DE3871798T2 - Modifizierter faktor vii/viia. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf modifizierte Faktoren VII/VIIa, DNA-Sequenzen, die für derartige modifizierte Faktoren kodieren, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
- Faktor VIIa ist eine Serinprotease, die an der Blutgerinnung durch Aktivierung von Faktor X und/oder Faktor IX teilhat. Faktor VIIa wird aus seinem Vorläufer, Faktor VII, hergestellt, welcher in der Leber synthetisiert und in das Blut abgesondert wird, wo er als einzelkettiges Glykoprotein (MG = 50,000) umläuft. Faktor VII kann in vitro in die zweikettige Form des Faktors VII durch Faktor Xa, Faktor XIIa, Faktor IXa oder Thrombin umgewandelt werden. Es wird angenommen, dar in Anwesenheit von Gewebsthrombokinase und Kalziumionen Faktor VIIa in vivo Faktor X durch beschränkte Proteolyse in Faktor Xa umwandelt. Das letztere Enzym wiederum wandelt Prothrombin in Anwesenheit von Faktor Va, Kalziumionen und Phospholipid in Thrombin um. Faktor VIIa wird ebenfalls bei Anwesenheit von Gewebsthrombokinase und Kalzium Faktor IX in Faktor IXa umwandeln.
- Faktor VII kann durch die von Broze und Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242 - 1247, 1980, und Hedner und Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836 - 1841, 1983, beschriebenen Verfahren vom Plasma gereinigt und zu Faktor VIIa aktiviert werden.
- Faktor VIIa kann auch durch Rekombinanten-DNA-Technologie hergestellt werden, indem man in einem geeigneten Medium Säugetierzellen kultiviert, die mit einer Faktor VII kodierenden DNA-Sequenz transfiziert sind, das erzeugte Protein isoliert und das Protein zu Faktor VIIa aktiviert (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 86 302 855.1).
- Die für Human-Faktor VII kodierende cDNA ist in ihren Eigenschaften beschrieben worden (Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2412 - 2416, 1986). Die von den cDNAs abgeleitete Aminosäurensequenz zeigt an, daß Faktor VII mit einer Präpro-Führersequenz von 60 oder 38 Aminosäuren synthetisiert wird. Der fertige Faktor VII, der in dem Plasma umläuft, ist aus 406 Aminosäureresten zusammengesetzt. Die Aminosäure-Sequenzanalyse des aktivierten Proteins und die Aminosäuresequenz, die von den cDNAs abgeleitet ist, zeigen an, daß Faktor VII durch die Spaltung einer einzelnen Peptidbindung zwischen Arginin (152) und Isoleucin (153) in Faktor VIIa umgewandelt wird. Dies führt zu der Bildung eines zweikettigen Moleküls, das aus einer leichten Kette (152 Aminosäurereste) und einer schweren Kette (254 Aminosäurereste) besteht, welche durch eine Disulfidbindung zusammengehalten werden. Die leichte Kette enthält eine γ-Carboxiglutaminsäure-(Gla)- Domäne und zwei potentielle epidermale Wachstumsfaktor- Domänen, während die schwere Kette den Serinproteaseabschnitt des Moleküles enthält.
- Faktor VIIa kann bei der Behandlung von Patienten verwendet werden, die Inhibitoren für den Faktor VIII entwickelt haben (Hedner, U. und Kisiel, W, J. Clin. Invest., 71: 1836 - 1841, 1983) und für die Behandlung von Patienten, die an Blutungsstörungen wie Blutplättchenstörungen einschließlich Thrombozytopenie, von Willebrands Krankheit und anderen leiden, die typischerweise in Verbindung mit schweren Gewebeschäden vorliegen (europäische Patentanmeldung Nr. 86 309 197.1).
- Nach Beobachtungen der Erfinder in dieser Sache ist Faktor VIIa als ein Protein gefunden worden, das zu proteolytischer Spaltung fähig ist, was zu einer Anzahl von Abbauprodukten ohne Gerinnungsaktiviät führt. Die proteolytische Spaltung kann bei unterschiedlichen Stufen des Heilungsverfahrens und auch während der Lagerung auftreten. Abbauprodukte sind sowohl für den vom Plasma abgeleiteten Faktor VIIa als auch für den durch Rekombinanten-DNA-Technologie hergestellten Faktor VIIa beobachtet worden. Der Abbau kann auftreten, bevor der Faktor VII zu Faktor VIIa aktiviert worden ist, d.h. während der Herstellung und Isolation von Faktor VII während des Aktivierungsschrittes selbst oder während der Isolation, Reinigung und/oder Lagerung des aktivierten Produktes.
- Da die Abbauprodukte inaktive Moleküle sind, wird ihr Auftreten in der Faktor VIIa-Zubereitung zu einer geringeren spezifischen Aktivität der endgültigen Zubereitung führen. Weiterhin kann die Menge und Natur der Abbauprodukte von einer Herstellungscharge zur anderen variieren, was zu Zubereitungen mit einem variablen Gehalt an biologisch aktivem Faktor VIIa führt.
- Faktor VIIa-Zubereitungen, die inaktive Abbauprodukte enthalten, werden, wie erwähnt, eine geringere spezifische Aktivität verglichen mit Zubereitungen naben, in denen das gesamte oder ein Hauptteil des Proteinmaterials aktiv ist. Demgemäß sind höhere und häufigere Dosen notwendig, um einen therapeutischen oder prophylaktischen Effekt, verglichen mit einer Zubereitung mit höherer spezifischer Aktivität, zu erhalten und aufrechtzuerhalten.
