelllinien, die derartige bicistronische subgenomische HCV-RNA aufnimmt, wie die S22.3-Zelllinie, sind von Kukolj und Pause (siehe WO 02/052015 , deren Inhalt durch Bezugnahme hier einbezogen wird) beschrieben. Diese Zelllinien sind bei der Beurteilung der Wirksamkeit und Potenz von potentiellen anti-HCV-Therapeutika verwendbar, die ein oder mehrere der nicht-strukturellen HCV-Proteine inhibieren.
Das vorliegende Verfahren, durch das die HCV-RNA-Replikation in Zellkultur erreicht wurde, ist in 1 zusammengefasst. Wie gezeigt, wurden Huh-7-Zellen (8 × 10⁶ Zellen) mit der bicistronischen subgenomischen HCV-RNA unter Verwendung von Transinfektionsverfahren, die im Stand der Technik gut etabliert sind, transinfiziert. Transinfizierte Huh-7-Zellen wurden durch Wachsen lassen in neomycinhaltigem Medium (0,5 mg/ml Neomycin) selektiert. Speziell replizieren transinfizierte Zellen die RNA, die Neomycinphosphotransferase erzeugt, um hierdurch die Zellen gegenüber cytotoxischer Wirkung des Neomycin resistent zu machen. Mutierte HCV-Replikon, wie in der WO 02/052015 beschrieben, können ebenfalls gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, um die RNA-Replikation und Effizienz der Replikon-Erzeugung zu erhöhen.
Kurz gesagt, war die Selektion der S22.3-Zelllinien, die gegenüber den NS3-Protease-Inhibitoren resistent sind, wie folgt: S22.3-Zellen wurden trypsinisiert und im frischen Medium (DMEM, 10% fötales Kalbsserum) mit 1 mg/ml G418-Antibiotikum resuspendiert. 150.000 Zellen wurden in einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert. Am folgenden Tag (t = Tag 0) wurde frisches Medium, enthaltend den NS3-Protease-Inhibitor, mit einer vorbestimmten Konzentration und 1 mg/ml G418 zur Vertiefung zugegeben. Nachdem die Zellen am Tag 3 Konfluenz erreichten, wurden die S22.3-Zellen trypsinisiert und in eine 10 cm-Platte überführt. Das Medium (enthaltend Inhibitor und 1 mg/ml G418) wurde am Tag 6 und am Tag 10 gewechselt. Am Tag 11 war Zelltod offensichtlich, da der Hauptteil der Zellen die Resistenz gegenüber G418 verloren hatte. Am Tag 14 wurde frisches Medium gewechselt, welches nun eine vorbestimmte Konzentration von NS3-Protease-Inhibitor mit 0,5 mg/ml G418 enthielt. Das Medium mit Inhibitor und 0,5 mg/ml G418 wurde am Tag 17 und am Tag 20 nachgefüllt. Die Zellen, die am Tag 21 Kolonien bildeten, wurden zur Ausweitung in Platten mit 48 Vertiefungen aufgesammelt, und die Kolonien wurden durch Fixieren und Färbung der Zellen mit Kristallviolett gezählt. Resistente Zelllinien wurden aus 48-Vertiefung zur 24-Vertiefung zur 6-Vertiefung und darüber hinaus vermehrt. Die gesamtzellulare RNA, die ebenfalls die HCV-subgenomische Replikon-RNA enthielt, wurde aus 1.000.000 Zellen (oder mehr) durch Qiagen RNeasy^® Kassette und Protokoll isoliert. Die HCV-Sequenz wurde durch RT-PCR amplifiziert, und die NS3-Region mit NS3-spezifischen Primern sequenziert.
Speziell wurden Neomycin-resistente Zellkolonien dann einem bekannten NS3-Protease-Inhibitor, speziell einem makrocyclischen Peptid-Inhibitor, ausgesetzt:
Inhibitor A = Cyclopropa[e]pyrrolo-[1,2-a][1,4]diazacyclopentadecin-14a(5H)-carbonsäure, 6-[[(Cyclopentyloxy)carbonyl]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,16, 16a-tetradecahydro-2-[[7-methoxy-2-[2-[(1-methylethyl)amino]-4-thiazolyl]-4-chinolinyl]oxy]-5,16-dioxo-(2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS),
der in der WO 00/59929 als Verbindung #822 beschrieben ist, deren Inhalt hier durch Bezugnahme mit einbezogen wird. Die Kolonien wurden in Gegenwart von steigenden Konzentrationen dieses Inhibitors (EC₅₀ von 2 nM) im Bereich von 2 bis 2000 nM wachsen gelassen.
Die Kolonien, die in Gegenwart von geringen (6 × EC₅₀ oder 12 nM) und hohen (1000 × EC₅₀ oder 2000 nM) Konzentrationen von Inhibitor A entstanden, wurden vermehrt, und das Replikon wurde über der NS3-/4A-Region, unter Verwendung von Standard-Sequenztechniken RNA-sequenziert. Mutationen, detektiert in der NS3-Protease-Domäne, sowohl bei hohen als auch niedrigen Inhibitor-Konzentrationen, sind nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Aminosäuren werden mit dem 1-Buchstaben-Code bezeichnet, wobei die native HCV-NS3-Protease-Aminosäure in der Protease vor dieser Positionsnummer steht und die Mutant-Aminosäure hinter der Positionsnummer, z. B. gibt D168G an, dass die native Aspartamsäure an Position 168 in der Mutant-Protease durch Glycin ersetzt ist. Tabelle 1

