DE60226133T2 - Fragmente von retinoic acid-related orphan-rezeptoren (ror) welche die ligandenbindedomaine (lbd) enthalten, kristallstruktur der lbd von ror-beta und deren verwendungen - Google Patents

Fragmente von retinoic acid-related orphan-rezeptoren (ror) welche die ligandenbindedomaine (lbd) enthalten, kristallstruktur der lbd von ror-beta und deren verwendungen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Ein Aspekt dieser Erfindung ist der Erhalt einer Kristallstruktur von Orphan-Rezeptoren durch Verwenden eines heterologen Expressionssystems, was nicht nur eine große Menge des gewünschten Proteins produziert, sondern auch einen Pseudo-Liganden liefern kann. Die Gegenwart dieses zufälligen Moleküls ist wichtig, um die Konformation eines aktiven Agonisten durch begleitendes Hinzufügen eines Co-Aktivatorpeptids zu stabilisieren. Diese beiden Elemente verhindern jegliche andere nicht aktive Konformationen.
  • Das Verfahren wird durch Kristalle einer gehirnspezifischen Retinoic-acid-related-orphan-rezeptor-Ligandenbindungsdomäne (RORβ-LBD) im Komplex mit einem Co-aktivatorpeptid und einem zufälligen Fettsäureliganden dargestellt. Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verwenden einer DNA-Sequenz oder abgeleiteten Konstruktionen zur Herstellung von Proteinen, um entweder den physiologischen Liganden herauszufinden oder nach synthetischen Analoga zu screenen. Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zum Designen und Auswählen von Liganden, die an den RORβ binden und Verfahren zur Verwendung solcher Liganden. Sie betrifft auch die Verwendung von DNA-Sequenzen von RORβ oder von abgeleiteten Sequenzen davon, um andere Proteine die mit RORβ wechselwirken zu identifizieren. Offenkundig ist dieser Gegenstand der Erfindung auch die Verwendung der Struktur ähnlicher oder homologer Proteine oder Proteinkomplexe, insbesondere werden alle diese Schutzbegehren auf die beiden Isotypen RORα und γ angewandt.
  • Hintergrund dieser Erfindung
  • Der Orphan-retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor β (RORβ), auch genannt Retinoid-Z-Rezeptor β (RZRβ) (NR1F2) gehört zur Überfamilie der Nuklearrezeptoren (NR) und wird in Bereichen des Zentralnervensystems exprimiert. Die ligandenabhängige Aktivität des Nuklearrezeptors macht sie offensichtlich in vielen therapeutischen Gebieten zu Zielen für Arzneimitteldesign. Im Fallen von Orphan-Rezeptoren, ist der Ligand jedoch nicht bekannt und es ist sogar die Existenz eines Liganden nicht nachgewiesen. Dass RORβ Retinsäure bindet wurde niemals gezeigt. RORβ reguliert Gene, deren Produkte eine Rolle im Zusammenhang mit der Integration sensorischen Inputs sowie im Zusammenhang mit der biologischen Uhr spielen. Ein Verhaltensphänotyp von RORβ-/-Mäusen wurde beobachtet und scheint dem Phänotyp, der mehr als 40 Jahre früher für eine spontane Mausmutation genannt Vacillans beschrieben wurde (Sirlin, 1956) ähnlich zu sein. Diese Mäuse zeigen einen entenähnlichen Gang, verübergehende männliche Unfähigkeit zur sexuellen Reproduktion und eine schwer desorganisierte Retina, die an postnataler Degeneration leidet.
  • Zwei andere nahe Nuklearrezeptoren sind RORα und RORγ. RORα weist 61% Identität und 74% Ähnlichkeit mit RORβ auf. RORα wird ziemlich allgegenwärtig exprimiert (Becker-André et al., 1993) und es wurde gezeigt, dass es wichtige Rollen in der Kleinhirnentwicklung und bei der Immunantwort spielt (Matysiak-Scholze and Nehls, 1997; Koibuchi and Chin., 1998). Bei Staggerer-Mäusen wurde festgestellt, dass sie eine Deletion im RORα-Gen tragen, die die Translation der Ligandenbindungsdomäne verhindert. Sie weisen eine schwere zerebellare Ataxie aufgrund eines Defekts in der Entwicklung von Purkinjezellen auf. Bestimmte Funktionen des Immunsystems sind ebenfalls betroffen (Hamilton & al., 1996).
  • Bestimmte Funktionen des Immunsystems sind ebenfalls betroffen (Hamilton & al., 1996). RORα wird auch wesentlich während Myogenese exprimiert (Lau et al., 1999).
  • Die Expression von RORγ findet man hauptsächlich in Skelettmuskulatur (Hirose et al., 1994) und wird in der mittleren Phase der Fettzellendifferenzierung hervorgerufen (Kurebayashi S., and Hirose T, 1998).
  • Wie bei den anderen Mitgliedern der Nuklearrezeptorfamilie, hat RORβ mehrere funktionale Domänen einschließlich einer DNA-Bindungsdomäne (DBD), und einer 250 Reste-Ligandenbindungsdomäne (LBD), welche die Ligandenbindungsstelle enthält und für das Einschalten der Ligandenbindungsfunktion verantwortlich ist.
  • Es ware vorteilhaft Verfahren und Zusammensetzungen zu entwickeln um die Zeit, die benötigt wird, um Liganden am RORβ zu entdecken, zu reduzieren, solche Verbindungen künstlich herzustellen und solche Verbindungen an Organismen zu verabreichen um physiologische Prozesse, die durch den RORβ-Rezeptor oder irgendeinen seiner Isotypen α oder β gesteuert werden, zu regulieren.
  • Bisher wurde von keinen Kristallen irgendwelcher Orphan-Rezeptoren in der Agonistbindungskonformation berichtet. Die Struktur von USP, dem Insektenortholog von RXR, wurde unlängst veröffentlicht. Obwohl RXRn 9c-RA binden, schafft es USP nicht diesen Liganden zu binden und muss nach wie vor als Orphan-Rezeptor angesehen werden. Juvenile Hormone wurden vorgeschlagen die natürlichen Liganden von USP zu sein, aber die Sache ist noch umstritten. Dennoch, die USP-LBD-Struktur ist eine antagonistartige Konformation. Wir berichten von der Entdeckung der ersten Kristallstruktur der Orphan-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne (RORβ-LBD) in der Agonistbindungskonformation, die die transkriptionsmäßig aktive Form des Nuklearrezeptors darstellt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Polypeptide aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die Aminosäuresequenz enthalten, die an ihrem N-terminalen Ende durch die erste Aminosäure der H1-Helix und an ihrem C-terminalen Ende durch die letzte Aminosäure der H12-Helix begrenzt ist, können hier genannt werden.
  • Polypeptide aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern, dadurch gekennzeichnet, dass sie an ihrem N-terminalen Ende durch eine Aminosäure begrenzt sind, die zwischen den Positionen 1 und 209 des RORβ, α oder γ der Ratte, des Menschen oder der Maus liegt, wie in 3 dargestellt, oder durch eine Aminosäure begrenzt sind, die an entsprechenden Positionen im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen als α, β oder γ und/oder anderer Säuger liegen, und an ihrem C-terminalen Ende von einer Aminosäure begrenzt sind, die zwischen den Positionen 450 und 452 des RORβ, α oder γ der Ratte, des Menschen oder der Maus liegt, wie in 3 dargestellt, oder durch eine Aminosäure begrenzt sind, die an entsprechenden Positionen im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen als α, β oder γ und/oder von anderen Säugern liegen, können hier ebenfalls genannt werden.
  • Einige Polypeptide aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern sind dadurch gekennzeichnet, dass sie an ihrem N-terminalen Ende durch eine Aminosäure begrenzt sind, die zwischen den Positionen 1 und 209 des Nuklearrezeptors RORβ des Menschen oder der Ratte liegt, wie in 3 dargestellt, oder durch eine Aminosäure begrenzt sind, die an entsprechenden Positionen im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen, wie RORα, und RORγ, wie in 3 dargestellt, und/oder anderer Säuger liegt, und an ihrem C-terminalen Ende von einer Aminosäure begrenzt sind, die zwischen den Positionen 450 und 452 Nuklerrezeptors RORβ des Menschen oder der Ratte liegt, wie in 3 dargestellt, oder durch eine Aminosäure begrenzt sind, die an entsprechenden Positionen im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen, wie RORα, und RORγ, und/oder anderer Säuger liegt.
  • Andere Polypeptide aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern sind dadurch gekennzeichnet, dass sie an ihrem N-terminalen Ende durch das Methionin an Position 209 des Nuklearrezeptors RORβ des Menschen oder der Ratte begrenzt sind, wie in 3 dargestellt, oder durch das Methionin oder eine andere Aminosäure wie Leucin, das bzw. die an einer entsprechenden Position im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen, wie RORα, und RORγ, und/oder anderer Säuger liegt, begrenzt sind, und an ihrem C-terminalen Ende durch das Phenylalanin an Position 450 des Nuklearrezeptors RORβ des Menschen oder der Ratte begrenzt sind, wie in 3 dargestellt, oder durch das Phenylalanin oder eine andere Aminosäure begrenzt sind, die an einer entsprechenden Position im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen, wie RORα, und RORγ, und/oder anderen Säuger liegt.
  • Vorteilhafterweise sind die oben definierten Polypeptide dadurch gekennzeichnet, dass zumindest die annähernd 100 bis 200 ersten Aminosäuren des N-terminalen Teils der Sequenz dieses Rezeptors deletiert sind.
  • Die obigen Polypeptide sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie Polypeptide aus dem Nuklearrezeptor ROR sind, wobei die Bindungseigenschaften der Ligandenbindungsdomäne, oder LBD, des Rezeptors erhalten bleiben.
  • Bestimmte Polypeptide aus dem Nuklearrezeptor RORβ von Säugern, wie Menschen oder Ratten, enthalten ein wie oben definiertes Polypeptid, wie die Polypetide, die durch die Aminosäuren begrenzt sind, die an den Positionen 201 bis 459 der Sequenzen von RORβ der Ratte oder des Menschen dargestellt in 3 liegen, wobei diese Polypeptide dadurch gekennzeichnet sind, dass zumindest ein Cystein an Position 454 oder an Position 458 der Aminosäuresequenz des Nuklearrezeptors RORβ, wie in 3 dargestellt, deletiert oder durch eine andere natürliche oder nicht natürliche Aminosäure, wie Alanin oder Serin substituiert ist.
  • Die oben definierten Polypeptide sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass:
    • – die N-terminale Sequenz, die durch die Aminosäuren an Position 1 bis 200 des Rezeptor begrenzt ist, deletiert ist
    • – und die C-terminale Sequenz, die mit der Aminosäure an der Position 450 des Nuklearrezeptors ROTβ des Menschen oder der Ratte beginnt, der in 3 dargestellt ist, oder mit der Aminosäure beginnt, die an einer entsprechenden Position im Nuklearrezeptor ROR anderer Subtypen, wie RORα, RORγ, wie in 3 dargestellt, und/oder anderer Säuger liegt und bevorzugter mit der Aminosäure in Position 451, 452 oder 453 beginnt, deletiert ist.
  • Die Erfindung betrifft Polypeptides aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Fragmente des RORβ, RORα oder RORγ von Ratte, Mensch oder Maus sind, die an ihrem N-terminalen Ende durch die Aminosäure begrenzt sind, die an einer der Positionen 201 bis 209 der ROR-Sequenzen, die in 3 dargestellt sind, liegt, und an ihrem C-terminalen Ende durch die Aminosäure begrenzt sind, die an einer der Positionen 451 oder 452 der ROR-Sequenzen, die in 3 dargestellt sind, liegt.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere oben definierte Polypeptide, die ausgewählt sind aus:
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 209 bis 452 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 2 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 3 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 4 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 5 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 6 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 7 liegen,
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 208 bis 452 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 8 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 9 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 10 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 11 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 12 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 13 liegen,
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 208 bis 451 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 14 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 15 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 16 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 17 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 18 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 19 liegen,
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 209 bis 451 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 20 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 21 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 22 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 23 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 24 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 25 liegen,
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 201 bis 451 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 26 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 27 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 28 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 29 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 30 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 31 liegen,
    • – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 201 bis 452 – der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID Nr. 32 – der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID Nr. 33 – der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID Nr. 34 – der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID Nr. 35 – der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID Nr. 36 – der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID Nr. 37 liegen.
  • Die oben definierten Polypeptide gemäß der Erfindung sind insbesondere durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:
    • – sie haben das Vermögen einen Liganden zu binden und die LBD des Rezeptors ROR zu transaktivieren
    • – sie sind in wässrigen Lösemitteln löslich
    • – sie sind in wässrigen Lösemitteln, speziell durch die Hanging-drop-Dampfdiffusionsmethode kristallisierbar, insbesondere bei ungefähr 4°C.
  • Die Erfindung betrifft auch Molekülkomplexe umfassend ein oben definiertes Polypeptid, wobei das Polypeptid assoziiert ist mit:
    • – einem ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist, wie etwa Stearinsäure, oder ein Antagonist der ROR-LBD ist, wie etwa Retinsäure,
    • – und/oder mit einem Co-Peptid, das eine Sequenz von ungefähr 15–20 Aminosäuren aufweist und das Co-Aktivatormotiv LXXLL oder ein Co-Repressormotiv (I/L)XX(V/I)I oder LXX(H/I)IXXX(I/L) umfasst, worin X für jede Aminosäure, natürlich oder nicht, steht, wie etwa Co-Peptide, ausgewählt aus Fragmenten von transkriptionellen Co-Aktivatoren, speziell solchen der p160-Familie, und insbesondere aus Fragmenten des Co-Aktivators SRC1, wie etwa das Fragment 686–700 von SRC1, oder aus Fragmenten von transkriptionellen Co-Repressoren.
