DE60031096T2

DE60031096T2 - Auf der dreidimensionalen struktur von lta4 hydrolase basierender entwurf von arzneimitteln

Info

Publication number: DE60031096T2
Application number: DE60031096T
Authority: DE
Inventors: Jesper Z. Haeggström; Pär Nordlund; Marjolein Thunissen
Original assignee: HAEEGGSTROEM JESPER Z; Haeeggstrom Jesper Z
Current assignee: Cardoz AB
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2020-02-29
Also published as: AU3468300A; US7590494B1; ATE341615T1; WO2000050577A1; DE60031096D1; EP1157101A1; EP1157101B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen LTA₄-Hydrolaseproteinkristall sowie auf die Verwendung der dreidimensionalen Struktur des Proteinkristalls im Verfahren zum Identifizieren von biologisch aktiven Verbindungen, die zur LTA₄-Hydrolase komplementär sind, wobei die Verfahren auf der ersten Definition einer dreidimensionalen Struktur eines Proteins basieren, das in der Leukotrienkaskade involviert ist.
Leukotrien A₄(LTA₄)-Hydrolase ist ein Schlüsselenzym in der Biosynthese von Leukotrienen, einer Familie von parakrinen Hormonen, die in der Pathophysiologie inflammatorischer und allergischer Störungen, insbesondere Bronchialasthma, impliziert sind (Samuelsson, B. Science 220, 568–75 (1983); und Lewis, R. A., Austen, K. F. & Soberman, R. J. N Engl J Med 323, 645–55 (1990)). Leukotriene werden durch immunkompetente Zellen, einschließlich Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Mastzellen und Makrophagen, als Reaktion auf eine Vielzahl immunologischer wie auch nicht-immunologischer Stimuli gebildet. Diese Lipidmediatoren werden in zwei Hauptklassen aufgeteilt, die durch Chemotaxin-LTB₄ und die spasmogenen Cysteinyl-Leukotriene (LTC₄, LTD₄ und LTE₄) dargestellt werden. Die Leukotrienbiosynthese wird durch das Enzym 5-Lipoxygenase initiiert, welches Arachidonsäure in das instabile Epoxid LTA₄ umwandelt, das ein zentrales Zwischenprodukt in der Leukotrienkaskade ist. LTA₄ kann durch das Enzym LTA₄-Hydrolase wiederum in LTB₄ hydrolysiert werden oder mit GSH unter Bildung von LTC₄ konjugiert werden, eine Reaktion, die durch eine spezifische LTC₄-Synthase katalysiert wird. Während der zellulären Aktivierung bilden alle Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese, außer LTA₄-Hydrolase, einen biosynthetischen Komplex, der an der Kernmembran zusammengebaut wird, was nahe legt, das Leukotriene unbekannte intranukleäre Funk tionen haben können, die mit Genregulation oder Zellwachstum in Verbindung stehen (Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z. & Leslie; C. C. Faseb J 10, 1147–58 (1996)).
Leukotrien B₄, das natürliche Produkt der LTA₄-Hydrolase, ist eines der stärksten chemotaktischen Mittel, die bis heute bekannt sind, und löst die Leukozytenanheftung und -aggregation bei nur nM-Konzentrationen aus (Ford-Hutchinson, A. W., Bray, M. A., Doig, M. V., Shipley, M. E. & Smith, M. J. H. Nature 286, 264–265 (1980)). Daher wird dieses Molekül als Schlüsselmediator von Entzündungen angesehen und ist bei einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Arthritis, Psoriasis, entzündlicher Darmerkrankung (inflammatory bowel disease (IBD)) und chronischer obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), impliziert. Darüber hinaus wurde die Rolle von LTB₄ bei Entzündungen durch die anti-inflammatorischen Eigenschaften von LTA₄-Hydrolaseinhibitoren, insbesondere in Kombination mit einem Cyclooxygenaseinhibitor, und spezifischen LTB₄-Rezeptorantagonisten wie auch durch die verringerten inflammatorischen Reaktionen, die in verschiedenen Tiermodellen von Leukotriendeffizienz beobachtet wurden, gut bestätigt (Tsuji, F., Miyake, Y., Enomoto, H., Horiuchi, M., Mita, S. Eur. J. Pharmacol. 346, 81–85, (1998); Chen, X. S., Sheller, J. R., Johnson, E. N. & Funk, C. D. Nature 372, 179–182 (1994); Griffiths, R. J., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92, 517–21 (1995); und Griffiths, R. J., et al. J Exp Med 185, 1123–9 (1997)). Außerdem moduliert LTB₄ die Immunantwort, z.B. durch Interferenz mit spezifischen Untergruppen von Lymphozyten, Produktion von Cytokinen sowie Freisetzung von Immunglobulinen aus B-Lymphozyten (Payan, D. G., Missirian-Bastian, A. & Goetzl, E. J. Proc Natl Acad Sci USA 81, 3501–5 (1984); Rola-Pleszczynski, M. & Lemaire, I. J Immunol 135, 3958–61 (1985); und Yamaoka, K. A., Claesson, H. E. & Rosen, A. J Immunol 143, 1996–2000 (1989)). Jüngere Daten zeigen auch, dass LTB₄ die Zellproliferation und das Zellüberleben bei HL-60-Zellen stimuliert und somit eine kritische Rolle bei der Regulierung der Zellproliferation und des Zellüberlebens bei HL-60-Zellen hat, was nahe legt, dass LTA₄-Hydrolaseinhibitoren eine antiproliferative Wirkung haben (Dittman, K. H., Mayer, C., Rodemann, H. P., Petrides, P. E. und Denzlinger, C. Leuk. Res. 22, 49–53 (1998)). Der Zelloberflächenrezeptor für LTB₄ (BLTR) wurde kürzlich kloniert und es wurde festgestellt, dass er im Immunsystem, einschließlich Lymphozyten, Milz und Thymus, reichlich exprimiert wird (Yokomizo, T., Izumi, T., Chang, K., Takuwa, Y. & Shimuzu, T. Nature 387, 620–624 (1997)). BLTR gehört zu einer Familie der Chemokinrezeptoren und interessanterweise wurde gefunden, dass er zusammen mit CD4 ein effizienter Corezeptor für die HIV-1-Infektion ist (Owman, C., et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 9530–4(1998)). Darüber hinaus ist LTB₄ auch ein natürlicher Ligand für den nukleären Orphanrezeptor PPARα, was nahe legt, dass LTB₄ intranukleäre Funktion haben kann, die möglicherweise mit Lipidhomeostase in Verbindung stehen (Devchand, P. R., et al. Nature 384, 39–43 (1996)).
LTA₄-Hydrolase ist ein cytosolisches 69 kDa-Enzym ohne Ähnlichkeit mit anderen löslichen oder membrangebundenen xenobiotischen Epoxidhydrolasen (Funk, C. D., et al. Proc Natl Acad Sci USA 84, 6677–81(1987)). Die Eopoxidhydrolaseaktivität des Enzyms, die LTB₄ erzeugt, ist in hohem Maße substratselektiv, wobei das Enzym nur LTA₄ und zu einem geringen Ausmaß die Doppelbindungsisomeren LTA₃ und LTA₅ akzeptiert. Typischerweise erleidet LTA₄-Hydrolase Suizidinaktivierung und eine kovalente Modifizierung, wenn sie LTA₄ ausgesetzt wird (Evans, J. F., Nathaniel, D. J., Zamboni, R. J. & Ford-Hutchinson, A. W. J. Biol. Chem. 260, 10966–10970 (1985)). Während dieses Prozesses bindet LTA₄ scheinbar ein Tyr-378, einen Rest, der auch eine Rolle zur Bildung der kritischen cis-trans-trans-Geometrie in der konjugierten Trienstruktur von LTB₄ zu spielen scheint (Mueller, M. J., et al. Proc Natl Acad Sci USA 93, 5931–5935 (1996); und Mueller, M., Andberg, M., Samuelsson, B. & Haeggstrom, J. Z. J. Biol. Chem. 271, 24345–24348 (1996)).
Aus Sequenzvergleichen mit bestimmten Metalloproteasen und Aminopeptidasen wurde unerwarteterweise in LTA₄-Hydrolase ein Zink-Bindungsmotiv (HEXXH-X18-E) gefunden (Vallee, B. L. & Auld, D. S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 220–224 (1990)). Weitere Studien bewiesen, dass das Enzym tatsächlich ein katalytisches Zinkatom enthält, das an His295, His299 und Glu318 komplexiert ist (Medina, J. F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7620–7624 (1991)). Außerdem wurde eine vorher unbekannte Peptidspaltungsaktivität entdeckt, die das Vorliegen von Anionen, insbesondere Chlorid erfordert (Haeggström, J. Z., Wetterholm, A., Medina, J. F. & Samuelsson, B. J Lipid Mediator 6, 1–13 (1993)). Obgleich das endogene physiologische Peptidasesubstrat (die endogenen physiologischen Peptidasesubstrate) noch nicht identifiziert wurden, spaltet LTA₄-Hydrolase bestimmte Arginyldi- und tripeptide mit sehr hoher Effizienz (Örning, L., Gierse, J. K. & Fitzpatrick, F. A. J. Biol. Chem. 269, 11269–11273 (1994)). Daher kann LTA₄-Hydrolase als bifunktionelles Zinkmetalloenzym mit der einzigartigen Fähigkeit, sowohl Lipid- als auch Peptid-Substrate zu akzeptieren, beschrieben werden. Unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese wurde gefunden, dass Glu296 und Tyr383 für die Peptidasereaktion kritisch sind, vermutlich als allgemeine Base bzw. Protonendonor (Blomster, M., Wetterholm, A., Mueller, M. J. & Haeggström J. Z. Eur. J. Biochem. 231, 528–534 (1995); und Wetterholm, A., et al. Proc Natl Acad Sci USA 89, 9141–9145 (1992)). Da die Fähigkeit des Enzyms, LTA₄ in LTB₄ umzuwandeln, durch die Mutationen nicht beeinträchtigt wurde, wurden die zwei Enzymaktivitäten von LTA₄-Hydrolase über nicht identische, aber überlappende aktive Stellen ausgeübt. Anders als andere Enzyme in der Leukotrienkaskade, ist LTA₄-Hydrolase bemerkenswerterweise in Säugerzellen und -gewebe überall zu finden, was nahe legt, dass sie andere Funktionen haben kann, die wahrscheinlich mit ihrer Peptidspaltungsaktivität in Verbindung stehen.
Als Folge der Identifizierung von LTA₄-Hydrolase als Zinkmetalloenzym mit Peptidaseaktivität wurde beobachtet, dass LTA₄-Hydrolase durch Bestatin, einen allgemeinen Aminopeptidaseinhibitor, und Captopril, einen Inhibitor von Angiotensin-umwandelndem Enzym, inhibiert wird (Örning, L., et al. J. Biol. Chem. 266, 16507–16511 (1991)).
Tsuge et al., (J. Mol. Biol. 238, 854–856 (1994)) haben die Kristallisation von LTA₄-Hydrolase beschrieben. Allerdings wurde die dreidimensionale Struktur von LTA₄-Hydrolase trotz des anerkannten Bedarfs dafür noch nicht offenbart. Spezifischer ausgedrückt, die Probleme, die zu überwinden sind, um eine solche Bestimmung bereitzustellen, können wie folgt kurz erläutert werden. Es gibt zwei Hauptschwierigkeiten beim Erhalten einer dreidimensionalen Struktur eines Proteinmoleküls. Die Hauptschwierigkeit besteht darin Kristalle guter Qualität wachsen zu lassen, die reproduzierbar sind und zur atomaren Auflösung beugen (unter 2,5 Å). Dies bedeutet eine sorgfältige und mühsame Untersuchung von Parametern, die das Kristallwachstum beeinflussen, zum Beispiel pH, Temperatur, Natur der Puffer, Natur des Fällungsmittels, um einige wenige zu nennen. Die Addition von Liganden, zum Beispiel Substratanaloga oder -inhibitoren, oder der Zusatz von anderen Molekülen kann für einen Erhalt guter Kristalle wichtig sein. Es gibt nur ein geringes Verständnis für den physikalischen Hintergrund des Kristallisationsprozesses, was bedeutet, dass die Suche nach geeigneten Kristallisationsbedingungen für ein bestimmtes Protein einzigartig ist, Kreativität und Intuition erfordert und durch Versuch- und -Fehler-Verfahren geleitet wird. Die Reinheit des Proteins ist auch ein entscheidender Parameter bei der Kristallisation und ein geeigneter Reinheitsgrad kann kaum oder sogar unmöglich erreicht werden. Die zweite Hauptschwierigkeit ist mit einer Überwindung des Phasenproblems verbunden, das Röntgendiffraktionsverfahren eigen ist. Um fähig zu sein, dieses Problem zu überwinden, ist es notwendig, das Protein mit geeigneten schweren Atomsubstanzen, z.B. Quecksilber-, Gold- oder Platinverbindungen, zu substituieren. Kristalle können oft die Behandlung mit diesen Verbindungen nicht aushalten und die Suche nach geeigneten Substitutionen ist nicht unkompliziert und kann sehr anstrengend werden. Eine andere Option besteht darin, alle Methionine durch Selenmethionin(Se-Met)-Reste zu ersetzen. Diese Methode erfordert die Herstellung von rekombinantem Protein in speziellen Stämmen von E. coli unter Nichtstandardbedingungen, gefolgt von einer neuen Reinigung und Umkristallisation des Se-Met-enthaltendem Protein. Obgleich Tsuge et al. die Kristallisation von LTA₄-Hydrolase beschrieben, konnten ihre Kristalle nur zu mittlerer Auflösung diffraktiert werden und das Phasenproblem wurde nicht gelöst. Wenn demnach eine zuverlässige Definition der dreidimensionalen Struktur von LTA₄-Hydrolase möglich wäre, z.B. eine Anzeige der Form des Moleküls in visueller Form auf einem Computerbildschirm, dann könnten die oben genannten Probleme gelöst werden, es könnte ein ganzer Bereich von Möglichkeiten eröffnet werden, zum Beispiel rationales strukturbasiertes Wirkstoffdesign, z.B. in Kombination mit kombinatorischer Chemie, das auf die Produktion neuer Medikamente abzielt, die bei Störungen einsetzbar sind, welche mit der Leukotrienkaskade in Verbindung stehen, wie auch Protein-Entwicklung, um neue Varianten des Enzyms mit veränderten, aber noch nützlichen, katalytischen Eigenschaften zu schaffen.
