DE60215658T2

DE60215658T2 - Zwitterkristall aus humaner papillomavirus-e2-transaktivierungsdomäne und einem inhibitor sowie roentgen-struktur-koordinaten, die die inhibitorbindende tasche definieren

Info

Publication number: DE60215658T2
Application number: DE60215658T
Authority: DE
Inventors: R. Dale Richmond CAMERON; Jacques Laval ARCHAMBAULT; Christiane Laval YOAKIM; Peter Laval WHITE; Yong Carmel WANG
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2022-07-13
Also published as: EP1695980A3; AU2002317122B2; NZ531068A; JP4602665B2; CA2448482C; ES2274051T3; HUP0402069A2; ES2342309T3; ATE465414T1; IL159150A0; EP1409525A2; WO2003006495A3; DK1409525T3; DE60215658D1; WO2003006495A2; HUP0402069A3; DE60236114D1; CA2448482A1; DK1695980T3; MXPA04000271A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Papillomavirus E2-Protein, insbesondere die kristalline Struktur der humanen Papillomavirus 11 (HPV-11)-E2-Protein-Transaktivierungsdomäne, die mit einem Inhibitor komplexiert ist. Insbesondere stellt die Erfindung Kristallstruktur-Koordinaten, die eine Inhibitor-Bindungstasche definieren, und ein dreidimensionales Strukturmodell zur Identifizierung von potentiellen Inhibitoren, die in diese Tasche passen, bereit. Ferner werden Verfahren beschrieben, die die Konstruktion und Auswahl von Inhibitoren der E2-Protein-Aktivität, die an der Papillomavirus-DNA-Replikation, insbesondere bei humanem Papillomavirus, beteiligt ist, ermöglichen.
Hintergrund der Erfindung
Papillomaviren (PV) sind DNA-Viren ohne Hülle, die hyperproliferative Läsionen des Epithels herbeiführen. Papillomaviren sind in der Natur weit verbreitet und wurden in höheren Wirbeltieren festgestellt. Unter anderem wurden Viren aus Menschen, Rindern, Kaninchen, Pferden und Hunden charakterisiert. Das erste Papillomavirus wurde im Jahre 1933 als Waldkaninchen ("cottontail")-Papillomavirus (CRPV) beschrieben. Anschließend dienten das Waldkaninchen- sowie auch das Rinder-Papillomavirus vom Typ 1 (BPV-1) als experimentelle Prototypen für Studien an Papillomaviren. Die meisten tierischen Papillomaviren stehen in Zusammenhang mit rein epithelialen proliferativen Läsionen und die meisten Läsionen bei Tieren sind kutan. Beim Menschen gibt es mehr als 75 Typen von Papillomaviren (HPV), die identifiziert worden sind und anhand ihrer Infektionsstelle eingeteilt worden sind: kutanes Epithel und mukosales Epithel (orale und genitale Schleimhäute). Zu den hautbezogenen Krankheiten gehören flache Warzen, plantare Warzen und dergl. Zu den schleimhautbezogenen Krankheiten gehören Kehlkopf-Papillome und anogenitale Krankheiten, einschließlich zervikale Karzinome (Fields, Virology, 3. Auflage (1996), Lippincott-Raven Pub., Philadelphia, N. Y.).
Es gibt mehr als 25 HPV-Typen, die an anogenitalen Krankheiten beteiligt sind; diese werden in Typen von "geringem Risiko" und "hohem Risiko" eingeteilt. Zu den Typen von geringem Risiko gehören HPV-Typ 6 und -Typ 11, die vorwiegend gutartige Läsionen hervorrufen, wie Condyloma acuminata (Genitalwarzen) und geringfügige squamöse, intraepitheliale Läsionen (SIL). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 5 Millionen Personen mit Genitalwarzen, von denen 90 % auf HPV-6 und HPV-11 zurückzuführen sind.
Die Typen von hohem Risiko sind mit hochgradigem SIL und Gebärmutterhalskrebs verbunden. Hierzu gehören am häufigsten die HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45 und 52. Die Progression von geringfügigem SIL zu hochgradigem SIL ist häufiger bei Läsionen, die HPV-16 und -18 von hohem Risiko enthalten, verglichen mit HPV-Typen von niedrigem Risiko. Ferner werden nur vier HPV-Typen häufig bei Gebärmutterhalskrebs nachgewiesen (Typen 16, 18, 31 und 45). Weltweit werden jährlich etwa 500 000 neue Fälle von invasivem Krebs des Gebärmutterhalses diagnostiziert (Fields, 1996, a.a.O.).
Zu Behandlungen von Genitalwarzen gehören eine physikalische Entfernung, wie Kryotherapie, CO₂-Laser, Elektrochirurgie oder chirurgische Exzision. Es können auch zytotoxische Mittel verwendet werden, wie Trichloressigsäure (TCA), Podophyllin und Podofilox. Es stehen auch immunomodulatorische Mittel zur Verfügung, wie Interferon und Imiquimod (Aldara^®, 3M Pharmaceuticals). Diese Behandlungen sind bei der Beseitigung sämtlicher viraler Partikel nicht völlig wirksam und sind entweder mit hohen Kosten verbunden oder mit lästigen Nebenwirkungen belastet. Auch Warzenrezidive sind üblich (Beutner & Ferenczy, Amer. J. Med., Bd. 102 (5A) (1997), S. 28-37).
Die fehlende Wirksamkeit der derzeitigen Verfahren zur Behandlung von HPV-Infektionen hat gezeigt, dass es erforderlich ist, neue Maßnahmen zur Bekämpfung oder Beseitigung derartiger Infektionen aufzufinden. In den letzten Jahren hatten sich die Anstrengungen auf das Auffinden von antiviralen Verbindungen und insbesondere von Verbindungen, die zur Störung der viralen Replikation befähigt sind, gerichtet (Hughes and Romanos, Nucleic Acids Res., Bd. 21 (1993), S. 5817-5823; Clark et al., Antiviral Res., Bd. 37(2) (1998), S. 97-106; Hajduk et al., J. Med. Chem., Bd. 49(20) (1997), S. 3144-3150; und Cowsert et al., Antimicrob. Agents, Chemother., Bd. 37(2) (1993), S. 171-177). Zu diesem Zweck ist es wichtig, die Genetik von HPVs zu untersuchen, um potentielle chemotherapeutische Ziele zu identifizieren, um etwaige Krankheiten, die durch HPV-Infektionen verursacht werden, einzudämmen und möglicherweise zu beseitigen.
Der Lebenszyklus von PV ist eng an die Keratinozyten-Differenzierung gekoppelt. Es wird angenommen, dass eine Infektion an der Stelle eines Geweberisses im basalen Epithel erfolgt. Im Gegensatz zu normalen Zellen setzt sich die Zellteilung mit der vertikalen Differenzierung der Zelle fort. Da die infizierten Zellen einer progressiven Differenzierung unterliegen, wird die zelluläre Replikationsmaschinerie aufrechterhalten, was einen Anstieg der viralen DNA-Replikation ermöglicht, wobei es schließlich zu einer späten Genexpression und zu einem Virion-Zusammenbau in terminal differenzierten Keratinozyten sowie zur Freisetzung von Viralen Teilchen kommt (Fields, a.a.O.).
Der Kodierungsstrang für jedes Papillomavirus-Genom enthält etwa 10 designierte, translationale offene Leseraster (ORFs), die entweder als frühe ORFs oder als späte ORFs klassifiziert worden sind. Die E1- bis E8-Gene werden früh im viralen Replikationszyklus exprimiert. Die beiden späten Gene (L1 und L2) kodieren für die übergeordneten bzw. untergeordneten Capsid-Proteine. Die E1- und E2-Genprodukte üben ihre Funktion bei der viralen DNA-Replikation aus, während E5, E6 und E7 die Wirtszellproliferation modulieren. Derzeit sind die Funktionen der E3-, E4- und E8-Genprodukte nicht sicher.
Studien über HPV haben gezeigt, dass die Proteine E1 und E2 die einzigen viralen Proteine sind, die für die virale DNA-Replikation erforderlich sind (Kuo et al., J. Biol. Chem., Bd. 30 (1994), S. 24058-24065). Dieses Erfordernis ist ähnlich wie beim Rinder-Papillomavirus vom Typ 1 (BPV-1 ). Tatsächlich besteht eine hochgradige Ähnlichkeit zwischen E1- und E2-Proteinen und den ori-Sequenzen sämtlicher Papillomaviren (PV), unabhängig von der Spezies und dem Typ des Virus (Kuo et al., 1994, a.a.O.).
Wenn die virale DNA-Replikation in vitro abläuft, wo das E1-Protein im Überfluss vorhanden ist, kann die Replikation in Abwesenheit von E2 ablaufen. In vivo in Gegenwart einer großen Menge an zellulärer DNA erfordert die Replikation die Anwesenheit sowohl von E1 als auch von E2. Es wird angenommen, dass am Mechanismus zur Einleitung der in vivo-Replikation die kooperative Bindung von E1 und E2 an den Ursprung beteiligt ist, was zum Aufbau eines ternären Protein-DNA-Komplexes führt (Mohr et al., Science, Bd. 250 (1990), S. 1694-1699). Beim E2-Protein handelt es sich um einen transkriptionellen Aktivator, der an das E1-Protein bindet. Dadurch wird die Bindung von E1 an die BPV-Replikationsursprungsstelle verstärkt (Seo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 90 (1993b), S. 2865-2869). Somit wirkt E2 als Spezifitätsfaktor beim Dirigieren von E1 zur Replikationsursprungsstelle (Sedman und Stenlund, Embo. J., Bd. 14 (1995), S. 6218-6228). Bei HPV nahmen Lui et al. an, dass E2 die Bindung von E1 an ori stabilisiert (J. Biol. Chem., Bd. 270 (45) (1995), S. 27283-27291; und McBride et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 18411-18414). Diese Wechselwirkungen von DNA-Protein und Protein-Protein erfolgen an der Ursprungsstelle der DNA-Replikation (Sverdrup und Meyers, a.a.O.).
Die ~45 kD-E2-Proteine, die aus zahlreichen humanen und tierischen Serotypen charakterisiert worden sind, besitzen eine gemeinsame Organisation von 2 Domänen. Die N-terminale Transaktivierungsdomäne (TAD) weist etwa 220 Aminosäuren auf und die C-terminale DNA-Bindungsdomäne (DBD) weist eine Länge von 100 Aminosäuren auf. Beide Domänen sind durch eine flexible Linkerregion verbunden.
E2 aktiviert die virale Replikation durch eine kooperative Bindung des viralen Initiatorproteins E1 an die Ursprungsstelle der DNA-Replikation, was letztlich zu funktionellen E1-Hexameren führt. E2 stellt ebenfalls einen zentralen Regulator der viralen Transkription dar. Es tritt in Wechselwirkung mit basalen Transkriptionsfaktoren, einschließlich TATA-Bindungsprotein, TFIIIB und humanes TAF_II70; dem proximalen Promotor-Bindungsprotein, wie Sp1; und anderen zellulären Faktoren, wie AMF-1, die positiv die transkriptionelle E2'-Aktivierung beeinflussen.
Welche dieser zahlreichen Wechselwirkungen zur Erzielung der transkriptionellen Aktivierung ausreichen oder notwendig ist, ist noch unklarer. Diese Einzelheiten stimmen mit der Vorstellung überein, dass Enhancer-Bindungsproteine als transkriptionelle Aktivatoren wirken, indem spezielle Protein-Protein-Kontakte zur Verknüpfung der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie an einen Promotor verwendet werden, und zwar mit dem Ziel, RNA-Polymerase II einzusetzen. Eine drittte Funktion von E2 besteht in der Unterstützung der genauen Segregation von viraler DNA. Das Rinder-Papillomavirus (BPV)-Genom und das E2-Protein befinden sich während der Mitose gemeinsam innerhalb von Wirtszellchromosomen, und zwar in Abhängigkeit von einer intakten E2-TAD.
Die E2-DBD dimerisiert unter Bildung eines β-Zylinders mit flankierenden Erkennungshelices, die in den Hauptfurchen der DNA-Bindungsstelle positioniert sind. Im Gegensatz dazu blieb die Struktur von E2-TAD schwer erfassbar, bis Harris und Botchan (Science, Bd. 284 (5420) (1999), S. 1673, ein erstes Modell eines proteolytischen Fragments von HPV-18 E2-TAD durch Rönfgenkristallographie erstellten. Das Modell lässt darauf schließen, dass ein Cashew-förmiges Protein von 55 Å × 40 Å × 30 Å mit einem konkaven Spalt auf einer Seite des Proteins und Rippen auf der gegenüberliegenden Oberfläche vorliegt. Harris und Botchan untersuchten, ob diskrete Oberflächen mit bekannten E2-Aktivitäten korrelierten und identifizierten insbesondere einen hervorstehenden Cluster von Resten, die den inneren Rand des Haupthohlraums unter Einschluss von E175, L178, Y179 und I73 darstellen, die eine für die Transkription wichtige Unterscheidungsoberfläche definieren.
Antson et al. (Nature, Bd. 403 (2000), S. 805-809) beschreiben die Kristallstruktur des vollständigen E2-TAD aus HPV-16, einschließlich einer zweiten, neu identifizierten, mutmaßlichen E2-E2-TAD-Grenzfläche, die einen Cluster von 7 konservierten Resten umfasst (R37, A69, I73, E76, L77, T81 und Q80). Anston et al. vertraten die Auffassung, dass Q12 und E39 an der Wechselwirkung mit E1 beteiligt sein könnten.
Das E2-Protein wird als potentielles Ziel für antivirale Mittel angesehen. Jedoch wurden Bemühungen zum Auffinden von Arzneistoffen gegen E2 durch fehlende Strukturinformationen über ein mit einem Inhibitor komplexiertes E2 behindert. Weder das Modell von Harris noch das von Anston liefern irgendwelche Informationen bezüglich der Position und/oder Charakterisierung einer potentiellen Inhibitor-Bindungstasche. Strukturinformationen über apo-E2-TAD haben einige wertvolle Erkenntnisse über die Oberfläche des apo-Proteins gebracht, es scheint aber nunmehr klar, dass dieses nicht für Konformationsänderungen, die bei Bindung mit einem Inhibitor herbeigeführt werden, repräsentativ ist.
Das Fehlen von spezifischen E2-Inhibitoren, die zur Gewinnung von Kokristallen von E2 und Inhibitoren erforderlich sind, hat die Suche nach der Inhibitorbindungstasche in E2 behindert. Somit war eine röntgenkristallographische Analyse eines derartigen Protein-Inhibitor-Komplexes nicht möglich.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Reihe von Dokumenten, deren Inhalt durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst die bisher vom Stand der Technik nicht beantworteten Probleme, indem sie eine neue Zusammensetzung, die eine humane Papillomavirus-E2-Protein-Transaktivierungdomäne, die mit einem Inhibitor von E2 in Form eines kleinen Moleküls komplexiert ist, umfasst, sowie Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zusammensetzung bereitstellt. Vorteilhafterweise stellt die vorliegende Erfindung ferner einen E2-Inhibitor-Komplex bereit, der kristallisiert und durch Röntgenbeugung analysiert werden kann, wodurch wichtige Informationen über die Inhibitor-Bindungstasche der Transaktivierungsdomäne des HPV-E2-Proteins bereitgestellt werden. Der Inhibitor bietet ein wertvolles Werkzeug zur Erzeugung eines Kokristalls, der die Charakterisierung einer bisher unbekannten Inhibitor-Bindungstasche, die möglicherweise an einer Wechselwirkung mit E1 während des Replikationszyklus von HPV beteiligt ist, ermöglicht.
Ferner wird ein Verfahren zur Bestimmung mindestens eines Teils der dreidimensionalen Struktur von Molekülen oder Molekülkomplexen beschrieben, der mindestens einige Merkmale enthält, die strukturelle Ähnlichkeiten mit einer HPV-E2-Inhibitor-Bindungstasche aufweist.
Ferner wird ein 3-D-Modell zur Analyse und der Vorhersage für die Bindung von potentiellen Inhibitoren bereitgestellt, um die Suche nach weiteren Inhibitoren, die an die identifizierte Tasche binden, zu unterstützen. Die Lokalisierung und Charakterisierung dieser Tasche, die erfindungsgemäß beschrieben wird, stellen ein potentielles neues therapeutisches Ziel bei der Behandlung von PV-Infektionen bereit.
Ferner werden ein Screening-Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, die zur Modulation dieses neuen Ziels befähigt sind, sowie ein System zur Auswahl mindestens eines derartigen Mittels, das zur Störung der PV-DNA-Replikation befähigt ist, beschrieben.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneistoffes bereitgestellt, der die E1-E2-Wechselwirkung hemmt, wobei das Verfahren das Identifizieren eines Arzneistoffes oder die Entwicklung eines Arzneistoffes, der in die hier beschriebene Tasche passt, umfasst.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Kristall bereitgestellt, der ein PV E2-TAD-artiges Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, umfasst:
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2-TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO:2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, gemäß der vorstehenden Definition, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Vermischen des gereinigten PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das in einem Reinigungspuffer enthalten ist, mit solubilisiertem Inhibitor L zur Erzeugung einer Komplexlösung mit einem Gehalt an dem PV E2 TAD-L-Komplex; und
b) Kristallisieren des Komplexes aus a) in einem Kristallisationspuffer.