- Variable Mengen inaktiver Abbauprodukte und als eine Folge variabler Gehalt biologisch aktiven Faktors VIIa werden weiterhin die Berechnung geeigneter Dosen mühsam und schwierig, wenn nicht unter gewissen Umständen unmöglich machen.
- Schließlich kann ein Gehalt an nicht-physiologischen Abbauprodukten in der endgültigen Zubereitung das Immunsystem des Patienten hemmen. Erneute Verabreichung kann dann zu allergischen Reaktionen führen, welche in schwerwiegenden Fällen einen tödlichen Verlauf haben können. Patienten können auch hohe Titer an Antikörpern gegen Faktor VIIa entwickeln, was die anschließende Behandlung schwierig oder unwirksam macht. Demgemäß wird eine Faktor VIIa-Zubereitung mit geringerer Tendenz zum proteolytischen Abbau in vitro zufriedenstellender sein und potentiell nützlicher in der Faktor VIIa-Therapie.
- Faktor VIIa wird wahrscheinlich, wie andere umlaufende Proteine, aus dem Blutstrom durch enzymatischen Abbau entfernt. Im Anfangsschritt dieses regulatorischen Prozesses wird das biologische aktive Enzym an einer oder an wenigen sensitiven Peptidbindungen gespalten, um ein inaktives, abgebautes Molekül zu erzeugen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Peptidbindungen, welche am sensitivsten für enzymatische Hydrolyse in vivo sind, identisch mit den labilen Peptidbindungen sind, bei denen am häufigsten beobachtet wird, daß sie während der Herstellung, Reinigung und/oder Lagerung von Faktor VIIa hydrolysiert werden (George J. Broze, Jr., Scot Hichman und Joseph P. Miletich, J. Clin. Invest. 76 (1985) 937 - 946).
- Faktor VII enthält 17 Lysin- (Positionen 18, 32, 38, 62, 85, 109, 137, 143, 148, 157, 161, 197, 199, 316, 337, 341, 389) und 24 Arginin- (Positionen 9, 15, 28, 36, 79, 110, 113, 144, 152, 202, 223, 224, 247, 266, 271, 277, 290, 304, 315, 353, 379, 392, 396, 402) Reste, die im Prinzip alle zu proteolytischem Abbau fähig sind, aber üblicherweise ist eine Anzahl dieser Reste als Spaltstellen nicht "aktiv".
- Obwohl die genaue Halbwertszeit von umlaufendem Faktor VIIa unbekannt ist, legen vorläufige Ergebnisse nahe, dar die Gerinnungsfaktorvorstufenaktivität von Faktor VIIa vom Blutstrom schnell nach der intravenösen Verabreichung aufgehoben wird (Ulla Hedner und Walter Kisiel, J. Clin.- Invest. 71 (1983) 1836 - 1841).
- Die Behandlung und das Leben der Patienten werden durch die beobachtete kurze in vivo-Halbwertszeit des nativen Faktors VIIa negativ beeinflußt. Relativ hohe Dosen und häufige Verabreichung wird notwendig sein, um die gewünschte therapeutische und prophylaktische Wirkung zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Als eine Folge wird die angemssene Dosiseinstellung schwierig zu erhalten sein, und die Notwendigkeit häufiger intravenöser Verabreichungen wird dem Lebensstil der Patienten Einschränkungen auferlegen.
- Folglich gibt es im Stand der Technik ein Bedürfnis nach Faktor VIIa-Zubereitungen, welche während der Herstellung Reinigung und Lagerung selbst bei hohen Konzentrationen stabil sind und welche weiterhin eine längere Halbwertszeit und ein geringeres Ausziehen aus dem Blut als der native oder rekombinante Faktor VIIa zeigen. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis, indem bestimmter modifizierter Faktor VII/VIIa zur Verfügung gestellt wird.
- In ihrem breitesten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen modifizierten Faktor VII/VIIa zur Verfügung, der an bestimmten Positionen in dem Molekül gegen proteolytische Spaltung stabilisiert ist. Genauer stellt die vorliegende Erfindung modifizierten Faktor VII/VIIa zur Verfügung, in dem eine oder mehrere proteolytisch sensible Peptidbindung(en) im nativen Faktor VII/VIIa durch eine proteolytisch stabilere Peptidbindung ersetzt worden ist/sind.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dies durch Modifikationen an bestimmten Stellen in dem nativen Human-Faktor VII/VIIa-Molekül erreicht. Derartige Modifikationen können das Entfernen bestimmter Aminosäurereste oder das Ersetzen eines oder mehrerer Aminosäurereste durch einen davon unterschiedlichen Aminosäurerest umfassen. Beispielsweise kann eine trypsinähnliche proteolytische Spaltung gehemmt werden, indem die Peptidbindung am C-terminalen Ende bestimmter Arg- und/oder Lys-Reste stabilisiert oder bestimmte Arg- und/oder Lys-Reste durch andere Aminosäurereste ersetzt und/oder bestimmte Arg- und/oder Lys- Reste entfernt werden.
- Beispiele trypsinähnlicher Spaltungsstellen innerhalb des Human-Faktors VII-Moleküls an denen Abspaltungen beobachtet worden sind, umfassen
- (i) Lysin(38)-Leucin(39),
- (ii) Lysin(32)-Aspartat(33),
- (iii) Lysin(143)-Arginin(144),
- (iv) Arginin(290)-Glycin(291),
- (v) Arginin(315)-Lysin(316),
- (vi) Lysin(316)-Valin(317),
- (vii) Lysin(341)-Glycin(342),
- (viii) Arginin(392)-Serin(393),
- (ix) Arginin(396)-Prolin(397) und
- (x) Arginin(402)-Alanin(403).