  • Die Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz, die für ein oben definiertes Polypeptid kodiert.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Nukleotidsequenz wie oben definiert, die mit Elementen assoziiert ist, die für die Transkription dieser Sequenz notwendig sind, insbesondere einen Promoter und einen Terminator der Transkription.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, insbesondere ein Plasmid, das eine wie oben definierte Nukleotidsequenz umfasst.
  • Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, wie E. coli, die mit einem wie oben definierten Vektor transformiert wurden.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erhalten eines wie oben definierten Polypeptids, oder eines wie oben definierten Molekülkomplexes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:
    • – einen Schritt zum Transformieren von Wirtszellen mit einer wie oben definierten Nukleotidsequenz unter Verwendung eines wie oben definierten Vektors,
    • – einen Schritt des Kultivierens der wie oben definiert transformierten Wirtszelle in einem geeignet Kulturmedium
    • – und das Gewinnen, und gegebenenfalls die Aufreinigung des erhaltenen rekombinanten Polypeptids oder Molekülkomplexes.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Kristall, der ein entsprechendes Polypeptid oder einen wie oben definierten Molekülkomplex umfasst.
  • Vorzugsweise ist ein wie oben definierter Kristall, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einer Auflösung von mindestens 3 Angström beugt und eine Kristallstabilität innerhalb 5% seiner Elementarzelldimensionen aufweist.
  • Ein bevorzugter wie oben definierter Kristall, ist so, dass die ROR-LBD die folgenden Elementarzelldimensionen in Angström aufweist: a = 52,302 Å, b = 58,490 Å und c = 106,036 Å, α = β = χ =90°, und eine orthorhombische Raumgruppe P212121.
  • Die Erfindung betrifft auch einen wie oben definierten Kristall, wie er erhalten wird, wenn das oben erwähnte Verfahren ausgeführt und es einen Schritt der Kristallisierung der wie oben definierten Polypeptide oder der wie oben definierten Molekülkomplexe in einem wässrigen Lösungsmittel, insbesondere bei 4°C durch die Hanging-drop-Dampfdiffusionsmethode, enthält Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der wie oben definierten Polypeptide, Molekülkomplexe oder Kristalle zur Durchführung:
    • – eines Verfahrens zum Screenen eines ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist oder ein Antagonist des Rezeptors ist, oder zum Screenen von Liganden, die die Struktur des Rezeptors stören und eine Wirkung auf die Rekrutierung von Co-Faktoren (Co-Aktivatoren und Co-Repressoren), und somit auf die Genregulation haben,
    • – oder eines Verfahrens zur Analyse der dreidimensionalen Struktur der Komplexe, die mit diesen Polypeptiden, Molekülkomplexen oder Kristallen und einer bestimmten Verbindung gebildet werden.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die oben genannte Verwendung zum Screenen von Verbindungen, die als Agonist oder Antagonisten von ROR wirken, wobei die Verbindungen im Rahmen der Behandlung von Pathologien nützlich sind, die mit dem zentralen Nervensystem, der retinalen Organisation, der sensoriellen Signalintegration, der Beweglichkeit und der Sterilität zusammenhängen.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screenen eines ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist oder ein Antagonist des Rezeptors ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • – Kontaktieren eines wie oben definierten, vorteilhafter Weise mit einem festen Träger verbundenen Polypeptids, Molekülkomplexes, oder Kristalls, mit der bestimmten Verbindung, die vermutlich ein ROR-LBD-Ligand ist, wobei vorzugsweise das Polypeptid oder der Molekülkomplex oder der Kristall oder der getestete Ligand markiert ist, etwa mit einem fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Marker,
    • – Nachweisen der möglichen Assoziation zwischen dem Polypeptid oder dem Molekülkomplex oder dem Kristall und dem getesteten Liganden durch Messen des verwendeten Markers, speziell nach dem Spülen des Trägers, der im vorhergehenden Schritt verwendet wurde, oder durch Massenspektrometrie unter nichtdenaturierenden Bedingungen.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Analyse der dreidimensionalen Struktur der Komplex, die mit einem wie oben definierten Polypeptid, Molekülkomplex oder Kristall mit einer bestimmten Verbindung gebildet wurden, die vermutlich ein ROR-LBD-Ligand ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • – Kontaktieren des Polypeptids oder des Molekülkomplexes oder des Kristalls mit der bestimmten Verbindung,
    • – Kristallisierung des Komplexes, der zwischen dem Polypeptid oder dem Molekülkomplex oder dem Kristall und dem getesteten Liganden gebildet wurde, speziell mit der Dampfdiffusionsmethode, und dreidimensionale Analyse des Komplexes, speziell mit der Methode des molekularen Ersatzes,
    • – oder dreidimensionale Analyse des Komplexes in löslichem Zustand unter Verwendung einer geeigneten Methode, wie etwa NMR.
  • Die vorliegende Erfindung liefert Kristalle einer RORβ-LBD gebunden an einen Liganden und an ein Co-Aktivatorpeptid, d. h. einen RORβ-LBD/Ligand/Peptid-Komplex. Der Ligand ist Stearinsäure.
  • Der Kristall beugt mit einer Auflösung von 1,9 Å. Der Kristall der RORβ-LBD hat vorzugsweise zumindest 243 Aminosäuren und umfasst vorzugsweise Aminosäuresequenz 208 bis 451 des RORβ der Ratte. Die vorliegende Erfindung liefert auch die Strukturkoordinaten des RORβ-LBD/Ligand/Peptid-Komplexes. Die vollständigen Koordinaten sind in Tabelle A aufgelistet.
  • Die vollständigen Koordinaten von Kristallen einer RORβ-LBD gebunden an einen Liganden und an ein Co-Aktivatorpeptid, d. h. eines RORβ-LBD/Ligand/Peptid-Komplexes, wobei der Ligand Retinsäure ist, sind in Tabelle B aufgelistet.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Bestimmung zumindest eines Teils der dreidimensionalen Struktur von Molekülen oder Molekülkomplexen, die zumindest einige strukturell ähnliche Merkmale zu der RORβ-LBD haben. Es ist bevorzugt, dass diese Moleküle oder Molekülkomplexe zumindest einen Teil der Ligandenbindungsstelle, die durch die Strukturkoordinaten der RORβ-LBD-Aminosäuren Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 und Y446 gemäß Tabelle A oder eine Mutante oder ein Homologes davon, definiert sind, enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch einen Computer mit einer computerlesbaren Form der in Tabelle A enthaltenen Koordinaten.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ferner eine Bindungsstelle für einen RORβ-LBD-Agonisten- oder -Antagonisten-Liganden in der RORβ-LBD, sowie Verfahren zum Designen oder Auswählen von Agonisten, Antagonisten und/oder eines selektiven RORβ-Rezeptor-Modulators (SRORM) des ROR unter Verwendung von Information über die hier offenbarten Kristallstrukturen.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren um Orphan-Rezeptoren zu kristallisieren, welches die Bestimmung der Ligandenbindungstasche, die für die Entdeckung von Agonisten und Antagonisten wichtig ist, erlaubt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 – Stearat
  • 2 – Nukleotid- und Polypeptidsequenzen von RORβ-LBD der Ratte.
  • 3 – Sequenz der RORβ-LBD der Ratte wie geklont mit den sekundären Strukturelemente umrahmt (α-Helices) oder mit einem Pfeil bezeichnet (β-Strang). Sequenzen von RORβ-LBD des Menschen, RORα-LBD der Maus, RORα-LBD des Menschen, RORγ-LBD der Maus und RORγ-LBD des Menschensind ebenfalls angegeben.
  • Zum Vergleich ist die ausgerichtete Sequenz von RARγ-LBD des Menschen angegeben, die verwendet wurde, um die kristallografische Struktur aufzuklären. Reste, die in der Stearatbindung im Falle von RORβ oder in der Bindung von Transretinsäure im Falle von RARγ des Menschen involviert sind, sind fett. Reste innerhalb eines 4 Å Cut-off-Bereiches sind von einen Kreis umgeben.
  • 4 – Bandartige Zeichnung der RORβ-LBD und des Co-Aktivatorpeptids. Das Ligandstearat ist als eine Kugel-Stab-Figur gezeigt.
  • 5 – Differenz (2Fo – Fc) Elektrondichte (1σ).
  • 6: Detail des Wasserstoffbindungsnetzwerks, das mit der ATRA-Karboylatgruppe gebildet wurde.
  • 7: Überlagerung von Stearat und ATRA in der RORβ-LBD-Tasche.
  • 8: Eindungs- und Transaktivierungsversuche für Alltransretinsäure
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die erste Kristallstruktur der RORβ-Ligandenbindungsdomäne (RORβ-LBD) wurde mit einer Auflösung von 1,9 Å bestimmt. Kristalle von RORβ der Ratte wurden aus einer Kristallisationslösung gezüchtet, die 0,1 M TrisHCl pH = 8,0 und PEG 6000 15% enthielt. Röntgenbeugungsmuster der Kristalle haben die Symmetrie und die systematischen Fehlstellen der orthorhombischen Raumgruppe P212121 mit Elementarzelldimensionen a = 52,302 Å, b = 58,490 Å und c = 106,036 Å und einem Molekül pro asymmetrischer Einheit (Mathews Volumen = 2,57 Å3 Da–1). Die Struktur wurde mit der Methode des molekularen Ersatzes unter Verwendung der Struktur der Retinsäure (RARγ-LBD) als Suchmodell bestimmt.
  • Der Komplex der RORβ-LBD mit Stearat und dem Co-Aktivatorpeptid zeigt die Bindungsart des Liganden an den Orphan-Rezeptor in der Agonistenkonformation.
  • Die folgenden Abkürzungen wurden in der Anmeldung verwendet
    • A = Ala = Alanin
    • V = Val = Valin
    • L = Leu = Leucin
    • I = Ile = Isoleucin
    • P = Pro = Prolin
    • F = Phe = Phenylalanin
    • W = Trp = Tryptophan
    • M = Met = Methionin
    • G = Gly = Glycin
    • S = Ser = Serin
    • T = Thr = Threonin
    • C = Cys = Cystein
    • Y = Tye = Tyrosin
    • N = Asn = Asparagin
    • Q = Gln = Glutamin
    • D = Asp = Aspartinsäure
    • E = Glu = Glutaminsäure
    • K = Lys = Lysin
    • R = Arg = Arginin
    • H = His = Histidin
  • "Atomtyp" bezieht sich auf das Element, dessen Koordinaten bestimmt wurden. Die Elemente sind durch den ersten Buchstaben in der Spalte definiert.
  • "X, Y, Z" bestimmen kristallografisch die für jedes Atom bestimmte atomare Position.
  • "B" ist ein thermaler Faktor, der die Bewegung des Atoms um sein atomares Zentrum bemisst.
  • "Occ" ist ein Besetzungsfaktor, der sich auf den Anteil der Moleküle bezieht, in welchem jedes Atom die durch die Koordinaten spezifizierte Position einnimmt. Ein Wert von "1" bedeutet, dass jedes Atom die selbe Konformation, d. h. die gleiche Position, in allen Molekülen des Kristalls hat.
  • Zusätzliche Definitionen werden in der Beschreibung, wo nötig, bekanntgegeben.
  • Der hier beschriebene RORβ-Rezeptor soll jedes Polypeptid enthalten, dass die Aktivität des natürlich vorkommenden RORβ hat. Der RORβ und die RORβ-LBD, welche hier betrachtet werden, enthalten alle Wirbeltier- und Säugetierformen, wie Ratte, Maus, Schwein, Ziege, Pferd, Meerschweinchen, Hase, Affe, Orang-Utan und Mensch. Solche Ausdrücke enthalten auch Polypeptide, die von natürlich vorkommenden Formen von RORβ und RORβ-LBD abweichen, da sie Aminosäuredeletionen, -substitutionen und -additionen haben, die aber die Aktivität von RORβ und RORβ-LBD behalten haben. Die Kristallstruktur der Erfindung enthält vorzugsweise zumindest 25%, bevorzugter zumindest 50%, bevorzugter zumindest 75%, bevorzugter zumindest 90%, bevorzugter zumindest 95%, bevorzugter zumindest 99%, und bevorzugter alle der in Tabelle A aufgelisteten Koordinaten. Der Kristall des RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand/RORβ-LBD-Ligand-Petid der Erfindung hat vorzugsweise die folgenden Elementarzelldimensionen in Angström: a = 52,302 Å b = 58,490 Å und c = 106,036 Å und eine orthorhombische Raumgruppe P212121.
  • Dies umfasst sowohl Agonisten oder Aktivatoren und Antagonisten oder Inhibitoren der RORβ-LBD.
  • Die Peptide, auf die hier Bezug genommen wird (z. B. RORβ, RORβ-LBD und dgl.) können mit irgendwelchen gut bekannten Methoden, einschließlich synthetischer Methoden, wie Festphasen-, Flüssigphasen- und kombinierte Fest/Flüssigphasensynthese; rekombinante DNA-Verfahren, einschließlich cDNA-Klonierung, gegebenenfalls kombiniert mit stellengerichteter Mutagenese; und/oder Aufreinigen der natürlichen Produkte, gegebenenfalls mit enzymatischern Spaltungsverfahren um Fragmente natürlicher vorkommender Proteine herzustellen.
  • Vorteilhafterweise sind die kristallisierbaren Verbindungen, die durch diese Erfindung geschaffen werden der Röntgenkristallografie zugänglich. So liefert diese Erfindung auch die dreidimensionale Struktur des RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand-Peptid-Komplexes, insbesondere des Komplexes aus Ratten-RORβ-LBD mit Stearinsäure.
  • Die dreidimensionale Struktur des RORβ-LBD/Ligand-Komplexes dieser Erfindung ist durch einen Satz Strukturkoordinaten, wie sie in Tabelle A angeführt sind, definiert. Der Ausdruck "Strukturkoordinaten" bezieht sich auf kartesische Koordinaten, die aus mathematischen Gleichungen in Zusammenhang mit den Mustern stammen, die durch Beugung eines monochromatischen Röntgenstrahls, durch die Atome (Streuzentren) eines RORβ/Stearat/Peptid-Komplexes in Kristallform erhalten wurden. Die Beugungsdaten werden verwendet, um eine Elektronendichtekarte der Repetiereinheit des Kristalls zu berechnen. Die Elektronendichtekarten werden dann verwendet, um die Positionen der einzelnen Atome des Komplexes nachzuweisen.
