DE60126970T2

DE60126970T2 - Kristallstruktur von bace und verwendungen dafür

Info

Publication number: DE60126970T2
Application number: DE60126970T
Authority: DE
Inventors: Rajiv Belmont CHOPPA; Kristine Andover SVENSON; Bethany Arlington ANNIS; Tatos N. West Roxbury AKOPIAN; Jonathan Daylestown BARD; Mark Lloyd Lexington STAHL; William S. Cambridge SOMERS
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-09-20
Also published as: DK1327143T3; AU2001292843A1; EP1327143A4; US7630838B2; EP1327143B1; ES2282292T3; DE60126970D1; EP1327143A1; WO2002025276A1; US20020055459A1; ATE355520T1

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft die dreidimensionale Kristallstruktur des Beta-Stelle-APP-Spaltenden Enzyms (BACE) und die Verwendung dieser Struktur in rationellen Medikamentenentwicklungsverfahren, um Mittel zu identifizieren, die mit aktiven Stellen von BACE interagieren können. Solche Mittel können eine neue Therapeutik bei der Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit repräsentieren.
Hintergrund der Erfindung
Eine charakteristische Pathologie der Alzheimer Krankheit ist der Aufbau unlöslicher Amyloid-Plaques im Gehirn. Diese proteinösen Plaques bestehen aus einem 4 kDa, 42 Aminosäuren Fragment eines β-Amyloid-Vorläuferproteins (APP), das als Amyloid-β-Peptid (Aβ) bezeichnet wird. Der Mechanismus der Aβ-Produktion ist daher für ein Verständnis des Entstehens und des Fortschreitens der Alzheimer Krankheit von kritischer Bedeutung. Es wurde gezeigt, dass Aβ aus der proteolytischen Spaltung eines größeren Proteins, dem β-Amyloid-Vorläuferprotein (APP), abgeleitet wird. Zwei Enzyme sind für diese Spaltung verantwortlich; zuerst spaltet das Enzym β-Sekretase APP an Rest 671 (770 aa Isoform der APP-Nummerierung), anschließend spaltet γ-Sekretase an Rest 716. Kürzlich wurde die neue Transmembran-Aspartat-Protease BACE als β-Sekretase identifiziert. Dieses Protein stellt nunmehr ein bedeutsames Target in einem therapeutischen Ansatz bei der Alzheimer Krankheit dar. In seltenen Fällen der Alzheimer Krankheit, die vererbbar sind (Familiäre Alzheimer Krankheit (FAD)), ist der Krankheitsphänotyp auf Mutationen in dem β-Amyloid-Vorläuferprotein zurückgeführt worden. Eine besondere Kohorte, die "Schwedische Mutation", weist eine Doppelmutation an der β-Sekretase-Spaltstelle auf.
Basierend auf der BACE-Funktion bei Alzheimer Krankheit, würde die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von BACE sowie seiner Bindungsstellen mit APP bedeutende Auswirkungen auf die Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit und ähnlicher Krankheiten haben, die mit dem Auftreten unlöslicher Amyloid-Plaques im Gehirn assoziiert sind, welche aus dem 42 Aminosäuren Fragment von APP zusammengesetzt sind.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Kristall von BACE, das mit einem APP-Inhibitorpeptid komplexiert ist, sowie die aus Röntgenbeugungsdaten des BACE/APP-Inhibitorpeptid-Kristalls abgeleitete dreidimensionale Struktur von BACE bereit. Im Speziellen wird die dreidimensionale Struktur von BACE durch die in 1 gezeigten Struktur-Koordinaten definiert, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å. Die Struktur-Koordinaten sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Visualisierung, Identifizierung und Charakterisierung verschiedener aktiver Stellen von BACE und des BACE/APP-Inhibitorpeptid Komplexes, einschließlich der APP-Bindungsstelle. Die Strukturen der aktiven Stelle können dann verwendet werden, um diverse Mittel zu konstruieren, welche mit BACE, sowie BACE, das mit einem APP-Protein oder -Peptid komplexiert ist, oder verwandten Molekülen interagieren.
Eine aktive Stelle eines APP bindenden Proteins oder Peptides und bevorzugt die APP-Peptid-Bindestelle von BACE kann anhand der durch die in 1 gezeigten relativen Struktur-Koordinaten, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, definierten dreidimensionalen Struktur von BACE aufgeklärt und abgeleitet werden.
Die aktive Stelle des APP bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt die APP-Peptid-Bindestelle von BACE kann gemäß 1 die relativen Struktur-Koordinaten der Reste SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 und ARG368, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, umfassen.
Die aktive Stelle des APP bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt die APP-Peptid-Bindestelle von BACE, kann gemäß 1 die relativen Struktur-Koordinaten der Reste LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 und ILE447, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels bereit, das mit einer aktiven Stelle des BACE interagiert. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Bestimmen einer putativen aktiven Stelle von BACE aus einem dreidimensionalen Modell von BACE unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten von 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und (b) Durchführen verschiedener Computer-bezogener Analysen, um ein Mittel zu identifizieren, welches mit der putativen aktiven Stelle interagiert.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels bereit, das mit einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt BACE, interagiert. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer aktiven Stelle eines APP- bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten der Reste SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 und ARG368 gemäß 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und
(b) Entwerfen eines Mittels unter Verwendung des in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modells.

Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein anderes Verfahren zur Identifizierung eines Mittels bereit, das mit einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt BACE, interagiert. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten der Reste LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 und ILE447 gemäß 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und (b) Entwerfen eines Mittels unter Verwendung des in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modells.
Kleine Moleküle oder andere Mittel, welche die Fähigkeit von BACE, APP zuschneiden, inhibieren oder anderweitig damit interferieren, können bei der Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit nützlich sein.