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2 FAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Vermischen des in einem Reinigungspuffer enthaltenen PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO:2 mit einem Kristallisationspuffer umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2 FAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist (PV E2 TAD-L), gemäß der vorstehenden Definition, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Solubilisieren des Inhibitors L in einem Kristallisationspuffer; und
b) das Einweichen des kristallisierten PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2 gemäß der vorstehenden Definition in a).

Ferner werden die Röntgen-Kristallstruktur-Koordinaten des vorstehend definierten PV E2 TAD-Inhibitorkomplexes (PV E2 TAD-L) beschrieben.
Ferner wird ein computerlesbares Datenspeichermedium beschrieben, das ein Datenspeichermaterial umfasst, das mit den Röntgenkristallstruktur-Koordinaten oder mindestens einem Teil der Struktur-Koordinaten gemäß 9 kodiert ist.
Ferner wird ein Computer zur Erzeugung einer dreidimensionalen Darstellung des PV E2 TAD-L-Komplexes gemäß der hier gegebenen Definition bereitgestellt, der folgendes umfasst:

a) ein computerlesbares Datenspeichermedium mit einem Datenspeichermaterial, das mit den Strukturkoordinaten gemäß 9 kodiert ist;
b) einen Speicher zur Speicherung von Anweisungen zur Verarbeitung der computerlesbaren Daten;
c) eine CPU, die mit dem computerlesbaren Datenspeichermedium verbunden ist, um die computerlesbaren Daten zu der genannten dreidimensionalen Darstellung zu verarbeiten; und
d) eine mit der CPU verbundene Anzeige zum Anzeigen der dreidimensionalen Darstellung.

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines E2-Proteins bereitgestellt, wobei das Protein zum Identifizieren oder Charakterisieren von E2 TAD-Inhibitoren geeignet ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Verwenden der HPV E2 TAD-L-Kristallstruktur gemäß der hier beschriebenen Definition zum Identifizieren von HPV-Inhibitor-Bindungstaschen-Resten;
b) das Vergleichen der HPV-Inhibitor-Bindungstaschen-Reste mit analogen Resten in einem anderen PV E2;
c) das Mutieren der anderen PV-Reste zu den HPV-Resten zur Erzeugung eines Hybrids; und
d) das Testen des Hybrids auf Hemmung durch einen Inhibitor.