Da LTA₄-Hydrolase als wichtiges Wirkstofftarget anerkannt ist, wurden einige Inhibitoren dafür synthetisiert (Wetterholm, A., et al. J Pharmacol Exp Ther 275, 31–7 (1995); und Yuan, W., Wong, C., Haeggstrom, J. Z., Wetterholm, A. & Samuelsson, B. J. Am. Chem. Soc., 114, 6552–6553 (1992)). Interessanterweise wurde berichtet, dass bestimmte Inhibitoren von LTA₄-Hydrolase auch als LTB₄-Rezeptorantagonisten wirken (Labaudinière R, Hilboll G, Leon-Lomeli A, Terlain B, Cavy F, Parnham M, Kuhl P und Dereu N J. Med. Chem. 35, 3170–3179 (1992)). In Folge des Fehlens verfügbarer Informationen bezüglich der dreidimensionalen Struktur von LTA₄-Hydrolase, wie es oben diskutiert wurde, wurde keiner der vorstehend beschriebenen Inhibitoren auf der Basis der exakten Struktur derselben konzipiert. Dementsprechend gibt es einen Bedarf auf diesem Gebiet zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von LTA₄-Hydrolase, um wirksamere und selektive Inhibitoren von LTA₄-Hydrolase wie auch modifizierte Strukturen, die sogar günstigere pharmazeutische Eigenschaften aufweisen, zu entwickeln.
Da das folgende Kapitel eine beachtliche Menge an Text enthält, wird es hierin in getrennte Abschnitte aufgeteilt, von denen jeder getrennte Aspekte der vorliegenden Erfindung offenbart.
Inhaltsverzeichnis Kapitel 2

2.1 Zusammenfassung der Erfindung
2.2 Kurze Beschreibung der Zeichnungen
2.3 Definitionen
2.4 Detaillierte Beschreibung der Erfindung
2.4.1 LTA₄-Hydrolase
2.4.2 Identifizierung von Verbindungen, die zur LTA₄-Hydrolase komplementär sind
2.4.3 Ein isolierter Proteinkristall eines Proteinkomplexes von LTA₄-Hydrolase und einer komplementären Verbindung
2.4.4 Vorteilhafte Verwendungen von LTA₄-Hydrolase, komplementären Verbindungen und Komplexen davon
2.4.5 Screening auf LTA₄-Hydrolase-Analoga
2.4.5 (a) Verfahren
2.4.5 (b) Mutierte Formen von LTA₄-Hydrolase
2.4.6 (a) Reinigung von LTA₄-Hydrolase
2.4.7 Identifizierung von LTA₄-Hydrolase-bindenden Verbindungen
2.4.7 (a) Verfahren
2.5 Herstellung der neuen Moleküle
2.6 Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

2.1 Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Kristallisation und Bestimmung der dreidimensionalen Struktur des LTA₄-Hydrolaseproteins, das mit dem kompetitiven Inhibitor Bestatin komplexiert ist, und auf die anschließende Strukturbestimmung von Komplexen zwischen LTA₄-Hydrolase und zwei spezifischen Inhibitoren. Es ist die erste dreidimensionale Struktur einer Proteinkomponente der Leukotrienkaskade und ermöglicht eine Beschreibung der strukturellen Basis und der molekularen Mechanismen verschiedener Enzymfunktionen, zum Beispiel die zwei katalytischen Aktivitäten von LTA₄-Hydrolase. Außerdem macht die strukturelle Information nun eine rationelle Entwicklung von Enzyminhibitoren möglich, die zu klinisch nützlichen anti-inflammatorischen Arzneimitteln entwickelt werden können.
2.2 Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Schlüsselenzyme und die Intermediate bei der Leukotrienbiosynthese.
2 zeigt die 2Fo-Fc-Dichte, die bei 1.1 s. umrissen ist, wo ein Teil der aktiven Stelle in der Nachbarschaft der Bestatinmoleküle gezeigt ist.
3 ist ein Bänderdiagramm der Tertiärstruktur von Leukotrien-A₄-Hydrolase.
4 zeigt Bänderdiagramme der N-terminalen Domänen der LTA₄-Hydrolase.
5 zeigt Bänderdiagramme der katalytischen Domäne von LTA₄-Hydrolase und Therolysin.
6 zeigt die Struktur der C-terminalen Domäne.
7 veranschaulicht die Zinkbindungsliganden in LTA₄-Hydrolase.
8(a) ist eine „Ball-and-Stick"-Darstellung der Bindung von Bestatin in LTA₄-Hydrolase während 8(b) eine schematische Übersicht der Bestatinbindung in LTA₄-Hydrolase ist.
9(a) ist eine Drahtdarstellung des zentralen Hohlraums, der in LTA₄-Hydrolase gefunden wird (als Cα-Spur gezeigt).
9(b) ist eine schematische Präsentation der vorgeschlagenen Bindung von LTA₄ in den Hohlraum.
10 ist eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus der Epoxidhydrolase.
2.3 Definitionen
Im vorliegenden Kontext ist der Ausdruck „die dreidimensionale Form, die in der Natur angenommen wird" als die Konformationsstruktur zu verstehen, die durch die Parameter x, y und z in einem herkömmlichen Koordinatensystem definiert ist, das ein natürlich auftretendes Molekül an Bedingungen anpasst, bei denen es fähig ist, seine biologischen Aktivitäten auszuüben.
Die spezifischen Bedingungen, unter denen die hierin präsentierten Daten gesammelt wurden, werden in Abschnitt „Experimentelles" detailliert beschrieben.
Der Ausdruck „isoliert" bzw. „isolierter" und Variationen davon, bedeuten, wenn sie in Verbindung mit einem Molekül, zum Beispiel Protein, einem Polypeptid oder einer Nukleinsäure verwendet werden, dass das Molekül von anderen Substanzen, zum Beispiel anderen Proteinen, DNA usw., die es normalerweise in seiner natürlichen Umgebung begleiten, isoliert ist.
Der Ausdruck „Leukotrien A₄ (LTA₄)-Hydrolase", wie er hierin verwendet wird, ist so zu verstehen, dass er eine beliebige Säuger- oder andere LTA₄-Hydrolase umfasst, die dieselbe Hauptkette wie die humane Form, die spezifisch in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, ungeachtet der Quelle, umfasst. Es wurde gezeigt, dass die Aminosäuresequenzen von Säuger-LTA₄-Hydrolase zu etwa 90% identisch sind. Somit kann erwartet werden, dass die dreidimensionalen Strukturen derselben zu etwa demselben Grad identisch sind.
„Thiolamin" und „Hydroxamsäure" werden hierin verwendet, um die Verbindungen zu bezeichnen, die im experimentellen Abschnitt der vorliegenden Erfindung als Beispiele genannt werden.
Eine „komplementäre Verbindung" bezeichnet eine beliebige Verbindung, deren Struktur eine Bindung derselben an ein spezifiziertes Protein ermöglicht, das heißt eine Verbindung mit einer Konformation oder Struktur, die eine geeignete Anpassung ermöglicht, um eine energetisch günstige Wechselwirkung zwischen Protein-komplementärer Verbindung bereitzustellen. „Analogon", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, meint ein chemisch verändertes Molekül, das die Hauptkette mit einem „Stammmolekül" teilt oder wenigstens diesen strukturell ähnelt. In der vorliegenden Erfindung kann ein solches „Stammmolekül" LTA₄-Hydrolase oder ein Inhibitor davon sein.
In der vorliegenden Anmeldung ist der Ausdruck „aktive Stelle" so zu verstehen, dass er eine beliebige Region umfasst, die fähig ist, ein Substrat zu binden und es in ein Produkt umzuwandeln.
Der Ausdruck „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Polymer entweder in Einzelstrangform oder Doppelstrangform, und wenn es nicht in anderer Weise beschränkt ist, umfasst es bekannte Analoga von Nukleotiden, die in ähnlicher Weise wie natürlich auftretende Nukleotide fungieren können.
Der Ausdruck „spezifisch hybridisierend an" bzw. „hybridisiert spezifisch an" bezieht sich auf die Bindung, Doppelstrangbildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur an eine bestimmte Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn jene Sequenz in einem komplexen Gemisch aus (z.B. gesamter zellulärer) DNA oder RNA vorliegt. Der Ausdruck „strin gente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter welchen eine Sonde an ihre Targetuntersequenz hybridisieren wird, nicht aber an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden bei verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegen. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, definiertem pH und definierter Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Sonden, die zu der Zielsequenz komplementär sind, im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren. (Da die Zielsequenzen im Allgemeinen im Überschuss vorliegen, sind bei Tm 50% der Sonden beim Gleichgewicht besetzt). Typischerweise werden stringente Bedingungen solche sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Na-Ionen ist, typischerweise wird die Na-Ionenkonzentration etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 betragen, und die Temperatur ist wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nukleotide). Stringente Bedingungen können auch mit Zusatz von Destabilisierungsmitteln, zum Beispiel Formamid, erreicht werden.
„Im Wesentlichen rein" bedeutet hierin eine Reinheit von wenigstens etwa 80%, speziell von wenigstens etwa 90% und vorzugsweise wenigstens etwa 95%, zum Beispiel 98–99%. Die Reinheit von LTA₄-Hydrolase, einem Analogon oder Inhibitor davon wird vorzugsweise durch allgemeine biochemische und biophysikalische Verfahren bestimmt, die einem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Für Proteine kann SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mit Coomassie- und Silber-Färbung oder Aminosäuresequenzanalyse verwendet werden, wohingegen Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie, gekoppelt an Massenspektrometrie (GC-MS) und kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) geeignete Verfahren für kleine organische Moleküle (Peptide, Lipide oder Kohlenhydrate oder Kombinationen dieser Substanzklassen) sind.
2.4 Detaillierte Beschreibung der Erfindung
2.4.1. LTA₄-Hydrolase
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen isolierten Proteinkristall, umfassend die Aminosäuresequenz von Leukotrien A₄ (LTA₄)-Hydrolase, wobei das Protein die entsprechende dreidimensionale Form hat, die der in der Natur entspricht. Das obige offenbarte Protein ist fähig, durch Bereitstellung enzymatischer Aktivität an der Leukotrienkaskade teilzunehmen und sie zu beeinflussen. Am bevorzugtesten ist das Protein fähig, diese Kaskade durch Ausüben einer enzymatischen Aktivität zu kontrollieren und somit die Produktion von Leukotrien B₄ (LTB₄) zu regulieren. Das LTA₄-Hydrolaseprotein besteht im Wesentlichen aus der gesamten Aminosäuresequenz von Leukotrien A₄ (LTA₄)-Hydrolase, wie sie in SEQ ID NO: 1 offenbart ist.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen isolierten LTA₄-Hydrolaseproteinkristall. Spezifischer stellt die vorliegende Anmeldung eine Liste bereit, die erstmals die Koordinaten erläutert, die humane LTA₄-Hydrolase komplexiert mit einem Inhibitor dafür definieren. Somit wurden von den Erfindern der vorliegenden Erfindung die Koordinaten bestimmt, die die Konformation von LTA₄-Hydrolase definieren, wenn sie mit Bestatin, Thiolamin bzw. Hydroxamsäure komplexiert ist. Bestatin ist ein universeller Inhibitor, der Aminopeptidaseaktivität (siehe z.B. Mathé, G. Biochem. Pharmacol. 45, 49–54 (1991)), während die Letztgenannten zwei spe zifische Inhibitoren von LTA₄-Hydrolase sind. Basierend auf diesen unterschiedlichen Aktivitäten können die genannten Inhibitoren als Modelle bei der Entwicklung von neuen Molekülen mit gewünschten Eigenschaften eingesetzt werden. Aus Gründen der Bequemlichkeit für den Leser der vorliegenden Beschreibung ist die Datensammlung, die die neuen Koordinaten gemäß der Erfindung umfasst, in der vorliegenden Beschreibung als ein getrennter Abschnitt mit der Bezeichnung „Röntgenstrahldaten", als Tabelle 9, unmittelbar vor den Ansprüchen enthalten. In der genannten Tabelle definieren Atom Nr. 1 bis Atom Nr. 4.876 den LTA₄-Hydrolaseteil des Komplexes (Proteinteil); Atom Nr. 4.877 bezieht sich auf Zn, Atom Nrn. 4.878–4.880 beziehen sich auf Yb; Atom Nrn. 4.881–4.885 beziehen sich auf Imidazol; Atom Nrn. 4.886–4.889 beziehen sich auf Acetat; Atom Nrn. 4.890–4.908 beziehen sich auf Thiolamin, während die Atom Nrn. 4.909–5.160 sich auf Wasser beziehen. Demnach beziehen sich die intervenierenden Atome auf die Metalle, die in LTA₄-Hydrolase binden, das heißt die aktive Stelle Zn-Atom und die Yb-Atome, die für die vorliegenden Strukturbestimmung essentiell sind. Die Bedingungen, die bei der Bestimmung derselben vorherrschen, werden detailliert im experimentellen Abschnitt unten beschrieben werden. Wie der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, weisen solche Koordinaten üblicherweise einen gewissen Variationsgrad in Folge z.B. thermischer Bewegung und leichter Unterschiede in der Kristallpackung auf. Somit ist jede Bezugnahme hierin auf Tabelle 9 in Verbindung mit den Proteinen und anderen Molekülen lediglich dazu bestimmt, einen Durchschnittswert für jede der Koordinaten anzugeben, die die Konformation der Molküle unter identischen Bedingungen definieren, wie sie durch Verwendung derselben Apparatur und desselben Verfahrens bestimmt wurden. Dementsprechend ist diese Ausführungsform der Erfindung nicht auf ein Molekül beschränkt, das exakt die spezifizierten Koordinaten hat, sondern eher auf Moleküle, die fähig sind, eine solche Struktur anzunehmen. Beispielsweise wird eine humane LTA₄-Hydrolase eine starke Konformationsähnlichkeit mit den Koordinaten aufweisen, die durch Atom Nrn. 1–4.876 von Tabelle 9 präsentiert werden, wobei eine Schwankung von etwa 1% oder 0,5 Å erwartet werden kann. Dementsprechend liegen beliebige derartige Varianten im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Was die Aminosäuresequenz angeht, so ist das Protein durch direkten Sequenzvergleich zu wenigstens etwa 50%, spezifischer wenigstens etwa 70%, zum Beispiel wenigstens etwa 90%, mit der LTA₄-Hydrolase, wie sie in SEQ ID NO: 1 definiert ist, identisch, während sie in der dreidimensionalen Form an die Natur angepasst ist. In diesem Kontext wird betont, dass die Aminosäuresequenz von LTA₄-Hydrolase auch aus den Daten von Tabelle 9 hervorgeht, allerdings ist sie auch als getrenntes Sequenzprotokoll aus Gründen der Klarheit enthalten. Das Protein sind z.B. Varianten, die von einer beliebigen Spezies, vorzugsweise Säugern, zum Beispiel Menschen, Mäusen oder anderen Nagern usw., stammen. Alternativ sind die Varianten, die Untersequenzen der humanen Sequenz enthalten, mutierte Formen, die entweder aus spontanen Mutationen oder bewusst produzierten Mutationen resultieren.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Proteinkristall, der wenigstens eine der Regionen, die unten in den Tabellen 1–3 definiert sind, als aktive Stellen umfasst.
