DE60214869T2

DE60214869T2 - Cytochrome p450 2c9 kristalle, strukturen und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60214869T2
Application number: DE60214869T
Authority: DE
Inventors: c/o Astex Therapeutics Ltd Pamela Ann WILLIAMS; Marie Jose COSME; c/o Astex Therapeutics Ltd Alison Cambridge WARD; Astex Therapeutics Ltd Suzanne Clare Cambridge BREWERTON; c/o Astex Therapeutics Ltd Bruce John Cambridge HAMILTON; c/o Astex Therapeutics Ltd Harren Cambridge JHOTI; c/o Astex Therapeutics Ltd Michelle Ann JONES; c/o Astex Therapeutic Ltd Laurent M. M. VUILLARD; c/o Astex TherapeuticsLtd Mark Gareth Cambridge WILLIAMS
Original assignee: Astex Technology Ltd; Astex Therapeutics Ltd
Current assignee: Astex Technology Ltd; Astex Therapeutics Ltd
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2022-10-26
Also published as: ATE340190T1; WO2003035693A3; US20030170842A1; JP2005522989A; EP1438337A2; WO2003035693A2; DE02770119T1; EP1438337B1; DE60214869D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das menschliche Cytochrom-P450-Protein 2C9, Verfahren zu dessen Kristallisation, seine Röntgenkristallstruktur und die Verwendung davon.
Hintergrund der Erfindung
Cytochrom-P450s (CYP450) bilden eine sehr große und komplexe Gen-Überfamilie an Hämoproteinen, die physiologisch wichtige Verbindungen in vielen Spezies von Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren metabolisieren. Cytochrom-P450s sind im oxidativen, peroxidativen und reduktiven Stoffwechsel zahlreicher und unterschiedlicher endogener Verbindungen, wie z.B. Steroide, Galle, Fettsäuren, Prostaglandine, Leukotriene, Retinoide und Lipide, wichtig. Viele dieser Enzyme metabolisieren ebenso eine große Bandbreite an Xenobiotika, unter anderem Arzneimittel, Umweltverbindungen und Schadstoffe. Ihre Involvierung in den Arzneimittel-Stoffwechsel ist weitreichend, Schätzungen zufolge werden 50 % aller bekannten Arzneimittel (Wirkstoffe) auf eine beliebige Art und Weise durch die Wirkung von CYP450-Enzymen beeinflusst. Die pharmazeutische Industrie verwendet beachtliche Ressourcen darauf, um Wirkstoffkandidaten zu optimieren, um deren schädliche Wechselwirkungen mit den CYP450-Enzymen zu vermeiden. Ein weiterer Grad an Schwierigkeiten entsteht aus der Tatsache, dass diese Enzyme unterschiedliche Gewebsverteilungen und Polymorphismen zwischen einzelnen Individuen und ethnischen Populationen aufweisen.
Die meisten Säugetier-P450s befinden sich in der Leber, es haben jedoch auch andere Organe und Gewebe hohe Konzentrationen gewisser Cytochrom-P450s, unter anderem die Darmwand, die Lunge, die Nieren, die Nebennierenrinde und das Nasenepithel. Säugetiere besitzen etwa 50 einzigartige CYP450-Gene, und jedes Mitglied dieser Familie ist 45–55 KDa groß und enthält eine Hämgruppierung, die eine Zwei-Elektronen-Aktivierung von Sauerstoff katalysiert. Die Quelle der Elektronen kann zur Klassifizierung der CYP450s verwendet werden. Jene, die Elektronen in ei ner Drei-Protein-Kette erhalten, in der Elektronen von einem Flavinadenin-Dinucleotid (FAD), das Reduktase enthält, zu einem Eisen-Schwefel-Protein fließen und danach zu P450, gehören der Gruppe der Klasse-I-P450s an und umfassen die meisten der bakteriellen Enzyme. Klasse-II-P450s erhalten Elektronen von einer Reduktase, die sowohl FAD als auch Flavinmononucleotid (FMN) enthält, und umfassen die microsomalen P450s, die die Hauptverantwortlichen des Wirkstoff-Stoffwechsels sind. Die microsomalen Säugetier-Cytochrom-P450s sind Integralmembranproteine, die durch eine N-terminate, transmembrandurchdringende α-Helix verankert sind. Sie sind in die Membran des endoplasmatischen Retikulums durch ein kurzes, hochgradig hydrophobes N-terminales Segment insertiert, das als nicht spaltbare Signalsequenz zur Insertion in die Membran fungiert. Der Rest des Säugetier-Cytochrom-P450-Proteins ist eine globuläre Struktur, die in den cytoplasmatischen Raum hineinragt. Daher ist der Großteil des Enzyms hin zur cytoplasmatischen Oberfläche der Lipiddoppelschicht ausgerichtet. P450s erfordern andere enzymatische Membrankomponenten zur Aktivität, unter anderem die Flavoprotein-NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreductase und, in einigen Fällen, Cytochrom-b5. Eine einzige Cytochrom-P450-Oxidoreductase unterstützt die Aktivität aller microsomaler Säugetier-Enzyme, indem sie direkt mit den P450s wechselwirkt und die erforderlichen zwei Elektronen von NADPH transferiert. Cytochrom-P450s sind in der Lage, eines der zwei Sauerstoffatome eines O₂-Moleküls in eine große Bandbreite an Substraten zu inkorporieren, mit einhergehender Reduktion des anderen Sauerstoffatoms durch zwei Elektronen zu H₂O. Cytochrom-P450 katalysieren bekannterweise Hydroxylierungen, E-poxidierungen, N-, S- und O-Dealkylierungen, N-Oxidationen, Sulfoxidierungen, Dehalogenierungen und andere Reaktionen.
Die Gene der P450-Überfamilie wurden von Nelson et al. (Pharmacogenetics 6, 1–42 (1996)) kategorisiert, die eine systematische Nomenklatur für die Mitglieder dieser Familie vorschlugen. Diese Nomenklatur wird nach dem Stand der Technik weitverbreitet verwendet und hierin angewandt. Nelson et al. stellen Querverweise zu Sequenzdatenbank-Einträgen für P450-Sequenzen bereit.
Homo sapiens besitzt 17 Cytochrom-P450-Genfamilien und 42 Unterfamilien, die eine Gesamtmenge von mehr als 50 sequenzierte Isoformen aufweisen. Cytochrom-P450s aus den Familien 1, 2 und 3 stellen die Hauptstoffwechselwege für den Wirkstoff-Metabolismus dar. Viele Wirkstoffe beruhen auf dem hepatischen Stoffwechsel durch Cytochrom-P450s für die Beseitigung aus dem Blutkreislauf und zur pharmakologischen Inaktivierung. Im Gegenteil dazu müssen einige Wirkstoffe im Körper von P450s in ihre pharmakologisch aktiven Metaboliten umgewandelt werden. Viele vielversprechende Leitverbindungen werden in der Entwicklungsphase aufgrund ihrer Wechselwirkung mit einer oder mehreren P450(s) Abstand terminiert. Eines der größten Probleme in der Entdeckung von Wirkstoffen ist das Vorhersagen der Rolle der Chytochrom-P450s in Bezug auf den Stoffwechsel oder die Modifikation von Leitwirkstoffen. Die frühe Erkennung der Stoffwechselprobleme, die mit einer chemischen Leitreihe assoziiert werden, ist von höchster Bedeutung für die pharmazeutische Industrie. Das Erhalten von Kristallstrukturen der wichtigsten menschlichen wirkstoffmetabolisierenden Cytochrom-P450s wäre für das Wirkstoffdesign von sehr großem Wert, da dies detaillierte Informationen darüber bereitstellen würde, auf welche Art und Weise P450-Enzyme Wirkstoffmoleküle sowie ihren Modus des Wirkstoffbindens erkennen. Dies würde es wiederum den pharmazeutischen Unternehmen ermöglichen, Strategien zur Modifikation der Stoffwechsel-Clearance zu entwickeln und die Verschleißraten an sich in Entwicklung befindlichen Verbindungen zu minimieren.
Die wichtigsten menschlichen CYP450-Isoformen, die in den Wirkstoff-Stoffwechsel involviert sind, umfassen CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4. Das Ausmaß der Sequenzidentität zwischen Mitgliedern dieser Familien reicht von etwa 20–80 %, wobei ein Großteil der Variabilität in den Resten in die Substraterkennung involviert war. CYP450-Enzyme sind ebenso in Bakterien vorhanden, und ein großer Teil des Wissens über Substraterkennung stammt von den Kristallstrukturen ab, die aus bakteriellen CYP450-Enzymen erhalten wurden.
Es ist auf dem Gebiet der Proteinchemie wohlbekannt, dass das Kristallisieren eines Proteins ein risikoreiches und schwieriges Verfahren ist, bei dem es keine klaren Er folgserwartungen gibt. Nun ist offensichtlich, dass die Proteinkristallisation das Haupthindernis bei der Bestimmung der Proteinstruktur ist. Aus diesem Grund hat sich die Proteinkristallisation zu einem eigenen und selbstständigen Forschungsbereich entwickelt und ist nicht einfach als Extension der proteinkristallographischen Laborarbeit anzusehen. Es gibt zahlreiche Verweise, in denen die Schwierigkeiten beschrieben werden, die mit der Zucht von Proteinkristallen assoziiert sind. Z.B. A.M. Kierzek und P. Zielenkiewicz, Models of protein crystal growth, Biophysical Chemistry 91, 1–20 (2001); J.M. Wiencek, New Strategies for crystal growth, Annu. Rev. Biomed. Eng. 1, 505–534 (1999).
Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass die Kristallisation von Proteinmolekülen aus einer Lösung die Hauptschwierigkeit im Verfahren der Bestimmung von Proteinstrukturen ist. Die Gründe dafür sind zahlreich; Proteine sind komplexe Moleküle, und das empfindliche Gleichgewicht, das spezifische und nicht spezifische Wechselwirkungen mit anderen Proteinmolekülen und kleinen Molekülen in einer Lösung involviert, ist schwierig vorherzusagen.
Jedes Protein kristallisiert unter einer einzigartigen Reihe an Bedingungen, die nicht im Voraus vorhergesagt werden können. Das einfache Übersättigen des Proteins, um es aus der Lösung herauszubringen, könnte nicht funktionieren, und das Ergebnis wäre, in den meisten Fällen, ein amorphes Präzipitat. Es werden viele Fällungsmittel verwendet, zu den häufig verwendeten zählen verschiedene Salze und Polyethylenglykole, es sind jedoch auch andere bekannt. Zusätzlich können Additive, wie z.B. Metalle und Detergenzien, hinzugefügt werden, um das Verhalten des Proteins in einer Lösung zu modulieren. Es sind viele Sets erhältlich (z.B. von Hampton Research), die versuchen, so viele Parameter im Kristallisationsraum wie nur möglich abzudecken, in vielen Fällen sind diese jedoch lediglich ein Ausgangspunkt für die Optimierung von kristallinen Präzipitaten und Kristallen, die für die Diffraktionsanalyse ungeeignet sind. Eine erfolgreiche Kristallisation wird durch Wissen über das Verhalten von Proteinen in Bezug auf Löslichkeit, Abhängigkeit von Metallionen für die korrekte Faltung oder die Aktivität, Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und anderen erhältlichen Informationen unterstützt. Trotzdem wird die Kristallisation von Proteinen oftmals als ein zeitraubender Prozess angesehen, wobei spätere Experimente auf Beobachtungen bereits durchgeführter Versuche aufbauen.
In Fällen, in denen Proteinkristalle erhalten werden, sind diese nicht notwendigerweise immer für die Diffraktionsanalyse geeignet; sie könnten in ihrer Auflösung eingeschränkt sein, und danach kann es sich als schwierig herausstellen, sie bis zu jenem Punkt zu verbessern, an dem sie in der für die Analyse erforderlichen Auflösung beugen. Eine eingeschränkte Auflösung eines Kristalls kann auf mehrere Dinge zurückgeführt werden. Sie kann auf eine intrinsische Mobilität des Proteins innerhalb des Kristalls zurückgeführt werden, was schwierig zu überwinden sein kann, sogar bei anderen Kristallformen. Sie kann auf einen hohen Lösungsmittelgehalt innerhalb des Kristalls zurückgeführt werden, was in der Folge zu schwacher Streuung führt. Alternativ dazu könnte sie auf Defekte innerhalb des Kristallgitters zurückzuführen sein, was bedeutet, dass die gebeugten Röntgenstrahlen von Struktureinheit zu Struktureinheit innerhalb des Gittes nicht vollständig in Phase sind. Jedes dieser oder eine Kombination dieser Szenarien könnte bedeuten, dass sich die Kristalle zur Strukturbestimmung nicht eignen.
Einige Proteine kristallisieren nie, und nach einem angemessenen Versuch ist es notwendig, das Protein selbst zu analysieren und in Betracht zu ziehen, ob es möglich ist, einzelne Domänen herzustellen, verschiedene N- oder C-terminale Trunkierungen herzustellen oder Punktmutationen durchzuführen. Es ist oftmals schwierig vorherzusagen, wie ein Protein erneut gentechnisch auf eine Art und Weise verändert werden könnte, um die Kristallisierbarkeit zu verbessern. Das Wissen der Erfinder über die Kristallisationsmechanismen ist noch unvollständig, und man weiß erst wenig über die Faktoren der Proteinstruktur, die in die Kristallisation involviert sind.
Bis zum Jahr 2000 wurden acht Cytochrom-P450-Strukturen mittels Röntgen-Kristallographie gelöst und sind öffentlich zugänglich. Alle der Cytochrom-P450s, deren Strukturen gelöst wurden, wurden in E. coli exprimiert. Sechs Strukturen entsprechen bakteriellen Cytochrom-P450s: P450cam (CYP101, Poulos et al., J. Biol. Chem. 260, 16122 (1985)), die Hämoproteindomäne von P450BM3 (CYP102, Ravi chandran et al., Science 261, 731 (1993)), P450terp (CYP108, Hasemann et al., J. Mol. Biol. 236, 1169 (1994)), P450eryF (CYP107A1, Cupp-Vickery und Poulos, Nature Struct. Biol. 2, 144 (1995)), P450-14α-Sterol-Demethylase (CYP51, Podust et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3068 (2001)), und die Kristallstruktur eines thermophilen Cytochrom-P450 (CYP119) von Archaeon sulfolobus solfataricus wurde gelöst (Yano et al., J. Biol. Chem. 275, 31086 (2000)). Die Struktur von Cytochrom-P450nor wurde aus dem denitrifizierenden Fungus Fusarium oxysporum erhalten (Shimizu et al., J. Inorg. Biochem. 81, 191 (2000)). Die achte Struktur ist jene der Kaninchen-2C5-Isoform, die erste und einzige Struktur eines Säugetier-Cytochrom-P450 (Williams et al., Mol. Cell. 5, 121 (2000)).
WO 0114565 betrifft die Verwendung von genetischem Material, das für ein Cyptochrom-P450-Protein kodiert, bei der Herstellung einer genetisch modifizierten Zelle, wobei diese Zelle die Fähigkeit besitzt, ein Pigment in Gegenwart von Indol oder einem Vorläufer, Analogon oder Derivat davon zu produzieren, und zwar bei der Expression dieses genetischen Materials. Hasemann et al. (J. Mol. Biol. 236 (4), 1169–85 (4. März 1994)) beschreiben die Kristallstruktur und die Verfeinerung des Cytochrom-P450terp bei einer Auflösung von 2,3 Å. Park et al. (Acta Crystallographica D56, 1173–1175 (2000)) beschreiben die Kristallisation und vorläufige Röntgenstrahlen-Diffraktionsanalyse von Cytochrom-P450-CYP119 aus Sulfolobus solfataricus. Ridderstrom et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 270 (3), 983–7 (21. April 2000)) beschreiben die Tatsache, dass die Arginine 97 und 108 in CYP2C9 wichtige Determinanten der katalytischen Funktion sind, wie dies von der Modellierung und der ortsgerichteten Mutagenese bestimmt wurde. V.A. Payne et al. (Proteins 37 (2), 176–90 (1. Nov. 1999)) beschreiben eine Homologiemodellierungs- und Substratbindungsstudie des menschlichen CYP2C9-Enzyms. Ekins et al. (Drug Metab. Dispos. 29 (7), 936–44 (Juli 2001)) beschreiben Pharmakophor und dreidimensionale quantitative Struktur-Aktivitäts-Verhältnisverfahren zur Modellierung von Cytochrom-p450-aktiven Stellen. Lewis (Exp. Toxicol. Pathol. 51 (4–5), 369–74 (Juli 1999)) beschreibt eine Homologiemodellierung menschlicher Cytochrom-P450s, die in den xenobiotischen Stoffwechsel involviert sind, und die Rationalisierung der Substratselektivität.
Der Grund, warum die Säugetier-Cytochrom-P450s im Vergleich zu ihren bakteriellen Gegenstücken besonders schwierig zu kristallisieren waren, ist auf die Natur dieser Proteine zurückzuführen. Die bakteriellen Cytochrom-P450s sind löslich, wohingegen die Säugetier-P450s membranassoziierte Proteine sind. Die strukturellen Studien an Säugetier-Cytochrom-P450s können daher die Kombination heterologer Expressionssysteme verwenden, die eine Expression von einzelnen Cytochrom-P450s in hohen Konzentrationen mit der Modifikation ihrer Sequenzen ermöglichen, um die Löslichkeit und das Verhalten dieser Proteine in einer Lösung zu verbessern.
Aufgrund signifikanter Sequenzunterschiede der bakteriellen Proteine und der Kaninchenproteine werden immer noch die Kristallstrukturen der menschlichen Isoformen benötigt, um die Rolle menschlicher CYP450-Enzyme im Wirkstoff-Stoffwechsel vollständig zu verstehen.
Ibeanu et al. (J. Biol. Chem, Band 271, 12496–12501 (1996)) beschreiben die Produktion modifizierter 2C9-Proteine in Hefe, in denen bestimmte Reste, unter anderem Ser 220 und Pro 221, verändert wurden. Von diesen veränderten Proteinen wurde herausgefunden, dass sie 2C19-artige Aktivität für Omeprazol aufwiesen. Die Proteine behielten die N-terminale Wildtyp-Sequenz bei.
Offenbarung der Erfindung
Es wurde eine Nomenklatur angewandt, um die Sekundärstruktur zu beschreiben, die in Cytochrom-P450s beobachtet wurde. Die Autoren der ersten Struktur eines P450, P450cam, bezeichneten die 12 Helixsegmente A bis L von der N-terminalen zur C-terminalen Richtung, und diese Benennung wurde weitergeführt, als weitere Strukturen bestimmt wurden. Zusätzlich dazu zeigten einige P450-Strukturen mehrere Helices, z.B. die Beschreibung von P450-BM3 zeigt 15 Helices (A, B, B', C, D, E, F, G, H, I, J, J', K, K', L), wobei die zusätzlichen Helices durch das Symbol ' markiert sind.
Jede Helix ist typischerweise 6 Aminosäuren (Helix H in 2C5) bis 32 Aminosäuren (Helix I in BM3) lang. Die Helices sind durch β-Stränge, kurze Linker und lange flexible Schleifen mit einer Länge von bis zu 30 Aminosäuren miteinander verbunden.
Unter diesen flexiblen Strukturen ist eine der am deutlichsten ausgeprägten die Schleife zwischen den F- und G-Helices („die F-G-Schleife"). Diese Schleife ist wahrscheinlich in den Substratzugangskanal involviert und könnte bewegt werden, um das Substrat an der aktiven Stelle unterzubringen. Über diese Schleife wurde ebenso geschrieben, dass sie, mit der N-Terminus-Domäne, an der Verankerung der Cytochrom-P450s an der Membran beteiligt ist.
In der 2C5-Struktur (PDB ID 1DT6) endet Helix F beim Rest 206, und Helix G beginnt beim Rest 228, die dazwischenliegende Schleife umfasst daher die Reste 207 bis 227 (Definitionen aus dem Sekundärstruktur-Zuweisungsprogramm DSSP (Kabsch und Sander, Biopolymers 22, 2577–2637 (1983))). Von diesen 21 Resten sind 12 nicht in der 2C5-Struktur zu sehen. Dies ist ein Anzeichen für ihre flexible Natur. Die Erfinder gehen daher davon aus, dass dies im Rest der C2-Familie und in anderen menschlichen P450s ähnlich sein wird. Von der Region wird angenommen, dass sie in vivo in eine Membran-Assoziierung des Enzyms sowie die Ausrichtung des Substratzugangskanäle involviert ist.
Unter Verwendung der von den Erfindern entwickelten Modelle prognostizierten die Erfinder, dass die F-G-Schleife in 2C9 von Leu208 bis zu Pro227 reichte. Diese Region enthält 20 Reste, von denen 11 als hydrophob klassifiziert werden können, was die Hypothese, dass diese Region in Membranen eingebettet sein kann oder, wie bereits vorgeschlagen wurde, in die Aggregation involviert sein kann, weiter unterstützt. Von der 2C9-Struktur der Erfindung (Definitionen aus DSSP) beginnt die Schleife zwischen den Helices F und G tatsächlich bei 209 und endet bei 227.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein auf der Verwendung von Computern basierendes Verfahren zur Analyse der Wechselwirkung einer Molekülstruktur mit einer P450-Struktur bereit, das Folgendes umfasst:

(a) die Bereitstellung einer 2C9-P450-Struktur aus einer beliebigen der Tabellen 1, 2, 3 und 8 oder Koordinaten mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen dieser Tabellen; oder zumindest 100 davon ausgewählte Koordinaten;
(b) die Bereitstellung einer Molekülstruktur, die an diese P450-Struktur angepasst werden soll, oder ausgewählter Koordinaten davon; und
(c) das Anpassen der Molekülstruktur an die P450-Struktur.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Prognose dreidimensionaler Strukturen von P450-Homologen (z.B. 2C8, 2C18 oder 2C19) oder Analoga einer unbekannten Struktur bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
die Anordnung eines repräsentativen Teils einer Aminosäuresequenz eines Ziel-P450-Proteins einer unbekannten, dreidimensionalen Struktur mit der Aminosäuresequenz des P450 aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8, um homologe Regionen der Aminosäuresequenzen abzugleichen;
die Modellierung der Struktur der übereingestimmten homologen Regionen des Ziel-P450 mit unbekannter Struktur nach den korrespondierenden Regionen einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen einer beliebigen der Tabellen 1, 2, 3 und 8;
die Bestimmung einer Konformation für dieses Ziel-P450 unbekannter Struktur, die im Wesentlichen die Struktur dieser übereingestimmten homologen Regionen erhält.
Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur eines Proteins bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das Bereitstellen der Koordinaten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen einer beliebigen der Tabellen 1, 2, 3 und 8; oder zumindest 100 davon ausgewählte Koordinaten, und
entweder (a) das Positionieren der Koordinaten in der Kristallelementarzelle des Proteins, um eine Struktur für das Protein zu bilden, oder (b) das Zuweisen von NMR-Spektren-Peaks des Proteins durch das Manipolieren der Koordinaten.
Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Verbindung bereit, die an ein P450-Protein gebunden ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das Bereitstellen eines Kristalls eines P450-Proteins;
das Einweichen des Kristalls in der Verbindung, um einen Komplex zu bilden; und
das Bestimmen der Struktur des Komplexes mithilfe der Daten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten.
Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Verbindung bereit, die an ein P450-Protein gebunden ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Mischen des P450-Proteins mit der Verbindung;
Kristallisieren eines P450-Protein-Verbindung-Komplexes; und
Bestimmen der Struktur des Komplexes mithilfe der Daten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 und 8 oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten.
Im Weiteren werden hierin und in den im Anhang befindlichen Ansprüchen bevorzugte Aspekte der Erfindung beschrieben.
Die oben genannten Aspekte der Erfindung tragen, sowohl alleine als auch in Kombination, zu Merkmalen der Erfindung bei, die als positiv angesehen werden.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Tabelle 1, in der die Koordinaten einer 2C9-Struktur dargestellt sind.
2 zeigt Tabelle 2, in der die Koordinaten einer 2C9-FG-Schleife-K206E-Struktur dargestellt sind.
3 zeigt Tabelle 3, in der die Koordinaten einer 2C9-FG-Schleifen-Struktur dargestellt sind, und
4 zeigt Tabelle 7, in der modellierte Koordinaten der Reste 215, 216, 220, 221, 222 und 223 eines 2C9-Wildtyp-Proteins dargestellt sind.
5 zeigt Tabelle 8, in der eine verfeinerte Struktur einer 2C9-FG-Schleife-K206E dargestellt ist.
6 zeigt Tabelle 11, in der Bedingungen dargestellt sind, unter denen Proteinkristalle der Erfindung erhalten wurden.
7 zeigt Tabelle 18, in der ein Homologiemodell von 2C19 dargestellt ist.
8 zeigt Tabelle 19, in der 2C18-Ersatzkoordinaten dargestellt sind.
9 zeigt Tabelle 20, in der 2C8-Ersatzkoordinaten dargestellt sind.
10 zeigt die Sequenzanordnung der N-terminal trunkierten 2C9-Varianten und 2C9trunk mit der veröffentlichten 2C9-Wildtypsequenz (Meehan et al., Am. J. Hum. Genet. 42, 26 (1988)).
11 zeigt Daten aus 4-Diclofenac-Hydroxylase-Tests.
Beschreibung der Tabellen
Tabelle 1 (siehe 1) zeigt die Koordinaten der in Beispiel 9 erhaltenen 2C9-Struktur.
Tabelle 2 (siehe 2) zeigt die Koordinaten der in Beispiel 11 erhaltenen 2C9-FG-Schleife-K206E-Struktur.
Tabelle 3 (siehe 3) zeigt die Koordinaten der in Beispiel 12 erhaltenen 2C9-FG-Schleife.
Tabelle 4 (siehe Beispiel 13) listet Reste auf, die sich entlang der Bindungsstelle von 2C9 befinden.
Tabelle 5 (siehe Beispiel 13) listet Reste auf, von denen bisher angenommen wurde, dass sie sich in der Bindungsstelle befinden.
Tabelle 6 (siehe Beispiel 13) listet neu identifizierte Bindungstaschenreste auf.
Tabelle 7 (siehe 4) stellt modellierte Koordinaten der Reste 215, 216, 220, 221, 222 und 223 eines 2C9-Wildtyp-Proteins dar.
Tabelle 8 (Beispiel 16 und 5) zeigt eine verfeinerte 2C9-FG-Schleife-K206E-Struktur.
Tabelle 9 (Beispiel 17) beschreibt weiters 2C9-Proteine sowie die Primer und Verfahren, die verwendet werden, um diese zu erhalten.
Tabelle 10 (Beispiel 17) beschreibt Kontroll-2C9-Proteine sowie die Primer und Verfahren, die verwendet werden, um diese zu erhalten.
Tabelle 11 (Beispiele 20 und 24 und 6) zeigt die Kristallisationsbedingungen für 2C9-Proteine.
Tabelle 12 (Beispiel 18) zeigt Massenspektrometriedaten für 2C9-Proteine.
Tabelle 13 (Beispiel 19) zeigt Aktivitätsdaten für 2C9-Proteine.
Tabelle 14 (Beispiel 21) zeigt 2C9-2C19-Chimären und die Primer und/oder Verfahren, die verwendet werden, um diese zu erhalten.
Tabelle 15 (Beispiel 22) zeigt Massenspektrometriedaten für 2C9-2C19-Proteine.
Tabelle 16 (Beispiel 23) zeigt die Aktivität von 2C9-FG-Schleife-K206E (1155).
Tabelle 17 (Beispiel 24) zeigt die Aktivität von 2C9-2C19-Chimären.
Tabelle 18 (Beispiel 25 und 7) zeigt ein Homologiemodell von 2C19.
Tabelle 19 (Beispiel 26 und 8) zeigt 2C18-Ersatzkoordinaten.
Tabelle 20 (Beispiel 27 und 9) zeigt 2C8-Ersatzkoordinaten.
Beschreibung der Sequenzen
Seq.-ID Nr. 1 ist eine DNA-Sequenz von 2C9trunk.
Seq.-ID Nr. 2 ist die Aminosäuresequenz von 2C9trunk.
Seq.-ID Nr. 3 ist die DNA-Sequenz von 2C9-P220 (wird auch als 1072 bezeichnet).
Seq.-ID Nr. 4 ist die Aminosäuresequenz von 2C9-P220.
Seq.-ID Nr. 5 ist die DNA-Sequenz von 2C9-FG-Schleife (wird auch als 1015 bezeichnet).
Seq.-ID Nr. 6 ist die Aminosäuresequenz von 2C9-FG-Schleife.
Seq.-ID Nr. 7 ist die DNA-Sequenz von 2C9-FG-Schleife-K206E (wird auch als 1155 bezeichnet).
Seq.-ID Nr. 8 ist die Aminosäuresequenz von 2C9-FG-Schleife-K206E.
Seq.-ID Nr. (2x+7) und (2x+8), in denen x eine ganze Zahl von 1 bis 49 ist, sind die DNA- bzw. die Aminosäuresequenzen der 2C9-Proteine, die als Klone 1078, 1081, 1082, 1085, 1097, 1100, 1101, 1102, 1115, 1116, 1117, 1118, 1121, 1122, 1123, 1165, 1220, 1319, 1339, 1340, 1361, 1362, 1363, 1364, 1366, 1367, 1368, 1369, 1370, 1371, 1372, 1391, 1392, 1394, 1396, 1397, 1424, 1443, 1444, 1475, 1477, 1491, 1595, 1600, 1610, 1632, 1661, 1662 bzw. 1664 bezeichnet werden. Somit ist die DNA-Sequenz, die für Klon 1078 kodiert, Seq.-ID Nr. 9 und ihre korrespondierende Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 10, für Klon 1664 ist die DNA Seq.-ID Nr. 105 und die korrespondierende Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 106.
Seq.-ID Nr. 107 ist die DNA-Sequenz von Klon 1039 (Kontrollklon).
Seq.-ID Nr. 108 ist die Aminosäuresequenz von Klon 1039.
Seq.-ID Nr. 109 ist die DNA-Sequenz von Klon 1365 (Kontrollklon).
Seq.-ID Nr. 110 ist die Aminosäuresequenz von Klon 1365.
Seq.-ID Nr. 111 ist die DNA-Sequenz von Klon 1423 (Kontrollklon).
Seq.-ID Nr. 112 ist die Aminosäuresequenz von Klon 1423.
Weitere Sequenzen werden im begleitenden Text identifiziert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. 2C9-Proteine und ihre Produktion
Die Sequenz von 2C9 ist auf dem Gebiet der Erfindung erhältlich, z.B. aus einer Reihe an Datenbankquellen, die in Nelson et al., ibid. (1996), zitiert werden. Dies umfasst die SwissProt-Datenbank, in der 2C9 Eintrag Nr. P11712 ist.
Das 2C9-P450-Protein wird erwünschtermaßen in seiner N-terminalen Region trunkiert, um die hydrophobe Transmembran-Domäne zu deletieren, und die Region wird durch eine kurze (z.B. 8- bis 12-) Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere (z.B. 3, 4 oder 5) positiv geladene Aminosäuren enthält, ersetzt. Zur Expression des menschlichen 2C9-P450 verwendeten die Erfinder eine N-terminate Sequenz MAKKTSSKGR (Seq.-ID Nr. 114) anstelle der 29 N-terminalen Aminosäurereste, was die Expression der Proteine in E. coli und die Löslichkeit erhöht.
2C9-P450 kann gegebenenfalls eine Markierung umfassen, wie z.B. ein C-terminale Polyhistidin-Markierung, um eine Gewinnung und Reinigung des Proteins zu ermöglichen.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Position des Prolin-Rests in der F-G-Schleife in der Bildung eines P450-Kristalls eine signifikante Rolle zu spielen scheint. Insbesondere scheint die Gegenwart eines Prolins an Position 220 oder 222 in 2C9 wichtig für das Stattfinden der Kristallisation zu sein.
Im 2C9-Wildtyp gibt es einen Prolin-Rest an Position 221. Seine Verschiebung zu Position 220, durch Substituieren von Position 220 mit Prolin und Entfernen von Pro221 (durch Substituieren mit einem anderen Rest, jedoch vorzugsweise mit Alanin oder Threonin), in 2C9 fördert die Kristallisation. Alternativ dazu kann das Prolin zu Position 222 bewegt werden, wobei die Position 221 gleichfalls substituiert wird.
In 2C9 haben die Erfinder die Veränderungen an Positionen 220 und 221 mit und ohne andere(n) Veränderungen durchgeführt. Wurden andere Veränderungen durchgeführt, so waren diese I215V, C216Y, I222L und I223L, obwohl es nicht essentiell ist, dass eine beliebige oder alle dieser durchgeführt werden, um für eine Kristallisation zu sorgen.
Die Experimente der Erfinder basierten auf der Verwendung einer besonderen N-terminalen Trunkierung von 2C9, wie dies in Seq.-ID Nr. 2 dargelegt und in 10 abgebildet ist. Dieses Protein umfasst ebenso eine Polyhistidin-Markierung am C- Terminus. Die N-terminale Trunkierung und die Markierung sind beides Merkmale, die unter Anwendung von Routinefähigkeiten vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung variiert werden können. Es können z.B. alternative N-terminale Sequenzen verwendet werden, z.B. für die Produktion in anderen Wirtszellen als E. coli. Ebenso können, wie unten stehend beschrieben, andere Markierungen zur Reinigung des Proteins verwendet werden. Diese N- und C-terminalen Modifikationen können bei einem 2C9-Protein durchgeführt werden, das die Kernsequenz der Reste 31–490 der in 10 dargestellten Wildtypsequenz enthält.
Hierin beschrieben ist ein P450-2C9-Protein, das folgende Veränderungen umfasst:
Position 220 oder Position 222 ist Prolin; und
gegebenenfalls werden bis zu 30, z.B. bis zu 25, z.B. bis zu 10, z.B. bis zu 5, andere Positionen verändert,
wobei die Positionen 220 und 222 gemäß dem Wildtyp 2C9 nummeriert sind. Diese Nummerierung ist in 10 dargestellt.
Vorzugsweise betrifft die Veränderung Position 220.
Aus der obigen Diskussion geht deutlich hervor, dass mit 2C9-Protein ein Protein gemeint ist, das die Reste 31 bis 490 der Wildtypsequenz umfasst, gegebenenfalls mit N- und/oder C-terminalen Sequenzen, die bereitgestellt werden, um die Expression und die Gewinnung des Proteins zu vereinfachen.
Wo vorhanden, ist die N-terminale Sequenz vorzugsweise nicht die Wildtypsequenz. Sie ist vorzugsweise kürzer als die Wildtypsequenz (die 30 Aminosäuren beträgt). Die N-terminale Region, die an Rest 31 gebunden ist, ist vorzugsweise die in den begleitenden Beispielen dargestellte Trunkierung, d.h. Seq.-ID Nr. 114 plus ein Prolin-Rest zwischen diesem und Rest 31 (ebenso Prolin). Diese Art der N-terminalen Sequenz reduziert im Vergleich zur Wildtypsequenz die Tendenz von 2C9, sich an Membranen zu binden und zu aggregieren.
Wo vorhanden, ist die C-terminale Sequenz vorzugsweise nicht größer als 30 und insbesondere bevorzugt nicht größer als 10 Aminosäuren.
In einem bevorzugten Aspekt betrifft eine der bis zu 30 Veränderungen die Position 221, sodass es sich nicht um Prolin handelt. Es ist jedoch nicht essentiell, wie hierin gezeigt (Klon 1078), dass Kristalle mit Prolin an Position 221 erhalten werden können, solange eine der oben durchgeführten Veränderungen ebenso inkludiert wird.
Ein besonderer Vorteil der oben genannten Proteine ist die Tatsache, dass diese kristallisierbar sind. D.h. die Erfinder haben herausgefunden, dass sie in der Lage waren, Kristalle zu bilden, die Röntgenstrahlen beugen, und daher waren die Erfinder in der Lage, diese Kristalle zu analysieren, um strukturelle Koordinatendaten in einer Auflösung von 3,1 Å oder auch einer besseren Auflösung bereitzustellen.
Ein weiteres, vorteilhaftes Merkmal einiger der hierin beschriebenen 2C9-Proteine ist, dass die Erfinder in der Lage waren, Kristalle eines P450-Proteins in Abwesenheit eines Liganden zu erhalten. Diese Kristalle sind für das Screening von Liganden im Hinblick auf die Bestimmung von Co-Komplex-Strukturen nützlich. Die Bestimmung der Molekülstruktur von 2C9 kann ebenso in einem auf Computern basierenden In-Silico-Liganden-Screening verwendet werden.
Die Erfinder haben ebenso zusätzliche Veränderungen der 2C9-Wildtypsequenz gezeigt, zusätzlich zu den Veränderungen an einer beliebigen Position von 220–222, die eingeführt werden können. In den Klonen von 2C9, die in den beigefügten Beispielen dargelegt sind, wird eine Reihe spezifischer Veränderungen dargestellt. Diese umfassen:

– Veränderungen der FG-Schleifen-Region. Eine Reihe an Klonen weisen solche Veränderungen auf, unter anderem der Klon 2C9-FG-Schleife (3 Veränderungen), der Klon 1363 (3 Veränderungen), die Klone 1361, 1362, 1364, 1369 (2 Veränderungen) und die Klone 1366 und 1371 (1 Veränderung).
– Veränderungen der Oberflächenregion von 2C9. Solche Veränderungen werden hierin durch Klon 1123 (3 Veränderungen), die Klone 1102, 1340, 1397, 1443 (2 Veränderungen) und die Klone 1081, 1082, 1085, 1097, 1100, 1101, 1115, 1116, 1117, 1118, 1121, 1122, 1165, 1339, 1391, 1392, 1394, 1396 (1 Veränderung) veranschaulicht. Diese Oberflächenveränderungen können zusätzlich zu den FG-Schleifen-Veränderungen erfolgen.
– bis zu 20 Veränderungen insgesamt zusätzlich zu Veränderungen an den Positionen 220 und 221; z.B. Klon 1595 (20 Veränderungen), 1600 (13) und 1632 (11).

Somit besitzt Klon 1595 insgesamt 22 Veränderungen gegenüber dem Wildtyp – 6 in der FG-Schleife (einschließlich 220, 221), 3 an der aktiven Stelle, 12 an der Oberfläche. Von diesen sind 9 konservierte Veränderungen und 13 nicht konservierte Veränderungen.
Die Daten der Erfinder zeigen, dass zusätzlich zu den spezifischen 220- oder 222-Veränderungen eine Reihe anderer Positionen durchgeführt werden kann und trotzdem ein Protein erhalten wird, das kristallisiert werden kann.
In einem Aspekt sind die Veränderungen, die eingeführt werden können, Veränderungen, die Reste einführen, die an der korrespondierenden Position in einem anderen Cytochrom-P450-Molekül zu finden sind. Die korrespondierende Position kann mittels Anordnung des anderen P450-Moleküls mit der Sequenz des 2C9-Wildtyps gefunden werden, um die Homologie zwischen den beiden zu maximieren. Die Veränderungen können insbesondere aus einem anderen Cytochrom-P450-Molekül stammen, das aus der aus 2C19, 2C18 und 2C8 bestehenden Gruppe ausgewählt wurde. Das unten stehende Beispiel 21 legt die Produktion von Proteinen dar, in denen Reste aus 2C19 in die 2C9-Sequenz substituiert werden.
Die Beispiele 25 bis 27 zeigen eine Homologiemodellierung der Proteine 2C19, 2C18 bzw. 2C8. Die diesen Beispielen beigefügten Tabellen können verwendet werden, um die Reste dieser Proteine zu identifizieren, die in 2C9 substituiert werden können.
In einem anderen Aspekt wird hierin ein Protein beschrieben, das aus der aus Seq.-ID Nr. (2x+2) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin x eine ganze Zahl von 1 bis 52 ist. Diese Proteine teilen alle das gemeinsame Merkmal der Einführung eines Prolin-Rests an Position 220 oder 222, was die Kristallisation von 2C9 erleichtert.
Expression und Gewinnung von P450
Die 2C9-P450-Proteine werden mittels DNA- Rekombinationsverfahren hergestellt. Die Nucleinsäuresequenzen, die für Wildtyp-P450-Proteine kodieren, sind nach dem Stand der Technik erhältlich, und ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung kann Routineverfahren, z.B. ortsgerichtete Mutagenese, verwenden, um Kodierungsveränderungen in die Nucleinsäuresequenzen einzuführen, um Nucleinsäuren bereitzustellen, die für die P450s der Erfindung kodieren.
In einem anderen Aspekt wird hierin eine isolierte Nucleinsäure beschrieben, die für ein 2C9-P450-Protein der Erfindung kodiert. Nucleinsäure umfasst DNA (sowohl genomische als auch cDNA) und RNA. Die Nucleinsäure der Erfindung kann aus einzel- oder doppelsträngigen Polynucleotiden bestehen.
Solche Nucleinsäuren können in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor inkorporiert werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. In einer weiteren Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuren durch Einführen einer Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die zu einer Replikation des Vektors führen, beschrieben. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden.
Vorzugsweise ist eine Nucleinsäure in einem Vektor operabel an eine Kontrollsequenz gebunden, die in der Lage ist, für die Expression der kodierenden Sequenz durch die Wirtszelle zu sorgen, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff „operabel gebunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei sich die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es ihnen ermöglicht, so zu wirken, wie es von ihnen erwartet wird. Eine „operabel" an eine kodierende Sequenz „gebundene" Kontrollsequenz wird so ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Es können geeignete Vektoren ausgewählt oder konstruiert werden, die geeignete Regulationssequenzen enthalten, unter anderem Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene sowie andere Sequenzen, wie geeignet. Die Vektoren können Plasmide sein sowie auch virale Vektoren, z.B. Phagen-, Phagemid- oder Baculovirus-Vektoren, Cosmide, YACs, BACs oder PACs, je nach Eignung.
Die Vektoren können mit einem Replikationsstartpunkt ausgestattet sein, gegebenenfalls mit einem Promotor zur Expression des Polynucleotids und gegebenenfalls mit einem Regulator des Promotors. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, z.B. ein Ampicillin-Resistenzgen im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenzgen für einen Säugetiervektor. Vektoren können in vitro verwendet werden, z.B. zur Herstellung von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle. Systeme zum Klonieren sowie zur Expression eines Polypeptids in einer Reihe verschiedener Wirtszellen sind wohlbekannt.
Es können Promotoren und andere Expressionsregulationssignale ausgewählt werden, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, für die der Expressionsvektor kreiert wird. Bakterielle Promotoren umfassen z.B. den IacZ-Promotor, Hefepromotoren umfassen S.-cerevisiae-GAL4- und -ADH-Promotoren, S.-pombe-nmt1- und -adh-Promotor, und Säugetierpromotoren umfassen den Metallothionein-Promotor, den SV40-large-T-Antigen-Promotor oder Adenovirus-Promotoren.
Für weitere Details siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Gold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Viele bekannte Verfahren und Arbeitsvorschriften bezüglich der Manipulation von Nucleinsäure, z.B. der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie die Analyse von Proteinen werden ausführlich in den Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992), beschrieben.
Eine weitere, hierin beschriebene Ausführungsform stellt Wirtszellen bereit, die für die Replikation und Expression von für 2C9 kodierenden Nucleinsäuren mit den Vektoren transformiert oder transfiziert wurden. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können z.B. Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen sein.
Die 2C9-P450-Proteine können in jeder geeigneten Wirtszelle exprimiert werden, die ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung aus Gründen des experimentellen Nutzens zu verwenden wünscht. Cytochrom-P450-Moleküle wurden bereits auf breiter Ebene in E. coli exprimiert, und es gibt zahlreiche Vektorsysteme für diese Wirtszelle, die verwendet werden können.
Weitere Wirtszellen umfassen Hefe-, z.B. S.-cerevisiae-, Insekten- oder Säugetier-, z.B. CHO-, Zellen. Expressionssysteme für diese und viele andere Wirtszellentypen sind auf dem Gebiet der Erfindung leicht erhältlich.
Wirtszellen können so konstruiert werden, dass 2C9-P450 konstitutiv exprimiert wird oder induziert wird.
Wurden die Zellen einmal gezüchtet, um 2C9-P450 zu exprimieren, so können sie mittels Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung erhältlich sind, gewonnen werden. Ein nützliches Verfahren ist die Gewinnung der Zellen mittels niedertouriger Zentrifugation, sodass die Zellen intakt pelletiert werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für die Batch-Zellkultur geeignet, und Zell-Chargen von 100 ml bis zu einigen, z.B. 10, Litern können mit der vorhandenen Laborausstattung leicht verarbeitet werden, obwohl größere Chargen, z.B. 10 bis 100 Liter, nicht ausgeschlossen werden.
Hierin wird ebenso ein Verfahren zur Expression und Gewinnung der hierin offenbarten, menschlichen 2C9-Cytochrom-P450s aus Wirtszellen beschrieben. Dieses Verfahren umfasst:

(a) die Expression des Cytochrom-2C9-P450-Moleküls in einer Wirtszellenkultur;
(b) die Gewinnung der Zellen aus der Kultur und das Suspendieren der Zellen in Salzpuffer mit einer Leitfähigkeit von 12 bis 110 mS/cm;
(c) die Lyse der Zellen und das Entfernen von Zelltrümmern, um ein salzreiches Lysat bereitzustellen;
(d) das Hinzufügen von Detergens zu dem Lysat (z.B. 0,015 % bis 1,2 Vol.-%), um ein salzreiches Detergens-Lysat bereitzustellen;
(e) die Gewinnung von P450 aus dem Lysat.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren:

(a) die Expression des Cytochrom-2C9-P450-Moleküls in E. coli;
(b) die Gewinnung der Zellen und die Suspendierung dieser in einem 200-mM- bis 1000-mM-Salzpuffer;
(c) die Lyse der Zellen und das Entfernen von Zelltrümmern, um ein salzreiches Lysat bereitzustellen;
(d) das Hinzufügen von Detergens zu dem Lysat (z.B. 0,015 % bis 1,2 Vol.-%), um ein salzreiches Detergens-Lysat bereitzustellen;
(e) die Gewinnung von P450 aus dem Lysat.

Der Gewinnungsschritt umfasst die Affinitätsreinigung des 2C9-P450 aus dem salzreichen Detergens-Lysat, da das Vorhandensein eines hohen Salzanteils die Alternative eines Ionenaustauschreinigungsschritts ausschließt.
Ist das P450 jedoch einmal mittels Affinitätschromatographie gereinigt worden, so muss das Salz entfernt werden, um eine weitere Reinigung des Produkts zu ermöglichen, sodass eine Kristallisation durchgeführt werden kann. Nach dem Stand der Technik wird die Salzentfernung typischerweise mittels einer Dialyse durchgeführt. Die Erfinder haben jedoch herausgefunden, dass dieses Verfahren, bei dem das Salz schrittweise über einen Zeitraum von mehreren Stunden entfernt wird, zu einer Aggregation und einer Denaturierung der P450s führt und daher nicht erwünscht ist. Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine schnelle Entsalzung dieses Problem in beträchtlichem Ausmaß verringert.
In einem weiteren Aspekt kann oben stehender Schritt (e) daher folgendermaßen durchgeführt werden:

(e(i)) durch Bindung des 2C9-P450 an einen Affinitätsträger;
(e(ii)) durch Spülen des Trägers in einem salzreichen Detergens-Spülwasser;
(e(iii)) durch Entfernen des 2C9-P450 in einem salzreichen Detergens-Puffer, um ein salzreiches P450-Detergens-Präparat bereitzustellen; und
(f) durch Austauschen des Puffers mit einem Puffer ohne Detergens mit niedriger Ionenstärke durch Größen-Ausschlusschromatographie, um ein P450-Präparat mit niedrigem Salzgehalt bereitzustellen.

