DE69938242T2

DE69938242T2 - Regionen des papillomavirus-e1-helikase beteiligt an e1 oligomerisierung

Info

Publication number: DE69938242T2
Application number: DE69938242T
Authority: DE
Inventors: Jacques Rosemère ARCHAMBAULT
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: CA2335230C; JP4430821B2; EP1102850A1; AU4766499A; JP2002522022A; NZ510016A; DK1102850T3; ATE387500T1; US20040002059A1; HUP0103948A3; ES2303380T3; DE69938242D1; IL140524A0; US6916622B2; EP1102850B1; HUP0103948A2; WO2000005380A1; US20050287554A1; CA2335230A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Aminosäuresequenz, die im Papilloma-Virus-E1-Protein enthalten ist und für die Homooligomerisation des E1-Proteins notwendig ist. Diese Oligomerisation stellt einen wesentlichen Schritt bei der Initiation der viralen DNA-Replikation dar. Ferner beschreibt die Erfindung ein Screening-Verfahren und ein Screening-System, die zum Auswählen von Mitteln befähigt sind, die diese Protein-Protein-Wechselwirkung stören können. Außerdem betrifft die Erfindung ein System zur Auswahl von Mitteln, die zur Modulation dieser Protein-Protein-Wechselwirkung befähigt sind, und zwar für die Verwendung bei der Behandlung und Bekämpfung von PV-Infektionen bei Tieren.
Hintergrund der Erfindung
Papillomaviren (PV) sind hüllenlose DNA-Viren, die hyperproliferative Läsionen des Epithels herbeiführen. Die Papillomaviren sind in der Natur weit verbreitet und wurden bei höheren Wirbeltieren festgestellt. Viren wurden unter anderem bei Menschen, Rindern, Kaninchen, Pferden und Hunden charakterisiert. Das erste Papillomavirus wurde im Jahre 1933 als Waldkaninchen-Papillomavirus (CRPV) beschrieben. Seitdem dienten das Waldkaninchen-Papillomavirus sowie das bovine Papillomavirus vom Typ 1 (BPV-1) als experimentelle Prototypen für Studien an Papillomaviren. Die meisten tierischen Papillomaviren sind mit rein epithelialen proliferativen Läsionen verbunden und die meisten Läsionen bei Tieren betreffen die Haut. Beim Menschen gibt es mehr als 75 Typen von Papillomaviren (HPV), die identifiziert worden sind und die aufgrund ihrer Infektionsstellen eingeordnet worden sind: Hautepithel und Schleimhautepithel (orale und genitale Schleimhaut). Zu den Krankheiten der Haut gehören flache Warzen, plantare Warzen und dergl. Zu den Krankheiten der Schleimhaut gehören Kehlkopf-Papillome und anogenitale Krankheiten, einschließlich Zervixkarzinome (Fields, Virology, 3. Auflg., Lippincott-Raven Pub., (1996), Philadelphia, N. Y.).
Es gibt mehr als 25 HPV-Typen, deren Beteiligung an anogenitalen Krankheiten angenommen wird. Sie werden in Typen von "geringem Risiko" und von "hohem Risiko" eingeteilt. Zu den Typen von geringem Risiko gehören HPV-Typ 6, -Typ 11 und -Typ 13. Sie induzieren hauptsächlich gutartige Läsionen, wie Condyloma acuminata (Genitalwarzen) und geringfügige squamöse, intraepitheliale Läsionen (SIL). In den Vereinigten Staaten weisen etwa 5 Millionen Personen Genitalwarzen auf, von denen 90% HPV-6 und HPV-11 zugeschrieben werden. Etwa 90% der SIL werden ebenfalls durch die Typen 6 und 11 von geringem Risiko verursacht. Die übrigen 10% SIL werden durch HPVs von hohem Risiko verursacht.
Die Typen von hohem Risiko sind mit hochgradigen SIL und zervikalem Krebs verbunden und umfassen besonders häufig die HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 und 58. Die Progression von geringfügigen SIL zu schwerwiegenden SIL ist bei Läsionen häufiger, die HPV-16 und -18 von hohem Risiko enthalten, verglichen mit den Läsionen, die HPV-Typen von geringem Risiko enthalten. Ferner werden nur vier HPV-Typen bei zervikalem Krebs festgestellt (Typen 16, 18, 31 und 45). Etwa 500 000 neue Fälle von invasivem Zervixkrebs werden jährlich weltweit diagnostiziert (Fields, 1996, a. a. O.).
Behandlungen von Genitalwarzen umfassen die physikalische Entfernung, z. B. durch Kryotherapie, CO₂-Laserbehandlung, Elektrochirurgie oder chirurgische Exzision. Zytotoxische Mittel können ebenfalls verwendet werden, z. B. Trichloressigsäure (TCA), Podophyllin oder Podofilox. Immunomodulatorische Mittel stehen ebenfalls zur Verfügung, z. B. Interferon oder Imiquimod. Diese Behandlungen sind in Bezug auf eine Beseitigung sämtlicher viraler Teilchen nicht vollkommen wirksam und damit sind entweder hohe Kosten oder unangenehme Nebenwirkungen verbunden. Tatsächlich gibt es derzeit keine wirksamen antiviralen Behandlungen von HPV-Infektionen. Bei sämtlichen derzeitigen Therapien ist das Wiederauftreten der Warzen üblich (Beutner & Ferenczy, Amer. J. Med., Bd. 102 (5A) (1997), S. 28–37).
Die mangelnde Wirksamkeit der derzeitigen Verfahren zur Behandlung von HPV-Infektionen zeigt, dass die Notwendigkeit zur Ermittlung neuer Maßnahmen zur Bekämpfung oder Beseitigung derartiger Infektionen besteht. In den letzten Jahren wurden die Anstrengungen auf das Auffinden von antiviralen Verbindungen gerichtet, und insbesondere von Verbindungen, die zur Störung der viralen Replikation befähigt sind (Hughes und Romanos, Nucleic Acids Res., Bd. 21 (1993), S. 5817–5823; Clark et al., Antiviral Res., Bd. 37 (2) (1998), S. 97–106; Hajduk et al., J. Med. Chem., Bd. 49 (20) (1997), S. 3144–3150; und Cowsert et al, Antimicrob. Agents Chemother., Bd. 37 (2) (1993), S. 171–177). Zu diesem Zweck ist es daher wichtig, die Genetik von HPVs zu untersuchen, um mögliche chemotherapeutische Ziele zu identifizieren, um beliebige Krankheiten, die durch HPV-Infektionen hervorgerufen werden, einzudämmen und möglicherweise zu beseitigen.
Der Lebenszyklus von PV ist eng an die Keratinozyten-Differenzierung gekoppelt. Man nimmt an, dass eine Infektion an der Stelle auftritt, an der das Gewebe im basalen Epithel aufbricht. Im Gegensatz zu normalen Zellen setzt sich die Zellteilung fort, wenn die Zelle einer vertikalen Differenzierung unterliegt.
Während die infizierten Zellen einer progressiven Differenzierung unterliegen, wird die zelluläre Maschinerie aufrechterhalten, die eine Steigerung der viralen Genexpression ermöglicht, wobei es schließlich zu einer späten Genexpression und einem Virion-Zusammenbau in terminal differenzierten Keratinozyten und zur Freisetzung von viralen Teilchen kommt (Fields, a. a. O.).
Der Kodierungsstrang für jedes Papillomavirus enthält etwa zehn designierte, translationale offene Leseraster (ORFs), die entweder als frühe ORFs oder als späte ORFs klassifiziert wurden. Die E1- bis E8-Gene werden im viralen Replikationszyklus früh exprimiert. Die beiden späten Gene (L1 und L2) kodieren für das große bzw. kleine Capsid-Protein. Die E1- und E2-Genprodukte entfalten ihre Wirkung bei der viralen DNA-Replikation, während E5, E6 und E7 die Wirtszellproliferation modulieren. L1 und L2 sind an der Virion-Struktur beteiligt. Die Funktionen von E3-, E4- und E8-Genproduken sind derzeit unbekannt.
Studien über HPV haben gezeigt, dass die Proteine E1 und E2 die einzigen viralen Proteine sind, die in vitro für die virale DNA-Replikation notwendig sind (Kuo et al., J. Biol. Chem., Bd. 30 (1994), S. 24058–24065). Dieses Erfordernis ist ähnlich dem von bovinem Papillomavirus vom Typ 1 (BPV-1). Tatsächlich gibt es eine hochgradige Ähnlichkeit zwischen E1- und E2-Proteinen und den ori-Sequenzen sämtlicher Papillomaviren (PV), unabhängig von der viralen Spezies und vom Typ (Kuo et al., (1994), a. a. O.). Bemerkenswert ist, dass E1 das am stärksten konservierte Protein in PV ist und dass angenommen wird, dass die enzymatische Aktivität für sämtliche PV-Typen ähnlich ist (Jenkins, J. Gen. Virol., Bd. 77 (1996), S. 1805–1809). Es wird daher erwartet, dass sämtliche E1-Genprodukte aus verschiedenen PV eine ähnliche Struktur und eine ähnliche Funktion aufweisen. Ferner zeigt PV-E1-Protein Sequenz- und Strukturähnlichkeiten mit Simian-Virus 40- und großen Polyomavirus-T-Protein (Clertant und Seif, Nature, Bd. 311 (1984), S. 276–279; und Mansley et al., J. Virology, Bd. 71 (1997), S. 7600–7608).
Das E2-Protein ist ein transkriptioneller Aktivator, der an E1-Protein bindet, wobei diese beiden Proteine und die ori-Sequenz einen ternären Komplex bilden (Mohr et al., Science, Bd. 250 (1990), S. 1694–1699). Es wird angenommen, dass E2 die Bindung von E1 an die BPV-Replikationsursprungsstelle verstärkt (Seo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 90 (1993b), S. 2865–2869). Lui et al. vertraten die Auffassung, dass im HPV die E1-Bindung an ori durch E2 stabilisiert wird (J. Biol. Chem., Bd. 270 (45) (1995), S. 27283–27291; und McBride et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 18411–18414).
Aus diesen Studien an BPV-1 ergaben sich Hinweise, dass E1 ATPase- und Helicase-Aktivitäten besitzt, die für die Initiation der viralen DNA-Replikation notwendig sind (Seo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993a), S. 702–706; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 90 (1993), S. 5086–5090; und MacPherson et al., Virology, Bd. 204 (1994), S. 403–408).
Beim E1-Protein von BPV handelt es sich um ein phosphoryliertes nukleares Protein mit replikationsbezogenen Funktionen. Hierzu gehören die DNA- und ATP-Bindung sowie ATPase- und Helicase-Aktivitäten. Deletionskartierungsstudien haben die Aminosäuren 121-311 als die Region, die für die DNA-Bindung notwendig ist, identifiziert. Mutationen innerhalb dieser Region verhindern eine DNA-Bindung durch E1-Protein von voller Länge (Leng et al., J. Virol., Bd. 71 (1997), S. 848–852; und Thorner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (1993), S. 898–902). Die zweite Funktion, nämlich die ATP-Bindung, und die ATPase-Aktivitäten sind für die virale DNA-Replikation wesentlich. Punktmutationen innerhalb von konservierten Regionen in der ATP-Bindungsdomäne inaktivieren die Fähigkeit von E1 zur Bindung oder Hydrolyse von ATP unter gleichzeitigem Verlust der DNA-Replikation (MacPherson et al., Virology, Bd. 204 (1994), S. 403–408; Raj und Stanley, J. Gen. Virol., Bd. 76 (1995), S. 2949–2956; und Sun et al., J. Virol., Bd. 64 (1990), S. 5093–5105). Die dritte Aktivität, die das E1-Protein aufweist, ist die Helicase-Aktivität oder das Loswickeln von DNA vor der Replikationsgabel. Studien haben vorhergesagt, dass die Helicase-Aktivität von der DNA-Bindungsdomäne, der Aminosäure 121, über die ATPase/Nucleotid-Bindungsregion etwa bis zur Aminosäure 530 reicht (Sverdrup und Myers, Human Papilloma Viruses, (1997), veröffentlicht von "Theoretical Biology and Biophysics").
Wenn die virale DNA-Replikation in vitro abläuft, erfolgt bei Anwesenheit von überschüssigem E1-Protein die Replikation in Abwesenheit von E2. In vivo ist in Gegenwart einer großen Menge an zellulärer DNA für die Replikation die Anwesenheit sowohl von E1 als auch von E2 erforderlich. E2 wirkt als ein Spezifitätsfaktor beim Dirigieren von E1 zur Replikationsursprungsstelle (Sedman und Stenlund, Embo. J., Bd. 14 (1995), S. 6218–6228). Man nimmt an, dass am Mechanismus zur Initiation der in vivo-Replikation die kooperative Bindung von E1 und E2 an die Ursprungsstelle beteiligt ist, wobei E1 und E2 einen Komplex bilden. Diese Wechselwirkungen von DNA-Protein und Protein-Protein erfolgen an der DNA-Replikationsursprungsstelle (Sverdrup und Myers, a. a. O.).
Ein Verständnis der Mechanismen des E1-Proteins als eine Helicase, die vermutlich zum Loswickeln der DNA an der Ursprungsstelle und vor der Replikationsgabel befähigt ist, stellt einen der Vorteile der Erfindung dar. Auf der Grundlage von PV-Studien und der SV40-DNA-Replikation wurde ein biphasisches Modell für die Replikationsinitiation von PV vorgeschlagen (Sverdrup und Myers, a. a. O.). In einem ersten Schritt binden E1 und E2 in kooperativer Weise an die Replikationsursprungsstelle, wodurch die Bindungsspezifität gegenüber der Replikationsursprungsstelle gewährleistet wird. In einem zweiten Schritt werden zusätzliche E1-Monomere zur Ursprungsstelle gebracht, wobei gleichzeitig E2 verloren geht. Es wird angenommen, dass die Bildung des homooligomeren E1-Komplexes an der Ursprungsstelle für die DNA-Replikationsaktivität und die Beteiligung der zellulären Replikationsmaschinerie bei der Initiation der DNA-Synthese erforderlich sind (Sverdrup und Myers, a. a. O.).
Da es bisher noch keine wirksamen therapeutischen Mittel zur Verhinderung, Kontrolle, Verminderung oder Beseitigung von PV-Infektionen gibt, war es wichtig, den Lebenszyklus von PV genauer zu untersuchen und speziell zu einem besseren Verständnis der viralen DNA-Replikation zu kommen. Überraschenderweise weiß man wenig über den Mechanismus der in vivo- oder in vitro-E1-Oligomerisation. Dem Stand der Technik ist nichts über die Position der Region entlang des E1-Proteins zu entnehmen, die für diese Protein-Protein-Wechselwirkung bei der Bildung des oligomeren E1-Komplexes erforderlich ist.
Somit bleibt ein Bedürfnis bestehen, zu einem besseren Verständnis über den Mechanismus und die bei dieser Oligomerisation beteiligten Elemente zu gelangen. Durch Kenntnis dieses Prozesses kommt man möglicherweise zu einem neuen therapeutischen Ziel gegen PV.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine Aminosäureregion im E1-Protein zu identifizieren, die für diese offensichtliche Selbstassoziierung erforderlich ist.
Ferner sorgt die von der Anmelderin erzielte Lokalisierung dieser Region für ein potentielles neues therapeutisches Ziel bei der Behandlung von PV-Infektionen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht daher darin, dass ein Screening-Verfahren zum Identifizieren von Mitteln bereitgestellt wird, die dazu befähigt sind, dieses neue Ziel zu modulieren. Ferner wird ein System zum Auswählen mindestens eines derartigen Mittels, das zur Störung der PV-DNA-Replikation befähigt ist, bereitgestellt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Aufklärung einiger der Schritte, die für die Initiation der Papillomavirus-DNA-Replikation erforderlich sind. Insbesondere handelt es sich um die Rolle von E1-Protein (Aminosäuren 1-649) (SEQ ID NO: 1) bei der viralen DNA-Replikation. Ganz besonders betrifft die Erfindung die Notwendigkeit einer PV-E1-Protein-Oligomerisation, als ein Schritt, der der Loswicklung von viraler DNA und der DNA-Replikation vorausgeht.