  • Der Fachmann wird verstehen, dass ein Satz Strukturkoordinaten für einen Rezeptor oder einen Rezeptor/Ligand oder Rezeptor/Ligand/Peptid-Komplex oder ein Abschnitt davon ein relativer Satz Punkte ist, der eine Form in drei Dimensionen definiert. So ist es möglich, dass ein vollkommen anderer Satz an Koordinaten eine ähnliche oder idente Form definieren kann. Ferner haben geringe Variationen in den einzelnen Koordinaten wenig Effekt auf die Gesamtform.
  • Die oben genannten Variationen in den Koordinaten können aufgrund mathematischer Bearbeitung der Strukturkoordinaten erzeugt werden. Z. B. könnten die in Tabelle A angeführten Strukturkoordinaten durch kristallografische Permutationen der Strukturkoordinaten, Fraktionalisierung der Strukturkoordinaten; Addition oder Subtraktion ganzer Zahlen zu bzw. von Strukturkoordinatensätzen, Inversion der Strukturkoordinaten oder jegliche Kombination des obigen, bearbeitet werden.
  • Alternativ können Modifikationen in der Kristallstruktur aufgrund von Mutationen, Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren oder andere Änderungen in irgendeiner der den Kristall bildenden Komponenten auch für Variationen in Strukturkoordinaten verantwortlich sein. Wenn solche Variationen innerhalb eines vertretbaren Standardfehlers im Vergleich mit den Originalkoordinaten sind, wird die resultierende dreidimensionale Form als gleich erachtet.
  • Mehrere Computeranalysen sind daher notwendig, um zu bestimmen, ob ein Molekül oder ein Molekülkomplex oder ein Abschnitt davon genügend ähnlich zum gesamten oder Teilen des oben beschriebenen RORβ-Rezeptor/Stearats ist, um als gleich angesehen zu werden. Solche Analysen können in aktuellen Softwareanwendungen, wie der Molecular Similarity Anwendung von Quants (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA) Version 4.1, und wie in der angeschlossenen Benutzungsanleitung beschrieben, durchgeführt werden.
  • Die Molecular Similarity Anwendung erlaubt Vergleiche zwischen verschiedenen Strukturen, verschiedenen Konformationen der gleichen Struktur und verschiedenen Teilen der gleichen Struktur. Das in Molecular Similarity verwendete Verfahren zum Vergleichen von Strukturen ist in vier Schritte aufgeteilt: 1) Laden der zu vergleichenden Strukturen; 2) Definieren der Atomäquivalenzen in diesen Strukturen; 3) Durchführen eines Anpassungsvorgangs; und 4) Analysieren der Ergebnisse.
  • Jede Struktur wird durch einen Namen identifiziert. Eine Struktur wird als das Target (d. h. die fixierte Struktur) identifiziert; alle übrigen Strukturen sind Arbeitsstrukturen (d. h. sich bewegende Strukturen). Da Atomäquivalenz in QUANTA durch Benutzereingabe definiert ist, werden wir für den Zweck dieser Erfindung äquivalente Atome als Protein-Backbone-Atome (N, Cα, C und O) für alle zwischen den zwei verglichenen Strukturen erhaltenen gebliebene Reste definieren. Wir werden auch nur starre Anpassungen in Erwägung ziehen.
  • Wenn ein starres Anpassungsverfahren verwendet wird, wird die Arbeitsstruktur verschoben und gedreht um eine optimale Übereinstimmung mit der Targetstruktur zu erhalten. Der Anpassungsvorgang verwendet einen Algorithmus, der die optimal auf die sich bewegende Struktur aufzubringende Verschiebung und Drehung berechnet, so dass die mittlere quadratische Abweichung der Anpassung bei den festgelegten Paaren äquivalenter Atome ein absolutes Minimum ist. Diese Zahl, ausgedrückt in Angström, wird durch QUANTA angegeben.
  • Zum Zwecke dieser Erfindung, wird jedes Molekül oder jeder Molekülkomplex, der eine mittlere quadratische Abweichung von erhalten gebliebenen Rest-Backbone-Atomen (N, Cα, C, O) von weniger als 1,5 Å hat, wenn es bzw. er über die relevanten Backbone-Atome, die durch die in Tabelle A aufgelisteten Strukturkoordinaten beschrieben sind, gelegt wird, als identisch angesehen. Bevorzugter ist die mittlere quadratische Abweichung kleiner als 1 Å. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthält das Molekül oder der Molekülkomplex zumindest einen Abschnitt der Ligandenbindungsstelle, die durch die Strukturkoordinaten von RORβ-LBD Aminosäuren Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 und Y446 gemäß Tabelle A definiert ist, oder eine Mutante oder ein Homologes dieses Moleküls oder Molekülkomplexes. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sind mit "zumindest ein Abschnitt davon" alle oder irgendwelche Teile der durch die Strukturkoordinaten definierten Ligandenbindungsstelle gemeint. Bevorzugter sind Moleküle oder Molekülkomplexe, die alle oder irgendwelche Teile der Ligandenbindungsstelle, die durch die Strukturkoordinaten von RORβ-LBD Aminosäuren Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 und Y446 gemäß Tabelle A definiert ist, enthalten, oder eine Mutante oder ein Homologes des Moleküls oder des Molekülkomplexes. Mit Mutante oder Homologes des Moleküls oder des Molekülkomplexes ist ein Molekül oder ein Molekülkomplex mit einer Bindungstasche gemeint, die eine mittlere quadratische Abweichung von den Backbone-Atomen der genannten RORβ-LBD-Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Angström hat.
  • Der Ausdruck "mittlere quadratische Abweichung" bedeutet die Quadratwurzel des arithmetischen Mittels der Quadrate von Abweichungen vom Mittel. Es ist ein Weg die Abweichung oder Variation von einer Richtung oder einem Gegenstand auszudrücken. Zum Zwecke dieser vorliegenden Erfindung definiert die "mittlere quadratische Abweichung" die Variation im Backbone eines Proteins oder eines Proteinkomplexes vom relevanten Abschnitt des Backbones des RORβ-Abschnitts des Komplexes, wie durch die Strukturkoordinaten hierin beschrieben. Nachdem die Strukturkoordinaten eines Proteinkristalls bestimmt wurden, sind sie nützlich für das Aufklären der Strukturen anderer Kristalle oder beim Homologie-Modellieren anderer Proteine, insbesondere der beiden Isotypen RORα und γ.
  • So werden gemäß der Erfindung die Strukturkoordinaten eines RORβ/Stearat/Peptid-Komplexes, und insbesondere ein Komplex und Abschnitte davon in einem maschinenlesbaren Speichermedium gespeichert. Solche Daten können für eine Vielfalt von Zwecken verwendet werden, wie Arzneimittelentdeckungen und Röntgenkristallografieanalysen von Proteinkristallen.
  • Entsprechend ist in einer Ausführungsform der Erfindung ein maschinenlesbares Speichermedium vorgesehen, das ein Datenspeichermaterial enthält, das mit den in Tabelle A angegebenen Strukturkoordinaten kodiert ist.
  • Zum ersten Mal erlaubt die vorliegende Erfindung die Verwendung von strukturbasierten oder rationellen Arzneimitteldesigntechniken um chemische Einheiten, einschließlich inhibierender und stimulierender Verbindungen, die geeignet sind an RORβ-LBD oder irgendeinen Abschnitt davon zu binden, zu designen, auszuwählen oder künstlich herzustellen.
  • Eine besonders nützliche Arzneimitteldesigntechnik, die durch diese Erfindung ermöglicht wird ist iteratives Arzneimitteldesign. Iteratives Arzneimitteldesign ist ein Verfahren zur Optimierung von Assoziationen zwischen einem Protein und einer Verbindung durch Bestimmen und Evaluieren der dreidimensionalen Strukturen aufeinanderfolgender Sätze von Protein/Verbindung-Komplexen.
  • Der Fachmann wird diese Assoziation natürlicher Liganden oder Substrate mit den Bindungstaschen ihrer entsprechenden Rezeptoren oder Enzyme in der Basis vieler biologischer Wirkmechanismen erkennen. Der Ausdruck "Bindungstasche", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Bereich eines Moleküls oder eines Molekülkomplexes, der aufgrund seiner Form bevorzugt mit einer anderen chemischen Einheit oder Verbindung assoziiert. Ebenso üben viele Arzneimittel ihre biologischen Effekte durch Assoziation mit den Bindungstaschen von Rezeptoren und Enzymen aus. Solche Assoziationen können mit allen oder irgendwelchen Teilen der Bindungstaschen stattfinden. Ein Verstehen solcher Assoziationen wird helfen zum Design von Arzneimitteln zu führen, die günstigere Assoziationen mit ihrem Targetrezeptor, und daher verbesserte biologische Effekte haben.
  • Daher ist diese Information wertvoll beim Designen von potentiellen Liganden oder Inhibitoren von Rezeptoren, wie Inhibitoren von RORβ.
  • Der Ausdruck "assoziierend mit" bezieht sich auf einen Zustand der Nähe zwischen chemischen Einheiten oder Verbindungen, oder Abschnitten davon. Die Assoziation kann nicht-kovalent – wobei die Nebeneinanderstellung energetisch durch Wasserstoffbindung oder Van-der-Waals- oder elektrostatische Wechselwirkung begünstigt wird – oder sie kann kovalent sein.
  • Bei iterativem Arzneimitteldesign werden Kristalle aus einer Reihe von Protein/Verbindung-Komplexen erhalten und dann werden die dreidimensionalen Strukturen jedes Komplexes aufgeklärt. Ein solcher Ansatz liefert Einblick in die Assoziation zwischen den Proteinen und Verbindungen jedes Komplexes. Diese wird durch Auswählen von Verbindungen mit inhibierender Aktivität, Erhalt von Kristallen dieses neuen Protein/Verbindungs-Komplexes, Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des Komplexes, und Vergleichen der Assoziationen zwischen dem neuen Protein/Verbindung-Komplex und früher aufgeklärten Protein/Verbindung-Komplexen erreicht. Durch Beobachtung, wie Veränderungen in der Verbindung die Protein/Verbindung-Assoziationen beeinflussen, können diese Assoziationen optimiert werden.
  • In einigen Fällen wird iteratives Arzneimitteldesign durchgeführt, indem aufeinanderfolgende Protein/Verbindung-Komplexe gebildet werden und dann jeder neue Komplex kristallisiert wird. Alternativ wird ein vorgeformter Proteinkristall in Gegenwart eines Inhibitors getränkt, wobei ein Protein/Verbindung-Komplex gebildet wird und der Notwendigkeit jeden einzelnen Protein/Verbindung-Komplex zu kristallisieren zuvorgekommen wird.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "getränkt" auf ein Verfahren, in dem der Kristall in eine Lösung gegeben wird, die die Verbindung von Interesse enthält.
  • Die in Tabelle A angegebenen Strukturkoordinaten können auch verwendet werden, um beim Erhalt von Strukturinformation über ein anderes kristallisiertes Molekül oder einen anderen kristallisierten Molekülkomplex zu helfen. Dies kann durch irgendeine einer Anzahl von gut bekannten Techniken, einschließlich der Methode des molekularen Ersatzes, erzielt werden.
  • Die in Tabelle A angegebenen Strukturkoordinaten können auch verwendet werden um zumindest einen Abschnitt der dreidimensionalen Struktur von Molekülen oder Molekülkomplexen zu bestimmen, die zumindest einige strukturell ähnliche Merkmale mit RORβ enthalten. Insbesondere kann strukturelle Information über andere kristallisierte Moleküle oder Molekülkomplexe erhalten werden. Dies kann durch irgendeine einer Anzahl von gut bekannten Techniken, einschließlich der Methode des molekularen Ersatzes, erzielt werden.
  • Daher schafft diese Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur Verwendung der Methode des molekularen Ersatzes, um strukturelle Information über ein kristallisiertes Molekül oder einen kristallisierten Molekülkomplex zu erhalten, dessen Struktur unbekannt ist, enthaltend die Schritte:
    • a) Erzeugen eines Röntgenbeugungsmusters des kristallisierten Moleküls oder des kristallisierten Molekülkomplexes,
    • b) Anwenden zumindest eines Abschnittes der in Tabelle A angeführten Strukturkoordinaten auf das Röntgenbeugungsmuster, um eine dreidimensionale Elektronendichtekarte des Moleküls oder des Molekülkomplexes zu erzeugen dessen Struktur unbekannt ist; und
    • c) Verwenden aller oder eines Teils der in Tabelle A angeführten Strukturkoordinaten um Homologie-Modelle der RORβ-LBD oder irgendeiner anderen nuklearen Orphan- oder Hormon-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne zur erzeugen.
  • Durch Verwenden der Methode des molekularen Ersatzes erhält man alle oder einen Teil der Strukturkoordinaten des durch diese Erfindung geschaffenen RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand/RORβ-LBD-Ligand-Peptid – Komplexes, oder eines Molekülkomplexes, dessen Struktur unbekannt ist, rascher und effizienter als beim Versuch eine solche Information ab initio zu bestimmen.
  • Die Methode des molekularen Ersatzes bringt eine genaue Schätzung der Phasen für eine unbekannte Struktur. Phasen sind Faktoren in Gleichungen, die verwendet werden um Kristallstrukturen aufzuklären, die nicht direkt bestimmt werden können. Genaue Werte für die Phasen durch andere Verfahren als die Methode des molekularen Ersatzes zu erhalten, ist ein zeitaufwändiger Prozess, der iterative Zyklen von Näherungen und Verfeinerungen beinhaltet und die Aufklärung von Kristallstrukturen stark behindert. Wenn jedoch die Kristallstruktur eines Proteins, das zumindest einen homolgen Abschnitt aufweist, aufgeklärt ist, bieten die Phasen der bekannten Struktur eine zufriedenstellende Schätzung der Phasen für die unbekannte Struktur.