- Geringe chymotrypsinähnliche Spaltungen sind auch beobachtet worden nach
- (xi) Isoleucin(42) und
- (xii) Tyrosin(44).
- Es wurde gefunden, dar von diesen Spaltungen (i), (ii), (iv) und (v) die am meisten anfälligen für proteolytischen Abbau sind, während die verbleibenden von geringerer quantitativer Bedeutung sind.
- Wenn man die Stabilisierung von Faktor VII/VIIa betrachtet, ist es ein wichtiger Gesichtspunkt, daß der sich ergebende modifizierte Faktor VII seine Aktivität beibehalten sollte. Dies wird gemäß der Erfindung erreicht, indem man die Sequenz nativen Faktors VII/VIIa im zu modifizierenden Bereich mit entsprechenden Sequenzen in damit in Verbindung stehenden Proteinen wie Faktor IX, X, Faktor II und Protein C vergleicht. Homologe Sequenzen um die Hauptspaltstellen sind unten gezeigt:
- Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, modifizierten Faktor VII/VIIa zur Verfügung zu stellen, indem einer, mehrere oder alle der Lysin-, Arginin-, Isoleucin-und Tyrosinreste:
- (i) Lysin(38)
- (ii) Lysin(32)
- (iii) Lysin(143)
- (iv) Arginin(290)
- (v) Arginin(315)
- (vi) Lysin(316)
- (vii) Lysin(341)
- (viii) Arginin(392)
- (ix) Arginin(396)
- (x) Arginin(402)
- (xi) Isoleucin(42) und
- (xii) Tyrosin(44)
- durch Substitution oder Entfernen stabilisiert worden sind.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind einer, mehrere oder alle der Aminosäurereste an den Positionen (32), (38), (290) und (315) durch Substitution oder Entfernen stabilisiert worden.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Lys an der Position 32 (ii) und/oder 38 (i) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden. Lys (38) kann bevorzugt durch Thr, Asp, Leu, Gly, Ala, Ser, Asn, oder His ersetzt werden und Lys (32) kann bevorzugt durch Gln, Glu, His, Gly, Thr, Ala, oder Ser ersetzt werden.
- Auch kann Arg an der Position 290 (iv) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden, z.B. Gly, Ala, Ser, Thr oder Lys, bevorzugt Ser, Ala oder Gly.
- Arg (315) (v) kann bevorzugt durch Gly, Thr, Ala, Ser oder Gln ersetzt werden.
- Weiterhin kann Lys (341) (vii) durch Glu, Gln, Gly, Thr, Ala oder Ser, bevorzugt Glu oder Gln ersetzt werden.
- Neben der Substitution der obengenannten Arg- bzw. Lys- Reste durch andere Aminosäurereste kann auch das Entfernen der Arg- oder Lys-Aminosäurereste in Betracht gezogen werden, um proteolytische Spaltung zu verhindern. Weiterhin können einer oder mehrere der Aminosäurereste entweder auf der N- oder der C-Terminalseite solcher Arg- oder Lys-Reste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert werden, welcher eine stabilisierende Wirkung auf die proteolytisch sensible Peptidbindung ausübt. Ein Beispiel solcher Modifikationen ist die Substitution des Aminosäurerestes, der an dem C-Terminalende eines Lys- oder Arg-Restes gebunden ist, durch Pro.
- Um proteolytische Spaltung an Position 42 (xi) und 44 (xii) zu vermeiden, können Ile (42) und/oder Tyr (44) durch Asn, Ser, Ala oder Gln ersetzt werden.
- Für die vorliegende Erfindung ist beabsichtigt, daß sie jegliche Kombination der oben genannten Substitutionen und Tilgungen abdeckt.
- Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezug auf die folgende genaue Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich.
- Figur 1 erläutert die Aminosäuresequenz, gegeben durch einbuchstabige Abkürzungen und die versuchsweise Struktur für Faktor VII,
- Figur 2 erläutert den Aufbau von Plasmid pFW 10-3/6,
- Figur 3 erläutert den Aufbau von Plasmid pFW 60-3/6 und
- Figur 4 erläutert den Aufbau von Plasmid pFWx-3/6.
- Bevor die Erfindung dargelegt wird, kann es nützlich für deren Verständnis sein, Definitionen bestimmter Begriffe, die hiernach verwendet werden, zu erläutern.
- Ein DNA-Molekül oder eine Sequenz das/die enzymatisch aus Sequenzen synthetisiert worden ist, die in einer mRNA-Matrize oder einem Klon eines solchen Moleküls vorliegen.
- Ein DNA-Molekül oder ein Klon eines solchen Moleküles, entweder einzel- oder doppelsträngig, das/der in Partialform aus einem natürlich auftretenden Gen isoliert werden kann oder das/der modifiziert worden ist, um DNA-Segmente zu enthalten, die in einer Weise kombiniert und aneinandergelegt sind, die sonst in der Natur nicht existiert.
- Ein DNA-Konstrukt, der genetische Information enthält, welche für seine Replikation sorgen kann, wenn es/er in eine Wirtszelle eingeführt wird. Ein Plasmid enthält im allgemeinen wenigstens eine Gensequenz, die in der Wirtszelle zu exprimieren ist, ebenso wie Sequenzen, die Funktionen kodieren, welche eine solche Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren und Transskriptions-Anfangsstellen. Es kann ein lineares oder geschlossenes kreisförmiges Molekül sein. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck Expressionsvektor ein Plasmid oder einen Vektor bedeuten, welches/welcher einen Transkriptionspromotor und Terminator enthält, wirkungsmäßig verbunden mit einer DNA-Sequenz, die ein interessierendes Protein oder Polypeptid kodiert. Expressionsvektoren können weiterhin andere Elemente enthalten, einschließlich selektierbarer Marken, Beschleuniger, Polyadenylationssignale usw., die teilweise durch die speziell gewählte Wirtszelle bestimmt werden.