schwacher Inhibitor [] (12 nM)		starker Inhibitor [] (2000 nM)
Nucl.-Änderung	AS.-Änderung	Nucl.-Änderung	AS.-Änderung
A503G	D168G	G466A–A503G	A156T D168A
A211G–G466A	I71V A156T	C467T	A156V
A257G–A503G	Q86R D168G	C467T	A156V
A503G	D168G	C467T	A156V
C467T	A156V	C467T	A156V
A503G	D168G	C265T–C467T	P89S A156V
G464A	R155Q	C265T–C467T	P89S A156V
A503T	D168V	A503T	D168V
A122G	Q41R	C467T	A156V
C467T	A156V	C266T–C467T	P89L A156V
A503G	D168G	C467T	A156V
G502R	D168N/D	C467T	A156V
G502A–A532T	D168N T178S	A503T	D168V
A239G–G331T	Q80R A111S	A503T	D168V
G502C	D168H	A503T	D168V
C467T	A156V	C467T	A156V
C467T	A156V	G466A	A156T
A257G–A503G	Q86R D168G	C467T	A156V
C315T	D168E	C467T	A156V
C467T	A156V	C467T	A156V
G526A	E176K

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vielzahl von Aminosäure-Mutationen in der Nähe der aktiven Stelle (siehe schwarze Aminosäuren in 3), insbesondere in Kolonien, isoliert bei geringer Inhibitor-Konzentration, auftraten. Die Mutationen, Alanin zu Valin oder Threonin an Position 156 (A156V/Y) und Aspartamsäure zu Valin/Alanin an Position 168 (D168V/A) wurden konsistent in Kolonien, die bei hoher Inhibitor-Konzentration isoliert wurden, beobachtet. Insbesondere wurde die Mutation A156V in 70% der bei hoher Inhibitor-Konzentration gezüchteten sequenzierten Kolonien detektiert, während die Mutation D168V in 20% der bei hoher Inhibitor-Konzentration wachsen gelassenen sequenzierten Kolonien detektiert wurde.
Beispiel 2 – Identifikation von HCV-NS3-Mutanten, resistent gegenüber NS3-Inhibitor B
Das in Beispiel 1 oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um NS3-Protease-Mutanten zu identifzieren, die beim Wachsen lassen in Gegenwart von NS3-Protease-Inhibitor auftraten:
Inhibitor B = Cyclopropancarbonsäure, N-[(Cyclopentyloxy)carbonyl]-3-methyl-L-valyl-(4R)-4-[[2-[2-acetylamino)-4-thiazolyl]-7-methoxy-4-chinolinyl]oxy]-L-prolyl-1-amino-2-ethenyl-(1R,2S)-, der einen EC₅₀ von 40 nM aufwies.