Somit wird gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz innerhalb der PV-E1-Proteinregion A, die durch die Aminosäuren 352 und 439 eingegrenzt wird, bereitgestellt, sowie beliebige Derivate, Varianten oder Fragmente davon, die für die Oligomerisation des E1-Proteins erforderlich sind. Diese Aminosäuresequenz ist zur Selbstassoziation und zur Assoziation mit dem E1-Protein von voller Länge und beliebigen Derivaten, Varianten oder Fragmenten davon, die die erfindungsgemäße Sequenz umfassen, befähigt.
Gemäß dieser ersten Ausführungsform wird eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, die für die Oligomerisation von PV-E1-Protein erforderlich ist. Diese Aminosäureregion oder -domäne wird gemäß Nummerierung für die Aminosäuresequenz von humanem Papillomavirus (HPV)-Typ 11 durch die Aminosäuren 352 und 439 eingegrenzt. Gemäß einem speziellen Aspekt dieser ersten Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz ferner durch die Aminosäuren 352 und 432 eingegrenzt. Gemäß einem besonders speziellen Aspekt dieser ersten Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz ferner durch die Aminosäuren 352 und 417 eingegrenzt. Die Anmelderin hat erstmals diese Domäne innerhalb des PV-E1-Proteins als die Aminosäuresequenz identifiziert, die für die E1-Protein-Oligomerisation, bei der es sich um einen wesentlichen, vorausgesetzten Schritt bei der Initiation der viralen DNA-Replikation handelt, erforderlich ist. Somit wird gemäß einem speziellen Aspekt dieser ersten Ausführungsform die erfindungsgemäße Aminosäuredomäne durch die Aminosäuren 353 bis 438 des PV-E1-Proteins begrenzt. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Aminosäuredomäne durch SEQ ID NO: 2 definiert.
Die Anmelderin hat ferner erstmals erkannt, dass die Aufklärung dieser Aminosäuresequenz zu einem neuen therapeutischen Ziel für die Kontrolle, Verhinderung, Beseitigung und Behandlung von PV-Infektionen bei Säugern führt.
Somit wird gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ein Screening-Assay zur Bestimmung der E1/DNA-Bindung (und somit der Oligomerisation von E1-Protein) bereitgestellt, indem man DNA, die mit dem E1-Protein kopräzipitiert wird, nachweist und/oder deren Menge misst.
Ohne Festlegung auf eine Theorie stellt die Anmelderin die Hypothese auf, dass die Messung der E1-Selbstoligomerisation indirekt mit der Messung von zusammen mit diesem E1-Protein koimmunopräzipitierter DNA korreliert werden kann. Unter Analogie zu BPV-E1 hat die Anmelderin angenommen, dass die Oligomerisation von E1 bei der Bindung an die Ursprungsstelle stattfindet, so dass die Messung der Menge von ori, die an E1 gebunden ist, eine indirekte Messung des oligomerisierten E1-Proteins darstellt.
Die Anmelderin hat nunmehr gezeigt, dass diese Hypothese zutreffend ist, und zwar durch Entwicklung eines Vernetzungsassays und durch den Nachweis einer Korrelation zwischen diesem Vernetzungsassay und dem Oligomerisationsassay gemäß früheren Ausführungsformen dieser Erfindung.
Somit wird gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung ein Vernetzungsassay zur direkten Messung des Grads der Oligomerisation (oder von dessen Hemmung) des E1-Proteins bereitgestellt.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird ein N-terminal geschnittenes E1-Protein bereitgestellt. Insbesondere umfasst ein Aspekt dieser vierten Ausführungsform das E1-Protein, das durch die Aminosäuren 72 bis 649 (SEQ ID NO: 78) begrenzt ist.
Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden, nicht-beschränkenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die lediglich beispielhaft sind und nicht als eine Begrenzung des Schutzumfangs der Erfindung zu interpretieren sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Im Anschluss an die vorstehende allgemeine Beschreibung der Erfindung wird nun auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, die eine bevorzugte Ausführungsform erläutern.
1A zeigt die Ergebnisse der E1-E1-Wechselwirkung im Hefe-Doppelhybrid-System, das zur Kartierung der E1-Proteinregion, die für die Protein-Protein-Wechselwirkung notwendig ist, verwendet wird. In diesem System wird ein Fusionsprodukt der GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) und eines E1-Proteins von voller Länge (Aminosäuren 1-649; SEQ ID NO: 1) mit Fusionsprodukten kotransfiziert, die aus einer Reihe von Deletionen am N-Terminus des HPV11-E1-Proteins und der DNA-Bindungsdomäne (BD) von GAL4 bestehen. Eine hochgradige transkriptionelle Aktivität liegt nur dann vor, wenn die Wechselwirkung der beiden Proteine in den Hybridmolekülen in ausreichendem Maße erfolgt, um die GAL4-AD und die BD in enge Nähe zu bringen, so dass die GAL4-Transkriptionsaktivität ermöglicht wird. Ein Diagramm des E1-Proteins ist oben in der Figur dargestellt. Graue Kästchen mit den Bezeichnungen A, B, C und D repräsentieren Regionen von E1, die eine hochgradige Sequenzähnlichkeit mit großen T-Antigenen aus SV40- und Polyomaviren aufweisen. Schwarze Kästchen zeigen die Position der DNA- und ATP-Bindungsdomänen von E1. Die Bereiche von E1, die in diesen Fusionsproteinen enthalten sind, sind angegeben. Die Höhe der β-Galactosidase-Aktivität wird in Hefezellen gemessen, die mit den beiden Plasmiden, einem GAL4-BD-Fusionsprotein und einem GAL4-AD-Fusionsprotein kotransformiert worden sind. Wie ersichtlich ist, wurden die ersten 71 Aminosäuren des E1-N-Terminus im BD-Hybridmolekül entfernt, um die Transkription des Lac-Z-Reportergens aufgrund der Anwesenheit einer Aktivierungsdomäne innerhalb dieser E1-Aminosäureregion zu umgehen.
1B zeigt ein Diagramm des C-Terminus-E1-Proteins, wobei die Position der konservierten Regionen A bis D angegeben ist. Die N-terminal geschnittenen E1-Moleküle, die eine Reihe von C-terminalen Deletionen aufweisen, werden mit der GAL4-AD fusioniert und mit einem geschnittenen N-terminalen E1 (330-649 von SEQ ID NO: 1) bei Fusion mit GAL4-BD kotransfiziert. Die Bereiche von E1, die in diesen Fusionsprodukten enthalten sind, sind angegeben, sowie der Grad der β-Galactosidase-Aktivität. In diesem Experiment wird nachgewiesen, dass das Fusionsprodukt, das das Proteinfragment (353-416; SEQ ID NO: 4) umfasst, zu einer messbaren β-Galactosidase-Aktivität führt.
1C zeigt die Selbstassoziierung von E1-Fragmenten in Hefe. Drei verschiedene E1-Fragmente mit N- und C-terminalen Verkürzungen werden im Hefe-Doppelhybrid-System getestet. Zum Vergleich wurde jedes E1-AD-Fusionsprodukt auch auf die Wechselwirkung mit E1 (330-649 von SEQ ID NO: 1) bei Fusion mit der GAL4-BD oder mit der GAL4-BD allein getestet. Der Grad der erzielten β-Galactosidase-Aktivität zeigt, dass die E1-Region (Aminosäuren 353-416; SEQ ID NO: 4) für die Selbstassoziierung sowie für die Wechselwirkung mit einer größeren E1-Proteinregion (330-649 von SEQ ID NO: 1) ausreichen.
2 zeigt den Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der konservierten ATP-Bindungsdomäne auf die E1-E1-Wechselwirkung. Unter Verwendung des Hefe-Doppelhybrid-Systems wurde die β-Galactosidase-Aktivität in Hefezellen gemessen, die mit Wildtyp-E1 (330-649) bei Fusion mit der GAL4-AD und einem Wildtyp-E1 (353-649; SEQ ID NO: 5) oder einem mutanten Derivat [P479S (SEQ ID NO: 6), K484E (SEQ ID NO: 7) und K484Q (SEQ ID NO: 8)] bei Fusion mit der GAL4-BD kotransfiziert worden waren. Plasmide mit GAL4-AD und GAL4-BD allein wurden als Kontrollen verwendet. Es wird dargelegt, dass die Substitutionen im Walker A-Motiv (P-Schleife) von E1 den Betrag der β-Galactosidase-Aktivität verringern, was zeigt, dass diese Substitutionen die Fähigkeit von E1 zur Selbstassoziation beeinträchtigen.
3A zeigt die Ergebnisse eines Assays zur Überwachung der Bindung von E1 an die HPV-Ursprungsstelle der DNA-Replikation. Protein-DNA-Komplexe wurden entweder mit Wildtyp-E1 (Aminosäuren 1-649; SEQ ID NO: 1) oder mit N-terminal geschnittenen E1 (E1* = Aminosäuren 72-649, SEQ ID NO: 78) oder in Abwesenheit von E1 (-E1) gebildet. E1-DNA-Komplexe wurden mit einem Antikörper gegen E1 immunopräzipitiert und die kopräzipitierte DNA wurde zusammen mit 0,5% der Sondenmenge, die bei der Bindungsreaktion verwendet wurde, durch Elektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Autoradiogramm zeigt, dass das geschnittene N-terminale E1-Protein (SEQ ID NO: 78) eine höhere Affinität zur Ursprungsstelle als das E1-Protein von voller Länge aufweist. Ein Pfeil bezeichnet das Fragment der Sonde, das die Ursprungsstelle enthält.
3B zeigt den Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der DNA-Bindungsdomäne von E1 auf die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle unter Anwendung des DNA-Koimmunopräzipitationsassays. Die Position der beiden verschiedenen doppelten Aminosäuresubstitutionen in E1 ist zusammen mit der primären Sequenz von E1 zwischen den Aminosäuren 280 und 300 angegeben. Bindungsreaktionen wurden gemäß den Angaben zu 3A durchgeführt. Die Ergebnisse des Autoradiogramms belegen, dass diese Substitutionen die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle beseitigten.
3C zeigt den Einfluss einer 3-fachen Nucleotidmutation in der HPV-11-Ursprungsstelle auf die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle. Die HPV-11-Ursprungsstelle ist mit den drei E2-Bindungsstellen (schwarze Kästchen mit der Bezeichnung "E2"), der E1-Bindungsstelle (graues Kästchen) und einer AT-reichen Region (offenes Kästchen) dargestellt. Die Sequenz eines Teils der E1-Bindungsstelle ist zusammen mit der Position von drei Nucleotidveränderungen in der mutanten Ursprungsstelle angegeben. Bindungsreaktionen wurden gemäß den Angaben für 3A durchgeführt. Das Autoradiogramm zeigt, dass die Anwesenheit einer 3-fachen Mutation in der HPV-Replikationsursprungsstelle die Bindung von E1-Protein an die Ursprungsstelle hemmte.
4A ist eine schematische Darstellung der Reihe von Deletionen, die erzeugt wurden, um die Domäne von E1, die für die Bindung an die virale DNA-Replikationsursprungsstelle in vitro erforderlich ist, zu kartieren. Geschnittene E1-Proteine wurden in vitro erzeugt und auf die Bindung an die virale Ursprungsstelle gemäß den Angaben in 3A getestet. N-terminal geschnittene Proteine wurden unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen den C-Terminus von E1 immunopräzipitiert. C-terminal geschnittene Proteine wurden an ihrem N-Terminus mit dem FLAG-Epitop markiert und unter Verwendung eines monoklonalen anti-FLAG-Antikörpers immunopräzipitiert.
4B zeigt die Ergebnisse der in 4A dargestellten Deletionen. Das Autoradiogramm belegt, dass die Region von E1, die für die Bindung an die Ursprungsstelle notwendig ist, die Aminosäuren 191-649 umfasst, was die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, die für die E1-E1-Oligomerisation erforderlich ist, einschließt. Deletionen am C-Terminus beseitigen die Ursprungsstellen-Bindung.
5A zeigt eine SDS-PAGE-Darstellung bei Färbung mit Coomassie-Blau der Thioredoxin(TRX)-Fusionsproteine, die den angegebenen Bereich von E1 bei Expression in E. coli und Reinigung durch Nickel-Affinitätschromatographie enthalten. Die Aminosäureregion eines jeden Fragments ist oben an den Bahnen angegeben. Für jedes Fusionsprotein wurden zwei unabhängige Präparate analysiert.
5B zeigt den Einfluss von überschüssigen TRX-E1-Fusionprodukten auf die Bindung von E1 (72-649 von SEQ ID NO: 1) an die virale Ursprungsstelle. Bindungsreaktionen wurden gemäß den Angaben in 4A durchgeführt. TRX-Fusionsproteine oder TRX allein wurden den Bindungsreaktionen in einer Konzentration von etwa 8 μM zugesetzt, was einen 300-fachen molaren Überschuss relativ zu E1 (72-649) bedeutet. Das Fusionsmolekül TRX-E1 (353-431; SEQ ID NO: 3) zeigte die höchste Hemmwirkung und das Fragment TRX-E1 (353-416; SEQ ID NO: 4) zeigte keine offensichtliche Hemmung. TRX allein zeigte keine messbare Bindung an die Ursprungsstelle.
5C zeigt den Einfluss einer unterschiedlichen Konzentration des TRX-E1-Fusionsmoleküls (353-431; SEQ ID NO: 3) auf die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle. Eine sinkende Konzentration von TRX-E1 (353-649; SEQ ID NO: 5) wurde zur Bestimmung des IC₅₀-Werts, mit dem dieses Fusionsprotein die Bindung von E1 an die virale Ursprungsstelle hemmt, verwendet. Aus diesen Daten wurde der IC₅₀-Wert zu etwa 3 μM bestimmt.
6A zeigt den Einfluss von Temperatur und Nucleotiden auf die Bindung von E1* an die virale Ursprungsstelle. Die Bindung von E1* (SEQ ID NO: 78) an die virale Ursprungsstelle wurde bei drei verschiedenen Temperaturen (4, 23 und 37°C) und in Gegenwart (+ ATP/Mg) oder Abwesenheit (– ATP/Mg) von ATP/Mg in einer Konzentration von 5 bzw. 3 mM durchgeführt. In Abwesenheit von ATP/Mg wird die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle bei 4°C partiell gehemmt, bleibt bei 23°C unverändert und wird bei 37°C drastisch verringert. Die Zugabe von ATP/Mg bei 37°C kehrt diesen temperaturbezogenen Effekt um.
6B zeigt, dass nur ADP und ATP in Kombination mit Magnesium zur Stimulation der Bindung von E1 an die Ursprungsstelle befähigt sind. Die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle wurde in Abwesenheit von Nucleotid (-nuc) oder in Gegenwart des angegebenen Nucleosidtriphosphats in einer Konzentration von 5 mM durchgeführt. "Adeno" bedeutet Adenosin und "cAMP" bedeutet cyclisches AMP.
6C zeigt den Einfluss der Bindung von E1 an die Ursprungsstelle in Abwesenheit von Nucleotid (-nuc) und in Gegenwart der Nucleotide (CTP, GTP und UTP) und der Desoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP). Die Ergebnisse des Autoradiogramms zeigen, dass die Nucleotide und Desoxynucleotide zur Stimulation der Bindung von E1 an die Ursprungsstelle befähigt sind. Die nicht-hydrolysierbaren Analogen (ATP-γ-S und GTP-γ-S) sind ebenfalls stimulatorisch, was zeigt, dass die Bindung an das Substrat, jedoch nicht dessen Hydrolyse für die E1-Bindung an die Ursprungsstelle erforderlich ist.