Tabelle 1: Reste, die den großen Hohlraum von der Außenseite zur Innenseite auskleiden
In Tabelle 1 sind Lys565, Ser380, Pro569, Glu533, Tyr383, Phe314, Glu318, Glu384, Arg326, Gly268, Gly269, Met270, His295, Phe340, Ser288 und Glu325 streng konservierte Aminosäuren, während Lys608, Phe356, Phe362, Lys572, Arg568, Tyr378, Phe536, Tyr267 und Asn291 in ihrer Natur konserviert sind.
Tabelle 2: Aminosäuren in der Bestatin-Bindungsstelle („basische" Aminopeptidase-Stelle)
Die Bindung von Bestatin an LTA₄-Hydrolase kann auch durch Koordinaten beschrieben werden. Unten folgen die spezifischen Aminosäuren, die bei der Bindung von Bestatin und ähnlichen Strukturen involviert sind, wie es gemäß der Erfindung definiert ist.
Gln136; Ala137; Tyr267; Gly268; Gly269; Met270; Glu271; Val292; His295; Glu296; His299; Glu318; Tyr378; Tyr383; Arg563; Lys565.
Tabelle 3: Aminosäuren in der Leukotrien-Bindungsstelle
Die vorliegenden Aminosäuren definieren die Bindungsstelle von Leukotrien-basierten Inhibitoren, zum Beispiel Thiolamin und Hydroxamsäure, wie es in Tabelle 9 für Thiolamin gezeigt ist.
Gln136; Ala137; Tyr267; Gly268; Gly269; Met270; Glu271; Val292; His295; Glu296; His299; Trp315; Glu318; Val322; Phe362; Val367; Leu369; Pro374; Asp375; Ile372; Ala377; Pro382; Tyr378; Tyr383; Arg563; Lys565.
In den Tabellen 1–3 oben beginnt die Durchnummerierung der Aminosäuresequenz von LTA₄-Hydrolase ohne das Anfangs-Met. Demnach ist die obige Aminosäurenummerierung im Vergleich zu SEQ ID NO: 1, die das Anfangs-Met enthält, um 1 niedriger. Folglich entspricht das obige Gln136 dem Gln137 von SEQ ID NO: 1, Ala137 entspricht Ala138 von SEQ ID NO: 1 usw.
Tabelle 4: Allgemeine katalytische Domäne für die M1-Klasse von Enzymen
Aminosäuren Nr. 210–450
Die vorliegende Region wird eine Basis für die Entwicklung von Enzyminhibitoren bereitstellen, die in der Kontrolle anderer biologischer Wege als der Leukotrienkaskade einsetzbar sind.
Was die oben definierte Region der Aminopeptidaseaktivität von LTA₄-Hydrolase angeht, so haben die Erfinder der vorlie genden Erfindung überraschenderweise beobachtet, dass die genannte Region in der Tat für alle Enzyme, die zu der Familie der Metallohydrolasen gehören, die M1 genannt werden, universell ist. Zusätzlich zu den verschiedenen vorteilhaften Verwendungen von Sequenzen der LTA₄-Hydrolase, die hierin in Verbindung mit der Leukotrienkaskade beschrieben werden, wird diese Region, die allen M1-Enzymen gemeinsam ist, mehrere weitere Anwendungen in Verbindung mit anderen enzymatischen Wegen finden. Beispielsweise kann die vorliegende Region, die hierin als die „M1-Region" bezeichnet wird, um klar zu stellen, dass sie den M1-Enzymen gemeinsam ist, vorteilhafterweise eingesetzt werden, um synthetische Inhibitoren zu produzieren oder natürliche Inhibitoren für eines der anderen M1-Enzyme zu identifizieren.
Die oben offenbarten Proteine und Peptide, die Untereinheiten der LTA₄-Hydrolase umfassen, werden vorteilhafterweise z.B. als Enzyme oder bevorzugter in Verfahren, in denen neue Inhibitoren enzymatischer Aktivitäten identifiziert und/oder entwickelt werden, eingesetzt.
2.4.2 Identifizierung von Verbindungen, die zur LTA₄-Hydrolase komplementär sind
In einem zweiten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Identifizierung einer neuen Verbindung, die durch eine Struktur definiert ist, die im Wesentlichen komplementär zu dem oben beschriebenen Protein ist, die vorzugsweise durch Verwendung der neuen LTA₄-Hydrolaseproteinkristall-Konformation gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde. Die komplementäre Verbindung ist ein natürlich auftretendes oder synthetisches Protein, Peptid, Lipid, Kohlenhydrat oder eine beliebige andere organische oder anorganische Verbindung. Solche Verbindungen werden aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert, sind vorzugsweise mit Hilfe der neuen Koordinaten identifizierbar, welche Strukturen definieren, wie es durch die komplementären Verbindungen, die in den in Tabelle 9 gezeigten Komplexen verwendet werden, beispielhaft gezeigt wird.
Eine komplementäre Verbindung ist im Wesentlichen komplementär zu einer enzymatisch aktiven Stelle des Proteins und ist vorteilhafterweise fähig, eine enzymatische Aktivität des Proteins spezifisch zu inhibieren. Eine Verbindung ist im Wesentlichen zu der ganzen „basischen" Aminopeptidase-Bindungsstelle, die in Tabelle 2 oben definiert ist, oder einem Teil davon komplementär. Somit ist die Verbindung ein Inhibitor, der spezifisch die Aminopeptidaseaktivität eines Enzyms, vorzugsweise von LTA₄-Hydrolase inhibieren kann. Die Verbindung ist im Wesentlichen komplementär zu Teilen der Leukotrienbindungsstelle, wie sie in Tabelle 3 oben definiert ist, oder zu der ganzen Leukotrien-Bindungsstelle. Somit ist die Verbindung ein Inhibitor, der fähig ist, eine Epoxidhydrolaseaktivität eines Enzyms, vorzugsweise von LTA₄-Hydrolase, spezifisch zu inhibieren (die Inhibierung sowohl von Aminopeptidase als auch von Epoxidasehydrolase wird detailliert im experimentellen Abschnitt diskutiert). Da die vorliegenden zwei Bindungsstellen von LTA₄-Hydrolase teilweise überlappen, ist eine Verbindung, die zu wesentlichen Teilen der beiden der oben diskutierten zwei Bindungsstellen teilweise komplementär ist, vorzugsweise ein Inhibitor von beiden diskutierten Aktivitäten.
Wie bereits oben erwähnt wurde, ist eine Verbindung, die komplementär zu einer enzymatisch aktiven Stelle von LTA₄-Hydrolase ist, eine Verbindung, die komplementär zu der M1-Region derselben ist und somit zur partiellen oder vollständigen Inhibierung der enzymatischen Aktivität von LTA₄-Hydrolase oder einer beliebigen anderen Metallohydrolase, die zu der M1-Familie gehört, fähig ist. In der vorliegenden Anmeldung werden solche Inhibitoren M1-Inhibitoren genannt.
Wie der Fachmann auf diesem Gebiet erkennen wird, müssen die oben offenbarten Inhibitoren keine Verbindung sein, die eine biologische Aktivität vollständig inhibiert, sondern sie kann fähig sein, eine partiell inhibierende Aktivität auszuüben, das heißt eine Senkung der enzymatischen Aktivität.
Die komplementäre Verbindung ist eine Verbindung, die auch fähig ist, an den Rezeptor für das Produkt einer LTA₄-Hydrolase, das heißt einen LTB₄-Rezeptor, z.B. auf einer Zelle, zum Beispiel als polymorphonukleärer Leukozyt, zu binden. Somit kann eine derartige Verbindung als LTB₄-Antagonist einsetzbar sein, wodurch die biologische Wirkung von LTA₄-Hydrolase-Aktivität reguliert werden kann.
Die komplementäre Verbindung ist eine Verbindung, die abgesehen davon, dass sie zur Bindung an eine aktive Stelle von LTA₄-Hydrolase fähig ist, auch fähig ist, an eine aktive Stelle von LTC₄-Synthase zu binden, welche dasselbe Substrat wie LTA₄-Hydrolase bindet, das heißt LTA₄, und es in LTC₄ umwandelt (siehe 1); demnach wird erwartet, dass es wichtige Strukturmerkmale mit der aktiven Stelle von LTA₄-Hydrolase teilt. Eine solche Verbindung kann als Inhibitor der LTC₄-Biosynthese nützlich sein, wodurch die Produktion desselben reguliert werden kann.
2.4.3 Ein isolierter Proteinkristall eines Proteinkomplexes von LTA₄-Hydrolase und einer komplementären Verbindung
In einem dritten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen isolierten Proteinkristall eines Proteinkomplexes, der aus einem Protein, wie es oben beschrieben wurde, und einer zu dem genannten Protein komplementären Verbindung besteht. Die genannte komplementäre Verbindung kann somit ein Inhibitor einer oder mehrerer der enzymatischen Aktivitäten des Proteins, zum Beispiel Aminopeptidase- und/oder Epoxidhydrolase-Aktivität, zum Beispiel Bestatin, Hydroxamsäure oder Thiolamin sein. Beispiele für komplementäre Verbindungen sind Bestatin, Thiolamin oder Hydroxamsäure. In spezifischen Ausführungsformen besteht der Proteinkristall eines Proteinkomplexes gemäß der Erfindung aus LTA₄-Hydrolase komplexiert mit Bestatin, Thiolamin oder Hydroxamsäure, wobei die LTA₄-Hydrolase durch die in Tabelle 9 angegebenen Koordinaten definiert ist. Da Bestatin auf Aminopeptidase basiert, können weitere ähnliche und vorteilhafte Inhibitoren auf der Basis der strukturellen Information für LTA₄-Hydrolase komplexiert mit Bestatin, vorzugsweise kombiniert mit der Spezifikation der Bindungsstelle von Tabelle 2, entwickelt werden. Da auch Thiolamin leukotrienbasiert ist, wobei die Information in Tabelle 9 bereitgestellt wird, das vorzugsweise mit der Spezifikation von der Bindungsstelle von Tabelle 3 kombiniert wird, wird es sich als vorteilhaftes Werkzeug erweisen, um mehr Informationen über eine derartige enzymatische Bindung und somit die Entwicklung weiterer neuer Inhibitoren zu erhalten, wobei dieselben Prinzipien auf Hydroxamsäure Anwendung finden, welche ebenfalls auf Leukotrien basiert.
Dementsprechend präsentiert die vorliegende Erfindung erstmals die Koordinaten, die die dreidimensionale Struktur eines Proteinkristalls eines Proteinkomplexes von LTA₄-Hydrolase und einem Inhibitor davon definieren, wie sie durch Röntgenstrahlkristallographie bestimmt wurden, die in Tabelle 9 dargestellt sind. Tatsächlich ist dies überhaupt das erste Mal, dass die genauen Parameter offenbart sind, die die dreidimensionale Struktur einer Proteinkomponente der Leukotrienkaskade definieren. In Folge dieser neuen zuverlässigen Parameter werden der Komplex wie auch die Komponenten desselben leicht vom Stand der Technik unterschieden. Zusammen mit biochemi schen und mutagenetischen Daten werden die neuen Strukturen die Basis für das Verständnis der molekularen Mechanismen der Aminopeptidase- und Epoxidhydrolase-Aktivitäten wie auch der Enzymsuizidinhibierung liefern. Folglich wird die vorliegende Erfindung einen ganzen Bereich neuer Möglichkeiten bezüglich z.B. Identifizierung und/oder Entwicklung neuer biologisch aktiver Moleküle und Verfahren zur Kontrolle dieser Kaskade in vivo oder in vitro eröffnen. Folglich können neue vorteilhafte Wirkstoffe, zum Beispiel Medikamente für die Behandlung und/oder Prävention inflammatorischer und/oder allergischer Krankheiten entwickelt werden.
Im vorliegenden Kontext ist zu verstehen, dass Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung die natürlich auftretenden dreidimensionalen Formen davon, getrennt und isoliert aus ihren natürlichen Umgebungen, wie auch ein beliebiges derartiges Protein in dem Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen der Aminosäuresequenz durchgeführt wurden, enthalten, vorausgesetzt, dass die dreidimensionale Struktur im Wesentlichen beibehalten wird, wenn die ausgeübte biologische Aktivität in kritischer Weise von der besonderen dreidimensionalen Faltung des Proteins abhängt.