  • Somit beinhaltet dieses Verfahren das Erzeugen eines vorläufigen Modells eines Moleküls oder eines Molekülkomplexes, dessen Strukturkoordinaten unbekannt sind, indem der relevante Abschnitt des RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand-Komplexes entsprechend Tabelle A in der Elementarzelle des Kristalls des unbekannten Moleküls oder Molekül-Komplexes so ausgerichtet und angeordnet wird, dass er am besten dem beobachteten Röntgenbeugungsmuster des Kristalls des Moleküls oder des Molekülkomplexes, dessen Struktur unbekannt ist, entspricht. Aus diesem Modell können dann Phasen errechnet werden und mit den beobachteten Röntgenbeugungsmusteramplituden kombiniert werden, um eine Elektronendichtekarte der Struktur, deren Koordinaten nicht bekannt sind, zu erzeugen. Diese kann wiederum irgendwelchen gut bekannten Modellaufbau- und Strukturverfeinerungstechniken unterworfen werden, um eine endgültige, genaue Struktur des unbekannten kristallisierten Moleküls oder Molekül-Komplexes zu liefern [E. Lattman, "Use of the Rotation and Translation Functions", in Meth. Enzymol., 115, pp55-77 (1985); M. G. Rossmann, ed., "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Set., No 13, Gordon & Breach, New York (1972)].
  • Die Struktur irgendeines Abschnittes irgendeines kristallisierten Moleküls oder Molekülkomplexes, die genügend homolog zu irgendeinem Abschnitt des RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand-Komplexes ist, kann durch dieses Verfahren aufgeklärt werden.
  • Die Strukturkoordinaten sind auch insbesondere nützlich, um die Struktur von Kristallen eines RORβ-LBD/RORβ-LBD-Liganden oder RORβ-LBD-Ligand-Peptids in einem Co-Komplex mit einer Vielzahl von chemischen Einheiten aufzuklären. Dieser Ansatz ermöglicht die Bestimmung der optimalen Stellen für Wechselwirkung zwischen chemischen Einheiten, einschließlich einer Wechselwirkung von Kandidat-RORβ-Inhibitoren, mit dem Komplex. Z. B. erlauben von Kristallen gesammelte Daten hoch auflösender Röntgenbeugung, die verschiedenen Arten von Lösungsmitteln ausgesetzt werden, die Bestimmung, wo jede Art an Molekülrest liegt. Dann können kleine Moleküle, die fest an diese Stellen binden, designt und künstlich hergestellt und auf ihre RORβ-Inhibierungs-Aktivität getestet werden.
  • Alle der oben genannten Komplexe können unter Verwendung gut bekannter Röntgenstrahlenbeugungstechniken studiert werden und können gegenüber Röntgendaten mit einer Auflösung von 1,5–3 Å zu einem R-Wert von etwa 0,20 oder weniger unter Verwendung einer Computersoftware, wie X-PLOR [Yale University, 1992, vertrieben durch Molecular Simulations, Inc.; siehe, z. B., Blundell & Johnson, supra; Meth. Enzymol., vol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press (1985)] verfeinert werden. Diese Information kann daher verwendet werden, um bekannte RORβ-Agonisten/Antagonisten zu optimieren und/oder, noch wichtiger, um neue RORβ-Agonisten/Antagonisten zu designen.
  • Entsprechend ist die vorliegende Erfindung auch auf eine Bindungsstelle im RORβ-LBD-Agonist- oder -Antagonist-Ligand gerichtet, in welcher ein Abschnitt des RORβ-LBD-Ligands in Van-der-Waals-Kontakt oder Wasserstoffbindungskontakt mit mindestens einem der folgenden Reste ist:
    Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 und Y446 der RORβ-LBD. Zum Zwecke dieser Erfindung ist mit RORβ-LBD-Bindungsstelle auch gemeint Mutanten oder Homologe davon zu umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform, haben die Mutanten oder Homologe zumindest 25% Identität, bevorzugter 50% Identität, bevorzugter 75% Identität, und am bevorzugtesten 95% Identität zu Resten Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 und Y446 von RORβ-LBD-Bindungsstellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein maschinenlesbares Datenspeichermedium, das ein mit maschinenlesbaren Daten kodiertes Datenspeichermaterial umfasst, wobei die Daten durch die Strukturkoordinaten eines RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand gemäß Tabelle A oder eines Homologen dieses Komplexes definiert sind, wobei dieses Homologe Backbone-Atome umfasst, die eine mittlere quadratische Abweichung von den Backbone-Atomen des Komplexes von nicht mehr als 3,0 Å haben. Vorzugsweise ist das maschinenlesbare Datenspeichermedium gemäß der Erfindung ein solches, worin das Molekül oder der Molekülkomplex durch den Satz von Strukturkoordinaten für RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand gemäß Tabelle A definiert ist, oder ein Homologes dieses Moleküls oder Molekülkomplexes, wobei das Homologe eine mittlere quadratische Abweichung von den Backbone-Atomen der Aminosäuren von nicht mehr als 2,0 Å hat. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das maschinenlesbare Datenspeichermedium ein Datenspeichermedium, welches ein Datenspeichermaterial umfasst, das mit einem ersten Satz maschinenlesbarer Daten kodiert ist, der eine Fourier-Transformation zumindest eines Teils der Strukturkoordinaten für ein RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand/RORβ-LBD-Ligand-Peptid gemäß Tabelle A umfasst; der bei Kombination mit einem zweiten Satz maschinenlesbarer Daten, der ein Röntgenbeugungsmuster eines Moleküls oder Molekülkomplexes unbekannter Struktur umfasst, unter Verwendung einer mit Anleitungen zur Verwendung des ersten Datensatzes und des zweiten Datensatzes programmierten Vorrichtung zumindest einen Teil der Strukturkoordinaten bestimmen kann, die dem zweiten Satz maschinenlesbarer Daten entsprechen, dem ersten Datensatz und dem zweiten Datensatz.
  • Die vorliegende Erfindung gibt auch computerunterstützte Verfahren unter Verwendung dreidimensionaler Modelle des RORβ-Rezeptors an, die auf Kristallen des RORβ-LBD/RORβ-LBD-Ligand-Komplexes basieren. Im Allgemeinen bestimmt das computerunterstützte Verfahren zum Entwerfen eines RORβ-Liganden, welche Aminosäure oder Aminosäuren der RORβ-LBD mit einer chemischen Einheit (zumindest einer) des Liganden interagiert bzw. interagieren, wobei ein dreidimensionales Modell eines kristallisierten Proteins verwendet wird, das RORβ-LBD mit einem gebundenen Liganden umfasst, und eine chemische Modifikation (zumindest eine) der chemischen Einheit selektioniert wird, um eine zweite chemische Einheit mit einer Struktur, welche die Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der zweiten chemischen Einheit im Vergleich zur Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der entsprechenden chemischen Einheit im natürlichen Hormon entweder vermindert oder steigert, zu produzieren.
  • Die erfindungsgemäßen computerunterstützten Verfahren sind zum Entwerfen synthetischer RORβ-Liganden unter Verwendung solcher Kristalle und dreidimensionaler Strukturinformation zur Erzeugung synthetischer Liganden, welche die konformationellen Änderungen der RORβ-LBD modulieren. Diese computerunterstützten Verfahren sind besonders nützlich zum Entwerfen eines Antagonisten oder partiellen Agonisten für RORβ, wobei der Antagonist oder partielle Agonist eine erweiterte Einheit aufweist, die jedwedes von einer Anzahl Ligand-induzierter molekularer Ereignisse verhindert, die den Einfluss des Rezeptors auf die Regulation der Genexpression ändern, wie das Verhindern der normalen Koordination der Aktivierungsdomäne, die bei einem natürlich vorkommenden Liganden oder anderen Liganden, die den natürlich vorkommenden Liganden nachahmen, wie einem Agonisten, beobachtet wird. Wie hier beschrieben wird, sind synthetische Liganden des RORβ-Rezeptors zum Modulieren der RORβ-Aktivität in einer Vielzahl medizinischer Zustände nützlich.
  • Es ist bekannt, dass RORβ verschiedene Domänen aufweist, wie folgt:
    • 1) eine variable aminoterminale Domäne;
    • 2) eine hochkonservierte DNA-Bindungsdomäne (DBD); und
    • 3) eine weniger konservierte carboxylterminale Ligandenbindungsdomäne (LBD).
  • Diese Modularität erlaubt, dass verschiedene Domänen jedes Proteins separat verschiedene Funktionen erfüllen, obwohl die Domänen einander beeinflussen können. Die separate Funktion einer Domäne wird üblicherweise beibehalten, wenn eine bestimmte Domäne vom Rest des Proteins isoliert wird. Unter Verwendung herkömmlicher Techniken der Proteinchemie kann eine modulare Domäne manchmal vom Ausgangsprotein abgetrennt werden. Unter Verwendung herkömmlicher Techniken der Molekularbiologie kann üblicherweise jede Domäne getrennt exprimiert werden, wobei ihre ursprüngliche Funktion intakt bleibt, oder es können Chimären zweier unterschiedlicher nuklearer Rezeptoren konstruiert werden, wobei die Chimären die Eigenschaften der individuellen funktionalen Domänen der jeweiligen nuklearen Rezeptoren, aus denen die Chimären erzeugt wurden, beibehalten.
  • Aminoterminale Domäne
  • Die aminoterminale Domäne ist die am wenigsten konservierte von den drei Domänen. Diese Domäne ist in die transkriptionelle Aktivierung involviert und in manchen Fällen kann ihre Einmaligkeit die selektive Rezeptor-DNA-Bindung und Aktivierung von Zielgenen durch spezifische Rezeptor-Isoformen bestimmen. Diese Domäne kann synergistische und antagonistische Wechselwirkungen mit den Domänen der LBD zeigen. Beispielsweise zeigen Studien mit mutierten und/oder deletierten Rezeptoren positives Zusammenwirken der amino- und carboxyterminalen Domänen.
  • In manchen Fällen beseitigt die Deletion einer dieser Domänen die transkriptionellen Aktivierungsfunktionen des Rezeptors.
  • DNA-Bindungsdomäne
  • Die DBD ist die am stärksten konservierte Domäne. Die DBD enthält zwei senkrecht orientierte α-Helices, die sich von der Basis des ersten und zweiten Zinkfingers erstrecken. Die zwei Zinkfinger wirken zusammen mit Nicht-Zinkfinger-Resten, um nukleare Rezeptoren auf spezifische Zielorte auf der DNA zu richten und für das Alignment von Rezeptor-Homodimer- zu Heterodimer-Interfaces. Verschiedene Aminosäuren in DBD beeinflussen den Abstand zwischen zwei Halbseiten für die Rezeptordimerbindung.
  • Ligandenbindungsdomäne
  • Die LBD ist die am zweitstärksten konservierte Domäne. Während die Integrität mehrerer verschiedener LBD-Subdomänen für die Ligandenbindung wichtig ist, behalten trunkierte Moleküle, die nur die LBD enthalten, die normale Ligandenbindungsaktivität bei. Diese Domäne hat auch an anderen Funktionen teil, einschließlich der Dimerisierung, nuklearen Translokation und transkriptionellen Aktivierung. Wichtig ist, dass diese Domäne den Liganden bindet und Ligand-induzierten konformationellen Änderungen unterliegt, wie hier im Detail ausgeführt wird.
  • Wie hier beschrieben wird, kann die LBD von RORβ exprimiert, kristallisiert, ihre dreidimensionale Struktur mit einem gebundenen Liganden bestimmt (unter Verwendung von Kristalldaten vom selben Rezeptor oder einem anderen Rezeptor oder einer Kombination davon) und computerunterstützte Verfahren verwendet werden, um Liganden für die LBD zu entwerfen, insbesondere Liganden, die eine Extensionseinheit enthalten, welche die Aktivierungsdomäne von RORβ koordiniert.
  • Wenn einmal ein mittels Computer entworfener Ligand (computationally designed ligand, CDL) synthetisiert ist, kann er unter Verwendung von Assays geprüft werden, um seine Aktivität als Agonist, partieller Agonist oder Antagonist und die Affinität zu bestimmen, wie hier beschrieben. Nach solchen Tests können die CDLs weiter verfeinert werden, indem LBD-Kristalle mit einem an die LBD gebundenen CDL generiert werden. Die Struktur des CDL kann dann weiter verfeinert werden, indem hier beschriebene Verfahren der chemischen Modifizierung für dreidimensionale Modelle verwendet werden, um die Aktivität oder die Affinität des CDL zu verbessern und CDLs der zweiten Generation mit verbesserten Eigenschaften zu machen, wie jenen eines Superagonisten oder -antagonisten.
  • Typischerweise wird RORβ-LBD für die Kristallisation zur Homogenität gereinigt. Die Reinheit von RORβ-LBD wird mittels SDS-PAGE und Massenspektrometrie gemessen. Gereinigter RORβ für die Kristallisation sollte mindestens 97,5% rein oder 97,5% rein, vorzugsweise mindestens 99,0% rein oder 99,0% rein, bevorzugter mindestens 99,5% rein oder 99,5% rein sein.
  • Anfangs kann die Reinigung des Rezeptors nach herkömmlichen Verfahren erhalten werden, wie Affinitätschromatographie und Gelfiltrationschromatographie.
  • Um eine höhere Reinheit für verbesserte Kristalle von RORβ zu erreichen, ist eine Liganden-Shift-Reinigung des nuklearen Rezeptors unter Verwendung einer Säule wünschenswert, welche den Rezeptor gemäß der Ladung trennt, wie eine Zonenaustausch- oder hydrophobe Interaktionssäule, und dann die Bindung des eluierten Rezeptors mit einem Liganden, insbesondere einem Agonisten. Der Ligand induziert eine Änderung in der Oberflächenladung des Rezeptors, sodass bei erneutem Chromatographieren auf derselben Säule der Rezeptor dann an der Position des ligandengebundenen Rezeptors eluiert und durch den ursprünglichen Säulendurchlauf mit dem ligandenfreien Rezeptor entfernt wird. üblicherweise werden Sättigungskonzentrationen von Liganden in der Säule verwendet, und das Protein kann mit dem Liganden vorinkubiert werden, bevor über die Säule geschickt wird.