7A zeigt in schematischer Weise das E1-Protein. Graue Kästchen bezeichnen die Positionen der Regionen A, B, C und D, die eine hochgradige Sequenzähnlichkeit mit großen T-Antigenen aus SV40- und Polyomaviren aufweisen, und die Position der DNA-Bindungsdomäne. Die Positionen von konservierten Motiven A und C, die in Mitgliedern der Überfamilie 3 von NTP-bindenden Proteinen vorhanden sind, sind zusammen mit einer Ausrichtung dieser Motive aus SV40-TAntigen, BPV-1 und HPV-11 und HPV-6b angegeben. Die Konsensus-Aminosäuresequenz eines jeden Motivs ist angegeben. Reste, die mutiert worden sind, sind mit einem Pfeil bezeichnet.
7B zeigt die Ergebnisse von E1* (SEQ ID NO: 78) oder der angegebenen mutanten Derivate, die auf die Bindung an die virale Ursprungsstelle gemäß den Angaben zu 4A getestet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass Substitutionen in den konservierten Resten im A-Motiv die Fähigkeit von E1 zur Bindung an die Ursprungsstelle verringerten, was zeigt, dass die ATP-Bindung an E1 bei der E1-Bindung an die Ursprungsstelle wichtig ist. Substitutionen im Motiv C beeinflussten die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle nicht.
8A zeigt den Einfluss von Substitutionen in der konservierten Region A von E1 auf die Bindung von E1 an die virale Ursprungsstelle. Es handelt sich um eine schematische Darstellung des E1-Proteins, bei der die grauen Kästchen die Positionen der Regionen A, B, C und D angeben, die eine hochgradige Sequenzähnlichkeit mit großen T-Antigenen aus Polyomaviren aufweisen, und die Position der DNA-Bindungsdomäne. Eine Ausrichtung der konservierten Region A von SV40-T-Antigen, BPV-1 und HPV-11 ist dargestellt. Hochgradig konservierte Reste dieser Region sind mit einem grauen Kästchen versehen. Reste, die mutiert worden sind, sind ebenfalls angegeben.
8B zeigt den Einfluss von sechs unabhängigen Substitutionen in der Region A auf die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle. E1* (SEQ ID NO: 78) oder die angegebenen mutanten Derivate wurden auf die Bindung an die virale Ursprungsstelle im Wesentlichen gemäß den Angaben zu 4A getestet. Bindungsreaktionen wurden entweder bei 23°C in Abwesenheit von zugesetztem ATP/Mg oder bei 37°C in mit ATP/Mg in Konzentrationen von 5 bzw. 3 mM versetzten Reaktionen durchgeführt. Alle sechs getesteten Substitutionen verringerten die Bindung, was anzeigt, dass die konservierte Region A für die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle von Bedeutung ist.
9A zeigt den Einfluss von Substitutionen in der konservierten Region A von E1 auf die in vitro-Bildung des E1-E2-ori-Komplexes und auch die vorübergehende HPV-DNA-Replikation in Zellen. In vitro-Einfluss auf die Bildung des E1-E2-ori-Komplexes. DNA-Protein-Komplexe wurden ohne E1 (-E1) oder entweder mit Wildtyp-E1 (1-649; SEQ ID NO: 1) oder dem angegebenen mutanten E1, das Substitutionen in der konservierten Region A aufwies, zusammengebaut. Die Komplexe wurden mit einem Antikörper gegen E1 immunopräzipitiert und die gebundene DNA wurde durch Elektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht. Drei der Substitutionen, nämlich Y389A (SEQ ID NO: 9), F393A (SEQ ID NO: 10) und N389A (SEQ ID NO: 11), zeigen eine wesentliche Verringerung der Komplexbildung. Zwei Substitutionen, nämlich A390G (SEQ ID NO: 12) und Q399A (SEQ ID NO: 13) zeigen einen weniger ausgeprägten Einfluss und die Substitution F378A (SEQ ID NO: 14) übt offensichtlich nur einen mäßigen Einfluss aus. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese konservierte A-Region eine Rolle bei der Bildung des E1-E2-ori-Komplexes spielt.
9B zeigt den Einfluss der sechs Substititionen auf die vorübergehende HPV-Replikation. Die Menge des eine replizierte Ursprungsstelle enthaltenden Plasmids (ori) oder eines internen Kontrollplasmids (E1 exprimierendes Plasmid, E1) wurde durch quantitative PCR-Analyse bestimmt. Die PCR-Amplifikation wurde an genomischer DNA durchgeführt, die aus Zellen, die mit einem E1 exprimierenden Plasmid (-E2) oder mit einer Kombination von E2 und E1 exprimierenden Plasmiden (entweder Wildtyp oder die angegebenen mutanten E1-Proteine) transfiziert worden waren, isoliert worden waren. Sämtliche Zellen wurden auch mit dem die Ursprungsstelle enthaltenden Plasmid pN9 transfiziert. PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht. Die mutanten E1-Proteine mit den Substitutionen F378A (SEQ ID NO: 14), A390G (SEQ ID NO: 12) und Q399A (SEQ ID NO: 13) zeigen verringerte Replikationsgrade, wobei die drei übrigen Mutanten keine nachweisbare Replikationsaktivität ergaben. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Region A für die vorübergehende HPV-DNA-Replikation wichtig ist.
10: Vernetzung von radioaktiv markiertem E1* zum Nachweis der Bildung von Oligomeren, die in ihrer Größe dem Monomeren (1), Dimeren (2), Trimeren (3), Tetrameren (4), Pentameren (5) und Hexameren (6) von E1* entsprachen. Die Bildung von E1*-Oligomeren wird stimuliert, wenn einzelsträngige DNA (+) der Reaktion zugesetzt wird. Oligomere werden nur in Anwesenheit (+) des Vernetzungsmittels BMH nachgewiesen.
11: Vernetzung von geschnittenen, radioaktiv markierten E1-Proteinen. Die verschiedenen geschnittenen Proteine, die in diesem Assay verwendet wurden, sind im Feld A angegeben. Die Ergebnisse der Vernetzungsexperimente sind im Feld B dargestellt. Eine Vernetzung wurde gemäß den Angaben in Beispiel 12 in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von ssDNA durchgeführt.
12: Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der ATP-Bindungsdomäne von E1* auf die Oligomerisation. Die Position der verschiedenen Aminosäuresubstitutionen, die in der E1*-ATP-Bindungsdomäne vorgenommen wurden, sind im Feld A angegeben. Die Ergebnisse, die bei der Vernetzung dieser mutanten E1*-Proteine (72-649) in Gegenwart von ssDNA erhalten wurden, sind im Feld B dargestellt.
13: Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der konservierten Region A von E1* auf die Oligomerisation. Sechs verschiedene E1*-Proteine, die jeweils eine einzelne Aminosäuresubstitution in der konservierten Region A aufwiesen (jeweils oberhalb der Bahn des Gels angegeben), wurden durch Vernetzung auf ihre Fähigkeit zur Oligomerisation in Gegenwart von ssDNA gemäß den Angaben in Beispiel 12 getestet.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Definitionen
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben die wissenschaftlichen und technischen Bezeichnungen und die hier verwendete Nomenklatur die gleichen Bedeutungen, wie sie der Fachmann auf dem für die Erfindung einschlägigen Gebiet kennt. Im allgemeinen handelt es sich bei den Verfahren der Zellzüchtung, der Infektion, der molekularbiologischen Maßnahmen und dergl. um im Stand der Technik übliche Verfahren. Derartige Standardtechniken werden in Handbüchern, wie Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstories, 1989) und Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, 1994) beschrieben.
Nucleotidsequenzen werden hier einzelsträngig in der 5'- → 3'-Richtung von links nach rechts dargestellt, wobei die im Stand der Technik üblichen Einbuchstaben-Nucleotidsymbole gemäß den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 1726–1732) verwendet werden.
Die vorliegende Beschreibung nimmt Bezug auf eine Anzahl von routinemäßig verwendeten Ausdrücken der rekombinanten DNA-Technik (rDNA- Technik). Dennoch werden Definitionen ausgewählter Beispiele derartiger rDNA-Ausdrücke aus Gründen der Klarheit und Übereinstimmung vorgelegt.
Die Ausdrücke "rekombinante DNA" oder "rekombinantes Plasmid" beziehen sich, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, auf ein DNA-Molekül, das sich durch Verbindung von DNA-Segmenten ergibt. Dieser Vorgang wird häufig als gentechnische Manipulation bezeichnet.
Die hier verwendeten Ausdrücke "DNA-Segment oder -Molekül oder -Sequenz" beziehen sich auf Moleküle aus den Desoxyribonucleotiden Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und/oder Cytosin (C). Diese Segmente, Moleküle oder Sequenzen lassen sich in der Natur finden oder ergeben sich durch Synthese. Beim Lesen in Übereinstimmung mit dem genetischen Code kodieren diese Sequenzen für eine lineare Strecke oder Sequenz von Aminosäuren, die als ein Polypeptid, Protein, Proteinfragment und dergl. bezeichnet werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck "Gen" ist aus dem Stand der Technik bekannt und bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die für ein einzelnes Protein oder Polypeptid kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz von voller Länge oder einen beliebigen Bereich der Kodierungssequenz, sofern die funktionelle Aktivität des Proteins erhalten bleibt, kodiert werden.
Ein "Strukturgen" definiert eine DNA-Sequenz, die in RNA transkribiert und in ein Protein mit einer spezifischen Aminosäuresequenz translatiert wird, wodurch ein spezifisches Polypeptid oder Protein entsteht.
Bei einer "Restriktionsendonuclease" oder einem Restriktionsenzym" handelt es sich um ein Enzym, das die Fähigkeit besitzt, eine spezifische Basensequenz (üblicherweise mit einer Länge von 4, 5 oder 6 Basenpaaren) in einem DNA-Molekül zu erkennen und das DNA-Molekül an jeder Stelle, an der diese Sequenz auftritt, zu spalten. Ein Beispiel für ein derartiges Enzym ist EcoRI, das die Basensequenz GAATTC/CTTAAG erkennt und ein DNA-Molekül an dieser Erkennungsstelle spaltet.
"Restriktionsfragmente" sind DNA-Moleküle, die durch Verdau von DNA mit einer Restriktionsendonuclease erzeugt worden sind. Ein beliebiges gegebenes Genom oder DNA-Segment kann mit einer speziellen Restriktionsendonuclease in mindestens zwei diskrete Moleküle oder Restriktionsfragmente verdaut werden.
"Agarose-Gelelektrophorese" ist ein analytisches Verfahren zum Fraktionieren von doppelsträngigen DNA-Molekülen auf der Grundlage ihrer Größe. Das Verfahren beruht darauf, dass DNA-Moleküle durch ein Gel wie durch ein Sieb wandern, wobei das kleinste DNA-Molekül die höchste Beweglichkeit besitzt und am schnellsten durch das Gel wandert. Die Siebeigenschaften des Gels verzögern die größten DNA-Moleküle, so dass diese die geringste Beweglichkeit besitzen. Die fraktionierte DNA kann durch Färben des Gels unter Anwendung bekannter Verfahren, wie Nucleinsäurehybridisierung oder Markierung der fraktionierten DNA-Moleküle mit einer nachweisbaren Markierung, sichtbar gemacht werden. Alle diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt, wobei spezielle Verfahren bei Ausubel et al. (a. a. O.) beschrieben werden.
Der Ausdruck "Oligonucleotid" bezeichnet ein Molekül, das aus zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden und vorzugsweise aus mehr als drei Bestandteilen besteht. Die genaue Größe des Moleküls hängt von zahlreichen Faktoren ab, die wiederum von der letztlichen Funktion oder Anwendung des Oligonucleotids abhängen. Ein Oligonucleotid kann synthetisch, durch Klonierung oder durch Amplifikation erhalten werden.
Eine "Sequenzamplifikation" ist ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen einer Zielsequenz. Im allgemeinen werden ein oder mehr Amplifikationsprimer an eine Nucleinsäuresequenz angelagert. Unter Verwendung geeigneter Enzyme werden Sequenzen, die sich neben oder zwischen den Primern befinden, amplifiziert. Ein hier verwendetes Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Ein "Amplifikationsprimer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das zur Anlagerung an eine DNA-Region neben einer Zielsequenz befähigt ist und als Initiationsprimer für die DNA-Synthese unter geeigneten Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, dient. Das synthetisierte Primer-Erweiterungsprodukt ist mit der Zielsequenz komplementär.
Die Ausdrücke "Domäne" oder "Region" betreffen eine spezifische Aminosäuresequenz, die entweder eine spezifische Funktion oder eine spezfische Struktur in einem Protein definiert. Ein Beispiel hierfür ist die erfindungsgemäße Oligomerisationsdomäne, die im Papillomavirus-E-Protein enthalten ist.
Der hier verwendete Ausdruck "eingegrenzt" bezeichnet ein Protein oder Peptidsegment, das sich zwischen den angegebenen Aminosäuren befindet, wobei die eingrenzenden Aminosäuren ausgenommen sind. Beispielsweise bezieht sich ein durch die Aminosäuren 30 bis 100 eingegrenztes Protein auf ein beliebiges Protein oder Peptidsegment einer beliebigen Länge, das sich zwischen der Aminosäure 30 (ausschließlich) und der Aminosäure 100 (ausschließlich) befindet oder auf beliebige Varianten, Derivate oder Fragmente davon.
Der hier verwendete Ausdruck "begrenzt" bedeutet ein Protein oder Peptidsegment, das aus den angegebenen Aminosäuren besteht, wobei die begrenzenden Aminosäuren eingeschlossen sind. Beispielsweise bezeichnet ein durch die Aminosäuren 31 bis 99 begrenztes Protein ein Protein oder Peptidfragment, das die Aminosäuren 31 bis 99 oder beliebige Varianten oder Derivate davon umfasst.
Der hier verwendete Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich auf mindestens zwei Polypeptidsegmente, die in der Natur nicht miteinander verbunden sind. Nicht-beschränkende Beispiele für derartige erfindungsgemäße "Fusionsproteine" umfassen das E1-Protein und beliebige Varianten, Fragmente oder Varianten davon, die mit Thioredoxin fusioniert sind. Für die Zwecke der Erfindung ermöglicht die Verwendung von Thioredoxin die Reinigung des fusionierten E1-Proteins oder beliebiger Fragmente, Varianten oder Derivate davon in einer löslichen Form. Daher können beliebige Proteine, die zur Solubilisierung des E1-Proteins befähigt sind, für die Zwecke der Erfindung eingesetzt werden. Ein weiteres Beispiel für Fusionsproteine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung stellt die Fusion von E1-Protein und beliebiger Varianten, Derivate oder Fragmente davon an das GAL4-Protein dar. Diese fusionierten Polypeptide können weiter mit einem Polypeptid einer "Affinitätsmarkierung" fusioniert werden. Bei einigen Ausführungsformen kann es von Vorteil sein, eine zusätzliche Spaltungsstelle zwischen die beiden Polypeptidsequenzen, die fusioniert worden sind, einzuführen. Derartige Spaltungsstellen zwischen zwei oder mehr heterolog fusionierten Proteinen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Die Ausdrücke "Vektor" oder "DNA-Konstrukt" sind im Stand der Technik üblich und beziehen sich auf beliebige genetische Elemente, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Plasmid-DNA, Phagen-DNA, virale DNA und dergl., die die Oligonucleotidsequenzen oder erfindungsgemäßen Sequenzen aufnehmen können und als DNA-Vehikel dienen können, in die die erfindungsgemäße DNA kloniert werden kann. Zahlreiche Typen von Vektoren existieren und sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Der Ausdruck "Expression" definiert den Vorgang, durch den ein Strukturgen in mRNA transkribiert wird (Transkription), wonach die mRNA in ein oder mehr Polypeptide (oder Proteine) translatiert wird (Translation).
Der Ausdruck "Expressionsvektor" definiert einen Vektor oder ein Vehikel gemäß den vorstehenden Ausführungen, die aber dazu bestimmt sind, die Expression einer inserierten Sequenz nach Transformation in einem Wirt zu ermöglichen. Das klonierte Gen (inserierte Sequenz) wird üblicherweise unter die Kontrolle von Kontrollelementsequenzen, wie Promotorsequenzen, gebracht. Derartige Expressionskontrollsequenzen variieren je nachdem, ob der Vektor zur Expression des funktionell verknüpften Gens in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt oder in beiden (Shuttle-Vektoren) vorgesehen ist. Sie können zusätzlich transkriptionelle Elemente, wie Enhancer-Elemente, Terminationssequenzen, gewebespezifische Elemente und/oder Initiations- und Terminationsstellen der Translation enthalten.