Zusätzliche Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 stellt die atomaren Struktur-Koordinaten für BACE und das APP-Inhibitorpeptid bereit, welche aus der Röntgenbeugung eines Kristalls des BACE und APP-Inhibitor-Komplexes abgeleitet sind. "Atomtyp" bezeichnet das Atom, dessen Koordinaten gemessen werden. "Rest" bezeichnet den Resttyp, dessen gemessenes Atom jeweils ein Teil ist – d.h. Aminosäure, Cofaktor, Ligand oder Lösungsmittel. Die "x, y und z" Koordinaten geben die kartesischen Koordinaten eines jeden gemessenen Atomortes in der Einheitszelle (Å) an. "Occ" gibt den Belegungsfaktor an. "B" gibt den "B-Wert" an, der ein Maßstab dafür ist, wie mobil das Atom in der atomaren Struktur (Å²) ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Begriffe und Redewendungen die nachstehend aufgeführten Bedeutungen haben:
Wenn nicht anders vermerkt, ist "BACE" ein Beta-Stelle APP-spaltendes Enzym sowie das β-Sekretase spaltende Enzym, welches das β-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) an Rest 671 (770 aa Isoform der APP-Nummerierung) schneidet. Nach dem Spalten von APP durch BACE wird das verbleibende APP durch γ-Sekretase an Rest 716 gespalten, was ein 42 Aminosäuren Fragment von APP hinterlässt, das in den proteinösen Plaques von Alzheimer Patienten gefunden wird. Die Aminosäuresequenz von BACE weist bevorzugt die mittels Swiss Prot unter der Zugangsnummer P56817 hinterlegte Aminosäuresequenz auf, einschließlich konservativer Substitutionen. Wie hierin verwendet, beinhaltet BACE auch "BACE-Peptide, bei denen es sich um Moleküle handelt, die weniger als die vollständige Aminosäuresequenz von BACE aufweisen. Bevorzugt beinhalten BACE-Peptide die aktive Stelle, an der BACE an APP bindet und dieses spaltet. Am meisten bevorzugt entspricht das BACE-Peptid den in 1 gezeigten Aminosäureresten 58-447 ("BACE_58-447"), einschließlich konservativer Substitutionen.
"APP" ist ein β-Amyloid-Vorläuferprotein, das die mittels Swiss Prot unter der Zugangsnummer CAA31830 hinterlegte Aminosäuresequenz, einschließlich konservativer Substitutionen aufweist. Wie hierin verwendet, beinhaltet APP auch "APP-Peptide", bei denen es sich um Moleküle handelt, die weniger als die vollständige Aminosäuresequenz von APP aufweisen. Bevorzugt beinhalten APP-Peptide die aktive Stelle, an der APP durch BACE gespalten wird.
Ein "APP-Inhibitorpeptid" ist ein Peptid, welches die Bindung zwischen BACE und APP inhibiert. Bevorzugt weist das APP-Peptid die Aminosäuresequenz SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE auf, wobei Sta die seltene Aminosäure (S)-Statin ist.
Ein "APP-bindendes Protein oder Peptid" ist ein Protein oder Peptid, welches APP bindet und eine APP-Bindungsstelle aufweist, sowie nicht beschränkend BACE und BACE-Peptide beinhaltet.
Wenn nicht anders vermerkt, soll ein "Protein" ein Protein, eine Proteindomäne, ein Polypeptid oder ein Peptid einschließen.
"Struktur-Koordinaten" sind die kartesischen Koordinaten, die der räumlichen Beziehung eines Atoms zu anderen Atomen in einem Molekül oder Molekülkomplex entsprechen. Struktur-Koordinaten können unter Verwendung von Röntgenkristallographietechniken oder NMR-Techniken erhalten werden oder sie können unter Verwendung einer molekularen Ersetzungsanalyse oder einer Homologie-Modellierung abgeleitet werden. Verschiedene Software-Programme gestatten die graphische Repräsentation eines Struktur-Koordinaten-Satzes, um eine dreidimensionale Repräsentation eines Moleküls oder eines Molekülkomplexes zu erhalten. Die Struktur-Koordinaten der vorliegenden Erfindung können durch mathematische Manipulation, wie zum Beispiel durch Inversion oder Ganzzahl-Additionen oder -Subtraktionen, gegenüber dem in 1 bereitgestellten Originalsatz modifiziert werden. Daher ist es zu verstehen, dass die Struktur-Koordinaten der vorliegenden Erfindung relativ sind und keinesfalls durch die gegenwärtigen x,y,z-Koordinaten von 1 spezifisch begrenzt sind.
Ein "Mittel" soll ein Protein, ein Polypeptid, ein Peptid, eine Nukleinsäure, einschließlich DNA oder RNA, Moleküle, eine Verbindung oder ein Arzneimittel einschließen.
"Standardabweichung" ist die Quadratwurzel des arithmetischen Mittels der Quadrate der Abweichungen von dem Mittel und stellt einen Weg dar, um eine Abweichung oder Variation der hierin beschriebenen Struktur-Koordinaten von BACE auszudrücken. Die vorliegende Erfindung schließt alle Ausführungsformen ein, umfassend konservative Substitutionen der bezeichneten Aminosäurereste, die innerhalb der angegebenen Standardabweichung zu denselben Struktur-Koordinaten führen.
Die Nummerierung der in 1 identifizierten Aminosäurereste basiert auf der Nummerierung des vollständigen BACE-Proteins ausgehend von dem Start der Signalsequenz. Für einen erfahrenen Praktiker wird es offensichtlich sein, dass die Nummerierung der Aminosäurereste von BACE zu der hierin Aufgeführten verschieden sein kann oder bestimmte konservative Aminosäuresubstitutionen enthalten kann, die zu den selben dreidimensionalen Strukturen, wie diejenigen, die in 1 definiert sind, führen. Entsprechende Aminosäuren und konservative Substitutionen zu anderen Isoformen oder Analogen werden durch visuelle Prüfung der relevanten Aminosäuresequenzen oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Softwareprogramme (z.B. MODELLAR, MSI, San Diego, USA) leicht identifiziert.
