DE60127299T2

DE60127299T2 - Gereinigte aktive hcv ns2/3 protease

Info

Publication number: DE60127299T2
Application number: DE60127299T
Authority: DE
Inventors: Diane Laval THIBEAULT; Daniel Laval LAMARRE; Roger Laval MAURICE; Louise Laval PILOTE; Arnim Laval PAUSE
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2000-12-15
Filing date: 2001-12-13
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2021-12-14
Also published as: NZ526863A; WO2002048375A3; JP2004514459A; EP1343897A2; HUP0302558A3; WO2002048375A2; EP1343897B1; ES2282320T3; HUP0302558A2; US20040077066A1; US20020192640A1; US20070160629A1; US20070172936A1; CA2430661C; IL155760A0; US7264811B2; AU2468802A; US6815159B2; JP3878132B2; CA2430661A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Reinigungs- und Aktivierungsverfahren für Hepatitis C-Virus (HCV)-NS2/3-Protease und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease oder von verkürzten Formen davon, die später für eine Autospaltung aktiviert werden können. Insbesondere stellt die Erfindung eine verkürzte, gereinigte, aktive HCV-NS2/3-Protease und Tests zum Identifizieren von Inhibitoren dafür bereit.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) stellt eine wichtige Ursache für eine chronische Lebererkrankung dar, die beim Menschen zu Zirrhose und Leberkrankheiten im Endstadium führt. Weltweit sind dauerhaft mehr als 150 Millionen Personen mit HCV infiziert. Die Anzahl an Todesfällen, die einer chronischen Infektion zuzuschreiben sind, wird vermutlich in den nächsten 10 bis 20 Jahren drastisch zunehmen. Derzeit verfügbare Therapien sind von begrenzter Wirksamkeit und unbefriedigend. Diese Therapien beinhalten die Verwendung von Interteron-alpha, entweder allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln, wie Ribavirin. Aufgrund der Tatsache, dass nur geringe Reaktionsraten beobachtet werden und in hohem Maße Rückfälle und Nebenwirkungen auftreten, werden neue Therapien benötigt, die eine erfolgreiche Therapie mit Langzeitwirkung ermöglichen.
Die klonierten und charakterisierten, partiellen vollständigen Sequenzen des HCV-Genoms wurden analysiert, um entsprechende Ziele für eine prospektive antivirale Therapie bereitzustellen. HCV ist ein mit einer Hülle versehenes Virus mit positiv geladenem RNA-Strang der Familie Flaviviridae. Das einzelsträngige HCV-RNA-Genom weist eine Länge von etwa 9 600 Nucleotiden auf und besitzt einen einzigen offenen Leseraster (ORF), der für ein einziges großes Polyprotein mit etwa 3 010 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zelluläre und virale Proteasen gespalten, wodurch strukturelle und nicht-strukturelle (NS) Proteine entstehen. Im Fall von HCV wird die Erzeugung von reifen, nicht-strukturellen Proteinen (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B) durch zwei virale Proteasen erreicht. Die erste, bisher nur schlecht charakterisierte Protease spaltet an der NS2/3-Verbindungsstelle und wird daher als NS2/3-Protease bezeichnet. Bei der zweiten Protease handelt es sich um eine Serin-protease, die in der N-terminalen Region von NS3 enthalten ist. Sie wird nachstehend als NS3-Protease bezeichnet und vermittelt sämtliche anschließenden Spaltungen strangabwärts von NS3, sowohl in cis-Position an der NS3/4A-Spaltungsstelle als auch in trans-Position für die restlichen NS4A/4B-, NS4B/5A- und NS5A/5B-Stellen. Das NS4A-Protein scheint mehrere Funktionen zu erfüllen, indem es als Cofaktor für die NS3-Protease wirkt und möglicherweise die Membranlokalisierung von NS3 und anderer viraler Replicase-Komponenten unterstützt. Die Komplexbildung des NS3-Proteins mit NS4A scheint für die Prozessierungsereignisse notwendig zu sein, indem es den proteolytischen Wirkungsgrad an sämtlichen Stellen verstärkt. Das NS3-Protein zeigt auch Nucleosid-triphosphatase- und RNAse-Helicase-Aktivitäten. NS5B ist eine von RNA abhängige RNA-Polymerase, die an der Replikation von HCV beteiligt ist.
Die meisten der HCV-kodierten Enzyme wurden als Ziele für die Entwicklung neuer antiviraler Therapien gewertet, nämlich die NS3-Protease-, Helicase- und ATPase-Aktivitäten sowie die von NS5B-RNA abhängige RNA-Polymerase-Aktivität (B. W. Dymock et al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy, Bd. 11 (2) (2000), S. 79-96, und M. A. Walker, Drug Discovery Today, Bd. 4 (11) (1999), S. 518-529). Das einzige virale Enzym, das bisher nicht gründlich charakterisiert worden ist, ist die NS2/3-Protease, vermutlich aufgrund der Tatsache, dass sie cotranslational wirkt.
Die NS2/3-Protease ist für die Autospaltung an der NS2- und NS3-Verbindungsstelle zwischen den Aminosäuren Leu1026 und Ala1027 verantwortlich (Y. Hirowatari et al., Arch. Virol., Bd. 133 (1993), S. 349-356, und K. E. Reed et al., J. Virol., Bd. 69 (7) (1995), S. 4127-4136). Diese Spaltung scheint für die produktive in vivo-Replikation wesentlich zu sein, wie durch das Fehlen einer HCV-Infektion bei einem Schimpansen nach einer Inokulation mit einem Klon ohne NS2/3-Protease-Aktivität gezeigt worden ist (A. A. Kolykhalov et al., J. Virol., Bd. 74 (4) (2000), S. 2046-2051). Es hat ferner den Anschein, dass die Erzeugung eines funktionellen NS2 und einer authentischen N-terminalen NS3-Proteasesequenz in gewisser Weise mit der NSSA-Phosphorylierung verbunden sind (Q. Liu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 254 (1999), S. 572-577, und P. Neddermann et al., J. Virol., Bd. 73 (12) (1999), S. 9984-9991).
Die minimale Region des offenen HCV-Leserasters, der für die Autospaltungsaktivität erforderlich ist, soll sich irgendwo zwischen den Aminosäuren 898 und 907 für die N-terminale Grenze und Aminosäure 1206 für die C-terminate Grenze befinden (M. Hijikata et al., J. Virol., Bd. 67 (8) (1993), S. 4665-4675; A. Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587; E. Santolini et al., J. Virol., Bd. 69 (12) (1995), S. 7461-7471; und Q. Liu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 254 (1999), S. 572-577; Pallaoro et al., J. Virol., Bd. 75 (20) (2001), S. 9939-9946). Interessanterweise ist die NS2/3-Protease-Aktivität von der NS3-Protease-Aktivität unabhängig (A. Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587; M. Hijikata et al., J. Virol., Bd. 67 (8) (1993), S. 4665-4675), jedoch kann die NS3-Protease-Domäne nicht durch ein anderes, nicht-strukturelles Protein ersetzt werden (E. Santolini et al., J. Virol., Bd. 69 (12) (1995), S. 7461-7471). Mutagenesestudien haben gezeigt, dass die Reste His952 und Cys993 für diese cis-Spaltungsaktivität wesentlich sind (A. Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587; M. Hijikata et al., J. Virol., Bd. 67 (8) (1993), S. 4665-4675). A. E. Gorbalenya et al., Perspect. Drug Discovery Design, Bd. 6 (1996), S. 64-86) haben den Vorschlag gemacht, dass es sich bei der NS2/3-Protease um eine Cystein-protease handeln könnte. Jedoch führte die Beobachtung, dass die Aktivität durch Metallionen stimuliert und durch EDTA gehemmt wird, zu der Auffassung, dass es sich bei der NS2/3-Protease um eine Metalloprotease handelt (A. Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587; M. Hijikata et al., J. Virol., Bd. 67 (8) (1993), S. 4665-4675). Studien mit klassischen Protease-Inhibitoren in einem in vitro-Transkriptions- und Translationstest (L. Pieroni et al., J. Virol., Bd. 71 (9) (1997), S. 6373-6380) haben bisher noch keine definitive Klassifizierung ermöglicht.
Über eine Prozessierung an der NS2/3-Verbindungsstelle wurde berichtet (P. L. Darke et al., J. Biol. Chem., Bd. 274 (49) (1999), S. 34511-34514, und WO-01/16379; A. Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587; M. Hijikata et al., J. Virol., Bd. 67 (8) (1993), S. 4665-4675; L. Pieroni et al., J. Virol., Bd. 71 (9) (1997), S. 6373-6380, und E. Santolini et al., J. Virol., Bd. 69 (12) (1995), S. 7461-7471), und zwar nach Expression der NS2/3-Region in zellfreien Translationssystemen, in E. coli, in Insektenzellen, die mit Baculovirus-Rekombinanten infiziert sind, und/oder in Säugetierzellen (vorübergehende Transfektion oder Vaccinia-Virus T7-Hybridsystem). Jedoch wurde bis vor kurzem nicht über eine Prozessierung in einem isolierten rekombinanten Enzym berichtet (Pallaoro et al., J. Virol., Bd. 75 (20) (2001), S. 9939-9946; Thibeault et al., J. Biol. Chem., Bd. 276 (49), S. 46678-46684).
Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 10583-10587, und Komoda et al., Gene, Bd. 145 (1994), S. 221-226, haben beide die Expression von HCV-Polypeptiden, einschließlich der NS2/3-Protease, in E. coli beschrieben. Im Anschluss an die Expression wurde die Prozessierung durch SDS-PAGE- und Immunoblot-Analysen von Zelllysaten bestimmt. Komoda berichtete bei Verwendung von HCV-Polyproteinen, die mit Maltose bindendem Protein (MBP) an ihrem N-Terminus und mit Dihydrofolat-reduktase (DHFR) an ihrem C-Terminus fusioniert waren, ferner über die partielle Reinigung der DHFR- fusionierten Produkte aus Zelllysaten durch Affinitätschromatographie, und zwar nur für die Zwecke der N-terminalen Sequenzierung.
Somit werden die biochemische Charakterisierung der NS2/3-Protease sowie mechanistische und strukturelle Untersuchungen durch die mangelnde Verfügbarkeit einer reinen, rekombinanten Form des Enzyms behindert. Bevor irgendwelche potentiellen Inhibitoren von NS2/3-Protease in einem Screening-Format mit hohem Durchsatz identifiziert werden können, muss eine zuverlässige Quelle für gereinigte, aktive NS2/3-Protease zur Verfügung stehen.
WO-01/68818, veröffentlicht am 20. September 2001 (sowie Pallaoro et al., J. Virol., Bd. 75 (20) (2001), S. 9939-9946) beschrieben ein Verfahren für die Reinigung einer rekombinanten, aktiven NS2/3-Protease. Jedoch muss ihr Rückfaltungsverfahren bei 4 °C durchgeführt werden, um eine Autokatalyse zu vermeiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren (auch von Thibeault et al., J. Biol. Chem., Bd. 276 (49), S. 46678-46684 beschrieben) beschreibt ein Reinigungsverfahren, das in 2 Stufen abläuft, bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann und zunächst zu einer löslichen, inaktiven NS2/3-Protease (bei Raumtemperatur stabil) führt, die in einem vergrößerten Maßstab hergestellt und sicher ohne Autospaltung gelagert werden kann.
Es stellt daher einen Vorteil der Erfindung dar, ein Verfahren für die Reinigung einer rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease bereitzustellen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die lösliche, inaktive Protease weiter aktiviert werden kann, um eine lösliche, aktive NS2/3-Protease für Screening-Bemühungen im Großmaßstab zu erzeugen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass eine gereinigte, rekombinante, aktive NS2/3-Protease und verkürzte Produkte davon in einem solchen Maßstab bereitgestellt werden, dass kleine Moleküle und Liganden einem Screening als potentielle Inhibitoren unterworfen werden können.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung verringert die Schwierigkeiten und Nachteile des Stands der Technik, indem ein neues Verfahren zur Reinigung und Aktivierung von HCV-NS2/3-Protease bereitgestellt wird. Vorteilhafterweise bewirkt dieses Verfahren sowohl eine Solubilisierung der Protease als auch der Rückfaltung unter Bedingungen, die nicht die Autospaltung der Protease fördern. Außerdem hat das Verfahren den weiteren Vorteil, dass eine N-terminal verkürzte Form von NS2/3-Protease in hohen Konzentrationen in Einschlusskörpern erzeugt wird, wobei rekombinante Verfahren und eine anschließende Expression in E. coli angewandt werden. Diese Erzeugung in hohen Konzentrationen ermöglicht die Isolierung und Reinigung von großen Mengen der Protease.
Es handelt sich hier um den ersten Bericht über eine isolierte, inaktive NS2/3-Protease, die bei Raumtemperatur stabil ist, ohne dass es zur Autokatalyse kommt. Es handelt sich ferner um den ersten Bericht über eine gereinigte, rekombinante, aktive NS2/3-Protease, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden ist. Die Verfügbarkeit der gereinigten, rekombinanten NS2/3-Protease ermöglicht eine ausführliche biochemische Charakterisierung des Enzyms und die Entwicklung von in vitro-Tests zum Screening in Bezug auf neue Inhibitoren.
Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, inaktiven HCV-NS2/3-Protease bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolieren der Protease in Gegenwart eines chaotropen Mittels;
b) Rückfalten der isolierten Protease durch Kontaktieren mit einem Reduktionsmittel und Lauryldiethylaminoxid (LDAO) in Gegenwart einer reduzierten Konzentration des chaotropen Mittels oder eines polaren Additivs. Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer aktiven NS2/3-Protease bereitgestellt, das den folgenden Schritt umfasst:
c) Zugeben eines Aktivierungsmittels zu einem Medium mit einem Gehalt an einer in Stufe b) erhaltenen löslichen, inaktiven NS2/3-Protease unter Bildung eines Spaltungs/Aktivierungspuffers, um die Autospaltung der NS2/3-Protease zu induzieren. Ferner wird ein Verfahren zum Testen der Aktivität von NS2/3-Protease bereitgestellt, das folgende Schritte umfasst:
d) Inkubieren der NS2/3-Protease im Spaltungs/Aktivierungspuffer von Stufe c) für eine ausreichende Zeitspanne, so dass die NS2/3-Protease der Autospaltung unterliegt; und
e) Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Spaltungsprodukten oder Fragmenten davon als Anzeichen der Autospaltung. Ferner wird ein Test zum Screening eines als Kandidat in Frage kommenden Arzneistoffes oder Liganden bereitgestellt, der die Protease-Aktivität einer NS2/3-Protease hemmt, wobei der Test folgende Schritte umfasst:
d) Inkubieren einer Probe der NS2/3-Protease im Spaltungs/Aktivierungspuffer von Stufe c) für eine ausreichende Zeitspanne in Gegenwart oder Abwesenheit des als Kandidat in Frage kommenden Arzneistoffes oder Liganden;
e) Messen der Menge an Spaltungsprodukten oder Fragmenten davon; und
f) Vergleichen der Menge der Spaltungsprodukte oder der Fragmente davon in Gegenwart oder Abwesenheit des als Kandidat in Frage kommenden Arzneistoffes oder Liganden.