Der Ausdruck "eukaryontisches Expressionssystem" bezeichnet die Kombination eines geeigneten Expressionsvektors und einer eukaryontischen Zelllinie, die zur Expression eines Proteins von Interesse verwendet werden kann. Bei einigen Systemen kann das Gen für das Protein in das Genom eines Virus inseriert werden, das den verwendeten Zelltyp infizieren kann. Plasmidvektoren, die das erwünschte Gen enthalten, können ebenfalls verwendet werden. In sämtlichen Fällen enthält der Vektor geeignete Kontrollelemente (Promotoren), um das Protein im Zelltyp von Interesse zu exprimieren. Weitere Komponenten, z. B. ein Vektor oder ein virales Genom, das für T7-Polymerase kodiert, können ebenfalls in bestimmten Expressionssystemen notwendig sein. Eukaryontische Zelltypen, die üblicherweise verwendet werden, sind Hefe (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), die mit einem Plasmidvektor transfiziert ist; Insektenzellen (z. B. SF9, SF21), die mit Baculovirus (Autographs californica oder Bombyx mori) infiziert sind (Luckow, Curr. Op. Biotech., Bd. 4 (1993), S. 564–572; Griffiths und Page, Methods in Molec. Biol., Bd. 75 (1994), S. 427–440; und Merrington et al., Molec. Biotech., Bd. 8 (3) (1997), S. 283–297); mit Adenovirus, Vaccinia-Virus, Sindbis-Virus oder Semliki-Forest-Virus infizierte Säugetierzellen; und mit DNA-Vektoren für die vorübergehende oder konstitutive Expression transfizierte Säugetierzellen. Besonders bevorzugt werden hier das Saccharomyces cerevisiae-Hefesystem und als Säugetierzellen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen).
Eine Wirtszelle oder Indikatorzelle ist durch exogene oder heterologe DNA (z. B. ein DNA-Konstrukt) "transfiziert", wenn eine derartige DNA in das Innere der Zelle eingeführt worden ist. Die transfizierende DNA kann in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert sein (kovalent gebunden) oder nicht. In Prokaryonten, Hefen und Säugetierzellen kann beispielsweise die transfizierende/transformierende DNA an einem episomalen Element, z. B. einem Plasmid, aufrechterhalten werden. Was eukaryontische Zellen betrifft, handelt es sich bei einem Beispiel für eine in stabiler Weise transfizierte Zelle um eine Zelle, in der die transfizierte DNA in das Chromosom integriert worden ist und auf Tochterzellen durch Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zellen, Zelllinien oder Klone aus einer Population von Tochterzellen mit einem Gehalt an der transfizierten DNA zu bilden, nachgewiesen. Transfektionsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt (Sambrook et al., 1989, a. a. O.; Ausubel et al., 1994, a. a. O.).
Der hier verwendete Ausdruck "Affinitätsmarkierung" bezieht sich auf eine Markierung, die spezifisch von einem komplementären Liganden eingefangen wird. Zu Beispielen für Paare von Affinitätsmarker und Affinitätsligand gehören (ohne Beschränkung hierauf): Maltose-Bindungsprotein (MBP)/Maltose; Glutathion S-transferase (GST)/Glutathion; Polyhistidin (His)/Metall. Das als Affinitätsligand verwendete Metall kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen und Nickel (Wong et al., Separation and Purification Methods, Bd. 20 (1) (1991), S. 49–106). Vorzugsweise handelt es sich beim ausgewählten Metall um Nickel. Der Affinitätsligand kann in Säulen bereitgestellt werden, um die Trennung durch Affinitätschromatographie zu erleichtern.
Die Affinitätsmarkierung kann am N- oder C-terminalen Ende des Proteins positioniert werden, befindet sich aber vorzugsweise am N-Terminus des Proteins.
Die beschriebenen Nucleotidsequenzen und Polypeptide umfassen (ohne Beschränkung hierauf) Mutanten, Homologe, Subtypen, Allelen und dergl. Es ist darauf hinzuweisen, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen allgemein für eine Wechselwirkungsdomäne kodieren. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die erfindungsgemäße Wechselwirkungsdomäne und beliebige Varianten, Derivate oder Fragmente davon leicht unter Anwendung der erfindungsgemäßen Lehre und Assays und unter Berücksichtigung des Stands der Technik bestimmt werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Variante" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Sequenz (eine Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz) bei der eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) erhalten bleibt, die eine wesentliche Ähnlichkeit mit der Aktivität der ursprünglichen Sequenz besitzt. Diese Variante oder dieses Äquivalent können aus der gleichen oder aus unterschiedlichen Spezies stammen und es kann sich um natürliche Varianten oder synthetisch hergestellte Varianten handeln. Derartige Varianten umfassen Aminosäuresequenzen mit Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren, mit der Maßgabe, dass die biologische Aktivität des Proteins konserviert ist. Entsprechendes gilt für Varianten von Nucleinsäuresequenzen, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einem oder mehreren Nucleotiden aufweisen können, mit der Maßgabe, dass die biologische Aktivität der Sequenz oder des translatierten Proteins allgemein erhalten bleibt.
Der Ausdruck "Derivat" bezeichnet beliebige der vorstehend beschriebenen Varianten, die einen zusätzlichen chemischen Rest, der normalerweise nicht Bestandteil dieser Moleküle ist, umfassen. Diese chemischen Reste können verschiedene Aufgaben erfüllen, einschließlich einer Verbesserung der Löslichkeit des Moleküls, der Absorption und der biologischen Halbwertszeit, der Verringerung der Toxizität und der Beseitigung oder Verringerung von unerwünschten Nebenwirkungen. Ferner können diese Reste für Markierungs- und Bindungszwecke eingesetzt werden oder sie können in einem oder mehreren Fusionsprodukten enthalten sein. Verschiedene Reste, die zur Vermittlung der vorstehend beschriebenen Effekte befähigt sind, finden sich in Remington's The Science and Practice of Pharmacy (1995). Verfahren zur Kupplung derartiger Reste an ein Molekül sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf beliebige Segmente einer identifizierten DNA, RNA oder Aminosäuresequenz und/oder auf beliebige Segmente von beliebigen Varianten oder Derivaten, die vorstehend beschrieben wurden.
Die Ausdrücke "Variante", "Derivat" und "Fragment" der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Proteine oder Nucleinsäuremoleküle, die isoliert/gereinigt, chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA-Technik erzeugt werden können. Alle diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Wie nachstehend durch Beispiele belegt, können die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen und Polypeptide beispielsweise durch in vitro-Mutagenese modifiziert werden, um ihre katalytische und Struktur-Funktions-Beziehung zu zergliedern und eine günstigere Konstruktion und Identifikation der erhaltenen Proteine zu ermöglichen.
Der Ausdruck "Oligomerisation" bezieht sich auf eine Wechselwirkung zwischen mindestens zwei Molekülen. Die Moleküle können gleich oder verschieden sein. Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck Selbstoligomerisation auf die Wechselwirkung zwischen dem E1-Protein und beliebigen Derivaten, Varianten oder Fragmenten davon.
Der Ausdruck "Screening-Sequenz" ist hier als eine Aminosäuresequenz definiert, die zur Oligomerisation mit sich selbst oder mit einem PV-E1-Protein (unter Einschluss von Derivaten, Fragmenten oder Varianten davon) befähigt ist. Diese Sequenz umfasst eine Komponente eines Screening-Verfahrens zur Selektion von Mitteln, die die Oligomerisation modulieren.
Beim "DNA-Koimmunopräzipitationsassay" handelt es sich um einen Assay zum Nachweis einer Protein-DNA-Wechselwirkung. Der Protein-DNA-Komplex wird mit einem Antikörper gegen das Protein, das im Komplex enthalten ist, immunopräzipitiert. Das immunopräzipitierte Produkt, das die DNA umfasst, kann mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen/gemessen oder sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch Agarose-Gelelektrophorese unter anschließender radiographischer Abbildung oder durch kolorimetrische Techniken.
Bevorzugte Ausführungsformen
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, die innerhalb der PV-E1-Proteinregion A, die für die E1-Oligomerisation notwendig ist, enthalten ist. Die Oligomerisation des E1-Proteinis wird gemäß dieser Anmeldung durch Aminosäurefragmente der E1-Proteinregion A von unterschiedlicher Größe nachgewiesen. Alle diese Fragmente fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Gemäß dieser ersten Ausführungsform wird eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, die für die Oligomerisation von PV-E1-Protein erforderlich ist, das durch die Aminosäuren 352 und 439 gemäß der HPV-11-Nummerierung eingegrenzt ist. Alternativ wird die Aminosäuresequenz durch die Aminosäuren 353 bis 438 gemäß der HPV-11-Nummerierung begrenzt. Gemäß einer weiteren Alternative ist die Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO: 2 definiert.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt dieser ersten Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz ferner durch die Aminosäuren 352 und 432 eingegrenzt. Alternativ wird die Aminosäuresequenz durch die Aminosäuren 353 bis 431 gemäß der HPV-11-Nummerierung begrenzt. Gemäß einer weiteren Alternative ist die Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO: 3 definiert.
Gemäß einem weiteren speziellen Aspekt dieser ersten Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz ferner durch die Aminosäuren 352 und 417 eingegrenzt. Alternativ wird die Aminosäuresequenz durch die Aminosäuren 353 bis 416 gemäß der HPV-11-Nummerierung begrenzt. Gemäß einer weiteren Alternative ist die Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO: 4 definiert.
In Übereinstimmung mit der vorstehend angegebenen Ausführungsform der Aminosäuresequenzen werden sämtliche Varianten, Derivate und Fragmente davon, die mit den hier angegebenen Sequenzen funktionell äquivalent sind, beschrieben.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen einer Selbstassoziierung unterliegen können. Ferner sind diese Sequenzen dazu befähigt, Oligomere mit dem E1-Protein von voller Länge und beliebigen Derivaten, Varianten oder Fragmenten davon, die die erfindungsgemäß Sequenz umfassen, zu bilden.
Demgemäß wird gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ein Screening-Assay zu Bestimmung der E1/DNA-Bindung (und somit der Oligomerisation von E1-Protein) bereitgestellt, indem man die Menge an DNA, die mit dem E1-Protein kopräzipitiert wird, nachweist und/oder misst.
Gemäß einem speziellen Aspekt dieser zweiten Ausführungsform wird ein Assay zum Screening eines Mittels bereitgestellt, das dazu befähigt ist, die E1-Oligomerisation zu hemmen, wobei die Verringerung der DNA, die mit dem E1-Protein gemeinsam der Immunopräzipitation unterliegt, gemessen wird.
Insbesondere wird gemäß dieser zweiten Ausführungsform ein Oligomerisationsassay bereitgestellt, der die folgenden Schritte umfasst:

a. Kombinieren eines E1-Proteins mit einem DNA-Fragment und Inkubieren für eine ausreichende Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen,
b. Isolieren des E1-Protein/DNA-Komplexes von der nicht-komplexierten DNA und
c. Nachweisen der DNA, wobei die Anwesenheit von DNA einen Hinweis auf E1-Protein, das an DNA bindet, darstellt und somit mit der E1-Oligomerisation korreliert.

Das für diesen Assay verwendete E1 kann ausgewählt werden aus den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, dem E1-Protein von voller Länge, dem N-terminal geschnittenen E1-Protein (e1*) und beliebigen Derivaten, Varianten oder Fragmenten davon.
Vorzugsweise enthält das in dieser speziellen Ausführungsform verwendete DNA-Fragment eine Replikationsursprungsstelle, um die Spezifität der E1-Bindung zu verstärken. Insbesondere wird das E1-Protein mit einem Gemisch von zwei DNA-Fragmenten kombiniert, von denen eines eine Replikationsursprungsstelle enthält und das zweite aus DNA von abweichender Länge besteht, die von der ori-enthaltenden DNA unterscheidbar ist. Dabei kann die Menge an E1, die an die ori-enthaltende DNA gebunden ist, mit der Menge der nicht-spezifischen Bindung verglichen werden.
Insbesondere wird der E1-DNA-Komplex von der freien DNA durch Säulenchromatographie, Zentrifugation, Extraktion, Filtration oder Immunopräzipitation isoliert. Ganz besonders wird die E1-DNA durch Immobilisieren des Antikörpers an einem festen Medium, wie einer SPA-Perle oder am Boden einer Vertiefung einer Testplatte isoliert, so dass nach Entfernen des Mediums die freie DNA vorliegt.
Speziell wird E1 unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers immunopräzipitiert oder immobilisiert. Insbesondere handelt es sich beim polyklonalen Antikörper um K71 oder K72.
Vorzugsweise wird die DNA vor dem Nachweis der komplexierten DNA aus dem E1/DNA-Komplex freigesetzt. Eine derartige Freisetzung kann beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel erfolgen.
Gemäß einem speziellen Aspekt dieser zweiten Ausführungsform kann die DNA durch Verfahren unter Einschluss von Gelelektrophorese, Spektrophotometrie und radioaktiver Abbildung nachgewiesen werden. Demgemäß wird je nach den gewählten Nachweismaßnahmen die DNA mit beliebigen geeigneten Mitteln markiert, unter Einschluss von fluoreszierenden Farbstoffen oder radioaktiven Isotopen. Vorzugsweise wird die DNA radioaktiv markiert und durch Gelelektrophorese unter anschließender radioaktiver Abbildung nachgewiesen. Alternativ wird die DNA mit einem kolorimetrischen Farbstoff markiert und spektrophotometrisch nachgewiesen, oder die DNA wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert und durch Szintillations-Nachbarschafts-Technik (SPA) nachgewiesen.
Speziell wird die DNA vor der Komplexbildung, nach der Immunopräzipitation oder nach Freisetzung der DNA aus dem Immunopräzipitationskomplex markiert.
Gemäß einem speziellen Aspekt dieser zweiten Ausführungsform wird ein Assay gemäß den vorstehenden Angaben bereitgestellt, das zum Screening auf ein Mittel geeignet ist, das zur Hemmung der E1-Oligomerisation befähigt ist, wobei dieser Assay ferner die folgenden Schritte umfasst:

a. Kontaktieren eines Mittels gegen das E1-Protein vor der Kombination mit dem DNA-Fragment und Inkubieren für eine Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen, und
e. Vergleichen der Ergebnisse mit einer Kontrollprobe, wobei die Kontrollprobe auf ähnliche Weise, jedoch ohne Zugabe dieses Mittels behandelt worden ist.

Insbesondere ist ein derart ausgewähltes Mittel dazu befähigt, die Oligomerisation zu beeinträchtigen und ganz besonders hemmt ein derartiges Mittel die Oligomerisation von E1-Protein und beliebigen Derivaten, Varianten oder Fragmenten davon gemäß den vorstehenden Ausführungen.
Gemäß der dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein Vernetzungsassay bereitgestellt, um den Grad der Oligomerisation (oder Hemmung) des E1-Proteins direkt zu messen. Insbesondere umfasst dieser Oligomerisationsassay die folgenden Schritte:

a. Kombinieren eines markierten E1-Proteins mit einem DNA-Fragment und Inkubieren für eine ausreichende Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen,
b. Vernetzen des E1-Proteins und der DNA im Komplex mit einem Vernetzungsmittel und
c. elektrophoretisches Abtrennen des E1-Proteins, so dass die Migration von E1 einen Hinweis auf den Grad der Oligomerisation von E1 darstellt.

Vorzugsweise wird der E1/DNA-Komplex von der freien DNA vor Durchführung der Trennung isoliert.
Insbesondere handelt es sich beim E1-Protein, das bei diesem Oligomerisationsassay verwendet wird, um ein N-terminal geschnittenes E1-Protein. Ganz besonders sind bei diesem Protein die ersten 70 N-terminalen Aminosäuren deletiert. In besonders bevorzugter Weise wird dieses E1-Protein durch die Aminosäuren 72-649 begrenzt.