"Konservative Substitutionen" sind diejenigen Aminosäuresubstitutionen, die zu den substituierten Aminosäureresten entweder aufgrund ähnlicher Polarität, sterischer Anordnung oder aufgrund der Zugehörigkeit zur selben Klasse wie der substituierte Rest (z.B. hydrophob, sauer oder basisch) funktionell äquivalent sind und schließen Substitutionen ein, die einen unmaßgeblichen Effekt auf die dreidimensionale Struktur von BACE aufweisen, im Hinblick auf die Verwendung dieser Struktur zur Identifizierung und Erzeugung von mit BACE interagierenden Mitteln für molekulare Ersetzungsanalysen und/oder für eine Homologie-Modellierung.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine "aktive Stelle" eine Region eines Moleküls oder molekularen Komplexes, die im Ergebnis ihrer Gestalt und ihres Ladungspotentials vorzugsweise über verschiedene kovalente und/oder nichtkovalente Bindungskräfte mit einem anderen Mittel (einschließlich, ohne Beschränkung, eines Proteins, eines Polypeptides, eines Peptides, einer Nukleinsäure, einschließlich DNA oder RNA, Moleküle, einer Verbindung, eines Antibiotikums oder eines Arzneimittels) interagiert oder assoziiert. Bevorzugt entspricht die aktive Stelle von BACE der Stelle, an der BACE das APP-Molekül spaltet.
Daher kann die aktive Stelle von BACE beispielsweise sowohl die tatsächliche Stelle, an der BACE APP bindet und schneidet, als auch akzessorische Bindungsstellen beinhalten, die benachbart oder proximal zur tatsächlichen Bindungsstelle sind und die dennoch die Fähigkeit von BACE, APP zu binden und zu spalten, beeinflussen können, entweder mittels direkter Interferenz mit der tatsächlichen Stelle oder mittels indirekter Beeinflussung der sterischen Konformation oder des Ladungspotentials des BACE-Moleküls, um dadurch die Fähigkeit von BACE, APP an der tatsächlichen Bindungsstelle zu binden, zu verhindern oder zu reduzieren. Wie hierin verwendet, enthält eine aktive Stelle auch BACE oder BACE-analoge Reste, welche bei Anwesenheit eines Bindungsliganden, wie zum Beispiel APP oder ein APP-Peptid, bemerkenswerte NMR-Störungen zeigen. Obwohl solche Reste, die bemerkenswerte NMR-Störungen zeigen, nicht notwendigerweise in direktem Kontakt mit Ligandenbindungsresten oder unmittelbar benachbart dazu stehen müssen, können sie für BACE-Reste im Hinblick auf rationelle Arzneimittelherstellungsprotokolle entscheidend sein.
Zur Bestimmung der Struktur-Koordinaten des Komplexes ist die vorliegende Erfindung auf einen kristallisierten Komplex aus BACE und einem APP-Inhibitorpeptid, der Röntgenstrahlen effektiv beugt, gerichtet. Wie hierin verwendet, entspricht BACE bevorzugt BACE_58-447 wie in 1 gezeigt, wobei die N-terminate Domäne aus den in 1 gezeigten Aminosäureresten 58-207 besteht und die C-terminale Domäne aus den in 1 gezeigten Aminosäureresten 208-447 besteht. Das APP-Inhibitorpeptid ist bevorzugt SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE.
Bei Verwendung des Kristallkomplexes der vorliegenden Erfindung können Röntgenbeugungsdaten durch eine Vielzahl an Mitteln gesammelt werden, um die Atom-Koordinaten des kristallisierten Moleküls oder Molekülkomplexes zu erhalten. Mit Hilfe speziell konstruierter Computersoftware können jene kristallographischen Daten verwendet werden, um eine dreidimensionale Struktur des Moleküls oder Molekülkomplexes zu generieren. Verschiedene Verfahren, die verwendet werden, um die dreidimensionale Struktur eines kristallisierten Moleküls oder einer Molekülstruktur zu generieren und zu verfeinern, sind einem Fachmann bekannt und schließen, ohne Beschränkung, Multiwellenlängen-Anomolie-Dispersion (MAD), multipler isomorpher Austausch, reziproke Entfernungs-Flüssigkeits-Abflachung, molekularer Austausch und einzel-isomorpher Austausch mit anomaler Streuung (SIRAS) ein.
Die dreidimensionale Struktur von BACE kann aus den Röntgenbeugungsdaten des BACE/APP-Inhibitorpeptid-Kristalls abgeleitet werden. Speziell kann die dreidimensionale Struktur von BACE durch die in 1 gezeigte Struktur-Koordinaten, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugt nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å, definiert werden. Die Struktur-Koordinaten von RACE sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Visualisierung, Identifizierung und Charakterisierung verschiedener aktiver Stellen von BACE und des BACE/APP-Inhibitorpeptid-Komplexes, einschließlich des APPs oder der APP-Peptid-Bindungsstelle. Die Strukturen der aktiven Stellen können dann verwendet werden, um Mittel zu konstruieren, die mit BACE, sowie mit BACE, das mit APP, einem APP-Peptid oder verwandten Molekülen komplexiert ist, interagieren.
Eine aktive Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt die APP-Bindungsstelle von BACE kann gemäß 1 die relativen Struktur-Koordinaten der Reste SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 und ARG368, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugter nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å, umfassen.