Kurze Beschreibung der Figuren
Im Anschluss an die vorstehende allgemeine Erfindungsbeschreibung wird nachstehend auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, die eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellen.
1A zeigt die Aminosäuresequenz der HPV-11-E2-Transaktivierungsdomäne (SEQ ID NO:1) wie sie von Sakai et al., J. Virol., Bd. 70 (1996), S. 1602-1611, erhalten worden ist.
1B zeigt die Aminosäuresequenz der HPV-11-E2-Transaktivierungsdomäne (SEQ ID NO:2), wie sie gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten worden ist.
2 zeigt Stereo-Banddiagramme des apo-E2 aus HPV-16 gemäß der Beschreibung von Anston et al. (a.a.O.).
3 zeigt Stereo-Banddiagramme des apo-E2 aus HPV-11, das von der Anwenderin hergestellt worden ist.
4 zeigt Stereo-Banddiagramme des E2 aus HPV-11, das gemäß den hier gemachten Angaben mit der Verbindung L komplexiert ist.
5 zeigt eine für Lösungsmittel zugängliche Oberflächendarstellung der Inhibitor-Bindungstasche des apo-E2-TAD aus HPV-16 (Antston et al., a.a.O.).
6A zeigt eine für Lösungsmittel zugängliche Oberflächendarstellung der Inhibitor-Bindungstasche des apo-E2 aus HPV-11, das von der Anmelderin hergestellt worden ist.
6B zeigt eine für Lösungsmittel zugängliche Oberflächendarstellung der Inhibitor-Bindungstasche des Kokristalls.
7 zeigt eine schematische Darstellung der Bewegung von Y19 und H32, die bei Bindung mit einem Inhibitor in der Tasche erfolgt.
8 zeigt eine für Lösungsmittel zugängliche Draufsicht der Oberfläche der Tasche, wobei insbesondere ein tiefer Hohlraum und ein flacher Hohlraum dargestellt sind.
9 listet die Atomstrukturkoordinaten für E2 TAD, das mit der Verbindung L komplexiert ist, auf, die durch Röntgenbeugung von Kokristallen dieses Komplexes erhalten worden sind (nachstehend als HPV TAD E2-L bezeichnet). Die Herstellung des Komplexes ist in Beispiel 3 beschrieben. Nachstehend werden einige Ausdrücke definiert: der Ausdruck A.A. bedeutet die Aminosäure, die durch jede Koordinate identifiziert wird, wobei in dieser Spalte der Ausdruck "CPR" cis-Prolin bedeutet; BLHA = erstes Molekül des Inhibitors L; BLHB = zweites Molekül des Inhibitors L. Informationen über die Aminosäuren 197 bis 201 aus der Kette A fehlen aufgrund der hohen Flexibilität dieser Reste, die sie für Röntgenstrahlen unsichtbar machen. Aus diesem Grund werden die folgenden Aminosäuren modellhaft als Alanin angegeben: E2: K107, K173, 5180, M182, H183 und P196. "X, Y, Z" definieren kristallographisch die Atomposition, die für jedes Atom in einem kartesischen Koordinatenraum bestimmt worden ist. "Occ" bedeutet einen Besetzungsfaktor, der sich auf die Fraktion der Moleküle bezieht, bei denen jedes Atom die durch die Koordinaten spezifizierte Position besetzt. Ein Wert von "1" gibt an, dass jedes Atom in sämtlichen Molekülen des Kristalls die gleiche Konformation, z. B. die gleiche Position, aufweist. "B" ist ein thermischer Faktor, der die Bewegung des Atoms um sein Atomzentrum misst. Die Koordinaten der Reste, die den tiefen Hohlraum bilden, sind fett dargestellt.
10 zeigt die Ausrichtung der Aminosäuresequenz-Cluster, die allgemein die Inhibitor-Bindungstaschenregion der E2-Transaktivierungsdomäne aus HPV-6A, HPV-11, HPV-16 und HPV-18 definieren. Die fett dargestellten Reste geben an, dass sie den tiefen Hohlraum der Inhibitor-Bindungstasche definieren. Die einfache Unterstreichung definiert die Reste am Boden der tiefen Tasche. Die doppelte Unterstreichung gibt die Reste der flachen Tasche an. Y19 ist in Kursivschrift angegeben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Die folgenden Abkürzungen werden in der gesamten Beschreibung verwendet. Der Ausdruck "assoziiert mit" oder "Bindung" bezieht sich auf einen Zustand der Nähe zwischen chemischen Einheiten oder Verbindungen oder Teilen davon. Die Assoziation kann nicht-kovalent (wobei die benachbarte Stellung energetisch durch Wasserstoffbrückenbindung, van der Waals-Kräfte oder elektrostatische Wechselwirkungen begünstigt wird) oder kovalent sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Bindungstasche" bezieht sich auf eine Region eines Moleküls oder eines Molekülkomplexes, der als Folge seiner Gestalt in günstiger Weise eine Assoziation mit einem anderen Molekül, einem Molekülkomplex, einer chemischen Einheit oder einer Verbindung eingeht. Der hier verwendete Ausdruck Tasche umfasst mindestens einen tiefen Hohlraum und gegebenenfalls einen flachen Hohlraum.
Der hier verwendete Ausdruck "Komplex" bezieht sich auf die Kombination eines Moleküls oder eines Proteins, auf konservative Analoge oder geschnittene Produkte davon in Assoziation mit einer chemischen Einheit.
Nachstehend werden die in dieser Anmeldung verwendeten Abkürzungen für die α-Aminosäuren aufgeführt:
Der hier verwendete Ausdruck "Analoges" bezieht sich im Zusammenhang mit der Erfindung auf eine Sequenz von Aminosäuren, bei der eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) aufrechterhalten wird, die im wesentlichen ähnlich mit der Aktivität der ursprünglichen Sequenz ist. Dieses Analoge kann von der gleichen oder einer unterschiedlichen Spezies stammen und es kann sich um ein natürliches Analoges oder um ein synthetisch hergestelltes Analoges handeln. Derartige Analoge umfassen Aminosäuresequenzen mit Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren, mit der Maßgabe, dass die biologische Aktivität des Proteins konserviert ist. Insbesondere bedeutet der Ausdruck "konservatives Analoges" ein Analoges, bei dem Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einer starken oder schwachen Ähnlichkeit (vergl. beispielsweise M. O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequenz and Structure, Bd. 5, suppl. 3 (1978), National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.) gemäß den Angaben in der folgenden Tabelle ersetzt sind. Tabelle der Aminosäure-Ähnlichkeit
Der Ausdruck "Seitenkette" in bezug auf eine Aminosäure oder auf einen Aminosäurerest bedeutet eine Gruppe, die am α-Kohlenstoffatom der α-Aminosäure gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei der R-Gruppen-Seitenkette von Glycin um Wasserstoff, von Alanin um Methyl und von Valin um Isopropyl. Für die speziellen R-Gruppen oder Seitenketten der α-Aminosäuren wird auf A. L. Lehninger, Biochemistry (vergl. Kapitel 4) verwiesen.
Der Ausdruck "geschnittenes Produkt" bezieht sich auf ein beliebiges Segment der E2 TAD-Aminosäuresequenz und/oder auf ein beliebiges Segment von einem der vorstehend beschriebenen Analogen, die Aminosäuren umfassen, die zur Definition des tiefen Hohlraums der erfindungsgemäßen Inhibitor-Bindungstasche in der gleichen räumlichen Beziehung, wie sie durch die Koordinaten von 9 definiert ist, ausreichen.
Der Ausdruck "mittlerer quadratischer Fehler" oder "rms-Fehler" oder "rmsd" bedeutet die Quadratwurzel des arithmetischen Mittels der Abweichungen vom Mittelwert. Im Zusammenhang mit Atomobjekten werden die Zahlenwerte in Angström (Å) angegeben. Dies stellt einen Weg dar, die Abweichung oder Variation von einem Trend oder einem Objekt anzugeben. Für die Zwecke der Erfindung wurden alle rmsd-Vergleiche durch Vergleichen von Strukturen erhalten, die unter Verwendung lediglich der Hauptketten der Atome von H32, W33 und L94 unter Erzielung eines minimalen Überlappung-rms lediglich durch Überlagern des starren Körpers erhalten worden sind. Der Hauptkettenatom-rmsd für diese Aktion zwischen unserer apo-Struktur und dem hier beschriebenen Komplex beträgt 0,078 Å.
Bevorzugte Ausführungsformen
1. Zusammensetzung
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird ein Kristall bereitgestellt, der ein HPV E2 TAD-artiges Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, umfasst:
Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung die Aminosäuren 1-220 des HPV E2-Proteins (SEQ ID NO. 1) gemäß der Definition von Swiss Prot: locus VE2_HPV11 accession P04015; unique ID: g137671, konservative Analoge oder geschnittene Produkte davon. Insbesondere umfasst die Transaktivierungsdomäne (TAD) von E2 die Aminosäuren 1-218, speziell 1-215 und ganz besonders bevorzugt 1-201. Insbesondere umfasst das erfindungsgemäß verwendete E2 TAD die Aminosäuren 2-201 und ganz besonders 2-196. Am meisten bevorzugt ist es, dass die Zusammensetzung die Aminosäuren 15-104 von E2 TAD umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der ersten Ausführungsform wird das erfindungsgemäß verwendete HPV E2 TAD aus dem HPV-11-Stamm erhalten und mit dem kleinen Inhibitormolekül L komplexiert. Weitere Typen von Papillomavirus (PV) kommen erfindungsgemäß ebenfalls in Betracht, einschließlich BPV (Rinder-Papillomavirus) oder CRPV (Waldkaninchen-Virus).
2. Kristallisierverfahren
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2 TAD-arigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, gemäß der vorstehenden Definition bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform wird in Stufe a) der Inhibitor L in 100 % DMSO in einer Konzentration von 60 mM solubilisiert.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform enthält in Stufe a) der Reinigungspuffer ein Reduktionsmittel, das aus TCEP oder DTT ausgewählt sein kann. Insbesondere handelt es sich beim Reduktionsmittel um TCEP. Vorzugsweise handelt es sich beim Reduktionsmittel um TCEP in einer Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 10 mM. Insbesondere handelt es sich beim Reduktionsmittel um TCEP in einer Konzentration von 5 mM.
Vorzugsweise wird der Reinigungspuffer bei einem pH-Wert von 7 bis 9 verwendet. Insbesondere wird der Reinigungspuffer bei einem pH-Wert von 8 verwendet.
Zusätzlich zum Reduktionsmittel kann ein Salz zugesetzt werden, um die Stabilität des HPV E2 TAD zu unterstützen. Vorzugsweise kann das Salz aus NaCl, (NH₄)₂SO₄ oder KCl ausgewählt sein. Insbesondere handelt es sich beim Salz um NaCl in einer Konzentration von etwa 200 mM bis etwa 800 mM. Ganz besonders handelt es sich beim Salz um NaCl in einer Konzentration von 500 mM.
Zusätzlich zum Reduktionsmittel kann ein Puffer zugesetzt werden, um die Stabilität des HPV E2 TAD weiter zu unterstützen. Vorzugsweise kann der Puffer aus Tris-HCl, HEPES oder bis-Tris ausgewählt werden. Insbesondere handelt es sich beim Puffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 0 nM bis 50 mM. Ganz besonders handelt es sich beim Puffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 25 nM.
Zusätzlich zum Reduktionsmittel kann ein Chelatbildner zugesetzt werden, um den Abbau von HPV E2 TAD durch Proteasen zu verringern. Vorzugsweise kann es sich beim Chelatbildner um EDTA oder EGTA handeln. Insbesondere handelt es sich beim Chelatbildner um EDTA in einer Konzentration von 0 mM bis 1 mM. Besonders bevorzugt handelt es sich beim Chelatbildner um EDTA in einer Konzentration von 0 mM bis 0,5 mM. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich beim Chelatbildner um EDTA in einer Konzentration von 0,1 mM.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform wird in Stufe a) vorzugsweise die HPV E2 TAD-Proteinlösung in einer Konzentration von etwa 5 mg/ml bis etwa 15 mg/ml im Reinigungspuffer verwendet. Insbesondere wird das HPV E2 TAD in einer Konzentration von etwa 10 mg/ml HPV E2 TAD im Reinigungspuffer verwendet.
Bei einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform wird in Stufe b) vorzugsweise der Kristallisationspuffer aus MES, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat oder Natriumsuccinat ausgewählt. Insbesondere handelt es sich beim Kristallisationspuffer um MES in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 0,2 M. Ganz besonders handelt es sich beim Kristallisationspuffer um MES in einer Konzentration von 0,1 M.
Vorzugsweise enthält der Kristallisationspuffer ferner ein Fällungsmittel, das die Kristallisation des HPV E2 TAD unterstützt. Vorzugsweise kann das Fällungsmittel ausgewählt sein aus MPD, Isopropanol, Ethanol oder tertiärem Butanol. Besonders bevorzugt handelt es sich beim Fällungsmittel um MPD in einer Konzentration von 30 bis etwa 40 %. Ganz besonders handelt es sich beim Fällungsmittel um MPD in einer Konzentration von 35 %.
Vorzugsweise wird der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 verwendet. Insbesondere wird der Kristallisationspuffer beim pH-Wert von 5,5 verwendet.
Bei einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform wird in Stufe b) die Kristallisation bei 0 °C bis 10 °C durchgeführt. Insbesondere wird die Kristallisation bei 4 °C durchgeführt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der dritten Ausführungsform wurde die Kristallisation des HPV E2 TAD-L-Komplexes unter Anwendung der Hängetropfen-Dampfdiffusionstechnik durchgeführt.
Gemäß einem wichtigen Aspekt der dritten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße kristallisierte HPV E2 TAD-L-Komplex der Röntgenkristallographie zugänglich. Unter Anwendung der röntgenkristallographischen Analyse gehören die erhaltenen HPV E2 TAD-Inhibitor-Komplex-Kristalle zur Raumgruppe P4(1) mit Gittereinheitsabmessungen von a=b=60,7 Å und c=82,5 Å und enthalten ein Molekül pro asymmetrischer Einheit. Anfängliche Beugungsdaten wurden unter Verwendung eines "Home Source X-Ray"-Generators (Rigaku, Japan), der mit einem R-Achse II-Bildplattenbereich-Detektor ausgerüstet war (Molecular Structure Corp., Texas), gemessen. Vorzugsweise wurden Daten bis zu einer Auflösung von 3,15 Å an einem Einkristall des auf 100 K abgekühlten Komplexes gewonnen.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von kristallisiertem apo HPV E2 TAD beschrieben, das folgendes umfasst:

a) das Vermischen von apo HPV E2 TAD, das in einem Reinigungspuffer enthalten ist, mit einem Kristallisationspuffer.