Vorzugsweise ist das E1-Protein mit einem Radioisotop markiert. Insbesondere ist es mit ³⁵S markiert und wird auf dem Gel durch Radioabbildungstechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, nachgewiesen.
Vorzugweise handelt es sich beim Vernetzungsmittel um Bismaleinimidohexan (BMH).
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird ein N-terminal geschnittenes E1-Protein bereitgestellt. Insbesondere umfasst ein Aspekt dieser vierten Ausführungsform das E1-Protein, das durch die Aminosäuren 72 bis 649 (SEQ ID NO: 78) begrenzt wird.
Da gezeigt worden ist, dass das E1-Protein Ähnlichkeit mit anderen Papillomavirus- sowie mit SV40- und Polyomavirus-T-Antigenen aufweist, umfasst die Erfindung beliebige Aminosäuresequenzen, die für die Oligomerisation eines Proteins notwendig sind, das zur Initiation der viralen DNA-Replikation erforderlich ist und funktionelle und/oder strukturelle Ähnlichkeiten mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz besitzt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Region im E1-Protein, die für die Oligomerisation notwendig ist, mit ähnlicher Funktion und/oder Struktur in bovinen Papillomavirus, Waldkaninchen-Papillomavirus oder humanen Papillomavirus vorhanden. Gemäß einem speziellen Aspekt der Ausführungsformen der Erfindung stammt die PV-DNA aus HPV.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Region des E1-Proteins aus HPV von niedrigem Risikotyp oder hohem Risikotyp ausgewählt; wobei Typen von hohem Risiko aus den Typen 16, 18, 31, 35, 45, 52 und 58 bestehen und Typen von geringem Risiko aus den Typen 6, 11 und 13 bestehen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt die Aminosäuresequenz der Erfindung von humanem Papillomavirus Typ 11 von geringem Risiko.
Gemäß einem speziellen Aspekt der Ausführungsformen der Erfindung kann das E1-Protein durch verschiedene Maßnahmen erhalten werden. In einem nichtbeschränkenden Beispiel wird das Protein durch Kupplung von Transkription/Translation in einem Kaninchen-Retikulozytenlysat synthetisiert oder durch rekombinante Technik hergestellt.
Gemäß einer Anwendung der vorliegenden Erfindung werden das Screening-Verfahren und das Screening-System bei niederen Temperaturen in Gegenwart oder Abwesenheit von ATP/Mg oder bei hohen Temperaturen in Gegenwart von ATP/Mg eingesetzt, insbesondere bei niederen Temperaturen von etwa 4°C und 23°C und bei einer hohen Temperatur von etwa 37°C. Ferner kann das E1-Protein durch in vitro-Transkription/Translation oder durch rekombinante Technik hergestellt werden, wobei es die Aminosäuren 72-649 (SEQ ID NO: 78) umfasst. Jedoch können auch andere, aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen dazu herangezogen werden, die Aminosäuresequenz für das Screening bereitzustellen.
Gemäß einer Anwendung der Erfindung können die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz und beliebige Varianten, Derivate oder Fragmente davon in einer Affinitätssäule für die Auswahl eines beliebigen Proteins oder Moleküls, die zur Bindung daran befähigt sind, verwendet werden. Zu nicht-beschränkenden Beispielen gehören Antikörper, Polypeptide, Nucleinsäuresequenzen und chemische Verbindungen.
Vorzugsweise beeinflusst das unter Anwendung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen ausgewählte Mittel die virale DNA-Replikation, speziell die Replikation von Papillomavirus-DNA und insbesondere von HPV. Gemäß einer speziellen Anwendung der Erfindung kommt es in Betracht, dass eines oder mehrere der ausgewählten Mittel in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Papillomavirus-Infektion verwendet werden können.
Beispiele
Beispiel 1: Hefestamm, Medium und gentechnische Verfahren
Saccharomyces cerevisiae-Stamm Y153 (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-901 his3-Δ200 ade2-101 gal4Δ gal80Δ URA3::GAL-IacZ LYS::GAL-HIS3) wurde für die Hefe-Doppelhybrid-Analyse verwendet (Durfee et al., Genes. Dev., Bd. 7 (1993), S. 555–569). Die Transformation des Hefestammes Y153 wurde unter Anwendung des LiAc-Verfahrens im Wesentlichen gemäß den Angaben in Clontech Matchmaker Library Protocol durchgeführt. Zellen, die mit einer Kombination von zwei Plasmiden kotransformiert worden waren, wurden bei 30°C 3 bis 5 Tage auf SD-Medium (beschrieben von Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, (1979) N. Y.), dem Leucin und Tryptophan fehlten, das jedoch mit den übrigen erforderlichen Aminosäuren versetzt war, selektiert.
Beispiel 2: β-Galactosidase-Assays
Transformierte Hefezellen wurden in flüssigem SD-Medium, das kein Leucin und Tryptophan enthielt, vorgezüchtet und sodann zur Inokulation von YPD-Kulturen (Sherman et al., a. a. O.) verwendet. Diese Kulturen wurden bei 30°C gezüchtet, bis sie eine optische Dichte von etwa 0,6 bei 600 nm (OD₆₀₀) erreichten. Anschließend wurden die Zellen geerntet, gewaschen und durch zwei Einfrier- und Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff) permeabilisiert. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde sodann spektrophotometrisch (bei 578 nm) unter Verwendung von Chlorphenyl-red-β-D-galactopyranosid (CRPG, Boehringer Mannheim) als Substrat gemäß den Angaben in Clontech Matchmaker Library Protocol gemessen. Die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Miller-Einheit = (1000 × OD₅₇₈)/(verstrichene Zeit in Minuten × 1,5 ml Kultur × OD₆₀₀).
Beispiel 3: Plasmid-Konstruktionen
A. Plasmide für die in vitro-Transkription/Translation
Die Konstrukte und die Primer für die Amplifikation sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Für die in vitro-Synthese von HPV-11-E1 und -E2 verwendete Plasmide wurden entweder von pCR3 (Invitrogen, CA) oder von pTM1 (erhalten von Bernard Moss, NIH) abgeleitet. In diesen Plasmiden kann das kodierte Protein in vitro aus dem T7-Promotor, der sich strangaufwärts vom offenen Leseraster (ORF) befindet, exprimiert werden. Bei Verwendung in einem gekuppelten Transkriptions/Translationssystem (TNT Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega) dirigierten von pTM1 abgeleitete Plasmide die Synthese höherer Proteinkonzentrationen. Vermutlich ist der Grund hierfür, dass dieses Plasmid die innere Enzephalomyokarditis-Virus-Ribosomenzugangsstelle (EMCV-IRES), die die Translation stimuliert (Daten nicht aufgeführt) kodiert.
Zur Konstruktion von pCR3-E1 und pCR3-E2 wurden die gesamten HPV-11-E1- und -E2-ORFs getrennt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, wenngleich auch beliebige Verfahren, die zur Amplifikation von DNA befähigt sind, für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet sind. Die folgenden Paare von Oligonucleotiden wurden bei der Amplifikationsreaktion verwendet:
(Die ATG- und Stoppcodons von E1 und E2 sind unterstrichen.)
Bei den für die PCR verwendeten DNA-Matrizen handelt es sich um die Baculovirus-Konstrukte Ac11E1 oder Ac11E2 (erhalten von R. Rose, Universität Rochester). Die E1- und E2-PCR-Produkte wurden jeweils unter der Kontrolle des unmittelbar frühen Cytomegalovirus-Promotors in das Plasmid pCR3 unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) kloniert, um pCR3-E1 und pCR3-E2 zu erzeugen.
Das Plasmid pCR3-FLAG-E1 (das FLAG-Epitop stammt von der Fa. Eastman Kodak Co.), das E1 (Aminosäuren 2-649), das an seinem N-Terminus mit dem FLAG-Epitop (Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) fusioniert ist, exprimiert, wurde durch PCR-Amplifikation des E1-ORF mit den folgendem beiden Oligonucleotiden konstruiert:
(der für das FLAG-Epitop kodierende Bereich ist unterstrichen). Das erhaltene PCR-Produkt wurde in das Plasmid pCR3 (Invitrogen) unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) kloniert.
Zur Konstruktion des Plasmids pTM1-E1 wurde der E1-ORF durch PCR unter Verwendung der folgenden beiden Oligonucleotide amplifiziert:
Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI (die Restriktionsstellen werden durch die beiden Oligonucleotide kodiert) verdaut und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen des Plasmids pTM1 inseriert.
Das Plasmid pTM1-FLAG-E1, das E1 (Aminosäuren 2-649), das an seinem N-Terminus mit dem FLAG-Epitop (Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) fusioniert ist, exprimiert, wurde durch PCR-Amplifikation des E1-ORF mit den folgenden beiden Oligonucleotiden konstruiert:
(der für das FLAG-Epitop kodierende Bereich ist unterstrichen). Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit NcoI und BamHI (kodiert durch die beiden Oligonucleotide) verdaut und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen des Plasmids pTM1 inseriert.
Plasmide zur in vitro-Expression von N-terminal geschnittenen E1-Proteinen wurden durch Amplifikation des erwünschten Bereiches des E1-ORF mit spezifischen Primern, die eine NcoI-Stelle (Vorwärtsprimer) und eine BamHI-Stelle (Rückwärtsprimer) trugen, konstruiert. PCR-Produkte wurden mit NcoI und BamHI verdaut und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen der Plasmide pTM1 inseriert. Die Sequenzen der verschiedenen E1-Vorwärtsprimer, die verwendet wurden, sowie die der üblichen Rückwärtsprimer sind nachstehend angegeben. In Klammern ist die erste Aminosäure (a. a.) von E1 angegeben, die durch jedes dieser Oligonucleotide kodiert wird. Vorwärtsprimer:
Rückwärtsprimer:
Das Plasmid pTM1-FLAG-E1 (72-649), das für ein geschnittenes HPV-11-E1-Protein kodiert, dem die N-terminalen 71 Aminosäuren fehlen, das aber am N-Terminus mit dem FLAG-Epitop markiert ist, wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Oligonucleotids, das für das FLAG-Epitop kodiert, konstruiert: GGGGGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGGCGGATGCTCATT ATGACTG (SEQ ID NO: 34) (die Sequenz des FLAG-Epitops ist unterstrichen). Der folgende Rückwärtsprimer wurde verwendet:
Plasmide mit Ähnlichkeit zu pTM1-FLAG-E1 (72-649), die aber für E1-Proteine mit einem geschnittenen C-Terminus kodierten, wurden durch PCR-Amplifikation des erwünschten Bereiches des E1-ORF mit spezifischen Primern, die eine NcoI-Stelle (Vorwärtsprimer) und eine BamHI-Stelle (Rückwärtsprimer) enthielten, konstruiert. Die PCR-Produkte wurden mit NcoI und BamHI verdaut und im Raster zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen der Plasmide pTM1 inseriert. Die Sequenz des üblichen E1-Vorwärtsprimers (der für das FLAG-Epitop kodiert) ist nachstehend angegeben. Ferner sind die Sequenzen der verschiedenen E1-Rückwärtsprimer, die verwendet wurden, beschrieben. In Klammern ist die letzte Aminosäure (a. a.) von E1 angegeben, die durch jeden dieser Rückwärtsprimer kodiert wird. Vorwärtsprimer:
B. Hefe-Doppelhybrid-Plasmide
Die Konstrukte und die Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden, sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengestellt.
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden HPV-11-E1-DNA-Fragmente durch PCR mit spezifischen Primern amplifiziert, die eine NcoI-Stelle (Vorwärtsprimen) und eine BamHI-Stelle (Rückwärtsprimer) trugen. Die PCR-Produkte wurden mit NcoI und BamHI verdaut und im Raster zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen der Hefe-Doppelhybrid-Vektoren pAS1 (GAL4 DNA-Bindungsdomäne) und pACT2 (GAL4 Aktivierungsdomäne) inseriert (Durfee et al., Genes. Dev., Bd. 7 (1993), S. 555–569). Doppelhybrid-Plasmide, die für das vollständige E1-Protein (Aminosäuren 1-649) kodierten, wurden auf ähnliche Weise konstruiert, mit der Ausnahme, dass der Vorwärtsprimer eine BamHI-Stelle anstelle einer NcoI-Stelle enthielt. In diesem Fall wurde das PCR-Produkt mit BamHI geschnitten und im Raster in die BamHI-Stellen von pAS1 und pACT2 inseriert. Doppelhybrid-Plasmide, die einen mutierten E1-ORF trugen (P479S, K484E oder K484Q) wurden auf ähnliche Weise erzeugt, wobei aber ein mutiertes E1-Gen als Matrize für die PCR verwendet wurde (vergl. die nachstehende Beschreibung von E1-Mutationen). Die verschiedenen Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die verwendet wurden, sind nachstehend angegeben. Vorwärtsprimer:
Rückwärtsprimer:
Unter Anwendung einer abweichenden Vorgehensweise wurden in zwei Schritten von pAS1 und pACT2 abgeleitete Plasmide, die für die E1-Sequenzen 353-572, 353-536 und 353-458 kodierten, konstruiert. In der ersten Stufe wurden E1-Sequenzen durch PCR unter Verwendung der folgenden beiden Primer amplifiziert:
Bei den Matrizen für die PCR handelte es sich um von pCR3 abgeleitete Plasmide, die einen geschnittenen E1-ORF exprimierten: E1-Aminosäuren 1-572, 1-536 oder 1-458. Eines der beiden für die PCR-Amplifikation verwendeten Oligonucleotide hybridisiert über dem Codon 353 von E1. Das andere Oligonucleotid hybridisiert in der Polylinker-Region von pCR3, strangabwärts vom geschnittenen E1-ORF. Die PCR-Produkte wurden mit NcoI und BamHI verdaut und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen von pAS1 und pACT2 kloniert. Die Plasmide, die als Matrizen bei diesen drei PCR-Reaktionen verwendet wurden, wurden durch Amplifikation des E1-ORF mit dem folgenden Oligonucleotid konstruiert: CAAGGATGGCGGACGATTCA (SEQ ID NO: 15) (ATG von E1 ist unterstrichen) und eines der drei Oligonucleotide, das über dem Codon 572, 536 bzw. 458 von E1 hybridisiert. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide sind nachstehend angegeben:
Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in pCR3 unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) kloniert.
C. Plasmide für die vorübergehende HPV-Replikation
Die Plasmide, die bei den Assays auf vorübergehende HPV-DNA-Replikation verwendet wurden, um E1 und E2 in transfizierten Zellen zu exprimieren, leiteten sich alle von pCR3 ab: pCR3-E1. pCR3-FLAG-E1 (Wildtyp- und mutantes E1) und pCR3-E2. Diese Plasmide wurden vorstehend beschrieben.
Das Plasmid pN9 (Lu et al., J. of Virol., Bd. 67 (1993), S. 7131–7139) wurde von D. McCance (Universität von Rochester) erhalten. Es enthält die vollständige Replikationsursprungsstelle von HPV-11 (Nucleotide 7884 bis 61) bei Klonierung in pBluescriptII-SK⁺ (Stratagene).
D. Plasmide für die Expression von Thioredoxin-Fusionsproteinen
Drei Fragmente von E1 (a. a. 353-416/353-431/353-438) wurden in E. coli als Fusionsproteine mit Thioredoxin (TRX) exprimiert. Die Plasmide zur Expression dieser Fusionsproteine wurden durch PCR-Amplifikation des entsprechenden Bereiches des E1-ORF unter Verwendung einer Untergruppe der vorstehend beschriebenen Vorwärts- und Rückwärtsoligonucleotide konstruiert. PCR-Produkte wurden mit NcoI und BamHI verdaut und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen des Plasmids pEP-32a-c(+) (Novagen), das für TRX kodiert, subkloniert.