Alternativ kann eine aktive Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides, bevorzugt die APP-Peptidbindungsstelle von BACE gemäß 1 die relativen Struktur-Koordinaten der Reste LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 und ILE447, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugter nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å, umfassen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels gerichtet, das mit einer aktiven Stelle von BACE interagiert, umfassend die Schritte: (a) Bestimmen einer aktiven Stelle des BACE aus einem dreidimensionalem BACE-Modell unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten von 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugter nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å; und (b) Erstellen einer Computer-bezogenen Analyse, um ein Mittel zu identifizieren, das mit der aktiven Stelle interagiert. Computer-bezogene Analysen verwenden verschiedene Computersoftwareprogramme, die die „Passform" zwischen der putativen aktiven Stelle und dem identifizierten Mittel durch (a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells der putativen aktiven Stelle eines Moleküls oder Molekülkomplexes unter Verwendung einer Homologie-Modellierung oder der atomaren Struktur-Koordinaten der aktiven Stelle, und (b) Bestimmen des Assoziationsgrades zwischen der putativen aktiven Stelle und dem identifizierten Mittel, bewertet. Dreidimensionale Modelle der putativen aktiven Stelle können unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das aus dem im Stand der Technik bekannt ist, generiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Homologie-Modellierung sowie Computeranalyse von Rohdaten, die unter Verwendung kristallographischer oder spektroskopischer Daten generiert wurden. Computerprogramme, die verwendet werden, um solche dreidimensionalen Modelle zu generieren und/oder die notwendigen Passform-Analysen durchzuführen, beinhalten nicht beschränkend: GRID (Oxford Universität, Oxford, UK), MCSS (Molecular Simulations, San Diego, CA), AUTODOCK (Scripps Forschungsinstitut, La Jolla, CA), DOCK (Universität von Kalifornien, San Francisco, CA), Flo99 (Thistlesoft, Morris Township, NJ), Ludi (Molecular Simulations, San Diego, CA), QUANTA (Molecular Simulations, San Diego, CA), Insight (Molecular Simulations, San Diego, CA), SYBYL (TRIPOS, Inc., St. Louis. MO) und LEAPFROG (TRIPOS, Inc., St. Louis. MO).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels bereit, das mit einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides und bevorzugt der APP-Peptidbindungsstelle von BACE, interagiert. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten der Reste SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 und ARG368 gemäß 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugter nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å; und (b) Entwerfen eines Mittels unter Verwendung des in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modells. In einer anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die aktive Stelle des APP-bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung des dreidimensionalen Modells generiert, das gemäß 1 durch die relativen Struktur-Koordinaten der Reste LYS70 SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 und ILE447, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å, bevorzugter nicht mehr als 1,0 Å und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 Å, definiert wird.
Die Auswirkung eines solchen, durch Computer-bezogene Analysen identifizierten Mittels auf das APP-bindende Protein oder Peptid kann mittels Erhalt oder Synthese des Mittels und Kontaktierung des identifizierten Mittels mit dem APP-bindenden Protein oder Peptid, um die Auswirkung zu bestimmen, die das Mittel auf das APP-bindende Protein oder Peptid hat, weiter bewertet werden. Bevorzugt ist das APP-bindende Protein oder Peptid BACE (oder ein BACE-Peptid) und das Mittel ist eine potenzieller Inhibitor der Bindung zwischen BACE (oder einem BACE-Peptid) und APP (oder einem APP-Peptid). Daher wird in der bevorzugten Ausführungsform das Mittel mit BACE (oder einem BACE-Peptid) in Anwesenheit von APP (oder eines APP-Peptides) in Kontakt gebracht, um die Fähigkeit des Mittels zu bestimmen, die Bindung zwischen BACE (oder dem BACE-Peptid) und APP (oder dem APP-Peptid) zu inhibieren. In Abhängigkeit von der Wirkung des Mittels auf die aktive Stelle kann das Mittel entweder als ein Inhibitor oder Aktivator der BACE/APP-Bindung agieren. Es können Untersuchungen durchgeführt werden, wobei die Ergebnisse analysiert werden, um zu bestimmen, ob das Mittel ein Inhibitor ist (d.h., das Mittel kann die Bindungsaffinität zwischen BACE und APP reduzieren oder verhindern), ein Aktivator ist (d.h., das Mittel kann die Bindungsaffinität zwischen BACE und APP erhöhen) oder keine Auswirkung auf die Interaktion zwischen BACE und APP hat. Mittel, die unter Verwendung der vorhergehenden Verfahren identifiziert wurden und bevorzugt Inhibitoren der BACE-Spaltung von APP können dann als Therapeutika bei der Behandlung und/oder Prävention der Alzheimer Krankheit und anderer Krankheiten, die ebenfalls durch die Anwesenheit des 42 Aminosäuren Fragments von APP in proteinösen Plaques des Gehirns charakterisiert sind, gestestet werden.
Verschiedene molekulare Analysen und rationelle Medikamentenentwicklungstechniken werden weiterhin in den U.S. Patent-Nummern 5,834,228, 5,939,528 und 5,865,116 sowie in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US98/7.6879, veröffentlicht unter WO 99/09148, offenbart, auf deren Inhalte hiermit Bezug genommen wird.
Die Mittel und bevorzugt die Inhibitoren, die unter Verwendung der vorhergehenden Verfahren identifiziert wurden, können ein Protein, ein Polypeptid, ein Peptid, eine Nukleinsäure, einschließlich DNA oder RNA, Moleküle, eine Verbindung oder ein Arzneimittel sein, wobei kleine Moleküle bevorzugt werden, die die Bindung zwischen BACE und APP oder einem APP-Peptid wirksam inhibieren können. Solche Moleküle können bei der Behandlung, Prävention oder Inhibierung des Fortschreitens der Alzheimer Krankheit nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele besser verstanden werden. Das folgende Beispiel wird präsentiert, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vollständiger darzustellen und sollte keinesfalls derart angesehen werden, dass es den Bereich der vorliegenden Erfindung beschränkt.
Beispiel 1
A. Verfahren
Klonierung von humanem BACE1. Humane polyA+ mRNA aus Gesamtgehirn (Clontech) wurde mittels Zufalls-priming („random-priming") unter Verwendung des Thermoscript RT-PCR Systems gemäß dem Herstellerprotokoll (Lifetechnologies) in cDNA umgewandelt. Diese cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der entsprechenden Vorwärts- und Rückwärts-Primer 5' GCTCTAGAACCCAGC ACGGCATCCGGCTG 3' (die XbaI-Stelle ist durch die unterstrichene Sequenz angegeben; Nukleotide 517-537 in der Zugangsnummer AF190725) und 5' CCAAGCATGCGGCCGCAATAGGCTA TGGTCATGAGGGTTGAC 3' (die NotI-Stelle ist durch die unterstrichene Sequenz angegeben; Nukleotide 1809-1833; das fettgedruckte "A" kennzeichnet ein zusätzliches Nukleotid, um eine in-frame Translation der Fc-Chimären zu gestatten; siehe unten) amplifiziert. Die PCR wurde unter Verwendung eines Expand Long Polymerase Kits gemäß den Herstellerbedingungen (Roche Biochemicals; Puffer #3) durchgeführt, wobei die PCR-Zyklen aus einem initialen Denaturierungsschritt bei 95°C für 3 min, 30-40 Denaturierungszyklen bei 94°C für 30 s, Anlagern („Annealing") bei 65°C für 30 s, Verlängerung („Elongation") bei 68°C für 1 min, 30 s, gefolgt von einer finalen Elongation bei 68°C für 5 min bestehen. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%igem Agarosegel aufgetrennt. Die passende Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, mittels Quantum Prep Freeze'N Squeeze DNA Extraktionssäulen (Bio-Rad) aufgereinigt und in die SpeI/Not/-Stellen des Säugerexpressionsvektors pED/Fc (Kaufman, RJ et al., 1991, Nucl. Acids. Res. 19: 4485-4490) kloniert.