  • Einige entwickelte Verfahren beinhalten die Konstruktion eines "Tag" wie Histidin, das an das Ende des Proteins gebracht wird, wie an den Aminoterminus, und dann die Verwendung einer Cobalt-Chelatsäule zur Reinigung, Chaga, G., Biotech. Appl. Biochem. 29: 13811–13814 (1991), das hier durch Bezugnahme zum Inhalt gemacht wird.
  • Um die dreidimensionale Struktur einer RORβ-LBD zu bestimmen, ist die Co-Kristallisation der LBD mit einem entsprechenden LBD-Liganden wünschenswert.
  • Typischerweise wird gereinigte RORβ-LBD bei einer Sättigungskonzentration des Liganden bei einer Temperatur, welche die Integrität des Proteins bewahrt, äquilibriert. Die Ligandenäquilibrierung kann zwischen 2 und 37°C erfolgen, obwohl der Rezeptor dazu tendiert, im 2–20°C-Bereich stabiler zu sein.
  • Wenn der Ligand jedoch unbekannt ist, ist es möglich, die RORβ-LBD mit einem zufälligen Liganden zu co-kristallisieren, der vom heterologen Expressionssystem kommt, i. e. Escherichia coli, und durch begleitende Zugabe eines Co-Aktivatorpeptids.
  • Vorzugsweise werden Kristalle nach dem Hanging-drop-Verfahren hergestellt. Geregelte Temperaturführung ist wünschenswert, um die Stabilität und Qualität des Kristalls zu verbessern. Temperaturen zwischen 4 und 25°C werden im Allgemeinen verwendet, und oft ist es vorzuziehen, die Kristallisation über einen Temperaturbereich zu testen. Es ist bevorzugt, Kristallisationstemperaturen von 18°C bis 25°C, bevorzugter 20 bis 23°C und am bevorzugtesten 22°C zu verwenden.
  • Liganden, die mit RORβ interagieren, können als Agonisten, Antagonisten und partielle Agonisten fungieren, basierend darauf, welche Ligand-induzierten konformationellen Änderungen stattfinden.
  • Agonisten induzieren Änderungen in Rezeptoren, die sie in eine aktive Konformation bringen, welche ermöglicht, dass sie die Transkription beeinflussen, entweder positiv oder negativ. Es kann mehrere verschiedene Ligand-induzierte Änderungen in der Konformation des Rezeptors geben.
  • Antagonisten binden an Rezeptoren, induzieren aber keine konformationellen Änderungen, die zur transkriptionell aktiven Form des Rezeptors oder zu physiologisch relevanten Konformationen führen. Die Bindung eines Antagonisten kann auch die Bindung blockieren und daher die Wirkungen eines Agonisten.
  • Partielle Agonisten binden an Rezeptoren und induzieren nur einen Teil der durch Agonisten induzierten Änderungen in den Rezeptoren. Die Unterschiede können qualitativ oder quantitativ sein. Ein partieller Agonist kann somit einige der von Agonisten induzierten Konformationsänderungen bewirken, andere aber nicht, oder er kann bestimmte Änderungen nur in einem beschränkten Ausmaß induzieren.
  • Wie hier beschrieben wird, ist der ligandenfreie Rezeptor in einer Konfiguration, die entweder inaktiv ist, etwas Aktivität oder Repressoraktivität hat. Die Bindung von Agonistliganden induziert konformationelle Änderungen im Rezeptor, sodass der Rezeptor aktiver wird, entweder um die Expression der Gene zu stimulieren oder zu reprimieren. Die Rezeptoren können auch nicht-genomische Wirkungen haben, wobei einige der bekannten Typen von Änderungen und/oder Sequenzen davon hier angeführt sind.
  • Die Ligandenbindung durch den Rezeptor ist ein dynamischer Prozess, der die Rezeptorfunktion reguliert, indem eine geänderte Konformation induziert wird.
  • Die dreidimensionale Struktur des ligandengebundenen RORβ-Rezeptors hilft sehr bei der Entwicklung neuer synthetischer RORβ-Liganden. Außerdem ist RORβ insgesamt gut geeignet für moderne Verfahren, einschließlich dreidimensionaler Strukturaufklärung und kombinatorischer Chemie, wie in EP 335 628 , US 5 463 564 offenbart, die hier durch Bezugnahme zum Inhalt gemacht werden. Computerprogramme, die kristallographische Daten bei der Durchführung dieser Erfindung verwenden, ermöglichen das rationelle Entwerfen von Liganden für RORβ.
  • Programme wie RASMOL können mit den Atomkoordinaten von Kristallen verwendet werden, die durch Ausführen der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, oder zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, indem dreidimensionale Modelle erzeugt und/oder die in die Ligandenbindung involvierten Strukturen bestimmt werden. Computerprogramme wie INSIGHT und GRASP erlauben die weitere Manipulation und die Möglichkeit der Einführung neuer Strukturen. Ferner können High-Throughput-Eindungs- und Bioaktivitäts-Assays unter Verwendung von gereinigtem rekombinanten Protein und moderner Reportergen-Transkriptions-Assays, die hier beschrieben und auf dem Gebiet bekannt sind, ersonnen werden, um die Aktivität eines CDL zu verfeinern.
  • Allgemein umfasst das computerunterstützte Verfahren zum Entwerfen eines synthetischen RORβ-Liganden zwei Schritte:
    • 1) Bestimmung, welche Aminosäure oder Aminosäuren von RORβ-LBD mit einer ersten chemischen Einheit (zumindest einer) des Liganden interagiert bzw. interagieren, wobei ein dreidimensionales Modell eines kristallisierten Proteins verwendet wird, das eine RORβ-LBD mit einem gebundenen Liganden umfasst; und
    • 2) Auswählen einer chemischen Modifikation (zumindest einer) der ersten chemischen Einheit, um eine zweite chemische Einheit mit einer Struktur, welche die Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der zweiten chemischen Einheit im Vergleich zur Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der ersten chemischen Einheit entweder vermindert oder steigert, zu produzieren.
  • Vorzugsweise wird das Verfahren durchgeführt, wobei das dreidimensionale Modell durch Vergleich isomorpher Ligandenderivate erzeugt wird, um eine verbesserte Phasierung zu erzeugen. Es ist auch bevorzugt, wo die Selektion die erste chemische Einheit verwendet, die mit zumindest einer der interagierenden Aminosäuren Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 oder Y446 interagiert.
  • Wie hier gezeigt wird, bilden interagierende Aminosäuren Kontakte mit dem Liganden und das Zentrum der Atome der interagierenden Aminosäuren ist üblicherweise 2 bis 4 Angstrom vom Zentrum der Atome des Liganden entfernt. Im Allgemeinen werden diese Abstände mittels Computer bestimmt, wie hier und in Mc Ree 1993 erörtert, Abstände können jedoch manuell bestimmt werden, wenn das dreidimensionale Modell einmal gemacht ist. Siehe auch Renaud et al., Nature 378, 681–689 (1995), hinsichtlich stereochemischer Figuren dreidimensionaler Modelle.
  • Häufiger sind die Atome des Liganden und die Atome der interagierenden Aminosäuren 3 bis 4 Angstrom entfernt. Die Erfindung kann ausgeführt werden, indem Schritt 1 und 2 wiederholt werden, um die Passung des Liganden zur LBD zu verfeinern und um einen besseren Liganden zu bestimmen, wie einen Agonisten. Das dreidimensionale Modell von RORβ kann in zwei Dimensionen repräsentiert werden, um zu bestimmen, welche Aminosäuren den Liganden kontaktieren, und um eine Position auf dem Liganden für chemische Modifizierung und Änderung der Wechselwirkung mit einer speziellen Aminosäure, verglichen mit jener vor der chemischen Modifizierung, auszuwählen. Die chemische Modifizierung kann durchgeführt werden, indem ein Computer verwendet wird, manuell unter Verwendung einer zweidimensionalen Repräsentation des dreidimensionalen Modells oder durch chemisches Synthetisieren des Liganden. Der Ligand kann nach der chemischen Modifizierung des Liganden zur Schaffung eines neuen Liganden auch mit entfernten Aminosäuren interagieren. Entfernte Aminosäuren sind im Allgemeinen vor der chemischen Modifizierung nicht in Kontakt mit dem Liganden. Eine chemische Modifizierung kann die Struktur des Liganden ändern, um einen neuen Liganden zu machen, der mit einer entfernten Aminosäure interagiert, üblicherweise zumindest 4,5 Angstrom vom Liganden entfernt, vorzugsweise wobei die erste chemische Einheit 6 bis 12 Angstrom von einer entfernten Aminosäure weg ist. Oft werden entfernte Aminosäuren die Oberfläche der Bindungsaktivität für den Liganden nicht belegen, sie sind zu weit weg von dem Liganden, um Teil einer Tasche oder Bindungskavität zu sein. Die Wechselwirkung zwischen einer LBD-Aminosäure und einem Atom eines LBD-Liganden kann durch jede in der Natur beschriebene Kraft oder Anziehung erfolgen. Üblicherweise ist die Wechselwirkung zwischen dem Atom der Aminosäure und dem Liganden das Ergebnis einer Wasserstoffbrückenbindung, einer Ladungswechselwirkung, einer hydrophoben Wechselwirkung, Van-der-Waals-Wechselwirkung oder Dipolwechselwirkung. Im Falle der hydrophoben Wechselwirkung ist es anerkannt, dass sie nicht per se eine Wechselwirkung zwischen der Aminosäure und dem Liganden ist, sondern das übliche Ergebnis, zum Teil, der Abstoßung von Wasser oder einer anderen hydrophilen Gruppe von einer hydrophoben Oberfläche. Die Verminderung oder Erhöhung der Wechselwirkung der LBD und eines Liganden kann gemessen werden, indem die Bindungsenergien berechnet oder untersucht werden, computerunterstützt oder unter Verwendung thermodynamischer oder kinetischer Verfahren, wie auf dem Gebiet bekannt ist.
  • Chemische Modifizierungen verstärken oder vermindern oft die Wechselwirkungen eines Atoms einer LBD-Aminosäure und eines Atoms eines LBD-Liganden. Sterische Hinderung ist ein übliches Mittel zur Änderung der Wechselwirkung der LBD-Kavität mit der Aktivierungsdomäne.
  • Die vorliegende Erfindung gibt auch Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die RORβ-Aktivität modulieren, an. Es können verschiedene Verfahren oder Kombinationen davon verwendet werden, um diese Verbindungen zu identifizieren. Beispielsweise können Testverbindungen modelliert werden, die räumlich in RORβ-LBD passen, wie durch die Strukturkoordinaten gemäß Tabelle A definiert, oder unter Verwendung eines dreidimensionalen Strukturmodells von RORβ-LBD, mutiertem RORβ-LBD oder RORβ-LBD-Homologem oder einem Teil davon.
  • Strukturkoordinaten der Ligandenbindungsstelle, insbesondere Aminosäuren Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 oder Y446, können auch verwendet werden, um strukturelle und chemische Merkmale zu identifizieren. Identifizierte strukturelle oder chemische Merkmale können dann verwendet werden, um Verbindungen als potenzielle RORβ-Modulatoren zu entwerfen oder auszuwählen. Unter strukturellen und chemischen Merkmalen versteht man, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Bildung von Wasserstoffbrücken, Ladungswechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung und Dipolwechselwirkung. Alternativ oder gemeinsam kann das dreidimensionale Strukturmodell oder die Ligandenbindungsstelle verwendet werden, um Verbindungen als potenzielle RORβ-Modulatoren zu entwerfen oder auszuwählen. Als potenzielle RORβ-Modulatoren identifizierte Verbindungen können dann synthetisiert und in einem Assay, der durch die Bindung einer Testverbindung an die RORβ-LBD charakterisiert ist, gescreent werden. Beispiele für Assays, die beim Screening potenzieller ROR-Modulatoren nützlich sind, beinhalten, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Screening in silico, in-vitro-Assays und High-Throughput-Assays. Schließlich können diese Verfahren auch die Modifizierung oder den Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren von RORβ-LBD beinhalten, wie Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, I338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 oder Y446 von RORβ-LBD gemäß Tabelle A.
  • Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung kann als computerunterstütztes Verfahren zum Entwerfen eines ROR-Antagonisten aus einem ROR-Rezeptoragonisten beschrieben werden, umfassend:
    • 1) Bestimmung einer Struktur einer Molekül-Erkennungsdomäne des Agonisten unter Verwendung eines dreidimensionalen Modells eines kristallisierten Proteins, das eine ROR-LBD umfasst, und
    • 2) Selektion mindestens einer chemischen Modifizierung des Agonisten, die eine Ligandenstruktur bereitstellt, die sich über eine Bindungsstelle für den Agonisten hinaus erstreckt und in Richtung mindestens einer Proteindomäne, die bei der biologischen Funktion von RORβ wichtig ist.
  • Ein anderes bevorzugtes Verfahren der Erfindung kann als computerunterstütztes Verfahren zum Entwerfen eines selektiven RORβ-Rezeptor-Modulators beschrieben werden, wie eines ROR-Rezeptor-Superagonisten oder -antagonisten, umfassend:
    • 1) Bestimmung mindestens einer interagierenden Aminosäure einer RORβ-LBD, die mit mindestens einer ersten chemischen Einheit des Liganden interagiert, unter Verwendung eines dreidimensionalen Modells eines kristallisierten Proteins, das RORβ-LBD mit einem gebundenen Liganden umfasst, und
    • 2) Selektion mindestens einer chemischen Modifizierung der ersten chemischen Einheit zur Herstellung einer zweiten chemischen Einheit mit einer Struktur, welche die Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der zweiten chemischen Einheit Im Vergleich zu Wechselwirkung zwischen der interagierenden Aminosäure und der ersten chemischen Einheit vermindert oder steigert.