Kolonien, die in Gegenwart von geringer (3 × EC₅₀ oder 120 nM) und hoher (50 × EC₅₀ oder 2000 nM) Konzentration von Inhibitor auftraten, werden vermehrt, und die Replikon-RNA wurde über der NS3/4A-Region unter Verwendung von Standard-Sequenztechniken sequenziert. Die in der NS3-Protease-Domäne, sowohl bei hohen als auch niedrigen Inhibitor-Konzentrationen detektierten Mutationen wurden nachfolgend in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2

schwacher Inhibitor [] (120 nM)		starker Inhibitor [] (2000 nM)
Nucl.-Änderung	AS.-Änderung	Nucl.-Änderung	AS.-Änderung
C467G	A156G	C467T	A156V
G115A–C430T–A503T	A39T L144F D168V	C467T	A156V
A503G	D168G	C467T	A156V
C266T–G464A	P89L R155Q	C467T	A156V
C467T	A156V	A503T	D168V
G77A–A503G–A535G	R26K D168G M179V
C467T–G537A	A156V M1791
A122G–A503G	Q41R D168G
C366A	S122R
C265T–C366A	P89S S122R
A211G–G502A	I71V D168N
G502A	D168N
A503C	D168A
C266T–G464A	P89L R155Q

Wieder zeigen die Ergebnisse, dass eine Vielzahl von Aminosäure-Mutationen, die in der Nähe der Inhibitorbindungstasche, speziell in Kolonien, isoliert bei niedriger Inhibitor-Konzentration, auftraten, und die Einzelmutationen A156V/G und D168V/N/A/G wurden konsistent in Kolonien beobachtet, die bei niedriger und hoher Inhibitor-Konzentration isoliert wurden. Die Mutation A156V wurde in 80% der sequenzierten Kolonien, gezüchtet bei hoher Inhibitor-Konzentration, detektiert, während die Mutation D168V in 20% der sequenzierten Kolonien, gezüchtet bei hoher Inhibitor-Konzentration, detektiert wurden.
Beispiel 3 – Identifikation von HCV-NS3-Mutanten, resistent gegenüber einem weiteren NS3-Inhibitor
Das in Beispiel 1 oben beschriebene Verfahren wurde im Zusammenhang mit dem NS3-Protease-Inhibitor verwendet:
Inhibitor C = Cyclopropa[e]pyrrolo-[1,2-a][1,4]diazacyclopentadecin-14a(5H)-carbonsäure, 2-[[2-[2-(Acetylamino)-4-thiazolyl]-7-methoxy-4-chinolinyl]oxy]-6-[[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,16,16a-tetradecahydro-5,16-dioxo-(2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS)-, der ebenfalls als Verbindung #702 in der WO 00/59929 beschrieben ist (die durch Bezugnahme hier einbezogen wird), der einen EC₅₀ von 5 nM aufweist.

Die Kolonien, die in Gegenwart von geringer (6 × EC₅₀ oder 30 nM), dazwischen liegender (20 × EC₅₀, 100 nM) und hoher (100 × EC₅₀, 500 nM und 200 × EC₅₀, 1000 nM) Konzentration des Inhibitors entstanden, wurden vermehrt, und die Replikon-RNA wurde über der NS3/4A-Region unter Verwendung von Standard-Sequenztechniken sequenziert. Die in der NS3-Protease-Domäne bei verschiedenen Konzentrationen der detektierten Mutationen sind nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3

schwacher Inhibitor [] (30 nM)		Mittlerer [] (100 nM)		starker Inhibitor [] (500 nM)		starker Inhibitor [] (1000 nM)
Nucl.-Änderung	AS.-^Änderung	Nucl.-Änderung	AS.-Änderung	AS.-Änderung	AS.-Änderung	Nucl.-Änderung	AS.-Änderung
G466A	A156T	G466A	A156T	A84G	Q28R	A503T/C	D168V
				A504T	D168V
C449T	A150V	A504C	D168A	A84G	Q28R	A503T	D168V
C467T	A156V			A504T	D168V
G59A	S20N	A504T	D168V	C467T	A156V	G466A	A156T
C343T	P115S
C430T	L144F
A503G	D168G
G466A	A156T	G466A	Al56T	A504T	D168V	C467T	A156V
A239G	Q80R	G466A	A156T	A504T	D168V	A503T	D168V
		G472C	V158L	T536C	M179Y
G466A	A156T					C467T	A156V
C463T	R155W					G302A	S101N
						A503C	D168A
A239G	Q80R
A503T	D168V
C467T	A156V