Ein Zwischenkonstrukt enthielt den mit der Prodomäne fusionierten sekretorischen Leader des Meletins der Honigbiene und die kodierende Region von BACE1, genau stromaufwärts zur vorhergesagten Transmembrandomäne von BACE1 (Vassar, R. et al., 1999, Science 286: 735-741). Das Fehlen der vorhergesagten hydrophoben Transmembrandomäne in diesem Konstrukt würde zu einem löslichen sezernierten BACE-Fc-Protein führen, das aus dem konditionierten Medium zu extrahieren ist. Stromabwärts von BACE befand sich eine konstruierte Enterokinase-Spaltstelle, gefolgt von einer Sequenz, die für den Fc-Teil von Immunglobulin IgG kodiert. Das finale Konstrukt enthielt das BACE1- Fc-Gen, das von SalI und EcoRI in pED/Fc flankiert war, in die SalI/EcoRI Stellen des Säugerexpressionsvektors pHTop, einem Derivat von pED kloniert wurde, in dem die Mehrheit des späten Hauptpromotors des Adenovirus durch sechs Wiederholungen eines bakteriellen Tetrazyklin-Operators (beschrieben in Gossen et al, 1992, PNAS, 89: 5547-5551) ersetzt wurde. Die Sequenzierung des rekombinanten BACE1-Fc-Gens wurde mittels einer BigDye Terminator Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung eines ABI3700 durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung eines DNAstar Softwarepacks durchgeführt.
Expression von humanem BACE1. Der Vektor pHTop mit dem BACE1-Fc-Insert enthält das Dihydrofolatreduktase-Gen und funktioniert sehr effizient, wenn er in die Zelllinie CHO/A2 (siehe Beschreibung unten) eingeführt wird, wobei stark exprimierende Zellen durch Isolieren von Zellen, welche bei hohen Methotrexatkonzentrationen überleben, selektiert werden können. Die CHO/A2 Zelllinie ist aus CHO DUKX B11 (Urlaub and Chasin, 1980, PNAS USA 77: 4216-4220) durch stabiles Integrieren eines transkriptionellen Aktivators (tTA), ein Fusionsprotein zwischen dem Tet-Repressor und der transkriptionellen Domäne des Herpes Virus VP16 (Gossen et al.), abgeleitet. Eine CHO Zelllinie, die extrazelluläres BACE1-Fc-Protein exprimiert, wurde durch Transfektion (Lipofektion) von pHTopBACE1-Fc in CHO/A2 Zellen und Selektion von Klonen in 0,02 und 0,05 μM Methotrexat erstellt. Die konditionierten Medien multipler Klone wurden mittels Westernblot unter Verwendung eines (Maus) anti-humanen IgG-Fc-HRP Antikörpers untersucht. Dieselben Klone wurden zudem mit 35 S (Met/Cys) metabolisch markiert. Der beste Klon, der aufgrund seiner hohen Expression bestimmt wurde, war einer, der aus einer 0,05 μM MTX Selektion resultierte und ausgewählt wurde, um den Maßstab für eine Rollflaschenkonditionierte Medienproduktion (4 Liter) zu erhöhen. Die konditionierten Medien wurden dann für eine Aufreinigung verwendet. Das exprimierte Protein weist die Reste 22-460 und neun zusätzliche Reste am C-Terminus (eine Artefakt aus der Klonierung und dem Zurückbleiben der EK-Spaltstelle) auf.
Aufreinigung von BACE1. Für die Aufreinigung von BACE wurden die 102 Liter konditionierter Medien verwendet. Während der Aufreinigung wurde die Aktivität des Enzyms mittels kontinuierlicher Kontrolle der Fluoreszenzintensität für 5-10 min bei 420 nm (ext – 320 nm) und Abz-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Dpa (Abz = Aminobenzoesäure, Dpa = 9, 10 Diphenylanthrazen) als das Substrat bei Raumtemperatur ermittelt. Die Reaktionsmischung enthielt 20 μM Substrat, verschiedene Mengen an Enzym in 0,5 ml 20 mM Tris-HCl pH 8,0 und 100 mM NaCl. Das konzentrierte Material der konditionierten Medien (1,61) wurde auf eine Säule (2,8 × 12 cm) appliziert, die in PBS-Puffer äquilibrierte ImmunoPure Protein A Agarose (Pierce, II, USA) enthielt. Die Geschwindigkeit der Applikation betrug 2 ml/min. Die Säule wurde mit 1 Liter PBS-Puffer gewaschen und das BACE-Fc-Protein wurde mittels des ImmunoPure IgG Elutionspuffers (Pierce, II, USA) eluiert. Die Protein-enthaltenden Fraktionen wurden sofort mit 1 M Tris-HCl auf pH 8,0 neutralisiert.
Das erhaltene Proteinmaterial wurde mit Enterokinase bei 25°C behandelt. Das Verhältnis von BACE-Fc zu Enterokinase betrug 3000:1 und die Reaktionszeit betrug 3 h. Die Reaktion wurde durch Entfernen der Enterokinase aus der Reaktionsmischung durch Applikation des Proteins auf eine Säule (1 × 5 cm), die Sojabohnen-Trypsininhibitor-Agarose (Sigma, Mo, USA) enthielt, die in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 100 mM NaCl, äquilibriert wurde, gestoppt (Geschwindigkeit betrug 1 ml/min). Das Durchflussmaterial enthielt BACE und gespaltenes Fc. Gespaltenes Fc wurde mittels eines Durchflusses durch eine in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 äquilibrierte Protein A Säule von BACE entfernt.