2.4.4 Vorteilhafte Verwendungen von LTA₄-Hydrolase, komplementären Verbindungen und Komplexen davon
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der dreidimensionalen Struktur eines LTA₄-Hydrolaseproteinkristalls, einer komplementären Verbindung oder eines Komplexes gemäß der Erfindung bei der Arzneimittelentwicklung, zum Beispiel bei der molekularen Modellierung, einer direkten strukturbasierten Entwicklung und/oder in der kombinatorischen Chemie. Solche Verfahren werden im Detail nachfolgend offenbart. Die Wirkstoffe bzw. Arzneimittel, die unter Verwendung der oben genannten Verbindungen entwickelt wurden, können für die Behandlung und/oder Prävention von Störungen, die akute und chronische inflammatorische Symptome involvieren geeignet sein, wobei die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die Arthritis, entzündliche Darmkrankheit (IBD), Psoriasis, chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD) und erworbenes Immundeffizienzsyndrom (AIDS), umfasst. Darüber hinaus kann ein solches Arzneimittel bzw. ein solcher Wirkstoff für die Behandlung und/oder Prävention von proliferativen Störungen, zum Beispiel Neoplasien und/oder Krebs, eingesetzt werden. Alternativ kann ein Wirkstoff entwickelt werden, der für die Behandlung und/oder Prävention von inflammatorischen und/oder allergischen Störungen, die durch den letalen Faktor von Bacillus anthracis verursacht werden, z.B. Anthrax, wirksam ist. Allerdings sind die oben genannten Erkrankungen exemplarisch und andere Erkrankungen oder Zustände, die hier nicht erwähnt sind, können ebenfalls in Betracht gezogen werden.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der dreidimensionalen Struktur eines Proteinkristalls, der eine Struktur hat, wie sie für die LTA₄-Hydrolase definiert ist, zum Screening auf eine Verbindung für mögliche medizinische Aktivität. In der pharmazeutischen Industrie werden routinemäßig neue oder bekannte Verbindungen für neue Verwendungen durchgemustert, wobei diese eine Vielzahl von bekannten in vitro- oder in vivo-Screens verwendet. Oft involvieren solche Screens komplexe natürliche Substanzen und sind folglich teuer durchzuführen, und die Resultate können schwer zu interpretieren sein. Allerdings erlaubt die Kenntnis der dreidimensionalen Proteinstruktur gemäß der Erfindung die Durchführung eines vorläufigen Screenings auf der Basis der dreidimensionalen Struktur einer Region davon auf strukturelle Ähnlichkeit eines Moleküls, das gescreent wird. Ein derartiges Screening bzw. eine derartige Durchmusterung kann zweckdienlicherweise unter Verwendung von Computer-Modellierungstechniken durchgeführt werden, die die dreidimensionale Struktur eines Proteins oder eines Teils davon mit der Struktur des Moleküls, das gescreent wird, anordnen. Potentielle Agonist- oder Inhibitoraktivität kann vorausgesagt werden. Als Resultat können die Produktionseffizienz, die Bioverfügbarkeit, die Immunogenität, Stabilität usw. günstigerweise bzgl. ihrer therapeutischen Anwendung verändert werden.
Was die oben offenbarten M1-Inhibitoren angeht, so werden diese Verbindungen wahrscheinlich ein breiteres Anwendungsgebiet finden als die anderen neuen Inhibitoren. Somit werden die neuen allgemeinen M1-Inhibitoren vorteilhafterweise z.B. in Modellen verwendet, um andere enzymatische Wege detaillierter zu offenbaren. Darüber hinaus werden sie auch in dem oben genannten Verfahrenstyp zur Wirkstoffentwicklung bzw. Arzneimittelentwicklung usw. eingesetzt.
2.4.5 Screening auf LTA₄-Hydrolase-Analoga
2.4.5 (a) Verfahren
Ein Verfahren zum Screening auf LTA₄-Hydrolase-Analoga, die wenigstens einen Teil der dreidimensionalen Struktur von LTA₄-Hydrolase nachahmen, umfasst die Schritte:

(a) Produzieren einer Vielzahl von Analogonstrukturen der LTA₄-Hydrolase,
(b) Auswählen einer Analogonstruktur, die durch eine dreidimensionale Darstellung dargestellt wird, wobei die dreidimensionale Konfiguration und die räumliche Anordnung spezifischer Regionen, die vorzugsweise bei der Ligandenbindung der LTA₄-Hydrolase involviert sind, im Wesentlichen konserviert bleiben.

Die verwendeten Koordinaten sind für LTA₄-Hydrolase allgemein und sind im Wesentlichen wie in Tabelle 9 dargestellt, wie es durch die Atomnummern 1–4.876 definiert wird.
Spezifischer können Analogonstrukturen der LTA₄-Hydrolase durch ihre Fähigkeit, eine bestimmte Reaktion zu katalysieren, die durch chemische, physikalische oder immunologische Mittel überwacht werden kann, durchgemustert werden. Darüber hinaus kann die Analogonstruktur nach ihrer Fähigkeit, Rezeptorliganden oder Inhibitoren von sekundären Reaktionen zu produzieren, die direkt, wie es oben beispielhaft beschrieben wurde, über Bindungsassays, Enzymassays, chemische Assays oder funktionelle Bioassays überwacht werden, ausgewählt werden.
In einem Screeningverfahren wird auf ein Analogon oder mehrere Analoga, das/die Epoxidhydrolaseaktivität aufweist/aufweisen, durchgemustert. Somit kann ein solches Verfahren auf den Daten von Tabelle 9 basieren, wo die Bindung von Thiolamin an LTA₄-Hydrolase gezeigt ist, vorzugsweise kombiniert mit den Informationen von Tabelle 3 bezüglich der aktiven Stelle von LTA₄-Hydrolase. Es wird auf ein Analogon oder mehrere Analoga, das/die Epoxidhydrolaseaktivität aufweist/aufweisen, durchgemustert. Ein Verfahren wird eingesetzt, um auf Analoga durchzumustern, die Aminopeptidaseaktivität aufweisen, wobei das Verfahren zum Beispiel auf Daten basiert, die die Bindung von Bestatin an LTA₄-Hydrolase betreffen, vorzugsweise kombiniert mit der Information von Tabelle 2 bezüglich der aktiven Stelle von LTA₄-Hydrolase. So werden die Analoga eine Region umfassen, die im Wesentlichen analog zu den Regionen von LTA₄-Hydrolase ist, die Aminopeptidaseaktivität aufweisen, und/oder es werden Analoga ausgewählt, die Epoxidhydrolase-Aktivität aufweisen.
2.4.5 (b) Mutierte Formen von LTA₄-Hydrolase
Ein spezifiziertes Analogon, das eine mutierte Form von LTA₄-Hydrolase ist, umfasst eine oder mehrere der Mutationen, die in den folgenden Tabellen 5–7 definiert sind, worin Aminosäuren im Einbuchstabencode angegeben sind. Somit gibt Q134G/A/V/L/I/S/T/D/E/N/R/H/K/P/C/M/F/Y/W an, dass der Glutaminrest 134 bei Verwendung des LTA4-Hydrolase-Nummerierungsschemas in Alanin, Valin, ein Leucin usw. modifiziert ist.
Tabelle 5: Mutationen an der aktiven Stelle
Ein Analogon umfasst eine beliebige Kombination von wenigstens zwei mutierten Aminosäuren oder eine beliebige der oben genannten Sequenzen von Mutationen oder eine getrennte Einaminosäuremutation ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Sequenzen Nummern 1–9, 13–15, 17–24, 26 und 28, die alle neue Mutationen sind, die vor der vorliegenden Anmeldung niemals veröffentlicht wurden. Zwei spezifische Ausführungsformen der Mutationen, die E271Q und D375N genannt werden, haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
Tabelle 6: Mutationen der gekrümmten Außenseite der N-terminalen Domäne
Tabelle 7: Mutationen an der Prolin-reichen Region
2.4.6 (a) Reinigung von LTA₄-Hydrolase
Ein Verfahren zur Reinigung von LTA₄-Hydrolase umfasst (i) Präzipitation mit Ammoniumsulfat, gefolgt von (ii) Trennungen an FPLC unter Verwendung von Anionenaustausch, hydrophober Wechselwirkung und chromatofokussierenden Harzen; dieses wurde beschrieben (Wetterholm A., Medina J. F., Rådmark O., Shapiro R., Haeggström J. Z., Vallee B. L., Samuelsson B. Biochim. Biophys. Acta. 1080, 96–102 (1991)). Um eine zur Kristallographie geeignete Reinheit zu erreichen, verwendeten wir (iii) eine Chromatographie an Hydroxyapatit, z.B. an einem TSK-Gel HA-1000, Tosohaas, gefolgt von (iv) einem Anionenaustauscherchromatographieschritt an z.B. Mono-Q HR5/5.
Beispiel 4 unten beschreibt außerdem detailliert eine Reinigung von LTA₄-Hydrolase.
2.4.7 Identifizierung von LTA₄-Hydrolase-bindenden Verbindungen
2.4.7 (a) Verfahren
Ein Verfahren zur Durchmusterung nach LTA₄-Hydrolasebindenden Verbindungen, die komplementär zu einer Region, vorzugsweise einer enzymatisch aktiven Stelle, z.B. wie sie in Tabellen 1–3 definiert sind, des LTA₄-Hydrolasemoleküls komplementär sind, umfasst die Schritte

(a) Herstellen einer Vielzahl möglicher komplementärer Strukturen und
(b) Auswählen einer Struktur, die durch eine dreidimensionale Darstellung dargestellt wird, wobei die dreidimensionale Konfiguration und die räumliche Anordnung von Regionen von LTA₄-Hydrolase, die bei der Bindung involviert sind, im Wesentlichen konserviert bleiben, wobei die Selektion auf der dreidimensionalen Struktur von LTA₄-Hydrolase und/oder LTA₄-Hydrolase komplexiert mit einem Inhibitor davon, z.B. wie durch die Koordinaten von Tabelle 9 definiert, basiert.

Spezifischer ausgedrückt, das Verfahren wird vorteilhafterweise verwendet, um Verbindungen, die fähig sind, Epoxidhydrolase-Aktivität und/oder Aminopeptidase-Aktivität zu inhibieren, LTB₄-Rezeptorantagonisten oder Inhibitoren von LTC₄-Synthasen oder Inhibitoren eines beliebigen Glieds der M1-Klasse von Metallohydrolasen auszuwählen. Allgemeine Enzyminhibitoren werden zum Beispiel auf Inhibitoren durchgemustert, die in der Kontrolle eines einer Vielzahl von enzymatischen Wegen einsetzbar sind, wobei eine Metallohydrolase des M1-Typs beteiligt ist. Diese allgemeinen Metallohydrolase-Inhibitoren werden hier als M1-Inhibitoren bezeichnet.
Strukturbasierte Entwicklung von Inhibitoren
Ein Verfahren einer strukturbasierten Entwicklung von LTA₄-Hydrolaseinhibitoren basiert auf der Verwendung der vorliegenden Koordinaten oder von Koordinaten, die eine ausgewählte Region definieren, als Matrizen, um vorteilhafte Inhibitoren mit starken und spezifischen Bindungseigenschaften zu synthetisieren. Spezifischer ausgedrückt, das Verfahren verwendet zuerst eine herkömmliche organische Synthese, allein oder kombiniert mit kombinatorischer Chemie, wobei die Struktur des Produktes der Synthese durch Kristallisationszyklen von Enzym und Inhibitor weiter verfeinert wird, gefolgt von einer weiteren chemischen Synthese, deren Produkt erneut gereinigt wird, usw.
Beispiel 2 beschreibt eine solche Entwicklung, wobei hervorgehoben wird, dass die Entfernung eines zusätzlichen Kohlenstoffatoms zu einer Verbindung führen könnte, die ein besserer Inhibitor als diese Hydroxamsäureverbindung ist. So werden ähnliche Schlussfolgerungen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren gezogen werden und zu Inhibitoren mit Eigenschaften, die denjenigen von Inhibitoren des Standes der Technik überlegen sind, führen.
2.5 Herstellung von neuen Proteinverbindungen
Die Verbindungen, die Proteine, Polypeptide, Peptide oder beliebige andere organische Moleküle sein können, können durch Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, chemisch synthetisiert werden, oder sie können durch Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologie durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, das dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt ist, hergestellt werden. Allgemeine Syntheseverfahren werden z.B. in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; und Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausbel et al., Current Protocols (1994) gefunden. Verfahren zur Reduzierung und Denaturierung von Proteinen und zur Induzierung der Rückfaltung sind dem Fachmann gut bekannt, siehe z.B. Debinski et al., J. Biol. Chem., 268: 14065–14070 (1993); Kreitman und Pastan, Bioconjug. Chem., 4: 581–585 (1993); und Buchner et al., Anal. Biochem., 205: 263–270 (1992).
2.6 Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Schlüsselenzyme und Intermediate in der Leukotrienbiosynthese.
2 zeigt 2Fo-Fc-Dichte konturiert bei 1,1 σ. Ein Teil der aktiven Stelle in der Nachbarschaft der Bestatinmoleküle ist gezeigt. Die Figuren sind unter Verwendung einer modifizierten Version von Molscript48,49 gebildet.
3 ist ein Bänderdiagramm der Tertiärstruktur von LTA₄-Hydrolase. Die N-terminale Domäne im oberen Teil des Diagramms ist reich an β-Strängen und wird an die katalytische Domäne an der linken Seite in der Figur, die stärker α-helikal ist und sich in den zentralen Teil des Moleküls erstreckt, gebunden. Die C-terminale Domäne, die am Boden des Bänderdiagramms dargestellt ist, erstreckt sich in Richtung der rechten Seite der katalytischen Domäne.