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Vielzahl von Aminosäure-Mutationen in der Nähe der aktiven Stelle auftrat, und die Mutationen A156V/T und D168V/A/G wurden konsistent beobachtet.
Beispiel 4 – Identifikation von HCV-NS3-Mutanten, resistent gegenüber einem makrocyclischen Peptid-HCV-Inhibitor in einer weiteren Zelllinie, die eine bicistronische subgenomische HCV-RNA enthält
Die Zelllinie R3 wurde aus S22.3 abgeleitet und enthielt ein bicistronisches HCV-Replikon mit Mutationen, die Anpassungsfähigkeit verleihen, um in Huh7-Zellen repliziert zu werden ( WO 02/052015 , hier durch Bezugnahme einbezogen). Der in Beispiel 1 oben beschriebene Inhibitor A wurde verwendet, um die NS3-Protease-Mutanten in den R3-Zelllinien zu identifizieren.

Die Kolonien, die in Gegenwart von 7,5 nM und 700 nM von Inhibitor A entstanden, wurden vermehrt, und die Replikon-RNA wurde über der NS3/4A-Region unter Verwendung von Standard-Sequenztechniken sequenziert. Die in der NS3-Protease-Domäne bei beiden Konzentrationen detektierten Mutationen sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4

Inhibitor [7.5 nM]		Inhibitor [700 nM]
Nucl.-Änderung	AS.-Änderung	Nucl.-Änderung	AS.-Änderung
A503G	D168G	A503T	D168V
A503T	D168V	G466A	A156T
A503C	D168A	A503C/T	D168A,V
G464A	R155Q
G502A, G464A	D168N, R155Q
C467T	A156V

Die Ergebnisse zeigen, dass eine ausgewählte Anzahl von Aminosäure-Mutationen in der Nähe der aktiven Stelle auftrat. Die einzelnen Mutationen, Aspartamsäure zu entweder Valin (D168V) oder Alanin (D168A) oder Glycin (D168G), wurden häufiger bei der niedrigen Konzentration des Inhibitors beobachtet, während D168V häufiger bei hoher Konzentration des Inhibitors beobachtet wurde.
Beispiel 5 – Bestimmung von Inhibitor-EC₅₀ unter Verwendung von NS3-Mutant-Replikon-Zelllinien
Spezifische isogene subgenomischer HCV-Replikon-cDNAs, die einzeln nur eine der Inhibitor-resistenten Mutationen enthielten (d. h. in diesem Beispiel: A156T oder A156V oder D168V oder D168G) wurden kloniert und entsprechende in vitro-transkribierte RNA dieser modifizierten bicistronischen Replikon wurde erzeugt. Die Mutant-kodierenden RNAs wurden verwendet, um Mutant-enthaltende Replikon-Zelllinien in nativen Huh-7-Zellen, wie zuvor für andere HCV-Replikon beschrieben, zu erzeugen. Jede dieser individuellen Replikon-Zelllinien wurde dann verwendet, um die Abnahme der Inhibierung, die durch den NS3-Protease-Inhibitor A bei den NS3-Mutanten gezeigt wurde, zu bestätigen. Diese wurden ebenfalls verwendet, um das Inhibierungsniveau der Inhibitor-resistenten Mutant-Zelllinien in Gegenwart eines nicht verwandten HCV-NS5B-Polymerase-Inhibitors oder eines α-Interferons zu bestimmen. Unter Verwendung des Tests, beschrieben in der WO 03/010141 (Beispiel 48), wurde der EC₅₀ jedes Inhibitors unter Verwendung der Mutant-Zelllinien bestimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche werden nachfolgend in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5