Erfindungsgemäß werden eine rückgefaltete, inaktive NS2/3-Protease, ein verkürztes Produkt davon oder eine funktionell äquivalente Variante davon bereitgestellt, die die minimale Aminosäuresequenz von den Resten 906 bis 1206 der NS2/3-Protease von voller Länge aufweist, wobei die Nummerierung der in
1B verwendeten Nummerierung entspricht.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine isolierte NS2/3-Protease umfasst, wobei die Protease aus NS2/3-Protease von voller Länge, einem verkürzten Produkt davon oder einer Sequenz gemäß SEQ ID. NO: 2, 4, 10, 11, 12, 13 und 14 ausgewählt ist, wobei diese Protease sich in einer Lösung befindet, die eine ausreichende Konzentration an LDAO enthält, um eine Autospaltung der Protease zu verhindern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, die eine bevorzugte Ausführungsform erläutern.
1A zeigt eine Nucleotidsequenz von NS2/3 von voller Länge (810-1206)st (SEQ ID NO: 1) von HCV 1b-Genotyp.
1B zeigt eine Aminosäuresequenz von NS2/3 von voller Länge (810-1206)st (SEQ ID NO: 2), die durch die Nucleotidsequenz von 1A kodiert wird.
2 zeigt eine N-terminale Verkürzungsstudie, bei der HCV-NS2/3-Protease von voller Länge und N-terminale Deletionsmutanten, die die Aminosäuren von 815-915 bis 1206 umfassten, im pET11d-Expressionsvektor kloniert wurden. NS2/3-Proteasekonstrukte wurden in vitro mit einem Kaninchen-Reticulocytenlysat translatiert. Translatierte [³⁵S]-markierte Produkte wurden durch SDS-PAGE (15%) abgetrennt und mit einem Phosphorlmager (A) sichtbar gemacht. Eine E. coli-Expression der NS2/3-Proteasekonstrukte ohne Induktion (Bahnen -) oder nach 2-stündiger Induktion bei 37 °C mit 1 mM IPTG (Bahnen +) wurde durch SDS-PAGE (15%) (B) und Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen anti-NS3-Antikörpers (C) bewertet. Die Bahnen wurden entsprechend der ersten Aminosäure der in jedem Transkript exprimierten NS2/3-Protease nummeriert. Die Positionen der Molekülmasse-Standards sind ebenso wie die Position der NS3-Protease angegeben.
3 stellt ein HCV-NS2/3-Proteasekonstrukt dar, das die Aminosäurereste 904-1206 zusammen mit N- und C-terminalen Lysinresten, einer N-terminalen Hexahistidin-Markierung und einer C-terminalen Streptavidin-Markierung ("st") umfasst.
4 zeigt ein Chromatogramm, das nach Rückfaltung von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K (SEQ ID NO: 4) an einer Superose 12-Gelfiltrationssäule erhalten wurde. Im Anschluss an die Zugabe von 5 mM TCEP und 5 mM ZnCl₂ zu den gereinigten Einschlusskörpern wurde das Enzym rückgefaltet und in 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 0,5 M Arginin-HCl, 1% LDAO, 5 mM TCEP eluiert. Die ausgezogene Linie (–) gibt die Absorption bei 280 nm wieder und die strichpunktierte Linie
zeigt die Aktivität der NS3-Protease-Domäne bei Überwachung von ausgewählten Fraktionen unter Verwendung des fluorogenen Substrats Anthranilyl-DDIVPAbu [C(O)-O]AMY(3-NO₂)TW-OH.
5 zeigt die Herstellung und Reinigung von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K aus Einschlusskörpern unter Überwachung mit 15% SDS-PAGE, gefärbt mit Coomassie-Blau (A), Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines anti-NS3-Kaninchen-Antiserums (B) und Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines anti-Hisg-Kaninchen-Antiserums (C). Bahn 1: roher E. coli-Zellextrakt; Bahnen 2-5: Einschlusskörper (IB)-Waschflüssigkeiten; Bahnen 6-10: Einschlusskörper, Reinigung an einer Ni²⁺-Chelatbildungssäule; Bahn 11: gereinigte Einschlusskörper; Bahn 12: Beladung einer Superose 12-Gelfiltrationssäule; Bahn 13: rückgefaltetes Enzym (vergl. die Beispiele bezüglich Einzelheiten). Das unprozessierte Enzym und die Spaltungsprodukte 4K-6H-NS2 (904-1026) und NS3 (1027-1206)st-4K sind angegeben.
6 zeigt den Einfluss von Glycerin und CHAPS auf die Autoprozessierungsaktivität des 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K unter Überwachung durch Immunoblot unter Verwendung eines anti-NS3-Kaninchen-Antiserums. Die Autospaltungsreaktion wurde durch Verdünnung des rückgefalteten Enzyms in 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 1 mM TCEP mit einem Gehalt an verschiedenen Mengen an Glycerin und CHAPS eingeleitet, wonach sich eine 18-stündige Inkubation bei 23 °C anschloss. Bahn 1: 30% Glycerin, kein CHAPS; Bahnen 2-5: kein Glycerin und 0,1, 0,25, 0,5 bzw. 1,0% CHAPS; Bahnen 6-9: 30% Glycerin und 0,1, 0,25, 0,5 bzw. 1,0% CHAPS. Das unprozessierte Enzym und das NS3 (1027-1206)st-4K-Produkt sind angegeben.
7 zeigt den zeitlichen Verlauf der 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K-cis-Spaltung bei Überwachung durch Immunoblot unter Verwendung von anti-NS3-Kaninchen-Antiserum (A) und anti-His₆-Kaninchen-Antiserum (B). Die Autospaltungsreaktion wurde durch Verdünnung des rückgefalteten Enzyms in 50 mM Hepes, pH-Wert 7,0, 50% Glycerin (Gew./Vol.), 1% n-β-D-Dodecylmaltosid, 1 mM TCEP und Inkubation für 0, 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden bei 23 °C eingeleitet. Das unprozessierte Enzym und die Produkte 4K-6H-NS2 (904-1026) und NS3 (1027-1206)st-4K sind angegeben.
8 zeigt einen Vergleich der NS2-NS3-Protease-Aktivität der gereinigten His952Ala ("H952A")-Mutante (SEQ ID NO: 16) von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K und des gereinigten Wildtyps durch Immunoblot-Analysen unter Verwendung eines anti-NS3-Antiserums (A) oder eines anti-His₆-Antiserums (B). Die Autospaltungsreaktion wurde in 50 mM Hepes, pH-Wert 7,0, 50% Glycerin Gew./Vol.), 1% n-β-D-Dodecylmaltosid, 1 mM TCEP für 0,2 und 24 Stunden bei 23 °C durchgeführt. Eine 24-stündige Inkubation wurde in Abwesenheit vom Detergens durchgeführt (Bahn 24*). Das unprozessierte Enzym und die Autospaltungsprodukte 4K-6H-NS2 (904-1026) und NS3 (1027-1206)st-4K sind angegeben.
9A zeigt eine Nucleotidsequenz von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K (SEQ ID NO: 3).
9B zeigt eine Aminosäuresequenz von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K (SEQ ID NO: 4), kodiert durch die Nucleotidsequenz von 9A.
10 zeigt das Format eines heterogenen, zeitlich aufgelösten Fluoreszenztests (TRF-Test).
11 zeigt das Format eines homogenen, zeitlich aufgelösten Fluoreszenztests (TRF-Test).
12 zeigt das Format eines Fluoreszenz-Polarisationstests.
13 zeigt das Format eines radiometrischen Tests.
14 ist eine schematische Darstellung eines alternativen TRF-Testformats unter Verwendung der erfindungsgemäßen, gereinigten NS2/3-Protease.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben sämtliche technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleichen Bedeutungen, die dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind. Im allgemeinen handelt es sich bei den Zellkulturverfahren, der Infektion, dem molekularbiologischen Verfahren und dergl. um im Stand der Technik übliche Verfahren. Derartige Techniken finden sich in Handbüchern, z. B. bei Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1989), und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1994).
Nucleotidsequenzen werden hier durch einen Einzelstrang in der Richtung 5' nach 3' von links nach rechts angegeben, wobei Einbuchstaben-Nucleotidsymbole, die im Stand der Technik üblich sind und den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 1726-1732) entsprechen, verwendet werden.
Die hier verwendeten Ausdrücke "NS2/3-Protease", "Protease" und "Enzym" werden in der gesamten Beschreibung in austauschbarer Weise verwendet und beziehen sich auf eine HCV-kodierte NS2/3-Protease.
Der hier verwendete Ausdruck "aktive NS2/3-Protease" bezeichnet eine NS2/3-Protease, die einen nachweisbaren Grad der Spaltungsaktivität zwischen den Resten 1026-1027 behält. Die Protease-Aktivität wird durch Überwachen der Konzentrationen an verbleibender, ungespaltener NS2/3-Protease, der Spaltungsprodukte, z. B. NS2-Protein oder NS3-Protease, oder eines Fragments davon, beispielsweise in enzymatischen Tests, ELISA-Tests oder durch Western-Blot-Analyse gemessen.
Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bezieht sich bei Bezugnahme auf NS2/3-Protease auf die NS2/3-Protease, die in Bezug auf zelluläre Komponenten angereichert ist. Insbesondere bedeutet dieser Ausdruck, dass die NS2/3-Protease um 50% oder mehr, verglichen mit verunreinigenden zellulären Komponenten, angereichert ist.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Reinigung" oder "gereinigt" bedeuten bei Bezugnahme auf NS2/3-Protease, dass die NS2/3-Protease im wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist. Vorzugsweise wird die NS2/3-Protease auf eine Reinheit von etwa 90% gereinigt. Insbesondere wird die NS2/3-Protease auf eine Reinheit von etwa 95% gereinigt. Ganz besonders wird die NS2/3-Protease auf eine Reinheit von etwa 98% gereinigt.
Der hier verwendete Ausdruck "inaktive NS2/3-Protease" beschreibt eine NS2/3-Protease, deren Spaltungsaktivität zwischen den Resten Leu1026 und Ala1027 erheblich verringert oder im wesentlichen beseitigt ist, und zwar bei Bestimmung durch SDS-PAGE.
Der hier verwendete Ausdruck "Nucleinsäuremolekül" umfasst DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA). Das Nucleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, wobei es sich aber vorzugsweise um doppelsträngige DNA handelt.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das zum Transport eines anderen Nucleinsäuremoleküls, mit dem es verknüpft ist, befähigt ist. Ein Typ eines Vektors ist ein "Plasmid", d. h. eine kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleife, in die zusätzliche DNA- Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt worden sind, befähigt (z. B. bakterielle Vektoren mit einer bakteriellen Replikationsursprungsstelle und episomale Säugetiervektoren). Weitere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle bei Einführung in die Wirtszelle integriert und somit zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Außerdem sind bestimmte Vektoren dazu befähigt, die Expression von Genen, mit denen sie funktionell verknüpft sind, zu dirigieren. Derartige Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die sich bei rekombinanten DNA-Techniken eignen, häufig in Form von Plasmiden vor. Erfindungsgemäß werden die Ausdrücke "Plasmid" und "Vektor" in austauschbarer Weise verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Jedoch sollen erfindungsgemäß auch andere Formen von Expressionsvektoren umfasst werden, z. B. virale Vektoren, die gleichwertige Funktionen erfüllen.
Der hier verwendete Ausdruck "Wirtszelle" bezieht sich auf eine Zelle, in die eine erfindungsgemäße Nucleinsäure, z. B. ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor, eingeführt worden ist. Die Ausdrücke "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier in austauschbarer Weise verwendet. Es ist darauf hinzuweisen, dass derartige Ausdrücke sich nicht nur auf die spezielle vorliegende Zelle, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft einer derartigen Zelle beziehen. Da bestimmte Modifikationen in den nachfolgenden Generationen aufgrund einer Mutation oder aufgrund von Umwelteinflüssen auftreten können, können derartige Nachkommen tatsächlich nicht-identisch mit der parentalen Zelle sein, fallen aber immer noch unter den Umfang des hier verwendeten Ausdrucks.
Die hier verwendeten Ausdrücke "rekombinant" oder "rekombinant hergestellt" bedeuten, dass eine Zelle ein Nucleinsäuremolekül repliziert oder exprimiert oder ein Peptid oder Protein exprimiert, das durch ein Nucleinsäuremolekül, dessen Ursprung für die Zelle exogen ist, kodiert wird. Insbesondere kann die rekombinante Zelle Gene exprimieren, die in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht auftreten.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell äquivalente Variante" bezieht sich bei Beschreibung der NS2/3-Protease auf eine Proteinsequenz, bei der eine oder mehrere Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren oder nicht-natürliche Aminosäuren ersetzt sind, die die Aktivität der NS2/3-Protease nicht erheblich beeinträchtigen. Zu derartigen Ersetzungen gehören konservative Aminosäuresubstitutionen und degenerierte Nucleinsäuresubstitutionen. Bei Bezugnahme auf eine Proteinsequenz weist die substituierende Aminosäure physikalisch-chemische Eigenschaften auf, die üblicherweise (jedoch nicht notwendigerweise) denen der substituierten Aminosäure ähnlich sind. Zu den ähnlichen physikochemischen Eigenschaften gehören Ähnlichkeiten in Bezug auf Ladung, Volumen, Hydrophobizität, Hydrophilizität und dergl. Zu einigen der gebräuchlichsten bekannten konservativen Aminosäuresubstitutionen gehören (ohne Beschränkung hierauf): Leu oder Val oder Ile; Gly oder Ala; Asp oder Glu; Asp oder Asn oder His; Glu oder Gln; Lys oder Arg; Phe oder Trp oder Tyr; Val oder Ala; Cys oder Ser; Thr oder Ser; und Met oder Leu.