Die oben genannte Schritte e(i)–(iii) erhalten 2C9-P450 in einem salzreichen und einem Detergens-Puffer während der anfänglichen Stadien des Reinigungsverfahrens, was für die Gewinnung von P450 hilfreich ist.
Die Herstellung kann zusätzlichen Reinigungs- und Säuberungs-Verfahren unterzogen werden, wie z.B. einer Kationenaustauschchromatographie, gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Größen-Ausschlusschromatographie oder einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie, um ein gereinigteres Proteinpräparat zu erhalten.
Salzpuffer
Dabei handelt es sich um einen Puffer mit hoher Ionenstärke, der verwendet wird, um die Zellen zu suspendieren. Dieser Puffer umfasst ein Salz, das leicht löslich ist, um einen Puffer mit einer Leitfähigkeit von 12 bis 110 mS/cm bereitzustellen. Solch ein Puffer besteht vorzugsweise aus einem Salz mit einer Konzentration in der Bandbreite von 200–1000 mM. Das Salz ist vorzugsweise ein Kalium- oder Natriumsalz eines Anions. Das Anion kann vorzugsweise Chlorid oder Phosphat sein. Kaliumphosphat (KPi) wird hierbei besonders bevorzugt.
Eine bevorzugte Salzkonzentration wird ausgewählt, um eine Leitfähigkeit von 25 bis 35 mS/cm, z.B. etwa 30 mS/cm, bereitzustellen. Eine insbesondere bevorzugte Salzkonzentration liegt bei etwa 500 mM, z.B. 500 + 50 mM.
Der Puffer wird bei einer pH-Bandbreite von 6,5 bis 8,0, vorzugsweise von 7,0 bis 7,6, gehalten. Der Puffer kann andere Reagenzien enthalten, die herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Proteinreinigung verwendet werden, wie z.B. Glycerin, β-Mercaptoethanol, DNase, pH-puffernde Agenzien, Histidin, Imidazol und Proteaseinhibitoren.
Zell-Lyse
Zellen können mittels physischer Mittel, wie z.B. durch Beschallung oder in einer French-Press oder mittels kontinuierlichem Durchflussmesszellenzerstörer, lysiert werden, sodass die Zellwände zerstört werden und der Inhalt der Zellen in den Salzpuffer austritt. Um dies in einer French-Press zu erreichen, muss diese mit 10.000 bis 20.000 psi betrieben werden.
Die Zelltrümmer werden entfernt (z.B. mittels niedertouriger Zentrifugation bei etwa 10.000–25.000 g (z.B. etwa 22.000 g) oder einer kurzen hochtourigen Zentrifugation bei 70.000 g; d.h. so, dass alle verbleibenden, ganzen Zellen pelletiert werden, jedoch nicht der Membranteil). Die Trümmer (z.B. die pelletierten Zellen) können ei ner weiteren Lyse-Runde unterzogen werden, und das trümmerfreie Lysat, das aus dieser weiteren Runde erhalten wurde, kann mit dem zuvor erhaltenen Lysat kombiniert werden.
Das Lysat ist danach für die direkte Verwendung im nächsten Stadium des Verfahrens bereit, und zwar ohne die Notwendigkeit, einen Membranteil mittels Ultrazentrifugation zu isolieren.
Verwendung des Detergens
Wurde das Lysat erhalten, so ist das Hinzufügen des Detergens zum Lysat so bald wie möglich erwünscht, wobei die Einschränkungen der Versuchsanlage miteinbezogen werden. Dies bedeutet, dass das Detergens innerhalb von 1 Stunde, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten oder weniger, vom Zeitpunkt der Herstellung des trümmerfreien Lysats zum Lysat hinzugefügt wird.
Die Detergenzien, die verwendet werden können, sind jene, die herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Molekular- und Zellbiologie zur Gewinnung und Verarbeitung von biologischen Materialien verwendet werden. Zu diesem Zweck ist eine große Anzahl verschiedener Detergenstypen erhältlich. Viele dieser Detergenzien sind jene, die sich in der Molekulargewicht-Bandbreite von etwa 350 bis 1000, z.B. von 400 bis 800, befinden. Sie umfassen anionische Tenside, wie z.B. Cholsäure oder Salze davon (z.B. das Natriumsalz) und Desoxycholsäure oder Salze davon (z.B. das Natriumsalz), sowie zwitterionische Tenside, wie z.B. CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat).
Eine insbesondere bevorzugte Klasse an Detergenzien sind nichtionische Detergenzien. Nach dem Stand der Technik ist eine große Bandbreite an nichtionischen Detergenzien erhältlich. Nichtionische Detergenzien umfassen Octyl-β-D-Glucopyranosid und Ether, wie z.B. C2-10-Alkylphenol-Ether, von Polyethylenglykol. Solche Verbindungen können ein Molekulargewicht in der Bandbreite von 500–800 Da aufweisen und umfassen Nonident^TM P40, IPEGAL CA630 und Triton^TM X-100 und dergleichen, wobei diese im Handel erhältlich sind.
Das Detergens wird hinzugefügt, um eine gewöhnliche Konzentration von 0,015 % bis 1,2 Vol.-% Detergens im Lysat bereitzustellen. Die Menge des hinzugefügten Detergens liegt vorzugsweise in der Bandbreite von 0,1 bis 1,2 %, noch bevorzugter von 0,2 bis 0,4 %, wie z.B. etwa 0,3 %.
Das Detergens wird in einer Volumeneinheit hinzugefügt, sodass die Salzkonzentration oder die Ionenstärke vorzugsweise um nicht mehr als 10 % absinkt.
Gewinnung von gereinigtem 2C9-P450
Die Erfinder haben herausgefunden, dass das oben erwähnte, salzreiche Detergens-Lysat, das gemäß der Erfindung hergestellt wurde, für eine Gewinnung des 2C9-P450-Proteins in reduzierter Aggregationsform sorgt, und zwar in einem Ausmaß, das viel höher ist als die bisherigen Erfahrungen nach dem Stand der Technik. Wie zuvor bereits erwähnt, schließt das Vorhandensein des salzreichen Puffers einen sofortigen Ionenaustauschchromatographieschritt aus, es kann jedoch als nächster Schritt eine Affinitätsreinigung durchgeführt werden.
Die Affinitätsreinigung kann die Form der Bereitstellung einer Affinitäts-Trägermatrix annehmen, in der ein Ligand für 2C9-P450 angebracht ist. Der Träger kann dabei ein Harz, eine Perle (z.B. Glas oder Polymer, wie z.B. Polystyrol), eine Magnetperle oder dergleichen sein. In Fällen, in denen 2C9-P450 eine Markierung enthält, ist der Ligand mit der Markierung verwandt, z.B. Ni-NTA für eine Histidin-Markierung, Biotin für eine Streptavidin-Markierung etc. Der Ligand kann ebenso ein Antikörper sein, entweder für eine Epitop-Markierung, wie z.B. eine HA-Markierung, oder für ein Epitop von 2C9-P450.
Das Lysat wird unter Bedingungen, die es 2C9-P450 ermöglichen, an den Träger zu binden, mit dem Affinitätsträger in Kontakt gebracht. Nach der Bindung wird der Trä ger gespült. Der Spülungspuffer sollte ein salzreicher Detergens-Puffer sein, der gleich wie der oder unterschiedlich vom Lysatpuffer sein kann. Vorzugsweise ist er gleich. Falls er ein anderer ist, so weist er trotzdem die oben angegebenen Salz- und Detergens-Konzentrationen auf.
Nach dem Spülen wird 2C9-P450 vom Träger entfernt. Dies kann in einer Charge oder durch Packen des Trägers in eine Säule und Eluieren des 2C9-P450 unter Verwendung eines salzreichen Detergens-Puffers, der modifiziert wurde, durchgeführt werden, um 2C9-P450 aus seinem Liganden zu entfernen. Für Ni-NTA z.B. kann der Puffer Histidin oder Imidazol in einer ausreichenden Überschusskonzentration enthalten, um die His-Markierung von 2C9-P450 zu verdrängen. Für andere Markierungs-Typen können geeignete Konkurrenten verwendet werden.
Entsalzung
Die Ionenstärke der resultierenden P450-Lösung wird durch einen schnellen Entsalzungsprozess verringert. Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine Größen-Ausschlusssäule zu diesem Zweck verwendet werden kann, wobei diese eine Durchflussrate aufweist, sodass 2C9-P450 von der salzreichen Konzentration innerhalb von 10–30, vorzugsweise innerhalb von 10, Minuten getrennt wird. 2C9-P450 wird auf die Säule geladen und mit einem niedrigen Salzpuffer durch die Säule eluiert.
Während die Erfinder sich nicht an eine bestimmte Theorie gebunden wissen möchten, haben sie jedoch beobachtet, dass der schnelle Entsalzungsprozess die Aggregation auf ein signifikantes Ausmaß reduziert, wohingegen eine schrittweise Entsalzung, z.B. mittels Dialyse, zu einer Aggregation und Denaturierung von Cytochrom-2C9-P450 führt.
Der salzarme Puffer ist vorzugsweise ein ähnliches Salz im Vergleich zu dem oben beschriebenen salzreichen Puffer, z.B. ein Natrium- oder Kaliumsalz, wie z.B. ein Chlorid oder Phosphat, wobei Kaliumphosphat erneut bevorzugt ist. Mit „salzarm" ist ein Gehalt von weniger als 50 mM, vorzugsweise weniger als 20 mM und insbeson dere weniger als 10 mM, gemeint. In diesem Stadium ist es nicht notwendig, ein Detergens im Puffer beizubehalten.
Weitere Reinigung
Es ist erwünscht, dass das Präparat nach dem Entsalzungsschritt sofort weiteren Reinigungsschritten unterzogen wird, d.h. ohne Lagerung oder Einfrieren der Probe. Dies kann durch Auftragen des entsalzten Eluats direkt auf eine weitere Reinigungssäule erreicht werden. Falls nicht, wird das Eluat aus dem Entsalzungsprozess gesammelt und innerhalb von 1 Stunde auf die Säule aufgetragen. Nach dem Stand der Technik ist eine Reihe an Verfahren zur weiteren Reinigung oder Konzentrierung von Proteinpräparaten bekannt, Beispiele dieser werden in den begleitenden Beispielen angeführt. Sie umfassen schwache Kationenaustauschsäulen, wie z.B. Carboxymethyl-Sepharose^TM, BioRex^TM70, Carboxymethyl-Biogel^TM und dergleichen, sowie starke Kationenaustauschsäulen, wie z.B. MonoS, die verwendet werden können, um Detergenzien weiter zu entfernen. Das entsalzte Cytochrom-P450 kann z.B. direkt auf eine CM-Sepharose^TM-Säule aufgebracht werden (z.B. eine 5-ml-HiTrap-Säule, Pharmacia), die zuvor mit 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 0,2–2,0 mM DTT, 1 mM EDTA („Puffer 1") äquilibriert wurde. Im folgenden Schritt kann das Elutionsprotokoll dann auf dem AKTA-FPLC-System laufen gelassen werden: Waschen mit 10–20 Säulen-Volumeneinheiten an Puffer 1 und dann 10–20 Säulen-Volumeneinheiten an 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 0,2–2,0 mM DTT, 1 mM EDTA, 75 mM KCl oder NaCl, um etwaige Spuren des Detergens zu entfernen. P450 wird danach mit letzterem, oben genanntem Puffer eluiert, wobei die KCl- oder NaCl-Konzentration auf 500 mM anstieg.
Diesem Schritt folgt gegebenenfalls eine Größen-Ausschlusssäule, z.B. Superose^TM, Superdex^TM, Sephacryl^TM und dergleichen. Das entweder aus dem Kationenaustausch- oder dem Größen-Ausschlussschritt gewonnene Protein kann konzentriert werden, um eine Lösung bereitzustellen, die für die Kristallisation oder andere Verwendungszwecke geeignet ist.
Durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung kann eine Konzentration von 20 bis 120, z.B. 20 bis 80, mg/ml erreicht werden.
B. Kristallisation von 2C9-Proteinen
Nach dem Stand der Technik ist eine Reihe an Verfahren bekannt, um Proteinkristalle zu erhalten. Das Endprotein wird angenehmerweise auf 10–60, z.B. 20–40, mg/ml in 10–100 mM Kaliumphosphat mit hohem Salzgehalt (z.B. 500 mM NaCl oder KCl) eingeengt, und zwar unter Verwendung von Konzentrationsvorrichtungen, die im Handel erhältlich sind. Das Protein kann in Gegenwart von 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT und 1 mM EDTA konzentriert werden.
Das Protein wird mittels Dampfdiffusion bei 5–25 °C gegen eine Bandbreite an Pufferverbindungen kristallisiert. Unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Screening-Sets, wie z.B. Polyethylenglykol-(PEG-)/Ionen-Screens, PEG-Gitter, Ammoniumsulfatgitter, PEG-/Ammoniumsulfatgitter oder dergleichen, zugekauft von Hampton Research, Emerald Biostructure, Molecular Dimension und anderen, können Kristalle hergestellt werden.
Typischerweise umfasst der Dampfdiffusionspuffer 0–27,5 %, vorzugsweise 2,5–27,5 %, PEG 1K-20K, vorzugsweise 1–8 K oder PEG 2000 MME–5000 MME, vorzugsweise PEG 2000 MME, oder 0–10 % Jeffamin M-600 und/oder 5–20 %, z.B. 10–20 %, Propanol oder 15–20 % Ethanol oder etwa 15 %–30 %, z.B. etwa 15 %, 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD), gegebenenfalls mit 0,01 M–1,6 M Salz oder Salzen und/oder 0–0,15, z.B. 0–0,1, M eines Lösungspuffers und/oder 0–35 %, wie z.B. 0–15 %, Glycerin und/oder 0–35 % PEG300-400; jedoch vorzugsweise:
10–25 % PEG 1K-8K oder PEG 2000 MME oder 0–10 % Jeffamin M-600 und/oder 5–15 %, z.B. 10–15 %, Propanol oder Ethanol, gegebenenfalls mit 0,1 M–0,2 M Salz oder Salzen und/oder 0–0,15, z.B. 0–0,1, M Lösungspuffer und/oder PEG400, jedoch noch bevorzugter:
10–25 % PEG 3350 oder PEG 4000 oder PEG 2000 MME oder 0–10 % Jeffamin M-600 oder 5–15 %, z.B. 10–15 %, Propanol oder Ethanol, gegebenenfalls mit 0,1 M–0,2 M Salz oder Salzen und/oder 0–0,15 M Lösungspuffer.
Besonders bevorzugte Kristallisationsbedingungen für die hierin beschriebenen 2C9-Proteine sind:
0,05–0,1 M Tris-HCl, pH 8,0–8,8, 0,1–0,2 M Lithiumsulfat, 10–15 % PEG 4000;
0,1 M Tris, pH 8,0–8,8, 15–30 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin; und
0,1–0,4 M KH₂PO₄, 0–25 % PEG 3350, 0–10 % Glycerin.
Das Salz kann ein Alkalimetall (insbesondere Lithium, Natrium und Kalium), Erdalkalimetall (z.B. Magnesium oder Calcium), Ammonium-, Eisen(III)-, Eisen(II)- oder Übergangsmetall-Salz (z.B. Zinksalz) eines Halogenids (z.B. Bromids, Chlorids oder Fluorids), Acetats, Formiats, Nitrats, Sulfats, Tartrats, Citrats oder Phosphats sein. Dies umfasst Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Ammoniumfluorid, Ammoniumacetat, Lithiumacetat, Magnesiumacetat, Natriumacetat, Kaliumacetat, Calciumacetat, Zinkacetat, Ammoniumchlorid, Lithiumchlorid, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumbromid, Magnesiumformiat, Natriumformiat, Kaliumformiat, Ammoniumformiat, Ammoniumnitrat, Lithiumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat, Lithiumsulfat, Natriumsulfat, Dinatriumtartrat, Kaliumnatriumtartrat, Diammoniumtartrat, Kaliumdihydrogenphosphat, Trinatriumcitrat, Trikaliumcitrat, Zinkacetat, Eisen(III)-chlorid, Calciumchlorid, Magnesiumnitrat, Magnesiumsulfat, Natriumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Diammoniumhydrogenphosphat, Trilithiumcitrat, Nickelchlorid, Ammoniumiodid, Diammoniumhydrogencitrat.
Falls vorhanden, umfassen Lösungspuffer z.B. Hepes, Tris, Imidazol, Cacodylat, Trinatriumcitrat/Zitronensäure, Trinatriumcitrat/HCl, Essigsäure/Natriumacetat, Phosphat-Citrat, Natriumkaliumphosphat, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure/NaOH (MES), CHES, Bistrispropan, CAPS, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat.
Die pH-Bandbreite wird vorzugsweise bei pH 4,2–10,5, vorzugsweise bei 4,2–8,5, noch bevorzugter bei 4,7–8,5 und insbesondere bei 6,5–8,5, beibehalten.
Kristalle können unter Verwendung eines Hampton-Research-Screening-Sets, Polyethylenglykol-(PEG-)/Ionenscreens, PEG-Gitter, Ammoniumsulfatgitter, PEG-/Ammoniumsulfatgitter oder dergleichen hergestellt werden.
Die Kristallisation kann ebenso in Gegenwart eines Inhibitors oder Substrats von P450, z.B. Fluoroxamin oder 2-Phenylimidazol, durchgeführt werden.
Es können Additive zu einer Kristallisationsbedingung hinzugefügt werden, von der bekannt ist, dass sie die Kristallisation beeinflusst. Während der Optimierung der vorläufigen Kristallisationsbedingungen sollen Additiv-Screenings verwendet werden, wobei die Gegenwart von Additiven bei der Kristallisation der Probe helfen kann, und die Additive können die Qualität des Kristalls verbessern, z.B. Hampton-Additiv-Screenings, die Glycerin, Polyole und andere proteinstabilisierende Agenzien in der Proteinkristallisation verwenden (R. Sousa, Acta. Cryst. D51, 271–277 (1995)) oder aber zweiwertige Kationen (S. Trakhanov und F.A. Quiocho, Protein Science 4, 9, 1914–1919 (1995)).
C. Kristalle
In einem weiteren Aspekt wird hierin ein Kristall von menschlichen 2C9-P450-Proteinmolekülen beschrieben sowie ein Verfahren zum Erhalten der Kristallstruktur eines menschlichen 2C9-P450-Moleküls, das das Unterziehen des Kristalls einer Röntgenbestrahlung und die Analyse des erhaltenen Diffraktionsmusters umfasst, um die dreidimensionalen Koordinaten der Atome des 2C9-P450 zu ermitteln.
Ein solcher Kristall ist ein Kristall von P450 mit der trigonalen Raumgruppe P321 und Elementarzelldimensionen von 165,46 Å, 165,46 Å, 111,70 Å, 90°, 90°, 120°. Der Kristall enthält zwei Kopien von 2C9 in einer asymmetrischen Einheit, in den Tabellen 1, 2, 3 und 8 mit A und B benannt. In allen Dimensionen kann eine Elementarzellenvariabilität von 5 % beobachtet werden.
Solch ein Kristall kann unter Verwendung der in den begleitenden Beispielen beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Die Kristalle können von einem 2C9-Protein stammen, das die Sequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst, jedoch abgesehen von folgenden Veränderungen:
Position 220 oder Position 222 ist Prolin; und
gegebenenfalls werden bis zu 21, z.B. bis zu 10, z.B. bis zu 5, andere Positionen verändert, wobei die Positionen gemäß Wildtyp-2C9 nummeriert sind, und umfassen die hierin in den begleitenden Beispielen beschriebenen Sequenzen.
Die Verfahren, die verwendet werden, um einen hierin dargestellten P450-Kristall bereitzustellen, können im Allgemeinen verwendet werden, um einen menschlichen P450-Kristall bereitzustellen, der mit einer Auflösung von zumindest 3,1 Å und vorzugsweise zumindest 3 Å auflösbar ist.
Daher wird ein hierin beschriebener Kristall eines P450-Proteins mit einer Auflösung von zumindest 3,1 Å und vorzugsweise zumindest 3 Å offenbart.
In einem weiteren Aspekt können die hierin beschriebenen Kristalle eines P450-Proteins unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt werden, das das Züchten eines Kristalls mittels Dampfdiffusion unter Verwendung eines Reservoir-Puffers umfasst, der ein Kaliumsalz und ein PEG-Präzipitat enthält. Das Züchten des Kristalls erfolgt mittels Dampfdiffusion und wird durch das Platzieren eines aliquoten Teils der Lösung auf ein Deckglas als ein hängender Tropfen über einem Well, der den Reservoir-Puffer enthält, durchgeführt. Das Kaliumsalz ist vorzugsweise Kaliumphosphat, insbesondere 0,05 bis 0,2 M Kaliumphosphat. Die PEG-Präzipitatkonzentration liegt vorzugsweise bei 10–30 % PEG (noch bevorzugter bei 10–20 % PEG). Ein höhergewichtiges PEG in der Bandbreite von PEG 2000 bis PEG 4000 kann verwendet werden. Vorzugsweise wird PEG 3350 verwendet. Die Aliquote enthält die Proteinlösung und den Reservoir-Puffer, typischerweise in einem Verhältnis von 1 Teil Proteinlösung zu 1 Teil Reservoir-Puffer. Die Proteinlösung lag bei 0,7 mM. Insbesondere wird bevorzugt, wenn der Reservoir-Puffer aus 0,2 M zweibasischem Kaliumphosphat und 20 % PEG 3350 besteht. Alternative Kristallisationsbedingungen umfassen (i) 0–0,2 M Tris-HCl (pH 8–9,5, vorzugsweise pH 8,4–8,8), 0–20 % PEG 400, 0–20 % PEG 8000, 0–20 % Glycerin oder (ii) 0–0,2 M Tris-HCl (pH 8–9), 0–0,25 M Li₂SO₄, 0–20 % PEG 4000; insbesondere (iii) 0,1 M Tris-HCl (pH 8,8), 15 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin, (iv) 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M Li₂SO₄, 15 % PEG 4000 oder (v) 0,1 M Tris-HCl (pH 8,4), 15 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin. Die Bedingung (iv) wird besonders bevorzugt.
Eine Gesamtmenge von 2648 Kristallisationswells wurde aufgebaut, um ein 3,0-Å-Datenset zu erhalten, das für die Lösung der ersten Struktur geeignet ist. Weitere 1584 Wells wurden aufgebaut, um einen Kristall zu erhalten, der bis zu 2,6 Å lösbar war. Dies ist ein Anzeichen für die Schwierigkeiten des Erhaltens von Kristallen mit geeigneter Auflösung für die Strukturlösung. Die Auslegung der Kristallisations-Screenings und die darauf folgende Analyse der Resultate, um zu bestimmen, welche Bedingungen erschaffen werden sollen, erfordern beachtliche Erfahrung.
Weitere Kristalle umfassen Kristalle, die ausgewählte Koordinaten der Bindungstasche besitzen, wobei sich die Aminosäurereste, die mit jenen ausgewählten Koordinaten assoziiert sind, in einem Proteinrahmen befinden, der diese Aminosäuren in einer relativen, räumlichen Konfiguration hält, die der räumlichen Konfiguration der in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargestellten Aminosäuren entspricht. Mit „entsprechen" ist innerhalb eines RMSD-Werts von weniger als 2,0 Å, vorzugsweise weniger als 1,5 Å, noch bevorzugter weniger als 1,0 Å, noch bevorzugter weniger als 0,64 Å und insbesondere bevorzugt weniger als 0,5 Å befindlich gemeint. Die Aminosäuren, die die ausgewählten Koordinaten bereitstellen, werden vorzugsweise aus Aminosäuren ausgewählt, die einen Teil der Bindungstasche von P450 darstellen, und umfassen jene aus Tabelle 5 oder 6 oder Kombinationen davon, wie sie weiter unten stehend hierin definiert sind.
Kristalle umfassen ebenfalls Kristalle von 2C9-Mutanten und Chimären, wie sie weiters in den Abschnitten F und G definiert sind.
Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Beurteilung der Fähigkeit einer Verbindung, mit einem P450-Protein wechselzuwirken, wobei dieses Folgendes umfasst:
das Erhalten oder Synthetisieren der Verbindung;
das Bilden eines kristallisierten Komplexes eines P450-Proteins und der Verbindung, wobei der Komplex zur Bestimmung der Atom-Koordinaten des Komplexes Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von mehr als 3,1 Å und vorzugsweise zumindest 3 Å beugt; und
das Analysieren des Komplexes mittels Röntgenstrahl-Kristallographie, um die Fähigkeit der Verbindung, mit dem P450-Protein wechselzuwirken, zu bestimmen.
D. Beschreibung der Struktur
Die Analyse der auf dem Weg zur vorliegenden Erfindung erhaltenen Kristalle ermöglichte eine ausführliche Analyse der Struktur eines menschlichen P450-Moleküls. Cytochrom-P450-2C9 kann als Zweidomänen-Protein angesehen werden, und zwar mit einer kleineren, vorwiegend β-Strangdomäne und einer größeren, vorwiegend α-Helixdomäne, die eine im Wesentlichen dreieckige Anordnung bilden. Alle bis heute gelösten P450-Strukturen besitzen im Wesentlichen dieselbe Topologie, was zu einer von der Literatur angenommenen Nomenklatur führt, um die einzelnen α-Helices und β-Stränge innerhalb der P450-Strukturen zu beschreiben (siehe Ravichandran et al., Science 261, 731–736 (1993), bezüglich Definitionen). Das gereinigte Protein besteht aus den Resten 19–494 (Nummerierung von 2C9 voller Länge), und alle außer den ersten und letzten paar dieser Reste können anhand der Elektronendichte unterschieden werden. Die β-Strangdomäne besteht aus den β-Faltblättern 1 und 2 und den α-Helices A und B. Diese Strukturelemente werden durch die N-terminate Regi on der Polypeptidkette (Reste 30–90) und Reste zwischen den Helices K und K' ausgebildet. Diese Reste, zusammen mit den Schleifen zwischen den Helices B und C und den Helices F und G (hierin als die B-C- und F-G-Schleifen bezeichnet), sind in die Wechselwirkung von Säugetier-P450s mit der Membran verwickelt, wenn das Protein in seiner nativen Membranform vorliegt. Diese Schleifen verleihen den einzelnen P450s auch ebenso einen Teil ihrer Reaktionsspezifität und zählen zu den am stärksten divergierenden Regionen der Sequenz.
Die α-Helixdomäne besteht aus den Helices C bis L. Der Hämteil befindet sich zwischen der α-Helixdomäne und den β-Strangdomänen und ist über Helix I (Reste 284–315) anzutreffen. Der einzelne Proteinligand für das Häm, Cystein 435, befindet sich in einer Schleife vor der letzten α-Helix. Angesichts der Bandbreite der Verbindungen, die die P450s metabolisieren, können die Substratbindungstaschen dieser Enzyme eine Reihe an Formen und Größen unterbringen. Zugang zu und von der Hämgruppe kann durch die Position der Schleifen reguliert werden, die die Substratbindungsstelle bilden, die zu offenen und geschlossenen Enzymkonformationen führen. Daten bezüglich Mutationen und der Aktivität ermöglichten eine Kartierung der Regionen der Sequenzen zur Funktion.
Eine Gesamtsumme von sechs Substraterkennungsstellen (SRS) wurden von Gotoh dargelegt (Gotoh, J. Biol. Chem. 267, 83–90 (1992)). Einige der Reste, die die Bindungstaschen der 2C9-Struktur auskleiden, umfassen Reste mit diesen prognostizierten SRS und umfassen einige Reste, die sowohl mit Veränderungen der Spezifitäts- als auch der Reaktionsraten in Mutantenformen des Proteins in Verbindung gebracht wurden. Die regiospezifische Hydroxylierung von Warfarin wurde mit Polymorphismus an Rest 359 in Verbindung gebracht, der sich über und an einer Seite der Hämgruppe befindet, während von Rest 114 gezeigt wurde, dass er Warfarin- und Diclofenac-Hydroxylierungsraten verändert und sich über und auf der anderen Seite der Hämgruppe befindet.
Die Struktur der vorliegenden Erfindung bestätigt, dass viele der nach dem Stand der Technik unter Verwendung anderer Verfahren (z.B. Sequenzanordnung und Mutagenese) als potentielle SRS-Reste abgeleiteten Reste in den verschiedenen SRSs zu finden sind, die in der Struktur der Erfinder zu sehen sind. Die Erfinder haben ebenso viele andere Reste identifiziert, die wahrscheinlich Seitenketten bereitstellen, die in der Lage sind, mit vielen P450-Substraten wechselzuwirken. Die Struktur der Erfinder gibt z.B. eine Reihe an Resten an, insbesondere mit hydrophoben Seitenketten, die sich in den SRS-Regionen befinden.
In den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, in denen ausgewählte Koordinaten der P450-Struktur verwendet werden können, können die Koordinaten einige oder alle dieser Reste umfassen.
Eine Überlagerung der 2C5- und der 2C9-Struktur deutet darauf hin, dass, während die wichtigen Merkmale des Proteins im Wesentlichen zwischen den beiden Proteinen konserviert sind, es einige interessante Unterschiede gibt. Der erste lösbare Rest in der Elektronendichte ist Rest 30 (die gesamte Nummerierung erfolgt in Relation zum Protein voller Länge), und der letzte Rest ist Rest 490. Es gibt daher 10 Reste ohne Elektronendichte am N-Terminus, und die vier C-terminalen Histidin-Markierungen sind ebenso nicht gelöst.
Beginnend beim N-Terminus nehmen die beiden Proteine dieselbe Position an Rest 48 ein. Der Polypeptidkette nach hinten hin zum N-Terminus folgend, befindet sich die Position der beiden Sequenzen um einen, und zum Ende hin, zwei Rest(e) außerhalb des Registers, während die Rückgratspur der zwei Proteine sehr eng ist. Die Sequenzidentität in dieser Region ist besonders hoch, sodass ein solcher Unterschied ein wenig überraschend ist. Er ist wahrscheinlich der vergleichsweise niedrigen Auflösung der 2C5-Struktur zuzuschreiben, die eine genaue Zuordnung der Sequenz am N-Terminus schwierig machte. Die höhere Auflösung der 2C9-Struktur machte die Zuordnung der Sequenz in dieser Region zu einer weniger zweideutigen Aufgabe. Diese Struktur von 2C9 könnte daher bezüglich der tatsächlichen Konformation der N-Termini in sowohl 2C5 als auch 2C9 repräsentativer sein.
Die erste Region, in denen sich die beiden Proteine substantiell unterscheiden, ist die Region zwischen den B- und den C-Helices (Reste 99 bis 111). Die Temperaturfaktoren der Kette zwischen den Resten 99 und 109 für 2C5 sind hoch (der durchschnittliche B-Faktor für alle Atome in dieser Bandbreite liegt bei 99,1 Å²), was auf eine starke Mobilität in dieser Region hindeutet, wodurch ein geringes Vertrauen in ihre Position gesetzt werden kann. Im Gegensatz dazu liegt der durchschnittliche B-Faktor für alle Atome der Reste 99 bis 111 bei 55,5 Å² in 2C9.
In der 2C9-Struktur haben die Reste 101 bis 106 eine Helixformation (Helix B') angenommen, die in bakteriellen P450-Strukturen beobachtet wurde. Diese Reste bilden einen Teil von SRS 1 und tragen daher zu der aktiven Stelle von P450 bei. Die Elektronendichte ermöglichte eine unzweideutige Interpretation aller Seitenkettenpositionen in dieser Region. Ein auffallendes Merkmal in dieser Region ist Arg97, das Vorschlägen zufolge ein wichtiges Kation an der aktiven Stelle ist (2C9-Substrate sind vorwiegend sauer). Der äquivalente Rest in 2C5 (Arg97) nahm eine andere Konformation an und war als Resultat kein Teil der aktiven Stelle. His99 wurde in die Omeprazol-Aktivität verwickelt (Ibeanu et al., J. Biol. Chem, Band 271, 12496–12501 (1996)); es ist der einzige Rest in SRS 1, der nicht zwischen 2C9 und 2C19 konserviert wurde (in 2C9 ist dieser ein Ile, in 2C19 ein His), und eine Mutation dieses Restes alleine in 2C19 verleiht dem resultierenden Mutantenprotein Omeprazol-Aktivität. Die 2C9-Struktur bestätigt, dass dieser Rest Teil der aktiven Stelle ist.
In der 2C9-Struktur wird die Seitenkettenposition von Arg97 klar aufgelöst, wodurch eine Wechselwirkung mit dem Häm und Val113 gebildet wird. Phe114 zeigt auf die aktive Stelle hin und ist gut angeordnet, um pi-pi-Stapel-Wechselwirkungen mit Substraten zu bilden, wie dies von einer Reihe an Gruppen vorgeschlagen wurde. Phe110 befindet sich ganz in der Nähe, jedoch nicht so ausgesetzt an Phe114.
Arg105 und Arg108, die ebenso als potentielle Beteiligten an einer Kationenstelle innerhalb der aktiven Stelle vorgeschlagen wurden, zeigen beide weg vom Hohlraum.
Die nächste abweichende Region zwischen den 2C5- und den 2C9-Strukturen ist die Region zwischen den F- und den G-Helices. Reste 212 bis 222 inklusive, die Teil der F-G-Schleife sind, fehlten in der veröffentlichten 2C5-Struktur. Diese Reste sind in der 2C9-Struktur gut aufgelöst und bilden zwei Helixdrehungen (die gesamte Sekundärstrukturzuordnung wurde unter Verwendung des Programms DSSP durchgeführt (Kabsch und Sander, Biopolymers 22, 2577–2637 (1983))). Reste 220 und 221 besitzen durch Vermitteln der Position der F-G-Schleife klarerweise eine gewisse Wirkungskraft auf die Zugänglichkeit der aktiven Stelle, obgleich sie nicht zu der aktiven Stelle beitragen. Einer der Nachteile der Kartierung von Regionen mit Sequenzen, die in Substratkontakt involviert sind, ist die Unfähigkeit, zwischen jenen Regionen zu unterscheiden, die Substrate direkt kontaktieren (durch Auskleiden der aktive Stelle), und jenen, die durch regulierende Strukturelemente im Enzym die Wechselwirkung des Substrats mit P450 vermitteln. Die 2C9-Struktur ermöglicht eine Unterscheidung zwischen direkten und indirekten Auswirkungen einzelner Reste auf die Substratspezifität und -aktivität. Das neuerliche Design von Verbindungen, um Wechselwirkungen mit 2C9 zu erleichtern oder zu entfernen, wird durch diese Unterscheidung klar und deutlich vereinfacht.
Die Reste an Positionen 286 und 289 wurden in die Substratspezifität verwickelt (Klose et al., Arch. Biochem. Biophys. Band 357, 240–248 (1998)). Nur Rest 289 kleidet tatsächlich die aktive Stelle aus, beide befinden sich jedoch in großer Nähe zu Phe110 der B-C-Schleife, daher kann ihre Rolle bei der Substratspezifität über das Packen der Strukturelemente eine indirekte sein anstatt einer direkten durch Substratkontakt.
Die Helices H und I nehmen in den beiden Proteinen dieselbe räumliche Konformation an; die Schleife zwischen den beiden Helices ist drei Reste länger und ist in der Elektronendichte klar aufgelöst.
Phe476 bildet einen hydrophoben Fleck in der aktiven Stelle, zusammen mit Phe100, Leu102, Leu208, Leu362 und Leu366.
Es gibt 4 andere Allele von 2C9, die zur Zeit identifiziert wurden und die eine Aminosäuresubstitution aufweisen. 2C9*2 besitzt R144C, 2C9*3 I359L, 2C9*4 I359T und 2C9*5 D360E. Ile359 liegt nicht in der aktiven Stelle, befindet sich jedoch in der Nähe von Thr305 und Thr361. Es ist nicht leicht, eine direkte Wirkung dieses Restes auf die Fähigkeit, Verbindungen zu katalysieren, ins Auge zu fassen, wie jedoch von anderen Resten festgestellt wurde, kann eine Mutation hier zum Verschieben struktureller Elemente führen, die eine Auswirkung auf die aktive Stelle besitzen. Eine ähnliche Wirkung kann für Asp360 der Fall sein. Arg144 ist nicht Teil der Bindungstasche von 2C9. Es wurde jedoch auf breiter Ebene angenommen, dass die von jenen Individuen, die die 2C9-R144C-Allelvariation besitzen, gezeigte Variation der Wirkstoff-Stoffwechseleigenschaften auf eine modifizierte Wechselwirkung zwischen P450 und der Reduktase zurückzuführen ist. Die periphere Anordnung dieses Restes in der Struktur von 2C9 würde dieses Argument unterstützen.
Dimer-Grenzfläche
Der Rotationswinkel zwischen den beiden Kopien in der asymmetrischen Einheit liegt nicht bei 180°, und als Resultat ist die Grenzfläche zwischen den beiden Kopien (hier mit A und B benannt) nicht symmetrisch. Die Grenzfläche umfasst eine Anzahl an Wasserstoffbindungen zwischen den Resten in Helix D von Molekül A und der G-H-Schleife von Molekül B, der G-H-Schleife von Molekül A und dem C-Terminus und Helix D von Molekül B, dem C-Terminus von A und der G-H-Schleife von Molekül B.
E. Kristallkoordinaten
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenso die Verwendung eines Kristalls von P450 mit den in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargestellten dreidimensionalen Atom-Koordinaten. Ein vorteilhaftes Merkmal der durch die Atom-Koordinaten definierten Struktur ist die Tatsache, dass sie eine hohe Auflösung besitzt (etwa 3 Å für Tabelle 1, etwa 2,6 Å für Tabelle 2, etwa 3,1 Å für Tabelle 3 und etwa 2,6 Å für Tabelle 8).
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist, dass sie Daten bezüglich Atom-Koordinaten im Hinblick auf die Schleife zwischen den Helices F und G (die F-G-Schleife) bereitstellt. Die F-G-Schleife ist eine der am stärksten divergierenden topologischen Regionen zwischen den Säugetier- und den bakteriellen P450-Enzymen. Als solche ist sie eine der schwieriger zu modellierenden Teile der Säugetierenzyme, wenn eine bakterielle Struktur als Modellmatrize verwendet wird. Die Struktur von P450BM3 (Ravichandran et al., ibid (1993)) wurde auf diesem Gebiet weitverbreitet als eine strukturelle Matrize zur Modellierung der menschlichen Formen verwendet. P450BM3 besitzt lediglich zwölf Reste in der F-G-Schleife, im Gegensatz zu den 21 Resten in den 2C-Isoformen. Die einzige Säugetier-P450-Struktur in der öffentlichen Domäne ist jene der Kaninchen-2C5-Isoform, die mittels Röntgenstrahlen-Kristallographie bis zu einer Auflösung von 3,0 Å gelöst wurde (Williams et al., Mol. Cell 5, 121–131 (2000)). Während die 2C5-Struktur im Vergleich zu den bakteriellen Strukturen eine verbesserte Modellierungsmatrize bereitstellt, war die Position der F-G-Schleife in der Kristallstruktur jedoch nicht auflösbar. Im Gegensatz dazu umfasst die hierin beschriebene 2C9-Struktur die F-G-Schleife. Reste innerhalb der F-G-Schleife wurden nicht auf breiter Ebene in die Selektivität des Substrats von P450s verwickelt und liegen außerhalb der Substraterkennungsstellen (SRSs), die von Gotoh identifiziert wurden (O. Gotoh, J. Biol. Chem. 267, 83–90 (1992)). Von Resten innerhalb der F-G-Schleife wurde gezeigt, dass sie die Verbindungs-Bindungsspezifität von 2C9 modifizieren (Tsao et al., Biochemistry 40, 1937–1944 (2001)). Es war nicht klar, ob diese Wirkung auf die indirekte Wechselwirkung der Reste innerhalb der F-G-Schleife und der Verbindung zurückzuführen war oder auf eine Sekundärwirkung, die durch die Wechselwirkung dieser Reste mit Resten in der Tasche verursacht wurden, die in die Substraterkennungsstellen (SRS) dieser Enzyme fallen. Aus der Struktur der Erfinder geht nun klar hervor, dass die Reste der F-G-Schleife nicht zu der Bindungstasche beitragen. Die Struktur von 2C9 erleichtert daher verstärkt die Identifikation direkter und indirekter Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und 2C9.
Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal ist die Tatsache, dass der durchschnittliche B-Faktor der 2C9-Struktur bei 43,9 Å² liegt, im Gegensatz zu der 2C5-Struktur, die ei nen allgemeinen B-Faktor von 58,6 Å² aufwies, was zu einer besseren Definition der meisten Seitenketten innerhalb der Struktur führt. Dies ist für alle Verwendungen der Koordinaten vorteilhaft, insbesondere für In-silico-Arbeit, molekularen Ersatz und Homologiemodellierung.
Ein weiterer Vorteil der hierin beschriebenen 2C9-Strukturen ist die Tatsache, dass es sich dabei um Apo-Strukturen ohne Liganden handelt. Dies macht sie besonders geeignet für das Einweichen in Liganden und daher zur Bestimmung von Co-Komplex-Strukturen, ebenso sind sie für Homologiemodellierungszwecke ideal, da es keine Konformationsverzerrung durch einen Liganden gibt.
Die B-C- und F-G-Schleifen zählen zu den am stärksten variierenden Merkmalen von Cytochrom-P450. Beide Schleifen sind am katalytischen Zyklus der Enzyme beteiligt; die B-C-Schleife direkt durch das Bereitstellen von Resten, die einen Teil der aktiven Stelle darstellen und Spezifitäts- und Aktivitätswechselwirkungen vermitteln, und die F-G-Schleife durch Bewegung, was das Eintreten und Austreten von Substrat ermöglicht. In dieser hohen Auflösung wurde die 2C9-Struktur von beiden dieser Schleifen gut gelöst, im Gegensatz zu der 2C5-Struktur.
Die Tabellen 1, 2, 3 und 8 zeigen Daten bezüglich Atom-Koordinaten für P450-2C9. In den Tabellen 1, 2, 3 und 8 zeigt die dritte Spalte das Atom, die vierte Spalte den Rest-Typ, die fünfte Spalte die Ketten-Identifikation (entweder A oder B), die sechste Spalte die Rest-Nummer (die Atomnummerierung bezieht sich auf das Wildtypprotein voller Länge), die siebente, achte und neunte Spalte zeigen die X-, Y- bzw. Z-Koordinaten des jeweiligen Atoms, die zehnte Spalte den Besetzungsgrad des Atoms, die elfte den Temperaturfaktor des Atoms, die zwölfte (wo vorhanden) die Ketten-Identifikation und die letzte Spalte den Atom-Typ.
Die Koordinaten der Tabellen 1, 2, 3 und 8 stellen ein Maß der Atom-Lage in Angstroms bis auf 3 Dezimalstellen bereit. Die Koordinaten bestehen aus einer Reihe relativer Positionen, die eine Form in drei Dimensionen definieren, ein Fachmann würde jedoch verstehen, dass auch eine vollkommen andere Reihe an Koordinaten mit einem unterschiedlichen Ursprung und/oder Achsen eine ähnliche oder identische Form definieren könnte. Weiters wäre dem Fachmann klar, dass eine Variation der relativen Atom-Positionen der Atome der Struktur, sodass die mittlere quadratische Abweichung der Rest-Rückgratatome (d.h. die Stickstoff-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Rückgratatome der Protein-Aminosäurereste) weniger als 2,0 Å, vorzugsweise weniger als 1,5 Å, noch bevorzugter weniger als 1,0 Å, noch bevorzugter weniger als 0,64 Å und insbesondere bevorzugt weniger als 0,5 Å, beträgt, wenn auf die in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargestellten Koordinaten für die Rest-Rückgratatome überlagert wird, im Allgemeinen zu einer Struktur führt, die im Wesentlichen dieselbe ist wie die in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargestellte Struktur, und zwar sowohl in Bezug auf ihre strukturellen Merkmale als auch auf ihren Nutzen für eine strukturbasierende Analyse der molekularen P450-Wechselwirkungs-Strukturen.
Ebenso wäre einem Fachmann bekannt, dass eine Veränderung der Anzahl und/oder der Positionen der Wassermoleküle und/oder Substratmoleküle aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 im Allgemeinen den Nutzen der Struktur für eine strukturbasierte Analyse der P450-Wechselwirkungs-Struktur nicht beeinflusst. Für die Zwecke, die daher hierin als Aspekte der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, umfasst der Umfang der Erfindung Folgendes: die Koordinaten der Tabelle 1, 2, 3 oder 8 werden an einen unterschiedlichen Ursprung und/oder Achsen transponiert; die relativen Atom-Positionen der Atome der Struktur werden variiert, sodass die mittlere quadratische Abweichung der Rest-Rückgratatome weniger als 2,0 Å, vorzugsweise weniger als 1,5 Å, noch bevorzugter weniger als 1,0 Å, noch bevorzugter weniger als 0,64 Å und insbesondere bevorzugt weniger als 0,5 Å, beträgt, wenn auf die in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargestellten Koordinaten für die Rest-Rückgratatome überlagert wird; und/oder die Anzahl und/oder Positionen der Wassermoleküle und/oder Substratmoleküle wird variiert.
Hierin enthaltene Verweise auf die Koordinaten-Daten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 und dergleichen umfassen daher die Koordinaten-Daten, in denen ein oder mehrere einzelne Werte aus der Tabelle auf diese Art und Weise variiert werden. Mit „mittlerer quadratischer Abweichung" meinen die Erfinder die Quadratwurzel des arithmetischen Mittels der Quadrate der Abweichungen vom Mittelwert.
Ein Variieren der Atom-Positionen der Atome der Struktur um bis zu etwa 0,5 Å, vorzugsweise um bis zu etwa 0,3 Å, in einer beliebigen Richtung führt daher beispielsweise zu einer Struktur, die im Wesentlichen dieselbe ist wie die Struktur in Tabelle 1, 2, 3 oder 8, sowohl in Bezug auf ihre strukturellen Merkmale als auch auf ihren Nutzen, z.B. für eine molekulare strukturbasierte Analyse.
Fachmänner werden die Tatsache zu schätzen wissen, dass es in vielen Anwendungen der Erfindung nicht notwendig ist, alle Koordinaten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 zu benutzen, sondern lediglich einen Teil dieser. Wie z.B. unten stehend beschrieben, können bei Verfahren zur Modellierung von Kandidatenverbindungen mit P450 ausgewählte Koordinaten von 2C9 verwendet werden.
Mit „ausgewählten Koordinaten" sind z.B. zumindest 5, vorzugsweise zumindest 10, noch bevorzugter zumindest 50 und noch bevorzugter zumindest 100, z.B. zumindest 500 oder zumindest 1000 Atome, der 2C9-Struktur gemeint. Ebenso können die anderen, hierin beschriebenen Anwendungen der Erfindung, unter anderem Homologiemodellierung und Strukturlösung sowie Datenspeicherung und computerunterstützte Manipulation der Koordinaten, auch alle oder einen Teil der Koordinaten (d.h. ausgewählte Koordinaten) aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 verwenden. Die ausgewählten Koordinaten können Atome umfassen oder aus diesen bestehen, die in der 2C9-P450-Bindungstasche, wie unten stehend hierin beschrieben, zu finden sind.
F. Chimären
Die Verwendung von chimären Proteinen, um gewünschte Eigenschaften zu erhalten, ist nun in der wissenschaftlichen Literatur häufig anzutreffen. Sieber et al. (Nature Biotechnology 19, 456–460 (2001)) z.B. stellten Hybride zwischen der menschlichen Cytochrom-P450-Isoform 1A2 und der bakteriellen P450-BM3 her, um Proteine mit der Spezifität von 1A2 zu erzeugen, die jedoch die gewünschten Expressions- und Löslichkeits-Eigenschaften von BM3 aufwiesen. Aktivstellen-Chimären werden ebenso beschrieben: Swairjo et al. (Biochemistry 37, 10928–10936 (1998)) z.B. stellten Schleifen-Chimären von HIV-1- und HIV-2-Protease her, um die Determinanten der inhibitorbindenden Spezifität zu verstehen.
Fälle, in denen die aktive Stelle modifiziert wird, um ein Ersatzsystem bereitzustellen, um strukturelle Informationen zu erhalten, sind von besonderer Bedeutung. Daher modifizierten Ikuta et al. (J. Biol. Chem. 276, 27548–27554 (2001)) die aktive Stelle von cdk2, für die sie strukturelle Daten erhalten konnten, um jener von cdk4 zu ähneln, für die im Moment keine Röntgenstruktur vorhanden ist. Auf diese Art und Weise waren sie in der Lage, Protein/Liganden-Strukturen aus dem chimären Protein zu erhalten, die im Design eines cdk4-Inhibitors nützlich waren. Auf eine ähnliche Art und Weise, basierend auf dem Vergleich primärer Sequenzen hochgradig verwandter Isoformen (z.B. 2C19 oder sogar 2D6), konnte die aktive Stelle des 2C9-Proteins modifiziert werden, um jenen Isoformen zu ähneln. Die Proteinstrukturen oder Protein/Liganden-Strukturen der chimären Proteine konnten in einer strukturbasierten Veränderung des Stoffwechsels der Verbindungen verwendet werden, die Substrate dieser verwandten P450-Isoform sind.
Sogar wenn der Prozentsatz der Aminosäuresequenzidentität zwischen Säugetier-P450s von 20 bis 80 % reicht, so wird erwartet, dass die allgemeine Faltung der Säugetier-P450s sehr ähnlich ist, mit derselben räumlichen Verteilung der strukturellen Elemente. Weiters zeigt diese Enzymklasse ausgeprägte Substratspezifitäten, die nur auf einer eingeschränkten Anzahl an Resten beruhen, die sich in nicht zusammenhängenden Teilen der Polypeptidkette befinden. Die Substratbindungstasche von P450 besteht im Allgemeinen aus Resten, die in die SRS-Regionen (Substraterkennungsstellen), die von Gotoh definiert wurden (O. Gotoh, J. Biol. Chem. 267, 83–90 (1992)), und in Schleifen des Moleküls fallen.
Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen daher Modifikationen von P450-Proteinen, sodass die aktiven Stellen jene von verwandten Isoformen imitieren. So könnte ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung z.B. aus dem Wissen über die Struktur und die Reste der aktiven Stelle des hierin beschriebenen menschlichen 2C9-Proteins und jenes über das Kaninchen-2C5-Protein, zuvor bereits veröffentlicht, das 2C5-Protein modifizieren, sodass die aktive Stelle jene des menschlichen 2C9 imitiert. Dieses Protein könnte dann dazu verwendet werden, um durch die Bestimmung der Protein/Ligand-Komplexstrukturen unter Verwendung des chimären 2C5-Proteins Informationen über das Bindungsverhalten von Verbindungen zu erhalten.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung z.B. ein chimäres Protein bereit, das einen Bindungshohlraum aufweist, der eine Substratspezifität bereitstellt, die im Wesentlichen mit jener des P450-2C9-Proteins identisch ist, worin der Bindungshohlraum des chimären Proteins mit einer Vielzahl an Atomen ausgekleidet ist, die den ausgewählten P450-2C9-Atomen entsprechen, die den P450-2C9-Bindungshohlraum auskleiden, wobei die relativen Positionen der Vielzahl an Atomen den relativen, wie in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 definierten Positionen der ausgewählten P450-2C9-Atome entsprechen.
Es ist möglich, zu postulieren, dass lediglich wenige Veränderungen notwendig wären, um die Substratspezifitäten der P450-Isoformen, die mehr als 70 % Aminosäureidentität aufweisen, gegenseitig umzuwandeln. 2C9 und 2C19 z.B., obwohl diese sich in nur 43 von 490 Aminosäuren unterscheiden, zeigen klare Unterschiede bei Substratspezifitäten. Unter Verwendung eines Panels an Chimären 2C9/2C19-Proteinen haben Jung et al. (F. Jung, Biochemistry 37, 16270–16279 (1998)) jene Sequenzunterschiede identifiziert, die 2C19 eine hohe Affinitätsbindung an Sulfaphenazol verleihen, einem sehr starken und spezifischen Inhibitor von 2C9. Experimente bezüglich ortsgerichteter Mutagenese haben gezeigt, dass die Umwandlung von 2C19 in ein 2C9-artiges Protein durch Einführen einer limitierten Anzahl an Substitutionen in die 2C19-Aminosäuresequenz möglich war. Diese Mutationen befinden sich in den SRS3- und SRS4-Regionen der Proteine. Ähnliche, von Klose et al. (Arch. Biochem. Biophys. 357, 240–248 (1998)) und Tsao et al. (Biochemistry 40, 1937–1944 (2001)) durchgeführte Studien haben die Machbarkeit des Transfers der Substratspezifitäten zwischen 2C9 und 2C19 durch Mutation der SRS-Regionen gezeigt.
Die Substratspezifität eines Enzyms beruht im Allgemeinen auf lediglich einer eingeschränkten Anzahl an Resten, die sich in nicht zusammenhängenden Teilen der Polypeptidkette befinden. Die Substratspezifitäten dieser Isoformen könnten durch Substitution dieser Reste mittels ortsgerichteter Mutagenese analysiert werden. Die minimalen Veränderungen, die erforderlich wären, um ein anderes Protein in eine 2C9-artige Chimäre umzuwandeln, könnten zumindest zwei aus Tabelle 4 ausgewählte Aminosäuren umfassen. Diese Mutationen können mittels ortsgerichteter Mutagenese, z.B. unter Verwendung eines Stratagene-QuickChange^TM-Sets für ortsgerichtete Mutagenese, oder Kassettenmutageneseverfahren eingeführt werden (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston et al. Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. New York; J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Die Erfindung stellt daher ein chimäres Protein mit einer oder mehreren Bindungstaschen bereit, die von den Resten in Tabelle 4 definiert werden.
Diese Strategie könnte klarerweise für Proteine angewandt werden, die eine hohe Sequenzhomologie mit oder ohne überlappende(n) Substratspezifitäten aufweisen, oder für Proteine von anderen Spezies. Von Kaninchen-2C5- und den menschlichen 2C9- sowie den 2C19-P450s wurde berichtet, sie wären mit unterschiedlichen Raten in den Progesteronstoffwechsel involviert, wobei die Kaninchen-Isoform deutlich das wirksamste Enzym war. Die Verwendung der für 2C5 und 2C9 aufgelösten Kristallstrukturen würde eine Charakterisierung des Bindungsmodus des Progesteronmoleküls in der Substrattasche dieser Proteine ermöglichen. Dies wiederum würde eine Identifikation von in den menschlichen Isoformen zu modifizierenden Resten ermöglichen, um diese in wirksame, Progesteron metabolisierende Enzyme umzuwandeln.
In einer Ausführungsform wird ein chimäres 2C9-Enzym, das mit einem anderen Enzym der 2C-Unterfamilie eine Isoform bildet, hergestellt. 2C9 könnte z.B. mit einigen Aminosäureveränderungen in eine 2C19-artige Isoform verwandelt werden. Basierend auf den in der Literatur zu findenden Struktur/Aktivitäts-Studien, die mit den 2C9- und 2C19-Isoformen durchgeführt wurden, und der Analyse der Struktur des menschlichen 2C9 postulieren die Erfinder, dass das 2C9-Protein in ein 2C19-artiges Protein mit den 2C19 zugeschriebenen Substratspezifitäten umgewandelt werden könnte.
Die zu mutierenden Reste sind einer oder mehrere von:
Substituieren von SRS-1 von 2C9 mit SRS-1 von 2C19 (die eingeführte Aminosäureveränderung ist I99H); und/oder
Substituieren von SRS-3 von 2C9 mit SRS-3 von 2C19 (die eingeführten Aminosäureveränderungen sind V237L und K241E); und/oder
Substituieren von SRS-4 von 2C9 mit SRS-4 von 2C19 (die eingeführten Aminosäureveränderungen sind S286N, E288V, N289I, V292A und F295L – die Hauptveränderungen könnten S286N, N289I, V292A und F295L sein); und/oder
das Verschieben von SRS5 von 2C19 zu 2C9 (die Aminosäure L362I wird eingeführt).
Die minimalen Veränderungen, die erforderlich wären, um 2C9 in 2C19 umzuwandeln, könnten I99H, K241E, S286N, N289I, V292A, F295L und L362I sein, noch wahrscheinlicher I99H, S286N, N289I, V292A und F295L. Diese Mutationen können durch ortsgerichtete Mutagenese oder Kassettenmutageneseverfahren wie hierin beschrieben eingeführt werden.
Eine 2C19-artige Chimäre kann ebenso durch Durchführen folgender Veränderungen hergestellt werden: I99H, S286N, E288V, N289I, V292A, F295L. Eine Alternative bezüglich der minimalen Veränderung wäre I99H, S286N, N289I.
Die Kristallisation solcher Chimären und die Bestimmung der dreidimensionalen Strukturen beruht auf der Fähigkeit der 2C9-Proteine der Erfinder, Kristalle zu ergeben, die zu einer Diffraktion mit einer hohen Auflösung führen. Das Ziel ist es, den inneren Teil von 2C9 zu modifizieren, um eine neue Substratbindungsstelle von 2C19 zu produzieren, ohne die Außenhülle der Proteine zu modifizieren, die es dem Protein ermöglichen, zu kristallisieren.
G. Homologie-Modellierung
Die Erfindung stellt ebenso ein Mittel zur Homologie-Modellierung anderer Proteine bereit (die untenstehend als Ziel-P450-Proteine bezeichnet werden). Mit „Homologie-Modellierung" ist gemeint, dass die Prognose verwandter P450-Strukturen entweder auf Röntgenkristall-Daten oder einer computerunterstützten De-novo-Prognose der Struktur beruht, basierend auf der Manipulation der Koordinatendaten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8.
Die in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 dargelegte P450-Struktur ist, wie hierin ausführlicher beschrieben wird, eine Dimerstruktur. Die unterschiedlichen, in diesem Abschnitt beschriebenen In-silico-Modellierungsverfahren und die anderen Abschnitte dieser Anwendung können entweder die Dimerstruktur aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 verwenden oder aber der Untereinheiten A und B. Um unnötige Wiederholungen zu vermeiden, wird hierin auf die Koordinatendaten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 verwiesen, dies ist jedoch sowohl als Daten für beide Untereinheiten als auch für eine der Untereinheiten zu verstehen.
Die „Homologie-Modellierung" erstreckt sich auf Ziel-P450-Proteine, die Analoga oder Homologe des 2C9-P450-Proteins sind, dessen Struktur in den begeleitenden Beispielen bestimmt wurde. Sie erstreckt sich ebenso auf P450-Proteinmutanten von 2C9 selbst.
Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Vergleichen der Aminosäuresequenzen des 2C9-P450-Proteins aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 mit einem Ziel-P450-Protein durch Anordnung der Aminosäuresequenzen. Die Aminosäuren in den Sequenzen werden dann verglichen, und homologe Gruppen von Aminosäuren (zur Vereinfachung als „korrespondierende Regionen" bezeichnete) werden zusammen angeordnet. Dieses Verfahren detektiert konservierte Regionen der Polypeptide und umfasst das Insertieren oder Deletieren von Aminosäuren.
Die Homologie zwischen Aminosäuresequenzen kann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Algorithmen bestimmt werden. Die Programme BLAST, gapped BLAST, BLASTN, PSI-BLAST und BLAST2 (bereitgestellt vom National Center for Biotechnology Information) werden nach dem Stand der Technik zu diesem Zweck auf breiter Ebene verwendet und können homologe Regionen von zwei Aminosäuresequenzen anordnen. Diese können mit Vorgabe-Parametern verwendet werden, um den Grad an Homologie zwischen der Aminosäuresequenz des Proteins aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 und anderen Ziel-P450-Proteinen zu bestimmen, die modelliert werden sollen.
Analoga werden als Proteine mit ähnlichen dreidimensionalen Strukturen und/oder Funktionen und wenigen Beweisen für einen gemeinsamen Vorfahren auf Sequenzebene definiert.
Homologe werden als Proteine mit Beweis eines gemeinsamen Vorfahren definiert, d.h. sie sind wahrscheinlich das Resultat evolutionärer Abweichungen und werden basierend auf dem Grad (normalerweise als Prozentzahl ausgedrückt) der Sequenzidentität in entfernte, mittlere und enge Untergruppierungen eingeteilt.
Ein Homolog wird hierin als ein Protein mit zumindest 15 % Sequenzidentität definiert oder eines, das zumindest eine funktionelle Domäne aufweist, die für 2C9 charakteristisch ist. Dies umfasst polymorphe Formen von 2C9.
Es gibt zwei Homolog-Typen: Orthologe und Paraloge. Orthologe werden als homologe Gene in verschiedenen Organismen definiert, d.h. die Gene teilen einen gemeinsamen Vorfahren, der mit dem Speziations-Event, durch den diese erzeugt wurden, übereinstimmt. Paraloge werden als homologe Gene im selben Organismus definiert, die von einer Gen/Chromosom/Genom-Duplikation abstammen, d.h. seit dem letzten Speziations-Event kam es zur Herausbildung des gemeinsamen Vorfahren der Gene.
Ein Mutant ist ein 2C9, das durch Ersatz oder Deletion von zumindest einer Aminosäure aus dem Wildtyp-2C9 charakterisiert wird. Solch ein Mutant kann z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder Inkorporation natürlicher oder unnatürlicher Aminosäuren hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung zieht „Mutanten" in Betracht, worin sich ein „Mutant" auf ein Polypeptid bezieht, das durch Ersetzen von zumindest einem Aminosäurerest in einem nativen oder synthetischen 2C9 mit einem anderen Aminosäurerest und/oder durch Addieren und/oder Deletieren von Aminosäureresten innerhalb des nativen Polypeptids oder am N- und/oder C-Terminus eines Polypeptids erhalten wird, das 2C9 entspricht und das im Wesentlichen dieselbe dreidimensionale Struktur aufweist wie 2C9, von dem es abstammt. Mit im Wesentlichen dieselbe dreidimensionale Struktur ist das Aufweisen einer Reihe Atom-Strukturkoordinaten gemeint, die eine mittlere quadratische Abweichung (RMSD) von weniger als oder entsprechend etwa 2,0 Å aufweisen, wenn sie über die Atom-Strukturkoordinaten des 2C9 gelegt werden, von dem der Mutant abstammt, wenn zumindest etwa 50 % bis 100 % der C_α-Atome von 2C9 in die Überlagerung eingeschlossen sind. Ein Mutant kann, muss jedoch keine, enzymatische oder katalytische Aktivität aufweisen.
Um Homologe oder Mutanten herzustellen, können die in dem Protein vorhandenen Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt werden, z.B. Hydrophobizität, hydrophobes Moment, Antigenität, die Tendenz, α-Helix- oder β-Faltblatt-Strukturen zu bilden oder aufzubrechen, etc. Substitutionsvarianten eines Proteins sind jene, in denen zumindest eine Aminosäure in der Proteinsequenz entfernt wurde und ein anderer Rest an deren Stelle eingeführt wurde. Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise einzelne Reste, können jedoch gehäuft auftreten, in Abhängigkeit von funktionellen Einschränkungen, z.B. an einem Kristallkontakt. Vorzugsweise umfassen Aminosäuresubstitutionen konservative Aminosäuresubsti tutionen. Insertions-Aminosäurevarianten sind jene, in die eine oder mehrere Aminosäure(n) eingeführt werden. Dies kann eine Amino-terminale und/oder eine Carboxyterminale Fusion sowie auch eine Intrasequenz sein. Beispiele für Amino-terminale und/oder Carboxy-terminate Fusionen sind Affinitätsmarkierungen, MBP-Markierungen und Epitop-Markierungen.
Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und -Additionen, die die dreidimensionale Struktur von 2C9 nicht signifikant stören, hängen teilweise von der Region von 2C9 ab, in der es zu der Substitution, Addition oder Deletion kommt. In hochgradig variablen Regionen des Moleküls können nicht konservative Substitutionen sowie konservative Substitutionen toleriert werden, ohne die dreidimensionale Struktur des Moleküls signifikant zu zerstören. In hochgradig konservierten Regionen oder Regionen, die eine signifikante Sekundär-Struktur in sich tragen, werden konservative Aminosäure-Substitutionen bevorzugt.
Konservative Aminosäure-Substitutionen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen Substitutionen, die auf Basis der Ähnlichkeit bezüglich der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der involvierten Aminosäurereste durchgeführt werden. Negativ geladene Aminosäuren umfassen z.B. Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Hauptgruppen mit ähnlichen Hydrophilie-Werten umfassen die Folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Andere konservative Aminosäuresubstitutionen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
In einigen Fällen kann es besonders von Vorteil oder geeignet sein, Aminosäurereste zu einer 2C9-Bindungstasche oder einem katalytischen Rest hinzufügen, diese zu deletieren und/oder zu substituieren, um passende Klonierungsstellen in der für das Polypeptid kodierenden cDNA bereitzustellen, um bei der Reinigung des Polypeptids etc. zu helfen. Solche Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen, die die drei dimensionale Struktur von 2C9 im Wesentlichen nicht verändern, werden dem Fachmann bekannt sein.
Es ist anzumerken, dass die hierin in Betracht gezogenen Mutanten keine enzymatische Aktivität aufweisen müssen. Tatsächlich zieht die Erfindung insbesondere Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in Betracht, die die katalytische Aktivität von 2C9 stören, die jedoch die dreidimensionale Struktur der katalytischen Region nicht wesentlich verändern. Solche kristallinen Polypeptide oder die aus diesen erhaltenen Atom-Strukturkoordinaten können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die an das Protein binden.
Sind die Aminosäuresequenzen der Polypeptide mit bekannten und unbekannten Strukturen einmal angeordnet, so werden die Strukturen der konservierten Aminosäuren in einer Computer-Darstellung des Polypeptids mit bekannter Struktur zu den korrespondierenden Aminosäuren des Polypeptids, dessen Struktur unbekannt ist, transferiert. Ein Tyrosin in der Aminosäuresequenz mit bekannter Struktur kann z.B. durch ein Phenylalanin, der korrespondierenden homologen Aminosäure in der Aminosäuresequenz unbekannter Struktur, ersetzt werden.
Die Strukturen von Aminosäuren, die sich in nicht konservierten Regionen befinden, können unter Verwendung von geometrischen Standard-Peptidverfahren oder mittels molekularer Simulationsverfahren, wie z.B. molekularer Dynamik, händisch zugeordnet werden. Der letzte Schritt in diesem Prozess wird durch Verfeinern der gesamten Struktur unter Verwendung der molekularen Dynamik und/oder Energieminimierung erreicht.
Die Homologie-Modellierung als solches ist ein Verfahren, das dem Fachmann wohlbekannt ist (siehe z.B. Greer, Science, Band 228, 1055 (1985), und Blundell et al., Eur. J. Biochem., Band 172, 513 (1988)). Die in diesen Verweisen beschriebenen Verfahren sowie andere Homologie-Modellierungsverfahren, die im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung erhältlich sind, können für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Homologie-Modellierung bereit, das folgende Schritte umfasst:

(a) das Anordnen eines repräsentativen Teils einer Aminosäuresequenz eines Ziel-P450-Proteins mit unbekannter dreidimensionaler Struktur mit der Aminosäuresequenz von P450 aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8, um homologe Regionen der Aminosäuresequenzen übereinzustimmem;
(b) das Modellieren der Struktur der übereingestimmten homologen Regionen des Ziel-P450 mit unbekannter Struktur nach den korrespondierenden Regionen der P450-Struktur, wie in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 definiert; und
(c) das Bestimmen einer Konformation (z.B. so, dass sich positive Wechselwirkungen innerhalb des Ziel-P450 unbekannter Struktur herausbilden, und/oder so, dass eine Niedrigenergie-Konformation ausgebildet wird) für das Ziel-P450 mit unbekannter Struktur, das im Wesentlichen die Struktur der übereingestimmten homologen Regionen beibehält.

Es wird/werden vorzugsweise einer oder alle der Schritt(e) (a) bis (c) mittels Computer-Modellierung durchgeführt.
Das Vorhandensein der F-G-Schleife in der Struktur der Erfinder ist für die Modellierung anderer P450s besonders vorteilhaft, insbesondere für Säugetier-P450s, die längere F-G-Schleifen besitzen als bakterielle P450s, da im Moment nach dem Stand der Technik nichts über die Konformation der F-G-Schleife in Säugetierstrukturen bekannt ist. Dies ist für die Modellierung von Verbindungen nach dieser Struktur oder modellierte Strukturen von Vorteil.
Die Daten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 sind besonders für die Homologie-Modellierung anderer menschlicher P450-Proteine von Vorteil, insbesondere menschlicher P450s, wie z.B. 2C8, 2C18, 2C19, 2D6, 3A4, 1A1, 1A2, 2E1. Diese Proteine können im oben beschriebenen Verfahren der Erfindung das Ziel-P450-Protein sein.
In einem besonders bevorzugten Aspekt wird das Homologie-Modell aus der aus 2C19, 2C18 und 2C8 bestehenden Gruppe ausgewählt. Die begleitenden Beispiele zeigen ein vollständiges Homologie-Modell für 2C19 und die Koordinaten von 2C18 und 2C8, die in die Strukturen von 2C9 oder 2C19 eingeführt werden können, um ein Homologie-Modell dieser Proteine bereitzustellen. Die daraus resultierenden Homologie-Modelle können in den hierin unten stehend in den Abschnitten H, I und J beschriebenen Verfahren verwendet werden.
H. Strukturlösung
Die Struktur des menschlichen 2C9-P450 kann ebenso verwendet werden, um die Kristallstruktur anderer Ziel-P450-Proteine aufzulösen, unter anderem andere Kristallformen von 2C9, Mutanten, Co-Komplexe von 2C9, wobei Röntgendiffraktionsdaten dieser Ziel-P450-Proteine generiert wurden und Interpretation erfordern, um eine Struktur bereitzustellen.
Im Fall von 2C9 kann dieses Protein in mehr als einer Kristallform kristallisieren. Die Strukturkoordinaten von 2C9 oder Teile davon, wie sie von dieser Erfindung bereitgestellt werden, sind besonders nützlich, um die Struktur jener anderen Kristallformen von 2C9 zu lösen. Sie können ebenso verwendet werden, um die Struktur von 2C9-Mutanten, 2C9-Co-Komplexen oder der kristallinen Form jedes anderen Proteins mit signifikanter Aminosäuresequenzhomologie zu einer beliebigen funktionellen Domäne von 2C9 zu lösen.
Im Fall anderer Ziel-P450-Proteine, insbesondere der menschlichen P450-Proteine, auf die im oben stehenden Abschnitt D Bezug genommen wird, ermöglicht die vorliegende Erfindung das leichtere Erhalten der Strukturen jener Ziele, bei denen Röntgendiffraktionsrohdaten erzeugt werden.
Werden daher kristallographische Röntgen- oder spektroskopische NMR-Daten für ein Ziel-P450 unbekannter dreidimensionaler Struktur bereitgestellt, so kann die in Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 definierte Struktur von P450 verwendet werden, um diese Daten zu interpretieren, um mittels Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, z.B. mittels Phasing im Fall einer Röntgenkristallographie und der Un- Unterstützung bei der Zuordnung von Peaks in NMR-Spektren, eine wahrscheinliche Struktur für die anderen P450 bereitzustellen.
Ein Verfahren, das für diese Zwecke verwendet werden kann, ist der molekulare Ersatz. In diesem Verfahren kann die unbekannte Kristallstruktur, egal ob diese eine andere Kristallform von 2C9, ein 2C9-Mutant oder ein 2C9-Co-Komplex ist oder der Kristall eines Ziel-P450-Proteins mit Aminosäuresequenzhomologie mit einer beliebigen funktionellen Domäne von 2C9, unter Verwendung der hierin in dieser Erfindung bereitgestellten 2C9-Strukturkoordinaten bestimmt werden. Dieses Verfahren stellt schneller und mit größerer Wirksamkeit eine genaue Strukturform für den unbekannten Kristall bereit als dies mit Versuchen, solche Informationen ab initio zu bestimmen, möglich wäre.
Beispiele für Computerprogramme, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, um molekularen Ersatz durchzuführen, sind CNX (A.T. Brunger, P.D. Adams, L.M. Rice, Current Opinion in Structural Biology, Band 8, Ausgabe 5, 606–611 (Oktober 1998)) (kommerziell auch bei Accelerys San Diego, CA, erhältlich) oder AMORE (J. Navaza, AMoRe: an automated package for molecular replacement, Acta Cryst. A50, 157–163 (1994)).
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur eines Proteins bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
die Bereitstellung der Koordinaten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 und
die Positionierung der Koordinaten in der Kristall-Elementarzelle des Proteins, um eine Struktur für das Protein bereitzustellen.
In einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung werden die Koordinaten verwendet, um die Struktur von Ziel-P450s, insbesondere Homologe von 2C9, z.B. 2C19, 2C8, 2C18, zu lösen.
Die Erfindung kann ebenso verwendet werden, um Peaks von NMR-Spektren solcher Proteine mittels Manipulation der Daten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 zuzuordnen.
I. Computersysteme
In einem anderen Aspekt sind die Systeme, insbesondere ein Computersystem, bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die Systeme umfassen entweder (a) Atom-Koordinatendaten gemäß Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur von P450 definieren, oder zumindest ausgewählte Koordinaten davon; (b) Strukturfaktordaten (wobei ein Strukturfaktor die Amplitude und Phase der gebeugten Welle umfasst) für P450, wobei die Strukturfaktordaten von den Atom-Koordinatendaten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 abgeleitet sein können; (c) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-P450-Proteins, das mittels Homologie-Modellierung des Ziels basierend auf den Daten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 erzeugt wurde; (d) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-P450-Proteins, die durch Interpretation von Röntgenkristalldaten oder NMR-Daten durch Verweis auf die Daten in Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 erzeugt wurden, oder (e) Strukturfaktordaten, die von den Atom-Koordinatendaten aus (c) oder (d) abgeleitet werden können.
Die Atom-Koordinatendaten können die Daten der ganzen Tabelle oder eines ausgewählten Teils davon umfassen.
Im Hinblick auf oben genannten Punkt (c) wird geschätzt, dass Tabelle 8 selbst die Atom-Koordinatendaten eines 2C19 umfasst, das durch die Homologie-Modellierung der 2C9-Struktur der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und die Daten aus Tabelle 18 und deren Anwendung bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die Systeme können ebenso auch Atom-Koordinatendaten von Ziel-P450-Proteinen umfassen, worin solche Daten gemäß der Verfahren der hierin beschriebenen Erfindung, basierend auf den in Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 bereitgestellten Ausgangsdaten, erhalten wurden.
Solche Daten sind für eine Reihe an Zwecken nützlich, unter anderem die Herstellung von Strukturen zur Analyse des Aktionsmechanismus von P450-Proteinen und/oder um ein rationales Wirkstoffdesign von Verbindungen durchzuführen, die mit P450 wechselwirken, z.B. Verbindungen, die von P450s metabolisiert werden.
In einem weiteren Aspekt beschreiben die Erfinder ein computerlesbares Speichermedium mit entweder (a) Atom-Koordinatendaten gemäß Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18, die darauf gespeichert sind, wobei die Daten die dreidimensionale Struktur von P450 definieren, oder zumindest ausgewählte Koordinaten davon; (b) Strukturfaktordaten für P450, die darauf gespeichert sind, wobei die Strukturfaktordaten von den Atom-Koordinatendaten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 abgeleitet werden können; (c) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-P450-Proteins, das mittels Homologie-Modellierung des Ziels, basierend auf den Daten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18, erzeugt wurde; (d) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-P450-Proteins, die durch Interpretation kristallographischer Röntgendaten oder NMR-Daten durch Verweis auf die in Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 enthaltenen Daten erzeugt wurden, oder (e) Strukturfaktordaten, die von Atom-Koordinatendaten aus (c) oder (d) abstammen können.
Die Atom-Koordinatendaten können die Daten der ganzen Tabelle oder eines ausgewählten Teils davon umfassen.
Wie hierin verwendet bezieht sich „computerlesbares Speichermedium" auf (ein) beliebige(s) Medium oder Medien, auf das/die direkt von einem Computer zugegriffen werden kann und gelesen werden kann. Solche Medien umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: magnetische Speichermedien, wie z.B. Floppydisks, Festplattenspeichermedien und Magnetbänder; optische Speichermedien, wie z.B. optische Disketten oder CD-ROM; elektrische Speichermedien, wie z.B. RAM und ROM; sowie Hybride dieser Kategorien, wie z.B. magnetisch/optische Speichermedien.
Durch die Bereitstellung eines solchen Speichermediums können die Atom-Koordinatendaten routinemäßig überprüft werden, um P450 oder ausgewählte Koordinaten dieser zu modellieren. RASMOL (Sayle et al., TIBS, Band 20, 374 (1995)) z.B. ist ein öffentlich erhältliches Computersoftwarepacket, das den Zugang zu und die Analyse von Atom-Koordinatendaten zur Strukturbestimmung und/oder zum rationalen Wirkstoffdesign ermöglicht.
Auf der anderen Seite sind Strukturfaktordaten, die von Atom-Koordinatendaten ableitbar sind (siehe z.B. Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York, London und San Francisco (1976)), z.B. für die Berechnung von Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karten besonders nützlich.
Wie hierin verwendet bezieht sich „ein Computersystem" auf die Hardwaremittel, die Softwaremittel und die Datenspeichermittel, die verwendet werden, um die Atom-Koordinatendaten der vorliegenden Erfindung zu analysieren. Die minimalen Hardwaremittel der computerbasierenden Systeme der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine zentrale Rechnereinheit (CPU), einen Arbeitsspeicher und Datenspeichermittel sowie z.B. Eingabevorrichtungen, Ausgabevorrichtungen etc. Wünschenswerterweise wird ein Monitor bereitgestellt, um die Strukturdaten darzustellen. Die Datenspeichermittel können RAM oder Mittel zum Zugreifen auf computerlesbare Medien der Erfindung sein. Beispiele solcher Systeme sind Mikrocomputer-Workstations, die bei Silicon Graphics Incorporated und Sun Microsystems erhältlich sind und auf Basis von Unix, Windows NT oder IBM OS/2-Betriebssystemen laufen.
In einem anderen Aspekt kann ein computerlesbares Speichermedium bereitgestellt werden, umfassend Datenspeichermaterial, das mit computerlesbaren Daten kodiert ist, worin die Daten von allen oder einem Teil (d.h. ausgewählten Koordinaten, wie hierin definiert) der Strukturkoordinaten von 2C9 aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder einem Homolog von 2C9, umfassend die Struktur von 2C19 aus Tabelle 18, definiert werden, worin dieses Homolog Rückgratatome umfasst, die eine mittlere quadratische Abweichung von den Rückgratatomen (Stickstoff-Kohlenstoff_α-Kohlenstoff) aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 von nicht mehr als 2,0 Å (vorzugsweise nicht mehr als 1,5 Å) umfassen.
Ein computerlesbares Datenspeichermedium kann ein Datenspeichermaterial umfassen, das mit einer ersten Reihe an computerlesbaren Daten kodiert ist, umfas send eine Fourier-Transformation von zumindest einem Teil (d.h. ausgewählte Koordinaten, wie hierin definiert) der Strukturkoordinaten für 2C9 gemäß Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder 2C19 aus Tabelle 18; wobei diese, wenn mit einer zweiten Reihe an maschinenlesbaren Daten kombiniert, umfassend ein Röntgendiffraktionsmuster eines Moleküls oder molekularen Komplexes einer unbekannten Struktur, unter Verwendung einer Maschine, die mit den Anweisungen zur Verwendung dieser ersten Reihe an Daten und dieser zweiten Reihe an Daten programmiert wurde, zumindest einen Teil der Strukturkoordinaten bestimmen kann, die mit der zweiten Reihe an maschinenlesbaren Daten korrespondieren.
Daten zur Erzeugung von Strukturen und/oder zur Durchführung von Wirkstoffdesign mit 2C9, 2C9-Homologen oder -Analoga, Komplexen von 2C9 mit einer Verbindung oder Komplexen von 2C9-Homologen oder -Analoga mit Verbindungen gemäß der Erfindung können mittels eines Verfahrens bereitgestellt werden, das Folgendes umfasst:

(i) die Bereitstellung der Kommunikation mit einer entfernten Vorrichtung, die computerlesbare Daten enthält, die zumindest eine der folgenden Kategorien umfasst: (a) Atom-Koordinatendaten gemäß Tabelle 1, 2, 3 oder 8, wobei diese Daten die dreidimensionale Struktur von 2C9, zumindest eine Subdomäne der dreidimensionalen Struktur von 2C9 definieren, oder die Koordinaten einer Vielzahl an Atomen von 2C9; (b) Strukturfaktordaten von 2C9, wobei die Strukturfaktordaten von den Atom-Koordinatendaten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 abgeleitet sein können; (c) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-2C9-Homologs oder -Analogs, das mittels Homologie-Modellierung des Ziels basierend auf den Daten aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 erzeugt wurde, wie z.B. die Daten aus Tabelle 18; (d) Atom-Koordinatendaten eines Proteins, die durch Interpretation kristallographischer Röntgendaten oder NMR-Daten mit Verweis auf die Daten in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 erzeugt wurden; und (e) Strukturfaktordaten, die von den Atom-Koordinatendaten aus (c) oder (d) abstammen können; und
(ii) das Erhalten der computerlesbaren Daten von der entfernten Vorrichtung.