Inhibitor

WT A156T A156V D168V D168G

A 0,0009 0,547 0,324 0,735 0,023

Polymerase inhibitor 1,39 1,34 1,19 1,38 1,13

IFN-α 0,23 0,21 0,23 0,20 0,18
Es ist festzuhalten, dass jeder dieser vier Mutanten nur die Potenz des diesbezüglichen NS3-Protease-Inhibitors verschob und keine Wirkung auf den EC₅₀ eines nicht verwandten HCV-NS5B-Polymeraseinhibitors oder eines Interferon-α hatte. Die D168V- und A156T-Mutanten sind für diese Klasse von NS3-Protease-Inhibitoren am schädlichsten, indem sie die EC₅₀-Potenz der Zellkultur um das bis zu 700-fache verschieben.
Beispiel 6 – In-vitro-Enzymtests und Bestimmung von K_i
DNA, die die NS3-NS4A-Kodierungsregion des HCV-Genotyps 1b kodiert, die eine 28-Rest-N-endständige Sequenz enthält, enthaltend ein Hexahistidin-Tag und eine TEV-Protease-Spaltungsstelle (Pause, A. et a). (2003), J. Biol. Chem. 278: 20374–20380) wurde durch PCR amplifiziert und dann in den bakteriellen pET11a-Expressionsvektor subkloniert. Die Aminosäure-Substitutionen A156T und D168V wurden in die NS3-NS4A-kodierende Region unter Verwendung von Stellen-gerichteten Standard-Mutagenese-Prozeduren eingeführt.
Alternativ wurde die NS3-Protease(1-180)-kodierende Region des Wild-Typs mit der Sequenz ASKKKK am C-Ende in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert, und die Aminosäure-Substitutionen A156T, D168V und R155Q wurden wie oben beschrieben eingeführt.
Die NS3-Protease-Domäne (die A156T- oder D168V- oder R155Q-Mutationen enthält) wurde in E. coli exprimiert und wie zuvor beschrieben gereinigt (LaPlante, S. R. et al. (1999), J. Biol. Chem., 274: 18618–18624). Die NS3-NS4A-Proteine mit entweder A156T- oder D168V-Mutation wurden ebenfalls in E. coli exprimiert, und die Zellpaste wurde in 5 ml Lysispuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 20% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,5 M NaCl) pro Gramm Zellen resuspendiert, mit DNase I behandelt, dann durch eine 30-minütige Zentrifugation bei 150.000xg aufgeklärt; der Überstand wurde 2-fach in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, verdünnt, und 0,5 M NaCl und Imidazol wurden zu einer Endkonzentration von 25 mM zugegeben. Die NS3-NS4A-Komplexlösung wurde durch aufeinander folgende Schritte auf einer Hi-Trap-Ni⁺²-Chelatsäule und Poly(U)-Sepharose-Affinitätssäule, zuvor equilibriert in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 10% Glycerin, 0,2 M NaCl, 0,05% n-Dodecyl-β-D-maltosid, 10 mM β-Mercaptoethanol, gereinigt. Das Enzym wurde im selben Puffer, enthaltend 2 M NaCl, eluiert. Die isolierten Enzyme wurden bei –80°C gelagert.
K_i-Bestimmung – Die Inhibierungskonstante (K_i) wurde unter Verwendung des depsipeptidfluorogenischen Substrats Anthranilyl-DDIVPAbu[C(O)-O]AMY(3-NO₂)TW-OH bestimmt. Die Spaltungsreaktion wurde kontinuierlich bei 23°C auf einem BMG POLARstar^® Galaxy-Fluorometer, ausgestattet mit Anregungs- und Emissionsfiltern von 320 bzw. 405 nm, überwacht. Die NS3-Protease vom Wild-Typ und der Mutant (5–20 nM) wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30% Glycerin, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP, in Gegenwart eines 1000-fach molaren Überschusses des NS4A_Peptids getestet. Eine 15-minütige Vorinkubation wurde durchgeführt, um die Bildung des NS3-Protease-NS4A_Peptid-Komplexes zu ermöglichen. Die NS3-NS4A-Proteine (5–20 nM) wurden in 50 mM Tris-Hcl, pH 8,0, 0,25 M Natriumcitrat, 0,01% n-Dodecyl-β-D-maltosid, 1 mM TCEP, getestet. Die anfängliche Geschwindigkeit der inhibierten Reaktion wurde bei mehreren Inhibitor-Konzentrationen (entsprechend einem 25–75%igen Inhibierungsbereich) bestimmt, während die Substratkonzentration (typischerweise von 0,1 bis 5,0 K_m) variiert wurde, unter Annahme der Michaelis-Menten-Kinetika. Die Reaktion wurde durch Enzymaddition initiiert. Die K_i-Berechnungen wurden durch nicht-lineare Regressionsanalyse der anfänglichen Geschwindigkeitsdaten unter Verwendung der GraFit-Software (Version 3.0, Erithacus^® Software Ltd., Staines, UK) durchgeführt. Einige K_i-Werte wurden aus den IC₅₀ (50% effektive Konzentration), basierend auf der nachfolgenden Gleichung für kompetitive Inhibierung berechnet: IC₅₀ = 0,5 E_t + K_i (1 + S/K_m). Die IC₅₀ wurden aus nicht-linearer Kurvenanpassung unter Verwendung des Hill-Modells angewendet auf die Prozent-Inhibierungskonzentrationsdaten, erhalten und durch die Verwendung von SAS (Statistical Software System, SAS Institute Inc., Cary, N. C.) berechnet.
Die in den Tabellen 6 und 7 gezeigten Ergebnisse fassen die in vitro-Empfindlichkeit einiger NS3-Protease-Inhibitoren (wie beobachtete K_i-Werte) zur NS3-Protease WT gegen den Inhibitor-resistenten Mutanten in Form von entweder dem NS3/NS4A-Protein, vollständiger Länge (Tabellke 6), oder dem NS3-NS4A-Peptid-Komplex (Tabelle 7) zusammen. Es ist festzuhalten, dass die Verschiebung der K_i-Werte für Inhibitor A (d. h. der K_i, erhalten mit den Mutant-Enzymen, mit Bezug auf das Wild-Typ-Enzym), der Verschiebung bei EC₅₀ mit diesem Inhibitor im Zellkultur-Test ähnelt (Tabelle 5). Tabelle 6