- Eine Funktion oder eine Gruppe von Funktionen, die von einem Molekül in einem biologischen Umfeld (d.h. in einem Organismus oder in einer In vitro- Kopie) ausgeführt wird/werden. Biologische Aktivitäten von Proteinen können in katalytische und Effektoraktivitäten unterteilt werden. Katalytische Aktivitäten von Gerinnungsfaktoren beziehen im allgemeinen die Aktivierung anderer Faktoren durch die spezifische Spaltung von Vorläufern ein. Effektoraktivitäten umfassen spezifische Bindungen des biologisch aktiven Moleküls an Kalzium oder an andere kleine Moleküle, an Makromoleküle so wie Proteine oder an Zellen. Effektoraktivität erhöht oftmals oder ist wesentlich für die katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen. Katalytische und Effektoraktivitäten können, in einigen Fällen, in derselben Domäne eines Proteins vorliegen.
- Für Faktor VIIa ist die biologische Aktivität durch die Vermittlung der Blutgerinnung durch den extrinsischen Seitenweg gekennzeichnet. Faktor VIIa aktiviert Faktor X zu Faktor Xa, der wiederum Prothrombin in Thrombin umwandelt, so daß die Bildung einer Fibringerinnung eingeleitet wird.
- Der modifizierte Faktor VIIa gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine biologische Aktivität, die im wesentlichen dieselbe ist wie die des nativen Faktors VIIa.
- "Faktor VII/VIIa", wie es in dieser Anmeldung verwendet wird, bedeutet ein Produkt, das entweder aus der nicht- aktivierten Form (Faktor VII) oder der aktivierten Form (Faktor VIIa) oder Mischungen davon besteht. "Modifizierter Faktor VII/VIIa" soll ein biologisch aktives Molekül bedeuten, das von Faktor VII/VIIa durch die Substitution oder Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurereste abgeleitet ist.
- Da die Modifikationen gemäß der vorliegenden Erfindung auf dem Genexpressionslevel gemacht werden, werden Modifikationen, die in das Faktor VII-Molekül eingeführt sind, auch in dem aktivierten Produkt (Faktor VIIa) gefunden werden.
- "Faktor VII/VIIa" in der obigen Definition schließt Proteine ein, die eine Aminosäuresequenz des nativen Human- Faktor VII/VIIa haben. Es schließt auch Proteine mit einer leicht modifizierten Aminosäuresequenz ein, zum Beispiel einem modifizierten N-Terminalende einschließlich N-Terminal-Aminosäuretilgungen oder -zusätzen, solange die Proteine im wesentlichen die Aktivität von Faktor VIIa behalten.
- "Faktor VII" in der obigen Definition umfaßt auch natürliche allelische Variationen, die von einem Individuum zu einem anderen existieren und auftreten können. Auch können Grad und Ort von Glykosilierung oder anderen Post-Translations-Modifikation abhängig von der gewählten Wirtszelle und der Natur der Wirtszellenumgebung variieren.
- Das Zahlensystem der Aminosäuresequenz von Faktor VII/VIIa, das hierin benutzt wird, wird aus Figur 1 deutich, in der das N-Terminal-Analin mit 1 beziffert ist und das C-Terminal-Prolin mit 406 beziffert ist.
- Die dreibuchstabigen und einbuchstabigen Abkürzungen, die für die Aminosäuren verwendet werden, sind diejenigen, die normalerweise im Stand der Technik verwendet werden, das heißt: Aminosäure dreibuchstabige Abkürzung einbuchstabige Abkürzung Alanin Cystein Aspartat Glutamat Phenylanalin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin γ-Carboxyglutaminsäure
- Die Aminosäureänderungen werden bevorzugt durch Oligonukleotid-gerichtete stellenspezifische Mutagenese in Faktor VII-cDNA eingeführt. Nach dem Sichten der E.coli- Zellen wird das mutierte Faktor VII-Gen isoliert und wieder in einen geeigneten Expressionsvektor geklont. Der Expresssionsvektor wird dann in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, welche, wenn sie in einem brauchbaren Kulturmedium kultiviert wird, den modifizierten Faktor VII exprimiert und absondert, welcher nach der Rückgewinnung aus dem Kulturmedium durch bekannte Mittel in den entsprechenden modifizierten Faktor VIIa umgewandelt wird.
- Verschiedene Wirtszellen können verwendet werden, einschließlich Säugetierzellen, Hefe und andere Pilze und Bakterien. Jedoch sind Säugetierzellen bevorzugt. Eine besonders bevorzugte Säugetierzellinie ist die BHK- Zellinie tk&supmin;ts13 (Waechter und Basserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106 - 1110, 1982). Verfahren zum Exprimieren geklonter Gene in jedem dieser Wirte sind im Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel EP veröffentlichte Patentanmeldung No. 200,421 (Expression von Faktor VII und Faktor IX in Säugetierzellen), EP veröffentlichte Patentanmeldung No. 191,606 (Expression von Protein C in Bakterienzellen) und EP veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 167,420 (Expression von Faktor IX in Hefe).