Gemäß einem weiteren Aspekt davon handelt es sich beim apo HPV E2 TAD um apo-HPV-11 E2 TAD. Insbesondere handelt es sich beim apo HPV E2 TAD um apo Se-HPV-11 E2 TAD.
Gemäß einem weiteren Aspekt davon enthält der Reinigungspuffer die hier beschriebenen Bestandteile. Vorzugsweise wird die apo HPV E2 TAD-Proteinlösung in einer Konzentration von etwa 1 mg/ml bis etwa 15 mg/ml im Reinigungspuffer verwendet. Insbesondere wird das apo HPV E2 TAD in einer Konzentration von etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml E2 TAD im Reinigungspuffer verwendet. Besonders bevorzugt wird das apo HPV E2 TAD in einer Konzentration von 5 mg/ml im Reinigungspuffer verwendet.
Ferner kann der Kristallisationspuffer aus MES, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat oder Natriumsuccinat ausgewählt werden. Insbesondere handelt es sich beim Kristallisationspuffer um Natriumsuccinat in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 0,2 M. Besonders bevorzugt handelt es sich beim Kristallisationspuffer um Natriumsuccinat in einer Konzentration von 0,1 M.
Vorzugsweise enthält der Kristallisationspuffer ferner PEG8K-, PEG4K- oder PEG5K-Monomethylether. Insbesondere enthält der Kristallisationspuffer ferner PEG5K-Monomethylether in einer Konzentration von etwa 10 % bis etwa 25 %. Besonders bevorzugt enthält der Kristallisationspuffer ferner PEG5K-Monomethylether in einer Konzentration von 18 %.
Vorzugsweise wird der Kristallisationspuffer beim pH-Wert von 4,5 bis 6,5 verwendet. Insbesondere wird der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 5,0 verwendet.
Vorzugsweise enthält der Kristallisationspuffer ferner Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 0,4 M. Insbesondere enthält der Kristallisationspuffer ferner Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 0,2 M.
Die Kristallisatioin kann bei 0 °C bis 10 °C durchgeführt werden. Insbesondere wird die Kristallisation bei 4 °C durchgeführt.
Die apo HPV-11 E2 TAD-Kristalle gehören zur Raumgruppe C222 mit Gittereinheitsabmessungen von a=54,9 Å, b=169,9 Å und c=46,1 Å und enthalten ein Molekül pro asymmetrischer Einheit. Beugungsdaten wurden mit einem Beamline X4a-Gerät (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York) gewonnen. Vier Datensätze wurden von einem auf 100 K gekühlten Einkristall bei vier verschiedenen Röntgenwellenlängen in der Nähe der Selenabsorptionskante gewonnen (0,9790 Å, 0,9794 Å, 0,9743 Å und 0,9879 Å). Abbildungen wurden an einem ADSC Q4 CCD-Gerät gewonnen. Vorzugsweise betrug die maximale Auflösung 2,4 Å.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten HPV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit dem Inhibitor L komplexiert ist, gemäß der vorstehenden Definition bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Solubilisieren des Inhibitors L in einem Kristallisationspuffer; und
b) das Einweichen des kristallisierten HPV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2 entsprechend der vorstehenden Definition in a).

Gemäß einem alternativen Aspekt dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2 TAD-Inhibitor-Komplexes gemäß der vorstehenden Definition bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Zugeben von Inhibitor L zu einem Kristallisationspuffer, der kristallisiertes PV E2 TAD-artiges Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2 enthält.

3. Röntgenkoordinaten
Ferner werden Röntgen-Kristallstruktur-Koordinaten des HPV E2 TAD-Inhibitor-Komplexes (HPV E2 TAD-L) gemäß der vorstehenden Definition beschrieben.
Insbesondere handelt es sich um die Koordinaten der Inhibitor-Bindungstasche. In besonders bevorzugter Weise entspricht der Satz von Koordinaten für den HPV E2 TAD-Inhibitor-Komplex der Definition in 9.
Vorzugsweise umfasst die Inhibitor-Bindungstasche einen tiefen Hohlraum, der von den Seitenketten der Aminosäuren H32, W33 und L94 begrenzt ist, wobei die Seitenkette von Y19 des HPV E2 TAD von seiner nativen Position wegbewegt wird, um einen tiefen Hohlraum von solchen Abmessungen zu bilden, dass einem Inhibitor in Form eines kleinen Moleküls der Zugang ermöglicht wird. Insbesondere ist der tiefe Hohlraum an seinem Boden mit den Aminosäuren H29 und T97 verkleidet.
Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die Tasche ferner einen flachen Hohlraum umfasst, der durch eine oder mehrere der Aminosäuren L15, I36, E39, K 68, N71 und A72 begrenzt ist.
Vorzugsweise wird die Inhibitor-Bindungstasche entsprechend den Koordinaten, die den folgenden Clustern von Aminosäuren zugeordnet werden, definiert:
Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die Inhibitor-Bindungstasche und insbesondere ihr tiefer Hohlraum durch die Koordinaten H32, W33 und L94 gemäß 9 definiert sind. Insbesondere handelt es sich dabei um die Koordinaten der Seitenketten von H32, W33 und L94.
Alternativ kann man eine Veränderung der Seitenkette von Y19 von einem Proteinkonstrukt in Betracht ziehen, das einen ähnlich tiefen Hohlraum ohne Behinderung durch die Y19-Seitenkette reproduzieren würde.
Noch mehr bevorzugt ist es, dass der Boden der tiefen Tasche durch die Koordinaten der Aminosäuren H29 und T97 definiert wird. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass der flache Hohlraum der Inhibitor-Bindungstasche durch die Koordinaten von einer oder mehreren der Aminosäuren L15, I36, E39, K68, N71 und A72 definiert ist.
Die dreidimensionale Struktur des erfindungsgemäßen HPV E2 TAD-L-Komplexes wird durch einen Satz von Strukturkoordinaten gemäß der Darstellung in 9 definiert. Der Ausdruck "Strukturkoordinaten" bezieht sich auf kartesische Koordinaten, die sich von mathematischen Operationen ableiten, die mit den bei Beugung eines monochromatischen Strahls von Röntgenstrahlen durch die Atome (Streuungszentren) eines E2-L-Komplexes in Kristallform erhaltenen Mustern in Zusammenhang stehen. Die Beugungsdaten werden zur Berechnung einer Elektronendichtekarte der Wiederholungseinheit des Kristalls verwendet. Die Elektronendichtekarten werden sodann zur Festlegung der Positionen der einzelnen Atome der E2 TAD-Inhibitortasche verwendet.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass ein Satz von Strukturkoordinaten für ein Protein oder einen Protein-Inhibitor-Komplex oder einen Teil davon einen relativen Satz von Punkten darstellt, der eine Gestalt in drei Dimensionen definiert. Somit ist es möglich, dass ein vollständig unterschiedlicher Satz von Koordinaten eine ähnliche oder identische Gestalt definieren kann.
Die Variationen der Koordinaten können durch mathematische Manipulationen der Strukturkoordinaten erzeugt werden. Beispielsweise könnten die in 9 dargestellten Strukturkoordinaten durch kristallographische Permutationen der Strukturkoordinaten, Fraktionalisierung oder Matrixoperationen zu Sätzen der Strukturkoordinaten oder durch eine beliebige Kombination davon manipuliert werden.
Verschiedene rechnerische Analysen sind erforderlich, um festzustellen, ob ein Molekül oder ein Molekülkomplex oder ein Teil davon eine ausreichende Ähnlichkeit mit der Gesamtheit oder Teilen des HPV E2-Proteins oder des HPV E2 TAD gemäß den vorstehenden Ausführungen besitzt, so dass sie als gleich angesehen werden können. Derartige Analysen können mit derzeitigen Software-Anwendungen durchgeführt werden, z. B. mit der "Molecular Similarity"-Anwendung von QUANTA (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA) Version 4,1.
Die Molecular Similarity-Anwendung erlaubt einen Vergleich zwischen unterschiedlichen Strukturen, unterschiedlichen Konformationen der gleichen Struktur und unterschiedlichen Teilen der gleichen Struktur. Das beim Molecular Similarity angewandte Verfahren zum Vergleich von Strukturen ist in vier Stufen unterteilt: 1) Laden der zu vergleichenden Strukturen; 2) Definieren der Atomäquivalente in diesen Strukturen; 3) Durchführen eines Anpassungsvorgangs (Überlagerung); und 4) Analysieren der Ergebnisse.
Jede Struktur wird namentlich identifiziert. Eine Struktur wird sodann als Ziel identifiziert (d. h. die fixierte Struktur); sämtliche übrigen Strukturen sind Arbeitsstrukturen (d. h. Bewegungsstrukturen). Da eine Atomäquivalenz im Rahmen von QUANTA durch die Eingabe des Anwenders definiert ist, wurden für die Zwecke dieser Erfindung die rmsd-Werte unter Verwendung von Hauptkettenatomen für die Aminosäuren H32, W33 und L94 zwischen den beiden zu vergleichenden Strukturen festgelegt.
Bei Anwendung eines starren Anpassungsverfahrens wird die Arbeitsstruktur einer Translation und Rotation unterzogen, um eine optimale Anpassung zur Zielstruktur zu erhalten. Der Anpassungsvorgang bedient sich eines Algorithmus, der die optimale Translation und Rotation, die auf die Bewegungsstruktur anzuwenden ist, berechnet, so dass die mittlere quadratische Differenz der Anpassung gegenüber den angegebenen Paaren von äquivalenten Atomen ein absolutes Minimum darstellt. Nach Überlagerung der beiden Strukturen lässt sich ein rmsd-Wert für spezifische Sätze von äquivalenten Atomen berechnen.
4. Auf einem maschinenlesbaren Medium gespeicherte Koordinaten
Ferner wird ein computerlesbares Datenspeichermedium beschrieben, das ein Datenspeichermaterialumfasst, das mit den Strukturkoordinaten oder mit mindestens einem Teil der Strukturkoordinaten gemäß 9 kodiert ist. Beispiele für derartige computerlesbare Datenspeichermedien sind dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören beispielsweise CD-ROM und Diskette ("floppy disks").
Somit können erfindungsgemäß die Strukturkoordinaten eines HPV E2-Inhibitor-Komplexes und insbesondere eines HPV E2 TAD-L-Komplexes, und Teile davon in einem maschinenlesbaren Speichermedium gespeichert werden. Derartige Daten können für verschiedene Zwecke verwendet werden, z. B. für das Auffinden von Arzneistoffen und für eine röntgenkristallographische Analyse von Proteinkristallen.
Ferner wird ein Computer zur Erzeugung einer dreidimensionalen Darstellung des HPV E2 TAD-L-Komplexes beschrieben, der folgendes umfasst:

a) ein computerlesbares Datenspeichermedium, das ein Datenspeichermaterial umfasst, das mit den Strukturkoordinaten von 9 kodiert ist;
b) einen Speicher zum Speichern von Instruktionen für die Bearbeitung der computerlesbaren Daten;
c) eine CPU, die mit dem computerlesbaren Datenspeichermedium verbunden ist, um die computerlesbaren Daten zur dreidimensionalen Darstellung zu verarbeiten; und
d) eine Anzeigeeinheit, die mit der CPU verbunden ist, um die dreidimensionale Darstellung abzubilden.