4(a) ist ein Bänderdiagramm der N-terminalen Domäne mit ihren Schichten aus β-Strängen, während (b) eine Überschichtung der Cα-Spur der N-terminalen Domäne auf die Cα-Spur von Bacteriochlorophyll a ist. Die N-terminale Domäne bedeckt etwa die Hälfte der Bacteriochlorophyll a-Struktur (der rechte und untere Teil des Diagramms).
5(a) ist ein Bänderdiagramm der katalytischen Domäne. Im Zentrum des Diagramms sind die drei Zink-Bindungsliganden, His295, His299 und Glu318, sowie der Inhibitor Bestatin in „Ball-and-Stick"-Darstellung gezeigt. Das Zinkion ist als ein CPK-Modell gezeigt. Das Diagramm in (b) zeigt die Struktur von Thermolysin in derselben Orientierung wie die katalytische Domäne von LTA₄-Hydrolase. Die drei Zinkliganden, His142, His146 und Glu166, wie auch der Inhibitor CbzGlyP-(O)-Leu-Leu50 sind in „Ball-and-Stick"-Darstellung gezeigt. Das Zinkion ist als ein CPK-Modell gezeigt.
6 zeigt die Struktur der C-terminalen Domäne.
7 zeigt die Zink-Bindungsliganden in LTA₄-Hydrolase, His295, His 299 und Glu318 aufgelegt auf die in Thermolysin, His142, His146 und Glu166. Andere katalytische oder benachbarte Reste in den zwei Enzymen sind Tyr383, Glu325, Glu296, Thr302 und Asn317 in LTA₄-Hydrolase, die His231, Asp170, Glu143, Asn165 und Tyr157 in Thermolysin entsprechen.
8(a) ist eine „Ball-and-Stick"-Darstellung bzw. eine „Kugel-und-Stab"-Darstellung der Bindung von Bestatin in LTA₄-Hydrolase.
8(b) ist eine schematische Übersicht der Bestatinbindung in LTA₄-Hydrolase.
9(a) ist eine Drahtdarstellung („wire representation") des Hohlraums, der in LTA₄-Hydrolase gefunden wird (gezeigt als Cα-Spur).
9(b) ist eine schematische Darstellung der vorgeschlagenen Bindung von LTA₄ in den Hohlraum.
10 ist eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen Epoxidhydrolasereaktionsmechanismuses. Das katalytische Zink wirkt als Lewis-Säure und aktiviert das Epoxid zur Bildung eines Carbokationintermediats entsprechend einer SN1-Reaktion. Wasser wird am C12 in stereospezifischer Weise addiert, vermutlich gesteuert durch Asp375. Die Doppelbindungsgeometrie wird durch die Bindungskonformation von LTA₄ kontrolliert. Weitere Details sind an anderer Stelle in der vorliegenden Beschreibung gegeben.
3. EXPERIMENTELLES
Die folgenden Beispiele sind lediglich zur Erläuterungszwecken angeführt und sollten in keiner Weise verwendet werden, um den Rahmen der vorliegenden Erfindung, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, zu deuten.
3.1 Beispiele
Beispiel 1: Bindung der Thiolverbindung (I)
Die Thiolgruppe der Verbindung wird an das Zn²⁺-Ion, das eine tetraedrische Konfiguration hat, ligiert. Beide Phenylgruppen erzeugen ausgiebige hydrophobe Wechselwirkungen. Die erste tritt in aromatische Stapelwechselwirkungen mit Phe314 und Trp311. In weitere hydrophobe Wechselwirkungen wird mit Pro374 und Leu369 getreten. Der andere Phenylring tritt in Stapelwechselwirkungen mit Tyr267 und Tyr378. Met270 und Gln136 liefern zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen. Der Ethersauerstoff im Linker zwischen den zwei Phenylringen macht eine Wasserstoffbindung an den Hauptkettenstickstoff von Ala137 und auch mit einem Wassermolekül, das an Asp375 gebunden ist. Die Amingruppe tritt in Wechselwirkungen zu Oε1 von Gln136 und Oε1 von Glu271.
Formel (I)
Beispiel 2: Bindung der Hydroxamsäureverbindung (II)
Die Bindung dieser Verbindung ist der Bindung der Thiolverbindung, die oben beschrieben ist, sehr ähnlich. Die Art, in der die Phenylgruppierungen, die Linkerregion und die Amingruppe gebunden werden, ist identisch. Die Art, in der der Hydroxamsäureteil gebunden ist, ist im Vergleich mit anderen Komplexen, zum Beispiel Thermolysin-HA-Komplexen und LTA₄-Hydrolase-Bestatin-Komplex anders. Anstelle einer zweifachen Wechselwirkung der Hydroxyl- und Carbonylsauerstoffe und dem Zinkion, die in einer pentavalenten Koordination resultiert, tritt hier nur eins der Sauerstoffe (der Hydroxylsauerstoff) in Wechselwirkung mit dem Zn-Ion, was eine tetraedrische Koordination ergibt. Die anderen Sauerstoffatome bilden eine Wechselwirkung zu Asp296 und dem Hauptkettenstickstoff von Gly268. Diese Differenz basiert wahrscheinlich auf der engen Bindung der Phenylringe und der Amingruppe. Die Verknüpfung zwischen der Amingruppe und der Hydroxamsäuregruppe enthält ein Kohlenstoffatom mehr als in einer normalen oder modifizierten Peptidverknüpfung vorliegt. Da die Bindungsstelle für Substrate eher eng an dem Zn-Ion ist, ist die Konformation von Verbindungen, die in diesem Bereich binden, eher beschränkt. Daher wird einer der sonst bindenden Sauerstoffe herausgedrückt und kann nicht länger eine Wechselwirkung mit dem Zn²⁺-Ion herstellen. Eine Entfernung dieses zusätzlichen Kohlenstoffatoms könnte zu einer Verbindung führen, die ein besserer Inhibitor als diese Hydroxamsäureverbindung ist. Die Säuregruppe an dem anderen Ende der Verbindung ist durch Herstellung einer doppelten Wechselwirkung mit dem Nε und dem NH2 von Arg563 fixiert.
Formel (II)
Beispiel 3: Strukturbestimmung von zwei spezifischen Inhibitor-LTA₄-Hydrolase-Komplexen
Kristalle, die wie oben beschrieben wachsen gelassen worden waren, wurden in 1 mM Thiolaminlösung (Yuan, et al., 1993) oder in 0,5 mM Hydroxamsäurelösung (Hogg et al., 1995) in 15% PEG8000, 50 mM Imidazol, pH 6,7, 25 mM Acetat und 2,5 mM YbCl₃ eingeweicht. Nach wenigstens 24 Stunden wurden die Kristalle in eine Lösung transferiert, die ein Cryoprotektant enthielt (siehe oben), und anschließend in flüssigem Stick stoff schnell gefroren. Die Daten für den Kristall, der in Thiolamin eingeweicht war, wurden bei BM14B in der EMBL-Außenstation in DESY, Hamburg, erhalten. Die Daten für die Hydroxamsäure wurden mit Beamline 7/11 bei MAX-lab, Lund, gesammelt. Statistiken aus den Datensammlungen sind in der Tabelle gezeigt. Die Daten wurden unter Verwendung von MOSFLM verarbeitet, ein Merging und andere Manipulationen wurden mit Programmen von CCP4 und den BIOMOL-Packages durchgeführt. Die Refinement-Verfahren für beide Datensätze waren sehr ähnlich. Zuerst wurde ein grobes „body refinement" unter Verwendung von TNT durchgeführt. Als Ausgangsmaterial zum Refinement und Modellierung wurde die Struktur von LTA₄-Hydrolase komplexiert mit Bestatin verwendet. Das Bestatinmolekül und alle Wassermoleküle wurden aus dem Modell gelöscht. Nach diesem Anfangs-Refinement wurde es möglich, die Inhibitoren in das Protein einzubauen. Zur Beurteilung der Dichtekarten und der Modellierung wurde das Programm QUANTA (Molecular Simulations Inc., Burlington, MA) verwendet. Das Refinement wurde unter Verwendung von TNT fortgesetzt und wurde mit Modellierungssitzungen kombiniert. In keiner Runde wurden Sigma-Cut-Offs verwendet, und die Auflösung wurde langsam während des Verfahrens erhöht. Wassermoleküle wurden identifiziert und in die Modelle eingearbeitet. Während dieser Verfahren wurde der R_free-Wert sorgfältig überwacht. Als das Refinement konvergiert war, wurde es mit einer Runde beendet, in die alle Überlegungen, einschließlich solcher, die für die Berechnungen des R_free-Wertes eingesetzt wurden, eingearbeitet waren. Eine Statistik über Refinement und Qualität der Modelle kann in Tabelle 5 gefunden werden.
Tabelle 8: Statistik des Refinements und der Qualität des Modells
Beispiel 4: Reinigung von LTA₄-Hydrolase
Für eine Adsorptionschromatographie an Hydroxyapatit wurde eine TSK-Gel HA-1000-Säule (Tosohaas) in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, supplementiert mit 0,2 mM CaCl₂, äquilibriert. Die Enzymprobe wurde aufgebracht und ein linearer Gradient an zunehmenden Phosphat (10–400 mM) wurde durch Mischen des Ausgangspuffers mit 400 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,8, supplementiert mit 10 μM CaCl₂, entwickelt. Aktive Fraktionen, die LTA₄-Hydrolase enthalten, wurden zwischen 150 und 190 mM Kaliumphosphat eluiert.
Es wurde eine Anionenaustauscherchromatographie an einer Mono-Q HR 5/5-Säule (Pharmacia Biotech), die mit dem Ladungspuffer 10 mM Tris-Cl, pH 8 equilibriert worden war, durchgeführt. Das reine Protein wurde unter Verwendung eines linea ren KCl-Gradienten (0–500 mM) eluiert und bei 110–140 mM KCl gewonnen.
Beispiel 5: Enzymtechnik
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass, wenn Tyr-378 in LTA₄-Hydrolase gegen einen Phe-Rest ausgetauscht wurde, das resultierende mutierte Enzym nicht länger durch LTA₄ suizidinhibiert war und eine deutlich erhöhte katalytische Wirksamkeit aufwies. Darüber hinaus war das mutierte Enzym fähig, LTA₄ nicht nur in das natürliche Produkt LTB₄, sondern auch in einen neuen Metaboliten 6-trans-8-cis-LTB₄ umzuwandeln (Mueller, M. J., et al. Proc Natl Acad Sci USA 93, 5931–5935 (1996)).
Beispiel 6: Enzymtechnik
Tyr-383 in Maus-LTA₄-Hydrolase wurde gegen einen Gln-Rest ausgetauscht, was in einem mutierten Enzym resultierte, das zur Bildung des nicht natürlichen Produktes 5S,6S-Dihydroxy-7,9-trans-11,14-cis-eicosatetraensäure aus LTA₄ fähig ist (Andberg, M., Hamberg, M. & Haeggström J. Z. J. Biol. Chem. 272, 23057–23063 (1997)).
Beispiel 7: Kristallisation von LTA₄-Hydrolase
LTA₄-Hydrolase wurde unter Verwendung von YbCl₃ als Additiv, 15% PEG und 50 mM Na-Acetat als Präzipitationsmittel und 50 mM Imidazol, pH 6,7, als Puffer kristallisiert. Eine Flüssig-Flüssig-Diffusion in Kapillaren wurde als Kristallisations-Setup verwendet.
3.2 Materialien und Verfahren
Enzymreinigung. Humane rekombinante LTA₄-Hydrolase wurde in E, coli exprimiert und zur Homogenität in vier chromatographischen Schritten an FPLC unter Verwendung von Anionaustausch, hydrophober Wechselwirkung, Chromatofokussierung und Hydroxyapatitharzen gereinigt, und zwar im Wesentlichen wie es bereits beschrieben wurde (Wetterholm A., Medina J. F., Rådmark, O., Shapiro R., Haeggström J. Z., Vallee B. L., Samuelsson B. Recombinant mouse leucotriene A4 hydrolase: a zinc metalloenzyme with dual enzymatic activities. Biochim. Biophys. Acta. 1080, 96–102 (1991)).
Kristallisationsbedingungen. Die für die Kristallisationsexperimente verwendeten Chemikalien wurden von Merck bezogen und hatten die höchste verfügbare Reinheit. Der Sparse-Matrix-Kit wurde von Hampton Research erhalten. Kristallisationsbedingungen für das Protein wurden zunächst unter Verwendung des Sparse-Matrix-Ansatzes (Jancarik, J. & Kim, S.–H. J. Appl. Crystallogr. 24, 409–411 (1991)) in einer Hängetropfen-Dampfdiffusionsanordnung in Zellkulturplatten bei Raumtemperatur gesucht. Unter Bedingung 28, (30% PEG8000, 0,2 M Natriumacetat, 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 6,5) wuchsen Nadeln. Sie wurden anschließend unter Verwendung eines „finer grit search", unterschiedlicher Temperaturen zur Equilibrierung und eines Testens von Additiven reproduziert und optimiert. Kristalle wurden nur erhalten, wenn der Inhibitor Bestatin in den Kristallisationsanordnungen vorlag. Unter Verwendung von YbCl₃ als Additiv und durch Umstellung auf Flüssig-Flüssig-Diffusion in Kapillaren wurden plattenartige Kristalle wachsen gelassen. So wurden 5 μl 28% PEG8000, 0,1 mM Na-Acetat, 0,1 mM Imidazolpuffer, pH 6, 8, 5 mM YbCl₃ in den Boden einer Schmelzpunktkapillare injiziert und ein gleiches Volumen an LTA₄-Hydrolase (5 mg/ml) in 10 mM Tris-Cl, pH 8, supplemen tiert mit 1 mM Bestatin, wird aufgeschichtet. Schließlich wird die Kapillare geschlossen und bei 22°C gelagert. In 3 bis 4 Wochen treten Kristalle mit einer durchschnittlichen Größe von 0,6 × 0,4 × 0,05 mm³ auf.