- Für die Expression von modifiziertem Faktor VII gemäß der Erfindung in kultivierten Säugetierzellen werden Expressionsvektoren, welche geklonte Modifizierter-Faktor VII-Sequenzen enthält, durch geeignete Transfektionstechniken in die Zellen eingeführt, so wie Kalziumphoshat- vermittelte Transfektion (Graham und van der Eb, Virology 52: 456 - 467, 1973; wie modifiziert von Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 - 3570, 1980). Elektroporation-Transfektionstechnik kann auch verwendet werden (Neuman et al., EMBO. J. 1: 841 - 845, 1982). Ein DNA-Kalziumphosphatniederschlag wird gebildet, und dieser Niederschlag wird den Zellen aufgegeben. Ein Anteil der Zellen nimmt die DNA auf und hält sie für einige Tage innerhalb der Zelle. Ein kleiner Bruchteil der Zellen integriert die DNA in das Genom der Wirtszelle. Diese Integranten werden durch Kotransfektion mit einem Gen identifiziert, das einen selektierbaren Phänotyp (eine selektierbare Marke) überträgt. Eine bevorzugte selektierbare Marke ist das Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)- Gen, welches der Droge Methotrexat (MTX) Zellwiderstand verleiht. Nachdem die Wirtszellen in die DNA aufgenommen haben, wird Wirkstoffselektion angewendet, um eine Population von Zellen auszuselektieren, die die selektierbare Marke in einer stabilen Ausbildung exprimieren.
- Von den transfizierten Zellen produzierter modifizierter Faktor VII kann durch Adsorption an Bariumcitrat aus dem Zellkulturmedium entfernt werden. Verbrauchtes Medium wird mit Natriumcitrat und Bariumchlorid gemischt und der Niederschlag gesammelt. Das niedergeschlagene Material kann dann auf Anwesenheit des geeigneten Gerinnungsfaktors geprüft werden. Weitere Reinigung kann durch Immunoadsorption erreicht werden. Es ist bevorzugt, daß die Immunoadsorptionssäule einen monoklonalen Antikörper hoher Spezifität aufweist. Alternativ kann die Reinigung des Bariumcitrat-Niederschlagmaterials durch konventionellere biochemische Methoden oder durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) vorgenommen werden.
- Die Umwandlung von einkettigem modifiziertem Faktor VII in aktiven zweikettigen modifizierten Faktor VIIa kann erreicht werden, indem man Faktor XIIa verwendet, wie es von Hedner und Kisiel beschrieben ist (J. Clin. Invest. 71: 1836 - 1841, 1983) oder mit anderen Proteasen, die trypsinähnliche Spezifität haben. (Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29 - 42, 1983). Alternativ modifizierter Faktor VII kann aktiviert werden, indem man ihn durch eine Ionentauscher-Chromatographiesäule, so wie Mono Q (Pharmacia Fire Chemicals) oder dergleichen leitet. (Bjoern et al., Research Disclosures, 269, September 1986, Seiten 564 - 565).
- Die folgenden Beispiele werden zwecks Erläuterung angegeben und nicht zwecks Beschränkung.
- Restriktionsenzyme wurden von Bethesda Research Laboratories (BRL), New England Biolabs, und Stratagene erhalten und wurden wie vom Hersteller angegeben verwendet, wenn nichts anderes ausgesagt ist, Oligonukleotide wurden in einer automatischen DNA-Herstellungsvorrichtung unter Verwendung von Phsosphoramidit-Chemie auf einem überwachten Porenglasträger synthetisiert (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers (1981) Tetrahydron Letters 22, 1859 - 1869). E. coli-Zellen wurden wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982) beschrieben transformiert.
- Ein repräsentativer modifizierter Faktor VII wurde durch Ändern der Aminosäure Nr. 32 von Lys --> Gln und Aminosäure Nr. 38 von Lys --> Thr durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese hergestellt.
- Die Oligonukleotide mit diesen Änderungen haben die Sequenzen: Oligonunkeotid Nukleotidposition
- welche ein 27-mer mit Änderungen an der Nukleotidposition 228, welche eine BglII-Stelle ohne Änderung der Aminosäure zerstört, und an der Stelle 235 ist, die die Aminosäure Lys(32) in Gln ändert. Oligonukleotid Nukleotidposition
- welche ein 21-mer mit Änderungen an der Nukleotidposition 254 ist, welche die Aminosäure Lys(38) in Thr ändert.
- Ein weiterer repräsentativer modifizierter Faktor VII wurde durch Ändern der Aminosäure Nr. 290 von Arg -- Ser und Aminosäure Nr. 315 Arg -- Ser durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese hergestellt.
- Die Oligonukleotide mit diesen Änderungen haben die Sequenzen: Oligonukleotid: Nukleotidposition
- welche ein 27-mer mit Änderungen an der Nukleotidposition 1009 ist, wobei die Aminosäure Arg (290) in Ser geändert worden ist. Oligonukleotid Nukleotidposition
- welche ein 26-mer mit Änderungen an der Nukleotidposition 1084 und 1086 ist, wobei die Aminosäure Arg(315) in Ser geändert worden ist.
- Faktor VII-cDNA mit einer 38 Aminosäuenlangen Führersequenz (Berkner, K.L. et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Vol. LI, 531 - 541, 1986) wurde in der EcoRI- Stelle des pGEM3-Vektors (Promega Biotec) geklont und in E.coli MC 1061 (dam&spplus;) oder MC 1000 (dam&supmin;) -Bakterienstamm fortgepflanzt.