Beispiel 4: Positionsgerichtete Mutagenese
Eine positionsgerichtete Mutagenese von E1 wurde mit dem QuickChange Site-Directed Mutagenesekit (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für jede Mutagenese wurde ein Paar von komplementären Oligonucleotiden verwendet. Für jedes Paar ist die Sequenz des Oligonucleotids, die dem sense-Strang entspricht, nachstehend angegeben. Die erhaltene Aminosäuresubstitution ist ebenfalls angegeben.
Die 3-fache Punktmutation in der HPV-11-Ursprungsstelle wurde in das Plasmid pN9 unter Verwendung des folgenden Oligonucleotids eingeführt:
sowie in das komplementäre Produkt (die mutanten Nucleotide sind unterstrichen).
Beispiel 5: E1-Ursprungsstellen-Bindungsassay
Das TNT-gekuppelte Retikulozytenlysat-System (Promega) wurde zur in vitro-Erzeugung des E1-Proteins durch gekuppelte Transkription/Translation verwendet. Das Lysat wurde mit 2 μg des entsprechenden Plasmids pro 50 μl TNT-Retikulozytenlysat und gemäß dem vom Hersteller angegebenen Verfahren angesetzt. Falls erforderlich, wurde das E1-Protein radioaktiv durch Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert. Bindungsreaktionen wurden durch Vermischen von 30 μl Lysat mit einem Gehalt an E1, 200 bis 400 ng einer ³³P-radioaktiv markierten DNA-Sonde und 7,5 μl 10 × DNA-Bindungspuffer (200 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) in einem Endvolumen von 75 μl durchgeführt. Man ließ die Bindungsreaktionen bei der angegebenen Temperatur 90 Minuten ablaufen. Sofern angegeben, wurden ATP (oder ein verwandtes Nucleotid) und MgCl₂ den Bindungsreaktionen in einer Endkonzentration von 5 mM bzw. 3 mM zugesetzt. DNA-Protein-Komplexe wurden entweder mit dem monoklonalen anti-FLAG-M2-Antikörper (Eastman Kodak) bei Verwendung von FLAG-markiertem E1 oder mit dem polyklonalen K72-Antikörper, der in Kaninchen gegen ein von den 14 C-terminalen Aminosäuren von HPV11-E1 abgeleitetes Peptid erzeugt worden war, immunopräzipitiert. Die Aminosäuresequenz dieses Peptids ist: QAFRCVPGSVVRTL (SEQ ID NO: 79). Vor der Verwendung bei der Immunopräzipitation wurden die Antikörper vorher entweder an Protein G-Sepharose-Perlen (bei Verwendung von anti-FLAG) oder an Protein A-Sepharose-Perlen (K72) gebunden. Eine Immunopräzipitation von Protein-DNA-Komplexen wurde 1 Stunde bei der Bindungsreaktionstemperatur durchgeführt. Die Komplexe wurden 3-mal mit 200 μl Waschpuffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) gewaschen. In diesen Komplexen vorhandene DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol in Gegenwart von Träger-Hefe-tRNA gefällt. Die gefällten, radioaktiv markierten DNA-Fragmente wurden an einem 5% Polyacrylamid-TBE-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die radioaktiv markierte Sonde, die bei diesen Experimenten verwendet wurde, bestand aus zwei DNA-Fragmenten und wurde in zwei Schritten hergestellt. Beim ersten Schritt wurde das Plasmid pN9 durch Verdau mit XmaI linearisiert und die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in Gegenwart von 5 μCi α³²P-dCTP und 0,1 mM jeweils an dTTP, dATP und dGTP markiert. Markierte DNA wurde an QlAquick-PCR-Reinigungssäulen (QIAGEN) gereinigt. Im zweiten Schritt wurde lineares, radioaktiv markiertes pN9 mit Pvull verdaut, um zwei markierte Fragmente zu erzeugen: ein 370 bp-Fragment, das die HPV-11-Replikationsursprungsstelle enthält, und 186 bp-Kontrollfragment, dem die Ursprungsstelle fehlt.
Beispiel 6: E2-abhängiger E1-Ursprungsstellen-Bindungsassay
Die Bedingungen für die Bildung des ternären E1-E2-ori-Komplexes waren im Wesentlichen die gleichen, wie sie vorstehend für den E1-Ursprungsstellen-Bindungsassay beschrieben wurden. Die einzigen Hauptunterschiede bestanden darin, dass 7,5 μl in vitro-translatiertes E2-Protein der Bindungsreaktion zugesetzt wurden und das E1-Protein von voller Länge (Aminosäuren 1-649) bei diesen Experimenten verwendet wurde. Wildtyp- und mutante E1-Proteine, die bei diesen Experimenten verwendet wurden, wurden aus Plasmiden, die von pCR3 abgeleitet waren, erzeugt. Zu kleineren Modifikationen gehörte die Tatsache, dass in vitro- Translationen mit der doppelten Menge an DNA (2 μg/25 μl Reaktionsgemisch) angesetzt wurden und dass pro Assay nur 100 ng Sonde verwendet wurden.
Beispiel 7: Reinigung von Trx-E1-Fusionsproteinen aus E. coli
E. coli-Zellen (BL21::DE3 [pLysS]), die ein Plasmid enthielten, das für eines der drei TRX-E1-Fusionsproteine (vergl. oben) kodierte oder nur für ein TRX [pET32a-c(+), Novagen] kodierte, wurden über Nacht in LB-Medium mit einem Gehalt an Ampicillin (100 μg/ml) und Chloramphenicol (34 μg/ml) gezüchtet. 3 ml dieser über Nacht gezüchteten Kulturen wurden mit frischem Medium (120 ml) auf das 40-fache verdünnt und bei 30°C bis zum Erreichen von OD₆₀₀ ≅ 0,5 inkubiert. Die Proteinexpression wurde sodann mit 1 mM IPTG 3 Stunden bei 30°C induziert (bis die Kulturen OD₆₀₀ ≅ 2,0 erreichten). Bakterienzellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation mit 5 000 × g geerntet. Bakterienpellets wurden in 1 ml Lysispuffer (60 mM Tris, pH-Wert 7,6, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) resuspendiert und der Ultraschallbehandlung unterzogen. Die erhaltenen Lysate wurden mit 16 000 × g zentrifugiert, um Zellbruchstücke und unlösliches Material zu entfernen. Die Überstände wurden auf voräquilibrierte Ni-NTA-Schleudersäulen (QIAGEN) aufgesetzt und gemäß den Angaben des Herstellers für die Reinigung von nativem Protein gereinigt. Kurz zusammengefasst, nach dem Aufsetzen wurden die einzelnen Säulen mit 2 × 600 μl Waschpuffer (60 mM Tris, pH-Wert 7,6, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) gewaschen und die gebundenen Proteine wurden mit 2 × 200 μl Elutionspuffer (60 mM Tris, pH-Wert 7,6, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol) eluiert. Die gereinigten Proteine wurden sodann mit 10%-SDS-PAGE analysiert. Sämtliche Fusionsproteine wurden anschließend mit Elutionspuffer auf eine Endkonzentration von 500 ng/μl verdünnt.
Beispiel 8: Vorübergehender HPV-DNA-Replikationsassay
CHO-K1 (bezogen von der American Type Culture Collection) wurde in 35 ml-Gewebekulturschalen in Ham F12-Medium mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum und Gentamicinsulfat bis zu einer Konfluenz von 40–60% gezüchtet. Die Zellen wurden mit 250 ng pCR3-E1- (oder pCR3-FLAG-E1-Mutante), 25 ng pCR3-E2- und 250 ng pN9-Plasmiden unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BRL) transfiziert. Die Anwesenheit des FLAG-Epitops am N-Terminus von E1 beeinflusst dessen Fähigkeit zur Unterstützung der vorübergehenden HPV-DNA-Replikation nicht (Daten nicht aufgeführt). Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion geerntet und die gesamte DNA wurde unter Verwendung des QlAmp-Blood-Kits (Qiagen) isoliert. Replizierte pN9-Plasmid-DNA wurde durch PCR-Amplifikation eines eine Ursprungsstelle enthaltenden Fragments unter Verwendung von Dpn1-verdauter gesamter DNA als Matrize und des folgenden Primerpaars nachgewiesen:
(entsprechend den Nucleotiden 7885-7913 des HPV-11-Genoms) und
(entsprechend den Nucleotiden 1848-1820 von pSK⁺). Als Kontrolle wurde ein Fragment des pCR3-E1-Plasmids in der gleichen PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar, das innerhalb des E1-ORF hybridisiert, amplifiziert: GCTTTGGGCTGTCATTTG (SEQ ID NO: 76) und TGTCAGGTGGCCCTACAA (SEQ ID NO: 77) (entsprechend den Nucleotiden 1475-1492 bzw. 2275-2258 des HPV-11-Genoms). Die PCR-Bedingungen bestanden aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt für 1 Minute bei 95°C, anschließenden 20 Runden mit einer Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden, einer Anlagerung für 1 Minute bei 51°C, für 90 Sekunden bei 72°C und einer endgültigen 3-minütigen Erweiterung bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden durch Zugabe von [α³³P]dCTP zu den PCR-Reaktionsgemischen radioaktiv gemacht und durch Agarose-Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 9: E1/DNA-Koimmunopräzipitationsassay
1. Bindung
Auf einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden wurden 5 μl einer Verbindung (oder eines Gemisches) in einer Menge von 150 μg/ml in DMSO zu 60 μl Bindungsmastergemisch (20 mM Tris, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM ATP, 3 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 ng HPV11-ori+Sonde) gegeben. Die Bindungsreaktionen wurden durch Zugabe von 10 μl von in vitro translatiertem HPV11-E1 (72-649) gestartet. Die Platte wurde verschlossen, dann 5 Minuten bewegt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
2. Immunoabfangvorgang
Vorherige Bindung von Antikörpern an Protein-A-Sepharose:
In jede Testvertiefung wird 1 μl polyklonaler anti-E1-Antikörper zu 10 μl 10% Protein-A-Sepharose-Aufschlämmung (20 mM Tris, pH-Wert 7,0) gegeben. Die Aufschlämmung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur bewegt. Die Perlen werden durch rasche Zentrifugation pelletisiert, mit 10 μl 1 × Bindungspuffer gewaschen und sodann in 50 μl 1 × Bindungspuffer (+5 mM ATP + 1 mM DTT) resuspendiert.
Abfangvorgang:
In einer zweiten Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden werden pro Vertiefung 50 μl vorher gebundene K71- oder K72-Antikörper-Protein A-Sepharose vorgelegt. Nach Beendigung der Bindungsreaktion wird das gesamte Bindungsreaktionsgemisch auf die Platte mit einem Gehalt an den Antikörper-Protein A-Sepharose-Perlen übertragen. Die Platte wird anschließend verschlossen, bei 37°C inkubiert und 1 Stunde bewegt.
Die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten polyklonalen anti-E1-Antikörper werden hier als K71 und K72 bezeichnet. Es handelt sich um Antiserum, das im Kaninchen gegen ein Peptid erzeugt worden ist, das den letzten (C-terminalen) 14 Aminosäuren von HPV11-E1 entspricht.
3. Isolierung von Komplexen durch Filtration
Zunächst wird eine Millipore-MHVB-N45 Filtrationspiatte mit 96 Vertiefungen durch Filtration von 100 μl 1 × Bindungspuffer äquilibriert. Komplexe werden sodann übertragen, filtriert und 3-mal mit 200 μl 1× Bindungspuffer gewaschen. Die restliche Flüssigkeit wird durch Abtupfen der Platte mit einem Papierhandtuch entfernt. Schließlich werden pro Vertiefung 150 μl MicroScint 20 zugesetzt und die Zählereignisse werden durch TopCount unter Verwendung eines ³³P-Verfahrens ermittelt.
Ergebnisse
E1-E1-Wechselwirkung in Hefe (1)
Das Doppelhybridsystem (Fields und Song, Nature, Bd. 340 (6230) (1989), S. 245–246 und Durfee, a. a. O.) wurde zum Testen verwendet, ob HPV11-E1 eine Selbstassoziation in Hefe durchführen kann, und um eine Domäne von E1, die an dieser Wechselwirkung beteiligt ist, zu kartieren (1). Wie aus 1A ersichtlich ist, ist ein Fusionsprotein, das aus dem gesamten E1-Molekül (Aminosäuren 1-649) in Fusion mit der DNA-Bindungsdomäne (BD) von GAL4 besteht, dazu befähigt, die Transkription des UAS_Gal-gesteuerten LacZ-Reportergens im Hefestamm Y153 zu aktivieren. Kürzere Fusionsproteine, denen die N-terminalen 71 Aminosäuren von E1 fehlten, aktivierten die Transkription nicht, was darauf hinweist, dass der N-Terminus von E1 eine Transkriptionsaktivierungsdomäne enthalten kann. Diese kürzeren Fusionsproteine konnten zum Test auf eine Wechselwirkung mit dem gesamten E1-Protein in Fusion mit der GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) verwendet werden (1A). Die Wechselwirkung dieser kürzeren Fusionsproteine mit dem gesamten E1-Molekül führte nur zu geringfügigen (wenngleich reproduzierbar über dem Hintergrund liegenden) Konzentrationen an β-Galactosidase (1A und aufgeführte Daten), was darauf hinweist, dass E1 in Hefe einer Selbstassoziierung unterliegen kann. Eine Reihe von Deletionen wurden dazu herangezogen, die Wechselwirkungsdomäne mit der C-terminalen Region von E1 (Aminosäuren 353-649) zu kartieren. Eine Selbstassoziation von E1 war zwischen Fusionsproteinen, die nur den C-terminalen Bereich von E1 enthielten (Aminosäuren 330-649 und 353-649) leichter nachweisbar (1B). Eine Reihe von Deletionen wurde dazu herangezogen, die Position der E1-Wechselwirkungsdomäne näher zu bestimmen (1B). Auf diese Weise wurde eine E1-Wechselwirkungsdomäne mit einer Länge von 64 Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 353 und 416 identifiziert (1B). Ein C-terminales E1-Fragment (Aminosäuren 435-649), dem diese Domäne mit 64 Aminosäuren fehlte, war nicht zu einer Assoziation mit E1 (330-649) befähigt (1B), obgleich es die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit E2 behielt. Die kleine E1-E1-Wechselwirkungsdomäne (353-416) war nicht nur zu einer Wechselwirkung mit einem größeren E1-Fragment (330-649), sondern auch zu einer Wechselwirkung mit sich selbst befähigt (1C). Dieses letzte Ergebnis zeigt, dass die Reste 353-416 notwendig und ausreichend für die homotypische Wechselwirkung von E1 sind. Die Wechselwirkung dieser kleinen Domäne mit E1 (330-649) oder mit sich selbst führte zu geringeren Konzentrationen an β-Galactosidase-Aktivität als die Wechselwirkung zwischen größeren E1-Fragmenten (353-649 und 330-649) (1C). Dieses Ergebnis stimmt mit der Annahme überein, dass die Reste zwischen den Aminosäuren 435-649 (obgleich diese für eine Wechselwirkung mit E1 nicht ausreichen) zur Festigkeit der Wechselwirkung beitragen können.
Rolle der ATP-Bindungsdomäne von E1 bei der Selbstassoziation (2)
Die vorstehend vorgelegten Ergebnisse sprachen für die Möglichkeit, dass die Reste 435-649 von E1, die sich in C-terminaler Position zur E1-E1-Wechselwirkungsdomäne (353-416) befinden, auch zur Stärke der E1-E1-Wechselwirkung in Hefe beitragen können. Da die Reste 435-649 die ATP-Bindungsdomäne von E1 umfassen, mutierten wir drei hochgradig konservierte Aminosäuren, die an der ATP-Bindung beteiligt sind, und testeten den Einfluss dieser Aminosäuresubstitutionen auf die Selbstassoziation von E1 in Hefe. Diese Substitutionen ersetzten zwei Reste des Walker-A-Motivs (P-Schleife) von E1: Prolin 479 wurde durch Serin ersetzt und Lysin 484 wurde durch Glutaminsäure und Glutamin ersetzt. Wie aus 2 ersichtlich ist, führten alle drei Substitutionen zu einer Verringerung der E1-E1-Wechselwirkung in Hefe. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Unversehrtheit der ATP-Bindungsdomäne für die Selbstassoziation des E1-Proteins von Bedeutung ist.