Kristalleigenschaften. Die plattenartigen Kristalle diffraktieren unter Verwendung von synchrotroner Strahlung über 2 Å. Sie gehören zu der Raumgruppe P21212 mit den Zellabmessungen a = 67,59 Å, b = 133,51 Å, c = 83,40 Å, a = b = g = 90° bei 100 K. Als Cryolösung wurde ein Gemisch von 15% PEG8000, 50 mM Va-Acetat, 50 mM Imidazolpuffer, pH 6,8, 2,5 mM YbCl₃ und 25% Glycerin verwendet. Unter Annahme von einem Molekül pro Asymetrieeinheit ist der Lösungsmittelgehalt der Kristalle 48%.
Strukturbestimmung. Die Struktur wurde unter Verwendung mehrer anormaler Dispersionsmessungen an der LIII-Kante von Ytterbium (λ = 1,3862 Å) mit der beam line BM14 in the European Synchroton Radiation Facility (ESFR), Grenoble, bestimmt. Drei Datensätze, Peak (PK), Wendepunkt (PI) und Remote (RM) wurden bis zu einer Auflösung von 2,5 Å von demselben Kristall gesammelt. Der Kristall wurde so angeordnet, dass Bijvoet-Äquivalentreflektionen in einem Durchgang von 90° für jede Wellenlänge gesammelt werden konnten. Für RM wurde ein Latensatz für 2,15 Å gesammelt. Ein zweiter Kristall wurde zum Erhalt eines Datensatzes bis 1,95 Å (für die Statistik über Datensammlung und Qualität siehe Tabelle 1) verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung des Programms Denzo integriert, unter Verwendung von Scalepack (Otwinowski, Z. Data collection and Processing. Proceedings of the ccp4 study weekend. SERC Daresbury Laboratory, Warrington, UK., 56–62 (1993)) zueinander in Maßstab gesetzt und außerdem unter Verwendung von Programmen aus dem CCP4-Package (Collaborative Computing Project Number 4. Acta Crystallogr. Sect. D 50, 760–763 (1994)) weiter analysiert.
Aus Patterson-Funktionen konnte leicht eine Haupt- und eine Neben-Yb-Position identifiziert werden, eine dritte Position wurde während des „heavy atom refinement" in Differenz-Fourier-Karten identifiziert. Die „heavy atom"-Parameter wurden unter Verwendung von MLPHARE (Otwinowski, Z. Isomorphus replacement anomalous scattering. Proceedings of the CCP4 study weekend. SERC Daresbury Laboratory, Warrington, UK., 80–85 (1991)) und SHARP (de La Fortelle, E. & Bricogne, G. Met. Enzymol. 276, 472–494 (1997)) verfeinert. Die bedeutenden Endziffern waren 0,57 bis 2,15 Å. Die Phaseninformation wurde weiter auf 2,15 Å verbessert, und zwar durch „solvent flattening" unter Verwendung von SOLOMON (Abrahams, J. P. & Leslie, A.G.W. Acta Crystallographica D52, 30–42 (1996)) mit einem Lösungsmittelgehalt von 43%. Die Qualität der Karten war sehr gut und das gesamte Proteinmolekül (Rest 1–610) konnte eindeutig bestimmt werden. Der gesamte Modelaufbau wurde unter Verwendung von QUANTA (Molekülsimulationen) durchgeführt. Ein Refinement wurde durch einen Lauf von langsam kühlender Molekulardynamik in XPLOR (Brünger, A. T., Kuriyan, J. & Karplus, M. Science 235, 458–460 (1987)) unter Verwendung des RM-Datensatzes bis 2,7 Å begonnen. Die drei Yb-Ionen wurden in das Refinement mit voller Belegung für das erste Yb-Ion und halber Belegung für die zwei anderen Ionen eingeschlossen. Das Refinement wurde mit TNT durchgeführt (Tronrud, D. E., ten Eyk, L. F. & Matthews, B. W. Acta Crystallogr. Sect. A 43, 481–501 (1987)). Dieselben Überlegungen (4% der Gesamtmenge von 25–1,95 Å) wurden durch alle Refinement-Verfahren für die Berechnung von R_free (Brünger, A. T. Nature 355, 472–475 (1992)) aufrechterhalten. Die Auflösung wurde langsam verbessert, indem Sessionen des Modellaufbaus und des Refinements abwechselten. Die Daten für den zweiten Kristall bis 1,95 Å wurden für ein weiteres Refinement verwendet, während dem ein Zn-Ion, Bestatin, ein Acetat und ein Imidazolmolekül identifiziert wurden. Nach einer Beurteilung aufgrund der B-Faktoren sind diese Moleküle alle vollständig besetzt. 540 Wassermoleküle wurden an die Koordinaten addiert. Der R_free-Wert war 24,7% und der Arbeits-R-Faktor war für alle Daten zwischen 25–1,95 Å 18,8%. In einer Endrunde des Refinements wurden alle Daten zwischen 25 und 1,95 Å eingeschlossen, was zu einem End-R-Faktor von 18,5 für Reste 1–610, 3 Yb-Ionen, 1 Zn, 1 Bestatin, 1 Imidazol, 1 Acetat und 540 Wassermoleküle führte. Größtenteils hat das Modell eine gute Dichte (2), ausgenommen eine Schleife, die die Reste 179–184 umfasst, für die eine schlechte Dichte beobachtet wurde. Das Modell hat gute stereochemische Parameter (r.m.s-Bindungen = 0,010 Å, r.m.s-Winkel = 2,2°), und 91,7 der Reste liegen in dem günstigsten Teil des Ramachandran-Diagrams.
4. RESULTATE UND DISKUSSION
4.1 Gesamtstruktur und Domänenorganisation
Das LeukotrienA₄-Hydrolasemolekül ist in drei Domänen gefaltet: eine N-terminale Domäne, eine katalytische Domäne und eine C-terminale Domäne, die zusammen eine flache dreieckige Anordnung mit den ungefähren Abmessungen 85 × 65 × 50 Å³ bilden. Die Gesamtstruktur des Enzyms ist in 3 gezeigt. Obgleich die drei Domänen dicht gepackt sind und miteinander in Kontakt stehen, ist ein tiefer Spalt dazwischen ausgebildet.
4.2 Die N-terminale Domäne ist strukturell mit Bacteriochlorophyll a verwandt
Die N-terminale Domäne (Rest 1–209) besteht aus einem 7-strängigen gemischten b-Faltblatt, einem 4- und einem 3-strängigen antiparallelen β-Faltblatt. Stränge aus dem größeren β-Faltblatt setzen sich in die zwei kleineren β- Faltblätter fort, die an den Rändern derselben Seite das größere Faltblatt einpacken, sodass eine Art Umschlag gebildet wird (4a & b). Die zwei kleinen β-Faltblätter werden zur Innenseite des ganzen Proteins gedreht, während das größere β-Faltblatt Lösungsmitteln ausgesetzt wird und einen großen konkaven Oberflächenbereich bildet. Schleifen, die die anderen Stränge und hydrophoben Reste verbinden, füllen den Kern dieser Domäne. Die N-terminale Domäne von LTA₄-Hydrolase teilt wichtige strukturelle Merkmale mit dem Chlorophyllenthaltenden Enzym Bacteriochlorophyll (Bchl) a (Matthews, B., Fenna, R., Bolognesi, M., Schmid, M. & Olson, J. J. Mol. Biol. 131, 259–285 (1979)). So haben 111 Cα-Positionen äquivalente Positionen in den zwei Proteinen trotz des Fehlens einer Sequenzidentität (4b). Die Domäne hat etwa die halbe Größe von Bchl a, welches eine Einzeldomänenstruktur ohne größere Ausdehnungen hat. Wie Bchl a ähnelt die Gestalt der N-terminalen Domäne einem Umschlag bzw. einer Hülle (oder Taco) mit einem Hohlraum, und in Bchl a sind in diesem Hohlraum 7 Bacteriochlorophylle versteckt. Allerdings ist die Domäne nicht so hohl wie BChl a, da eine Schleife 135–155, die ein kleines helikales Segment enthält, nach innen gedreht ist und den Kern auffüllt. In BChl a ist die äquivalente Schleife (290–305) mehr in Richtung des äußeren des Proteins positioniert, wodurch Raum für einige der Tetrapyrrole der Bacteriochlorophylle bleibt. Das große Faltblatt (17 Stränge) von Bchl a ist auf nur 7 Stränge in LTA₄-Hydrolase verkürzt. Speziell die Region zwischen Rest 35 und 263 von Bchl a wurde durch eine viel kürzere Region in LTA₄-Hydrolase (Reste 45 bis 98) ersetzt, die das 3-strängige kleine β-Faltblatt und den Randstrang des größeren 7-strängigen β-Faltblatts bildet. Die Struktur der anderen Hälfte des Moleküls ist fast vollständig konserviert, ausgenommen die Insertion von zwei zusätzlichen Strängen anstelle von Schleifen in LTA₄-Hydrolase. Die strukturelle Homologie zwischen Bchl a, einem Protein, das bei der Lichtsammlung involviert ist, und LTA₄-Hydrolase war zweifellos unerwartet. Bei der LTA₄-Hydrolase ist die Funktion der N-terminalen Domäne noch nicht bekannt, aber man kann spekulieren, dass sie an einer Bindung an hydrophobe Moleküle oder Oberflächen mit einer möglichen regulatorischen Funktion beteiligt ist. Bei Säuger-15-Lipoxygenase wurde eine ähnliche Funktion für eine N-terminale β-Tonnendomäne mit struktureller Homologie zu einer entsprechenden C-terminalen Domäne in Säugerlipasen vorgeschlagen (Gillmor, S. A., Villasenor, A., Fletterick, R., Sigal, E. & Browner, M. F. Nature Struc. Biol. 4, 1003–1009 (1997)).
Die Verknüpfung von der N-terminalen zu der katalytischen Domäne ist sehr kurz, ein Strang aus dem 4-strängigen β-Faltblatt verknüpft zu einem Strang eines 5-strängigen antiparallelen β-Faltblatts der katalytischen Domäne. Die zwei Faltblätter sind dicht gepackt und die Grenzfläche hat hauptsächlich einen hydrophoben Charakter mit 14 hydrophoben Resten, die aus der N-terminalen Domäne stammen, und mit 11 aus der katalytischen Domäne. Wasserstoffbindungen treten zwischen Gln116 und Ser264, Ser124 und Gln226, in der Hauptkette zwischen Ser124 und Glu223, in der Hauptkette zwischen Ser151 und Lys309, Lys153 und in der Hauptkette zwischen Leu305 und indirekt durch ein Wassermolekül zwischen Tyr130 und dem Val260 in der Hauptkette auf. Zwei Salzbrücken zwischen His139 und Asp375 und zwischen Arg174 und Asp275 vervollständigen die Wechselwirkungen, die in dieser Grenzfläche auftreten.
4.3 Die katalytische Domäne enthält die Zink-Bindungsstelle und ist strukturell Thermolysin ähnlich
Die Struktur der katalytischen Domäne (Reste 210–450) ist überraschenderweise der Struktur von Thermolysin ähnlich 5a & b) (Holmes, M. & Matthews, B. J. Mol. Biol. 160, 623–639 (1982)). Als die Aminosäuresequenz in dieser Domäne mit der von Thermolysin verglichen wurde, wurde festgestellt, dass die Sequenzidentität sehr niedrig war (im Wesentlichen auf die Zinkbindungsmotive beschränkt war). Allerdings erstreckt sich die strukturelle Homologie über die gesamte Domäne. Somit überlappen nicht weniger als 146 Ca-Positionen mit einer r.m.s.-Abweichung von 1,946 Å. Wie bei Thermolysin besteht die katalytische Domäne aus zwei Lappen, einem hauptsächlich a-helikalem und einem gemischten a/b-Lappen. Der a-Lappen besteht aus 6 Haupthelices, die durch lange Schleifen, die kleinere helikale Segmente enthalten, untereinander verbunden sind, während der a/b-Lappen ein 5-strängiges gemischtes β-Faltblatt hat, das an einer Seite mit 3 Helices ausgekleidet ist. Die Zinkbindungsstelle wird zwischen den zwei Lappen gefunden. Da diese Domäne nur 245 Aminosäuren enthält und Thermolysin 314 Reste enthält, erfolgten einige Verkürzungen, speziell im a/b-Lappen, in dem die N-terminale verlängerte b-Struktur verkürzt ist und nur ein gemischtes 5-strängiges β-Faltblatt zurückbleibt. Die Änderungen in dem a-Lappen sind kleiner. Hier wurde die lange mäanderartige Schleife 181 bis 221 durch eine lange a-Helix ersetzt, und die b-Haarnadel von 245 bis 258 wurde deletiert.
Eine Schleife in der ausgedehnten Konformation an der Oberfläche des Proteins von 451 bis 463 verbindet die katalytische Domäne mit der C-terminalen Domäne. Interessanterweise enthält dieses Segment ein hochkonserviertes Prolin-reiches Motiv P451-G-f-P-P-x-K-P-x-Y460, das eine gewisse Ähnlichkeit zu einer SH3-Domäne-Erkennungssequenz trägt. Allerdings ist der kanonische Argininrest nicht auf beiden Seiten des Prolinmotivs vorhanden. Da dieser Bereich an Aminosäuren an der Oberfläche des Proteins exponiert ist, ist es noch möglich, das er als Verankerungsstelle für Protein-Protein-Wechselwirkungen dienen könnte.