Daten zur Erzeugung von Strukturen und/oder zur Durchführung von Wirkstoffdesign mit 2C19, 2C19-Homologen oder -Analoga, Komplexen von 2C19 mit einer Verbindung oder Komplexen von 2C19-Homologen oder -Analoga mit Verbindungen können mittels eines Verfahrens bereitgestellt werden, das Folgendes umfasst:

(i) die Bereitstellung der Kommunikation mit einer entfernten Vorrichtung, die computerlesbare Daten enthält, die zumindest eine der folgenden Kategorien umfasst: (a) Atom-Koordinatendaten gemäß Tabelle 18, wobei diese Daten die dreidimensionale Struktur von 2C19, zumindest eine Subdomäne der dreidimensionalen Struktur von 2C19 definieren, oder die Koordinaten einer Vielzahl an Atomen von 2C19; (b) Strukturfaktordaten von 2C19, wobei die Strukturfaktordaten von den Atom-Koordinatendaten aus Tabelle 18 abgeleitet sein können; (c) Atom-Koordinatendaten eines Ziel-2C19-Homologs oder -Analogs, das mittels Homologie-Modellierung des Ziels basierend auf den Daten aus Tabelle 18 erzeugt wurde; (d) Atom-Koordinatendaten eines Proteins, das durch Interpretation kristallographischer Röntgendaten oder NMR-Daten mit Verweis auf die Daten in Tabelle 18 erzeugt wurde; und (e) Strukturfaktordaten, die von den Atom-Koordinatendaten aus (c) oder (d) abstammen können; und
(ii) das Erhalten der computerlesbaren Daten von der entfernten Vorrichtung.

Die entfernte Vorrichtung kann daher ein z.B. ein Computersystem oder ein computerlesbares Speichermedium einer der vorangegangenen Aspekte der Erfindung umfassen. Die Vorrichtung kann sich in einem anderen Land befinden oder unter anderer Gerichtsbarkeit im Vergleich zur Herkunft der computerlesbaren Daten.
Die Kommunikation kann via Internet, Intranet, E-Mail etc. erfolgen. Typischerweise ist die Kommunikation elektronischer Natur, ein Teil oder der ganze Kommunikationsweg kann jedoch optisch sein, z.B. via Lichtwellenleiter.
J. Verwendungen der Strukturen der Erfindung
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Kristallstrukturen (unter anderem die Strukturen aus Tabelle 1, 2, 3, 8 und 18 sowie die Strukturen von Ziel-P450-Proteinen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurden) können auf mehrere Arten für das Wirkstoffdesign verwendet werden. Viele Wirkstoffe oder Wirkstoffkandidaten z.B. können aufgrund der schädlichen Wechselwirkungen mit P450-Proteinen, die zu einer schnellen Clearance der Wirkstoffe aus dem Körper führen, klinisch nicht verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht dem Fachmann den Versuch, solche Verbindungen von der Entwicklung auszunehmen, indem er diesen strukturbasierenden chemischen Strategien folgt.
Sollte ein Wirkstoffmolekül von einer P450 metabolisiert werden, so können Informationen über die Bindungsorientierung entweder durch Co-Kristallisation, Einweichen oder mittels über Berechnungen durchgeführtes Anbinden der Bindungsorientierung des Wirkstoffs in der Bindungstasche bestimmt werden. Dadurch werden spezifische Modifikationen an der chemischen Struktur gesteuert, die zur Mediation oder Kontrolle der Wechselwirkung des Wirkstoffs mit dem Protein gedacht ist. Solche Modifikationen können mit dem Ziel kreiert werden, den Stoffwechsel des Wirkstoffs durch P450 zu reduzieren und dadurch dessen therapeutische Wirkung zu verbessern.
Die Kristallstruktur könnte ebenso nützlich sein, um Wirkstoff-Wirkstoff-Wechselwirkungen zu verstehen. Es gibt zahlreiche Beispiele, in denen nachteilige Reaktionen auf Wirkstoffe bemerkt wurden, falls diese verabreicht wurden, während der Patient bereits andere Medikamente einnimmt. Der Mechanismus hinter diesem schädlichen und oftmals gefährlichen Wirkstoff-Wirkstoff-Wechselwirkungsszenario kann damit begründet sein, dass es durch die Inhibitorwirkung eines Wirkstoffs auf ein P450 zu einem Aufbau toxischer Spiegel des anderen Wirkstoffs kommt, da es geringen oder keinen Stoffwechsel gibt. Die Kristallstruktur der vorliegenden Erfindung, die (entweder in vitro oder in silico) mit solch einem Inhibitor einen Komplex gebildet hat, kann ebenso rationale Modifikationen ermöglichen, und zwar entweder, um den Inhibitor zu modifizieren, sodass er nicht mehr oder weniger inhibiert, oder um den zweiten Wirkstoff zu modifizieren, sodass er besser an das P450 binden könnte (wodurch er metabolisiert wird) und so den Inhibitor verdrängen könnte.
P450s zeigen signifikante polymorphe Variationen, je nach Abhängigkeit der ethnischen Herkunft des Patienten. Dies kann sich in nachteiligen Reaktionen einiger Segmente der Patientenpopulationen in Bezug auf einige Wirkstoffe bemerkbar machen. Durch die Verwendung der Kristallstrukturen der vorliegenden Erfindung zur Kartierung der relevanten Mutation in Bezug auf den Bindungsmodus des Wirkstoffs könnten ebenso chemische Modifikationen des Wirkstoffs vorgenommen werden, um Wechselwirkungen mit der variablen Region des Proteins zu vermeiden. Dies würde einen beständigeren therapeutischen Wert des Wirkstoffs für diese Segmente der Bevölkerung sicherstellen und würde gefährliche Nebenwirkungen vermeiden.
Einige pharmazeutische Verbindungen werden von P450s in aktive Metaboliten umgewandelt. Im Falle dieser Verbindungen ermöglicht ein besseres Verständnis der Umwandlung solcher Verbindungen durch ein P450 eine Modifikation der Verbindung, sodass diese mit einer unterschiedlichen Geschwindigkeit umgewandelt werden kann. Eine Erhöhung der Umwandlungsgeschwindigkeit kann z.B. ein schnelleres Eintreten einer gewünschten therapeutischen Wirkung ermöglichen, wohingegen ein Herabsetzen der Umwandlungsgeschwindigkeit eine Verabreichung höherer Dosen ermöglicht oder aber die Entwicklung von pharmazeutischen Retard-Präparaten, die z.B. ein Gemisch an Verbindungen umfassen, die in verschiedenen Geschwindigkeiten metabolisiert werden, um denselben aktiven Metaboliten auszubilden.
Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von P450 stellt daher eine Grundlage für das Design neuer Verbindungen dar, die mit P450 auf neue Arten Wechselwirken. Ist z.B. die dreidimensionale Struktur von P450 einmal bekannt, so können Computer-Modellierungsprogramme verwendet werden, um verschiedene Moleküle zu kreieren, von denen erwartet wird, dass sie mit möglichen oder bestätigten aktiven Stellen wechselwirken, z.B. mit Bindungsstellen oder anderen strukturellen oder funktionalen Merkmalen von P450.
(i) Erhalt und Analyse von Kristallkomplexen
In einem Ansatz kann die Struktur einer an ein P450 gebundenen Verbindung mittels eines Experiments bestimmt werden. Dadurch ist ein Ausgangspunkt in der Analyse der an P450 gebundenen Verbindung gegeben, wodurch der Fachmann detaillierte Einblicke bezüglich der Wechselwirkung der spezifischen Verbindung mit P450 und des Mechanismus, durch den sie metabolisiert wird, erhält.
Viele der oben beschriebenen Verfahren und Ansätze in Bezug auf das strukturbasierte Wirkstoffdesign beruhen in einem bestimmten Stadium auf der Röntgenstrukturanalyse, um die Bindungsposition eines Liganden in einem Ligand-Protein-Komplex zu identifizieren. Ein häufig verwendeter Weg dazu ist die Durchführung einer Röntgenstrahlen-Kristallographie des Komplexes, die Erstellung einer Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karte sowie das Assoziieren eines bestimmten Musters der Elektronendichte mit dem Liganden. Um jedoch die Karte zu erstellen (wie z.B. von Blundell et al., s.o., beschrieben) ist es notwendig, die Protein-3D-Struktur zuvor zu kennen (oder zumindest die Proteinstrukturfaktoren). Die Bestimmung der P450-Struktur ermöglicht daher auch die Produktion von Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karten von P450-Verbindungskomplexen und die Bestimmung der Bindungsposition eines Wirkstoffs, was eine große Hilfe im Verfahren des rationalen Wirkstoffdesigns sein kann.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Verbindung bereit, die an P450 gebunden ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das Bereitstellen eines Kristalls von 2C9-P450 gemäß der Erfindung;
das Einweichen des Kristalls in den Verbindungen; und
das Bestimmen der Struktur des 2C9-P450-Verbindungskomplexes mithilfe der Daten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18.
Alternativ dazu können das P450 und die Verbindung co-kristallisiert werden. Die Erfindung umfasst daher ein Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer Verbindung, die an P450 gebunden ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Mischen des Proteins mit der/den Verbindung(en), das Kristallisieren des Protein-Verbindungskomplexes und das Bestimmen der Struktur des P450-Verbindungskomplexes mittels Verweis auf die Daten aus Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18.
Die Analyse solcher Strukturen kann folgendermaßen durchgeführt werden: (i) mit kristallographischen Röntgendiffraktionsdaten aus dem Komplex und (ii) mit einer dreidimensionalen Struktur von P450 oder zumindest ausgewählten Koordinaten davon, um eine Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karte des Komplexes zu erstellen, wobei die dreidimensionale Struktur von Atom-Koordinatendaten gemäß Tabelle 1, 2, 3 oder 8 definiert wird. Danach kann die Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karte analysiert werden.
Daher können solche Komplexe kristallisiert und analysiert werden, und zwar unter Verwendung von Röntgendiffraktionsverfahren, z.B. gemäß dem von Greer et al., J. of Medicinal Chemistry, Band 37, 1035–1054 (1994), beschriebenen Ansatz, und Differenz-Fourier-Elektronendichte-Karten können basierend auf Röntgendiffraktionsmustern eingeweichter oder co-kristallisierter P450 und der gelösten Struktur von unkomplexierten P450s berechnet werden. Diese Karten können danach analysiert werden, z.B. um zu bestimmen, ob und wo eine bestimmte Verbindung an P450 bindet und/oder die Konformation von P450 verändert.
Elektronendichtekarten können unter Verwendung von Programmen, wie z.B. jenen des CCP4-Rechenpakets (Collaborative Computational Project 4, The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica D 50, 760–763 (1994)), berechnet werden. Zur Kartendarstellung und Modellbildung können Programme wie z.B. „O" verwendet werden (Jones et al., Acta Crystallographica A47, 110–119 (1991)).
Zusätzlich dazu können gemäß dieser Erfindung 2C9-Mutanten im Co-Komplex mit bekannten 2C9-Substraten oder -Inhibitoren oder neuen Verbindungen kristallisiert werden. Die Kristallstrukturen einer Reihe solcher Komplexe können danach mittels molekularen Ersatzes gelöst werden und mit jenen von 2C9 aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 verglichen werden. Potentielle Stellen zur Modifikation in den verschiedenen Bindungsstellen des Enzyms können so identifiziert werden. Diese Informationen stellen ein zusätzliches Werkzeug zur Bestimmung der wirksamsten Bindungs-Wechselwirkungen dar, z.B. erhöhte hydrophobe Wechselwirkungen zwischen 2C9 und einer chemischen Gruppierung oder Verbindung.
Es gibt z.B. Allele von 2C9, die sich vom nativen 2C9 durch nur 1 oder 2 Aminosäure-Substitutionen unterscheiden, trotzdem können Individuen, die diese Allelvarianten exprimieren, höchst unterschiedliche Wirkstoff-Stoffwechselprofile aufweisen. Durch die Erzeugung dieser allelen Proteine und die Bestimmung des Co-Komplexes mit Verbindungen kann ein besseres Verständnis der allelen Wechselwirkungen mit Verbindungen entwickelt werden.
Alle der oben erwähnten Komplexe können unter Verwendung wohlbekannter Röntgenstrahlen-Diffraktionsverfahren studiert werden und können gegenüber 1,5- bis 3,5-Å-Auflösungs-Röntgendaten verfeinert werden und zwar bis auf einen R-Wert von etwa 0,30 oder weniger, unter Verwendung von Computer-Software, wie z.B. CNX (oben bereits erwähnt), X-PLOR (Yale University, © 1992, vertrieben von Accelerys – siehe auch z.B. Blundell et al., Methods in Enzymology, Band 114 & 115, 23, H.W. Wyckoff et al. (Hrsg), Academic Press (1985)).
Diese Informationen können daher verwendet werden, um bekannte Klassen an 2C9-Substraten oder -Inhibitoren zu optimieren und, was wichtiger ist, um neue Klassen an 2C9-Inhibitoren zu kreieren und synthetisieren und Wirkstoffe mit modifiziertem P450-Stoffwechsel zu erschaffen.
(ii) In-silico-Analyse und -Design
Obwohl die Erfindung die Bestimmung der eigentlichen Kristallstrukturen vereinfacht, die P450 und eine Verbindung umfassen, die mit P450 wechselwirkt, bieten aktuelle Rechenverfahren eine starke Alternative zu der Notwendigkeit, solche Kristalle zu er zeugen und Diffraktionsdaten zu erzeugen und zu analysieren. Dementsprechend betrifft ein insbesondere bevorzugter Aspekt der Erfindung In-silico-Verfahren, die auf die Analyse und die Entwicklung von Verbindungen gerichtet sind, die mit P450-Strukturen der vorliegenden Erfindung wechselwirken.
Als Resultat der Bestimmung der dreidimensionalen P450-Struktur können daher auch weitere, rein rechenbezogene Verfahren zum rationalen Wirkstoffdesign verwendet werden, um Strukturen zu kreieren, deren Wechselwirkung mit P450 besser verstanden wird (für einen Überblick über diese Verfahren siehe z.B. Walters et al. (Drug Discovery Today, Band 3 Nr. 4, 160–178 (1998))). Es können z.B. automatisierte Ligand-Rezeptor-Anbindungsprogramme (z.B. von Jones et al., Current Opinion in Biotechnology, Band 6, 652–656 (1995), beschrieben) verwendet werden, die genaue Informationen über die Atom-Koordinaten der Zielrezeptoren erfordern.
Die hierin beschriebenen Aspekte der Erfindung, die die P450-Struktur in silico verwenden, können ebenso sowohl auf die 2C9-Struktur aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 verwendet werden als auch auf die Modelle für Ziel-P450-Proteine, die durch andere Aspekte der Erfindung erhalten werden. Wurde daher die Konformation eines P450 mittels des oben beschriebenen Verfahrens bestimmt, so kann diese Konformation, wie hierin beschrieben, in einem computerbasierenden Verfahren des rationalen Wirkstoffdesigns verwendet werden. Zusätzlich ermöglicht die Verfügbarkeit der Struktur von P450-2C9 die Herstellung von Pharmacophor-Modellen mit hohem Prognosegrad für das Screening virtueller Bibliotheken oder das Verbindungsdesign.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein computerbasierendes Verfahren zur Analyse der Wechselwirkung einer molekularen Struktur mit einer P450-Struktur der Erfindung bereit, das Folgendes umfasst:
die Bereitstellung der Struktur einer P450 der Erfindung;
die Bereitstellung einer molekularen Struktur, die an die P450-Struktur anzupassen ist; und
das Anpassen der molekularen Struktur an die P450-Struktur.
Die P450-Sruktur der Erfindung kann die Struktur aus einer beliebigen der Tabellen 1, 2, 3, 8 oder 18 oder ausgewählter Koordinaten dieser sein.
In einem alternativen Aspekt kann das Verfahren der Erfindung die Koordinaten von Atomen von Interesse von P450 benutzen, die sich in der Nähe einer mutmaßlichen Bindungsregion der Molekülstruktur befinden, um die Tasche, in der die Struktur bindet, zu modellieren. Diese Koordinaten können verwendet werden, um einen Raum zu definieren, der dann „in silico" analysiert wird. Die Erfindung umfasst daher ein computerbasierendes Verfahren zur Analyse molekularer Strukturen, das Folgendes umfasst:
die Bereitstellung der Koordinaten von zumindest zwei Atomen einer P450-Struktur der Erfindung („ausgewählte Koordinaten");
die Bereitstellung einer molekularen Struktur, die an die Koordinaten anzupassen ist; und
das Anpassen der Struktur an die ausgewählten Koordinaten von P450.
In der Praxis ist es wünschenswert, eine ausreichende Anzahl an Atomen von P450 zu modellieren, wie sie von den Koordinaten in Tabelle 1, 2, 3, 8 oder 18 definiert werden, die eine Bindungstasche darstellen. Bindungstaschen und andere Merkmale der Wechselwirkung von P450 mit dem Co-Faktor werden in den begleitenden Beispielen beschrieben. In dieser Ausführungsform der Erfindung werden daher vorzugsweise die Koordinaten von zumindest 5, vorzugsweise zumindest 10, noch bevorzugter zumindest 50 und noch bevorzugter zumindest 100, ausgewählten Atomen, wie z.B. zumindest 500 oder zumindest 1000 Atomen, der P450-Struktur bereitgestellt.
Obwohl jede verschiedene Verbindung, die von P450 metabolisiert wird, mit anderen Teilen der Bindungstasche des Proteins wechselwirken kann, ermöglicht die Struktur dieses P450 die Identifikation einer Reihe bestimmter Stellen, die wahrscheinlich in viele der Wechselwirkungen von P450 mit einem Wirkstoffkandidaten involviert sind. Die Reste werden in dem begleitenden Beispiel dargelegt. In diesem Aspekt der Er findung können die ausgewählten Koordinaten Koordinaten von einigen oder allen dieser Reste umfassen.
Um eine dreidimensionale Struktur von Verbindungen bereitzustellen, die an eine P450-Struktur der Erfindung anzupassen sind, kann die Verbindungsstruktur unter Verwendung von im Handel für diesen Zweck erhältlicher Software in drei Dimensionen modelliert werden, oder, falls ihre Kristallstruktur erhältlich ist, es können die Koordinaten der Struktur verwendet werden, um einen repräsentativen Teil der Verbindung zum Anpassen an eine P450-Struktur der Erfindung bereitzustellen.
Mit „anpassen" ist eine Bestimmung der Wechselwirkungen zwischen zumindest einem Atom einer molekularen Struktur und zumindest einem Atom einer P450-Struktur der Erfindung mit automatischen oder semi-automatischen Mitteln gemeint sowie die Berechnung des Ausmaßes, in dem solch eine Wechselwirkung als stabil angesehen werden kann. Wechselwirkungen umfassen Anziehung und Abstoßung, die durch Ladung, sterische Erwägungen und dergleichen verursacht werden. Verschiedene computerbasierende Verfahren zur Anpassung sind weiters hierin beschrieben.
Genauer gesagt, kann die Wechselwirkung einer Verbindung mit P450 durch die Verwendung einer Computermodellierung mittels eines Anbindungsprogramms, wie z.B. GRAM, DOCK oder AUTODOCK (siehe Walters et al., Drug Discovery Today, Band 3 Nr. 4, 160–178 (1998), und Dunbrack et al., Folding and Design 2, 27–42 (1997)), untersucht werden. Dieses Verfahren kann eine Computer-Anpassung von Verbindungen an P450 umfassen, um festzustellen, wie gut die Form und die chemische Struktur der Verbindung an das P450 binden.
Ebenso kann eine computerunterstützte, händische Untersuchung der Struktur der aktiven Stellen von P450 durchgeführt werden. Die Verwendung von Programmen, wie z.B. GRID (Goodford, J. Med. Chem. 28, 849–857 (1985)) – ein Programm, das wahrscheinliche Wechselwirkungsstellen zwischen Molekülen mit verschiedenen funktionellen Gruppen und einer Enzymoberfläche bestimmt –, kann ebenso mit ein bezogen werden, um die aktive Stelle zu analysieren, um z.B. die Arten an Modifikationen vorherzusagen, die die Geschwindigkeit des Stoffwechsels einer Verbindung verändern.
Computerprogramme können verwendet werden, um die Anziehung, Abstoßung sowie die sterische Hinderung der beiden Bindungspartner (d.h. das P450 und eine Verbindung) abzuschätzen.
Wird mehr als eine aktive Stelle von P450 charakterisiert und wird eine Vielzahl an jeweiligen kleineren Verbindungen kreiert oder ausgewählt, so kann eine Verbindung durch Verbinden der jeweiligen kleinen Verbindungen an eine größere Verbindung gebildet werden, die die relativen Positionen und Ausrichtungen der jeweiligen Verbindungen an den aktiven Stellen beibehält. Die größere Verbindung kann als richtiges Molekül oder mittels Computermodellierung ausgebildet werden.
Danach können ausführliche strukturelle Informationen über die Bindung der Verbindung an P450 erhalten werden, und angesichts dieser Informationen können Adjustierungen bezüglich der Struktur oder Funktionalität der Verbindung durchgeführt werden, z.B. um ihre Wechselwirkung mit P450 zu verändern. Die oben genannten Schritte können je nach Notwendigkeit wiederholt und erneut wiederholt werden.
Wie oben angeführt, umfassen molekulare Strukturen, die an die P450-Struktur der Erfindung angepasst werden können, Verbindungen, die sich als potentielle pharmazeutische Agenzien in Entwicklung befinden. Die Agenzien können angepasst werden, um zu bestimmen, wie die Wirkung von P450 das Agens modifiziert, sowie um eine Basis für die Modellierung von Kandidatenagenzien bereitzustellen, die in unterschiedlicher Geschwindigkeit von einem P450 metabolisiert werden.
Molekulare Strukturen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind normalerweise Verbindungen, die sich in Entwicklung befinden und zur pharmazeutischen Verwendung gedacht sind. Im Allgemeinen sind solche Verbindungen organische Moleküle, typischerweise von etwa 100 bis 2000 Da, noch bevorzugter von etwa 100 bis 1000 Da, Molekulargewicht. Solche Verbindungen umfassen Peptide und Derivate davon, Steroide, entzündungshemmende Wirkstoffe, gegen Krebs gerichtete Agenzien, antibakterielle oder antivirale Agenzien, neurologische Agenzien und dergleichen. Im Prinzip kann jede in Entwicklung befindliche Verbindung auf dem Gebiet der Pharmazie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ihre Entwicklung zu erleichtern oder um ein weiteres rationales Wirkstoffdesign zur Verbesserung ihrer Eigenschaften zu ermöglichen.
Eine einzelne Reduktase versorgt mehrere verschiedene Isoformen von P450 mit den im katalytischen Zyklus erforderlichen Elektronen. Als solches stellt das Wissen über die Bindungsstelle der Cytochrom-P450-Reduktase (CPR) auf P450 und seine Merkmale ein Mittel zur Veränderung der Katalyse-Rate dar, und zwar durch Vermittlung der P450-CPR-Wechselwirkungen. Die Struktur von 2C9 ermöglicht die In-silico-Identifikation von Resten, die für die P450-CPR-Grenzfläche von Bedeutung sind.
(iii) Analyse und Modifikation von Verbindungen und Metaboliten
Wo der primäre Metabolit einer potentiellen oder tatsächlichen pharmazeutischen Verbindung bekannt ist und dieser Metabolit durch die Wirkung von P450 erzeugt wird, kann die Struktur des Agens und seines Metaboliten sowohl modelliert werden als auch miteinander verglichen werden, um Reste von P450, die mit dem Agens wechselwirken, besser zu bestimmen. In jedem Fall stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prognose potentieller pharmazeutischer Verbindungen mit einer gewünschten Aktivität bereit, die von P450 in einer anderen Geschwindigkeit metabolisiert werden als eine Ausgangsverbindung mit derselben gewünschten Aktivität, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
das Anpassen einer Ausgangsverbindung an eine P450-Struktur der Erfindung oder ausgewählte Koordinaten dieser;
das Bestimmen oder Vorhersagen, wie die Verbindung von der P450-Struktur metabolisiert wird; und
das Modifizieren der Verbindungsstruktur, um die Wechselwirkung zwischen ihr und der P450 zu verändern.
Es wäre einem Fachmann bewusst, dass eine Modifikation der Struktur normalerweise in silico vorkommt, wodurch Prognosen über die Art der Wechselwirkung der modifizierten Struktur mit der P450 gemacht werden können.
Modifikationen sind jene, die auf dem Gebiet der medizinischen Chemie üblich sind, und umfassen z.B. Substitutionen oder die Entfernung von Gruppen, die Reste enthalten, die mit den Aminosäureseitenkettengruppen einer P450-Struktur der Erfindung wechselwirken. Die Ersetzungen können z.B. die Zugabe oder Entfernung von Gruppen umfassen, um die Ladung einer Gruppe in einer Testverbindung zu erhöhen oder zu verringern, den Ersatz einer Ladungsgruppe mit einer Gruppe der entgegengesetzten Ladung oder den Ersatz einer hydrophoben Gruppe mit einer hydrophilen Gruppe oder umgekehrt. Es ist klar erkenntlich, dass dies nur Beispiele der Art von Substitutionen sind, die von medizinischen Chemikern in der Entwicklung neuer pharmazeutischer Verbindungen in Betracht gezogen werden, und andere Modifikationen können in Abhängigkeit der Natur der Ausgangsverbindung und ihrer Aktivität durchgeführt werden.
Obwohl es normalerweise erwünscht ist, eine Verbindung zu verändern, um ihren Stoffwechsel durch P450 zu vermeiden oder um zumindest die Geschwindigkeit zu verringern, mit der P450 die Verbindung metabolisiert, umfasst die vorliegende Erfindung auch die Entwicklung von Verbindungen, die schneller metabolisiert werden als eine Ausgangsverbindung, z.B. in Fällen, in denen eine solche Verbindung den Stoffwechsel eines anderen Wirkstoffes blockiert.
Wurde eine potentielle modifizierte Verbindung durch Anpassen einer Ausgangsverbindung an die P450-Struktur der Erfindung und darauf basierendes Prognostizieren einer modifizierten Verbindung mit einer veränderten Geschwindigkeit des Stoffwechsels entwickelt, so umfasst die Erfindung weiters den Schritt des Synthetisierens der modifizierten Verbindung und des Testens dieser in einem biologischen In-vivo- oder In-vitro-System, um ihre Aktivität und/oder die Geschwindigkeit, mit der sie metabolisiert wird, zu bestimmen.
Die oben beschriebenen Verfahren der Erfindung können wiederholt werden, wobei die modifizierte Verbindung selbst die Grundlage für das Design weiterer Verbindungen sein kann.
(iv) Bindung und Züchten von Fragmenten
Die Bereitstellung der Kristallstrukturen der Erfindung ermöglicht ebenso die Entwicklung von Verbindungen, die mit den Bindungstaschenregionen von P450s Wechselwirken (z.B. um als Inhibitoren einer P450 zu agieren), basierend auf einem Ansatz der Bindung oder des Züchtens von Fragmenten.
Die Bindung von einem oder mehreren molekularen Fragment(en) kann z.B. in der Proteinbindungstasche mittels Röntgenkristallographie bestimmt werden. Molekülfragmente sind typischerweise Verbindungen mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 200 Da. Dies kann dann einen Ausgangspunkt für die medizinische Chemie darstellen, die Wechselwirkungen unter Verwendung eines strukturbasierenden Ansatzes zu optimieren. Die Fragmente können auf einer Matrize kombiniert werden oder als Ausgangspunkt für die „Entwicklung" eines Inhibitors in andere Taschen des Proteins verwendet werden. Die Fragmente können in der Bindungstasche des P450 positioniert werden und dann „heranwachsen gelassen werden", um den vorhandenen Raum auszufüllen, wobei die elektrostatischen, die Van-der-Waals- oder die Wasserstoffbindungs-Wechselwirkungen erforscht werden, die in die molekulare Erkennung involviert sind. Die Stärke des ursprünglich schwachen Bindungsfragments kann daher unter Verwendung wiederholter strukturbasierter chemischer Synthese schnell verbessert werden.
In einem oder mehreren Stadien des fragmentzüchtenden Ansatzes kann die Verbindung synthetisiert und in einem biologischen System auf ihre Aktivität getestet werden. Dies kann verwendet werden, um das weitere Heranwachsenlassen des Fragments zu steuern.
Werden zwei fragmentbindende Regionen identifiziert, so kann ein Ansatz der gebundenen Fragmente auf dem Versuch beruhen, die zwei Fragmente direkt zu verbinden oder eines oder beide Fragmente auf die oben beschriebene Art und Weise zu züchten, um eine größere, verbundene Struktur zu erhalten, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen könnte.
(v) Verbindungen
Wurde eine potentielle modifizierte Verbindung durch Anpassen einer Ausgangsverbindung an die P450-Struktur der Erfindung und darauf basierendes Prognostizieren einer modifizierten Verbindung mit einer veränderten Geschwindigkeit des Stoffwechsels entwickelt (umfassend eine langsamere, schnellere oder Nullraten-Geschwindigkeit), so umfasst die Erfindung weiters den Schritt des Synthetisierens der modifizierten Verbindung und des Testens dieser in einem biologischen In-vivo- oder In-vitro-System, um ihre Aktivität und/oder die Geschwindigkeit, mit der sie metabolisiert wird, zu bestimmen.
Nach der Identifikation einer solchen Verbindung kann diese hergestellt werden und/oder in der Zubereitung, d.h. der Herstellung oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie z.B. eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Wirkstoffs, verwendet werden. Diese können an Individuen verabreicht werden.
Eine durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung identifizierte Verbindung kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, eines Medikaments, eines Arzneimittels oder einer anderen Zusammensetzung, die solch eine Verbindung umfasst, vorliegen, z.B. zur Behandlung (was auch präventive Behandlung umfassen kann) einer Krankheit; ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, z.B. zur Behandlung einer Krankheit; sowie einer solchen Verbindung, die als Inhibitor in der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung verwendet wird, z.B. zur Behandlung einer Krankheit; und zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zu sammensetzung, die das Beimischen eines solchen Inhibitors zu einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Zutaten umfasst, verwendet werden.
Zusammenfassung der Beispiele
Die Erfindung wird in den Beispielen veranschaulicht, in denen die Erfindung wie folgt dargestellt wird:

Beispiel 1 zeigt die Herstellung von DNA, die für 2C9trunk, 2C9-F-G-Schleife, 2C9-F-G-Schleife-K206E und 2C9P220 kodiert.
Beispiel 2 zeigt die Expression von 2C9P220 und 2C9-F-G-Schleife in Bakterien sowie die Gewinnung von Protein.
Beispiel 3 zeigt Qualitätstests der Proteine aus Beispiel 2.
Beispiel 4 zeigt die Kristallisationsbedingungen, die verwendet wurden, um Kristalle aus der 2C9-F-G-Schleife zu erhalten.
Beispiel 5 zeigt die Kristallisationsbedingungen, die verwendet wurden, um Kristalle von 2C9P220 zu erhalten.
Beispiel 6 zeigt eine weitere Herstellung von 2C9-F-G-Schleife sowie die Massenspektrometrie- und Aktivitätsdaten des gewonnenen Proteins.
Beispiel 7 zeigt die Herstellung von Kristallen aus der 2C9-F-G-Schleife.
Beispiel 8 zeigt die Expression und die Gewinnung von 2C9-F-G-Schleife-K206E sowie die Massenspektrometrie- und Aktivitätsdaten des gewonnenen Proteins plus Kristallisation des Proteins.
Beispiel 9 zeigt die Kristallisation und Strukturanalyse von 2C9-F-G-Schleife-K206E bei einer Auflösung von 3 Å, wie in Tabelle 1 dargelegt.
Beispiel 10 zeigt eine weitere Kristallisation von 2C9-F-G-Schleife-K206E.
Beispiel 11 zeigt die Herstellung einer Struktur mit höherer Auflösung (2,6 Å) von 2C9-F-G-Schleife-K206E.
Beispiel 12 zeigt die Herstellung einer Struktur mit hoher Auflösung (3,1 Å) von 2C9-F-G-Schleife.
Beispiel 13 identifiziert Reste der P450-Bindungstasche und beschreibt deren Verwendung in der Durchführung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 14 beschreibt die Verwendung von Modellierungsverfahren unter Verwendung von Strukturen der Erfindung.
Beispiel 15 skizziert ein Anbindungs-Experiment.
Beispiel 16 zeigt die Verfeinerung der 2C9-F-G-Schleife-K206E-Struktur.
Beispiel 17 zeigt die Herstellung weiterer 2C9-Proteine.
Beispiel 18 zeigt die Herstellung von 2C9-Proteinen.
Beispiel 19 zeigt die Aktivität von 2C9-Proteinen der Erfindung.
Beispiel 20 zeigt die Kristallisation von 2C9-Proteinen.
Beispiel 21 beschreibt 2C9-2C19-Chimären.
Beispiel 22 zeigt die Herstellung von 2C9-2C19-Chimären.
Beispiel 23 zeigt die Validation der 2C9-FG-Schleife-K206E.
Beispiel 24 zeigt die Aktivität von 2C9-2C19-Chimären.
Beispiel 25 zeigt die Kristallisation von 2C9-2C19-Fusionsproteinen.
Beispiel 26 zeigt die Homologiemodellierung von 2C19.
Beispiel 27 zeigt die Homologiemodellierung von 2C18.
Beispiel 28 zeigt die Homologiemodellierung von 2C8.

Beispiel 1: Produktion von DNA, die für 2C9-Proteine kodiert
Zusammenfassung
Cytochrom-P450-2C9 sollte kristallisiert werden. Die Umwandlung dieses Membranproteins in eine wasserlöslichere Form durch das Entfernen der N-terminalen Transmembrandomäne wurde vor der Kristallisation durchgeführt.
Mehrere N-terminate Trunkierungen, die in der Literatur umfassend beschrieben sind, sind zur Produktion von N-trunkiertem Cytochrom-P450 (einschließlich 2E1, 2D6, 2B1 und andere) verwendet worden. Jedoch konnten die meisten dieser N-terminalen Trunkierungen keine vollständig löslichen Proteine produzieren, und in den meisten Fällen blieben die trunkierten P450s mit den Membranen assoziiert.
Die Membranankerdomäne MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKL (Seq.-ID-Nr. 113), die in 2C9 (Reste 2 bis 29) vorhanden ist, wurde durch ein kurzes hydrophiles Peptid MAKKTSSKGR (Seq.-ID-Nr. 114) ersetzt. Es ist herausgefunden worden, dass die Einführung eines hochgeladenen Polypeptids am N-Terminus dieses Proteins die Membranassoziation dieser Proteine stark verringert. Es ist auch festgestellt worden, dass die Natur des zweiten Codons in einem IacZ-Expressionssystem den Expressionsgrad beeinflusst (Looman et al., EMBO J. 6, 2489–24992 (1987)) und hier Alanin an Position 2 eine gute Expression in E. Coli bereitstellte.
Cytochrom-P450 tendiert stark dazu, große Aggregate auszuformen. Die N-terminate Deletion von Cytochrom-P450 hat Aggregation vermieden und die Polydispersität reduziert. Dies erleichtert wiederum die Kristallisation dieser Proteine.
Am C-Terminus von 2C9 wurde eine 4-Histidin-Markierung eingeführt, um die Reinigung in Puffern mit hohem Salzgehalt zu unterstützen.
Die vorläufigen Ergebnisse der Erfinder, unter den Bedingungen handelsüblicher Screening-Sets, zeigten, dass der apo- und native N-Terminus 2C9 trunkierte, 2C9trunk, und keine nützlichen Kristalle produzierte. Daher erfordert das Protein zur Förderung der Kristallisation und noch wichtiger zur Produktion nützlicher Kristalle weitere Modifikationen. Dementsprechend wurde die FG-Schleife des Proteins für die Modifikation in Betracht gezogen.
Das Design der Modifikation in der F-G-Schleife basierte auf den veröffentlichten Ergebnissen über die Kristallisation des Kaninchen-Cytochrom-P450, die zeigten, dass die F- und G-Helices in der Bildung eines Kristallkontaktes involviert waren. Die Erfinder gingen davon aus, dass die relative Position der F-G-Schleife im Protein 2C9trunk die Fähigkeit der F- und G-Helices beeinflussen kann, Kristallkontakte zu schaffen. Es wurde vorgeschlagen, dass die F-G-Schleife, die länger und mobiler ist als das in bakteriellem P450 BM3 zu findende Gegenstück, stabilisiert oder konformationell durch sechs Aminosäuresubstitiutionen geändert werden kann: Ile215Val, Cys216Tyr, Ser220Pro, Pro221Ala, Ile222Leu und Ile223Leu. Im resultierenden Konstrukt, der 2C9-F-G-Schleife, wird die Position von Prolin 220 um einen Rest bewegt. Der Prolinrest, von dem oft berichtet wird, dass er Veränderungen in der Sekundärstruktur einleitet, kann eine Konformationsänderung in der F-G-Schleife hervorrufen und die Bildung von Kristallkontakten erleichtern. In der Erzeugung des Proteins 2C9-P220 wird das Prolin von Position 221, wie am Beispiel des 2C9-Wildtyps zu sehen ist, auf Position 220 bewegt, wie am Beispiel des 2C19-Wildtyps zu sehen ist. Daher wurde das Serin 220 zu Prolin mutiert und Prolin 221 zu Threonin. Das Einleiten dieser beiden Veränderungen war alleine ausreichend, um die Kristallisation zu fördern. Eine einzige Mutation von S220P, die das Prolin an 221 beibehält, war ebenfalls ausreichend, um Kristallisation zu erreichen.
Bei der Erzeugung des Proteins 1424 wird das Prolin von Position 221, wie am Beispiel des 2C9-Wildtyps zu sehen ist, auf Position 222 bewegt. Das zeigt, dass das Prolin an beiden Seiten von 221 um eine Aminosäure bewegt werden kann, um eine erfolgreiche Kristallisation zu fördern.
Die Erfinder sind der Meinung, dass das Vorhandensein eines Prolins an 220 oder 222, bevorzugt eines Prolins 220, eine kritische Determinante für die Kristallisation von 2C9 ist. Insbesondere ist es eine kritische Determinante, um Apo-Kristalle von 2C9 zu erhalten. Es ist auch wichtig, um Kristalle von 2C9 mit Diffraktionsqualität zu erhalten. Der Rest 221 kann Alanin oder Threonin, aber auch Prolin oder Serin, sein.
Die Mutagenese von menschlichem 2C9-Cytochrom-P450 wurde mithilfe verschiedener Standard-DNA-Rekombinationsverfahren, einschließlich Kassettenmutagenese, ortsgerichteter Mutagenese oder spezifischer Klonierungsprotokolle, durchgeführt. Für die Kassettenmutagenese wurden komplementäre Oligonucleotide, die Mutationen trugen, unter Einsatz natürlicher Restriktionsstellen oder Stellen, die durch PCR-Mutagenese in die P450-cDNA eingeführt wurden, anelliert und kloniert. Die Konstrukte wurden mittels Restriktionsanalyse gefolgt von vollständigem Sequenzieren verifiziert. Andere Verfahren sind hierin beschrieben oder Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
N-Terminale Trunkierung von P450
Der Expressionsvektor pCWOri+, bereitgestellt von Prof. F. W Dahlquist, Universität von Oregon, Eugene, Oregon, USA, wurde dazu verwendet, trunkiertes menschliches Cytochrom-P450 im E.-coli-Stamm CL1-Blue (Stratagene) zu exprimieren. cDNA voller Länge, die für Cytochrom-P450-2C9 kodiert, wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation, die gentechnische Herstellung der 5'-Terminusdeletion, die Einführung stummer Restriktionsstellen und die Einführung einer 4-Histidin-Markierung am C-Terminus verwendet.
Eine NotI-Restriktionsstelle (unterstrichen) wurde in 2C9 an Position 87 mittels PCR-Amplifikation unter Einsatz des folgenden 5'-Oligonucleotids eingeführt:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTGATTGGAAATATC-3'
(Seq.-ID-Nr. 115)
Die 3'-Oligonucleotide:
5'-TGCGGTCGACTCAGTGGTGGTGGTGGACAGGAATGAAGCAGAGCTGGTAG-3'
(Seq.-ID-Nr. 116) mit einer SalI-Klonierungsstelle (unterstrichen) und der 4-Histidinmarkierung (kursiv) wurden verwendet. Einer Gesamtzahl von 30 Zyklen bei 94 °C 1 min, bei 52 °C 1 min, bei 72 °C 2 min folgte eine Extension von 10 min bei 72 °C. Das 1420-bp-PCR-Fragment wurde doppelt mit NotI/SalI verdaut und mittels Gelagarose-Elution und -Extraktion gereinigt.
Die komplementären Oligonucleotide
5'-TATGGCTAAGAAAACGAGCTCTAAAGGGC-3' (Seq.-ID-Nr. 117) und
5'-GGCCGCCCTTTAGAGCTCGTTTTCTTAGCCA-3' (Seq.-ID-Nr. 118)
wurden mit den NdeI- und NotI-Überhangrestriktionsstellen (unterstrichen) geschaffen, um die Reste 2–29 des nativen N-Terminus vom menschlichen Cytochrom-P450-2C9 durch das kurze AKKTSSKGR-Polypeptid zu ersetzen. Die Oligonucleotide wurden durch Mischung von 10 μg jedes Oligonucleotids in 100 μl Wasser anelliert, 5 min lang auf 100 °C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
Das 1420-bp-PCR-Fragment wurde mit dem doppelsträngigen Oligonucleotid gemischt und in den Vektor pC-Wori+ ligiert, der zuvor mit NdeI und SalI verdaut wurde. Eine Aliquote des Ligationsprodukts wurde verwendet, um den E.-coli-XL1-Blue-Stamm zu transformieren und dadurch das Plasmid pCW-2C9trunk zu ergeben, das für das aminoterminale trunkierte 2C9 kodiert.
Das trunkierte 2C9 wurde verwendet, um die Proteine für weitere Kristallisationsversuche herzustellen.
Schaffung einer 2C9-FG-Schleife
Das Plasmid pCW-2C9trunk wurde als Matrize zur Einführung von sechs Aminosäuresubstitutionen, Ile215Val, Cys216Tyr, Ser220Pro, Pro221Ala, Ile222Leu, Ile223Leu, in die FG-Schleife verwendet. pCW-2C9trunk wurde durch NdeI- und BamHI-Restriktionsenzym verdaut, und das 579-bp, das dem 5'-Terminus des P450-Gens entspricht, wurde mittels Gelagarose-Extraktion und -Elution gereinigt. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das geschaffen wurde, um die 6 Aminosäuresubstitution in die FG-Schleife einzuführen, wurde durch Annealing der folgenden komplementären Oligonucleotide 5'-GATCCAGGTCTACAATAATTTCCCTGCTCTCCTTGATTATTTC-3' (Seq.-ID-Nr. 119) und
5'-CCGGGAAATAATCAAGGAGAGCAGGGAAATTATTGTAGACCTG-3',
(Seq.-ID-Nr. 120) mit den Überhang-BamHI- und -XmaI-Restriktionsstellen (unterstrichen) und den sechs mutierten Codons (kursiv) erzeugt. Das 579-bp-Fragment und das doppelsträngige Oligonucleotid wurden in den Vektor pCW-2C9trunk ligiert, der zuvor mittels NdeI und XmaI verdaut worden war. Eine Aliquote der Ligation wurde dazu verwendet, XI1-Blue-E.-coli zu transformieren, und ergab das Plasmid pCW-2C9-FG-Schleife.
Konstruktion von 2C9-P220
2C9-P220 ist ein 2C9trunk-Mutant, der die Mutationen S220P und P221T trägt. Dieser Mutant wurde unter Einsatz eines Quikchange^TM-Mutagenesesets (Katalognummer 200518) von Strategene gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Das Quikchange^TM-Mutageneseverfahren erzeugt ein mutiertes Plasmid mit versetzten Nicks und verwendet Dpnl-Verdau, um die gesamte Eltern-DNA zu entfernen. Die Reaktionen wurden unter Einsatz von 5,0 μl × 10 Reaktionspuffer, 5–50 ng pCW-2C9trunk-Plasmid-DNA und 125 ng Oligonucleotidprimeren wie folgt mit mutierten Basen, in Kleinbuchstaben, und den zwei Aminosäureveränderungen, unterstrichen, durchgeführt.
5'CCAGATCTGCAATAATTTTcCgaCcACATTGATTACTTCCC3' (Seq.-ID-Nr. 121)
5'GGGAAGTAATCAATGATgGtcGgAAAATTATTGCAGATCTGG3' (Seq.-ID-Nr. 122)
Die Reaktionen wurden mit sterilem Wasser auf 50 μl aufgefüllt, danach wurden 2,5 U Pfu Turbo hinzugefügt und die Reaktion mit 30 μl Mineralöl überschichtet. Wie folgt wurde dann Thermocycling durchgeführt: 95 °C, 30 s (1 Zyklus), 95 °C, 30 s, 55 °C, 1min, 68 °C, 13,5 min (18 Zyklen) und letztendlich eine Halteperiode bei 4 °C. Es wurde eine Kontrollreaktion mit Wasser anstelle von Oligonucleotidprimern durchgeführt.
Nach dem Thermocycling wurden zu jeder Reaktion 10 U Dpnl unter dem Spiegel des Mineralöls hinzugefügt. Die Reaktionen wurden dann vorsichtig gemischt, gefolgt von Zentrifugation in einer Labormikrozentrifuge, 1 min lang bei 13.000 U/min, und bei 37 °C 3 Stunden lang inkubiert. Das verdaute Produkt (1 μl) wurde dann verwendet, um 50 μl der kompetenten E.-coli-XL1-Blue-Zellen zu transformieren. Die gesamte Transformation wurde dann auf Luria-Agar-Platten ausplattiert, die 100 μg/ml Carbenicillin enthielten, umgedreht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien wurden isoliert und die Plasmid-DNA pCW-2C9-P220 isoliert und sequenziert, um die Insertion der korrekten Mutation zu überprüfen.
Konstruktion von 2C9-FG-Schleife-K206E
Das Plasmid pCW-2C9-FG-Schleife wurde als Matrize für die Substitution Lys206Glu verwendet (worin die Nummerierung die des Wildtyp-2C9 voller Länge ist, SwissProt: P11712, nicht jene von Seq.-ID-Nr. 2 oder 4). Die Primer wurden so kreiert, dass sie über die zu mutierende Region liegen:
5'-GGAAAAGTTGAATGAAAACATCGAGATTTTGAGCAGCCCCTGG-3'
(Seq.-ID-Nr. 123)
5'-CCAGGGGCTGCTCAAAATCTCGATGTTTTCATTCAACTTTTCC-3'
(Seq.-ID-Nr. 124), worin das mutierte Codon fett dargestellt ist. Diese Primer wurden dann im kurz zusammengefassten Protokoll zur Quikchange^TM-Mutagenese (Strategene) verwendet.
Die Primer wurden auf 125 ng/μl resuspendiert und in einer PCR-Reaktion verwendet, die vom mutagenen Pimer um das Plasmid verlängert. Die Matrizen-DNA wurde dann unter Einsatz von Dpnl, einer spezifischen Methylierungsrestriktionsendonuclease, verdaut, welche die Matrize aufgrund ihrer Methylierung bevorzugt abbaut. Nach der Dpnl-Behandlung wurde 1 μl der resultierenden Probe in einen E.-coli-CL1-Blue-Stamm transformiert. Die Kolonien wurden gesammelt und sequenziert. Es wurden Plasmide gewählt, welche die Mutation enthielten, und mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und SalI verdaut. Das NdeI-SalI-DNA-Fragment, das der kodierenden Sequenz des 2C9-FG-Schleife-K206E-Mutanten entspricht, wurde dann in einen pCW-Vektor subkloniert, der mit NdeI und SalI verdaut worden war. Dies diente dazu, beliebige Fehler, die in der PCR-Phase der Quickchange-Mutagenese eingeführt wurden, zu entfernen.
Beispiel 2: Expression von 2C9P220 und der 2C9-FG-Schleife
Bakterienexpression
Bei 37 °C wurde in einem Terrific-Broth-Medium unter Schütteln eine einzige ampicillinresistente Kolonie von XL1-Blue-Zellen nahezu bis zur Sättigung gezüchtet und dann dazu verwendet, frisches TB-Medium zu inokulieren. Die Bakterien wurden in 1 Liter TB-Nährmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37 °C bei 185 U/min in einem 2-Liter-Kolben bis zu OD600nm = 0,4 gezüchtet. Der Häm-Vorläufer Delta-Aminolävulinsäure (80 mg/l) wurde 30 min vor der Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid (IPTG) hinzugefügt und die Temperatur auf 30 °C gesenkt. Die Bakterienkultur wurde unter Rühren bei 30 °C 48 bis 72 Stunden lang fortgesetzt.
(a) Proteinreinigung
Die Zellen wurden bei 10000g 10 min lang pelletiert und in einem Puffer, der 500 mM KPi bei einem pH von 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% des Proteaseinhibitorcocktails (Calbiochem), 10 mM Imidazol, 0,01 mg/ml DNase 1 und 5 mM MgSO₄ enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden lysiert, indem sie zweimal durch einen Constant-Systems-Zellhomogenisator bei 12000 psi passagiert wurden. Die Zelltrümmer wurden dann mittels 30-minütiger Zentrifugation bei 70000 g bei 4 °C lang entfernt.
Das Detergens IGEPAL CA630 (Sigma) wurde zu dem Lysat in einer Endkonzentration von 0,3 Vol.-% aus einer 10-%-Stammlösung zugetropft, und das Lysat wurde mit dem zuvor gewaschenen NiNTA-Harz (Qiagen) über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Das proteingebundene NiNTA-Harz wurde mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000 g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde mit 20 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, einer 1:1000-Verdünnung des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000 × g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde dann mit 10 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 % IGEPAL CA 630 gewaschen und das Harz mittels Zentrifugation wie oben beschrieben wiedergewonnen. Der Waschschritt wurde wie zuvor beschrieben mit einem Puffer wiederholt, der 50 mM Imidazol enthielt. Das Harz wurde bei 4 °C in eine Säule gepackt, und Cytochrom-P450 eluierte mit 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 300 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630.
(b) Ein alternatives Verfahren zur Proteinreinigung ist wie folgt:
Die Zellen wurden bei 10000g 10 Minuten lang pelletiert und in einem Puffer, der 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitorcocktail (Calbiochem), 0,01 mg/ml DNase 1 und 5 mM MgSO₄ enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden lysiert, indem sie zweimal durch einen Constant-Systems-Zellhomogenisator bei 12000 psi passagiert wurden. Die Zelltrümmer wurden dann mittels 30-minütiger Zentrifugation bei 70000 g bei 4 °C entfernt.
Das Detergens IGEPAL CA630 (Sigma) wurde zu dem Lysat in einer Endkonzentration von 0,3 Vol.-% aus einer 10-%-Stammlösung zugetropft und das Lysat mit dem zuvor gewaschenen NiNTA-Harz (Qiagen) über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Das NiNTA-Harz wurde mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000 g bei 4 °C pelletiert und wie oben beschrieben mit 20 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 50 mM Glycin, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 % IGEPAL CA630 gewaschen, gefolgt von Waschung mit 10 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 7,5 mM Histidin, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 % IGEPAL CA630. Das Harz wurde mittels Zentrifugation zwischen den Waschschritten wiedergewonnen, und dann wurde das Harz bei 4 °C in eine Säule gepackt. Das Protein wurde mit 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 100 mM Histidin, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitorcocktail, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630 eluiert.
Cytochrom-P450, das mithilfe eines der Elutionsprotokolle von der NiNTA-Säule erhalten wurde, wurde unter Einsatz einer HiPrep-26/10-Entsalzungssäule (Pharmacia) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min und durch die Sammlung von 16-ml-Fraktionen rasch (<10 min) in 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 0,2 mM DTT, 1 mM EDTA entsalzt. Entsalztes Cytochrom-P450 wurde direkt auf eine CM-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 0,2 mM DTT, 1 mM EDTA äquilibriert worden waren. Es wurde die folgende stufenweise Elution angewendet: Waschung mit 10 Säulenvolumina von 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 0,2 mM DTT, 1 mM EDTA, Waschung mit dem obigen Puffer mit 75 mM KCl, um jede beliebige Spur eines Detergens zu entfernen, dann Elution mit dem obigen Puffer mit einer KCl-Konzentration, die auf 500 mM erhöht wurde. Das Protein wurde unter Einsatz eines Mikrokonzentrators für Kristallisationstests auf bis zu 40 mg/ml konzentriert.
In diesem Stadium kann das Protein gegebenenfalls weiter gereinigt werden, indem eine Gelfiltrationssäule betrieben wird. Die konzentrierte P450-Probe wurde auf eine Superose-6-HR10/30-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) aufgetragen und bei 0,2 ml/min mit einem Puffer eluiert, der 100 mM KPi, pH 7,4, 300 mM KCl, 20 % Glycerin, 0,2 mM DTT enthielt. Das Protein wurde gesammelt und für die Kristallisation und Qualitätstests wie oben beschrieben auf 40 mg/ml konzentriert.
Beispiel 3: Qualitätstests
Die Qualität der Endformulierung der Proteine aus Beispiel 2 wurde folgendermaßen beurteilt:
(a) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Diese wurde unter Einsatz handelsüblicher Gele (Nugen) gefolgt von CBB- (Coomassie-Brillantblau-) Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Reinheit, die durch das Scannen eines digitalen Bilds eines Gels beurteilt wurde, wurde auf zumindest 95 % geschätzt.
(b) Gelfiltrationschromatographie
Diese wurde unter Einsatz einer Superose-6-HR10-30-Säule (Pharmacia) durchgeführt, um den Aggregationszustand zu beurteilen. Der Fraktionierungsbereich für diese Säule ist 5 × 10³ bis 5 × 10⁶ Da und ist daher an die Auflösung großer Komplexe angepasst. Die Säule wurde bei 0,2 ml/min mit einem Puffer eluiert, der 100 mM KPi, pH 7,4, 300 mM KCl, 20 % Glycerin, 0,2 mM DTT, 1 mM EDTA enthielt. 0,2-ml-Proteinproben mit einer Konzentration von etwa 40 mg/ml wurden verwendet. Es wurde die Absorption bei 280 nm überwacht, und die Peakfraktion wurde gesammelt und unter Einsatz dynamischer Lichtstreuung analysiert.
(c) Lichtstreuung
Proben (0,15 ml), die nach der CM-Sepharosesäule und/oder Gelfiltrationssäule gezogen wurden, wurden mittels DLS in Fluorimeter-Quarzzellen bei 90 °C unter Einsatz von Laserbestrahlung bei 830,3 nm analysiert. Die Daten wurden unter Einsatz eines Log-Korrelators mit unterschiedlicher Ausdehnung, der einen umfassenden dynamischen Bereich abdeckte, gesammelt. Alle Messungen wurden bei 20 °C mit Proben durchgeführt, die sofort von der Gelfiltrationssäule entnommen wurden. Ein Durchlauf umfasste durchschnittlich 10 Durchläufe à 10 s. Um eine Schätzung des Molekulargewichts zu erhalten, verwendeten die Erfinder ein Reibungsverhältnis von 1,26 und ein spezifisches Teilvolumen von 0,726.
Proben, die unter Einsatz des neuen Reinigungsverfahrens der Erfinder hergestellt wurden, besaßen gute Löslichkeit und es fehlte signifikante Aggregation, wie durch Nachstehendes angezeigt wird:

– das Verhältnis der Fernkanalextrapolation und der gemessenen durchschnittlichen Streuung betrug immer zwischen 0,999 und 1,003.
– die durchschnittliche Zählgeschwindigkeit variierte nicht signifikant, mit etwa 1 % Standardabweichung
– Analyse der Autokorrelationsfunktion unter Einsatz der bi-exponentiellem Anpassung, die zeigte, dass 2C9 ein geschätztes Mr von etwa 180 KDa hatte, d.h. es ist ein Oligomer, das aus nicht mehr als 4 Untereinheiten besteht
– gute Stabilität der Proben bei 20 °C (über 24 h)

Proben, die unter Einsatz veröffentlichter Protokolle hergestellt wurden, wiesen Anzeichen für schwere Aggregation auf:

– große Fluktuationen der Intensität des gestreuten Lichts mit einer Standardabweichung von mehr als 10
– die Analyse der Autokorrelationsfunktion zeigte einen sehr geringen exponentiellen Zerfall, ein Anzeichen für die Gegenwart großer Aggregate (Mr < 10⁶ Da), zusammengesetzt aus einer großen Zahl von P450-Untereinhieten. Diese Proben zeigen auch einen hohen Grad an Polydispersität.
– Die Proben zeigten auch weitere Aggregation als Funktion der Zeit
Diese Anzeichen für schwere Aggregation in Proben, die mithilfe veröffentlichter Verfahren hergestellt wurden, waren nach der Probenfiltration durch Poren mit einem Durchmesser von 20 nm oder 30-minütige Zentrifugation bei 200.000 g gegenwärtig.