5. Dreidimensionale Struktur der Tasche
Ferner wird eine dreidimensionale Struktur mindestens eines Teils des molekularen Komplexes beschrieben, der Merkmale einer strukturellen Ähnlichkeit mit einer HPV E2 TAD-Inhibitor-Bindungstasche enthält.
Die Gestalt der erfindungsgemäßen Inhibitor-Bindungstasche kann so betrachtet werden, dass sie eine tiefe Tasche und gegebenenfalls eine flachere Tasche umfasst (vergl. 7). Die Gestalt des tiefen Hohlraums ist durch die relativen Positionen der Seitenketten der Aminosäuren H32, W33 und L94 und nicht durch ihre absoluten Koordinaten gemäß 9 definiert. Ähnliche Koordinaten oder ein dreidimensionales Modell lassen sich durch verschiedene Techniken erhalten (z. B. NMR, Modellbildung und dergl.) und gelten als Bestandteil des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Somit wird die dreidimensionale Struktur eines HPV E2-Inhibitor-Komplexes und insbesondere eines HPV E2 TAD-L-Komplexes beschrieben. Von Bedeutung ist, dass damit erstmals Informationen über die Gestalt und die Struktur dieser HPV E2 TAD-Inhibitor-Bindungstasche bereitgestellt werden.
6. Einsatz des dreidimensionalen Modells für Screeningzwecke
Ferner wird ein Verfahren zur Bewertung des Potentials einer chemischen Einheit zur Assoziation mit einer Papillomavirus-E2-Transaktivierungsdomäne beschrieben, die eine Bindungstasche umfasst, die durch die Strukturkoordinaten einer HPV-11 E2-Protein-Transaktivierungsdomäne, die die Aminosäuren H32, W33 und L94 umfasst, oder ein dreidimensionales Modell davon definiert ist; oder
es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Bindungstasche ferner die Strukturkoordinaten von H29 und/oder T97 umfasst, die den Boden der tiefen Tasche definieren; oder
es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Bindungstasche ferner die Strukturkoordinaten von mindestens einer Aminosäure umfasst, die aus der Gruppe L15, I36, E39, K68, N71 und A72 ausgewählt ist.
Ferner wird die Verwendung von strukturbasierten oder rationalen Arzneistoff-Entwicklungstechniken beschrieben, um chemische Einheiten, einschließlich Inhibitorverbindungen, die zur Anpassung und/oder Bindung an die HPV E2 TAD-Inhibitor-Bindungstasche oder einen beliebigen Teil davon befähigt sind, zu entwickeln, auszuwählen und zu synthetisieren.
Eine besonders geeignete Arzneistoff-Entwicklungstechnik, die erfindungsgemäß ermöglicht wird, besteht in der iterativen Arzneistoff-Entwicklung. Bei der iterativen Arzneistoff-Entwicklung handelt es sich um eine Methode zur Optimierung von Assoziationen zwischen einem Protein und einer Verbindung, indem man die dreidimensionalen Strukturen von aufeinanderfolgenden Sätzen von Protein/Verbindungs-Komplexen bestimmt und bewertet.
Der Fachmann erkennt, dass eine Assoziation von natürlichen Liganden oder Substraten mit der Bindungstasche der entsprechenden Rezeptoren oder Enzyme die Basis zahlreicher biologischer Wirkungsmechanismen darstellt. Gleichermaßen üben zahlreiche Arzneistoffe ihre biologischen Wirkungen über eine Assoziation mit den Bindungshohlräumen von Rezeptoren und Enzymen aus. Derartige Assoziationen können in der Gesamtheit oder in beliebigen Teilen der Bindungstasche erfolgen. Ein Verständnis derartiger Assoziationen unterstützt die Entwicklung von Arzneistoffen, die günstigere Assoziationen mit dem Zielrezeptor oder -enzym und somit verbesserte biologische Wirkungen aufweisen. Daher sind diese Informationen wertvoll bei der Entwicklung potentieller Liganden oder Inhibitoren von Rezeptoren oder Enzymen, wie von Inhibitoren von HPV E2-artigen Polypeptiden und was besonders wichtig ist, von HPV E2 TAD.
Bei der iterativen Arzneistoffentwicklung werden Kristalle einer Reihe von Protein/Verbindungs-Komplexen erhalten und anschließend wird die dreidimensionale Struktur eines jeden Komplexes aufgelöst. Eine derartige Vorgehensweise liefert Erkenntnisse über die Assoziation zwischen den Proteinen und den Verbindungen eines jeden Komplexes. Dies wird durch Auswahl von Verbindungen mit Hemmwirkung, erhalten von Kristallen dieses neuen Protein/Verbindungs-Komplexes, Auflösen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes und Vergleichen der Assoziationen zwischen dem neuen Protein/Verbindungs-Komplex und früher aufgelösten Protein/Verbindungs-Komplexen erreicht. Durch Beobachtung der Art und Weise, wie Veränderungen der Verbindung die Protein/Verbindungs-Assoziationen beeinflussen, lassen sich diese Assoziationen optimieren.
In einigen Fällen wird eine iterative Arzneistoffentwicklung durchgeführt, indem man nacheinander Protein-Verbindungs-Komplexe bildet und anschließend jeden neuen Komplex kristallisiert. Alternativ kann ein vorher gebildeter Proteinkristall in Gegenwart eines Inhibitors eingeweicht werden, wie vorstehend ausgeführt wurde, wodurch ein Protein/Verbindungs-Komplex entsteht und die Notwendigkeit der Kristallisation jedes einzelnen Protein/Verbindungs-Komplexes umgangen wird. Vorteilhafterweise können die HPV E2-Proteinkristalle und insbesondere die E2 TAD-Kristalle, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, in Gegenwart eines Inhibitors oder insbesondere eines E2-Inhibitors, z. B. der Verbindung L, eingeweicht werden, um die vorstehend beschriebenen E2-Inhibitor-Kristallkomplexe bereitzustellen.
7. Verwendung der Tasche zum Screening
In bestimmten Fällen ist man möglicherweise in der Lage, ein E2 TAD aufzubauen, dem die Seitenkette von Y19 fehlt, um die hier definierte Inhibitor-Bindungstasche zu reproduzieren. Derartige Modifikationen der Primärsequenz zur Erzielung einer ähnlichen Bindungstasche fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Unter diesen Umfang fällt auch die Verwendung eines derart modifizierten E2 TAD für Screeningzwecke (durch NMR, MS, Sondenverdrängungstests und dergl.), um ein Screening auf potentielle Inhibitoren der neu definierten Tasche durchzuführen.
8. Veränderung von Wildkaninchen-Papillomavirus (CRPV)-E2 für eine wirksame Bindung von Inhibitoren
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines E2-Proteins beschrieben, wobei sich dieses Protein zum Identifizieren oder Charakterisieren von E2 TAD-Inhibitoren eignet, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) das Verwenden der HPV E2 TAD-L-Kristallstruktur gemäß der vorstehenden Definition zum Identifizieren von HPV-Inhibitor-Bindungstaschenresten;
b) das Vergleichen der HPV-Inhibitor-Bindungstaschenreste mit Wildkaninchen-Papilloma Virus (CRPV)-Proteinresten;
c) das Mutieren dieser CRPV-Reste zu den HPV-Resten, um ein Hybrid zu erzeugen; und
d) das Testen des Hybrids auf Hemmung durch einen Inhibitor.