- Kurz gesagt wurde das Plasmid FVII(565 + 2463)/pDK mit EcoRI geschnitten, und die Faktor VII-cDNA wurde an das EcoRI- geschnittene pGEM3 gebunden. Der Aufbau des Plasmids FVII (565 + 2463)/pDX ist in der EP Patentanmeldung Nr. 86 302 855.1 beschrieben. Das Plasmid ist auch bei der American Type Culture Collection (ATTC Nr. 40205) hinterlegt worden.
- DNA-Zubereitungen in kleinem und großem Maßstab wurden hergestellt wie beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour 1982 beschrieben. Eine dieser Plasmidzubereitungen wird pFW 10-3/6 genannt. Der Aufbau von pFW 10-3/6 ist in Figur 2 erläutert.
- Der Zusatz von markierten oder unmarkierten Phosphatgruppen an Oligonukleotide wurde wie beschrieben durchgeführt (Maniatis et al., wie oben).
- Die stellengerichtete Mutagenesereaktion wurde ausgeführt, indem das Verfahren von Morinaga et al. 1984 (BIO/TECHNOLOGY vol. 2 S. 636) modifiziert wurde. Plasmid pFW 10-3/6, das FVII-cDNA enthält, wurde mit BglI digeriert, einer eindeutigen Stelle in dem Plasmid. Diese Spaltung erzeugte Fragment a), gezeigt in Figur 4, was den Ampicillin-Widerstand zerstört. Fragment a) wurde durch Elektroelution vom Agarosegel gereinigt und mit Kälber-Intestinal-Alkaliphosphatase (CIAP) wie bei Maniatis et al., wie oben, beschrieben, behandelt.
- Eine andere Probe des pFW 10-3/6 wurde mit BssHII und SacII digeriert, was Fragment b) in Figur 3 erzeugte, mit einem Fenster von 575 bp in der FVII-cDNA. Fragment b) wurde durch Elektroelution vom Agarosegel nach der Elektrophorese gereinigt.
- Die Fragmente a) und b) wurden weiterhin durch mehrere Phenolextraktionen, Phenol-Chloroform (1:1 v/v)- und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v)-Extraktionen gereinigt, mit 0.3 M Na-Acetat und 70% (v/v) Äthanol niedergeschlagen und in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA mit pH 7.6) gelöst.
- Dann wurden 0.1-0.15 pmol sowohl von Fragment a) als auch von b) mit 25 pmol des phosphorylierten synthetischen Oligonukleotid I) in einem Eppendorf-Rohr gemischt.
- Dann wurden 10ul 5X Polymerase-Ligasepuffer (0.5M NaCl, 33 mM Tris Hcl, pH 7.5, 40 mM MgCl&sub2;, 5 mM 2-ME) hinzugefügt.
- Von der endgültigen Mischung wurden 15 ul-Proben entnommen und bis zur späteren Verwendung als Marker bei der Gel-Elektrophorese auf Eis gelagert. Die verbleibende Mischung wurde in einem Kochendwasserbad vier Minuten lang inkubiert, um die DNA-Fragmente zu denaturieren. Nach der Inkubation wurde die Mischung nach und nach abgekühlt. Beim Wiederanlassen wurden Heteroduplexe gebildet und unter Verwendung von Agarosegel- Elektrophorese wurde die Bildung einer neuen ringförmigen DNA mit der korrekten Mutation durch Vegleich mit der nicht erhitzten Probe von oben gezeigt.
- Dann wurden 10ul der vier Desoxyribonukleosid-Triphosphate (jedes 2.5 mM), 3ul 20 mM ATP, 1ul Klenow-Fragment der DNA- Polymerase 1 (5U/ul) und 1ul T4 DNA-Ligase (10U/ul) zu der Mischung (20ul) der Heteroduplexe hinzugefügt (Endvolumen 40ul). Die endgültige Mischung wurde über Nacht bei 12ºC inkubiert.
- Die Transformation von E.coli MC 1061 und MC 1000 mit der Inkubationsmischung führte zu Ampicillin-resistenten Transformanten. Transformanten, die das mutante FVII-Gen trugen, wurden durch Kolonie-Hybridisierung (Maniatis et al.) mit den 5'-³²P-gezeichneten 27-mer- und 21-mer-synthetischen Oligonukleotiden ausgewählt.
- Nach der Retransformation wurde Plasmid-DNA von ausgewählten Kolonien gereinigt, analysiert und ihre Sequenz bestimmt (durch das Maxam-Gilbert-Verfahren und das Dideoxy-Verfahren), um die durch das synthetische Oligonukleotid bewirkte Mutation zu verifizieren.
- Der Aufbau von Plasmid pFW 60-3/6, das ein mutiertes Faktor VII-Gen beherbergt, in dem Lys(32) durch Gln ersetzt worden ist, ist in Figur 3 dargestellt.
- pFW 60-3/6 wurde mit EcoRI digeriert, und das EcoRI-EcoRI- Faktor VII-Fragment wurde in das EcoRI-geschnittene pDx-Plasmid eingebunden, um Plasmid pFW 78-3/6 zu erhalten, das das Faktor VII(Gln 32)-Gen in derselben Ausrichtung wie in Plasmid FVII (565 + 2463)/pDX beherbergt. Plasmid pFW 78-3/6 wurde dann in BHKtk&supmin;ts13-Zellen transfiziert, wobei dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde.
- Der von den Zellen produzierte modifizierte Faktor VII wird dann mit Bariumcitrat niedergeschlagen, durch Immunoadsorption gereinigt und zu modifiziertem Faktor VIIa aktiviert, indem er durch eine Ionentauscher-Chromatographiesäule wie von Bjoern et al., aaO. beschrieben, geleitet wird.