Der hier verwendete Ausdruck "Hemmung" unter Bezugnahme auf die NS2/3-Protease bedeutet, dass die Fähigkeit der Protease zur Autospaltung verringert ist. Arzneistoffe oder Liganden, die NS2/3-Protease hemmen können (nachstehend als "potentielle Inhibitoren" bezeichnet), können sich zur Modulation einer HCV-Infektion in einer Population von Zellen eignen und können daher als Arzneimittel zur Behandlung einer Pathologie, die durch das Vorliegen von HCV in den Zellen charakterisiert ist, wertvoll sein.
Der hier verwendete Ausdruck "rückgefaltet" bezieht sich bei Verwendung unter Bezugnahme auf die NS2/3-Protease auf den Vorgang, durch den die ungefaltete oder falsch gefaltete NS2/3-Protease Konformationsänderungen (partiell oder vollständig) unterliegt, so dass sie eine Konformation annimmt, die ohne nachweisbare Autospaltungsaktivität bei Raumtemperatur löslich und stabil ist. Die rückgefaltete Protease benötigt zur Aktivierung die Zugabe eines Aktivierungsdetergens.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Autospaltung" oder "autogespaltet" beziehen sich bei Verwendung zur Beschreibung der NS2/3-Protease auf die Tatsache, dass die Spaltung an der NS2/3-Verbindungsstelle (Leu1026-Ala1027) intramolekular ohne ein exogenes Substrat erfolgt.
Der hier verwendete Ausdruck "Affinitätsmarkierung" bezieht sich auf eine Markierung, die durch einen komplementären Liganden spezifisch eingefangen wird. Zu Beispielen für Paare von Affinitätsmarker/Affinitätsligand gehören (ohne Beschränkung hierauf): Maltose-Bindungsprotein (MBP)/Maltose; Glutathion S-transferase (GST)/Glutathion; Histidin(His)/Metall; Streptavidin-Markierung/Streptavidin oder Neutravidin. Das als Affinitätsligand verwendete Metall kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen und Nickel (Wong et al., Separation and Purification Methods, Bd. 20 (1) (1991), S. 49-106). Die Affinitätsmarkierung kann sich am N- oder C-terminalen Ende des Proteins befinden, liegt aber vorzugsweise am N-Terminus des Proteins. Vorzugsweise handelt es sich beim gewählten Metall um Nickel. Der Affinitätsligand kann in Säulen bereitgestellt werden, um die Trennung durch Affinitätschromatographie zu erleichtern,
Bevorzugte Ausführungsformen
I. Verfahren zur Rückfaltung und Reinigung
Gemäß einem ersten Aspekt der ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, inaktiven HCV-NS2/3-Protease bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolieren der Protease aus Einschlusskörpern in Gegenwart einer hohen Konzentration eines chaotropen Mittels;
b) Rückfalten der isolierten Protease durch Kontaktieren der Protease mit einem Reduktionsmittel und LDAO in Gegenwart einer geringen Konzentration des chaotropen Mittels oder eines polaren Additivs.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform wird die aktive NS2/3-Protease unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren (vergl. die Beispiele) umfassen eine erfindungsgemäße Nucleinsäure in einer für die Expression des Proteins in einer Wirtszelle geeigneten Form, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, die auf der Basis der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt sind und die funktionell mit der Nucleinsäuresequenz, die für das zu exprimierende Protein kodiert, verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors bedeutet der Ausdruck "funktionell verknüpft", dass die Nucleotidsequenz von Interesse mit der oder den regulatorischen Sequenzen in solcher Weise verknüpft sind, dass die Expression der entsprechenden Aminosäuresequenz ermöglicht wird (z. B. in einem in vitro-Transkriptions-Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Ausdruck "regulatorische Sequenz" bezieht sich auf Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerelemente (z. B. Polyadenylierungssignale). Derartige regulatorische Sequenzen sind beispielsweise bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990), beschrieben. Regulatorische Sequenzen umfassen solche Sequenzen, die die konstitutive Expression einer Nucleotidsequenz in zahlreichen Typen von Wirtszellen dirigieren, und solche, die die Expression der Nucleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen dirigieren (z. B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen). Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Konstruktion des Expressionsvektors von Faktoren, wie Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, Grad der Expression des angestrebten Proteins und dergl., abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide zu erzeugen, die durch die hier beschriebenen Nucleinsäuren kodiert werden (z. B. NS2/3-Protease, verkürzte Produkte oder mutierte Formen von NS2/3-Protease).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können für die Expression von NS2/3-Protease in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen konstruiert werden. Beispielsweise kann NS2/3-Protease in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990), erörtert.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten wird häufig in E. coli mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nichtfusionsproteinen dirigieren. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren an ein hier kodiertes Protein an, üblicherweise an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Derartige Fusionsvektoren haben üblicherweise drei Aufgaben: 1) Verstärkung der Expression des rekombinanten Proteins; 2) Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) Unterstützung bei der Reinigung des rekombinanten Proteins durch seine Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung (z. B. Affinitätsmarkierung, wie eine Hexahistidin-Markierung). Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins in E. coli besteht in der Expression des Proteins in Wirtsbakterien mit einem beeinträchtigten Vermögen zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins (S. Gottesman, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990), S. 119-128). Eine weitere Strategie besteht in der Veränderung der Nucleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor einzuführenden Nucleinsäure, so dass die individuellen Codons für jede Aminosäure die vorzugsweise in E. coli verwendeten Codons sind (Wada et al., Nuc. Acids Res., Bd. 20 (1992), S. 2111-2118). Eine derartige Veränderung von erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen kann durch übliche DNA-Synthesetechniken vorgenommen werden.
Vektor-DNA kann in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Die hier verwendeten Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" beziehen sich auf eine Vielzahl von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken zur Einführung von fremden Nucleinsäuren (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen finden sich bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), sowie in anderen Laboratoriumshandbüchern.
Häufig werden während der Proteinexpression sogenannte Einschlusskörper (Inklusionskörper) gebildet. Die NS2/3-Protease kann aus der Wirtszelle z. B. durch Lysis der Wirtszelle und Gewinnen der rekombinanten NS2/3-Protease aus den Einschlusskörpern isoliert werden. Bei Einschlusskörpern handelt es sich um Aggregate von intakten Proteinen oder Polypeptiden in Konformationen, die nicht der nativen Konformation entsprechen (vergl. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons Inc. (1997)). Es gibt zahlreiche Beispiele für die Art und Weise der Extraktion von Proteinen aus Einschlusskörpern. Diese werden in Current Protocols in Protein Science erörtert. Die erfindungsgemäße Wirtszelle, z. B. eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle in Kultur, kann zur Erzeugung der erfindungsgemäßen NS2/3-Protease verwendet werden.
Die Erfindung umfasst ferner die Züchtung einer Wirtszelle in einem Kulturmedium. Die Wirtszelle enthält einen Expressionsvektor, der eine Kodierungsregion einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für NS2/3-Protease kodiert, woraus die Erzeugung einer ungefalteten oder falsch gefalteten, inaktiven, rekombinanten NS2/3-Protease in Einschlusskörpern resultiert. Die Wirtszellen werden mit einem Lysispuffer lysiert, um Wirtszelllysate zu erzeugen. Die Einschlusskörper in den Wirtszelllysaten werden daraus durch Zentrifugation bei geringer Drehzahl gewonnen. Vorzugsweise enthält der Lysispuffer etwa 0,1% Triton X-100. Die Einschlusskörper werden sodann selektiv unter Verwendung eines Extraktionspuffers extrahiert, der vorzugsweise etwa 2% Triton X-100 und 2 M Harnstoff enthält. Vorzugsweise enthalten sowohl der Lysispuffer als auch der Extraktionspuffer ein Reduktionsmittel, das aus der Gruppe DTT und TCEP ausgewählt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der ersten Ausführungsform werden die Einschlusskörper, die inaktive NS2/3-Protease enthalten, anschließend durch Zentrifugation bei niedriger Drehzahl isoliert, wonach sich die selektive Extraktion aus Pellets anschließt, die durch die Zentrifugation mit niedriger Drehzahl aus den vorstehend beschriebenen Wirtszelllysaten erhalten worden sind. Die isolierten Einschlusskörper werden mit einem chaotropen Mittel in einer ausreichenden Konzentration, um lösliche, inaktive NS2/3-Protease zu erzeugen, behandelt.
Vorzugsweise wird das chaotrope Mittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Guanidin, Guanidin-HCl und Harnstoff besteht. Insbesondere handelt es sich beim chaotropen Mittel um Guanidin-HCl. Vorzugsweise beträgt die ausreichende Konzentration 4 M bis 9 M. Insbesondere liegen Guanidin oder Guanidin-HCl in einer Konzentration von 4 bis 8 M und ganz besonders von 6 M vor. Vorzugsweise liegt Harnstoff in einer Konzentration von 6 bis 9 M und insbesondere von 8 M vor.
Alternativ kann rekombinante NS2/3-Protease auch als ein extrazelluläres Protein hergestellt werden, indem man eine heterologe Signalsequenz mit dem Aminoterminus der Protease so verknüpft, dass diese aus einer eukaryontischen Zelle sezerniert wird. In diesem Fall kann rekombinante NS2/3-Protease aus dem Kulturmedium, in dem die Zellen gezüchtet worden sind, gewonnen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der ersten Ausführungsform wird die NS2/3-Protease so konstruiert, dass sie eine Affinitätsmarkierung enthält, die so verwendet werden kann, dass die lösliche, inaktive NS2/3-Protease aus den Einschlusskörpern unter Anwendung von Affinitätschromatographie isoliert werden kann. Eine derartige Affinitätsmarkierung und entsprechende Liganden sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform wird LDAO bei seiner kritischen Mizellenkonzentration oder oberhalb davon verwendet. Vorzugsweise liegt das LDAO in einer Konzentration von 0,003% bis 1% vor. Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt wird LDAO in einer Konzentration von 0,03% bis 1% verwendet. Ohne Festlegung auf eine Theorie nehmen die Erfinder an, dass LDAO, das im Rückfaltungspuffer (Gelfiltrationspuffer) vorhanden ist, für die Rückfaltung erforderlich ist, jedoch nicht für die cis-Spaltung des Enzyms ausreicht.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform wird in Stufe b) das chaotrope Mittel oder das polare Additiv aus der Gruppe ausgewählt, die aus folgenden Bestandteilen besteht: Guanidin, Guanidin-hydrochlorid, Harnstoff und Arginin-hydrochlorid. Insbesondere werden Guanidin-hydrochlorid oder Arginin-HCl verwendet. Die Verwendung von Arginin-HCl wird ganz besonders bevorzugt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform wird in Stufe b) das chaotrope Mittel oder das polare Additiv vorzugsweise in einer Konzentration von 0,25 M bis 2 M verwendet. Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt wird es in einer Konzentration von 0,5 M bis 1 M und insbesondere in einer Endkonzentration von 0,5 M verwendet.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt wird das Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus TCEP und DTT besteht. Vorzugsweise liegt das Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 0 bis 100 mM und insbesondere von 1 mM bis 10 mM vor. Besonders bevorzugt ist, dass das Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 5 mM vorliegt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt dieser ersten Ausführungsform wird das vorstehend beschriebene Rückfaltungsverfahren durch Dialyse oder durch Gelfiltration durchgeführt, wodurch man eine gereinigte NS2/3-Protease erhält. Gemäß einem wichtigen Aspekt wird die lösliche, inaktive NS2/3-Protease unter Anwendung von Gelfiltration rückgefaltet. Der verwendete Elutionspuffer enthält LDAO, Arginin-HCl und das Reduktionsmittel und das lösliche, inaktive NS2/3 wird in Elutionspuffer für eine zur Rückfaltung der NS2/3-Protease ausreichende Zeitspanne gehalten. Das Sammeln der Hauptfraktionen ermöglicht die Gewinnung eines hochgradig gereinigten Enzyms.
II. Aktivierungsverfahren
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven NS2/3-Protease bereitgestellt, das den folgenden Schritt umfasst:

c) Zugeben der in Stufe b) erhaltenen löslichen, inaktiven NS2/3-Protease zu einem Medium, das ein Aktivierungsmittel enthält, um die Autospaltung der NS2/3-Protease zu induzieren.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der zweiten Ausführungsform wird das Aktivierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glycerin oder einem Detergens, wie CHAPS, Triton X-100, NP-40 und n-Dodecyl-β-D-maltosid, besteht.
Als eine Alternative dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven NS2/3-Protease bereitgestellt, das den folgenden Schritt umfasst:

c) Verdünnen der in Stufe b) erhaltenen rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease in einem Medium mit einem Gehalt an einem Aktivierungsdetergens, um die Autospaltung der NS2/3-Protease zu induzieren.

Vorzugsweise liegt das LDAO, das in der NS2/3-Protease verbleibt, nach der Verdünnung in einer Endkonzentration unter 0,25% vor. Insbesondere wird das LDAO auf eine Endkonzentration von 0,1% oder weniger verdünnt. Ganz besonders bevorzugt ist es, das LDAO auf eine Endkonzentration unter 0,05% zu verdünnen.
Vorzugsweise wird das Aktivierungsdetergens aus CHAPS, Triton X-100, NP-40 und n-Dodecyl-β-D-maltosid ausgewählt. Insbesondere handelt es sich beim Aktivierungsdetergens um CHAPS oder n-Dodecyl-β-D-maltosid.
Vorzugsweise liegt das Aktivierungsdetergens in einer Endkonzentration von etwa 0,1% bis etwa 3% vor. Insbesondere liegt das Aktivierungsdetergens in einer Endkonzentration von etwa 0,1% bis etwa 1% vor. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das Aktivierungsdetergens in einer Endkonzentration von 0,5% vorliegt.
Zusätzlich zum Aktivierungsdetergens kann auch Glycerin zugesetzt werden, um die Aktivierung der rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease zu unterstützen. Vorzugsweise kann das Glycerin in einer Endkonzentration von 0% bis 60% vorliegen. Insbesondere kann das Glycerin in einer Endkonzentration von 10% bis 50% vorliegen. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das Glycerin in einer Endkonzentration von 30% vorliegt.
Wichtig ist es gemäß einem bevorzugten Aspekt, dass das Reduktionsmittel im Puffer oder im Aktivierungs/Spaltungsmedium, das für die Aktivierung verwendet wird, immer noch vorhanden ist, wenngleich in einer Konzentration, die geringer als die für die Rückfaltungsstufe erforderliche Konzentration ist. Das Reduktionsmittel kann aus der Gruppe, die aus TCEP und DTT besteht, ausgewählt werden. Insbesondere handelt es sich beim Reduktionsmittel um TCEP.
Vorzugsweise liegt das Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 1 mM bis 100 mM vor. Insbesondere liegt das Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 1 mM bis 10 mM vor. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 1 mM vorliegt.
III. Verfahren zum Messen der NS2/3-Protease-Aktivität
Ferner wird ein Verfahren zum Messen der Autospaltungsaktivität von gereinigter NS2/3-Protease bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

c) Inkubieren der in Stufe b) erhaltenen rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease in einem Puffer mit einem Gehalt an einem Aktivierungsdetergens für eine ausreichende Zeitspanne, dass die NS2/3-Protease einer Autospaltung unterliegt; und
d) Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit von verbleibender, ungespaltener NS2/3-Protease, Spaltungsprodukten oder Fragmenten davon als Anzeichen für eine Autospaltung.