Domänen von E1, die für die in vitro-Bindung an der viralen Ursprungsstelle erforderlich sind (3 und 4).
Die vorstehenden Studien in Hefe ließen darauf schließen, dass mindestens zwei Regionen von E1 an der Selbstassoziation teilnehmen: eine Selbstassoziationsdomäne (Aminosäuren 435-416) und die ATP-Bindungsdomäne. Um die Rolle dieser beiden Regionen bei der E1-Oligomerisation in vitro zu untersuchen, wendeten wir einen Test an, der die Bindung von E1 an die HPV-Ursprungsstelle nachweist. In Analogie zu BPV-E1 nahmen wir an, dass die Oligomerisation von E1 bei der Bindung an die Ursprungsstelle eintritt. Bei diesem Test wird HPV11-E1-Protein, das durch gekuppelte Transkription/Translation in Kaninchen-Retikulozytenlysat synthetisiert wird, mit einem Gemisch von zwei radioaktiven DNA-Fragmenten inkubiert, von denen eines die HPV11-Ursprungsstelle enthält. E1-Protein-DNA-Komplexe, die bei dieser Reaktion gebildet werden, werden sodann mit einem Antikörper gegen E1 immunopräzipitiert und die kopräzipitierte DNA wird durch Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht. Bei diesen Experimenten wurde eine Reihe von geschnittenen E1-Proteinen neben dem Wildtypprotein verwendet, um die minimale Domäne zu definieren, die zur Bildung eines Komplexes mit der Ursprungsstelle befähigt ist. Sämtliche E1-Proteine wurden in ähnlichen Konzentrationen exprimiert (Daten nicht aufgeführt). Es wurden drei Feststellungen gemacht. Erstens konnte unter Verwendung von Wildtyp-E1 nur eine geringe Menge der E1-ori-Komplexe unter den Testbedingungen gebildet werden (3A). Dies ist vermutlich auf den großen Überschuss an Konkurrenz-DNA, die bei diesen Reaktionen vorhanden ist (in Form der zur Programmierung der Lysate verwendeten Plasmide) und auf die geringe Sequenzspezifität von E1 für die Ursprungsstelle zurückzuführen. Zweitens stellten wir fest, dass ein mutantes E1-Protein, dem die N-terminalen 71 Reste fehlen, eine erhöhte Affinität (etwa 5-fach) für die Ursprungsstelle aufwies, verglichen mit dem Wildtypprotein (3A) (nachstehend als E1* bezeichnet). Der Mechanismus, gemäß dem die Deletion des N-Terminus die Affinität von E1 für die Ursprungsstelle erhöht, wird noch untersucht. Die Bindung des geschnittenen E1-Moleküls an die Ursprungsstelle war spezifisch, da sie durch zwei doppelte Aminosäuresubstitutionen in der E1-DNA-Bindungsoberfläche beeinflusst wurde (3B). Diese beiden Aminosäuresubstitutionen waren ähnlich mit denen in BPV-1-E1, die die Bindung von BPV-E1 an die Ursprungsstelle beseitigen (Thorner et al., J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 2474–2482). Die Spezifität wurde auch nachgewiesen, indem gezeigt wurde, dass eine 3-fache Mutation an der Ursprungsstelle die E1-Bindung verringerte (3C). Von dieser 3-fachen Punktmutation wurde früher durch DNase I-Fußabdruckanalyse gezeigt, dass sie in der E1-Bindungsstelle der Ursprungsstelle liegt und die Bindung von E1 beeinflusst (Sun et al., Virology, Bd. 216 (1995), S. 219–222). Die dritte Beobachtung, die gemacht wurde, bestand darin, dass die kleinere Domäne von E1, die an die Ursprungsstelle binden konnte, aus den Aminosäuren 191-649 bestand (4). Eine weitere Deletion dieser Domäne am N- oder C-Terminus beseitigte die Ursprungsstellenbindung (4). Die einfachste Interpretation dieser Ergebnisse besteht darin, dass die Bindung und Oligomerisation von E1 an die Ursprungsstelle eine DNA-Bindungsoberfläche (positioniert zwischen den Resten 191 und 300) und eine Oligomerisationsdomäne (Aminosäuren 353-649) erforderlich macht.
Ein Fusionsprotein, das die E1-E1-Wechselwirkungsdomäne enthält, hemmt die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle (5).
Wenn die Aminosäuren 353-431 von E1 für eine E1-E1-Wechselwirkungsdomäne, die für die Oligomerisation an der Ursprungsstelle erforderlich ist, kodieren, wäre anzunehmen, dass diese Domäne, eine Variante, ein Derivat oder ein Fragment davon allein bei Bereitstellung im Überschuss in trans-Stellung die Bindung von E1* (72-649) an die Ursprungsstelle hemmen sollten. Um diese Hypothese zu testen, wurden Fragmente von E1, nämlich 353-416, 353-431 und 353-438, in E. coli exprimiert und in löslicher Form als Fusionsprodukte mit Thioredoxin gereinigt. In Abwesenheit von Thioredoxin als Fusionspartner waren alle drei E1-Fragmente unlöslich (Daten nicht aufgeführt). Die Fusionsproteine enthielten eine Polyhistidinsequenz, die ihre Reinigung durch Nickel-Affinitätschromatographie ermöglichte (5A). Die drei Fusionsproteine wurden sodann auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von E1* (72-649) an die Ursprungsstelle in einer Konzentration von 8 μM (etwa 300-facher molarer Überschuss gegenüber E1) getestet. Wie aus 5B ersichtlich ist, hemmten TRX-E1 (353-431) und TRX-E1 (353-438) die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle. TRX-E1 (353-416) bewirkte in einer Konzentration von 8 μM keine Hemmung, vermutlich aufgrund der Tatsache, dass dieses Fusionsprotein einer starken Proteolyse unterliegt oder eine geringere Affinität für E1 aufweist, als durch die beiden Doppelhybridstudien nahegelegt wurde (2B). Unter den gleichen Bedingungen hatte TRX allein keinen Einfluss (5B). Bei diesen Experimenten wurden zwei unabhängige Präparate eines jeden Fusionsproteins unter Erzielung ähnlicher Ergebnisse getestet (1A und nicht aufgeführte Daten). Die 50%-Hemmkonzentration für TRX-E1 (353-431) wurde zu etwa 3 μM gemessen (5C). Diese Ergebnisse stützten die Annahmen, dass die Region A für die E1-Oligomerisation an der Ursprungsstelle erforderlich ist und dass E1 (353-431) für eine E1-E1-Wechselwirkungsdomäne kodiert.
Rolle von ATP und der E1-ATP-Bindungsdomäne bei der Ursprungsstellenbindung (6 und 7)
Da die Selbstassoziation von E1 in Hefe eine intakte ATP-Bindungsdomäne erfordert (vergl. die vorstehenden Ausführungen), untersuchten wir die Rolle von ATP/Mg bei der in vitro-E1-Ori-Komplexbildung. Dies wurde durch Ergänzen der Bindungsreaktionsgemische mit ATP/Mg in Konzentrationen von 5 bzw. 3 mM durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei drei verschiedenen Temperaturen (4, 23 und 37°C) durchgeführt. Wie aus 6A ersichtlich ist, wurde in Abwesenheit von ATP/Mg die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle bei einer hohen Temperatur (37°C) drastisch verringert. Diese Hemmung durch eine hohe Temperatur konnte durch Zugabe von ATP/Mg verringert werden (6A). Bei niedrigeren Temperaturen (23°C und 4°C) hatte ATP/Mg nur eine mäßige Wirkung. Verschiedene Typen von Nucleotiden wurden in Kombination mit Magnesium auf ihre Fähigkeit zur Stimulation der Bindung von E1 an die Ursprungsstelle getestet. ADP, jedoch nicht AMP oder Adenosin konnten anstelle von ATP verwendet werden (6B). Gleichermaßen konnten die drei übrigen Nucleotide (CTP, GTP, UTP) sowie sämtliche vier Desoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, TTP) die Bindung an die Ursprungsstelle stimulieren (6C). Zwei nicht-hydrolysierbare Analoge, nämlich ATP-γ-S und GTP-γ-S, wirkten ebenfalls stimulatorisch, was einen Hinweis dafür darstellte, dass die Bindung an das Substrat, jedoch nicht dessen Hydrolyse für die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle notwendig ist (6C).
Aminosäuresubstitutionen in der ATP-Bindungsdomäne von E1 wurden auf ihren Einfluss auf die E1-Bindung an die Ursprungsstelle getestet (7). Einige Substitutionen beeinflussten hochgradig konservierte Reste des Walker-A-Motivs (7A), das vermutlich an der Bindung des Triphosphatschwanzes des Substrat-Nucleotids beteiligt ist (Gorbalenya und Koonin, Current Opinion in Structural Biology, Bd. 3 (1993), S. 419–429). Wie aus 7B ersichtlich ist, verringerten diese Substitutionen, unter Einschluss von solchen, die die E1-Selbstassoziation in Hefe verhinderten (P479S, K484Q und K484E), die E1-Bindung an die Ursprungsstelle. Zusammen mit den vorstehend vorgelegten Ergebnissen, sprechen diese Befunde dafür, dass die ATP-Bindung dafür notwendig ist, dass E1 an die Ursprungsstelle bindet.
Bei diesen Experimenten testeten wir auch den Einfluss einer Veränderung von hochgradig konservierten Resten im Motiv C sowie von Phenylalanin 509 von E1. Diese Reste sind unter den Mitgliedern der Überfamilie 3 konserviert, jedoch ist ihre Funktion unbekannt. Wie aus 7B ersichtlich ist, beseitigte ein Ersatz dieser Aminosäuren durch Alanin nicht die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle, was dafür spricht, dass sie für diesen Vorgang und für die ATP-Bindung nicht wesentlich sind.
Die konservierte Region A von E1 ist für die E1-Bindung an die Ursprungsstelle notwendig (8)
Die E1-E1-Wechselwirkungsdomäne, die in Hefe kartiert worden war, bestand aus den Aminosäuren 353-416. Diese Region von E1 umfasst die konservierte Region A, eine von vier Regionen von hoher Sequenzähnlichkeit zwischen E1 von verschiedenen Papillomaviren und den großen T-Antigenen von SV40- und Polyomaviren (Clertant und Seif, 1984). Um festzustellen, ob diese Region für die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle wesentlich ist, wurden sechs unabhängige Aminosäuresubstitutionen in dieser Domäne erzeugt (F378A, Y380A, N389A, A390G, F393A, Q399A) (8A) und auf ihren Einfluss auf die E1-Ori-Komplexbildung getestet. Vier der sechs Substitutionen beeinflussen Reste, die zwischen Papilloma- und Polyomaviren unverändert sind (N389A, A390G, F393A, Q399A) (8A). Die anderen beiden Substitutionen (F378A und Y380A) beeinflussen hydrophobe Reste, die Bestandteil eines Zink-Bindungsmotivs im großen T-Antigen sind (8A), das für die Oligomerisation erforderlich ist (Loeber et al., J. Virology, Bd. 65 (6) (1991), S. 3167–3174). Obgleich dieses Zink-Fingermotiv in Papillomaviren nicht konserviert ist, liegen F378 und Y380 in einer Region von E1, von der wie bei der analogen Region im großen T vorhergesagt wird, dass sie sich zu einer alpha-Helix faltet (Daten nicht aufgeführt). Die Bindung dieser mutanten E1-Proteine an die Ursprungsstelle wurde sowohl bei 23°C in Abwesenheit von zugesetztem ATP/Mg als auch bei 37°C bei mit ATP/Mg ergänzten Reaktionsgemischen (5 bzw. 3 mM) getestet. Unter beiden Sätzen von Bedingungen waren die Ergebnisse sehr ähnlich. Drei der Substitutionen, nämlich Y380A, N389A und F393A verringerten in drastischer Weise die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle (8B). Zwei weitere Substitutionen, nämlich A390G und Q399A, waren ebenfalls schädlich und führten nur zu einer mäßigen Bindung von E1 an die Ursprungsstelle. Nur eine Substitution, nämlich F378A, hatte einen geringen Einfluss auf die E1-Bindung an die Ursprungsstelle. Diese Ergebnisse zeigen, dass die strukturelle Unversehrtheit der konservierten Region A von E1 für die Bindung von E1 an die Ursprungsstelle erforderlich ist.
Die konservierte Region A von E1 ist für die Bildung des ternären E1-E2-Ori-Komplexes notwendig (9A).
Um zu testen, ob die konservierte Region A von E1 für die E2-abhängige Bindung von E1 an die Ursprungsstelle notwendig ist, wurde ein ähnlicher Test wie der vorstehend beschriebene Test der Bindung von E1 an die Ursprungsstelle unter folgenden Änderungen herangezogen: E2, hergestellt durch in vitro-Translation wird dem Reaktionsgemisch zugesetzt und E1 von voller Länge (1-649) wird verwendet. Wie aus 9A ersichtlich ist, verringerten drei der Substitutionen (Y380A, N389A, F393A) die Komplexbildung in drastischer Weise. Zwei weitere Substitutionen (A390G und Q399A) hatten einen weniger stark ausgeprägten Einfluss. Eine Substitution, nämlich F378A, hatte nur einen mäßigen Einfluss auf die E1-E2-Ori-Komplexbildung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die strukturelle Unversehrtheit der konservierten Region A für die Bildung des ternären E1-E2-Ori-Komplexes erforderlich ist.
Einfluss von Substitutionen in der konservierten Region A von E1 auf die vorübergehende HPV-DNA-Replikation (9B)
Die mutanten E1-Proteine, die Substitutionen in der konservierten Region A trugen, wurden zusammen mit E2 auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der Replikation eines eine Ursprungsstelle enthaltenden Plasmids in vorübergehend transfizierten Zellen getestet. Wie aus 9B ersichtlich ist, waren drei der E1-Mutanten, nämlich F378A, A390G und Q399A, zur Unterstützung der HPV-DNA-Replikation befähigt, wenngleich auch auf verringerten Niveaus, verglichen mit Wildtyp-E1 im Fall von A390G und Q399A. Drei der E1-Mutanten, nämlich Y380A, N389A und F393A, waren zur Unterstützung der Replikation unfähig. Diese Ergebnisse zeigen, dass die konservierte Region A von E1 für die vorübergehende HPV-DNA-Replikation notwendig ist. Die Fähigkeit von E1-Mutanten zur Unterstützung der vorübergehenden HPV-DNA-Replikation korrelierte gut mit ihrer Fähigkeit zur Bindung an die Ursprungsstelle, entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart von E2 (vergl. die vorstehenden Ausführungen). Ein möglicher Vorbehalt bei diesen Experimenten besteht darin, dass die Stabilität der verschiedenen mutanten E1-Proteine, verglichen mit der Stabilität von Wildtyp-E1, aufgrund der niedrigen Expressionsgrade von E1 nicht bestimmt werden konnte (Daten nicht aufgeführt). Es ist daher möglich, dass der niedrige Replikationsgrad, der bei einigen mutanten Proteinen beobachtet wurde, auch mit einem Einfluss auf die Proteinakkumulation im Zusammenhang steht.
Beispiel 10: E1-Oligomerisationsassay unter Verwendung von rekombinantem E1-Protein
Es handelt sich um den gleichen Assay wie in Beispiel 9, der aber mit 75 ng rekombinantem, gereinigtem, His-markiertem HPV11-E1* (72-649), das in mit Baculovirus infizierten Sf21-Insektenzellen und 200 ng Plasmid-DNA als Konkurrent gebildet worden war, durchgeführt wurde. Ferner wurde dem Bindungsgemisch CHAPS in einer Endkonzentration von 0,15% zugesetzt.