Eine Infektion von Laborkaninchen mit Wildkaninchen-Papillomavirus (CRPV) oder die Einführung des CRPV-Genoms in die Haut dieser Kaninchen führt zum Wachstum von großen Warzen. Das CRPV-Modellsystem wurde zur Bewertung des Potentials von anti-HPV-Behandlungen herangezogen (J. W. Kreider et al. "Preclinical system for evaluating topical podofilox treatment of papillomas: dose response and duration of growth prior to treatment", J. Invest. Dermatol., Bd. 99 (1992), S. 813-818.). Dies kann als ein zweckmäßiges System zum Testen der in vivo-Wirksamkeit von E2-bindenden HPV-DNA-Replikationsinhibitoren angesehen werden. Jedoch haben die CRPV- und HPV E2-Proteine nur eine 39%ige Sequenzidentität und Inhibitoren, die an das HPV-Protein binden, binden möglicherweise nicht an CRPV E2.
Die HPV E2 TAD-Inhibitor-Kristallstruktur, die hier beschrieben wird, kann zum Identifizieren von Resten verwendet werden, die Bestandteile der HPV-Inhibitor-Bindungstasche sind, und die sich im CRPV-Protein unterscheiden. Die entsprechenden CRPV-Reste können sodann zum HPV-Gegenstück mutiert werden. Das erhaltene Hybrid kann durch in vitro-Translation des Hybridgens getestet werden, um ein E2-Protein zu erzeugen, das dann durch in vitro-Tests getestet werden kann, z. B. durch den E2-abhängigen E1-DNA-Bindungstest (vergl. Beispiel 6). Wenn das Hybridprotein im Test funktionell ist und sich als empfindlich gegenüber HPV-Inhibitoren erweist, kann das entsprechende Gen dazu herangezogen werden, das Wachstum von Warzen bei Kaninchen zu induzieren. Warzen, die sich bei dieser Vorgehensweise ergeben, sollten mit Inhibitoren, die ursprünglich auf HPV E2 abzielten, behandelbar sein. Somit könnte dieses Hybridmodell, das durch Analyse des HPV TAD-Inhibitorkomplexes aufgestellt worden ist, zum Testen von HPV-Verbindungen in einem Tiermodell eingesetzt werden. Diese Technik kann auch auf andere Papillomaviren anwendbar sein, z. B (ohne Beschränkung hierauf) auf den Rinder-Papillomavirus (BPV).
Um ein besseres Verständnis der Erfindung zu gewährleisten, werden die folgenden Beispiele vorgelegt. Diese Beispiele dienen lediglich Erläuterungszwecken und sind in keiner Weise als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen.
Beispiele
Beispiel 1
Expression und Reinigung von HPV-11 E2 TAD
Expression der His-markierten HPV-11 E2-Transaktivierungsdomäne.
Die Aminosäuren 2-201 von HPV-11 E2 (SEQ ID NO. 2) wurden durch pcr aus dem Plasmid pCR3-E2 (Titolo, 1999) unter Verwendung der Primer 5'-CAA GAC GTG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG-3' (sense) (SEQ ID NO. 3) und 5'-CAC CAA GTG GAT CCG CTA GCT TAG CTA GAT ACA GAT GCA GGA-3' (antisense) (SEQ ID NO. 4) amplifiziert. Das pcr-Produkt wurde unter Verwendung von Ncol und BamHI verdaut und in das Plasmid pET-28b ligiert, das in ähnlicher Weise verdaut worden war. Das Ligationsprodukt wurde in kompetente MAX Efficiency^R-DH5α-E. coli-Zellen (Life Technologies) transformiert. Rekombinantes Plasmid, das für His-markiertes HPV11 E2 TAD (His- TAD) kodiert, wurde aus einer Kultur des transformierten DH5α isoliert und die DNA-Sequenz des E2 TAD wurde als korrekt bestätigt. Das isolierte Plasmid wurde sodann in den E. coli-Stamm BL21 (DE3)pLysS (Novagen) transformiert.
Ein zweites Konstrukt, das für zusätzliche vier Lysinreste am C-Terminus der E2-Transaktivierungsdomäne kodiert (Lys-geschwänztes TAD) wurde durch pcr unter Verwendung des sense-Primers 5'-GGG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA G-3' (SEQ ID NO. 5) und des antisense-Primers 5'-CCC CGG ATC CTC ATT ACT TTT TCT TTT TGC TAG ATA CAG ATG CAG GAG AAC-3' (SEQ ID NO. 6) erzeugt. Dieses pcr-Produkt wurde auf die vorstehend angegebene Weise verdaut und in das Plasmid pET15b ligiert. Die für die HPV11 E2-Aminosäuren 2-201 kodierende Sequenz wurde als korrekt bestätigt und das Plasmid wurde auf die vorstehend angegebene Weise in den E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS transformiert.
Zur Proteinexpression wurde CircleGrow-Medium (Bio101) mit einem Gehalt an 34 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Kanamycin (His-TAD) oder 100 μg/ml Ampicillin (Lys-geschwänztes TAD) mit 1/25 Volumenteilen einer frischen, über Nacht gezüchteten Kultur inokuliert und die Zellen wurden bei 37 °C bis zu einem OD-Wert (600 nm) von etwa 1,0 gezüchtet. Die Kultur wurde sodann auf 22 °C umgestellt und die Proteinexpression wurde mit 0,5 mM IPTG bei einem OD-Wert (600 nm) von 1,4 induziert. Nach 6 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und auf Trockeneis eingefroren und sodann bei –80 °C aufbewahrt.
Reinigung von His-markierten HPV11 TAD-Proteinen.
Das Reinigungsverfahren war identisch wie beim His-markierten TAD- und Lysgeschwänzten TAD-Protein; sämtliche Stufen wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden pro Gramm in 5 ml Reinigungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 500 mM NaCl, 5 mM TCEP) plus Protease-Inhibitoren Pepstatin, Leupeptin und Antipain (jeweils 5 μg/ml), Phenylmethylsulfonylfluorid (1 mM) und Pefabloc^R (Roche, 0,4 mM) resuspendiert. Die Suspension wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen und das rohe Lysat wurde 30 Minuten bei 26 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 5 ml fassende Hi-Trap-Chelatsäure (APB), die mit Nickelsulfat äquilibriert war, aufgesetzt. Nach Waschen mit Reinigungspuffer plus 0 mM und 25 mM Imidazol wurde das TAD mit Reinigungspuffer mit einem Gehalt an 100 mM Imidazol eluiert. TAD-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und auf weniger als 5 ml eingeengt und sodann auf eine Superdex-75-Gelfiltrationssäule (APB), die mit Reinigungspuffer plus 0,1 mM EDTA äquilibriert worden war, aufgesetzt. Fraktionen mit einem Gehalt an reinem TAD wurden vereinigt und auf etwa 5 mg/ml (His-markiertes TAD) oder 12 mg/ml (Lys-geschwänztes TAD) eingeengt. Das eingeengte Protein wurde in Aliquotanteile aufgeteilt, auf Trockeneis eingefroren und bei –80 °C aufbewahrt.
Expression und Reinigung von His-TAD mit einem Gehalt an Selenomethionin.
Das für His-TAD kodierende Plasmid wurde in den E. coli-Stamm B834 (auxotroph in Bezug auf Methionin) transformiert. Eine einzelne bakterielle Kolonie wurde zur Inokulation einer über Nacht gezüchteten Kultur in LB-Medium mit einem Gehalt an 34 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Kanamycin verwendet. Ein Teil dieser Kultur wurde 4 000-fach in DL30-Medium (D. M. LeMaster und R. M. Richards, Biochemistry, Bd. 24 (1985), S. 7263-7268), das kein Methionin enthielt und mit 2 μg/ml Biotin und Thiamin sowie mit 50 μg/ml d,l-Selenomethionin und den gleichen Antibiotika ergänzt war, verdünnt. Nach 26 Stunden bei 37 °C hatte die Kultur eine Dichte von 0,8 (OD 600 nm) erreicht. Die Expression wurde bei 23 °C mit 0,5 mM IPTG induziert. Nach etwa 7 Stunden wurden die Zellen geerntet und auf die vorstehend angegebene Weise aufbewahrt. Eine Reinigung wurde gemäß den vorstehenden Angaben für His-TAD durchgeführt, mit der Ausnahme, dass in die Reinigungspuffer vor der Verwendung Helium eingeleitet wurde und His-TAD mit 200 mM Imidazol nach Waschvorgängen mit 50 und 100 mM eluiert wurde.
Beispiel 2
Synthese und Reinigung der Verbindung L
5-Methyl-1,3-indandion (A)
Eine Suspension von 4-Methylphthalsäureanhydrid (25,65 g, 158,2 mmol) in McOH (79 ml) wurde bei Raumtemperatur mit Natriummethoxid (69 ml einer 25 gew.-%igen Lösung, 316 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und die wässrige Phase wurde mit Et₂O gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit HCl (4N) angesäuert und mit Et₂O extrahiert. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gespült, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt.
Der rohe Rückstand wurde in Acetonitril (79 ml) gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Die erhaltene Lösung wurde nacheinander mit DBU (31,3 g, 206 mmol) und Iodmethan (33,7 g, 237,3 mmol) versetzt. Nach 1 Stunde bei 0 °C wurde Iodmethan (33,7 g, 237,3 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 1 weitere Stunde gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand wurde mit Et₂O (300 ml) verdünnt. Die Etherlösung wurde nacheinander mit wässrigem HCl (4 N, 100 ml), NaOH (10 %) und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde mit einer Etherlösung von Diazomethan behandelt, um die Veresterung zu vervollständigen. Anschließend wurde das Produkt eingeengt. Man erhielt 4-Methyldimethylphtalat (22,2 g, Ausbeute 67 %) in Form eines blassgelben Öls.
Eine Lösung von rohem 4-Methyldimethylphthalat (22,20 g, 106,6 mmol) in Ethylacetat (107 ml) wurde mit Natriumhydrid (97 %, 3,84 g, 160 mmol) versetzt. Die erhaltene Suspension wurde 4,5 Stunden unter Rückfluss erwärmt und sodann auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach Zugabe von Et₂O (100 ml) erhielt man einen gelben Niederschlag. Der gelbe Feststoff wurde abfiltriert und 2-mal mit einem Gemisch aus Ethylalkohol/Diethylether (1/1) gewaschen.
Dieser gelbe Feststoff wurde sodann in HCl (4 N, 100 ml) gelöst und 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen wurde EtOAc zugegeben und die organische Phase wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt 5-Methyl-1,3-indandion in Form eines gelben Feststoffes (3,7 g, Ausbeute 22 % ).
Stufe a:
Eine Lösung von 5-Methylindan-1,3-dion (A) (410 mg, 2,6 mmol) in EtOH (13 ml) wurde mit 3,4-Dichlorbenzaldehyd (B) (493 mg, 2,8 mmol) und anschließend mit Piperidin (1 Tropfen) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit wässrigem Wasserstoffperoxid (30 %, 0,87 ml, 7,7 mmol) und DBU (97 mg, 0,6 mmol) versetzt. Der Rührvorgang wurde 30 Minuten fortgesetzt. Anschließend wurde Hexan (5 ml) zugegeben und der Niederschlag wurde abfiltriert. Der erhaltene Feststoff wurde 2-mal mit einem Gemisch aus Propanol/Hexan (1/1) verrieben und unter Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3-(3,4-Dichlorphenyl)-spiro-(oxiran-2,2'-[5-methylindan])-1',3'-dion (D) (701 mg, Ausbeute 82 %).
Stufe c:
Ein Gemisch aus 3-(3,4-Dichlorphenyl)-spiro-(oxiran-2,2'-[5-methylindan])-1',3'-dion (D) (200 mg, 0,8 mmol) und 1-(4-[1,2,3]-Thiazol-4-yl-phenyl)-pyrrol-2,5-dion (e) (155 mg, 0,6 mmol) in Toluol (4,6 ml) wurde 16 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen und Einengen wurde der Rückstand mit EtOAc verrieben. Man erhielt ein Gemisch aus den zwei Verbindungen F/G (razemische cis/cis-Isomere, 228 mg, Ausbeute 60 %).
Stufe d:
Eine Lösung der Verbindungen F/G (210 mg, 0,36 mmol) in CH₃CN (36 ml) wurde mit NaOH (0,02 N, 17,8 ml, 0,36 mmol) innerhalb von 1 Stunde unter Verwendung einer Spritzenpumpe versetzt. Nach beendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 1 weitere Stunde gerührt. Sodann wurde die Lösung lyophilisiert. Man erhielt ein Gemisch der razemischen Verbindungen J/K (227 mg, quantitative Ausbeute). Reines Enantiomeres L wurde durch Trennung mit präparativer HPLC unter Verwendung einer chiralen Säule (Chiracel OD, isokratisches Elutionsmittel 65 % CH₃CN/H₂O mit einem Gehalt an 0,06 % TFA; UV-Lampe bei 205 nm; Fließgeschwindigkeit 7 ml/min) erhalten. Die erwünschten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das entsprechende Natriumsalz wurde durch Behandlung mit NaOH (0,02 N, 1 Äquivalent) in Acetonitril unter anschließender Lyophilisation hergestellt. Man erhielt die Natriumsalze (15 mg) in Form eines weißen Feststoffes.