(d) Massenspektroskopie
Die Massenspektroskopie wurde auf einem Quadrupol-Massenspektrometer (Platform II, Micromass UK Ltd.) durchgeführt. Die Proben (25 μl des gereinigten Proteins bei 25–60 mg/ml) wurde gegen 0,1 M Ammoniumacetat bei 4 °C 4 Stunden lang unter Einsatz eines Mikrozellendialysators (Pierce) dialysiert. Die Proben wurden um einen Faktor 100 in 1:1 Vol.-% Methanol: 0,1 % wässriger Ameisensäure verdünnt und dann mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 20 μl/min in die Ionisierungsquelle des Massenspektrometers infundiert.
Der Massenspektrometer wurde mit einer Standard-Elektrospray-Ionisierungsquelle ausgestattet. Die positive Elektrosprayionisierung wurde mit einer Sondenspitzenspannung von 3,5 kV und einer Gegenelektrodenspannung von 0,5 kV durchgeführt. Stickstoff wurde sowohl als Vernebelungs- als auch als Trocknungsgas mit einer Durchflussgeschwindigkeit des Vernebelungsgases von 20 l/h und einer Durchflussgeschwindigkeit des Trocknungsgases von 200 l/h verwendet. Die Spannung des Probenkegels wurde auf 40 V gehalten. Die Daten wurden über den geeigneten m/z-Bereich erworben und infolge wo es möglich war mittels manueller Identifikation der Komponenten verarbeitet, gefolgt von einer Transposition auf die Skala der wahren Molekularmasse zur leichteren Identifikation unter Einsatz von Verarbeitungsverfahren der maximalen Entropie. Die Genauigkeit der Masse, die für das analysierte Protein erhalten wurde, betrug 0,01 % der Masse.
(e) Funktionalitätstests
In einem 96-Well-Platten-Testformat wurden mit einem Fluoroscan-Ascent-FL-Instrument (Labsystem) unter Einsatz von Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin als Fluoreszenzsubstrat Aktivitättests auf P450-2C9 durchgeführt.
Fünfzehn pmol von P450 wurden mit 0,1 Einheiten gereinigter menschlicher Oxidoreductase in Gegenwart von 140 μM des Substrats Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin, einem NADPH-regenierenden System, das 0,15 mM NADP⁺, 0,38 mM Glucose-6-Phosphat und 2,9 Einheiten/ml Glucose-6-Phosphatdehydrogenase in 170 μl Endvolumen von 25 mM KPi, pH 7,4, 0,38 mM MgCl₂ umfasst, rekonstituiert. Bei 37 °C wurden mehrere Minuten lang Inkubationen durchgeführt, und 7-Hydroxy-4-(trifluormethyl)cumarin wurde als Metabolitstandard zur Bestimmung der Metabolismusgeschwindigkeit verwendet. Die eingesetzten Anregungs- und Emissionswellenlängen waren 409 beziehungsweise 530 nm.
Beispiel 4: Kristallisationsbedingungen für die 2C9-FG-Schleife
Die Kristallisation der P450-2C9-FG-Schleife wurde bei 10–60 mg/ml Protein in 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4; 0,5 M KCl, 0,2 mM DTT, 1,0 mM EDTA, 20 % Glycerin unter den unten angeführten Bedingungen vollzogen. Die Kristalle wuchsen über einen zweiwöchigen Zeitraum in den angegebenen Morphologien.
Aussehen: nadel- und stabförmig
Zelldimensionen: a=161 Å, b=161 Å, c=110 Å, α=90°, β=90°; γ=120°
Raumgruppe: P321
0,2 M Natriumfluorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumfluorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumfluorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Lithiumchlorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Magnesiumchlorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumchlorid, 20 % PEG 3350
2,0 M Natriumchlorid, 10 % PEG 6K
0,2 M Calciumchlorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumchlorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumchlorid, 20 % PEG 3350
0,2 M Lithiumnitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Magnesiumnitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumnitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumnitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumnitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Magnesiumformiat, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumformiat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumformiat, 20 % PEG 3350
0,2 M Amminiumformiat, 20 % PEG 3350
0,2 M Lithiumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Magnesiumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumacetat, pH 4,6, 10–20 % PEG 4000
0,2 M Calciumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumacetat, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumacetat, pH 4,6, 10–20 % PEG 4000
0,2 M Natriumsulfat, 20 % PEG 3350
0,2 M Magnesiumsulfat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumsulfat, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumsulfat, 20 % PEG 3350
0,2 M Dinatriumtartrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumnatriumtartrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Diammoniumtartrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Natriumdihydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Kaliumdihydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Dikaliumhydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumdihydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Diammoniumhydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trilithiumcitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trinatriumcitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trikaliumcitrat, 20 % PEG 3350
15 % PEG 1500
30 % PEG 1500
0,1 M MES pH 6,0, 5–20 % PEG 6000
0,1 M MES pH 6,5, 12 % PEG 20.000
0,1 M Zitronensäure pH 5,0, 10 % PEG 6000
0,1 M Natriumcacodylat, pH 6,6, 10–25 % PEG 1500
0,1 M Natriumcacodylat, pH 6,4–6,8, 0,05–0,2 M Magnesiumacetat, 10–20 % PEG 8000
0,05–0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat, 10–20 % PEG 8000
0,2 M Kaliumdihydrogenphosphat, 20 % PEG 3000
0–0,2 M Natriumchlorid, 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat pH 5,8–6,6, 5–20 % PEG 8000
0–0,2 M Natriumchlorid, 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat pH 5,8–6,6, 20 % PEG 1000
0–0,2 M Natriumchlorid, 0,1 M Kaliumdihdrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat pH 5,8–6,6, 20 % PEG 3350
0–0,2 M Natriumchlorid, 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat/Dinatriumhydrogenphosphat pH 5,8–6,6, 15–20 % PEG 5000MME
0,5 M Ammoniumsulfat, 0,1 M HEPES pH 7,5, 30 % 2-Methyl-2,4-pentandiol
0,01 M Nickel(II)-chlorid, 0,1 M Tris pH 8,5, 20 % PEG MME 2000
0,05–0,2 M Calciumacetat, 0,1 M Tris HCl pH 7,0–7,6, 10–22,5 % PEG 3000
0,1 M Phosphatcitrat, pH 4,2, 0,05 M Lithiumsulfat, 20 % PEG 1000
0,025–0,25 M Dikaliumhydrogenphosphat, pH 7,0–7,8
0,2 M Dikaliumhydrogenphosphat, pH 8,4, 17,5 % PEG 3350
0,2 M Ammoniumiodid, 20 % PEG 3350
0,2 M Diammoniumhydrogencitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Lithiumsulfat, 20 % PEG 3350
0,05–0,2 M K2HPO4, 10 % PEG 4000
0,05–0,2 M K2HPO4, 6,25 %–20 % PEG 3350
0,2 M K2HPO4, 3,75 %–25 % PEG 3350
0,2–0,35 M K2HPO4, 20 % PEG 3350
0,1–0,15 M K2HPO4, 10 % MPEG 2000
0,2 M K2HPO4, 3,75 %–10 % MPEG 2000
0,5 M K2HPO4, 10 % MPEG 2000
0,1–0,15 M K2HPO4, 10 % PEG 1000
0,2 M K2HPO4, 3,75 %–10 % PEG 1000
0,5 M K2HPO4, 10 % PEG 1000
0,1 M Citrat-HCl pH 5,6, 20 % PEG 3000
0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 20 % MPEG 2000
0,1 M HEPES pH 7,5, 0,2 M Natriumchlorid, 20 % PEG 3000
0,1 M Imidazol-HCl H 8,0, 0,2 M Calciumacetat, 10 % PEG 8000
0,1 M Imdiazol-HCl pH 8,0, 10 % Isopropanol
0,1 M Imidazol-HCl pH 6,5, 0,5 M Natriumacetat
0,1 M Natriumcacodylat pH 6,6, 20 % PEG 3350
0,1 M Citrat-HCl pH 5,6, 10 % PEG 4000, 10 % Isopropanol
0,1 M Tris-HCl pH 7,0–7,6, 0,1–0,2 M Calciumacetat, 15–20 % PEG 3000
0,1 M Phosphat-Citrat pH 4,2, 0,2 M Lithiumsulfat, 10 % 2-Propanol
0,1 M Citrat pH 5,5, 0,2 M Lithiumsulfat, 15 % Ethanol
0,1 M HEPES pH 7,5, 0,2 M Magnesiumchlorid, 15 % Ethanol
20 % PEG 300, 10 % Glycerin, 0,1 M Tris pH 8,5, 5 % PEG 8000
Beispiel 5: Kristallisationsbedingungen für 2C9P220
Kristallisation von P450-2C9P220 wurde bei 10–60 mg/ml Protein in 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,5 M KCl, 0,2 mM DTT; 1,0 mM EDTA, 20 % Glycerin unter den unten angeführten Bedingungen erreicht. Die Kristalle wuchsen über einen Zeitraum von zwei Wochen in den angegebenen Morphologien.
Aussehen: sphärische Cluster
0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 0,2 M Natriumacetat, 15 % PEG 4000
0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 4 % PEG 8000
0,1 M Trinatriumcitratdihydrat pH 5,6, 10 % Isopropanol PEG 4000
0,1 M HEPES pH 7,5, 0,2 M Natriumchlorid, 20 % PEG 3000
0,1 M Na/K-Phosphat pH 6,2, 10 % PEG 3000
0,1 M Tris pH 7,0, 0,2 M Calciumacetat, 20 % PEG 3000
0,1 M Tris pH 8,5, 20 % PEG 1000
0,1 M HEPES pH 7,5, 0,1 M Natriumchlorid, 30 %, PEG 400
0,2 M Dinatriumtartrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Dikaliumhydrogenphosphat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trilithiumcitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trinatriumcitrat, 20 % PEG 3350
0,2 M Trikaliumcitrat, 20 % PEG 3350
0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,2 M Calciumacetat, 20 % PEG 3000
0,2 M K2HPO4, 15 % PEG 3350
0,2 M K2HPO4, 15 % PEG 3350
0,1 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,2 M Calciumacetat, 20 % PEG 3000
0,1 M Tris-HCl pH 7,2, 0,2 M Calciumacetat, 15 % PEG 3000
0,2 M K2HPO4, 17,5 % PEG 3350
0,2 M K2HPO4, 20 % PEG 3350
0,3 M K2HPO4, 20 % PEG 3350
0,2 M K2HPO4, 2,5 % PEG 3350
0,2 M K2HPO4, 25 % PEG 3350
0,1 M Tris-HCl pH 7,6, 0,2 M Calciumacetat, 20 % PEG 3000
0,1 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 M Calciumacetat, 15 % PEG 3000
0,1 M Trinatriumcitratdihydrat pH 5,0, 5 % PEG 4000
0,1 M HEPES 7,0, 5 % PEG 4000
0,1 M Tris pH 8,0, 5 %–15 % PEG 4000
0,1 M Bis-Tris-Propan pH 9,0, 5 %–10 % PEG 4000
Beispiel 6: Weitere Produktion der 2C9-FG-Schleife
Die 2C9-FG-Schleife wurde in einem Bakterienexpressionssystem hergestellt und aus diesem wie oben in Beispiel 2(a) beschrieben gewonnen und einer weiteren Analyse durch Massenspektroskopie und Aktivitätstest unterworfen.
Massenspektroskopie
Unter Einsatz eines „BioTOF"-Elektrospray-Flugzeitinstruments von Bruker wurde Massenspektroskopie durchgeführt. Die Proben wurden entweder um Faktor 1000 gleich vom Speicherpuffer in Methanol/Wasser/Ameisensäure (50:48:2 (Vol.)) verdünnt oder einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung unter Einsatz einer C4-Säule unterworfen. Die Kalibrierung wurde unter Einsatz von Bombesin und Angiotensin-1 mithilfe des 2+- und 1+-Ladungszustands erreicht. Die Daten wurden in einem Bereich zwischen 200 und 2000 m/z erfasst und infolge unter Einsatz eines Bruker-X-Mass-Programms verarbeitet. Die Massengenauigkeit betrug typischerweise unter 1 in 10000.

Massendaten der 2C9-FG-Schleife: 53963,72 Da (vorhergesagt) 53967 Da (beobachtet)
Funktionalitätstests
In einem 96-Well-Platten-Testformat wurden mit einem Fluoroscan-Ascent-FL-Instrument (Labsystem) unter Einsatz von Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin als Fluoreszenzsubstrat Aktivitätstest auf P450-2C9 durchgeführt.
Fünfzehn pmol von P450 wurden mit 0,1 Einheiten gereinigter menschlicher Oxidoreductase in Gegenwart von 140 μM des Substrats Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin, einem NADPH-regenerierenden System, das 0,15 mM NADP⁺, 0,38 mM Glucose-6-Phosphat und 2,9 Einheiten/ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase in 170 μl Endvolumen von 25 mM KPi, pH 7,4, 0,38 mM MgCl₂ umfasst, rekonstituiert. Bei 37 °C wurden mehrere Minuten lang Inkubationen durchgeführt, und 7-Hydroxy-4-(trifluormethyl)cumarin wurde als Metabolitstandard zur Bestimmung der Metabolismusgeschwindigkeit eingesetzt. Die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 409 beziehungsweise 530 nm. Die Aktivität der 2C9-FG-Schleife betrug 0,110 pmol/min/pmol P 450 mit 2C9-Substrat.
Beispiel 7: Kristalle der 2C9-FG-Schleife
Die Kristalle der 2C9-FG-Schleife wurden unter Einsatz des Dampfdiffusionsverfahrens des hängenden Trapfens gezüchtet. Das Protein aus Beispiel 6 mit 40 mg/ml in 10 mM KPi pH 7,4, 0,5 M KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin wurde in einem Verhältnis von 1:1 unter Einsatz von 0,5-μl-Tropfen mit einer Reservoirlösung gemischt. Die Kristalle von 2C9-FG-Schleifen wuchsen über einer Reservoirlösung, die 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8; 15 % PEG 400; 5 % PEG 8000; 10 % Glycerin enthält. Die Kristalle bildeten sich innerhalb von 1–7 Tagen bei 25 °C und wiesen Morphologien hexagonaler Nadeln und Stäbe auf. In einem ersten Versuch zeigte sich, dass ein erster Kristall („1") Zelldimensionen von etwa 161 Å, 161 Å, 110 Å, 90°, 90°, 120° hat. In einem zweiten Versuch stellte sich heraus, dass ein zweiter Kristall („ 2") Zelldimensionen von etwa 164 Å, 164 Å, 111 Å, 90°, 90°, 120° hatte. Dies zeigt einen typischen Variationsbereich innerhalb der oben genannten 5 % Variabilität.
Die Kristalle wurden unter Einsatz einer 80 % Reservoirlösung, 10 % PEG 400 und 10 % Glycerin als Gefrierschutzmittel in flüssigem Stickstoff schnellgefroren.
Die Daten wurden aus einem 2C9-FG-Schleifenkristall bis zu einer Auflösung von 3,3 Å bei einer Strahlenlinie ID 14,1 (Wellenlänge 0,933 Å) bei der European Synchrotron Radiation Source unter Verwendung eines Quantum-4-CCD-Detektors aus einem einzigen Kristall bei 100 K gewonnen. Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P321. Es wurde festgestellt, dass Kristall 1 Zelldimensionen von 161,35 Å, 161,35 Å 110,75 Å, 90°, 90°, 120° aufwies, im Fall von Kristall 2 die Dimensionen 163,95 Å, 163,95 Å, 111,06 Å, 90°, 90°, 120° betrugen und die Daten für den Kristall zu 3,0 Å gewonnen wurden.
Die Koordinaten aus Tabelle 1 oder 2 können verwendet werden, um die Struktur der ZC9-FG-Schleife durch molekularen Ersatz zu lösen.
Beispiel 8: Kristallisation und Strukturanalyse der 2C9-FG-Schleife-K206E
E. coli, die mit dem obigen 2C9-FG-Schleife-K206E-Vektor transformiert wurden, wurden gezüchtet und in Beispiel 2 beschrieben.
Proteinreinigung
Die Zellen wurden bei 10000 g 10 Minuten lang pelletiert und in einem Puffer, der 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% des Proteaseinhibitorcocktails (Calbiochem), 10 mM Imidazol, 40 U/ml DNase 1 und 5 mM MgSO₄ enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden lysiert, indem sie bei 12000 psi zweimal durch einen Constant-Systems-Zellhomogenisator passagiert wurden. Die Zelltrümmer wurden dann mittels 30-minütiger Zentrifugation bei 70000 g bei 4 °C entfernt.
Das Detergens IGEPAL CA630 (Sigma) wurde zu dem Lysat zu einer Endkonzentration von 0,3 Vol.-% aus einer 10-%-Stammlösung zugetropft, und das Lysat wurde mit dem zuvor gewaschenen NiNTA-Harz (Qiagen) über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Das proteingebundene NiNTA-Harz wurde mittels 2-minütige Zentrifugation bei 2000 g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde mit 20 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, einer 1:1000-Verdünnung des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000 × g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde dann mit 10 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels Zentrifugation wie oben beschrieben wiedergewonnen.
Das Harz wurde bei 4 °C in eine Säule gepackt, und das Cytochrom-P450 eluierte mit 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 300 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitorcocktail, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630.
Das Cytochrom-P450, das mithilfe eines der beiden Elutionsprotokolle von der NiN-TA-Säule erhalten wurde, wurde in 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA unter Einsatz einer HiPrep-26/10-Entsalzungssäule (Pharmacia) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min und bei einer Entnahme von 17-ml-Fraktionen entsalzt.
Das entsalzte Cytochrom-P450 wurde direkt auf eine CM-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA äquilibriert worden war. Die folgende stufenweise Elution wurde verwendet: Waschung mit 10 Säulenvolumina von 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA, Waschung mit dem obigen Puffer mit 75 mM KCl, um jede beliebige Spur des Detergens zu entfernen, danach Elution mit dem obigen Puffer mit einer auf 500 mM gesteigerten KCl-Konzentration.
Das Protein wurde unter Einsatz eines Mikrokonzentrators für Kristallisationstests auf bis zu 40 mg/ml konzentriert. Um das Protein zu charakterisieren, wurde die Qualität der Endformulierung folgendermaßen beurteilt:
(a) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Diese wurde unter Einsatz handelsüblicher Gele (Nugen) gefolgt von CBB-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Die Reinheit, die über das Scannen eines digitalen Bilds eines Gels beurteilt wurde, wurde auf zumindest 95 % geschätzt.
(b) Massenspektroskopie
Die Massenspektroskopie wurde unter Einsatz eines „BioTOF"-Elektrospray-Flugzeitinstruments von Bruker durchgeführt. Die Proben wurden entweder um einen Faktor 1000 gleich vom Speicherpuffer weg in Methanol/Wasser/Ameisensäure (50:48:2 (Vol.)) verdünnt oder einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung unter Verwendung einer C4-Säule unterworfen. Die Kalibration wurde unter Einsatz von Bombesin und Angiotensin I unter Verwendung des 2+- und 1+-Ladungszustandes erreicht. Die Daten wurden in einem Bereich zwischen 2000 und 2000 m/z erfasst und infolge unter Einsatz eines Bruker-Mass-X-Programms verarbeitet. Die Massengenauigkeit betrug typischerweise unter 1 in 10000.