- Wie aktivierter nativer Faktor VIIa verkürzte der aktivierte modifizierte Faktor VIIa die Gerinnungsdauer in einer einstufigen Gerinnungsprobe. Der aktivierte modifizierte Faktor VIIa wurde bei einer Konzentration von etwa 0,9 mg/ml in einem 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8.5 mit 390 mM NaCl und 5 mM EDTA bebrütet. Der Abbau wurde durch SDS-PAGE reduzierter Proben aufgezeichnet, und als ein signifikanter Abbau aufgetreten war, wurde eine Probe gezogen und einer HPLC-Säule aufgegeben. Die präparative Chromatographie diente hauptsächlich dazu, Tris aus der Probe für die Aminosäuren-Sequenzbestimmung auszunehmen, als intakten und abgebauten modifizierten Faktor VIIa, der gleichzeitig aus der Säule ausgelöst wurde. Aminosäure-Sequenzbestimmung am N-Terminalende zeigte, dar keine Hydrolyse der Peptidbindung zwischen dem Glutaminrest Nr. 32 und dem Asparginsäurerest Nr. 33 aufgetreten ist. Im Gegensatz dazu wurde starker Abbau am Lysinrest Mr. 32 beobachtet, wenn aktivierter nativer Faktor VIIa derselben Behandlung und Analyse ausgesetzt war, wie sie in einer parallelen Untersuchung durchgeführt wurde.
- Indem man dem Verfahren des Beispiels 1 folgt, mit der einzigen Ausnahme, daß das synthetische Oligonukleotid II) anstelle von I) verwendet wurde, wurde ein Expressionsplasmid erhalten, das das mutierte Faktor VII-Gen beherbergte.
- Dieses Plasmid wird dann in BHKtk&supmin;ts13-Zellen transfiziert, und Faktor VII(Thr 38) wird aus dem Zellenüberstand gewonnen und zu Faktor VIIa(Thr 38) wie beschrieben aktiviert.
- Indem man dem Verfahren nach Beispiel 1 folgte, mit der einzigen Ausnahme, daß 12.5 pmol sowohl des Oligonukleotids I) als auch II) in der stellengerichteten Mutagenesereaktion verwendet werden, wurde ein Expressionsplasmid erhalten, das das mutierte Faktor VII-Gen beherbergte.
- Dieses Plasmid wird dann BHKtk&supmin;ts13-Zellen transfiziert, und Faktor VII (Gln32, Thr38) wird aus dem Zellenüberstand gewonnen und zu Faktor VIIa (Gln32, Thr38) wie beschrieben aktiviert.
- Der Aufbau von Plasmid pFW A-3/6, das ein mutiertes Faktor VII-Gen beherbergt, in dem Arg(290) durch Ser ersetzt worden ist, ist in Figur 4 dargestellt,
- Plasmid pFW 10-3/6 wurde verwendet, um das Fragment a) von Beispiel 1 herzustellen und eine andere Probe von pFW 10-3/6 wurde mit SacII und Dra II digeriert, wobei Fragment b) in Figur 4 mit einem Fenster von 1366 bp in der FVII-cDNA erzeugt wurde.
- Die Fragmente b) und a) wurden nacheinander wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, mit Ausnahme der Verwendung von Oligonukleotid III) anstelle von I).
- pFW A-3/6 wurde mit EcoRI digeriert, und das EcoRI-EcoRI- Faktor VII-Fragment wurde in das EcoRI-geschnittene pDx-Plasmid eingebunden, um Plasmid pFW X-3/6 zu erhalten, welches das Faktor VII(Ser 290)-Gen in derselben Ausrichtung wie im Plasmid FVII(565 + 2463)/pDX beherbergt. Plasmid pFW X-3/6 wurde dann in BHKtk&supmin;ts13-Zellen transfiziert, wobei dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde.
- Der von den Zellen produzierte modifizierte Faktor VII wird dann mit Bariumcitrat niedergeschlagen, durch Immunoadsorption gereinigt und zu modifiziertem Faktor VIIa aktiviert, indem man ihn durch eine Ionentauscher-Chromatographiesäule wie von Bjoern et al., a.a.O., beschrieben, leitet.
- Indem man dem Verfahren nach Beispiel 4 folgt, mit der einzigen Ausnahme, daß das synthetische Oligonukleotid IV) anstelle von III) verwendet wurde, wurde ein Expressionsplasmid erhalten, das das mutierte Faktor VIIa-Gen beherbergte.
- Dieses Plasmid wird dann im BHKtk&supmin;ts13-Zellen transfiziert und Faktor VII(Ser315) wird aus dem Zellenüberstand zurückgewonnen und zu Faktor VIIa(Ser315) wie beschrieben aktiviert.
- Um einige aktive Spaltstellen zu identifizieren, wurde eine stark abgebaute Zubereitung von Rekombinanten-Faktor VII der N-Terminal-Sequenzanalyse durch automatisierten Edman-Abbau unterworfen, wobei ein Gasphasen-Sequenzierer vom Typ Applied Biosystems model 470 A verwendet wurde. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Zyklus Nr. Ausbeute (*) die Gesamtmenge an Aminosäureresten, die aus zwei Sequenzen auftreten, ist gegeben (**) glykosyliertes Asn n.b. nicht bestimmt
- In dieser Probe wurden vier N-Terminalenden abgeleitet: Leu-39 (Spalte 1), Gly-291 (Spalte 3) und Lys-316 (Spalte 4), welche proteolytischer Spaltung entsprechen, und Ile-153 (Spalte 2), welche der Aktivierung von FVII zu FVIIa entspricht.