L: ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10,35 (s, 1H), 8,40 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,89-7,80 (m, 3H), 7,64 (m, 3H), 7,52 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,51-7,34 (m, 1H), 5,75 (s, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 2,57 (s, 3H); ES MS m/z 606 (MH⁺).
Die Hemmaktivität der Verbindung wurde gemäß den in Beispiel 6 beschriebenen enzymatischen Tests ermittelt. Es wurde ein IC₅₀-Wert von 180 nM bestimmt. Die Selektivität des Inhibitors wurde durch die fehlende Aktivität (oder geringere Wirkungsstärke) im SV40-großen T-Antigentest gemäß der Beschreibung in Beispiel 7 bestätigt.
Beispiel 3
E2 TAD-Inhibitor-Komplexbildung
Inhibitor L wurde in Pulverform in 100 % DMSO in einer Konzentration von 60 mM in Lösung gebracht. Die Proteinlösung bestand aus 10 mg/ml E2 TAD in Reinigungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 500 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1 mM EDTA). Der Komplex von E2 TAD-L wurde hergestellt, indem 1 μl Inhibitor L in 74 μl Proteinlösung eingemischt wurde. Die Lösung wurde 2 bis 3 Stunden auf 4 °C gehalten, bevor die Kristallisationsexperimente durchgeführt wurden.
Beispiel 4
Kristallisation und Datengewinnung
Die Kristallisation des apo-E2 TAD und des Komplexes E2 TAD-L wurden unter Anwendung der Hängetropfen-Dampfdiffusionstechnik (A. McPherson, Preparation and Analysis of Protein Crystals, Krieger Pub., 1989) in VDX-Kristallisationsplatten (Hamton Research, Laguna Niguel, Kalifornien) durchgeführt.
Speziell wurden für apo-HPV-11 E2 TAD 1 μl der Se-E2 TAD-Lösung (5 mg/ml in Reinigungspuffer) mit 1 μl einer Lösung von 0,1 M Natriumsuccinat, pH-Wert 5,0, 18 % PEG5000mme und 0,2 M Ammoniumsulfat vermischt. Der erhaltene 2 μl-Tropfen wurde oberhalb von 1 ml Vorratslösung aus 0,1 M Natriumsuccinat, pH-Wert 5,0, 18 % PEG5000mme und 0,2 M Ammoniumsulfat aufgehängt. Die bei 4 °C erhaltenen Kristalle gehören zur Raumgruppe C222 mit den Gittereinheitsabmessungen a=54,9 Å, b=169,9 Å und c=46,1 Å. Sie enthielten 1 Molekül pro asymmetrischer Einheit.
Beugungsdaten wurden an einem Beamline X4a-Gerät (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York) gewonnen. Vier Datensätze wurden von einem auf 100 K abgekühlten Einkristall bei vier verschiedenen Röntgenwellenlängen nahe der Selen-Absorptionskante (0,9790 Å, 0,9794 Å, 0,9743 Å und 0,9879 Å) gewonnen. Abbildungen wurden mit einem ADSC Q4 CCD-Gerät bei einer maximalen Auflösung von 2,4 Å aufgenommen.
Zur Kristallisation des Komplexes wurde 1 μl der Komplexlösung gemäß den Angaben in Beispiel 3 mit 1 μl einer Lösung aus 0,1 M MES, pH-Wert 5,5, und 35 MPD (Methylpentandiol) vermischt. Der erhaltene Tropfen wurde oberhalb von 1 ml Reservoirlösung aus 0,1 M MES, pH-Wert 5,5, 35 % MPD, aufgehängt. Die Platten wurden sodann bei 4 °C aufbewahrt. Die erhaltenen Kristalle gehören zur Raumgruppe P4(1) mit Abmessungen der Gittereinheit von a=b=60,7 Å und c=82,5 Å. Sie enthalten 1 Molekül pro asymmetrischer Einheit.
Anfängliche Beugungsdaten wurden unter Verwendung eines "Homesource"-Röntgengenerators (Rigaku, Japan), der mit einem R-Achsen II-Bildplatten-Bereichdetektor (Molecular Structure Corp., Texas) ausgerüstet war, gemessen. Daten mit einer Auflösung von 3,15 Å wurden an einem auf 100 K abgekühlten Einkristall des Komplexes gewonnen.
Hochauflösende Beugungsdaten wurden sodann an einem Beamline X25-Gerät (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York) gewonnen. Beugungsbilder wurden an einem Brandeis B4-Detektor (Brandeis University), der an einem kappa-Achsen-Goniometer (Enraf-Nonius, Niederlande) montiert war, gewonnen. Ein voller Datensatz mit einer Auflösung von 2,4 Å wurde an einem auf 100 K abgekühlten Einkristall des Komplexes gewonnen (aufgeführt in 9).
Beispiel 5
Phasenbildung, Modellaufbau und Verfeinerung
Eine Phasenbildung der apo-Kristalldaten wurde durch MAD (Multi wavelength Anomalous Dispersion) unter Verwendung des Programms mIPHARE (Collaborative Computational Project, number 4, 1994, the CCP4 suite: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst, D50, 760-763) durchgeführt.
Für den Komplexkristall wurde das Molecular Replacement (MR)-Verfahren zur anfänglichen Bestimmung von Beugungsdatenphasen herangezogen. Die apo-Struktur von Se-E2 TAD wurde als Modell verwendet. Ein Rotations- und Translationsversuch wurde unter Verwendung des Programms AMORE (Collaborative Computational Project, number 4, 1994, the CCP4 suite: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst, D50, 760-763) durchgeführt.
Der Modellaufbau in die Elektronendichtekarte wurde mit der Software O (Alwyn Jones, Universität Upsala, Schweden) durchgeführt. Die Modellverfeinerung wurde mit der Software CNX (Molecular Simulation Inc., San Diego, Kalifornien) vorgenommen. Das neue Modell wurde sodann durch ein Cyclisierungsverfahren unter Einschluss der Stufen der Elektronendichtenkarte-Berechnung, des Modellneuaufbaus und der Modellverfeinerung verbessert. Das endgültige Modell umfasste die Reste 2 bis 196 von E2 TAD und zwei Inhibitor L-Moleküle. Der letzte kristallographische R-Faktor betrug 24,6 % und der R_free-Faktor betrug 29,3 %.
Beispiel 6
E2-abhängiger E1-Ursprungsstellen-Bindungstest
Dieser Test wurde auf einem ähnlichen Test für SV40 T-Antigen von McKay (J. Mol. Biol., Bd. 145 (1981), S. 471) nachgebildet. Eine radioaktiv markierte 400 bp-DNA-Sonde mit einem Gehalt an der HPV-11-Replikationsursprungsstelle (Chiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 5799) wurde durch pcr unter Verwendung des Plasmids pBluescript^R SK, das für die Ursprungsstelle kodiert (Nucleotide 7886-61 des HPV-11-Genoms in einer einzigen BamHI-Stelle), als Matrize und von die Ursprungsstelle flankierenden Primern erzeugt. Eine radioaktive Markierung wurde als [³³P]dCTP eingebaut. Der Puffer für den Bindungstest bestand aus 20 mM Tris, pH-Wert 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA.
Folgende weitere Reagenzien wurden verwendet: Protein A-SPA-Perlen (Typ II, Amersham) und polyklonales K72-Kaninchen-Antiserum, erzeugt gegen ein Peptid entsprechend den 14 C-terminalen Aminosäuren von HPV-11 E1. Unter Einhaltung des Amersham-Verfahrens wurde ein Fläschchen der Perlen mit 25 ml Puffer für den Bindungstest vermischt. Für den Test wurde eine Sättigungsmenge an K72-Antiserum zu den Perlen gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde inkubiert, mit 1 Volumenteil Puffer für den Bindungstest gewaschen und sodann im gleichen Volumen an frischem Puffer für den Bindungstest resuspendiert. Die Bindungsreaktionsgemische enthielten 8 ng E2, etwa 100-200 ng E1 enthaltenden Nuklearextrakt, der aus mit Baculovirus infizierten Zellen exprimiert worden war (gemäß WO-99/57283) und 0,4 ng radioaktiv markierte Sonde in einer Gesamtmenge von 80 μl des Puffers für den Bindungstest. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden 25 μl einer K72-Antikörper-SPA-Perlen-Suspension zum Bindungsreaktionsgemisch gegeben und vermischt. Nach einer weiteren Stunde der Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsgemische kurz zentrifugiert, um die Perlen zu pelletisieren. Das Ausmaß der Komplexbildung wurde durch Szintillationszählung an einem Packard TopCount^R-Gerät bestimmt. Typischerweise waren die Signale für Reaktionsgemische mit einem Gehalt an E1 und E2 20- bis 30-fach höher als der Hintergrund, der festgestellt wurde, wenn E1 und/oder, E2 weggelassen wurden.
Beispiel 7
SV40 T-Antigen-DNA-Bindungstest
Dieser Test misst die Bildung eines SV40 T-Antigen (TAg)-Ursprungsstellen-Komplexes. Der Test wurde von R. D. G. McKay (J. Mol. Biol., Bd. 145 (1981), S. 471-488) entwickelt. Im Prinzip ist er sehr ähnlich mit dem von E2 abhängigen E1-DNA-Bindungstest (Beispiel 6), wobei TAg als Ersatz für E1 und E2 dient und eine radioaktiv markierte SV40-ori-Sonde die HPV-ori-Sonde ersetzt. Dieser Test wird als Gegenscreening für den Test von Beispiel 6 verwendet, da TAg funktionell homolog zu E1 und E2 ist, jedoch eine sehr geringe Sequenzähnlichkeit aufweist.
Die radioaktiv markierte ori-enthaltende DNA-Sonde wurde durch PCR unter Verwendung des pCH110-Plasmids (Pharmacia) als Matrize hergestellt. Diese Matrize kodiert für die minimale SV40-Replikationsursprungsstelle an den Nucleotiden 7098-7023. Bei den Primern handelte es sich um "sv40-6958sens" = 5'-GCC CCT AAC TCC GCC CAT CCC GC (SEQ ID NO. 7) und "sv40-206anti" = 5'-ACC AGA CCG CCA CGG CTT ACG GC (SEQ ID NO. 8). Das PCR-Produkt wies eine Länge von etwa 370 Basenpaaren auf und wurde radioaktiv unter Anwendung einer 50 μCi/100 μl-PCR-Reaktion von dCTP (α-³³P) markiert. Im Anschluss an die PCR-Reaktion wurde das Produkt entweder unter Verwendung des Qiagen^R-PCR-Reinigungskits oder durch ein Phenolextraktion/Ethanolfällungs-Verfahren gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde auf 1,5 ng/μl (bestimmt durch Gelelektrophorese) in TE verdünnt. Frische Präparate wiesen etwa 150 000 cpm/μl auf.
Bindungsreaktionen wurden durch Vermischen von 30 μl TAg-Lösung (100 ng/Vertiefung, 200 ng einer mit ³³P radioaktiv markierten DNA-Sonde und 7,5 μl 10 × DNA-Bindungspuffer (200 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) in einem Endvolumen von 75 μl durchgeführt. Man ließ die Bindungsreaktionen 60 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Das große T-Antigen wurde von Chimerx mit 2,0 mg/ml bezogen.
Die Protein-DNA-Komplexe wurden unter Verwendung eines monoklonalen α-TAg-Antikörpers (PAb 101, Subtyp IgG2a, Hybridom erhalten von ATCC und im Haus gereinigter Antikörper), gebunden an A-SPA-Perlen, einer Immunoabfangreaktion unterzogen. Eine Immunopräzipitation von Protein-DNA-Komplexen wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten wurden sodann kurz geschleudert und die gefällten, radioaktiv markierten DNA-Fragmente wurden an einem TopCount^R-Zählgerät ausgezählt.
Diskussion
2 zeigt ein Modell der Kristallstruktur von E2 TAD aus HPV-16 (Antson et al., Nature, Bd. 403 (2000), S. 805-809). Eine vergrößerte Ansicht der Bindungstaschenregion in diesem Modell (wie in 5 dargestellt) ergibt, dass die Aminosäuren Y32, W33 und L94 einen Hohlraum definieren, der zu klein ist, um eine geeignete Tasche zu definieren, die darin die Bindung eines kleinen Inhibitormoleküls ermöglicht, wobei keine vergleichbaren Anpassungen der Aminosäure-Seitenketten zur Aufnahme des Inhibitors vorgenommen worden sind.
Selbst wenn die entsprechende HPV-11 E2 TAD-Domäne kristallisiert wird und ein Modell gebildet wird, ergeben die entsprechenden Aminosäuren erneut einen zu kleinen Hohlraum, um irgendeine Art von Tasche zu definieren, die als ein für die Inhibitorbindung geeignetes Ziel angesehen werden könnte (6A). Wie in 6B dargestellt, zeigt die vorliegende Erfindung nunmehr erstmals, dass die Kristallstruktur des neuen E2 TAD-Inhibitor-Komplexes eine neuartige und überraschende Inhibitor-Bindungstasche bereitstellt, die ein einzigartiges Werkzeug zum Identifizieren von potentiellen Inhibitoren des HPV-DNA-Replikationsprozesses darstellt.
Überraschenderweise ergibt die Struktur des E2 TAD-Inhibitor-Komplexes, dass die Bindung des Inhibitors L eine Bewegung der Seitenkette von Tyrosin in Position 19 (7) induziert, wobei der aromatische Ring sich in beträchtlichem Umfang aus dem in der apo-Struktur erkennbaren kleinen Hohlraum herausdreht, was zur Bildung eines tiefen Hohlraums führt. Die Bewegung der Tyrosin 19-Seitenkette ergibt eine rms-Abweichung für sämtliche Atome von 1,959 Å. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass diese Abweichung eine große Bewegung darstellt von der nicht vorhergesagt werden konnte, dass sie von selbst oder in Gegenwart eines kleinen Inhibitormoleküls ablaufen würde.