Massenspektroskopie der 2C9-FG-Schleife-K206E: 53966 Da (beobachtet) 53964,67 Da (vorhergesagt)
(c) Funktionalitätstests
In einem 96-Well-Platten-Testformat wurden mit einem Fluoroscan-Ascent-FL-Instrument (Labsystem) unter Einsatz von Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin als Fluoreszenzsubstrat Aktivitätstests auf P450-2C9 durchgeführt.
Fünfzehn pmol P450 wurden mit 0,1 Einheiten gereinigter menschlicher Oxidoreductase in Gegenwart von 140 μM Substrat Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin, einem NADPH-regenerierenden System, das 0,15 mM NADP⁺, 0,38 mM Glucose-6-phosphat und 2,9 Einheiten/ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase in 170 μl Endvolumen von 25 mM KPi, pH 7,4, 0,38 mM MgCl₂ umfasst, rekonstituiert. Bei 37 °C wurden mehrere Minuten lang Inkubationen durchgeführt, und 7-Hydroxy-4-(trifluormethyl)cumarin wurde als Metabolitstandard zur Bestimmung der Metabolismusgeschwindigkeit verwendet. Die eingesetzten Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 409 beziehungsweise 530 nm. Die Aktivität der 2C9-FG-Schleife-K206E betrug 0,083 pmol/min/pmol P450 mit 2C9-Substrat.
Kristallisation der 2C9-FG-Schleife-K206E
Kristalle der 2C9-FG-Schleife-K206E wurden unter Einsatz des Dampfdiffusionsverfahrens des hängenden Tropfens gezüchtet. Das Protein mit 40 mg/ml in 10 mM KPi pH 7,4, 0,5 M KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin wurde unter Einsatz von 0,5-μl-Tropfen mit einer Reservoirlösung in einem 1:1-Verhältnis gemischt. Die Kristalle der 2C9-FG-Schleife-K206E wuchsen über einer Reservoirlösung, die 0,2 M zweibasiges Kaliumphosphat und 20 % PEG 3350 enthielt (es wurden auch alternative Bedingungen eingesetzt: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 0,2 M LiSO4, 15 % PEG 4000). Die Kristalle bildeten sich innerhalb von 1–7 Tagen bei 25 °C und wiesen Morphologien hexagonaler Nadeln und Stäbe auf. Die ungefähren Zelldimensionen der Kristalle betrugen 165 Å, 165 Å, 112 Å, 90°, 90°, 120°. Die Kristalle wurden unter Einsatz einer 80 % Reservoirlösung, 10 % PEG 400 und 10 % Glycerin als Gefrierschutzmittel in flüssigem Stickstoff schnellgefroren.
Beispiel 9: Struktur von 2C9-FG-Schleife-K206E
Die Daten wurden aus einem 2C9-FG-Schleife-K206E-Kristall (der wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt wurde) bis zu einer Auflösung von 3,0 Å bei einer Strahlenlinie ID 14,1 (Wellenlänge 0,933 Å) bei der European Synchrotron Radiation Source unter Einsatz eines Quantum4-CCD-Detektors bei 100 K aus einem einzigen Kristall erhalten. Eine Gesamtzahl von 90 1-Grad-Oszillationsbildern wurde gesammelt und unter Einsatz von MOSFLM 6,11 verarbeitet (A.G.W. Leslie, Jnt CCP4/ESF-EACMB Newslett. Protein Crystallogr. 26 (1992)), unter Einsatz von SCALA 4,1 skaliert und unter Verwendung der CCP4-Programmfamilie (Collaborative Computational Project, Nr. 4, The CCP4 suite: programs for protein cristallography, Acta Cryst, D50, 760–763 (1994)) reduziert.
Tabelle der Datenstatistik
Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P321 und weisen Zelldimensionen von 165,46 Å, 165,46 Å, 111,70 Å, 90°, 90°, 120° auf. Es gibt zwei Kopien in der asymmetrischen Einheit, und die Kristalle verfügen über einen Lösungsmittelgehalt von 68 %. Die Struktur wurde durch Molekularersatz unter Einsatz der 2C5-Struktur (pdbid 1DT6) (P.A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E.F. Johnson, D.E. Mc Ree, Molecular Cell, Band 5, Ausgabe 1, 121–131 (Jänner 2000)) und des Programms AMORE (J. Navaza, AMoRe: an automated package for molecular replacement, Acta Cryst. A50, 157–163 (1994)) gelöst, wodurch sich ein Korrelationseffizient von 67,8 % und einen R-Faktor von 38,9 % ergibt. Die Koordinaten der Struktur sind in Tabelle 1 angeführt. Die zwei Kopien in der asymmetrischen Einheit sind durch eine Rotation von 145° um die Z-Achse verbunden. Die anfänglichen Karten (sowohl gemittelt als auch nicht gemittelt) waren relativ klar und enthielten eine für die Häm-Gruppe unverkennbare Elektronendichte, die aus dem Suchmodell ausgenommen war. Diese Lösung verwendete das Programm CNX (ibid) als Ausgangspunkt für die Verfeinerung.
Beispiel 10: Weitere Kristallisation von 2C9-FG-Schleife-K206E
Bakterienexpression
Eine einzige ampicillinresistente Kolonie von XL1-Blue-Zellen, die mit dem oben beschriebenen, 2C9-FG-Schleife-K206E-exprimierenden Plasmid transformiert wurden, wurden unter Schütteln über Nacht bei 37 °C in Terrific Broth (TB) fast bis zur Sättigung gezüchtet und dazu verwendet, frisches TB-Medium zu inokulieren. Die Bakterien wurden bis zu einer OD600nm = 0,4 in 1 Liter TB-Broth, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37 °C bei 185 U/min in einem 2-Liter-Kolben gezüchtet. Der Häm-Vorläufer Deltaaminlävulinsäure (80 mg/l) wurde 30 min vor der Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzugefügt und die Temperatur auf 25 °C gesenkt. Die Bakterienkultur wurde unter Rühren bei 25 °C 72 Stunden lang fortgeführt.
Proteinreinigung
Die Zellen wurden bei 10000 g 10 min lang pelletiert und in einem Puffer, der 50 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitorcocktail (Calbiochem), 10 mM Imidazol, 40 U/ml DNase 1 und 5 mM MgSO₄ enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden lysiert, indem sie bei 10000 psi zweimal durch einen Constant-Systems-Zellhomogenisator passagiert wurden. Die Zelltrümmer wurden dann mittels 30-minütiger Zentrifugation bei 22000 × g bei 4 °C entfernt.
Das Detergens IGEPAL CA630 (Sigma) wurde zu dem Lysat zu einer Endkonzentration von 0,3 Vol.-% aus einer 10-%-Stammlösung zugetropft, und das Lysat wurde mit dem zuvor gewaschenen NiNTA-Harz (Qiagen) über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Das proteingebundene NiNTA-Harz wurde mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde mit 30 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, einer 1:1000-Verdünnung des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels 2-minütiger Zentrifugation bei 2000 xg bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde dann mit 15 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 % IGEPAL CA 630 gewaschen und das Harz mittels Zentrifugation wie oben beschrieben wiederhergestellt.
Das Harz wurde bei 4 °C in eine Säule gepackt, und das Cytochrom-P450 eluierte mit 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 300 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitorcocktail, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630.
Das Cytochrom-P450, das von der NiNTA-Säule erhalten wurde, wurde in 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA unter Einsatz einer HiPrep-26/10-Entsalzungssäule (Pharmacia) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min rasch entsalzt.
Das entsalzte Cytochrom-P450 wurde direkt auf eine CM-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM KPi, pH 7,0, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA äquilibriert worden war. Die folgende stufenweise Elution wurde verwendet: Waschung mit 20 Säulenvolumina von 10 mM KPi, pH 7,0, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA, Waschung mit dem obigen Puffer mit 75 mM KCl, um jede beliebige Spur des Detergens zu entfernen, danach Elution mit dem obigen Puffer mit einer auf 500 mM gesteigerten KCl-Konzentration.
Das Protein wurde unter Einsatz eines Mikrokonzentrators für Kristallisationstests auf bis zu 40 mg/ml konzentriert.
Kristallisation von 2C9-FG-Schleife-K206E
Die Kristalle von 2C9-FG-Schleife-K206E wurden unter Einsatz des Dampfdiffusionsverfahrens des hängenden Tropfens gezüchtet. Das Protein bei 40 mg/ml in 10 mM KPi pH 7,0, 0,5 M KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin wurde unter Einsatz von 0,5-μl-Tropfen mit einer Reservoirlösung in einem 1:1-Verhältnis gemischt. Die Kristalle von 2C9-FG-Schleife-K206E wurden über einer Reservoirlösung gezüchtet, die 0,1 M Tris-HCl, pH 8,4, 15 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin enthielt.
Es bildeten sich innerhalb eines Tages bei 25 °C stabförmige Kristalle. Die Kristalle wurden unter Einsatz der Reservoirlösung als Gefrierschutzmittel in flüssigem Stickstoff schnellgefroren. Die ungefähren Zelldimensionen der Kristalle waren 164,9 Å, 164,9 Å, 111,1 Å, α = 90 °, β = 90°, γ = 120°.
Beispiel 11: Herstellung einer 2,6- Å -Auflösungsstruktur von 2C9-FG-Schleife-K206E
Die Daten wurden aus einem 2C9-FG-Schleife-K206E-Kristall (der wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurde) bis zu einer 2,6-Å-Auflösung bei einer Strahlenlinie 14,1 bei der European Synchrotron Radiation Source unter Einsatz eines Quantum-4-CCD-Detektors bei 100 K aus einem einzigen Kristall erhalten. Der Kristall wurde gegen eine Reservoirlösung von 0,1 M, Tris pH 8,4, 15 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin gezüchtet und direkt aus der Reservoirlösung gefroren. Es wurde eine Gesamtzahl von 50 Bildern gesammelt und unter Einsatz von MOSFLM (A.G.W. Leslie, Jnt CCP4/ESF-EACMB Newslett. Protein Crystallogr. 26 (1992)) verarbeitet, unter Verwendung von SCAL skaliert und unter Einsatz einer CCP4-Programmfamilie (Collaborative Computational Project Nr. 4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography, Acta Cryst. D50, 760–763 (1994)) reduziert.
Tabelle der Datenstatistik
Diese Daten wurden zur Verfeinerung verwendet, wobei das Modell eingesetzt wurde, das durch die Verfeinerung gegen die anfänglichen 3,0-Å-Daten erzeugt wurde, um die Koordinaten aus Tabelle 2 zu erzeugen. Eine einheitliche Reihe von 5 % der Reflektionen wurde zur Kalkulation freier R markiert und auf höhere Auflösung ausgedehnt. Die Verfeinerung wurde unter Einsatz der Programm CNX (Brunger et al., Current Opinion in Structural Biology, Band 8, Ausgabe 5, 606–611 (Oktober 1998), von Accelerys, San Diego, Kalifornien, zu beziehen) und REFMAC (Collaborative Computational Project, Nr. 4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography, Acta Cryst. D50, 760–763 (1994)) bis zu einem R-Faktor von 21,9 % und einem freien R-Faktor von 25,0 % fortgesetzt.
Beispiel 12: Struktur der 2C9-FG-Schleife
Die Daten wurden aus einem 2C9-FG-Schleifenkristall 2 (der wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurde) bis zu einer 3,1 Å-Auflösung bei einer Strahlenlinie ID 14,1 (Wellenlänge 0,933 Å) bei der European Synchrotron Radiation Source unter Einsatz eines Quantum-4-CCD-Detektors aus einem einzigen Kristall erhalten, der bei 100 K direkt aus der Kristallisationslösung (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 15 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin) gefroren wurde. Der Kristall gehört zur Raumgruppe P 321. Es ist festgestellt worden, dass Kristall 2 Zelldimensionen von 163,95 Å, 163,95 Å, 111,06 Å, 90°, 90°, 120° hat.
Daten mit insgesamt 100 Grad wurden gesammelt, die unter Einsatz von MOSFLM verarbeitet, unter Verwendung von SCALA skaliert und unter Einsatz der CCP4-Programmfamilie weiter reduziert wurden. Die Struktur der 2C9-FG-Schleife wurde durch Molekularersatz mithilfe des Programms AMORE und der 2,6-Å-2C9-FG-Schleife-K206E-Struktur (Tabelle 2) als Suchmodell gelöst. Die Struktur wurde unter Einsatz strenger nicht-kristallgraphischer Symmetrie mithilfe des Programms CNX verfeinert, um die Koordinaten aus Tabelle 3 zu erzeugen. Die Endstruktur weist einen R-Faktor von 26,8 % und einen freien R-Faktor von 29,8 % für alle Daten zwischen 30 und 3,1 Å auf.
Tabelle der Datenstatistik:
Beispiel 13: Identifikation und Verwendung von P450-Bindungstaschenresten
Die Kristallstruktur für 2C9 hat zum ersten Mal eine genaue Identifikation all jener Reste ermöglicht, welche die Bindungsstelle des Enzyms auskleiden (Tabelle 4). Es kann nun bewiesen werden, dass einige Reste, die gemäß einer Reihe von Quellen am Katalyseort liegen sollen, keine Bindungstaschenreste sind, sondern Reste, welche die katalytischen Reste an Ort und Stelle halten.
Tabelle 4: Alle die 2C9-Bindungstasche auskleidenden Reste
Die Reste, die wie zuvor erwähnt aufgrund der Modellierung (z.B. Homologiemodellierung, SRS-Vorhersage, 3D/4D-QSAR, Sequenzanordnungen oder Mutagenesestudien) an der Bindungsstelle von 2C9 liegen sollen und von welchen nun mithilfe der Kristallstruktur bekannt ist, dass sie die 2C9-Bindungstasche säumen, sind in Tabelle 5 angeführt.
Tabelle 5: Reste, die wie zuvor erwähnt an der Bindungsstelle von 2C9 liegen sollen
Einige Reste, die in der Bindungstasche zu finden sind, sind nie zuvor als Bindungsstellenreste identifiziert worden. Diese sind in Tabelle 6 angeführt. Die Identifikation dieser erleichtert die Modellierung der Verbindungsbindung enorm.
Tabelle 6: Reste, die kürzlich als Reste identifiziert wurden, weiche die 2C9-Bindungstasche säumen
Dementsprechend umfassen die gewählten, in einem Verfahren der Erfindung eingesetzten Koordinaten in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung zumindest eine Koordinate, bevorzugt zumindest eine Seitenkettenkoordinate, eines Aminosäurerests, der entweder aus Tabelle 5 oder 6 ausgewählt ist.
Vorzugsweise umfassen die gewählten Koordinaten die Koordinaten aller Atome aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8, die mit zumindest einer Aminosäure aus Tabelle 5 oder 6 zusammenhängen.
Ob nun alle oder nur einige Atome einer besonderen Aminosäure ausgewählt sind, sind bevorzugt zumindest 2, noch bevorzugter zumindest 5 und am bevorzugtesten zumindest 10, der gewählten Koordinaten von Seitenkettenresten der entsprechenden Zahl verschiedener Aminosäurereste. Diese können ausschließlich aus Tabelle 5 oder Tabelle 6 oder einer Kombination daraus ausgewählt sein. Es ist bevorzugt zumindest eine Seitenkettenrestkoordinate aus Tabelle 6 enthalten.
Beispiel 14: Modellierung anderer P450-Strukturen
Einige der Reste in Tabelle 5 und 6 sind Reste, die nicht an den in den Tabellen angegeben Sequenzpositionen in einem natürlich auftretenden menschlichen 2C9 auftreten, oder sind Reste, die sich in anderen menschlichen P450-Strukturen unterscheiden. Für diese Reste können insbesondere Molekularmodellierungsverfahren (einschließlich aber nicht ausschließlich Molekularersatz oder computergestützte halbmanuelle Verfahren) eingesetzt werden, um ein Modell zu erhalten, in welchem an einer solchen Stelle ein anderer Rest bereitgestellt wird. Zum Beispiel ist Position 206 (in Tabelle 5 s.o. zitiert) in dem Protein 2C9-FG-Schleife ein Lysin, das eine positive Ladung umfasst. Unter Einsatz der Röntgenbeugungsdaten. von 2C9-FG-Schleife-K206E haben die Erfinder das 2C9-FG-Schleifenprotein modelliert, um für dieses Protein Koordinatendaten bereitzustellen.
Die Koordinatendaten entsprechen abgesehen von den Daten für Rest 206, der nachstehend angeführt ist, Tabelle 1:
Es ist festzustellen, dass das CB-Kohlenstoffatom, d.h. das erste Kohlenstoffatom in der Seitenkette, an einer zur Position des Glu-CB-Kohlenstoffatoms aus Tabelle 1 fast identischen Position liegt, wobei die übrigen Atome der Seitenkette (CD, CE & NZ) an Stellen liegen, die auf einer energiearmen Konfiguration der Lysinseitenkette basieren, wobei die Verbindung der Seitenkette mit dem CA-Kohlenstoffatom berücksichtigt wird. Es ist daher für einen Fachmann auf dem Gebiet der Molekularmodellierung relativ einfach, zu einem Modell für ein P450 zu gelangen, in welchem einer oder mehrere Reste von 2C9-FG-Schleife-K206E analog ersetzt sind. Die Koordinatendaten für 2C9-FG-Schleife sind in Tabelle 3 angeführt. Fachleute schätzen, dass es in der Raumgruppe P321 möglich ist, die Beugungsdaten auf eine von zwei Arten zu indizieren. Die Daten können unter Einsatz des Operators k, h, -l von einer Indizierung in die andere konvertiert werden. Im Fall von 2C9-FG-Schleife-K206E bei 3,0 Å (Tabelle 1) wurden die Daten verglichen mit den Daten von 2C9-FG-Schleife-K206E bei 2,6 Å (Tabelle 2) oder 2C9-FG-Schleife (Tabelle 3) unterschiedlich indiziert, und obwohl die Kristallformen der Proteine im Wesentlichen identisch sind, liegen die Kristallstrukturen nicht im selben absoluten Raum. Daher entsprechen die Koordinatendaten für Glu206 in Tabelle 3 numerisch nicht den oben gezeigten, in Tabelle 1 als Modell angeführten Daten. Fachleute können die obigen Daten für Rest 206 dementsprechend konvertieren.
Wenn bei der Modellierung eine Wechselwirkung einer Verbindung oder eines Metabolits davon mit einer P450-Struktur der Erfindung vorliegt, ist deshalb festzustellen, dass der Rest an Position 206 in der Wechselwirkung mit diesem bestimmten Metaboliten eine Rolle spielen kann, die obigen Daten für Rest 206 können in Tabelle 1 anstelle der Daten für 206Glu verwendet werden. Dies betrifft die Ladungsänderung, die sich aus der Differenz ergibt. Bei Verbindungen oder Metaboliten, von denen festgestellt wird, dass sie mit anderen Regionen von P450 wechselwirken, muss kein Bedarf bestehen, Tabelle 1 auf diese Art und Weise zu ändern.
Jedoch kann eine ähnliche Modellierung für andere Teile von P450 ausgeführt werden, wo es als wichtig erachtet wird, dass die potenziellen Wechselwirkungen einer Verbindung mit der Bindungstasche in diesen Teilen des Proteins von besonderem Interesse sind. Daher wurden insbesondere die Reste Pro220, Ala221, Leu222 und Leu223 auf ähnliche Weise wie oben beschrieben neumodelliert, um die Koordinaten der Seitenketten des Wildtyprests in einer P450-Struktur vorauszuberechnen.
Die modellierten Koordinaten des 2C9-Wildtypproteins sind dieselben wie jene, die in Tabelle 1, 2, 3 oder 8 enthalten sind, mit der Ausnahme, dass die Reste, die in Tabelle 7 angeführt sind, die entsprechenden Reste aus Tabelle 1, 2, 3, oder 8 substituieren.
Daher deckt die vorliegende Erfindung eine Struktur von 2C9 zur In-silico-Verwendung ab, in welcher die Koordinaten jene aus den Tabellen 1, 2, 3 oder 8 sind, mit der Ausnahme, dass die Atome und entsprechenden Koordinaten eines oder mehrerer Reste 215, 216, 220, 221, 222 und 223 durch die Atome und entsprechenden Koordinaten der Wildtypreste aus Tabelle 7 substituiert sind. Somit beziehen sich bis zu dem Ausmaß, dass vorherige Aspekte der Erfindung sich auf Tabelle 1, 2, 3 oder 8 beziehen, die Aspekte auch auf Tabelle 1, 2, 3 oder 8 mit den Atomen und entsprechenden Koordinaten von einem oder mehreren Resten 215, 216, 220, 221, 222 und 223, die durch jene der in Tabelle 7 als Wildtyp typisierte Reste substituiert sind.
Beispiel 15: Docking-Versuch
Die Kristallstruktur von 2C9 wurde verwendet, um mittels Computer ein Arzneimittelmolekül in der Bindungstasche anzukoppeln. Das Arzneimittel Diclofenac, ein für menschliches 2C9 bekanntes Substrat, wurde erzeugt und unter Einsatz interaktiver Computergraphiken in die 2C9-Bindungstasche platziert. Die beobachteten Wechselwirkungen können nun verwendet werden, um Diclofenac über eine strukturbasierte Designstrategie chemisch zu modifizieren, um seine Wechselwirkung mit menschlichem 2C9 zu vermitteln und sein therapeutisches Potenzial zu verbessern.
Beispiel 16: Verfeinerung der 2C9-FG-Schleife-K206E-Struktur
Die Daten, die in Beispiel 11 erzeugt wurden, wurden weiter verfeinert, um Tabelle 8 (5) zu ergeben. Es ist eine Gesamtzahl von 147 Wassermolekülen hinzugefügt (manuell und automatisch) und in die Verfeinerung integriert worden. Dies ergab einen R-Faktor von 20,7 % und einen freien R-Faktor von 25,9 %.
Beispiel 17: Produktion weiterer 2C9-Proteine
Die Nucleinsäuren, die für 2C9trunk, für 2C9P220 (auch 1072 genannt), 2C9-FG-Schleife (1015) und 2C9-FG-Schleife-K206E (1155) kodieren, wurden verwendet, um weitere für 2C9 kodierende Nucleinsäuren unter Einsatz entweder von Kassettenmutagenese (CM) oder ortsgerichteter Mutagenese (QC) zu produzieren. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde unter Einsatz eines Quikchange^TM-Mutagenese-Sets von Stratagene (Katalognummer 200518) ortsgerichtete Mutagenese (PCR-Mutagenese) durchgeführt. Das Quikchange^TM-Mutageneseverfahren erzeugt ein mutiertes Plasmid mit versetzten Nicks und verwendet den Dpnl-Verdau, um die gesamte parenterale DNA zu entfernen. Die Reaktion wurde unter Inkorporation von 5,0 μl von 10X Reaktionspuffer, 5–50 ng Matrizenplasmid-DNA, 1,0 μl dNTP-Gemisch und 125 ng Oligonucleotidprimer durchgeführt. Die für jedes Konstrukt verwendeten Primer und Matrizen sind in der Tabelle nachstehend angeführt.
Die Reaktionen wurden mit sterilem Wasser auf 50 μl aufgefüllt, und es wurden 2,5 U Pfu Turbo hinzugefügt und die Reaktion mit 30 μl Mineralöl überschichtet, dann wurde wie folgt Thermocycling durchgeführt: 95 °C, 30 s (1 Zyklus), 95 °C, 30 s, 55 °C, 1 min, 68 °C 13,5 min (18 Zyklen) und letztendlich eine Haltedauer bei 4 °C. Es wurde ebenfalls eine Kontrollreaktion mit Wasser anstelle von Oligonucleotidprimern durchgeführt. Nach dem Thermocycling wurden unter dem Spiegel des Mineralöls zu jeder Reaktion 10 U Dpnl hinzugefügt. Die Reaktionen wurden dann vorsichtig gemischt, gefolgt von Zentrifugation in einer Labormikrozentrifuge, 1 min, 13.000 U/min, und bei 37 °C 3 h lang inkubiert.
Das verdaute Produkt (1 μl) wurde dann verwendet, um 50 μl kompetenter E.coli-XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Die gesamte Transformation wurde dann auf Luria-Agarplatten, die 100 μg/ml Carbenicillin enthielten, ausplattiert, umgedreht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Aus einzelnen Kolonien wurde Plasmid-DNA hergestellt und sequenziert, um die Insertion der korrekten Mutation(en) zu überprüfen.
Auf der 2C9-FG-Region (Reste 215 bis 226) wurde unter Einsatz der BamHI-Stellen und XmaI-Stellen, zweier einzigartiger und natürlicher, in dieser Region vorliegenden Restriktionsstellen, Kassettenmutagenese ausgeführt. Es wurden komplementäre Oligonucleotide mit den 5'-BamHI- und 3'-XmaI-Überhangrestriktionsstellen geschaffen, um in der FG-Region Mutationen einzuführen (Tabellen 9, 10 und 14). Es wurden doppelsträngige Oligonucleotide hergestellt, indem 10 μg eines Gemisches komplementärer Oligonucleotide 5 min lang in 100 μl Wasser auf 100 °C erhitzt wurden und langsam auf 25 °C abgekühlt wurden. Doppelsträngige Oligonucleotide wurden in gereinigtes Plasmid pCW-2C9 wt ligiert, das durch BamHI und XmaI-Restriktionsenzyme geöffnet wurde, und eine Aliquote der Ligation wurde verwendet, um die XI1-Blue-E.-coli zu transformieren.
Mithilfe der obigen Verfahren erzeugte 2C9-Proteine der Erfindung sind in Tabelle 9 angeführt, welche auch die verwendeten Primer angibt. Kristalle all dieser Proteine wurden unter einer Reihe von Bedingungen, die in Tabelle 11 angeführt sind (siehe Beispiel 20), erhalten.
Unter Einsatz derselben Verfahren wurden 2C9-Proteine ohne Prolin an 220 als Kontrollen hergestellt. Die hergestellten Proteine sind in Tabelle 10 angeführt. Bei einer Vielzahl getesteter Bedingungen wurden keine Proteinkristalle erhalten.
Beispiel 18: Produktion von 2C9-Proteinen
Bakterienexpression
Die 2C9-Proteine aus Beispiel 17 wurden in einem Bakterienexpressionssystem produziert. Bei 37 °C wurde in Terrific-Broth (TB) unter Schütteln eine einzige ampicillinresistente Kolonie von XL1-Blue-Zellen über Nacht nahezu bis zur Sättigung gezüchtet und dann dazu verwendet, frisches TB-Medium zu inokulieren. Die Bakterien wurden in 1 Liter TB-Nährlösung, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37 °C bei 185 U/min in einem 2-Liter-Kolben auf OD600nm = 0,4 gezüchtet. Der Häm-Vorläufer Deltaaminolävulinsäure (80 mg/l) wurde 30 min vor der Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzugefügt und die Temperatur auf 25 °C gesenkt. Die Bakterienkultur wurde unter Rühren bei 25 °C 72 Stunden lang fortgesetzt.
Proteinreinigung
Die Zellen wurden bei 10000 g 10 min lang pelletiert und in einem Puffer, der 500 mM KPi bei einem pH von 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% des Proteaseinhibitorcocktails (Calbiochem), 10 mm Imidazol, 40 U/ml DNase 1 und 5 mM MgSO₄ enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden lysiert, indem sie zweimal durch einen Constant-Systems-Zellhomogenisator bei 10000 psi passagiert wurden. Die Zelltrümmer wurden dann mittels 30-minütiger Zentrifugation bei 22000 × g bei 4 °C entfernt.
Das Detergens IGEPAL CA630 (Sigma) wurde zu dem Lysat auf eine Endkonzentration von 0,3 Vol.-% aus einer 10-%-Stammlösung zugetropft, und das Lysat wurde mit dem zuvor gewaschenen NiNTA-Harz (Qiagen) über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Das proteingebundene NiNTA-Harz wurde mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 2000 g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde mit 30 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, einer 1:1000- Verdünnung des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 2000 × g bei 4 °C pelletiert. Das Harz wurde dann mit 15 Harzvolumina von 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol, 0,1 Vol.-% Proteaseinhibitoren, 0,3 % IGEPAL CA630 gewaschen und das Harz mittels Zentrifugation wie oben beschrieben wiedergewonnen.
Das Harz wurde bei 4 °C in eine Säule gepackt, und Cytochrom-P450 eluierte mit 500 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 10 mM Mercaptoethanol, 300 mM Imidazol, 1:1000 (Vol.) des Proteaseinhibitorcocktails, 0,3 Vol.-% IGEPAL CA630.
Das Cytochrom-P450, das von der NiNTA-Säule erhalten wurde, wurde in 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA unter Einsatz einer HiPrep-26/10-Entsalzungssäule (Pharmacia) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min rasch entsalzt.
Das entsalzte Cytochrom-P450 wurde direkt auf eine CM-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA äquilibriert worden war. Es wurde die folgende stufenweise Elution angewendet: Waschung mit 20 Säulenvolumina von 10 mM KPi, pH 7,4, 20 % Glycerin, 2,0 mM DTT, 1 mM EDTA, Waschung mit dem obigen Puffer mit 75 mM KCl, um jede beliebige Spur eines Detergens zu entfernen, dann Elution mit dem obigen Puffer mit einer auf 500 mM erhöhten KCl-Konzentration.
Das Protein wurde unter Einsatz eines Mikrokonzentrators für Kristallisationstests auf bis zu 40 mg/ml konzentriert. Die Qualität der Endformulierung wurde folgendermaßen beurteilt:
(a) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Diese wurde unter Einsatz handelsüblicher Gele (Nugen) gefolgt von CBB-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Die Reinheit, die durch das Scannen eines digitalen Bilds eines Gels beurteilt wurde, wurde auf zumindest 95 % geschätzt.
(b) Massenspektroskopie
Unter Einsatz eines „BioTOFII"-Elektrospray-Flugzeitinstruments von Bruker wurde Massenspektroskopie durchgeführt. Die Proben wurden entweder um einen Faktor 1000 gleich vom Speicherpuffer in Methanol/Wasser/Ameisensäure (50:48:2 (Vol.)) verdünnt oder unter Einsatz einer C4-Millipore-„zip"-Spitze oder einer C4-HPLC-Säule einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung unterworfen, bevor sie in Methanol/Wasser/Ameisensäure verdünnt wurden. Die Kalibrierung wurde durch die Messung der 2+- und 1+-Ladungszustände eines Peptidgemisches, das Bombesin und Angiotensin I enthielt, oder durch die Verwendung multipler Ladungszustände von Pferdemyoglobin erreicht. Die Daten wurden in einem m/z-Bereich von 200 bis 2000 m/z erfasst und infolge unter Einsatz eines Bruker-X-Mass-Programms verarbeitet. Von der Massengenauigkeit wurde erwartet, dass sie besser als 1 in 10000 (100 ppm) ist.
In Tabelle 12 sind vorhergesagte und beobachtete Massenspektroskopiedaten für die Proteine angeführt.
Tabelle 12: Massenspektroskopiedaten für 2C9-Proteine
Beispiel 19: Aktivität der 2C9-Proteine der Erfindung
In einem 96-Well-Platten-Testformat wurden mit einem Fluoroscan-Ascent-FL-Instrument (Labsystem) unter Einsatz von 7-Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin als Fluoreszenzsubstrat Aktivitätstests auf P450-2C9 durchgeführt.
Fünfzehn pmol von gereinigtem P450 wurden mit 0,1 Einheiten gereinigter menschlicher Oxidoreductase in Gegenwart von 137 μM des Substrats. 7-Methoxy-4-(trifluormethyl)cumarin und einem NADPH-regenierenden System, das 0,14 mM NADP⁺, 0,37 mM Glucose-6-phosphat, 0,38 mM MgCl₂ und 2,8 Einheiten/ml Glucose-6-Phosphatdehydrogenase in 180 μl Endvolumen von 25 mM KPi, pH 7,4 umfasst, rekonstituiert. Bei 37 °C wurden über einen Zeitraum von 40 Minuten Inkubationen durchgeführt, und 37,5 pmol des Metabolitstandards 7-Hydroxy-4-(trifluormethyl)cumarin wurden zur Bestimmung der Metabolismusgeschwindigkeit verwendet. Die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 409 beziehungsweise 530 nm. Die Ergebnisse für die getesteten Klone sind in Tabelle 13 angeführt.
Tabelle 13: Aktivitätsdaten
Als Kontrolle wurde die Aktivität vom Protein 2C9trunk (Wildtyp) und von 1365 (die beide an 220 kein Prolin haben) bestimmt und herausgefunden, dass diese 0,47 beziehungsweise 0,43 beträgt.
Beispiel 20: Kristallisation von 2C9-Proteinen
Die Kristalle der 2C9-Mutanten wurden unter Einsatz des Dampfdiffusionsverfahrens der hängenden Tropfen gezüchtet. Das Protein mit 10–60 mg/ml (üblicherweise 40 mg/ml) in 10 mM KPi pH 7,4, 0,5 M KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 % Glycerin wurde in einem 1:1-Verhältnis unter Einsatz von 0,5-μl-Tropfen mit einer Reservoirlösung gemischt. Eine Anzahl verschiedener 2C9-Proteine der Erfindung formte Kristalle unter den folgenden Reservoirlösungsbedingungen:
0,05–0,1 M Tris-HCl pH 8,0–8,8, 0,1–0,2 M Lithiumsulfat, 10–15 % PEG 4000;
0,1 M Tris pH 8,0–8,8, 15–30 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin; und
0,1–0,4 M KH₂PO₄, 0–25 % PEG 3350, 0–10 % Glycerin.
Es wurden ebenfalls weitere Reservoirlösungen, welche die in Tabelle 11 (6) angeführten Bedingungen umfassen, verwendet, um weitere Kristalle mehrerer verschiedener 2C9-Proteine der Erfindung zu erhalten. In Tabelle 11 wurde die Kristallisation der Klone, die durch die Klonnummern identifiziert sind, unter Einsatz einer Reservoirlösung erreicht, welche die in den Säulen aufgelisteten Bestandteile enthält, worin diese folgende sind:
Puffer (M) – Molarität des Puffers (in M)
Puffer – Puffer-Typ
pH – pH des verwendeten Puffers
Salz (M) – Molarität des Salzes (in M)
Salz – Salz-Typ
Ppt (M) – Molarität des Fällungsmittels (in M)
Ppt – Fällungsmitteltyp
Ppt 2 (M) – Molarität des Fällungsmittels 2 (in M)
Ppt 2 – verwendetes Fällungsmittel 2
Zusatz M – Molarität des Additivs (in M)
Additiv – verwendetes Additiv
Beispiel 21: 2C9-2C19-Chimären
Es wurden sieben weitere 2C9-Proteine erzeugt, die auf der Substitution von Resten, die in 2C19 zu finden waren, in 2C9 basierten. Drei Chimären (1661, 1662 und 1664) wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese wie in Beispiel 17 siehe oben beschrieben und unter Einsatz der nachstehend in Tabelle 14 aufgelisteten Primer erzeugt. Die vier anderen Chimären, 1595, 1600, 1610 und 1632, wurden mittels Klonierungsverfahren wie folgt erzeugt:
Chimäre 1595
Der Mutant 1155-I99H wurde zuerst mittels Quikchange^TM-Mutageneseverfahren unter Einsatz der in Tabelle 14 angeführten Oligonucleotide erzeugt. Die Reste 227 bis 339 wurden dann im Konstrukt 1155-I99H durch die in Cytochrom P450-2C19 (Klon 1026) vorliegenden Reste mittels Klonierung des XmaI/SphI-339-bp-DNA-Fragments von 2C19 in das Plasmid pCW-1155-I99H substituiert, das von denselben Restriktionsenzymen geöffnet worden war, um die Chimäre 1595 zu ergeben.
Chimäre 1600
Chimäre 1600 wurde durch Substitution der Reste 1 bis 282 durch die in dem 1155-I99H-Konstrukt zu findenden Reste aus Chimäre 1595 gewonnen. Eine stumme Restriktionsstelle EcoRI (unterstrichen) wurde in das 1155-I99H-Konstrukt an Position 784 mittels PCR-Amplifikation unter Einsatz der folgenden 5'-Oligonucleotide eingeführt: 5'ctttcaatagtgaattcagatggttggttgtgc3' (Seq.-ID-Nr. 226) und 5'tatggctaagaaaacgagctctaaagggc3' (Seq.-ID-Nr. 225), die EcoRI-Restriktionsstelle ist unterstrichen. Einer Gesamtzahl von 28 Zyklen bei 94 °C über 30 s, 55 °C über 1 min und 72 °C über 1 min folgte eine 10-minütige Verlängerung bei 72 °C. Das 795-bp-PCR-Fragment wurde mit NotI/EcoRI doppelt verdaut und mittels Agarosegelextraktion und -elution gereinigt. Das NotI/EcoRI-DNA-Fragment wurde dann in das Plasmid 1595, das durch die NotI/EcoRI-Restriktionsenzyme geöffnet worden war, kloniert, um die 1155-I99H/1595-Chimäre zu ergeben. Letztendlich wurde die L362I- Änderung mittels Quikchange^TM-Mutageneseverfahren unter Einsatz der in Tabelle 14 angeführten Oligonucleotdie in die 1155-I99H/1595-Chimäre eingeführt, um Chimäre 1600 zu ergeben.
Chimäre 1610
Chimäre 1610 wurde aus dem Konstrukt 1155 durch Substitution der Reste 215–328 durch die in Chimäre 1600 zu findenden Reste gewonnen. Das BamHI/AffIII-DNA-Fragment wurde aus Chimäre 1600 isoliert und in das Plasmid pCW-1155 kloniert, das mit den BamHI/AffIII-Restriktionsenzymen geöffnet worden war.
Chimäre 1632
Das Konstrukt 1632 wurde durch die Substitution der Reste 329 bis 476 in Chimäre 1600 durch die im Konstrukt 1155 zu findenden Reste aus Chimäre 1600 gewonnen. Das AffIII/SalI-DNA-Fragment wurde aus dem Konstrukt 1155 isoliert und in das Plasmid pCW-1600 kloniert, das mit den AffIII/SalI-Restriktionsenzymen geöffnet worden war. Tabelle 14 führt diese Chimären an.
Tabelle 14: 2C9-C19-Chimären
Beispiel 22: Produktion von 2C9-2C19-Chimären
Diese Proteine wurden wie oben beschrieben für die 2C9-Proteine aus dem obigen Beispiel 18 hergestellt. In Tabelle 15 sind vorhergesagte und beobachtete Massenspektrometriedaten für die Proteine angeführt.
Tabelle 15: Massenspektrometrie für 2C9-Proteine
Beispiel 23: Validation von 2C9-FG-Schleife-K206E
Die Substratspezifität von 2C9-FG-Schleife-K206E wurde durch die Ausführung metabolischer Tests mit Diclofenac als Substrat in Kombination mit Inhibitionstests mit sechs in der Literatur beschriebenen Substraten/Inhibitoren von 2C9 charakterisiert.
Die 4-Diclofenac-Hydroxylasetests (11), die gemäß dem von Mancy et al., Biochemistry 38, 14264–14270 (1999), beschriebenen Verfahren bestimmt wurden, zeigen, dass der Km-Wert des 2C9-FG-Schleife-K206E-Mutants für Diclofenac dem für das native N-trunkierte 2C9 erhaltenen Wert ähnelt und in den Bereich jener Werte fällt, die in der Literatur für native Vollängen-2C9 berichtet werden. Jedoch zeigt Cytochrom-P450-2C9-FG-Schleife-K206E einen doppelt niedrigeren Vmax-Wert, der geänderte Wechselwirkungen mit seinem Redoxpartner reflektieren kann. Die Ergebnisse der Inhibitionsstudien (Tabelle 16) zeigen auch, dass das Inhibitionsprofil von 2C9-FG-Schleife-K206E bei einem Vergleich mit dem nativen N-trunkierten Enzym mit Ki- und IC50-Werten, die den in der Literatur berichteten sehr genau entsprechen, unverändert ist.
Diese Ergebnisse zeigen insgesamt, dass die zur Förderung der Kristallisation von 2C9 in die FG-Schleifenregion eingeführten Mutationen die Substratspezifität weder ändern, noch die Integrität der Substratbindungstasche modifizieren. Deshalb repräsentiert 2C9-FG-Schleife-K206E ein geeignetes Modell des nativen 2C9 zur Studie des Bindungs-Modus chemischer Verbindungen in die aktive Stelle.
Tabelle 16: Aktivität von 2C9-FG-Schleife-K206E (1155)
Beispiel 24: Aktivität von 2C9-2C19-Chimären
Die Substratspezifität der Proteine, die in Beispiel 22 hergestellt worden waren, wurde durch die Ausführung von Inhibitionstests mit sechs in der Literatur beschriebenen Substraten/Inhibitoren von 2C19 und 2C9 charakterisiert.
Die Aktivitäts- und Inhibitionstest wurden auf den chimären 2C9-2C19Proteinen ausgeführt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 17 angeführt.
Tabelle 17: Aktivität von 2C9-2C19-Chimären
Wie ersichtlich ist zeigen 1632 und 1661 2C19-ähnliche Aktivität. Daher kann eine 2C9-2C19-Chimäre auch durch das Veranlassen folgender Änderungen I99H S286N E288V N289I V292A F295L hergestellt werden. Ein alternativer minimaler Mutant ist I99H S286N N289I.
Beispiel 25: Kristallisation von chimären 2C9-2C19-Proteinen
Die Kristalle wurden wie in Beispiel 20 oben beschrieben hergestellt. Die Kristalle wurden über einer Reservoirlösung unter folgenden Bedingungen gezüchtet:
0,05–0,1 M Tris-HCl pH 8,0–8,8, 0,1–0,2 M Lithiumsulfat, 10–15 % PEG 4000;
0,1 M Tris pH 8,0–8,8, 15–30 % PEG 400, 5 % PEG 8000, 10 % Glycerin; und
0,1–0,4 M KH₂PO₄, 0–25 % PEG 3350, 0–10 % Glycerin; und auch die in Tabelle 11 (6) angeführten Bedingungen.
Beispiel 26: Homologiemodellierung von 2C19
Unter Einsatz der Homologiemodellierung wurde ein Modell vom 2C19-Protein hergestellt. Das Modell wurde aus einer Anordnung der 2C9-Matrizenstruktur und der Target-Sequenz unter Verwendung von CLUSTALW geschaffen. Die Anordnungen wurden an die Information des Sekundärstrukturprogramms PSIPRED angepasst und manuell optimiert. Das Programm MODELLER wurde dazu verwendet, dreidimensionale Modelle zu schaffen und zu optimieren, wobei das Endmodell das mit der geringsten Energie und jenes Modell war, das den vom Programm erzeugten Einschränkungen am besten gerecht wurde. Das produzierte 2C19-Modell ist in Tabelle 18 (7) angeführt.
Beispiel 27: Homologiemodellierung von 2C18
Dies wurde durch die Bestimmung jener Reste, die sich in 2C18 von 2C19 unterscheiden, und unter Einsatz der im obigen Beispiel 25 beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Koordinaten dieser Reste ausgeführt. Diese Koordinaten, die in Tabelle 19 (8) angeführt sind, können in die 2C9- oder 2C19-Koordinatentabellen substituiert werden.
Beispiel 28: Homologiemodellierung von 2C8
Dies wurde durch die Bestimmung jener Reste, die sich in 2C8 von 2C19 unterscheiden, und unter Einsatz der im obigen Beispiel 25 beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Koordinaten dieser Reste ausgeführt. Diese Koordinaten, die in Tabelle 20 (9) angeführt sind, können in die 2C9- oder 2C19-Koordinatentabellen substituiert werden.
Sequenzprotokoll:

Claims

Computergestütztes Verfahren zur Analyse der Wechselwirkung zwischen einer Molekülstruktur und einer P450-Struktur, umfassend: (a) Bereitstellen einer 2C9-P450-Struktur aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder von Koordinaten mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus diesen Tabellen; oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten; (b) Bereitstellen einer Molekülstruktur, die an die P450-Struktur oder ausgewählte Koordinaten davon angepasst werden soll; und (c) Anpassen der Molekülstruktur an die P450-Struktur.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausgewählten Koordinaten Atome von einem oder mehreren Resten aus Tabelle 4 enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eines der Atome von einem Rest aus Tabelle 6 stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest 10 der ausgewählten Koordinaten von Seitenkettenresten der entsprechenden Anzahl an unterschiedlichen Aminosäureresten aus Tabelle 5 oder 6 oder eine Kombination daraus sind.
Verfahren zur Vorhersage dreidimensionaler Strukturen von P450-Homologen oder -Analogen mit unbekannter Struktur, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Ausrichten einer Darstellung einer Aminosäuresequenz eines P450-Zielproteins mit unbekannter dreidimensionaler Struktur mit der Aminosäuresequenz des P450 aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8, um homologe Regionen der Aminosäuresequenzen zur Deckung zu bringen; Modellieren der Struktur der zur Deckung gebrachten homologen Regionen des Ziel-P450 mit unbekannter Struktur an den entsprechenden Regionen einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8; und Bestimmen einer Konformation für das Ziel-P450 mit unbekannter Struktur, welche die Struktur der zur Deckung gebrachten homologen Regionen im Wesentlichen beibehält.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das P450-Zielprotein aus der aus 2C8, 2C18 und 2C19 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Konformation des Ziel-P450 die Struktur aus Tabelle 18 ist.
Verfahren zur Bestimmung der Struktur eines Proteins, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen der Koordinaten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten und entweder (a) Positionieren der Koordinaten in der Kristallelementarzelle des Proteins, um eine Struktur für das Protein bereitzustellen, oder (b) Zuordnen von NMR-Spektren-Peaks des Proteins durch Manipulieren der Koordinaten.
Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer an P450-Protein gebundenen Verbindung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen eines Kristalls von P450-Protein; Einweichen des Kristalls in der Verbindung, um einen Komplex zu bilden; und Bestimmen der Struktur des Komplexes mithilfe der Daten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten.
Verfahren zur Bestimmung der Struktur einer an P450-Protein gebundenen Verbindung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Mischen des P450-Proteins mit der Verbindung; Kristallisieren eines P450-Protein-Verbindung-Komplexes; und Bestimmen der Struktur des Komplexes mithilfe der Daten einer 2C9-P450-Struktur mit einem RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å von den Rückgratatomen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 8 oder von zumindest 100 davon ausgewählten Koordinaten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 8 bis 10, worin zumindest 500 ausgewählte Koordinaten verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å weniger als 1 Å beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der RMSD-Wert von weniger als 2,0 Å weniger als 0,64 Å beträgt.