BACE wurde unter Verwendung von PNGase F (New England Labs., Ma, USA) teilweise deglykosyliert. 8-9 μg PNGase wurden zu 1 mg BACE zugesetzt und die Inkubation wurde bei 37°C für 16 h durchgeführt. Die zusätzlichen 5-6 μg PNGase wurden jedem mg BACE zugesetzt und die Inkubation wurde für weitere 4 h fortgesetzt. Das aufgereinigte BACE wurde mittels HPLC Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer 21,5 × 30 cm G-3000SW Säule (TosoHaas, Pa, USA), die in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 200 mM NaCl, äquilibriert war, von PNGase abgetrennt. (Die Elutionsgeschwindigkeit betrug 3 ml/min). Das aufgereinigte BACE wurde konzentriert und für Kristallisationsexperimente verwendet.
Die N-terminale Sequenzierung von aufgereinigtem BACE zeigte eine Mischung von Proteinspezies, wobei die Hauptprobe die gespaltene prozessierende Domäne aufweist und mit Rest 47 beginnt (alle Nummerierungen beziehen sich auf das vollständige BACE; Zugangscode: A59090) und eine Minderprobe, welche nicht gespalten worden war, mit Rest 22 beginnt. Eine kleinere Probe mit der Sequenz MTIAY wurde ebenfalls detektiert.
Kristallisierung. Die Kristalle wurden unter Verwendung der hängenden-Tropfen-Dampfdiffusionsmethode gezüchtet. Das Protein wurde auf mg/ml in 20 mM Tris pH 7,5, 200 mM Natriumchlorid konzentriert. Die Inhibitorpeptid-Sequenz ist SEVNStaVAEF, wobei Sta die seltene Aminosäure (S)-Statin ist. Es wurde auf 100 mM in 100% DMSO konzentriert und in einem zweifachen Peptidüberschuss mit konzentriertem Protein gemischt, um den Komplex zu bilden. 1 μl des Komplexes wurde zu 1 μl einer 100 mM Natrium-Cacodylat pH 6,5, 25% PEG8k, 300 mM Lithium-Sulfat enthaltenden Minerallösung zugesetzt. Plattenartige Kristallcluster wuchsen innerhalb eine Woche zu Dimensionen von 200 μm × 400 μm × 75 μm. Einzelne Kristalle wurden kurz in eine stabilisierende Kryoschutzmittel-Lösung, welche die Minerallösung plus 25% Glycerin enthielt, transferiert, 10 Sekunden eingeweicht und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Röntgenbeugungs-Kristalle wiesen die Raumgruppe 1222 und die Einheitszellen-Parameter a = 86,627, b = 130,861, c = 130,729 und α = β = γ = 90° auf.
B. Ergebnisse
Strukturbestimmung und Gesamtfaltung. Vollständiges BACE wurde in CHO-Zellen als ein Fc-Fusionsprotein exprimiert und nach Aufreinigung, Spaltung und partieller Deglykosylierung mit einem Peptid-Inhibitor komplexiert und kristallisiert. Kristalle beugten zu 2,3 Å, wobei die Struktur unter Verwendung der molekularen Ersetzungstechnik aufgelöst wurde. Das verwendete Suchmodell wurde aus dem Pepsin des atlantischen Dorschs abgeleitet und enthielt 63% der Endanzahl der Atome. Die unter Verwendung einer Poly-Alanin Version des Suchmodells (39% der Endatome) erhaltenen Dichte-modifizierten Karten, stellten eine ausreichende Information bereit, um fast alle 12 Aminosäuren zu erstellen. Das Endmodell enthält die Reste 59 bis 448 (unter Verwendung der vollständigen Nummerierung), alle 9 Reste des Statin-Inhibitors und 360 Wassermoleküle. Von den 4 vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen, weisen nur zwei eine interpretierbare Elektronendichte auf.
Die Gesamtgestalt des BACE-Proteins ist sphärisch und aus zwei verschiedenen Domänen, einer N-terminalen (58-207) und einer C-terminalen (208-447), zusammengesetzt, wobei die ersten dreizehn Aminosäuren (58-71) gegenüber den Resten 238-243 dicht gepackt sind. Quer über eine Oberfläche der Grenzschicht zwischen den Domänen befindet sich ein deutlicher spaltenartiger Kanal. Dieser enthält das Inhibitorpeptid und konservierte Asparaginsäuremotive, die die aktiven Stellen von Aspartat-Proteasen definieren.
Die N-terminale Domäne ist aus einer einzelnen α-Helix, die der loop-Verbindung der zwei Domänen und den 13 β-Strängen vorausgeht, zusammengesetzt. Die größere C-terminate Domäne weist insgesamt 17 β-Stränge und drei α-Helices auf. Die Gesamt-Topologie ist durch ein achtsträngiges, antiparalleles Zwischendomänen-β-Faltblatt charakterisiert. Das zentrale Faltblatt umfasst die Mehrheit der Reste der aktiven Stellen, einschließlich der zwei konservierten Aspartate (eins aus jeder Domäne: 93 und 289). Asp93 und Asp289 definieren die Position einer Pseudo-Zweifach-Achse für das zentrale β-Faltblatt. Außerhalb dieser Symmetrie unterscheiden sich die zwei Domänen signifikant voneinander. Die N-terminate Domäne weist zusätzliche zwei Stränge auf, die das zentrale Faltblatt ausdehnen. Zusätzlich gibt es zwei antiparallele β-Faltblätter über und unter dem zentralen Faltblatt, die jeweils aus drei und vier β-Strängen bestehen. Die Reste des oberen Faltblattes (131-135) falten sich über die Aspartate der aktiven Stellen und bilden einen „Lasche" über dem Zentrum der Peptid-bindenden Spalte.
Die C-terminale Domäne enthält zwei Lappen zusätzlich zu den Strängen, die das zentrale β-Faltblatt bilden. Diese sind zu bekannten Aspartat-Proteasestrukturen schwach homolog. Die Bindungstaschen für die P1' und P3'-Positionen sind stattdessen aus den drei β-Schleifen 388-391, 284-286 und 255-261 abgeleitet.