Vorzugsweise wird die rückgefaltete, inaktive NS2/3-Protease vor Durchführung des vorerwähnten Tests unter Anwendung von Gelfiltration rückgefaltet und gereinigt.
Vorzugsweise handelt es sich beim Aktivierungsdetergens um CHAPS, n-Dodecyl-β-D-maltosid, NP-40 und Triton X-100. Insbesondere handelt es sich beim Aktivierungsdetergens um n-Dodecyl-β-D-maltosid (DM) in einer Konzentration von 0,1% bis 3%. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass es sich beim Aktivierungsdetergens um n-Dodecyl-β-D-maltosid in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 1% handelt. Insbesondere ist es bevorzugt, dass DM in einer Endkonzentration von 0,5% vorliegt.
Ein weiteres Aktivierungsmittel, wie Glycerin, kann ebenfalls zugesetzt werden, um die Aktivierung der rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease zu unterstützen. Vorzugsweise kann das Glycerin in einer Endkonzentration von 0% bis 60% vorliegen. Insbesondere kann das Glycerin in einer Endkonzentration von 10% bis 50% vorliegen. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das Glycerin in einer Endkonzentration von 30% vorliegt.
Vorzugsweise wird die NS2/3-Protease im Spaltungspuffer mindestens 1 Stunde bei einer Temperatur von 15 bis 30 °C inkubiert. Insbesondere wird die NS2/3-Protease im Spaltungspuffer mindestens 1 Stunde bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C inkubiert. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die NS2/3-Protease im Spaltungspuffer mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur (etwa 23 °C) inkubiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der zweiten Ausführungsform wird die Spaltungsreaktion durch Denaturieren der NS2/3-Protease gestoppt. Insbesondere wird die NS2/3-Protease durch Wärmeeinwirkung denaturiert. Ganz besonders bevorzugt ist es, die NS2/3-Protease mit SDS zu denaturieren, um die Autospaltung zu stoppen.
Bei den Spaltungsprodukten handelt es sich vorzugsweise um NS2-Protein oder NS3-Protease. Die Menge an NS2-Protein oder NS3-Protease oder von Fragmenten davon kann unter Anwendung einer der zahlreichen Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, gemessen werden. Zu Beispielen für derartige Techniken gehören die enzymatische Aktivität, die Immunoblot-Färbung, die Chemilumineszenz, die Fluoreszenz oder die Coomassie-Färbung. Alternativ kann die Menge an restlicher, ungespaltener NS2/3-Protease ebenfalls als Indikator der Spaltung gemessen werden.
IV. Verfahren zum Screening von Inhibitoren
Ferner wird ein Test zum Screening von potentiellen Inhibitoren der Autospaltungsaktivität einer aktiven NS2/3-Protease beschrieben, der folgende Schritte umfasst:

c) Inkubieren einer Probe der in Stufe b) erhaltenen rückgefalteten, inaktiven NS2/3-Protease in einem Puffer, der ein Aktivierungsdetergens enthält, für eine ausreichende Zeitspanne in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Inhibitors;
d) Messen der Menge an Spaltungsprodukten oder Fragmenten davon und
e) Vergleichen der Menge der Spaltungsprodukte oder der Fragmente davon in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Inhibitors.

Die Probe der aktiven NS2/3-Protease wird vorzugsweise etwa 1 Stunde im geeigneten Medium mit dem als Kandidat in Frage kommenden Arzneistoff oder Liganden inkubiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt handelt es sich bei den Spaltungsprodukten entweder um NS2-Protein oder um NS3-Protease. Vorzugsweise wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von NS2-Protein oder NS3-Protease oder von Fragmenten davon unter Anwendung von enzymatischer Aktivität oder Immunoblot-Analyse analysiert, wobei ein anti-NS3-Protease-Antikörper oder ein anti-Histidin-Markierungs-Antikörper verwendet wird. Als eine Alternative kann auch die Menge an verbleibender ungespaltener NS2/3-Protease als ein Indikator der Spaltung gemessen werden.
V. NS2/3-Protease, Polypeptide und verkürzte Produkte/Nucleinsäuremoleküle
Vorzugsweise handelt es sich bei der NS2/3-Protease um die NS2/3-Protease 810-1206 von voller Länge oder um ein verkürztes Produkt davon. Insbesondere ist die NS2/3-Protease N-terminal verkürzt, wobei ihre erste Aminosäure einer der Aminosäuren 815 bis 906 entspricht. Insbesondere entspricht die erste Aminosäure des N-terminal verkürzten Proteins einer der Aminosäuren 866 bis 906. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die erste Aminosäure des N-terminal verkürzten Proteins einer der Aminosäuren 890 bis 904 entspricht. Insbesondere wird ein verkürztes NS2/3-Protein bereitgestellt, das die minimale Aminosäuresequenz von den Resten 904 bis 1206 der NS2/3-Protease von voller Länge aufweist. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das verkürzte NS2/3-Protein aus den Aminosäuren 904-1206 gemäß der Nummerierung von SEQ ID NO: 10 besteht.
Erfindungsgemäß wird ein aktives NS2/3-Polypeptid bereitgestellt, das aus einer verkürzten NS2/3-Protease besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Bestandteilen besteht: eine Sequenz gemäß der Definition von SEQ ID NO: 2, 4, 10, 11, 12, 13 und 14. Vorzugsweise weist die NS2/3-Protease eine Sequenz auf, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: eine Sequenz gemäß der Definition von SEQ ID NO: 4, 10, 11 und 12. Insbesondere weist die NS2/3-Protease eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder 10 auf oder es handelt sich um eine funktionell äquivalente Variante davon. Insbesondere weist die NS2/3-Protease die in SEQ ID NO: 4 oder 10 dargestellte Sequenz auf.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine rückgefaltete, inaktive NS2/3-Protease bereitgestellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Bestandteilen besteht: NS2/3-Protease von voller Länge, eine Sequenz gemäß der Definition von SEQ ID NO: 2, 4, 10, 11, 12, 13 und 14. Insbesondere wird eine rückgefaltete, inaktive NS2/3-Protease gemäß der Definition von SEQ ID NO: 4 oder 10 bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die über ihre Länge hinweg eine 90%ige Identität mit dem Polypeptid gemäß der Definition von SEQ ID NO: 2, 4, 10, 11, 12, 13 und 14 aufweist. Insbesondere wird ein Polypeptid bereitgestellt, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die über ihre Länge hinweg eine 90%ige Identität mit dem Polypeptid gemäß der Definition von SEQ ID NO: 4 oder 10 aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das für die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 bzw. 15 kodiert.
Nucleinsäurefragmente, die für funktionell äquivalente Varianten von NS2/3-Protease kodieren, lassen sich herstellen, indem man einen Bereich von Resten von SEQ ID NO: 1 isoliert, den kodierten Bereich 890-1206 von NS2/3-Protease exprimiert, z. B. durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle (gemäß den vorstehenden Ausführungen) und die Fähigkeit des Bereiches zur Autospaltung nach Reinigung und Rückfaltung bestimmt.
Erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle lassen sich unter Anwendung üblicher molekularbiologischer Techniken und der hier vermittelten Sequenzinformationen isolieren. Ein Nucleinsäuremolekül, das den Gesamtgehalt oder einen Teil der Reste, die für die Aminosäuren 890-1206 kodieren, umfasst, lässt sich durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung geeigneter Oligonucleotid-Primer isolieren. Beispielsweise kann mRNA aus Zellen isoliert werden (z. B. durch das Guanidinium-thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry, Bd. 18 (1979), S. 5294-5299) und cDNA lässt sich unter Verwendung von reverser Transkriptase herstellen (z. B. mit Moloney-MLV-reverser Transkriptase, erhältlich von der Fa. Gibco/BRL, Bethesda, Md; oder AMV-reverser Transkriptase, erhältlich von der Fa. Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Fla.). Synthetische Oligonucleotid-Primer für die PCR-Amplifikation lassen sich auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz konstruieren. Eine erfindungsgemäße Nucleinsäure lässt sich unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und unter Verwendung entsprechender Oligonucleotid-Primer gemäß üblichen PCR-Amplifikationstechniken amplifizieren. Die auf diese Weise amplifizierte Nucleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner lassen sich Oligonucleotide, die einer NS2/3-Protease-Nucleotidsequenz entsprechen, nach üblichen synthetischen Techniken herstellen, z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zusätzlich zu natürlich auftretenden Varianten der NS2/3-Proteasesequenz, die in einer viralen Population vorliegen können, Veränderungen durch eine Mutation in die Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuren 890 bis 1206 kodiert, eingeführt werden können, was zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins führt, die gegebenenfalls die funktionelle Aktivität der NS2/3-Protease verändern. Beispielsweise können Nucleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an "nicht-wesentlichen" Aminosäureresten führen, in. der Sequenz von SEQ ID NO: 1 vorgenommen werden. Bei einem "nicht-essentiellen" Aminosäurerest handelt es sich um einen Rest, der an der Sequenz von NS2/3-Protease von voller Länge (z. B. die Sequenz von SEQ ID NO: 2) abgeändert werden kann, ohne dass die funktionelle Aktivität der NS2/3-Protease verändert wird, während ein "essentieller" Aminosäurerest für die funktionelle Aktivität erforderlich ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die für NS2/3-Protease kodieren, die Änderungen in den Aminosäureresten, die für NS2/3-Protease-Aktivität essentiell sind, aufweist. Derartige NS2/3-Protease-Mutanten unterscheiden sich bezüglich der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 und haben ihre Protease-Aktivität verloren. Zu Beispielen für derartige mutante NS2/3-Proteasen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören NS2/3-Protease [904-1206]H952A (SEQ ID NO: 16), bei der His-952 durch Ala ersetzt ist, NS2/3-Protease [904-1206]ΔL1026A 1027 (SEQ ID NO: 17), die einer Deletion an den Resten der Spaltungsstelle zwischen den NS2- und NS3-Proteinen entspricht, und NS2/3-Protease [904-1206]C993A, bei der Cys993 durch Ala ersetzt ist (SEQ ID NO: 18).
Beispiele
Nachstehend wird die Erfindung anhand der folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert.
Materialien und Methoden
Abkürzungen:

Ala:: Alanin
°C: Grad Celsius
CHAPS:: 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat
CMC:: kritische mizellare Konzentration
DHFR:: Dihydrofolat-reductase
DNase:: Desoxyribonuclease
DTPA:: N,N-Bis-[2-(bis-[carboxymethyl]-amino)-ethyl]-glycin
DTT:: Dithiothreit
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
g:: Gramm
g:: relative Zentrifugalkraft
h:: Stunde
HCV:: Hepatitis C-Virus
Hepes:: 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
His:: Histidin
His₆:: Hexahistidin-Markierung
HMK:: Herzmuskel-kinase
IPTG:: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kDa:: Kilodalton
LDAO:: Lauryldiethylaminoxid
Leu:: Leucin
M:: molar
MBP:: Maltose bindendes Protein
min:: Minute
ml:: Milliliter
mM:: millimolar
Octyl-POE:: n-Octylpentaoxyethylen
PCR:: Polymerase-Kettenreaktion
SDS-PAGE:: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
st:: Streptavidin-Markierung gemäß Schmidt & Skerra, Prot. Engineering, Bd. 6 (1993), S. 109-122
TCEP:: Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid
Tris:: Tris-[hydroxymethyl]-aminomethan
μg:: Mikrogramm
μm:: Micron
WT:: Wildtyp
w/v:: Gewicht pro Volumen