Inhibitor Ki (nM)

WT A156T D168V

E 1600 n. d. 8100

F 0,047 29 12

A 1,6 870* 520*

*aus IC₅₀ berechneter K_i

Verbindung E hat die nachfolgende Struktur:
Verbindung F hat die nachfolgende Struktur:
Tabelle 7

Inhibitor K_i (nM)

WT A156T D168V R155Q

A 5,6 800* 970* 220*

*aus IC₅₀ berechneter K_i

Schlussfolgerung
Ein Verfahren zur Auswahl von subgenomischen HCV-RNAs, die in Gegenwart verschiedener Inhibitoren von HCV-NS3-Protease replizieren, wird in den vorangehenden Beispielen beschrieben. Dieses Verfahren zur Isolierung von HCV-Replikons, die gegenüber NS3-Protease-Inhibitoren resistent sind, erlaubt die Identifizierung und Vorhersage von Nucleotid- und Aminosäure-Substitutionen, die einen Wachstumsvorteil für das HCV-Virus in Gegenwart dieser Inhibitoren, verwandter Inhibitoren, und in der Tat irgendwelcher anderer bekannter oder zukünftiger HCV-Inhibitoren, speziell NS3-Protease-Inhibitoren, verleihen können, die das Enzym durch denselben Mechanismus oder Bindung an dieselbe Region/Tasche inhibieren.
Das a priori-Wissen von Mutationen, welches HCV resistent gegenüber NS3-Protease-Inhibitoren macht, liefert die Basis zur Identifizierung von Inhibitoren, die gegenüber derartigen resistenten Stämmen wirksam sind, bei spielsweise unter Verwendung von in vitro-Tests mit hohem Durchsatz, die Aktivitäten des resistenten HCV-Enzyms oder Proteins rekonstituieren. Die HCV-NS3-Mutant-Proteasen (die irgendeine der oben beschriebenen Mutationen aufweisen), die die Aktivität beibehalten, aber nicht durch Inhibitoren der "ersten Generation" inhibiert werden, sind wertvolle Werkzeuge bei der Identifizierung von Inhibitoren der zweiten Generation, die in Multi-Arzneimittel-Kombinationstherapien für die Behandlung von HCV-Infektion erforderlich sein können.
Literatur