Claims (31)
1. Modifizierter Faktor VII/VIIa, dadurch gekennzeichnet,
daß einer, mehrere oder alle der Lysin-, Arginin-,
Isoleucin- und Tyrosin-Reste
(i) Lys(38)
(ii) Lys(32)
(iii) Lys(143)
(iv) Arg(290)
(v) Arg(315)
(vi) Lys(316)
(vii) Lys(341)
(viii) Arg(398)
(ix) Arg(396)
(x)Arg (402)
(xi) Ile(42)
(xii) Tyr(44)
substituiert und/oder entfernt worden sind.
2. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß einer, mehrere oder alle der
Aminosäure-Reste (i), (ii), (iv) und (v) substituiert oder
entfernt worden sind.
3. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Lys(38) durch Thr, Asp, Leu,
Gly, Ala, Ser, Asn oder His ersetzt worden ist.
4. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß Lys(38) durch Thr ersetzt worden ist.
5. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Lys(32) durch Gln, Glu, His,
Gly, Thr, Ala oder Ser ersetzt worden ist.
6. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß Lys(32) durch Gln ersetzt worden ist.
7. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Arg(290) durch Gly, Ala, Ser,
Thr oder Lys ersetzt worden ist.
8. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Lys(38) durch Ser, Ala oder
Gly ersetzt worden ist.
9. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Arg(315) durch Gly, Thr,
Ser, Ala oder Gln ersetzt worden ist.
10. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Lys(341) durch Glu, Gln, Thr,
Ser, Ala oder Gly, bevorzugt durch Glu oder Gln, ersetzt
worden ist.
11. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Ile(42) durch Asn, Ser, Ala oder Gln
ersetzt worden ist.
12. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß Tyr(44) durch Asn, Ser, Ala oder Gln
ersetzt worden ist.
13. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß er irgendeine Kombination der
Substitutionen nach einem der Ansprüche 3 bis 12 aufweist.
14. Modifizierter Faktor VII/VIIa nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß Lys(38) durch Thr ersetzt
worden ist und Lys(32) durch Gln ersetzt worden ist.
15. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie für
einen modifizierten Faktor VII/VIIa nach einem der
Ansprüche 1 bis 14 codieren.
16. Expressionsvektoren, dadurch gekennzeichnet, dadurch
gekennzeichnet, daß sie eine DNA-Sequenz nach Anspruch 15
enthalten.
17. Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum Erzeugen
eines modifizierten Faktors VII/VIIa nach einem der
Ansprüche 1 bis 14 transformiert werden.
18. Verfahren Für die Herstellung von modifiziertem Faktor
VII/VIIa, dadurch gekennzeichnet, daß ein für die
Expression des Faktors VII codierendes Gen in eines, mehrere
oder alle der Codone mutiert wird, die für die Expression
der Lysin-, Arginin-, Isoleucin- und Tyrosin-Reste
(i) Lys(38)
(ii) Lys(32)
(iii) Lys(143)
(iv) Arg(290)
(v) Arg(315)
(vi) Lys(316)
(vii) Lys(341)
(viii) Arg(398)
(ix) Arg(396)
(x) Arg(402)
(xi) Ile(42)
(xii) Tyr(44)
im nativen Faktor VII verantwortlich sind, der ein
mutiertes Gen erzeugt, welches zum Exprimieren eines
modifizierten Faktors VII fähig ist, in dem einer, mehrere
oder alle der Aminosäure-Reste substituiert oder entfernt
worden sind, wobei das mutierte Gen in einen zweckmäßigen
Wirt eingefügt wird, der fähig ist, das mutierte Gen zu
exprimieren, wobei der Wirt in einem geeigneten
Wachstumsmedium kultiviert wird, so daß der modifizierte Faktor
VII/VIIa exprimiert wird, welcher anschließend isoliert
und wahlweise aktiviert wird, um ein Modifizierter-Faktor-
VIIa-Produkt zu erzeugen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
einer, mehrere oder alle der Aminosäure-Reste (i), (ii),
(iv) und (v) substituiert oder entfernt worden sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Lys(38) durch Thr, Asp, Leu, Gly, Ala, Ser, Asn
oder His ersetzt worden ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIIa Lys(38)
durch Thr ersetzt worden ist.
22. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Lys(32) durch Gln, Glu, His, Gly, Thr, Ala oder
Ser ersetzt worden ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
Lys(32) durch Gln ersetzt worden ist.
24. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Arg(290) durch Gly, Ala, Ser, Thr oder Lys
ersetzt worden ist.
25. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Lys(38) durch Ser, Ala oder Gly ersetzt worden
ist.
26. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Arg(315) durch Gly, Thr, Ser, Ala oder Gln
ersetzt worden ist.
27. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
Lys(341) durch Glu, Gln, Thr, Ser, Ala oder Gly, bevorzugt
durch Glu oder Gln, ersetzt worden ist.
28. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
Ile(42) durch Asn, Ser, Ala oder Gln ersetzt worden ist.
29. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
Tyr(44) durch Asn, Ser, Ala oder Gln ersetzt worden ist.
30. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem erzeugten modifizierten Faktor VII/VIIa
irgendeine Kombination der Substitutionen nach einem der
Ansprüche 20 bis 29 vorliegt.
31. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem erzeugten modifizierten Faktor
VII/VIIa Lys(38) durch Thr ersetzt worden ist und Lys(32)
durch Gln ersetzt worden ist.
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