Die C-terminale Domäne (464–610) besteht aus 9 a-Helices, die ein ungewöhnliches Knäuel aus Helices bilden, die an diejenigen erinnern, die in lytischer Transglycosylase⁴⁰ und kürzlich in der Armadillo-Repetierregion von b-Catenin gefunden wurden (Huber, A. H., Nelson, W. J. & Weis, W. I. Cell 90, 871–882 (1997)) (6). Die Helices sind in zwei Schichten aus parallelen Helices (5 innere und 4 äußere Helices) und in einer anti-parallelen Art zwischen den zwei Schichten gepackt. Die in den zwei anderen Proteinen gefundenen Anordnungen sind viel größer und bilden superhelikale Strukturen. In der C-terminalen Domäne von LTA₄-Hydrolase ist die Anordnung geradliniger und hat eine sehr kompakte Form. Eine der Helices ist verformt und eine der verknüpfenden Schleifen ist lang und enthält eine kleine 310-Helix. Die Domäne steht in Kontakt sowohl mit den a-Lappen der katalytischen Domäne als auch mit einem der Ränder der N-terminalen Domäne. Sie ist so positioniert, dass die Helices senkrecht zu dem 7-strängingen b-Blatt der N-terminalen Domäne und zu den meisten Helices in der katalytischen Domäne liegen. Die Helices haben einen amphipatischen Charakter, wobei die hydrophoben Stellen in Richtung der Mitte der Domäne liegen und die hydrophilen Reste zum Lösungsmittel und in die tiefe Spalte in der Mitte des ganzen Moleküls gerichtet sind. Diese Seite der Spalte ist hoch polar; 10 Arg- und Lys-Reste und 4 Asp- und Glu-Reste sind an dieser Seite positioniert.
4.4 Zinkkoordination
Die unmittelbaren Umgebungen der aktiven Stelle des Zn²⁺-Ions sind in Thermolysin und LTA₄-Hydrolase sehr ähnlich. Das Zn²⁺ ist zwischen den zwei Lappen gebunden und ist durch His295, His299, einen Carboxylsauerstoff von Glu 318 und den Carbo nyl- und Hydroxyl-Sauerstoffatomen des Inhibitors Bestatin koordiniert, so dass eine Pyramide mit quadratischer Basis gebildet wird. Die zwei Histidine stammen aus einer langen a-Helix und das Glutamat aus einer Nachbar-a-Helix, alle in dem a-Lappen. Glu296 und Tyr383, zwei Reste, die im Reaktionsmechanismus für die Peptidspaltungsaktivität impliziert sind, sind nahe dem Zn-Ion lokalisiert. Glu296, die vermeintliche allgemeine Basis, ist nahe dem Metallliganden His295 positioniert und biegt sich über das Bestatinmolekül, und Tyr383, das als ein Protonendonor beschrieben wurde, stellt ebenfalls einen Kontakt mit dem Bestatinmolekül her (8a).
Interessanterweise zeigt die zweite Schicht um das Zn-Ion Unterschiede zwischen Thermolysin und LTA₄-Hydrolase. In beiden Enzymen ist die Orientierung der Zink-Bindungsliganden durch Wasserstoffbindungen fixiert, allerdings sind die Wasserstoffbindungsakzeptoren unterschiedlich positioniert. In Thermolysin ist Nd1 von His142 über Wasserstoffbrücken an Od2 von Asp170 gebunden, während in LTA₄-Hydrolase Nd1 von His295 an Oe1 von Glu325 durch Wasserstoffbrücken gebunden ist. Dieser Rest kommt aus einem strukturellen Äquivalent zu der Helix, die Asp170 in Thermolysin trägt, ist aber eine halbe Drehung nach außen verschoben. Nd1 von His146 in Thermolysin ist durch Wasserstoffbrücken an Od1 von Asn165 gebunden. Dieser Rest ist Teil der Zinkbindungssignatur und ist zwischen den zwei Enzymen konserviert. In LTA₄-Hydrolase wurde die Helix, in der sich dieser konservierte Rest befindet, leicht gedreht und Asn317 bildet nicht länger eine Wasserstoffbindung zu His299. Die Orientierung von His299 ist nun durch eine Wasserstoffbindung von Nd1 zu dem Carbonylhauptkettensauerstoff von Thr302 fixiert. Od1 von Asn317 bildet stattdessen eine Wasserstoffbindung zu dem Hauptkettenamid von Asn381, während Nd2 eine Wasserstoffbindung zu der Hydroxylgruppe von Tyr200 bildet. Der letzte Proteinligand, Glu166 ist in Thermolysin an Tyr157 und ein Wassermolekül über Wasserstoff ge bunden, in LTA₄-Hydrolase ist Glu318 nur an ein Wasserstoffmolekül über Wasserstoff gebunden (7).
4.5 Bestatinbindung
Obgleich die Zinkbindungsstelle nur durch Reste aus der katalytischen Domäne gebildet wird und die meisten katalytischen Reste auch aus dieser Domäne kommen, ist die aktive Stelle selbst von Schleifen aus allen drei Domänen umgeben. Die Bindung von Bestatin spiegelt dies wider, da es Wechselwirkungen mit Resten aus allen drei Domänen eingeht. Die Hauptwechselwirkungen von Bestatin erfolgen durch die Carbonyl- und Hydroxylsauerstoffatome an das Zn-Atom. Hydrophobe Wechselwirkungen werden zwischen der Phenylgruppierung und den Phenylringen von Tyr267, Phe316, Tyr378 und Tyr383 gebildet. Met270 und Gln136 sind ebenfalls involviert (8a). Das andere Ende des Inhibitors ist auf das Lösungsmittel gerichtet, die Leukingruppierung bildet Wechselwirkungen mit Val292 und His295, während die Carboxylsauerstoffatome Wechselwirkungen mit Arg563 und Lys565 durch Wassermoleküle wie auch Wasserstoffbindungen an die Hauptkettenstickstoffatome von Gly268 und Gly269 eingehen. Wasserstoffbindungen werden zwischen dem Peptidyl-N von Bestatin und Oe2 von Glu296 und zwischen dem terminalen NH₂ und dem Oe1 von Glu271 und Oe1 von Gln136 gebildet. Der Hydroxylsauerstoff geht außer der Wechselwirkung mit dem Zn-Ion auch eine Wechselwirkung mit dem OH von Tyr383 ein. (Für eine schematische Übersicht siehe 8b). Tyr378, das während einer Suizidinaktivierung modifiziert wird, befindet sich etwas weiter weg, bildet aber eine Wasserstoffbindung zu Tyr383 und geht einige hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Phenylring des Inhibitors ein. Es wurde festgestellt, dass diese zwei Thyrosine an derselben Aminosäuresequenz sind, die in Thermolysin eine lange Helix bildet, in Leukotrienhydrolase ist diese Helix allerdings unterbrochen und zwei Windungen der Helix sind durch drei Reste (378–380) in einer ausgedehnten Konformation ersetzt. Die Bindung von Bestatin unterscheidet sich ziemlich von der, die im Komplex zwischen Bestatin und Rinderlinsenleukinaminopeptidase (blLAP) gefunden wurde (Burley, S., David, P., Sweet, R., Taylor, A. & Lipscomb, W. J. Mol. Biol. 224, 113–140 (1992)). In diesem Komplex war Bestatin sowohl durch den terminalen Stickstoff als auch durch den Nichtprotein-P1-Hydroxylsauerstoff an das Zn gebunden, während in LTA₄-Hydrolase das Bestatin durch die Hydroxyl- und Carbonylsauerstoffatome gebunden ist. Der terminale Stickstoff ist in der Wasserstoffbindung an Glu271 und Gln136 involviert. Diese Differenzen könnten aus der Tatsache herrühren, dass blLAP ein Bimetallprotein mit einem anderen Reaktionsmechanismus ist. Darüber hinaus ist die Bindung von Bestatin, wie sie in LTA₄-Hydrolase gesehen wird, ähnlich wie bei den Komplexen, die zwischen Thermolysin und Hydroxamaten gebildet werden, die durch die Hydroxyl- und Carbonyl-Sauerstoffatome ebenfalls als zweizähnige Liganden wirken (Holmes, M & Matthews, B. Biochemistry 20 (1981)).
Hinter der Tasche, in der der Phenylring von Bestatin bindet, gibt es einen Hohlraum, der sich 15 Å tiefer in das Protein erstreckt und etwa 6 bis 7 Å weit ist. In der vorliegenden Struktur ist dieser Hohlraum mit Wassermolekülen gefüllt. Er hat allerdings eine sehr hydrophobe Natur und ist mit Trp311, Phe314, Trp315, Phe362, Leu365, Val367, Leu369, Pro374, Ala377, Tyr378 und Pro382 ausgekleidet. In allen LTA₄-Hydrolasesequenzen, die bis jetzt bekannt sind, sind die meisten dieser Reste streng konserviert oder in der Natur konserviert, allerdings mit Ausnahme von Val367, das in den Hefe- und C. Elegans-Sequenzen durch ein Gln ersetzt ist. Interessanterweise wird Raum für diesen Hohlraum teilweise durch die Unterbrechung durch die ausgedehnte Konformation in der Sequenz, in der Tyr378 und Tyr383 gefunden werden, ge schaffen. Ein Pflaster dieser Bindungsstelle ist mit Asn134, Asp375 und dem OH von Tyr267, die ein Cluster bilden, ziemlich hydrophil. Dieser größere Hohlraum könnte eine Bindungsstelle für das LTA₄-Substratmolekül sein. Wenn die Epoxidgruppierung in ähnlicher Weise wie der Carbonylsauerstoff von Bestatin an das Zn-Ion binden würde, dann würde sich der hydrophobe Schwanz eng in die Bindungsstelle einpassen, die nun durch die Phenylgruppe von Bestatin besetzt ist und würde sich in den tieferen hydrophoben Hohlraum fortsetzen (9a). Der andere Schwanz würde in der Tasche sitzen, die nun durch die Carboxylgruppe von Bestatin besetzt ist, und er würde lang genug sein, damit die Carbonsäure direkte elektrostatische Wechselwirkungen mit den konservierten Arg563 und Lys565 eingehen kann.
Der Ersatz von Val367 durch Gln, wie es in dem Enzym aus Hefe gesehen wurde, würde den hydrophoben Kanal kürzer machen und dies könnte einer der Gründe sein, warum das Hefeenzym eine schlechte LeukotrienA₄-Epoxidhydrolaseaktivität hat. Die Art, in der das Leukotrienmolekül binden würde, ist ähnlich der, wie sie zur Bindung von Arachidonsäure in 15-Lipoxygenase vorgeschlagen wurde (Gillmor, S. A., Villasenor, A., Fletterick, R., Sigal, E. & Browner, M. F. Nature Struc. Biol. 4, 1003–1009 (1997)), wobei das hydrophobe Ende im Inneren des Proteins verborgen ist und die Carbonsäure, die sich mehr zur Oberfläche erstreckt Wechselwirkungen mit Arg- und Lys-Resten eingeht.
Die Bindung von Bestatin wirkt auch als Wegweiser für die Bindung von Peptidsubstratmolekülen. Aus systematischen Bindungsstudien mit Tripeptiden wurde gezeigt, dass das Enzym eine starke Präferenz für einen Argininrest als N-terminalen Rest hat, und für mehrere Tripeptide hat das Enzym ein kcat/Km-Verhältnis, das das zehnfache des kcat/Km für LTA₄ ist (Örning, L., Gierse, J. K. & Fitzpatrick, F. A. J. Biol. Chem. 269, 11269–11273 (1994)). Wenn wir grob ein Peptid in der aktiven Stelle mit einem N-terminalen Arg modellieren, bei dem der Carbonylsauerstoff an der Stelle der Hydroxylgruppe von Bestatin sitzt, dann wird die Arg-Seitenkette dieses Rests an derselben Stelle wie die Phenylgruppe des Bestatin sitzen, wobei die Guanidiniumkopfgruppe mit dem konservierten Asp375 und dem OH von Tyr267 wechselwirkt und die hydrophoberen Cb-, Cd- und Cg-Atome ähnliche Wechselwirkungen eingehen wie der Phenylring. Die terminale Aminogruppe könnte dieselbe elektrostatische Wechselwirkung wie die terminale Aminogruppe von Bestatin mit Asp271 und Gln136 eingehen. Dieser Bindungsmodus von Bestatin steht im Gegensatz zu dem von Örning vorgeschlagenen Modus, da der Phenylring die S1-Tasche zu besetzen scheint. Wir schlagen auch vor, dass das LTA₄-Substratmolekül alle drei Taschen, S1, S'1 und S'2 besetzt.
Wenn der Bindungsmodus von Peptiden in LTA₄-Hydrolase mit dem für Thermolysin beschriebenen verglichen wird, so werden eine Reihe von Unterschieden beobachtet. In Thermolysin wird das Peptidmolekül durch viele Wechselwirkungen zu den Hauptkettenatomen, die durch Asn112, Ala203, Arg203 und Trp115 bereitgestellt werden, an Ort und Stelle gehalten. In der Bindungsstelle in LTA4-Hydrolase kann keiner dieser Reste oder äquivalenter Reste gefunden werden. Obgleich die Bindungstaschen S1 und S'1 in ähnlichen Positionen wie in Thermolysin sind, muss die Stelle S'2 anders sein, da ihr Raum in LTA₄-Hydrolase durch Tyr378 besetzt ist. Glu271 und Gln136 und die N-terminale Domäne füllen den Raum auf, in dem in Thermolysin das „Upstream"-Peptid bindet, was zur Exopeptidasefunktion anstelle der Endopeptidasefunktion wie in Thermolysin beiträgt.
4.6 Vermeintliche Phosphorylierungsstelle
Kürzlich wurde eine spezifische Phosphorylierung durch eine noch unbekannte spezifische Kinase von Ser415 als Mittel zur Regulierung der LTA₄-Hydrolaseaktivität in Endothelzellen beschrieben (Rybina, I. V., Liu, H., Gor, Y. & Feinmark, S. J. J Biol Chem 272, 31865-71 (1997)). Dieser Rest ist in allen Säuger-LTA₄-Hydrolasen konserviert und ist in eine hochhomologe Folge von Resten eingebettet. Die Phosphorylierung dieses Rests scheint die Epoxidhydrolaseaktivität zu inhibieren, nicht aber die Aminopeptidaseaktivität. In der Struktur ist dieser Rest in einer Schleife lokalisiert, die zwei a-Helices verbindet, die auf der Oberfläche des Moleküls liegen. Die Schleife selbst ist an der Rückseite des Enzyms lokalisiert.