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Gale Jr. et al., 1997, Virology 230, 217
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Sambrook et al., 2000, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 3. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press
Trozzi et al., 2003, J. Virol. 77, 3669–3679 (entspricht Migliaccio et al., 2002, Selection and Characterization of HCV Replicon Mutants; Resistant to Antiviral Agents, Abst. 9^th International Meeting of HCV and Related Viruses, 7.–11. Juli, La Jolla, Kalifornien)

SEQUENZLISTING

Claims

HCV-NS3-Protease, umfassend eine Aminosäuresequenz wie beschrieben gemäß der SEQ.-ID Nr. 2, worin die Aminosäuresequenz der natürlichen HCV-NS3-Protease an mindestens einer der Positionen 155 oder 156 mutiert ist, wobei die Aminosäureposition 155 mit Glutamin oder Tryptophan substituiert ist, oder worin die Aminosäure an der Position 156 mit Glycin, Threonin oder Valin substituiert ist.
HCV-Protease nach Anspruch 1, worin die Aminosäure an Position 156 Valin darstellt.
HCV-NS3-Protease nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz die SEQ.-ID Nr. 2 umfasst, und weiterhin eine oder mehrere Mutationen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: R155Q; R155W; A156G; A156T; und A156V.
Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach den Ansprüchen 1 bis 3, weiterhin umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Q8OR und S122R.
Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach den Ansprüchen 1 bis 4, weiterhin umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R; I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S; P115S; L144F; A150V; V158L; E176K; und T178S; M179I; M179V und M179T.
Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease, die mindestens zu 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der SEQ.-ID Nr. 2; wobei die inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease eine oder mehrere Mutationen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: R155Q; R155W; A156G; A156T; und A156V.
Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach Anspruch 6, weiterhin umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Q8OR und S122R.
Inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach Anspruch 6 oder 7, weiterhin umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R; I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S; P115S; L144F; A150V; V158L; E176K; und T178S; M179I; M179V und M179T.
Rekombinante Nukleinsäure, die eine inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Vektor, der eine inhibitor-resistente HCV-NS3-Protease nach den Ansprüchen 1 bis 8 kodiert, verbunden mit einer Nukleinsäure, die einen auswählbaren Marker kodiert.
Wirtszelle, transfiziert mit dem Vektor, wie definiert in Anspruch 10.
Verfahren zur Bewertung der HCV-NS3-Protease-Aktivität der inhibitor-resistenten NS3-Protease, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: • Inkubieren von Wirtszellen, wie definiert in Anspruch 11, unter Bedingungen, die die Expression der Protease bewirken; und • Messen des Expressionsniveaus des auswählbaren Markers; wobei das Niveau des auswählbaren Markers proportional zur Aktivität der exprimierten Protease ist.
Verfahren zur Identifizierung eines potentiellen Inhibitors der HCV-NS3-Protease-Aktivität der zweiten Generation, umfassend: • Inkubieren von Wirtszellen, wie definiert in Anspruch 11, unter Bedingungen, die die Expression der inhibitor-resistenten Protease bewirken, in Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; • Inkubieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression der inhibitor-resistenten Protease bewirken, in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; und • Messen des Expressionsniveaus des auswählbaren Markers in Gegenwart und Abwesenheit des Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; wobei das Niveau des auswählbaren Markers proportional zur Aktivität der exprimierten Protease ist, und wobei eine Abnahme der Aktivität der Protease in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten anzeigt, dass die Verbindung die Protease inhibiert.
Verfahren zur Identifizierung eines potentiellen Inhibitors der HCV-NS3-Protease-Aktivität der zweiten Generation, umfassend: • Inkubieren eines inhibitor-resistenten NS3-Protease-Mutanten, wie definiert in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; und • Messen der Protease-Aktivität der inhibitor-resistenten NS3-Protease in Gegenwart und Abwesenheit des Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation; wobei eine Abnahme der Aktivität der Protease in Gegenwart eines Inhibitorverbindungskandidaten der zweiten Generation anzeigt, dass die Verbindung die inhibitor-resistente NS3-Protease inhibiert.