  • Fachleute auf dem Gebiet werden jedoch anhand dieser Offenbarung verstehen, dass andere strukturbasierte Entwurfsmethoden verwendet werden können. Verschiedene computerunterstützte strukturbasierte Design-Verfahren wurden auf dem Gebiet offenbart.
  • Beispielsweise ist eine Anzahl von Computermodellierungssystemen verfügbar, worin die Sequenz der RORβ-LBD und die RORβ-LBD-Struktur (i. e. Atomkoordinaten von RORβ-LBD und/oder die Atomkoordinaten der Ligandenbindungsstelle, Bindungs- und Öffnungswinkel und Abstände zwischen Atomen an der aktiven Stelle, wie in der Tabelle A angegeben) eingegeben werden können. Dieses Computersystem generiert dann die strukturellen Details der Stelle, an der ein potenzieller RORβ-Modulator bindet, sodass die komplementären Strukturdetails der potenziellen Modulatoren bestimmt werden können. Der Entwurf basiert in diesen Modellierungssystemen im Allgemeinen auf der Verbindung, die in der Lage ist, mit RORβ-LBD physikalisch oder strukturell zu assoziieren. Ferner muss die Verbindung in der Lage sein, eine Konformation einzunehmen, welche die Assoziation mit RORβ-LBD erlaubt. Einige Modellierungssysteme schätzen den potenziellen Hemm- oder Bindungseffekt eines potenziellen ROR-Modulators vor der tatsächlichen Synthese und Testung ab.
  • Verfahren zum Screenen chemischer Einheiten oder Fragmente hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Assoziation mit RORβ-LBD sind gut bekannt. Diese Verfahren beginnen oft mit einer visuellen Untersuchung der aktiven Stelle auf dem Computerbildschirm. Ausgewählte Fragmente oder chemische Einheiten werden dann mit der RORβ-LBD angeordnet. Das Docking erfolgt unter Verwendung einer Software wie QUANTA und SYBYL, gefolgt von Energieminimierung und Molekulardynamik mit Standard-Molekülmechanik-Kraftfeldern wie CHARMM und AMBER. Beispiele für Computerprogramme, welche die Selektion des chemischen Fragments oder chemischer Einheiten unterstützen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen GRID (Goodford, P. J. J. Med. Chem. 1985, 28: 849–857), AUTODOCK (Goodsell, D. S. und Olsen, A. J. Proteins, Structure, Functions, and Genetics 1990, 8: 195–202) und DOCK (Kunts et al., J. Mol. Biol. 1982, 161: 269–288) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
  • Nach der Selektion bevorzugter chemischer Einheiten oder Fragmente kann ihre Beziehung zueinander und zu RORβ-LBD visualisiert und dann in einen einzigen potenziellen Modulator zusammengesetzt werden. Programme, die zum Zusammenbauen der individuellen chemischen Einheiten nützlich sind, schließen CAVEAT (Bartlett et al. Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems Special Publication, Royal Chem. Soc. 78, 00.182-196 (1989) und 3D Datenbanksysteme (Martin, Y. C. J. Med. Chem. 1992, 35: 2145–2154) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
  • Alternativ können Verbindungen de novo entworfen werden, indem eine leere aktive Stelle verwendet wird oder optional ein Teil eines bekannten Inhibitors inkludiert wird. Verfahren für diese Art von Design schließen LUDI (Bohm H-J, J. Corp. Aid. Molec. Design 1992, 6: 61–78) und LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis, MO) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen RORβ-LBD-selektiven RORβ-Modulator (SRORM), insbesondere einen Agonisten oder Antagonisten, der nach einem computerunterstützten Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung einer mit ROR in Zusammenhang stehenden Erkrankung, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines durch ein computerunterstütztes Verfahren gemäß der Erfindung identifizierten Antagonisten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung einer mit ROR in Zusammenhang stehenden Erkrankung, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines durch ein computerunterstütztes Verfahren gemäß der Erfindung identifizierten Agonisten.
  • Als Agonisten, Antagonisten oder SRORMs mit den hier offenbarten Verfahren identifizierte Verbindungen, die aktiv sind, wenn sie oral verabreicht werden, können als Flüssigkeiten, z. B. Sirupe, Suspensionen oder Emulsionen, Tabletten, Kapseln und Pastillen formuliert werden. Eine flüssige Zusammensetzung besteht im Allgemeinen aus einer Suspension oder Lösung der Verbindung in (einem) geeigneten flüssigen Träger(n), z. B. Ethanol, Glycerin, Sorbit, nichtwässriges Lösemittel wie Polyethlenglycol, Öle oder Wasser, mit einem Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Tensid, Netzmittel, Aromastoff oder Färbemittel.
  • Alternativ kann eine flüssige Formulierung aus einem rekonstituierbaren Pulver bereitet werden. Beispielsweise kann ein Wirkstoff, Suspendiermittel, Saccharose und Süßungsmittel enthaltendes Pulver mit Wasser rekonstituiert werden, um eine Suspension zu bilden; ein Sirup kann aus einem einen Wirkstoff, Saccharose und ein Süßungsmittel enthaltenden Pulver hergestellt werden. Eine Zusammensetzung in Form einer Tablette kann aus einem einen Wirkstoff, Saccharose und ein Süßungsmittel enthaltenden Pulver hergestellt werden. Eine Zusammensetzung in Form einer Tablette kann unter Verwendung eines geeigneten pharmazeutischen Trägers (geeigneter pharmazeutischer Träger), der (die) routinemäßig zur Herstellung fester Zusammensetzungen verwendet wird (werden), hergestellt werden. Beispiele für solche Träger schließen ein: Magnesiumstearat, Stärke, Lactose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Bindemittel, z. B. Polyvinylpyrrolidon. Die Tablette kann auch mit einer gefärbten Filmbeschichtung versehen sein oder es kann Farbe als Teil des (der) Träger(s) enthalten sein. Ferner kann der Wirkstoff in einer Dosisform mit verzögerter Freisetzung als Tablette formuliert werden, die eine hydrophile oder hydrophobe Matrix aufweist. Eine Zusammensetzung in Form einer Kapsel kann nach Routineverfahren der Verkapselung hergestellt werden, beispielsweise indem Wirkstoff und Exzipienten in eine Hartgelatinekapsel eingebracht werden. Alternativ kann eine halbfeste Matrix aus Wirkstoff und Polyethylenglycol mit hohem Molekulargewicht hergestellt und in eine Hartgelatinekapsel gefüllt werden; oder eine Lösung eines Wirkstoffs in Polyethylenglycol oder eine Suspension in Speiseöl, z. B. flüssigem Paraffin oder fraktioniertem Kokosnussöl, kann hergestellt und in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden. Nach den hier beschriebenen Verfahren identifizierte Verbindungen, die aktiv sind, wenn sie parenteral verabreicht werden, können für die intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung formuliert werden. Eine typische Zusammensetzung für die intramuskuläre Verabreichung besteht aus einer Suspension oder Lösung eines Wirkstoffs in einem Öl, z. B. Arachisöl oder Sesamöl. Eine typische Zusammensetzung für die intravenöse Verabreichung besteht aus einer sterilen isotonischen wässrigen Lösung, die beispielsweise Wirkstoff, Dextrose, Natriumchlorid, ein Cosolvens, z. B. Polyethylenglycol, und gegebenenfalls einen Chelatbildner, z. B. Natriummetabisulfit, enthält.
  • Alternativ kann die Lösung gefriergetrocknet und dann mit einem geeigneten Lösemittel unmittelbar vor der Verabreichung rekonstituiert werden. Identifizierte Verbindungen, die bei rektaler Verabreichung aktiv sind, können als Suppositorien formuliert werden. Eine typische Suppositorienformulierung besteht im Allgemeinen aus Wirkstoff mit einem Binde- und/oder Gleitmittel wie Gelatine oder Kakaobutter oder einem anderen niedrigschmelzenden pflanzlichen oder synthetischen Wachs oder Fett. Identifizierte Verbindungen, die bei topischer Verabreichung aktiv sind, können als transdermale Zusammensetzungen formuliert werden. Solche Zusammensetzungen schließen z. B. eine Unterlagsschicht, ein Wirkstoffreservoir, eine Regelungsmembran, eine Außenlage und einen Kontaktklebstoff ein. Eine typische Tagesdosis variiert je nach den individuellen Bedürfnissen, dem zu behandelnden Zustand und dem Verabreichungsweg. Geeignete Dosen liegen im allgemeinen Bereich von 0,001 bis 10 mg/kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen aber nicht als deren Einschränkung ausgelegt werden.
  • Beispiele
  • Klonieren, Expression und Reinigung der RORβ-Ligandenbindungsdomäne
  • Eine cDNA zum Exprimieren der Ligandenbindungsdomäne der RORβ-LBD der Ratte (RORβ-LBD) wurde unter Verwendung de pet15b-Vektors (Novagen) konstruiert, um einen N-terminalen Polyhistidin-Tag und eine Thrombin-Spaltstelle einzuschließen. E. coli BL21 (DE3) Zellen wurden in IBM bei 37°C zu einer OD von 0,6 kultiviert und mit 0,8 mM IPTG induziert. Die Inkubation wurde bei 16°C über Nacht aufrechterhalten. Die Zellen wurden geerntet und bei –20°C gelagert. insgesamt wurden 6–9 mg rekombinante RORβ-LBD von einem 6-Gramm-Zellpellet nach Sonifikation und Chromatographie auf einem Cobalt-Chelat-Harz isoliert. Mit Polyhistidin-Tag versehene RORβ-LBD mit etwa 90% Reinheit eluierte bei einem Gradienten von 0 bis 1 M Imidazol. Eine Gelfiltration erfolgte mit Superdex S-200 Hiload 16:60 von Pharmacia. Mit Polyhistidin-Tag versehene rRORβ-LBD mit mehr als 95% Reinheit und Homogenität, wie mittels SDS-PAGE überprüft wurde, wurde auf 5,8 mg/ml in 20 mM TnsHCl pH = 8,5, 5 mM DTT, 2 mM Chaps und 100 mM NaCl konzentriert.
  • Kristallisation
  • Der RORβ-LBD-Stearatkomplex wurde bei 22°C mittels Dampfdiffusion im „Hanging-drop"-Modus kristallisiert. In den Kristallisationsversuchen wurde das Protein ohne weitere Reinigung verwendet und mit einem 3-molaren Überschuss an SRC-1686-700(RHKILHRLLQEGSPS) NR-interagierender Peptid-Co-Aktivatorsequenz co-kristallisiert. Die Zugabe des Peptids war entscheidend für den Erhalt der Kristalle. In dem anfänglichen Versuch zur Ermittlung der Kristallisationsbedingungen wurde eine „Sparse-Matrix-Screen"-Kristallisation mit einem „Home-Screen" durchgeführt. Für jeden Kristallisationsversuch wurde ein 4-μl-Tropfen bereitet, indem 2 μl gereinigtes Protein (5,8 mg/ml) mit einem gleichen Volumen Reservoirlösung gemischt wurde. Das Reservoir enthielt 500 μl Präzipitationslösung. Ein Kristall mit den Maßen 110 × 60 × 30 mm bei 22°C in PEG 6000 15% und 100 mM TrisHCl bei pH = 8,0 wuchs innerhalb von etwa 2 Wochen. Dieser Kristall wurde in einem ersten Durchgang des Datensammelns (wie nachstehend beschrieben) verwendet.
  • Datensammlung und -reduktion
  • Die Kristalle wurden durch Äquilibrierung in 15% PEG 6000 bei pH 8,0, das 15% Glycerol enthielt, kryogeschützt und dann in flüssigem Ethan bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff schockgefroren. Röntgenbeugungsdaten wurden bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff von einem gefrorenen Einkristall an der ID14-3 Beamline am ESRF Grenoble, Frankreich, gesammelt. Die Kristalle beugten die Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösungsgrenze von 1,9 Å. Alle Daten wurden integriert und skaliert unter Verwendung von DENZO und SCALEPACK (Otwinowski und Minor, 1997). Der Datensatz zwischen 30 und 3,4 Å zeigt eine Vollständigkeit von 88,9% Auflösung mit Rsym(I) von 2,5. Die Vollständigkeit bei hoher Auflösung (zwischen 3,4 und 1,9) war 99,8% mit Rsym(I) 3,3. Die Einheitszellparameter waren a = 52,302 Å, b = 58,490 Å und c = 106,036 Å, a = b = c = 90°. Der Kristall bestand aus einem Monomer pro asymmetrischer Einheit, hat einen Lösemittelgehalt von 52% und ein Molekül pro asymmetrischer Einheit (Matthew-Koeffizient = 2,57 Å3 Da–1). Der abgeschätzte B-Faktor gemäß Wilson-Plot ist 29. Die Untersuchung systematischer Absenzen entlang jeder Achse zeigte an, dass die Raumgruppe orthorhombisch P212121 war. Tabelle 1: Datensammlung und -prozessierung
    Quelle Grenoble ID14-3
    Zahl der Kristalle 1
    Wellenlänge 0,93100 Å
    Frames 331
    ΔΦ 1°
    Abstand Kristall zu Platte 260 mm
    Zeit/Frame 5 s (niedrige Auflösung); 20 s (hohe
    Auflösung)
    Zahl der Beobachtungen 28846
    Datenreduktionsprogramm HKL
    Einmalige Reflexe 26336
    Verwendete Reflexe 26331
    Auflösung 30,0–1,9
    Vollständigkeit 100
    Multiplizität 1
    Mosaizität 0,5
    aRsym 3,6% (15%)
    Raumgruppe P212121
    a 52,302 Å
    b 58,490 Å
    c 106,036 Å
    Wilson B-Wert 28,78 Å2
  • Bei der Datensammlung sind die Werte der letzten Schale in Klammem angegeben.