In BACE gibt es eine Gesamtanzahl von 6 Cysteinresten. Jeder dieser ist an einer Disulfid-Interaktion beteiligt. Das Muster der Disulfid-Quervernetzung, Cys278-Cys443, Cys380-Cys330, Cys420-Cys216, ist unter den bisher bekannten Aspartat-Proteasen einzigartig.
Eine neue Aspartat-Protease. Die ersten Versuche, die Funktion-Struktur-Beziehung einer Aspartat-Protease zu studieren, begannen in den 30iger Jahren des letzten Jahrhunderts mit Pepsin. Seitdem ist dieses reichhaltige Forschungsgebiet für die Konstruktion klinisch verwendeter Inhibitoren nur in einem System – der HIV-Protease – erfolgreich angewendet worden. Die Gründe dafür liegen mehr in der Validität der pharmakologischen Zielsubstanz als die Wirksamkeit der Inhibitoren. β-Sekretase wurde als eine neue Protease beschrieben und von ihr wurde gezeigt, dass sie mit der Entstehung und dem Ablauf der Alzheimer Krankheit in Verbindung steht.
Von einem groben Standpunkt aus gesehen ist die Gesamtfaltung und Domänen-Organisation zu der einer kanonischen Aspartat-Protease sehr ähnlich. Der Vergleich auf einer genaueren Ebene offenbart eine deutliche Anzahl von Unterschieden. Die aktive Stelle ist durch zwei Aspartatreste gekennzeichnet, die von einem konservierten Satz an Wasserstoffbrückenbindungen, die als „Feuerwehrmanngriff" bezeichnet werden, umgeben. Dies wird in der hierin repräsentierten -Sekretasestruktur reproduziert. Die charakteristische Lasche, die sich in Pepsin über der aktiven Stelle einwickelt, fehlt der C-terminalen Domäne in einer zu Cathepsin D analogen Art und Weise. In β-Sekretase wird die kritische Amid-Wasserstoffbrückenbindung der Hauptkette zur Carboxylgruppe von Statin durch Thr133 aus dieser Lasche aufrechterhalten. Das Amid des Statins bildet eine Wasserstoffbrückenbindung zur Carboxylgruppe von Gly95, wobei hervorzuheben ist, dass der Statinrest sowohl die P1 als auch die P1'-Position belegt.
Enzymmechanismus. Es ist gezeigt worden, dass die β-Sekretase-Spaltung von der Nähe zur Zellmembran abhängig ist. Sowohl β-Sekretase als auch ihr Substrat APP weisen putative Transmembranregionen auf. Unser exprimiertes BACE-Konstrukt endet eine Aminosäure vor der vorhergesagten Transmembranregion. Der letzte Rest in der aktuellen Struktur ist Ile447, 13 Reste vom Beginn der putativen Transmembrandomäne entfernt. In der aktuellen Kristallstruktur ist Ile447 nur 6 Å von der P3 Glutaminsäure des Inhibitors entfernt, was eine Rolle der verbleibenden C-terminalen Reste im Enzymmechanismus andeutet. Der Statinrest des Inhibitorpeptides ist an der S1-Position innerhalb der aktiven Stelle gebunden. Die Position der C-3 Hydroxylgruppe, die co-planar zum Wasserstoffbrückenbindungs-Abstand und innerhalb des Wasserstoffbrückenbindungs-Abstandes beider Carboxylgruppen der Aspartate 93 und 289 liegt, bestätigt, dass die seltene Aminosäure den tetrahedrischen Übergangszustand, d.h. die Zwischenform der Hydrolyse der Peptidbindung, imitiert. Der Abstand zwischen den Sauerstoffatomen von Asp93 und Asp289 beträgt 2,8 Å, was stark auf ein geteiltes Protonen-Atom und ein klassisches Aspartat-Protease pK-Profil für diese Seitenketten sowie einen, mit anderen bekannten Aspartat-Proteasen gemeinsamen, Enzymmechanismus hinweist.
Inhibitorbindung. Das Inhibitorpeptid bindet in einer ausgedehnten Form entlang einer an der Grenzschicht zwischen den Domänen gebildeten 20 Å Furche. Die konservierten katalytischen Aspartat-Reste liegen in der Mitte dieser Furche. Das gebundene Peptid besteht aus 8 Aminosäuren plus einer Statin-Aminosäure an Position 5. Für das gesamte Peptid gibt es eine zusammenhängende Elektronendichte. Von dem in dieser Studie verwendeten Statin-basierenden Inhibitor wurde gezeigt, dass er das β-Sekretaseenzym mit nanomolarer Wirksamkeit inhibiert. Die Peptidesequenz basiert auf der schwedischen Familien-Mutation P10 bis P4' APP751. Diese Mutation eines Lys-Asn an der P2-Position und eines Met-Leu an der Position P1 korreliert stark mit der frühen Entstehung der Alzheimer Krankheit. Das Inhibitorpeptid verwendet die Leucyl-artige Seitenkette des Statins, um diese Interaktion zu erkunden. Aufgrund der Dipeptidnatur des Statins wird die P1-Position des Substrats auf P2' verlagert, was eine leere S1'-Tasche hinterlässt. Das β-Sekretaseenzym scheint eine neue Präferenz für ein Aspartat oder Glutamat an der P1'-Position zu haben, wohingegen andere Aspartat-Proteasen eine Präferenz für hydrophobe Reste zeigen. Die ungewöhnliche Präferenz für eine negativ geladene P1'-Aminosäure wird durch die Guanidin-Gruppe von Arg189 erklärt, die einen Teil der putativen S1'-Tasche bildet. Selbst bei dem sauren pH-Optimum von BACE würde die Arginin-Seitenkette eine positiv geladene Umgebung für die möglicherweise protonierten Carboxyl-Seitenkettenatome bilden.
Bei den S1- und S3-Bindungstaschen handelt es sich um eine zusammenhängende hydrophobe Tasche, die durch die Seitenketten der Reste Tyr132, Phe169, Ile171, Trp176, Ile179 und die Hauptkettenatome von Gly74 und Gln73 gebildet werden. Diese Packung der Inhibitor- P1- und P3-Seitenketten wurde in früheren Aspartat-Proteasekomplexen beobachtet.