Ferner dreht sich der Imidazolring von Histidin 32 um 90°, um den Inhibitor aufzunehmen, bleibt aber immer noch Bestandteil des tiefen Hohlraums. Die Bewegung der Hauptkette von Histidin 32 ergibt eine rms-Abweichung für sämtliche Atome von 0,704 Å. Bezüglich keiner dieser beiden Rotationsbewegungen konnte eine Vorhersage getroffen werden, dass sie abläuft und zur Bildung des tiefen Hohlraums innerhalb der Bindungstasche führt.
Wie in 6A dargestellt, ist der tiefe Hohlraum durch die Aminosäuren Histidin 32, Tryptophan 33 und Leucin 94 definiert. Die rmsd-Verschiebung "sämtlicher Atome" dieser drei Aminosäurereste beträgt 0,515 Å. Ein derartiger rms-Wert kann nicht für die native Flexibilität dieser Reste im Zusammenhang mit der Bindungstasche verantwortlich gemacht werden. Tatsächlich ist man der Auffassung, dass eine rms-Abweichung von 1,0 Å im Zusammenhang mit einem vollständigen Protein von 200 Aminosäuren innerhalb normaler Grenzen liegt. Im vorliegenden Fall beträgt die rms-Variation sämtlicher Atome von H32, W33 und L94 zwischen HPV-16-apo-E2 TAD von Antson (a.a.O.) und HPV-11-apo-E2 TAD der Anmelderin 0,212 Å. Dies definiert die vorhersagbare Grenze (Obergrenze), um die sich diese drei Reste miteinander bewegen können. Die vorliegende Erfindung liegt außerhalb dieses Bereiches einer vorhersagbaren Bewegung dieser drei Reste.
Serin 98 liegt nicht auf der gleichen Ebene wie H32, W33 und L94 und ist Bestandteil eines flacheren Bereiches, der ebenfalls zur Erzeugung von Modellen einer größeren Tasche verwendet werden kann, die einen tiefen Hohlraum, der durch H32, W33 und L94 gebildet wird, und einen flachen Hohlraum umfasst, der durch eine oder mehrere Aminosäuren, die aus L15, I36, E39, K68, N71, A72, S98 und Y99 ausgewählt sind, definiert ist (vergl. 8).
9 führt die Röntgenkoordinaten des Protein-Inhibitor-Komplexes auf, der für Modellierungszwecke verwendet werden kann. Aus diesen Koordinaten ist ersichtlich, dass der von der Anmelderin erhaltene Komplex zwei Moleküle des Inhibitors enthält, jedoch ergab das Modell, dass der zweite Inhibitor sich außerhalb des tiefen Hohlraums befindet und nicht in signifikanter Weise mit dem Protein in Wechselwirkung tritt. Ferner sind die folgenden Aminosäuren aufgrund ihrer hohen Flexibilität, die sie gegenüber Röntgenstrahlen unsichtbar macht, modellhaft als Alanin ausgebildet: E2, K107, K173, S180, M182, H183 und P196.
Gemäß Harris & Botchan, (Science, Bd. 284 (5420) (1999), S. 1673) weisen verschiedene E2-Proteine durchschnittlich nur eine 30 %ige Aminosäure-Sequenzidentität auf. Jedoch lässt eine Mutationsanalyse darauf schließen, dass verschiedene E2 TADs gleich gefaltet sind und einen gleichen Wirkungsmechanismus aufweisen. Berücksichtigt man diese letzte Feststellung, weisen die Aminosäurecluster, die die von der Anmelderin identifizierte Inhibitor-Bindungstasche definieren, einen überraschenden Betrag an Identität/Ähnlichkeit auf, selbst zwischen HPVs von geringem Risiko und hohem Risiko (10). Der erste identifizierte Cluster umfasst die Seitenkette der Aminosäure Y19, die sich aus dem Taschenbereich herausbewegt und dadurch den tiefen Hohlraum öffnet. Diese Aminosäure ist unter verschiedenen HPV-Typen hochgradig konserviert, wobei eine 100%ige Identität zwischen HPV-6, -11, -16 und -18 besteht. Der zweite Cluster umfasst Histidin 32 und Tryptophan 33, die den tiefen Hohlraum der Tasche definieren. Histidin 32 ist zwischen HPV-6 und -11 identisch und zeigt eine starke Ähnlichkeit zwischen HPV von geringem Risiko und HPV von hohem Risiko, während Tryptophan 33 unter den vier Typen zu 100 % identisch ist. Schließlich umfasst der vierte Cluster Leucin 94, das ebenfalls den tiefen Hohlraum der Tasche definiert und zwischen den vier HPV-Typen zu 100 % konserviert ist.
Bei der Definition des Bodens der tiefen Tasche ist H29 unter HPV-6, -11 und -16 identisch und in HPV-18 ähnlich. Gleichermaßen ist T97 unter HPV-6, -11 und -18 identisch und in HPV-16 ähnlich.
Bei der Definition des flachen Hohlraums der Tasche ist die Aminosäure L15 Bestandteil des ersten identifizierten Clusters und hochgradig ähnlich zwischen HPV von geringem Risiko und HPV von hohem Risiko. Innerhalb des zweiten Clusters ist I36 ebenfalls hochgradig ähnlich, während E39 unter sämtlichen vier Typen hochgradig konserviert ist. Ein dritter Cluster wird identifiziert, der den flachen Hohlraum der Bindungstasche auskleidet, während K68 und N72 beide hochgradig unter den Typen konserviert sind. Schließlich ist N71 identisch zwischen HPV-6 und -11 und zeigt Ähnlichkeit zu den Typen von hohem Risiko. Die flache Tasche umfasst ferner die Aminosäuren des vierten Clusters, wie S98 und Y99, die ebenfalls unter den verschiedenen HPV-Typen hochgradig ähnlich sind.
Der hohe Grad an Identität/Ähnlichkeit stellt einen starken Hinweis darauf dar, dass diese Tasche, wie sie gemäß dem erfindungsgemäßen HPV-11-E2 TAD definiert ist, sich auch in anderen HPV-Typen findet, entweder solchen von geringem Risiko oder solchen von hohem Risiko. Vermutlich besteht bei Inhibitoren, die an diese Tasche binden, insbesondere an den tiefen Hohlraum, wie sie modellhaft unter Verwendung der Daten von 9 dargestellt worden ist, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Bindung/Hemmung des E2-Proteins aus einem breiten Bereich von Papillomaviren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Kristall, umfassend ein PV E2 TAD-artiges Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist:
Kristall nach Anspruch 1, wobei das E2 TAD eine Inhibitor-Bindungstasche aufweist, die einen tiefen Hohlraum umfasst, der durch die Koordinaten der Aminosäuren H32, W33 und L94 gemäß 9 gebildet ist.
Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, gemäß Anspruch 1, umfassend: a) das Vermischen des gereinigten PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das in einem Reinigungspuffer enthalten ist, mit solubilisiertem Inhibitor L zur Erzeugung einer Komplexlösung mit einem Gehalt an dem PV E2 TAD-L-Komplex; und b) Kristallisieren des Komplexes aus a) in einem Kristallisationspuffer.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe a) der Reinigungspuffer ein Reduktionsmittel, das aus TCEP und DTT ausgewählt ist, enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich beim Reduktionsmittel um TCEP in einer Konzentration von 1 mM bis 10 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das TCEP in einer Konzentration von 5 mM vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe a) der Reinigungspuffer bei einem pH-Wert von 7 bis 9 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Reinigungspuffer bei einem pH-Wert von 8 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe a) der Reinigungspuffer ferner ein Salz, das aus NaCl, (NH₄)₂SO₄ oder KCl ausgewählt ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Salz um NaCl in einer Konzentration von 200 mM bis 800 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Salz um NaCl in einer Konzentration von 500 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe a) der Reinigungspuffer ferner einen Stabilisierungspuffer, der aus Tris-HCl, HEPES oder bis-Tris ausgewählt ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich beim Stabilisierungspuffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 0 mM bis 50 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich beim Stabilisierungspuffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 25 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in der Stufe a) der Reinigungspuffer ferner EDTA in einer Konzentration von 0 mM bis 1 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das EDTA in einer Konzentration von 0 mM bis 0,5 mM vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das EDTA in einer Konzentration von 0,1 mM vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe a) das PV E2 TAD in einer Konzentration von 5 mg/ml bis 15 mg/ml im Reinigungspuffer verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das PV E2 TAD in einer Konzentration von 10 mg/ml PV E2 TAD im Reinigungspuffer verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe b) der Kristallisationspuffer aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: MES, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat und Natriumsuccinat.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei es sich beim Kristallisationspuffer um MES in einer Konzentration von 50 mM bis 0,2 M handelt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich beim Kristallisationspuffer um MES in einer Konzentration von 0,1 M handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe b) der Kristallisationspuffer ferner ein Fällungsmittel enthält, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist: MPD, Isopropanol, Ethanol und tert.-Butanol.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich beim Fällungsmittel um MPD in einer Konzentration von 30 % bis 40 % handelt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich beim Fällungsmittel um MPD in einer Konzentration von 35 % handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe b) der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 5,5 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Stufe b) die Kristallisation bei 0 °C bis 10 °C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Kristallisation bei 4 °C durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten, PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, umfassend: a) das Solubilisieren des Inhibitors L in einem Kristallisationspuffer; und b) das Einweichen des kristallisierten PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2 in a).
Verfahren zur Herstellung eines kristallisierten, PV E2 TAD-artigen Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, das mit einem Inhibitor L komplexiert ist, umfassend: das Zugeben des Inhibitors L zu einem Kristallisationspuffer, der kristallisiertes, PV E2 TAD-artiges Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2 enthält.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei der Kristallisationspuffer aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: MES, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat und Natriumsuccinat.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei es sich beim Kristallisationspuffer um Natriumsuccinat in einer Konzentration von 50 mM bis 0,2 M handelt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei es sich beim Kristallisationspuffer um Natriumsuccinat in einer Konzentration von 0,1 M handelt.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Kristallisationspuffer ferner PEG8K-, PEG4K- oder PEG5K-monomethylether enthält.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Kristallisationspuffer ferner PEG5K-monomethylether in einer Konzentration von 10 % bis 25 % enthält.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Kristallisationspuffer ferner PEG5K-monomethylether in einer Konzentration von 18 % enthält.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Kristallisationspuffer bei einem pH-Wert von 5,0 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Kristallisationspuffer ferner Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 0,1 M bis 0,4 M enthält.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Kristallisationspuffer Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 0,2 M enthält.