Materialien
Die Detergentien CHAPS und Triton X-100 wurden von der Fa. Sigma erhalten, LDAO von der Fa. Calbiochem, n-Dodecyl-β-D-maltosid von der Fa.
Anatrace Inc., NP-40 von der Fa. Roche und Octyl-POE von der Fa. Bachem. Die Reduktionsmittel DTT und TCEP wurden von den Firmen Pharmacia Biotech bzw.
Pierce erhalten. Arginin-hydrochlorid, Glycerin, Hepes, Imidazol und Magnesiumchlorid wurden von der Fa. Sigma erhalten. Guanidin-hydrochlorid und Tris wurden von der Fa. Gibco BRL erhalten, während IPTG und Harnstoff von der Fa. Roche bezogen wurden. Natriumchlorid und Zinkchlorid wurden von der Fa. Fisher bzw. Aldrich bezogen. EDTA wurde von der Fa. Ambion bezogen und DNase von der Fa. Pharmacia Biotech. Restriktionsenzyme wurden von der Fa. Pharmacia Biotech. bezogen. E. coli XL-1 Blue-Zellen wurden von der Fa. Stratagene erhalten und BL21(DE3)pLysS-Zellen von der Fa. Novagen. FLAG^R wurde von der Fa. Eastman Kodak Company bezogen; es entspricht einer Peptidsequenz, die von einem anti-FLAG-Antikörper erkannt wird. HMK_tag ist ein Peptid mit 5 Resten (RRASV), bei dem es sich um eine Erkennungssequenz für die spezifische Protein-kinase HMK (Herzmuskel-kinase) handelt, so dass eine Phosphorylierungsstelle eingeführt wird (M. Blanar und W. Rutter, Science, Bd. 256 (1992), S. 1014-1018).
Beispiel 1
NS2/3-Konstrukt von voller Länge
Die (810-1206) NS2/3-Sequenz von voller Länge wurde durch PCR aus der HCV-1b-40-Sequenz (WO-99/07733, Boehringer-Ingelheim (Kanada), Ltd.) unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern amplifiziert, nämlich 5'-CCATGGACCGGGAGATGGCT-3' (SEQ ID NO: 5) für den N-Terminus und 5'-GGATCCTTAACCACCGAACTGCGGGTGACGCCAAGCGCTACTAGTCCGCAT GGTAGTTTCCAT-3' (SEQ ID NO: 6) für den C-Terminus. Dieses Verfahren führt eine Ncol-Stelle am 5'-Ende und eine Streptavidin-Markierung "st" (Schmidt & Skerra, Prot. Engineering, Bd. 6 (1993), S. 109-122), gefolgt von einer BamHI-Stelle am 3'-Ende ein, wodurch man ein Nucleinsäuremolekül mit SEQ ID NO: 1 erhält (1). Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pCRi^R3 unter Verwendung des TA-Klonierungskits^R der Fa. Invitrogen inseriert. Das Insert wurde sodann in einen bakteriellen Expressionsvektor pET-11d (Novagen) übertragen, indem es mit EcoRI geschnitten und anschließend einer Klenow-Behandlung zur Erzeugung stumpfer Enden und einem anschließenden partiellen Verdau mit Ncol unterzogen wurde. Dieses Konstrukt erhielt die Bezeichnung pET-11d-NS2/3st. Die DNA wurde in XL-1 Blue E. coli-Zellen transformiert, isoliert und sequenziert. Anschließend wurde die DNA in E. coli-BL21 (DE3)-pLysS für die Proteinerzeugung übertragen.
Beispiel 2
N-terminate NS2/3-Deletionsmutanten
Die N-terminalen Deletionsmutanten 815-1206, 827-1206, 855-1206, 866-1206, 904-1206 und 915-1206 wurden von der pET-11d/NS2/3-Matrize abgeleitet, die mit einer Ncol-Stelle am 5'-Ende und innerhalb der NS3-Domäne an der Aminosäure 1083 konstruiert worden war. Nach dem Matrizen-Verdau mit Ncol wurden das 3'-Endfragment und der Vektor einer Gelreinigung unterzogen. Die Mutanten wurden durch PCR unter Verwendung geeigneter synthetischer Oligonucleotid-Primer mit einem Gehalt an der NS2/3-Sequenz aus Nucleotiden, die für den angestrebten N-terminalen Rest bis zur Aminosäure 1083 kodieren, erhalten. Die Primer führten ferner eine Ncol-Stelle am 5'-Ende ein, so dass die erhaltenen Inserts mit dem gelgereinigten Fragment verknüpft werden konnten. Die DNA wurde sodann in E. coli-XL-Blöue-Zellen transformiert, isoliert und sequenziert. Schließlich wurde die DNA in E. coli-BL21(DE3)pLysS für die Proteinerzeugung übertragen. Die Expression wurde durch SDS-PAGE bestätigt (2A, 2B, 2C).
Beispiel 3
N-terminate verkürzte NS2/3-Mutante 4K-6H (904-1206)st-4K (SEQ ID NO: 4)
In diesem Konstrukt wurden vier Lysinreste an den N- und C-Termini sowie eine Hexahistidin-Markierung am N-Terminus addiert. Dieses Konstrukt wurde unter Anwendung von PCR und der pET-11d/NS2/3st-Matrize mit zwei Primern erhalten, die die Sequenz für die Markierungen sowie die NS2/3-Sequenz aus den Nucleotiden, die für die Aminosäurereste 904-1206 kodieren, enthalten. Die Primer führten auch eine Ndel und BamHI-Stelle am 5'- bzw. am 3'-Ende ein. Das Insert wurde in pET-11d kloniert und erhielt die Bezeichnung pET-11d-4K-6H-NS2/3 (904-1206)-st-4K (SEQ ID NO: 3). Die DNA wurde in E. coli-XL-1-Blue-Zellen transformiert, isoliert und sequenziert. Die DNA wurde sodann für die Proteinerzeugung in E. coli-BL21(DE3)pLysS übertragen.
Für das geschnittene Konstrukt 904-1206 wurden 4 Primer und 2 aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen angewandt. Bei der ersten PCR-Reaktion wurden die Primer
GCTCGAGCATCACCATCACCATCACACTAGTGCAGGCATAACCAAA (SEQ ID NO: 7) für den N-Terminus und
AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO: 8) für den C-Terminus verwendet. Für die zweite PCR-Reaktion wurden die Primer ACCTGCCATATGAAAAAGAAAAAGCTCGAGCATCACCATCACCAT (SEQ ID NO: 9) für den N-Terminus und
AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO: 7) für den C-Terminus verwendet.
Beispiel 4
Enzym-Expression und -Erzeugung
Die HCV-NS2/3-Protease Genotyp 1b [904-1206] (3) mit einer N-terminalen Hexahistidin-Markierung wurde in den pET-11d-Expressionsvektor kloniert. Vier Lysinreste wurden ferner sowohl an den N- als auch an den C-terminalen Enden addiert, um die Proteinlöslichkeit zu erhöhen; zusammen mit einer Streptavidin-Markierung am C-terminalen Ende ergab sich das Nucleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 3. Die Protease wurde in E. coli-BL21(DE3)pLysS nach Induktion mit 1 mM IPTG für 3 h bei 37 °C exprimiert. Eine typische 4 Liter-Fermentation ergab etwa 20 g feuchte Zellpaste. Die Zellpaste kann bei –80 °C aufbewahrt werden.
Beispiel 5
Einschlusskörper-Extraktion
Nach Auftauen bei 23 °C wurden die Zellen in Lysispuffer (5 ml/g), der aus 100 mM Tris, pH-Wert 8,0, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 20 mM MgCl₂, 5 mM DTT bestand, homogenisiert. Anschließend wurden eine DNase-Behandlung (20 μg/ml) 15 Minuten bei 4 °C und 1 h bei 4 °C und eine Zentrifugation mit 22 000 × g durchgeführt. Das Zellpellet wurde dann 2-mal durch Homogenisieren (5 ml/g) in 100 mM Tris, pH-Wert 8,0, 2% Triton X-100, 5 mM EDTA, 2 M Harnstoff, 5 mM DTT gewaschen und 30 min bei 4 °C mit 22 000 × g zentrifugiert. Schließlich wurden die Zellen in 100 mM Tris, pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT gewaschen. Die Einschlusskörper wurden im Pellet durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 °C mit 22 000 × g gewonnen.
Beispiel 6
a) Einschlusskörper-Extraktion
Zur Solubilisierung der Einschlusskörper wurde das Zellpellet im Extraktionspuffer (4 ml/g), der aus 100 mM Tris, pH-Wert 8,0, 6 M Guanidin-HCl, 0,5 M NaCl bestand, suspendiert und 1 h bei 23 °C in diesem Puffer belassen. Sodann wurde die Suspension 30 min bei 4 °C mit 125 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch ein 0,22 μm-Filter filtriert. Der geklärte Einschlusskörper-Extrakt kann bei –80 °C aufbewahrt werden, bis er benötigt wird.
b) 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K-Isolierung aus Einschlusskörpern
Zur Isolierung des 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K (SEQ ID NO: 4) wurde der Einschlusskörper-Extrakt 2-fach (auf etwa 1 mg/ml) in 100 mM Tris, pH-Wert 8.0, 6 M Guanidin-HCl, 0,5 M NaCl verdünnt und auf eine Pharmacia Hi-Trap Ni²⁺-Chelatbildungssäule aufgetragen. Das isolierte Protein wurde typischerweise mit 250 mM Imidazol mit einem linearen 50 bis 500 mM Imidazol-Gradienten eluiert.
Die Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprachen, wurden vereinigt.
Beispiel 7
Rückfaltung und Reinigung an einer Gelfiltrationssäule
Das Präparat der isolierten Einschlusskörper wurde mit 5 mM TCEP und 5 mM ZnCl₂ versetzt. Nach 15-minütiger Inkubation bei 23 °C wurde die Probe auf eine Pharmacia Superose 12-Gelfiltrationssäule aufgesetzt. Das 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K wurde sodann in Tris, 50 mM, pH-Wert 8,0, 0,5 M Arginin-HCl, 1% LDAO, 5 mM TCEP eluiert, wodurch man eine rückgefaltete NS2/3-Protease erhielt. Nur die Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprachen (4), wurden gewonnen und vereinigt. Unter diesen Bedingungen war keine Autospaltung nachweisbar. Das gereinigte, rückgefaltete, inaktive Enzym wurde in Elutionspuffer bei –80 °C aufbewahrt. Typischerweise wurden etwa 7 mg rückgefaltete NS2/3-Protease pro Liter E. coli-Kultur erhalten.
Um das Problem der NS2/3-Protease-Autospaltung zu überwinden, wurden die Rückfaltungsbedingungen zunächst unter Verwendung entweder der His952Ala-Mutante (SEQ ID NO: 16) oder der ΔLeu1026-Ala1027-Mutante (SEQ ID NO: 17) von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K festgelegt. Diese beiden Mutanten sind frei von autokatalytischer Aktivität. Die Rückfaltung wurde indirekt auf der Grundlage der Aktivität der NS3-Protease bestimmt (4), indem man serielle Verdünnungen des rückgefalteten Enzyms mit 5 μM des intern gequenchten fluorogenen Substrats Anthranilyl-DDIVPAbu [C(O)-O]AMY(3-NO2)TW-OH (SEQ ID NO: 19) in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 30% Glycerin, 1 mg/ml BSA und 1 mM TCEP 30 oder 60 Minuten bei 23 °C inkubierte (ausführlich beschrieben in WO-99/07733, hier durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Die proteolytische Aktivität wurde durch die Fluoreszenzänderung in Verbindung mit der Spaltung des Substrats und durch das Auftreten des fluoreszierenden Produkts Anthranilyl-DDIVPAbu-COOH (SEQ ID NO: 20) an einem BMG-Galaxy-Lesegerät für Platten mit 96 Vertiefungen (Anregungsfilter: 355 nm; Emissionsfilter: 485 nm) bestimmt.
Anschließend wurde 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K nach dem gleichen Verfahren hergestellt, gereinigt und rückgefaltet. Man erhielt ein Enzym mit einer Reinheit von >95%. Die einwandfreie Rückfaltung wurde durch die NS3-Protease-Aktivität bestätigt (4, punktierte Linie).
Beispiel 8
Bestätigung der Aktivität nach Rückfaltung
cis-Spaltungstest
Die Autospaltungsreaktion von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K wurde durch Zugabe des Enzyms zum Spaltungspuffer, der aus 50 mM Hepes, pH-Wert 7,0, 50% (Gew./Vol.) Glycerin, 0,1% CHAPS (6) oder 1% n-Dodecyl-β-D maltosid (7, 8) (NP-40 und Triton X-100 können ebenfalls verwendet werden) und 1 mM TCEP bestand, initiiert. Das Testgemisch wurde sodann 3 h bei 23 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzedenaturierung des Enzyms in Gegenwart von SDS gestoppt. Die Spaltung an der NS2/3-Verbindungsstelle wurde durch SDS-PAGE (15%) und Immunoblot-Analysen unter Verwendung von entweder polyklonalem NS3-Protease-Antikörper, der selbst hergestellt worden war, oder von handelsüblichem polyklonalem Antikörper mit Hexahistidin-Markierung (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) bestimmt (5).
Beispiel 9
Heterogener Fluoreszenztest mit zeitlicher Auflösung
Die NS2/3-Protease wird zunächst an einer Nickel-Chelatbildungsplatte immobilisiert (10). Ein mit Europium markierter anti-NS2- oder anti-FLAG_tag-Antikörper wird sodann zugegeben. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zahlreiche Markierungen zur Markierung von Proteinen verfügbar sind. In diesem Beispiel wurden FLAG^R und HMK verwendet. Im Anschluss an die Bindung des Antikörpers wird eine Waschstufe zur Entfernung von überschüssigem Antikörper durchgeführt. Anschließend wird die Autospaltungsreaktion durch Zugabe des Spaltungspuffers eingeleitet. Nach entsprechender Inkubationszeit wird das Testgemisch auf eine zweite Platte übertragen und die Spaltung wird durch Messung der zeitlich aufgelösten Fluoreszenz in Verbindung mit dem mit Europium markierten Produkt überwacht. Die Spaltung der NS2/3-Protease kann ferner durch die Abnahme des zeitlich aufgelösten Europium-Fluoreszenzsignals, das sich durch das unprozessierte Enzym, das an die Nickel-Chelatbildungsplatte gebunden ist, ergibt, bestimmt werden.
Als Alternative wird eine Strep-tag^R enthaltende NS2/3-Protease in Aktivierungspuffer inkubiert, wobei man die Autospaltungsreaktion ablaufen lässt. (14). Das erhaltene Strep-tag-NS3-Fragment und die ungespaltene Strep-tag-NS2/3-Protease werden sodann an einer mit Streptavidin beschichteten Platte immobilisiert. Ein mit Europium markierter anti-NS2-Antikörper wird sodann zugegeben und die zeitlich aufgelöste Fluoreszenz in Verbindung mit dem gebundenen, mit Europium markierten Antikörper wird gemessen.
Testverfahren
1. Autospaltungsreaktion
Auf eine Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen werden nacheinander folgende Bestandteile gegeben: i) 20 μl Testpuffer (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 30% Glycerin, 1 mM TCEP) mit oder ohne eine Testverbindung (potentieller Inhibitor) und ii) 10 μl NS2/3-Protease (in einer Endkonzentration von 200 nM), gereinigt gemäß Beispiel 7. Die Autospaltungsreaktion wird durch Zugabe von 20 μl Aktivierungspuffer (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 30% Glycerin, 0,5% n-Dodecyl-β-D-maltosid, 1 mM TCEP) eingeleitet und 1,5 Stunden bei 30 °C durchgeführt.
2. Bindung an die Streptavidinplatte
In einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen (Pierce) wird das Autospaltungs-Reaktionsgemisch 5-fach in Testpuffer (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 30% Glycerin, 1 mM TCEP) verdünnt. Nach 1-stündiger Inkubation bei 23 °C wird die Platte mit PBS, 0,05% Tween-20, 2 M Guanidin-HCl gewaschen.
3. Bindung von Eu⁺³-markiertem anti-NS2
Die mit Streptavidin beschichtete Platte mit 96 Vertiefungen (es können auch Neutravidin-Platten verwendet werden) wird sodann mit Eu⁺³-markiertem anti-NS2 in einer Endkonzentration von 35 nM in PBS, 0,05% Tween-20, 0,3% BSA, 1 μM Biotin, 100 μM DTPA versetzt. Nach 1-stündiger Inkubation bei 23 °C wird die Platte mit dem DELFIA-Waschpuffer (Perkin Elmer Wallac) gewaschen. Schließlich wird die Verstärkungslösung (Perkin Elmer Wallac) zugegeben und die zeitlich aufgelöste Fluoreszenz wird an einem Wallac 1420 VICTOR^R-Multimarkierungs-Zählgerät gemessen.
Beispiel 10
Homogener, zeitlich aufgelöster Fluoreszenztest
Die NS2/3-Protease wird mit einem fluoreszierenden Europium-Chelat an einem Ende und mit einem Quencher der Europium-Fluoreszenz am anderen Ende markiert (11). Beispielsweise wird ein mit Europium markierter anti-NS2 oder anti-FLAG_tag als fluoreszierender Rest verwendet, während der Quencher der Europium-Fluoreszenz entweder kovalent an das Enzym gebunden ist oder an einen potentiellen NS3-Protease-Inhibitor gebunden ist. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des Spaltungspuffers eingeleitet. Bei der Autospaltung werden das Europium-Chelat und der Quencher getrennt, was zu einer Zunahme des zeitlich aufgelösten Europium-Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit führt.
Beispiel 11
Fluoreszenz-Polarisationstest
Eine fluoreszierende Sonde, wie ein potentieller NS3-Protease-Inhibitor, der mit einem fluoreszierenden Rest markiert ist, wird zu einer Lösung mit einem Gehalt an NS2/3-Protease gegeben (12). Die Autospaltungsreaktion wird durch Zugabe des Spaltungspuffers eingeleitet. Die Veränderung der Fluoreszenzpolarisation der Sonde bei Autospaltung wird im zeitlichen Verlauf überwacht. Alternativ kann auch eine an einer Nickel-Chelatbildungsplatte immobilisierte NS2/3-Protease verwendet werden. Nach Inkubation des Enzyms mit der fluoreszierenden Sonde wird die Autospaltungsreaktion durch Zugabe des Spaltungspuffers eingeleitet. Nach entsprechender Inkubationszeit wird die Spaltung durch Messen der Veränderung der Fluoreszenzpolarisation der Sonde bestimmt.
Beispiel 12
Radiometrischer Test
Die NS2/3-Protease wird zunächst an einer Nickel-Chelatbildungsplatte immobilisiert (13). Das HMK-tag wird sodann unter Verwendung von Proteinkinase A und einem radioaktiv markierten Substrat phosphoryliert. Nach Beendigung der Phosphorylierungsreaktion wird die Platte gewaschen und die Autospaltungsreaktion wird durch Zugabe des Spaltungspuffers eingeleitet. Nach entsprechender Inkubationszeit wird die Reaktion quantitativ durch Messen der Menge an radioaktiv markiertem Produkt, das in der Testlösung freigesetzt worden ist, oder der Menge an radioaktiv markierter, unprozessierter NS2/3-Protease bestimmt. Alternativ kann die Phosphorylierungsreaktion durchgeführt werden, wonach sich die Immobilisierung an der Nickel-Chelatbildungsplatte anschließt.
Beispiel 13
NS2/3-Protease-Hemmung
Die von der NS2/3-Protease-Spaltungsstelle abgeleiteten Peptide wurden sodann als potentiell konkurrierende Substrate bewertet (Tabelle I). Von der NS2/3-Protease-Spaltungsstelle abgeleitete Peptide und von NS4A abgeleitete Peptide wurden unter Anwendung eines üblichen Festphasenverfahrens synthetisiert oder von der Fa. Multiple Peptide Systems (San Diego, CA) hergestellt. Verschiedene Konzentrationen von Peptiden wurden vorher mit 0,54 μM NS2/3-Protease 30 min bei 23 °C in 50 mM Hepes, pH-Wert 7,0, und 50% (Gew./Vol.) Glycerin inkubiert. Die Autospaltungsreaktion wurde durch Zugabe von n-Dodecyl-β-D-maltosid in einer Endkonzentration von 0,5% eingeleitet. Der endgültige DMSO-Gehalt überstieg nie 5% (Vol./Vol.). Das erhaltene Gemisch wurde sodann 3 h bei 23 °C inkubiert. Sodann wurde die Reaktion gestoppt und quantitativ bestimmt. Keines der von der NS2/3-Protease-Spaltungsstelle abgeleiteten Peptide wurde in trans-Stellung gespalten (Daten nicht aufgeführt). Das Peptid, das die Reste P10-P10' der NS2/3-Verbindungsstelle überspannte (Peptid 1), hemmte die Autospaltung mit einem IC₅₀-Wert von 270 μM, während das Peptidsubstrat, das die Reste P6-P6' überspannte (Peptid 4) mit einem IC₅₀-Wert von 630 μM weniger stark wirksam war. Unter den entsprechenden Spaltungsstellenprodukten war das Peptid SFEGQGWRLL (IC₅₀ = 90 μM, SEQ ID NO: 21), das N-terminale Produkt von Peptid 1, am aktivsten. Tabelle I Hemmung der NS2/3-Autospaltung durch Peptide^a

^aPeptide wurden als 20 mM Vorratslösung in DMSO zubereitet. Der endgültige DMSO-Gehalt überstieg nie 5% (Vol./Vol.).
^bEin Test wurde in Gegenwart von 0,54 μM NS2/3-Protease durchgeführt.
^cDer Bindestrich gibt die Spaltungsstelle zwischen P1- und P1'-Resten an.