4.7 Aminopeptidaseaktivität
Die Aminopeptidaseaktivität, die durch dieses Enzym katalysiert wird, wurde gut untersucht und viele der wichtigen Reste waren Ziel für ortsspezifische Mutagenesestudien. Dies führt zu einem Vorschlag, in dem Glu296 als allgemeine Base wirken würde (Wetterholm, A., et al. Proc Natl Acad Sci USA 89, 9141–9145 (1992)) und Tyr383 als vermeintlicher Protonendonor wirken würde (Blomster, M., Wetterholm, A., Mueller, M. J. & Haeggström, J. Z. Eur. J. Biochem. 231, 528–534 (1995)). Im vorliegenden Komplex sind diese Reste in Wasserstoffbindungen mit dem Bestatinmolekül involviert. Wenn die Bestatinbindung als grobes Analogon für die Übergangszustandsbindung angesehen wird, dann gibt die Wechselwirkung von Glu296 mit dem Hydroxylsauerstoff von Bestatin an, dass dieser Rest tatsächlich ein Wassermolekül für den nukleophilen Angriff aktivieren könnte. Die Rolle von Tyr383 kann nicht so einfach bestätigt werden, allerdings legt seine Position die Rolle eines Protonendonors stark nahe. Im Thermo lysin ist der Protonendonor His231 und obgleich die Ca-Position dieses Rests 4,1 Å von der Ca-Position von Tyr383 in LTA₄-Hydrolase entfernt ist, ist Nd1 nur 1 Å von der OH-Position von Tyr383 entfernt. Das konservierte Glu271 könnte in die Exoproteaseaktivität des Proteins involviert sein. Kürzlich waren die Analoga Glu350 in Aminopeptidase N und Glu352 in Aminopeptidase A Gegenstand von Arbeiten über ortsspezifische Mutagenese (Luciani, N., et al. Biochemistry 37, 686–692 (1998); und Vazeux, G., Iturrioz, X., Corvol, P. & Llorenz-Cortez, C. Biochem. J. 334, 407–413 (1998)) und es wurde beobachtet, dass Mutationen dieses Rests zu großen Abnahmen bei der Aktivität im Fall von Substitutionen durch konservierte Aminosäuren wie Aspartat und Glutamin, und in Abwesenheit von Aktivität bei Substitution durch Alanin führen. Es wurde der Schluss gezogen, dass Glu350 zu der anionischen Bindungsstelle in jenem Protein gehörte. Auf der Basis von Thermolysin wurde ein Mechanismus für Aminopeptidase N mit einem fünfwertigen Übergangszustand mit einer zusätzlichen Wechselwirkung zwischen der freien α-Aminogruppe und Glu350 vorgeschlagen. In dieser Struktur können wir eine derartige Wechselwirkung zwischen Glu271 und der freien Aminogruppe von Bestatin beobachten. Darüber hinaus zeigt die fünfwertige Koordination von Zn durch His295, His299, Glu318 und den Carbonyl- und Hydroxylgruppen von Bestatin an, dass dies ein äquivalenter Übergangszustand-Analogonkomplex ist, wie er früher für Thermolysin bestimmt worden war.
Aus sorgfältigen Sequenzanordnungen und strukturellen Einblicken können wir schließen, dass die Enzyme in der M1-Familie der Proteasen eine hochkonservierte katalytische Domäne teilen, die einen Teil der N-terminalen Domäne beinhaltet, wie wir sie in LTA₄-Hydrolase und der thermolysinartigen Domäne sehen. Es gibt keine Homologie für Reste in der C-terminalen Domäne und wir glauben, dass diese Domäne für LTA₄-Hydrolasen einzigartig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird nahe gelegt, dass alle Proteasen, die zu der Klasse M1 mit der Signatur HExxH und einem Glu18-Rest stromabwärts in ähnlicher Weise wie Thermolysin wirken.
4.8 Epoxidhydrolaseaktivität
Was die Epoxidhydrolaseaktivität angeht, so ist viel weniger über die funktionellen Elemente und Mechanismen der Katalyse bekannt. In der Tat ist das prostetische Zink die einzige kritische Komponente, die bisher identifiziert wurde, und kann möglicherweise die Einführung eines Wassermoleküls am C12 oder bei der Aktivierung des Epoxids unterstützen. Obgleich Tyr378 und Tyr383 wichtige Reste der aktiven Stelle sind, ist keiner von ihnen für die Katalyse essentiell. Eine Mutation von Tyr378 zu Phe schützt das Enzym gegen Suizidinhibierung, allerdings geht die Spezifität der Doppelbindungskonfiguration teilweise verloren (Mueller, M., Andberg, M., Samuelsson, B. & Haeggström, J. J. Biol. Chem. 271, 24345–24348 (1996)), da ein neuer Metabolit mit einem cis-trans-cis-konjugiertem System detektiert werden kann. Somit ist Tyr378 während einer Suizidinaktivierung eine Hauptbindungsstelle für LTA₄ und scheint eine Rolle bei der Bildung der korrekten Doppelbindungsgeometrie in dem Produkt LTB₄ zu spielen. Mutationen von Tyr383 heben die Aminopeptidase-Aktivität auf, wenn es eine Rolle als potentieller Protonendonor (siehe oben) hat, allerdings wird die Epoxidhydrolaseaktivität im Vergleich zum Wildtyp nur verringert. Es ist allerdings in der stereospezifischen Einführung von Wasser während der Hydrolyse von LTA₄ zu LTB₄ impliziert, da diese Mutanten LTA₄ sowohl in LTB₄ als auch 5[S], 6[S]-DHETE (Andberg, M., Hamberg, M. & Haeggström, J. J. Biol. Chem. 272, 23057–23063 (1997)) umwandeln. Darüber hinaus haben sorgfältige Analysen der katalytischen Eigenschaften von Enzymen, die in Position 383 mutiert sind, viz [Y383F], [Y383H] und [Y383Q]LTA₄-Hydrolase gezeigt, dass die Epoxidhydrolasereaktion einem SN1-Mechanismus folgt.
Wenn man die Chemie betrachtet, die durch LTA₄-Hydrolase durchgeführt wird, so hat das Enzym während der Hydrolyse von LTA₄ zu LTB₄ zwei Hauptaufgaben. Erstens, Einführung eines Wassermoleküls stereospezifisch am C12 und zweitens, Bildung einer cis-Doppelbindung Æ 6 in dem resultierenden konjugierten Triensystem [siehe 1]. Wenn LTA₄ zu einer vermeintlichen Substratbindungstasche moduliert wird, wie es in 9b gezeigt ist, kommt das katalytische Zink nahe an das Epoxid und nicht an C12 des Substrats. Daher ist die wahrscheinlichste Rolle des Zn-Ions, direkt als Lewis-Säure zu wirken, um den Epoxidring zu aktivieren und zu öffnen. Dies würde ein Carbokation erzeugen, dessen Ladung über dem konjugierten Triensystem von C7 bis C12 delokalisiert sein wird. Da dieses Intermediat eine sp2-hybridisierte planare Konfiguration am C12 hat, ist es im Prinzip für einen nukleophilen Angriff von jeder Seite des Moleküls offen. Das konservierte Asp375 ist so positioniert, dass ein an es gebundenes Wassermolekül in „attackierender" Entfernung von C12 eines modellierten LTA₄-Moleküls ist, die Position, in welcher eine Hydroxylgruppe während der Reaktion insertiert wird. Dies wird zu der richtigen stereochemischen und positionalen Insertion der Hydroxylgruppe am C12 in R-Konfiguration beitragen.
Die Gestalt und die Krümmung der LTA₄-Bindungstasche gibt auch einen Hinweis, wie das Enzym diese cis-Doppelbindung am Æ6 erzeugt. Da es eine freie Rotation zwischen c6 und c7 von LTA₄ gibt, kann diese Bindung im Übergangszustand in einer „Pro-cis"-Konfiguration gehalten werden, welche wiederum die Bildung einer Æ6-cis-Doppelbindungsform des Carbokationintermediats erleichtert. Wenn LTA₄ auf diese Weise modelliert wird, nimmt das ganze Molekül eine gebogene Form an, die sich sehr gut an die Architektur der Bindungstasche anpasst (9b). Daher ist die kritische Doppelbindungsgeometrie an Æ6 von LTB₄ wahrscheinlich durch die exakte Bindungskonformation von LTA₄ an der Bindungsstelle garantiert, die wiederum durch alle Strukturelemente gesteuert wird, die an der Substratbindung teilnehmen, einschließlich der Carboxylaterkennungsstellen, Arg56 und Lys565, des katalytischen Zinks und der hydrophoben Reste, die die Tasche auskleiden. Der vermeintliche Bindungsspalt für das Leukotrienmolekül ist eng und gebogen und dadurch wird LTA₄ gegenüber anderen Epoxiden begünstigt. Die zwei Tyrosine sind so positioniert, dass sie in Kontakt mit der Dreifachdoppelbindungskonfiguration eines modellierten LTA₄-Moleküls an der Biegung der vermeintlichen Bindungstasche sind und sie durch Wasserstoffbrückenbindungen aneinander gebunden sind. Daher ist ihre Position zur Steuerung der Stereospezifität der Doppelbindungskonfiguration ideal. Der Verlust an Spezifität für den Hydroxyleinbau in der C12-Position im Fall der Tyr383-Position kann dadurch erläutert werden, dass Mutationen in dieser Position möglicherweise einen zusätzlichen Raum für ein Wassermolekül schaffen würden, das an der C6-Position angreifen könnte und so 5[S], 6[S]-DHETE bilden könnte.
Die Position von Tyr378 ist so, dass es mit dem C6-Atom des modellierten LTA₄-Moleküls in Kontakt ist. Wenn nach Öffnung des Epoxidrings die Hydroxylgruppe von Tyr378 anstelle eines Wassermoleküls das Kohlenstoffkation in der C6-Position angreifen wird, wird ein kovalent gebundenes Molekül gebildet, das den Suizid-inhibierten Komplex bildet. Um diese Hypothese zu prüfen und um mehr Informationen über die Bindungsstelle für Leukotrien A4 zu erhalten, wäre die Struktur dieser inhibierten Spezies essentiell.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass Reste nahe der aktiven Stelle weitere katalytische Rollen in der Epoxidhydrolasereaktion haben könnten, muss eine gründliche Untersuchung dieser Reste, zum Beispiel Glu271 und Gln136 begonnen werden. Darüber hinaus muss die vorgeschlagene Rolle von Asp375 bei der Aktivierung eines Wassermoleküls für den stereospezifischen Angriff am C12 untersucht werden.
Folglich hat die vorliegende Erfindung das erste spezifische leukotrienumwandelnde Enzym geklärt, das erstmals den Bindungsmodus für Leukotrienmoleküle zeigt. Darüber hinaus werden Einblicke in eine einzigartige aktive Stelle geliefert, welche zwei Aktivitäten beherbergt, indem verschiedene Aminosäuren genutzt werden, um unterschiedliche Reaktionen zu katalysieren.
5. KONFORMATIONSDATEN Tabelle 9: Strukturkoordinaten des LTA₄-Hydrolase-Thiolamin-Komplexes
Sequenzprotokoll

Claims

Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinkristall eine dreidimensionale Form aufweist, die durch die Parameter in Tabelle 9, die Atom 1 bis Atom 4876 definieren, definiert ist, wobei der Proteinkristall erhalten wird, wenn: a) ein Ytterbiumsalz, wie Ytterbiumchlorid, als ein Zusatzstoff während des Kristallisationsverfahrens verwendet wird; b) Bestatin im Kristallisationsaufbau vorhanden ist; und c) während des Kristallisationsverfahrens Flüssig-Flüssig-Diffusion in Kapillaren eingesetzt wird.
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach Anspruch 1, wobei der Proteinkristall ein enzymatisch aktives Zentrum, das in der folgenden Tabelle definiert ist, umfasst:
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach Anspruch 1, wobei der Proteinkristall ein durch die folgenden Aminosäuren definiertes enzymatisch aktives Zentrum umfasst: Gln136; Ala137; Tyr267; Gly268; Gly269; Met270; Glu271; Val292; His295; Glu296; His299; Glu318; Tyr378; Tyr383; Arg563; Lys565.
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach Anspruch 1, wobei der Proteinkristall ein durch die folgenden Aminosäuren definiertes enzymatisch aktives Zentrum umfasst: Gln136; Ala137; Tyr267; Gly268; Gly269; Met270; Glu271; Val292; His295; Glu296; His299; Trp315; Glu318; Val322; Phe362; Val367; Leu369; Pro374; Asp375; Ile372; Ala377; Pro382; Tyr378; Tyr383; Arg563; Lys565.
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Proteinkristall mindestens eines der in einem der Ansprüche 2 bis 4 definierten enzymatisch aktiven Zentren umfasst.
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Protein Metallohydrolase-Aktivität aufweist.
Proteinkristall des LTA₄-Hydrolaseproteins nach einem der vorstehenden Ansprüche, der in 1 mM Thiolamin oder 0,5 mM Hydroxamsäure in 15% PEG8000, 50 mM Imidazol pH 6,7, 25 mM Acetat und 2,5 mM YbCl₃ eingeweicht ist.
Verfahren zur Kristallisation des LTA₄-Hydrolaseproteins, wobei die Kristallisation durchgeführt wird durch: a. Zusetzen eines Ytterbiumsalzes, wie ein Ytterbiumchlorid, als ein Zusatzstoff, b. Vorhandensein des Inhibitors Bestatin im Kristallisationsaufbau; und c. Einsetzen von Flüssig-Flüssig-Diffusion in Kapillaren.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung in einem vorläufigen Screening-Verfahren, wobei die Verbindung ein potenzieller Agonist oder Inhibitor des LTA₄-Hydrolaseproteins ist, wobei das Verfahren Vergleichen der dreidimensionalen Struktur des LTA₄-Hydrolaseproteins, die durch die Koordinaten für Atom 1 bis Atom 4876 in Tabelle 9 definiert ist, mit der dreidimensionalen Struktur der Verbindung unter Verwendung von Computer-Modellierungstechniken umfasst.