  • Strukturbestimmung (Molekularer Ersatz)
  • Die Struktur des Komplexes wurde durch Molekularen Ersatz unter Verwendung des Programms AmoRe (Navaza, 1994) und von RARγ Holo-LBD (Proteindatenbank-Zugriffscode 2 lbd) als Suchmodell aufgelöst. Die oberste Lösung hatte einen Korrelationskoeffizienten von 27,8 (nächsthöchste Lösung 26,2) und einen R-Faktor von 52,7 nach AMoRe „Starre-Körper-Verfeinerung" (rigid body refinement). Eine Lösung konnte auch mit RAR anta als Suchmodell gemäß den folgenden Werten gefunden werden: Korrelationskoeffizient 21,4 (nächsthöchste Lösung 19,8) und R-Faktor 55,9. Tabelle 2: Statistik beim Molekularen Ersatz
    Suchmodell: Holo-RARγ
    (PDB file 2LBD)
    Verwendetes Programm AMoRe
    Auflösungsbereich 15–3,0 Å
    Zahl der Reflexe 4338
    Zahl der Atome 2011
    RF-Korrelation (erste Lösung) 18,8
    TF-Korrelation (erste Lösung) 24,3
    TF R-Faktor (erste Lösung) 57,0
    Starrer Körper Korrelation 26,0
    Starrer Körper R-Faktor 56,7
  • Strukturverfeinerung
  • Der automatisierte Modellaufbau mit Arp/wARP (Perrakis A. et al., 1999) in Verbindung mit iterativer Strukturverfeinerung wurde verwendet und erlaubt uns, 3 Ketten konstruiert zu erhalten, die 243 Resten entsprechen und einem Konnektivitätsindex von 0,98. Die berechneten Elektronendichtekarten 3Fo-2Fc ergaben Rcryst = 0,2703 und Rfree = 0,2644.
  • Ein partielles Modell des Monomers wurde unter Verwendung des Graphikprogramms O (Jones et al., 1991) aufgebaut und abwechselnden Durchgängen von Starrer-Körper-Verfeinerung mit X-PLOR (Brünger, 1996) und manuellem Aufbau unterworfen. Die Endschritte, die Zyklen positioneller Verfeinerung, manuellen Wiederaufbaus, Torsionsvorgänge unter langsamer Abkühlung aus dem Programm XPLOR und individueller isotroper B-Faktor-Verfeinerung verwendeten, ergaben Rcryst = 0,2238 und Rfree = 0,2494. Das Endmodell, verfeinert bei 1,9 Å, umfasst 244 Reste, einen Liganden, ein Peptid mit 10 Aminosäureresten und 146 Wassermoleküle. Gemäß Procheck (Laskowski et al., 1993) sind 93,2% aller Reste in dem Modell in den meist-favorisierten Hauptketten- Torsionswinkel Ramachandran-Bereichen, 5,9% in zusätzlichen erlaubten Bereichen, 0,4% in allgemein erlaubten Bereichen und 0,4% in nicht erlaubten Bereichen. Diese letzten Prozentsätze entsprechen zwei Resten (D403 und E404), die sich in der Schleife 9–10 befinden, die keine gut definierte Dichte zeigte. Tabelle 3: Parameter der Endverfeinerung
    Auflösungsbereich 30,0–1,9
    Reflexe 26331
    R-Faktor 22,4%
    R-free 24,9%
    # Reste 201–452 (207)
    # Atome 1977
    RMS-Abweichungen
    Bindungslängen 0,008
    Bindungswinkel 1,282
    Mittlere B-Faktoren
    Protein 29,5 Å2
    Stearat 47,9 Å2
    Wasser 39,8 Å2
  • Beschreibung des Moleküls
  • Die Struktur von RORβ-LBD ist vollständig von den Resten 208 bis 451.
  • Die Analyse der Struktur mit dem Programm Procheck zeigte nur kleinere Ausnahmen von der erlaubten Geometrie. In der Struktur sind die ersten sieben Reste der Kette (201–207) in der Elektronendichtekarte nicht zu sehen und wahrscheinlich gestört. Dies lässt nur einen Rest vor dem Anfangsrest der ersten α-Helix (H1) in der Wildtyp-Struktur. Am C-terminalen Ende ist nur der letzte Rest (452) in der Elektronendichtekarte nicht zu sehen. Die Schleife zwischen den Helices H9 und H10 (Reste N399 und E405) ist nicht gut definiert.
  • Faltung und Packung
  • Wie erwartet, hat RORβ-LBD die gleiche dreidimensionale Gesamtstruktur wie jene der anderen Hormon-Nuklearrezeptor-LBDs. Das Molekül ist in ein „helikales Sandwich" gefaltet, das aus 10 α-Helices besteht. Es gibt zwei kleine Stücke β- Strang, die ein kurzes β-Faltblatt bilden, das sich im Molekül-Core zwischen den Helices 5 und 6 nahe der Ligandenbindungsstelle befindet. Die Helix 12 ist zum Ligandenbindungsdomänen-Core gefaltet. Ihre letzte Schlaufe kommt in engen Kontakt mit H4, H11 und dem Co-Aktivatorpeptid. Eine Interaktionsfläche mit Resten von der H3-H4-Region und H12 erlaubt die Bindung des Co-Aktivatorpeptids.
  • Die folgende Sequenz des Peptids ist in der Kristallstruktur zu sehen: HKILHRLLQE. Das LXXLL-Motiv, das auch NR-Box genannt wird, ist in einer amphipathischen α-Helix inkludiert, die mit einem hydrophoben Spalt an der LBD-Oberfläche interagiert. Insbesondere die Seitenketten von Leu 693 und Leu 694 sind Teil eines hydrophoben Clusters, der auch von Val 274 (H3), Ile 292 (H4) und Leu 295 (H4) gebildet ist.
  • Das γ Carboxylat von E448 (H12) bildet Wasserstoffbrücken mit den Backbone-Amiden von Leu 697 und Leu 698, Resten der N-terminalen Schlaufe der Peptidhelix. Diese N-Capping-Wechselwirkung wurde bereits beschrieben (Nolte & al., 1998, Shiau et al., 1998). Von diesem hochkonservierten Glutamatrest ist bekannt, dass er für die Transaktivierung wichtig ist. Eine andere Wasserstoffbrücke erfordert Gln 288 (H4) OE2 mit NE2 von His 695. Die Seitenkette von Glu 700 bildet eine Wasservermittelte Wasserstoffbrücke zum Carbonyl des Restes Arg 696.
  • Stearatbindung
  • Das Volumen der Ligandenbindungstasche ist 758 Å3, was nahe jenem von VDR ist (660 Å3) (Rochel et al., 2000). Ein zufälliger Ligand, Stearinsäure, wurde in der Ligandenbindungstasche gefunden, der früher mittels Massenspektrometrie charakterisiert wurde. Es scheint somit, dass E. coli-endogene Stearinsäure co-gereinigt und co-kristallisiert wurde mit dem heterolog exprimierten RORβ-LBD. Die Fettsäure (FA) befindet sich in einer vorwiegend hydrophoben Tasche, die von den Resten gebildet wird, die sich in H3 (Gln 265, Ile 266, Ala 269), H5 (Leu 300, Val 303, Leu 97), Schleife H5-H6 (Phe 113), H6 (Phe 320) und H7 (Leu 131, Val 338) befinden. Die meisten dieser Reste machen einen Van-der-Waals-Kontakt mit der aliphatischen Kette des FA (3a). Die Kavität enthält auch 11 angeordnete Wassermoleküle. Ein Sauerstoffatom der Carboxylatgruppe bildet eine Wasserstoffbrücke mit NE2 von Gln 265. Dieser Rest variiert zwischen RORα und β. Das andere Sauerstoffatom der Carboxylatgruppe bildet eine Wasserstoffbrücke mit zwei angeordneten Wassermolekülen. Diese zwei Moleküle sind Teil eines Wasserstoffbrückennetzwerks, welches das Carboxylat mit anderen konservierten Resten bei RORβ und β der LBP, nämlich Gln 228 und Arg 306, verbindet. Stearat nimmt beim Binden eine U-förmige Konformation ein. Tabelle 4: Stearatkontakte (3,5 Å)
    Wasserstoffbindungen
    O2 Gln 265 Nε2 2,79 Å
    O1 Wat 944 2,54 Å O Val 303 3,11 Å
    Mögliche enge Kontakte
    O1 Ala 269 Cβ 3,31 Å
    O2 Gln 265 Cγ 3,33 Å
    O2 Gln 265 Cδ 3,41 Å
    O2 Wat 946 3,06 Å
    C3 Wat 944 3,43 Å
    C3 Wat 946 3,21 Å
    C4 Wat 946 3,30 Å
    C10 Phe 123 CE1 3,43 Å
    C11 Leu 131 CD2 3,45 Å
  • Kristallisation und Strukturbestimmung des RORβ-LBD/ATRA(all-trans Retinsäure)-Komplexes
  • Wie oben erwähnt, hat sich das RORβ-LBD-Konstrukt, worin die zwei C-terminalen Lösemittel-exponierten Cysteine durch Trunkieren eines 7 Reste langen C-terminalen Segments entfernt wurden, als wertvolles Werkzeug erwiesen, um andere Kristallstrukturen von RORβ-LBD im Komplex mit anderen Liganden zu erhalten.
  • Dies wird nachstehend mit der Beschreibung der Kristallisation und der Strukturbestimmung des RORβ-LBD/ATRA(all-trans Retinsäure)-Komplexes erläutert. Diese neue Struktur zeigt einen anderen Bindungsmodus für den Liganden und legt nahe, dass natürliche und synthetische Retinoide Ligandenkandidaten für RORβ sind. Diese Familie von Verbindungen kann somit hinsichtlich der Bindung an RORβ-LBD untersucht werden, z. B. mittels Massenspektrometrie, und die Kristallisation kann in positiven Fällen versucht werden. Aus den erhaltenen Strukturen können Liganden hoher Affinität entworfen, synthetisiert und in vivo, in vitro sowie hinsichtlich der Kristallisation geprüft werden. Selbst ohne die Kristallstruktur anderer Komplexe kann das Filtern in Bezug auf Liganden-Screening und/oder Design besserer Liganden durch Docking-Studien in computo erreicht werden.
  • Kristallisation des RORβ-LBD/ATRA-Komplexes
  • Der RORβ-LBD/ATRA-Komplex wurde mittels Dampfdiffusion im „Hanging-drop"-Modus kristallisiert. Das Protein (die RORβ-LBD, Stearinsäure enthaltend, wie zuvor gereinigt) wurde mit einem Überschuss ATRA und einem Überschuss SRC-1 (Reste 686–700) unter ähnlichen Bedingungen wie beim RORβ-LBD/STE(Stearinsäure)-Komplex co-kristallisiert. Ein 4-μl-Tropfen wurde hergestellt, indem 2 μl gereinigtes Protein (5,8 mg/ml) mit einem gleichen Volumen Reservoirlösung gemischt wurden. Das Reservoir (500 μl) enthielt 18% PEG 6000 und 100 mM TrisHCl pH = 8,0. Ein Kristall mit den Maβen 300 × 160 × 100 μm wuchs innerhalb von 2 Wochen bei 22°C.
  • Datensammlung
  • Die Kristalle wurden mit einem Film von viskosem Paraffinöl kryogeschützt und dann bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff in flüssigem Ethan schockgefroren. Die Röntgenbeugungsdaten wurden bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff von einem gefrorenem Einkristall an der BM14-CRG Beamline am ESRF Grenoble, Frankreich, gesammelt. Die Kristalle beugten die Röntgenstrahlen zu einer Auflösungsgrenze von 2,1 Å. Alle Daten wurden integriert und skaliert unter Verwendung von DENZO und SCALEPACK (Tabelle 5). Der Datensatz zwischen 20,0 und 2,1 Å zeigt eine Vollständigkeit von 100% mit einem Rsym(I) von 4,5%. Die Vollständigkeit in der Schale der höchsten Auflösung (2,17–2,10 Å) war 100% mit einem Rsym(I) von 17,5%. Die Einheitszellparameter waren a = 52,199 Å, b = 58,125 Å und c = 106,039 Å, a = b = c = 90°. Der Kristall enthält ein Monomer pro asymmetrischer Einheit und einen Lösemittelgehalt von 52%. Der geschätzte B-Faktor mittels Wilson-Plot ist 32. Die Untersuchung systematischer Absenzen entlang jeder Achse zeigte an, dass die Raumgruppe P212121 war.
  • Strukturbestimmung und -verfeinerung
  • Die Struktur des Komplexes wurde durch Molekularen Ersatz unter Verwendung des RORβ-LBD/STE-Komplexes als Ausgangsmodell aufgelöst. Die all-traps-Retinsäure wurde unter Verwendung von Quants (MSI) aufgebaut. Das Endmodell (Rcryst = 0,2180 und Rfree = 0,2549), verfeinert bei 2,1 Å (Tabelle 5), umfasst 244 Reste von RORβ-LBD, 10 Reste vom Peptid, einen Liganden und 139 Wassermoleküle. Gemäß Procheck sind 91,2% aller Reste in dem Modell in meist-favorisierten Hauptketten-Torsionswinkel Ramachandran-Bereichen, 5,9% in zusätzlichen erlaubten Bereichen, 2,1% in generell erlaubten Bereichen und 0,0% in nicht erlaubten Bereichen.