Beispiel 11: Reinigung von rekombinantem E1* (72-649)
E1* wurde in Sf21-Insektenzellen durch Infektion mit rekombinanten Baculoviren, die ein mit Histidin markiertes (6 Histidinreste) E1* (72-649) exprimieren, erzeugt. Infizierte Zellen wurden durch Zentrifugation 48 Stunden nach der Infektion geerntet und das Volumen des Zellpellets wurde gemessen. Das Zellpellet wurde auf Trockeneis eingefroren und bei –80°C aufbewahrt.
Zur Reinigung wurde das Zellpellet aufgetaut und in 1 Volumenteil (relativ zum Volumen des Pellets) hypotonischem Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, Antipain, Leupeptin und Pepstatin in einer Menge von 1 μg/ml und 1 mM Pefabloc) resuspendiert. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension 20 Hüben eines Dounce-Homogenisators mit Pistill B unterzogen. Die Kerne wurden sodann durch 20-minütige Zentrifugation bei 2 500 g und 4°C gewonnen und in 1,5 Volumenteilen (relativ zum anfänglichen Volumen des Zellpellets) in Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, Antipain, Leupeptin und Pepstatin in einer Menge von 2 μg/ml und 2 mM Pefabloc) resuspendiert. 1,4 Volumenteile Puffer C (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, 900 mM NaCl) wurden sodann zugegeben und die Suspension wurde vermischt und 30 Minuten bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Der Extrakt wurde 45 Minuten bei 4°C mit 148 000 g zentrifugiert, um die Bruchstücke zu pelletisieren. Der Überstand wurde gewonnen und mit Glycerin in einer Endkonzentration von 10% versetzt, wonach er auf Trockeneis eingefroren und bis zur Chromatographie bei –80°C aufbewahrt wurde.
Für die Chromatographie wurde der Zellextrakt aufgetaut und auf eine 5 ml-Hi-Trag-Säule (Pharmacia Biotech), die mit Nickel beladen und mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 10% Glycerin äquilibriert worden war, aufgesetzt. Nach dem Aufsetzen des Extrakts wurde die Säule mit 7 bis 8 Volumenteilen Äquilibrierungspuffer mit einem Gehalt an 150 mM Imidazol gewaschen. Das gebundene E1*-Protein wurde sodann mit Äquilibrierungspuffer mit einem Gehalt an 250 mM Imidazol eluiert.
Beispiel 12: In vitro-Oligomerisation von E1
Zum Nachweis der in vitro-El-Oligomerisation bedienten wir uns des mit Sulfhydryl reagierenden Vernetzungsmittels Bismaleinimidohexan (BMH, Pierce). ³⁵5-markiertes E1*-Protein (72-649), das durch in vitro-Transkription/Translation hergestellt worden war (TNT-gekuppeltes Retikulozytenlysat-System, Promega), wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 ng/ml einzelsträngiger (ss) DNA (60-mer, entsprechend den Nucleotiden 7902 bis 34 der HPV-11-Ursprungsstelle) 1 Stunde bei zwei verschiedenen Temperaturen, nämlich 23 und 37°C, inkubiert (Bindungsbedingungen am Schluss: 12,5 μl translatiertes E1 in einem Endvolumen von 37,5 μl mit einem Gehalt an 20 mM Tris, pH-Wert 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM ATP, 3 mM MgCl₂). Die Vernetzung wurde durch Verdünnen der Bindungsreaktionsgemische auf das 13-fache mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 100 μM BMH durchgeführt. Die Vernetzungsreaktionen wurden nach 1 Minute durch Zugabe von DTT bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM gestoppt. E1-Proteine wurden sodann mit einem polyklonalen Antikörper gegen die 14 C-terminalen Aminosäuren von HPV-11 immunopräzipitiert und durch Gelelektrophorese (3% Weber-Osborn-Polyacrylamidgel (Weber und Osborn, 1969)) und Autoradiographie analysiert. Unter diesen Bedingungen stimulierte einzelsträngige DNA in starkem Maße die Vernetzung von E1 zu Oligomeren (10). Fünf verschiedene Proteinbanden, die den Oligomeren von E1 entsprachen, wurden zusätzlich zu monomerem E1 festgestellt. Diese oligomere E1-Spezies wanderte im Vergleich zu Molekulargewichtsstandards zu den erwarteten Positionen für Dimere, Trimere, Tetramere, Pentamere und Hexamere (Daten nicht aufgeführt). Entsprechendes galt bei Durchführung der Vernetzungsexperimente mit geschnittenen E1-Proteinen (vergl. die nachstehenden Ausführungen), so dass ausgeschlossen werden konnte, dass Proteine aus dem Retikulozytenlysat Bestandteil dieser Komplexe waren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass HPV-11-E1 die Fähigkeit besitzt, bei Bindung von einzelsträngiger DNA Hexamere zu bilden. Schließlich haben wir gezeigt, dass die Oligomerisation von E1 durch ss-DNA-Oligonucleotide stimuliert werden konnte, die sich nicht von der HPV-Ursprungsstelle ableiteten, was darauf hinweist, dass die Bindung von E1 an ss-DNA weitgehend sequenzunabhängig ist (Daten nicht aufgeführt).
Der C-Terminus von E1 reicht für die Oligomerisation aus.
Sodann verwendeten wir einen Satz von geschnittenen E1-Proteinen (11), die durch in vitro-Translation hergestellt worden waren, zur Kartierung der minimalen Domäne von E1, die zur Oligomerisation befähigt ist. Es wurde festgestellt, dass die Reste 353-649 von E1 zur in vitro-Bildung von Oligomeren ausreichen. Interessanterweise waren die Oligomerisationsgrade von E1 (330-649) und E1 (353-649) in Abwesenheit von einzelsträngiger DNA im Wesentlichen gleich und wurden durch Zugabe von ss-DNA nicht erhöht. Die Tatsache, dass der C-Terminus von E1 "konstitutiv" oligomerisiert, liefert eine plausible Erklärung dafür, dass diese Domäne im Gegensatz zum vollständigen Protein im Hefe-Doppelhybrid-System leicht eine Selbstassoziation eingehen konnte. Das kleinste E1-Protein, dessen Oligomerisation von ss-DNA abhängig war, umfasste die Aminosäuren 191-649. Daher spielt anscheinend die Region zwischen den Resten 191 und 330 eine kritische Rolle bei der Hemmung der Oligomerisation der C-terminalen Domäne (330-649) und bei der Entwicklung der DNA-Empfindlichkeit.
Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der ATP-Bindungsdomäne von E1 auf die Oligomerisation
Die Region von E1, die für die Oligomerisation ausreicht (Reste 353-649) umfasst die ATP-Bindungsdomäne. Wir untersuchten die Rolle der ATP-Bindungsdomäne auf die Oligomerisation von E1, indem wir den Einfluss von Mutationen testeten, die hochgradig konservierte Reste, die an der ATP-Bindung beteiligt sind, verändern. Diese mutanten E1*-Proteine (72-649), die durch in vitro-Translation synthetisiert wurden, tragen Aminosäuresubstitutionen in einem von drei Motiven mit den Bezeichnungen A, B und C, die die ATP-Bindungsdomäne von E1 und von anderen Mitgliedern der Überfamilie 3 von NTP-Bindungsproteinen charakterisieren (12A). Die Motive A und B entsprechen den klassischen Walker-A- und B-Motiven, die zusammen ATP als Magnesium-Chelat binden. Die Reste im Motiv A, auch als die Phosphat-Bindungsschleife (P-Schleife) bekannt, treten mit dem Triphosphatschwanz von ATP in Wechselwirkung. Das Motiv B ist an der Koordination des mit dem Substratnucleotid assoziierten Magnesiumions beteiligt. Die genaue Funktion des konservierten Motivs C ist unbekannt, es wurde jedoch die Auffassung vertreten, dass es auch bei der Bindung von ATP beteiligt sein könnte. Ein weiteres mutantes E1*-Protein wurde ebenfalls getestet, bei dem ein hochgradig konservierter Rest, nämlich F509, der zwischen den Motiven B und C liegt und dessen Funktion unbekannt ist, verändert wurde. Mit Ausnahme der F509A-Substitution verringerten sämtliche übrigen Substitutionen die E1-Oligomerisation in unterschiedlichem Maße (12B). Substitutionen im Motiv A hatten einen stärkeren Einfluss, was darauf hinweist, dass die strukturelle Unversehrtheit der P-Schleife für die Oligomerisation wesentlich ist. Substitutionen in den Motiven B oder C verringerten die Oligomerbildung, beseitigten sie aber nicht vollständig. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die strukturelle Unversehrtheit der ATP-Bindungsdomäne von E1 für die Oligomerisation wesentlich ist. Die ATP-Bindungsdomäne könnte zur Bindung von ATP erforderlich sein, das allosterisch die Oligomerisation regulieren könnte. Alternativ oder zusätzlich könnte die Unversehrtheit der ATP-Bindungsdomäne für die einwandfreie Faltung/Stabilität der gesamten C-terminalen Domäne erforderlich sein. Jedoch lässt die Tatsache, dass sämtliche Substitutionen, die die Oligomerisation beeinflussen, mit Ausnahme von K484E und K484Q, die Bindung an E2 nicht beeinflussen (Titolo et al., 1999) darauf schließen, dass diese Substitutionen die Gesamtstruktur der C-terminalen Domäne nicht drastisch verändern.
Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der konservierten Region A von E1 auf die Oligomerisation
Wir untersuchten anschließend den Einfluss von Aminosäuren in der konservierten Region A von E1 auf ihren Einfluss auf die Oligomerisation des Proteins, wobei wir den Vernetzungstest verwendeten. Sechs mutante E1*-Proteine wurden durch in vitro-Translation synthetisiert und auf die Oligomerisation in Gegenwart von ss-DNA auf die vorstehend angegebene Weise getestet. Drei der sechs getesteten, mutanten Proteine, nämlich Y380A, N389A und F393A, erwiesen sich bei diesem Test als stark defektiv (13). Erwartungsgemäß handelt es sich um die gleichen drei mutanten Proteine, die auch stark defektiv bei der Bindung/Oligomerisation an der HPV-Ursprungsstelle sind (9). Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass die konservierte Region A von E1 für die Oligomerisation notwendig ist.
Schlussfolgerungen
Ohne Festlegung auf eine Theorie nimmt die Anmelderin an, dass die hier vorgelegten Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Region, die durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 definiert ist, die Region darstellt, die für die E1-Oligomerisation erforderlich ist. Daher kann diese Region als Ziel zur Hemmung der PV-DNA-Replikation zur Behandlung einer PV-Infektion dienen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid eines E1-Proteins, definiert durch die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz.
Peptid eines E1-Proteins, definiert durch die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz.
Peptid eines E1-Proteins, definiert durch die in SEQ ID NO: 4 angegebene Aminosäuresequenz.
Peptid eines E1-Proteins, definiert durch die in SEQ ID NO: 78 angegebene Aminosäuresequenz.
Oligomerisationsassay, umfassend die folgenden Schritte: a. Kombinieren eines E1-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 78, mit einem DNA-Fragment und Inkubieren für eine ausreichende Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen, b. Isolieren des E1-Protein/DNA-Komplexes von der nicht-komplexierten DNA und c. Nachweisen der DNA, wobei die Anwesenheit von DNA einen Hinweis auf E1-Protein, das an die PV-Ursprungsstelle bindet, darstellt und somit mit der E1-Oligomerisation korreliert.
Oligomerisationsassay nach Anspruch 5, wobei das E1-Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 78 aufweist.
Screeningassay für ein Mittel, das zur Hemmung der E1-Oligomerisation befähigt ist, wobei dieser Assay die Schritte gemäß Anspruch 5 oder 6 und ferner die folgenden Schritte umfasst: a. Kontaktieren eines Mittels gegen E1 gemäß der Definition in Anspruch 5 oder 6 vor der Kombination mit dem DNA-Fragment und Inkubieren für eine ausreichende Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen, und b. Vergleichen der Ergebnisse mit einer Kontrollprobe, wobei die Kontrollprobe auf ähnliche Weise, jedoch ohne Zugabe dieses Mittels behandelt wird.
Assay nach Anspruch 5 oder 6, wobei die DNA eine Replikationsursprungsstelle enthält.
Assay nach Anspruch 8, wobei das E1 mit einem Gemisch von zwei DNA-Fragmenten kombiniert wird, von denen eines eine Replikationsursprungsstelle enthält und das zweite aus einer DNA von unterschiedlicher Länge besteht, so dass sie von der die ori enthaltenden DNA unterscheidbar ist und dass die Menge an E1, das an die ori enthaltende DNA gebunden ist, mit der Menge der nicht-spezifischen Bindung verglichen werden kann.
Assay nach Anspruch 5 oder 6, wobei der E1-DNA-Komplex von der freien DNA durch Säulenchromatographie, Zentrifugation, Extraktion, Filtration, Immunpräzipitation oder Immobilisierung an einem festen Träger unter Verwendung eines Antikörpers gegen E1-Protein isoliert wird.
Assay nach Anspruch 10, wobei die E1-DNA durch Immobilisieren des Antikörpers an einem festen Medium, wie einer Perle oder dem Boden einer Vertiefung einer Testplatte, isoliert wird, so dass beim Entfernen des Mediums auch die freie DNA entfernt wird.
Assay nach Anspruch 10, wobei es sich beim Antikörper um einen polyklonalen Antikörper handelt.
Assay nach Anspruch 5 oder 6, wobei die komplexierte DNA aus dem E1/DNA-Komplex vor dem Nachweis der DNA freigesetzt wird.
Assay nach Anspruch 13, wobei die DNA mit einem Radioisotop markiert wird und durch Gelelektrophorese und anschließende radioaktive Abbildung nachgewiesen wird.
Assay nach Anspruch 13, wobei die DNA mit einem kolorimetrischen Farbstoff markiert und spektrophotometrisch nachgewiesen wird.
Vernetzungsassay zur Bewertung des Grades der Oligomerisation des E1-Proteins, wobei der Assay die folgenden Schritte umfasst: a. Kombinieren eines markierten E1-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 78, mit einem DNA-Fragment und Inkubieren für eine ausreichende Zeitspanne, um dem E1-Protein und der DNA die Bildung eines Komplexes zu ermöglichen, b. Vernetzen des E1 und der DNA im Komplex mit einem Vernetzungsmittel, c. Isolieren des E1/DNA-Komplexes von der nicht-komplexierten DNA und d. elektrophoretisches Abtrennen von E1, so dass die Migration von E1 auf einem Gel einen Hinweis auf den Grad der Oligomerisation von E1 darstellt.
Vernetzungsassay nach Anspruch 16, wobei das E1-Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 78 aufweist.
Assay nach Anspruch 16 oder 17, wobei es sich beim DNA-Fragment um eine einzelsträngige DNA handelt.
Assay nach Anspruch 16 oder 17, wobei der E1-DNA-Komplex von der freien DNA durch Säulenchromatographie, Zentrifugation, Extraktion, Filtration, Immunpräzipitation oder Immobilisierung an einem festen Träger unter Verwendung eines Antikörpers gegen E1-Protein isoliert wird.
Assay nach Anspruch 19, wobei das E1 unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers immunpräzipitiert wird.
Assay nach Anspruch 16 oder 17, wobei das E1-Protein mit einem Radioisotop markiert wird.
Assay nach Anspruch 21, wobei das E1 mit ³⁵S markiert wird und auf dem Gel durch Radioabbildungtechniken nachgewiesen wird.
Assay nach Anspruch 16 oder 17, wobei es sich beim Vernetzungsmittel um Bismaleinimidohexan (BMH) handelt.
Assay nach Anspruch 5 oder 6 oder 16 oder 17, wobei das E1-Protein durch gekuppelte Transkriptions/Translationssynthese in einem Kaninchen- Retikulozytenlysat erhalten worden ist oder durch rekombinante Technik hergestellt worden ist.
Assay nach Anspruch 5 oder 6 oder 7, wobei der Assay bei einer niedrigen Temperatur in Gegenwart oder Abwesenheit von ATP/Mg durchgeführt wird.
Assay nach Anspruch 5 oder 6 oder 7, wobei der Assay bei einer hohen Temperatur in Gegenwart von ATP/Mg durchgeführt wird.