Diskussion
Bisher wurde die Herstellung von nativem NS2 allein oder in Verknüpfung mit NS3 durch seine hydrophobe Natur behindert, wobei nur sehr geringe Expressionsgrade erreicht wurden. Eine N-terminate Verkürzungsstudie ermöglichte die Identifizierung der NS2/3-Protease [904-1206] (3). Dieses verkürzte Produkt wurde in hohen Konzentrationen in E. coli bei IPTG-Induktion exprimiert (2B und 2C, Bahn 904) und war aktiv, wie durch die Anwesenheit des NS3-Protease-Spaltungsprodukts gezeigt wird (2A und 2C, Bahn 904). Jedoch wurde die NS2/3-Protease [904-1206] nur in der unlöslichen Fraktion in Form von Einschlusskörpern gewonnen. Die Verwendung von löslichen Fusionspartnern, wie Maltose bindendes Protein und Thioredoxin, erwies sich in Bezug auf eine Erhöhung der Löslichkeit der Protease bei Expression als erfolglos (Daten nicht aufgeführt).
Die Aufrechterhaltung einer geringen Konzentration eines chaotropen Mittels oder eines polaren Additivs, wie 0,5 M Arginin-HCl erwies sich als wichtig, um das 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K (9B, SEQ ID NO: 4) während des Rückfaltungsvorgangs in Lösung zu halten. Arginin-HCl ist ein polares Additiv, das Proteine geringfügig destabilisiert, und zwar in vergleichbarer Weise wie geringe Konzentrationen an chaotropen Mitteln. Es wird angenommen, dass Arginin-HCl die Solubilisierung von Faltungszwischenprodukten erhöht (T.-Y. Lin et al., Protein Sci., Bd. 5 (1996), S. 372-381).
Ein Detergens war ferner für die Rückfaltung erforderlich, um die Aggregation bei Ersatz des Denaturierungspuffers durch den Rückfaltungspuffer zu verringern und/oder zu unterdrücken. Die Detergentien LDAO, n-Dodecyl-β-D-maltosid und Octyl-POE wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Förderung der Rückfaltung von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K in Konzentrationen bei ihren entsprechenden CMC-Werten von 0,03, 0,01 und 0,25% (in Wasser) oder bei höheren Konzentrationen bewertet. Keine Rückfaltung war in Gegenwart von Octyl-POE nachweisbar. Bei LDAO und n-Dodecyl-β-D-maltosid wurde festgestellt, dass sie die Rückfaltung des Enzyms bewirken. Bei n-Dodecyl-β-D-maltosid wurde festgestellt, dass es zusätzlich zu seinem Rückfaltungsvermögen die Aktivierung von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K induziert. LDAO war überraschenderweise selektiv, da es die Rückfaltung und Rekonstitution der NS3-Protease-Aktivität ohne Förderung der Autospaltung ermöglichte. Schließlich haben die Erfinder festgestellt, dass die Anwesenheit eines Reduktionsmittels, entweder DTT oder TCEP, für die Rückfaltung des Enzyms notwendig war.
Mehrere Spaltungs/Aktivierungs-Detergentien wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Förderung der Autospaltung von 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K bewertet. Eine Autoprozessierung wurde bei Zugabe von CHAPS im Testpuffer von Beispiel 7 beobachtet (6, Bahnen 2-5). Eine ähnliche Autoprozessierung wurde auch mit n-Dodecyl-β-D-maltosid, NP-40 und Triton X-100 festgestellt, obgleich 0,5% und 1% n-Dodecyl-β-D-maltosid sich als überlegen erwies. Eine schlechte Prozessierung wurde jedoch in Anwesenheit von Octyl-POE beobachtet, während fast keine Prozessierung mit LDAO festgestellt wurde (Daten nicht aufgeführt). Neben den Spaltungs/Aktivierungs-Detergentien wurde auch für Glycerin festgestellt, dass es die Autospaltung fördert (6, Bahn 1). Interessanterweise wurden geringe Spaltungsgrade mit 0% Glycerin festgestellt, während eine erheblich erhöhte Spaltung beobachtet wurde, wenn der Testpuffer sowohl mit Glycerin als auch mit Spaltungs/Aktivierungs-Detergens versetzt wurde (6, Bahn 6).
LDAO, das während der Rückfaltung verwendet wurde, hemmte die Autoprozessierung, so dass die Autospaltungsreaktion nur durch Verdünnung des Enzyms im entsprechenden Spaltungs/Aktivierungs-Puffer und durch Verdünnung des LDAO auf eine Konzentration unter etwa 0,25% eingeleitet werden konnte.
Die NS2/3-Protease-Aktivität wurde durch SDS-PAGE und Immunoblot-Analysen (7) und durch das Fehlen von Spaltungsprodukten für die entsprechende His952Ala-Mutante (8) bestätigt. Ferner wurde keine Veränderung der Aktivität in Gegenwart von wirkungsstarken NS3-Protease-Inhibitoren beobachtet (Daten nicht aufgeführt). Schließlich bestätigte die N-terminale Sequenzierung beider cis-Spaltungsprodukte, dass die Spaltung zwischen den Resten Leu1026 und Ala1027 auftrat.
Die von der Spaltungsstelle abgeleiteten Peptidsubstrate P10-P10' und P6-P6' wurden als potentielle konkurrierende Substrate bewertet. In einem gut definierten Testsystem unter Verwendung von gereinigtem NS2/3 (904-1206) und eines optimierten Spaltungspuffers (mit einem Gehalt an 50% Glycerin und 0.5% n-Dodecyl-β-D-maltosid) hemmten die P10-P10'- und P6-P6'-Peptide die NS2/3-Prozessierung mit IC₅₀-Werten von 270 bzw. 630 μM. Unter identischen Testbedingungen wurde keine trans-Spaltung der Peptide festgestellt (Daten nicht aufgeführt). Die Daten lassen auf eine nicht-produktive Bindung des Peptidsubstrats am aktiven Zentrum schließen. Bemerkenswerterweise stellte das kürzere N-terminale P10-P10-Spaltungsprodukt-Peptid den besten Inhibitor mit einem IC₅₀-Wert von 90 μM dar, während das entsprechende C-terminate Produkt keine Hemmwirkung aufwies.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung einer rückgefalteten, inaktiven HCV NS2/3-Protease, umfassend die Schritte: a) Isolieren der Protease in Gegenwart eines chaotropen Mittels; b) Rückfalten der isolierten Protease durch Kontaktieren mit einem Reduktionsmittel und Lauryldiethylaminoxid (LDAO) in Gegenwart einer reduzierten Konzentration des chaotropen Mittels oder eines polaren Additivs.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das LDAO in einer Endkonzentration bei oder über der kritischen Micellenkonzentration vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das LDAO in einer Endkonzentration zwischen 0,003% und 1% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das LDAO in einer Endkonzentration zwischen 0,03% und 1% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das LDAO in einer Endkonzentration von 1% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt a) das chaotrope Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Guanidin-HCl, Guanidin oder Harnstoff.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das chaotrope Mittel in hoher Konzentration zwischen 5M und 8M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das chaotrope Mittel Guanidin oder Guanidin-HCl, jeweils in einer Endkonzentration von 6M, oder Harnstoff in einer Endkonzentration von 8M ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das chaotrope Mittel 6M Guanidin-HCl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt b) das chaotrope Mittel oder polare Additiv ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Guanidin, Guanidin-HCl, Harnstoff und Arginin-HCl.
Verfahren nach Anspruch 10, worin Guanidin-HCl oder Arginin-HCl verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin Arginin-HCl verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Arginin-HCl in einer Endkonzentration zwischen 0,25M und 2M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Arginin-HCl in einer Endkonzentration zwischen 0,5M und 1M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 143, worin das Arginin-HCl in einer Endkonzentration von 0,5M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TCEP und DTT.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Reduktionsmittel TCEP in einer Endkonzentration von 5mM ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Protease aus den Zellinklusionskörpern isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Rückfaltung durch Dialyse oder Gelfiltration durchgeführt wird, um eine gereinigte NS2/3-Protease zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Rückfaltung durch Gelfiltration durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die NS2/3-Protease die NS2/3-Protease voller Länge oder eine verkürzte Form davon ist, die als N-terminalen Rest irgendeine Aminosäure von Aminosäure 810 bis Aminosäure 906 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die NS2/3-Protease die minimale Aminosäuresequenz von den Resten 904 bis 1206 der NS2/3-Protease von HCV 1b-40 voller Länge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die NS2/3-Protease aus einer verkürzten NS2/3-Protease entsprechend SEQ ID. NO. 10 besteht.
Verfahren zur Herstellung einer aktiven NS2/3-Protease, umfassend: c) Verdünnen der rückgefalteten inaktiven NS2/3-Protease, wie in Anspruch 1 definiert, in einem Medium, das ein Aktivierungsdetergens enthält, um die Selbstspaltung der NS2/3-Protease zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das LDAO auf eine Endkonzentration gleich oder unter 0,1% verdünnt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, worin in Schritt c) außerdem Glycerol zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Glycerol in einer Endkonzentration zwischen 10% und 50% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Aktivierungsdetergens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CHAPS, Triton X-100, NP-40 und n-Dodecyl-β-D-maltosid.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Aktivierungsdetergens in einer Endkonzentration zwischen 0,1% und 1% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 29, worin das Aktivierungsdetergens CHAPS ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin das Aktivierungsdetergens n-Dodecyl-β-D-maltosid ist.
Zusammensetzung umfassend eine isolierte HCV NS2/3-Protease, die ausgewählt ist aus NS2/3-Protease voller Länge, einer verkürzten Form davon oder einer Sequenz entsprechend SEQ ID. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 und 14, worin die Protease in einer Lösung vorliegt, die eine ausreichende Konzentration von LDAO enthält, um die Selbstspaltung der Protease zu verhindern.