Die kanonische APP-Spaltstelle für β-Sekretase scheint eine Präferenz für kleine hydrophobe Reste an der P2'-Position zu haben. Die Seitenkette des in der putativen S2'-Stelle der β-Sekretase gebundenen Valin-Restes scheint keinerlei signifikante Interaktionen mit dem Protein einzugehen, seine Hauptkette scheint jedoch einen dichten Satz von Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Rückgrat-Carboxyl von Gly95 und dem Seitenketten-OH von Tyr259 zu bilden. Tyr259 wiederum wird durch eine Grenz-pi-Interaktion mit Trp258 starr am Platz gehalten, das gegen die Guanidin-Gruppe von Arg256 drängt.
Schwedische Mutation. Autosomal dominante Mutationen, die auf dem β-Amyloid-Vorläuferprotein identifiziert wurden, haben mit den Fällen der frühen Entstehung der Alzheimer Krankheit korreliert. Von diesen wurde gezeigt, dass sie sich um die drei kanonischen Spaltstellen anhäufen. Eine Doppel-(die so genannte Schwedische) Mutation von Lys670-Met671 (770 aa Isoform der APP-Nummerierung) zu Asn-Leu verursacht einen Anstieg in der Gesamtmenge von Aβ, das im Plasma und in dem Medium kultivierter Fibroblasten von Trägern der Schwedischen Mutation nachweisbar ist. Diese zwei Aminosäuren befinden sich an den P2- und P1-Positionen der aktiven Stelle der β-Sekretase. Der hier verwendete Statin-basierte Inhibitor basiert auf dieser schwedischen Mutation. An Position P1 ist vermeintlich ein Methionin untergebracht, es würde jedoch die zwischen der Statin-Seitenkette und Leu90 sowie Ile178 aufgezeigten van Der Waal's Wechselwirkungen auflösen. Das C_ε-Atom des Methionins würde die hydrophobe Interaktion mit Phe169 ergänzen.
Tabelle 1
BACE-Reste innerhalb von 4 Å des Peptid-Inhibitors

SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296, ARG368

BACE-Reste innerhalb von 8 Å des Peptid-Inhibitors

LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396, ILE447

Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen, ob ausgegebene Patente, anhängige Anmeldungen, publizierte Artikel, hinterlegte Sequenzen oder anderweitige sind hiermit in ihrer Gesamtheit einbezogen. Während die vorangegangene Erfindung zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses im Detail beschrieben worden ist, wird es für einen Fachmann, der die Offenbarung gelesen hat, offensichtlich sein, dass verschiedene Änderungen in der Form und im Detail gemacht werden können, ohne von dem eigentlichen Bereich der Erfindung in den anhängigen Ansprüchen abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Kristallisierter Komplex aus Beta-Stelle-APP-spaltendem Enzym (BACE) und SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE.
Kristallisierter Komplex aus Anspruch 1, worin BACE eine N-terminate Domäne, die aus den in 1 gezeigten Aminosäureresten 58-207 besteht und eine C-terminale Domäne, die aus den in 1 gezeigten Aminosäureresten 208-447 besteht, aufweist.
Verfahren zur Identifikation eines Mittels, das mit einer aktiven Stelle des Beta-Stelle-APP-spaltenden Enzyms BACE interagiert, wobei das Verfahren die Schritte: (a) Bestimmen einer aktiven Stelle des BACE aus einem dreidimensionalem BACE-Modell unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten von 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und (b) Erstellen einer Computer-geeigneten Analyse, um ein Mittel zu identifizieren, das mit der aktiven Stelle interagiert, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 1,0 Å beträgt.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 0,5 Å beträgt.
Verfahren zur Identifikation eines Mittels, das mit einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides interagiert, wobei das Verfahren die Schritte: (a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten der Reste SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 und ARG368 gemäß 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und (b) Entwerfen eines Mittels unter Verwendung des in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modells, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 1,0 Å beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 0,5 Å beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Mittel durch Erstellen einer Computer-geeigneten Analyse des Mittels mit dem in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modell entworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 6, das weiterhin die Schritte: (c) Erhalten oder Synthetisieren des so entworfenen Mittels; und (d) Kontaktieren des Mittels mit dem APP-bindenden Protein oder Peptid, um die Wirkung, die das Mittel auf das APP-bindende Protein oder Peptid hat, zu bestimmen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das APP-bindende Protein oder Peptid BACE ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Mittel ein potenzieller Inhibitor einer Bindung zwischen BACE und APP ist.
Verfahren nach Anspruch 12, das weiterhin die Schritte: (c) Erhalten oder Synthetisieren des so entworfenen Mittels; und (d) Kontaktieren des Mittels mit BACE in Anwesenheit von APP, umfasst.
Verfahren zur Identifikation eines Mittels, das mit einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides interagiert, wobei das Verfahren die Schritte: (a) Erzeugen eines dreidimensionalen Modells einer aktiven Stelle eines APP-bindenden Proteins oder Peptides unter Verwendung der relativen Struktur-Koordinaten der Reste LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 und ILE447 gemäß 1, ± einer Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren von nicht mehr als 1,5 Å; und (b) Entwerfen eines Mittels unter Verwendung des in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modells, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 1,0 Å beträgt.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die ± Standardabweichung der Rückgrat-Atome der Aminosäuren nicht mehr als 0,5 Å beträgt.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Mittel durch Erstellen einer Computer-geeigneten Analyse des Mittels mit dem in Schritt (a) erzeugten, dreidimensionalen Modell entworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 14, das weiterhin die Schritte: (c) Erhalten oder Synthetisieren des so entworfenen Mittels; und (d) Kontaktieren des Mittels mit dem APP-bindenden Protein oder Peptid, um die Wirkung, die das Mittel auf das APP-bindende Protein oder Peptid hat, zu bestimmen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das APP-bindende Protein oder Peptid BACE ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das Mittel ein potenzieller Inhibitor einer Bindung zwischen BACE und APP ist.
Verfahren nach Anspruch 20, das weiterhin die Schritte: (c) Erhalten oder Synthetisieren des so entworfenen Mittels; und (d) Kontaktieren des Mittels mit BACE in Anwesenheit von APP, umfasst.