  • Bindung von ATRA (all-frans-Retinsäure)
  • Die Protein-Ligand-Kontakte innerhalb von 3,5 Å sind in der Tabelle 6 aufgelistet. Die vorliegende Struktur zeigt die Bindungsstelle für die Carboxylatgruppe von ATRA, die an Arg 306 und Arg 309 in jedem Fall durch ein Wassermolekül Wasserstoffbrückengebunden ist (6). Der Bindungsmodus unterscheidet sich von dem von Stearat (7), welches an Gln 265 direkt und an Gln 228 durch ein Wassermolekül Wasserstoffbrücken-gebunden ist. Andererseits macht Stearat mehr Van-der-Waals-Kontakte mit Taschenresten dank seiner flexiblen Kette, die eine U-Form einnimmt, wahrscheinlich um die Zahl solcher Kontakte zu maximieren. ATRA ist starrer, was weniger Van-der-Waals-Kontakte erlaubt. Es scheint somit ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Van-der-Waals-Kontakt- und Wasserstoffbrücken-Ligandenbindung an RORβ-LBD zu bestehen. Tabelle 5: Statistik der Datensammlung und der Verfeinerung
    Quelle ESRF BM14
    Wellenlänge 0,976205 Å
    Einmalige Reflexe 19431
    Auflösungsbereich 20,0–2,1
    aVollständigkeit 100% (100%)
    Multiplizität 6,6
    Mosaizität 0,75°
    aRsym 4,5% (17,5%)
    Raumgruppe P212121
    a 52,199 Å
    b 58,125 Å
    c 106,039 Å
    • aDie Werte der letzten Schale sind in Klammem angegeben.
    Auflösungsbereich 20,0–2,1
    Reflexe 17679
    R-Faktor 21,8%
    R-free 25,5%
    # sichtbare Reste 244 (Reste 208–451)
    # Atome 2219
    RMS-Abweichungen
    Bindungslängen 0,007
    Bindungswinkel 1,129
    Mittlere B-Faktoren
    Protein und Peptid 33,6 Å2
    All-trans-Retinsäure 40,3 Å2
    Wasser 43,2 Å2
    Wilson B-Faktor 31,9 Å2
    Tabelle 6: RORβ-LBD/ATRA(all-trans Retinsäure)-Kontakte innerhalb von 3,5 Å Wasserstoffbindungen
    O1 N Gln 228 2,97 Å
    O1 Wat 802 2,72 Å
    O2 Wat 825 2,59 Å
    NH1 Arg 306 2,92 Å
    NH1 Arg 309 2,84 Å
    Van-der-Waals-Kontakte
    O1 Arg 306 Cδ 3,50 Å
    O2 Tyr 229 N 3,42 Å
    O2 Gln 228 N 3,42 Å
    C15 Gln 228 N 3,48 Å
    C15 Wat 825 3,39 Å
    C18 Cys 262 Cβ 3,42 Å
    C18 Cys 262 Sγ 3,44 Å
    C19 Leu 319 O 3,34 Å
    C20 Wat 825 3,22 Å
  • Zellkultur und Versuche zur transienten Transfektion
  • HT22 wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert. Das Medium war mit 5% delipidiertem fetalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und Glutamin supplementiert. Transiente-Transfektion-Assays wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (0,5·105 Zellen pro Vertiefung) durchgeführt, N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP) Lipofektion (Roche Molecular Biochemicals) nach dem Protokoll des Herstellers. Die Luciferaseaktivität wurde wie vom Hersteller empfohlen (Promega) in einem Microplate Luminometer (EG & G Berthold) untersucht. Relative Lichteinheiten wurden gemäß (Muller et al., 2002) normalisiert und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bradford-Farbstoff-Assay (Bio-Rad) bestimmt. Alle Versuche wurden zumindest fünfmal wiederholt.
  • Liganden.
    • Erworbene Liganden schließen die Folgenden ein: all-trans-[20-Methyl-3H]-retinsäure (65 Ci/mmol) (NEN); all-trans-Retinsäure (Sigma)
  • Rekombinante Plasmide.
    • Reporterplasmide G5E1BTataLuc Expressionsvektoren. CMX-Gal, CMX-Gal-RORβ201-459, pGEX-RORβ201-459, beschrieben in (Greiner et al., 1996)
  • Ligandenbindungs-Assays.
  • Ein „Scintillation Proximity Assay" wurde mit gereinigtem bakteriell exprimiertem RORβ-LBD (Stehlin et al., 2001) (250 ng pro Vertiefung) und all-trans-[20-Methyl-3H]-retinsäure (60 Ci/mMol, NEN) in NiNTA-Flashplates (NEN) mit 96 Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Bindungspuffer: 40 mM HEPES pH 7,6, 40 mM KCl, 0,2% CHAPS, 0,1 mg/ml BSA. Die Bindung wurde 1 Stunde bei 4°C in 100 μl Bindungspuffer durchgeführt. Der Radioligand wurde in Bindungspuffer auf eine Endkonzentration von 5 nM verdünnt. Unmarkierte konkurrierende Liganden wurden seriell in Bindungspuffer verdünnt und bei einer Endkonzentration im Bereich von 1 nM bis 10 μM zugegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei 25°C geschüttelt. Dann wurde die Radioaktivität mit einem Packard Topcount 2 min pro Vertiefung gemessen. Alle Konzentrationen wurden dreifach untersucht und die Ergebnisse gemittelt. Die Werte von Vertiefungen ohne Kompetitor repräsentierten 100% Bindung. Die Sättigungs-Bindungsversuche verwendeten die in der Figur angegebenen Ligandenkonzentrationen. Die nichtspezifische Bindung wurde bestimmt, indem unmarkierte Retinsäure bei 10–4 M inkludiert und von der Gesamtbindung subtrahiert wurde. Die Nichtlineare Regressionsanalyse in Bezug auf die Kompetitionskurven, Sättigungsbindung und Scratchard-Analyse zur Bestimmung von Kd erfolgten unter Verwendung von GRAPHPAD PRISM.
  • Greiner, E. F., Kirfel, J., Greschik, H., Dorflinger, U., Becker, P., Mercep, A. und Schule, R. (1996). Functional analysis of retinoid Z receptor beta, a brain-specific nuclear orphan receptor. Proc Natl. Acad. Sci. USA 93, 10105–10110.
  • Muller, J. M., Metzger, E., Greschik, H., Bosserhoff, A. K., Mercep, L., Buettner, R. und Schule, R. (2002). The transcriptional coactivator FHL2 transmits Rho signals from the cell membrane into the nucleus. Embo J 21, 736–748.
  • Tabelle A: Kristallographische Koordinaten von RORβ-LBD/Stearinsäure/SRC1-Peptid-Komplex
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  • Tabelle B: Kristallographische Koordinaten von RORβ-LBD/Retinsäure/SRC1-Peptid-Komplex
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  • Sequenzprotokoll
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Claims (17)

  1. Polypeptide aus dem Retinoic-acid-related-orphan-Rezeptor (ROR) in Säugern, dadurch gekennzeichnet, dass sie Fragmente des RORβ, RORα oder RORγ von Ratte, Mensch oder Maus sind, die an ihrem N-terminalen Ende durch die Aminosäure begrenzt sind, die an einer der Positionen 201 bis 209 der ROR-Sequenzen, die in 3 dargestellt sind, liegt, und an ihrem C-terminalen Ende durch eine Aminosäure begrenzt sind, die an einer der Positionen 451 oder 452, der ROR-Sequenzen, die in 3 dargestellt sind, liegt.
  2. Polypeptide nach Anspruch 1, ausgewählt aus: – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 209 bis 452: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 2, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 3, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 4, • der Sequenz des RORγ SEQ der Maus, ID NO: 5, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 6, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ED NO: 7 liegen, – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 208 bis 452: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 8, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 9, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 10, • der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID NO: 11, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 12, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID NO: 13 liegen, – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 208 bis 451: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 14, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 15, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 16, • der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID NO: 17, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 18, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID NO: 19 liegen, – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 209 bis 451: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 20, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 21, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 22, • der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID NO: 23, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 24, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID NO: 25, liegen, – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 201 bis 451: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 26, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 27, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 28, • der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID NO: 29, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 30, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID NO: 31 liegen, – dem Fragment, das durch die Aminosäuren begrenzt wird, die an den Positionen 201 bis 452: • der Sequenz des RORβ der Ratte, SEQ ID NO: 32, • der Sequenz des RORβ des Menschen, SEQ ID NO: 33, • der Sequenz des RORγ des Menschen, SEQ ID NO: 34, • der Sequenz des RORγ der Maus, SEQ ID NO: 35, • der Sequenz des RORα des Menschen, SEQ ID NO: 36, • der Sequenz des RORα der Maus, SEQ ID NO: 37 liegen.
  3. Polypeptide nach Anspruch 1 oder 2, die durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet sind: – sie haben das Vermögen, einen Liganden zu binden und die LBD des Rezeptors ROR zu transaktivieren, – sie sind in wässrigen Lösemitteln löslich, – sie sind in wässrigen Lösemitteln, speziell durch die Hanging-drop-Dampfdiffusionsmethode kristallisierbar, insbesondere bei ungefähr 4°C.
  4. Molekularkomplexe umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid assoziiert ist mit: – einem ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist, wie etwa Stearinsäure, oder ein Antagonist der ROR-LBD ist, wie etwa Retinsäure, – und/oder mit einem Co-Peptid, das eine Sequenz von ungefähr 15 bis 20 Aminosäuren aufweist und das Co-Aktivatormotiv LXXLL oder ein Co-Repressormotiv (I/L)XX(V/I)I oder LXX(H/I)IXXX(I/L) umfasst, worin X für jede Aminosäure, natürlich oder nicht, steht, wie etwa Co-Peptide, ausgewählt aus Fragmenten von transkriptionellen Co-Aktivatoren, speziell solche der p160-Familie, und insbesondere aus Fragmenten des Co-Aktivators SRC1, wie etwa das Fragment 686–700 von SRC1, oder aus Fragmenten von transkriptionellen Co-Repressoren.
  5. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
  6. Nukleotidsequenz nach Anspruch 5, die mit Elementen assoziiert ist, die für die Transkription dieser Sequenz notwendig sind, insbesondere ein Promoter und ein Terminator der Transkription.
  7. Vektor, insbesondere Plasmid, umfassend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 oder 6.
  8. Wirtszellen, wie etwa E. coli, die mit einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert wurden.
  9. Verfahren zum Erhalten eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Molekularkomplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – einen Schritt des Transformierens der Wirtszellen mit einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 oder 6 unter Verwendung eines Vektors nach Anspruch 7, – einen Schritt des Kultivierens der so erhaltenen transformierten Wirtszelle nach Anspruch 8 in einem geeigneten Kulturmedium, – und das Gewinnen, und gegebenenfalls die Aufreinigung des erhaltenen rekombinanten Polypeptids oder Molekularkomplexes.
  10. Kristall, der ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Molekularkomplex nach Anspruch 4 umfasst.
  11. Kristall nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Kristall mit einer Auflösung von mindestens 3 Angstrom beugt und eine Kristallstabilität innerhalb 5% seiner Elementarzelldimensionen aufweist.
  12. Kristall nach Anspruch 10 oder 11, worin die ROR-LBD die folgenden Elementarzelldimensionen in Angstrom aufweist: a = 52,302 Å, b = 58,490 Å und c = 106,036 Å, α = β = χ = 90°, und eine orthorhombische Raumgruppe P212121.
  13. Kristall nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wie er erhalten wird, indem ein Verfahren nach Anspruch 9 durchgeführt wird, und umfassend einen Schritt der Kristallisierung der, Polypeptide aus einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Molekularkomplexe nach Anspruch 4 in wässrigen Lösemitteln, speziell bei 4°C, durch die Hanging-drop-Dampfdiffusionsmethode.
  14. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Molekularkomplexe nach Anspruch 4 oder der Kristalle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 zum Durchführen: – eines Verfahrens zum Screenen eines ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist oder ein Antagonist des Rezeptors ist, oder zum Screenen von Liganden, die die Struktur des Rezeptors stören und eine Wirkung auf die Rekrutierung von Co-Faktoren (Co-Aktivatoren und Co-Repressoren), und somit auf die Genregulation haben, – oder eines Verfahrens zur Analyse der dreidimensionalen Struktur des Komplexes, die mit den Polypeptiden, Molekülkomplexen oder Kristallen und einer besonderen Verbindung gebildet werden.
  15. Verwendung nach Anspruch 14 zum Screenen von Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten von ROR wirken, wobei die Verbindungen im Rahmen der Behandlung von Pathologien nützlich sind, die mit dem zentralen Nervensystem, der retinalen Organisation, der sensoriellen Signalintegration, der Beweglichkeit und der Sterilität zusammenhängen.
  16. Verfahren zum Screenen eines ROR-LBD-Liganden, der ein Agonist oder ein Antagonist des Rezeptors ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Kontaktieren eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Molekülkomplexes nach Anspruch 4 oder eines Kristalls nach einem der Ansprüche 10 bis 13, das vorteilhafterweise mit einem festen Träger verbunden ist, mit der besonderen Verbindung, die vermutlich ein ROR-LBD-Ligand ist, wobei vorzugsweise entweder das Polypeptid oder der Molekularkomplex oder der Kristall oder der getestete Ligand markiert ist, etwa mit einem fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Marker, – Nachweisen der möglichen Assoziation zwischen dem Polypeptid oder dem Molekularkomplex oder dem Kristall und dem getesteten Liganden durch Messen des verwendeten Markers, speziell nach dem Spülen des Trägers, der in dem vorhergehenden Schritt verwendet wurde, oder durch Massenspektrometrie unter nicht denaturierenden Bedingungen.
  17. Verfahren zur Analyse der dreidimensionalen Struktur der Komplexe, die mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 bis 3, oder einem Molekularkomplex nach Anspruch 4 oder einem Kristall gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 und einer bestimmten Verbindung gebildet wurden, die vermutlich ein ROR-LBD-Ligand ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Kontaktieren des Polypeptids oder des Molekülkomplexes oder des Kristalls mit der besonderen Verbindung, – Kristallisierung des Komplexes, der zwischen dem Polypeptid oder dem Molekülkomplex oder dem Kristall und dem getesteten Liganden gebildet wurde, speziell mit der Dampfdiffusionsmethode, und dreidimensionale Analyse des Komplexes, speziell mit der Methode des molekularen Ersatzes, – oder dreidimensionale Analyse des Komplexes in löslichem Zustand unter Verwendung einer geeigneten Methode, wie etwa NMR.
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