PATENTANWÄLTE
dr. V. SCHMIED-KOWARZIK · dr. P. WEINHOLD · dr. P. BARZ München
DiPL.-iNC. C. DANNENBERG · dr. D. GUDEL- dipl.-inc. S. SCHUBERT · Frankfurt
ZUCELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT
- 3-
SIECFRIEDSTRASSE β βΟΟΟ MÜNCHEN «Ο
TELEFON. (Οβ9) 335024 A 335025
TELECRAMMEi WIRPATENTE TELEX. 5215679
Case: 100/65,119,164
GENENTECH, INC.
60 Point San Bruno Blvd.
South San Francisco
California 94080 / U.S.A.
HUMANGEWEBE-PLASMINOGEN-AKTIVATOR
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
Die Erfindung betrifft Human-Plasminogen-Aktivator, der dem
in Humanserum und/oder -geweben gefundenen Aktivator entspricht, sowie neue Formen und Zusammensetzungen davon. Insbesondere
betrifft die Erfindung Mittel und Verfahren, mit dem dieser Aktivator in homogener Form in therapeutisch erheblichen
Mengen hergestellt werden kann.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung der DNA-Sequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz von Human-Plasminogen-Aktivator.
Diese Ermittlung ermöglichte die Bildung von Human-Plasminogen-Aktivator unter Anwendung der rekombinanten
DNA-Technik, die wiederum die Bildung von Material in ausreichender Qualität und Menge möglich machte, um Tierversuche
und klinische Untersuchungen als Voraussetzung für eine Markteinführung durchzuführen, wobei keine Beschränkungen
vorlagen, mit denen bisherige Isolationsverfahren unter Produktion und Extraktion vorhandener^ Zellkulturen
notwendigerweise behaftet sind. Gegenstand der Erfindung sind sämtliche vorstehend angedeuteten Ausführungsformen.
Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien,
die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich
der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind in der nachstehenden Beschreibung mit Nummern gekennzeichnet.
Diese Nummern beziehen sich auf die Bibliographie am Schluss der Beschreibung.
A. Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
Das fibrinolytische System befindet sich in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem Koagulationssystem, wodurch ein
intaktes, offenes Gefässbett aufrechterhalten wird. Das Ko-
5agulationssystem lagert Fibrin als eine Matrix ab, die zur
Wiederherstellung eines hämostatlschen Zustands dient. Das fibrinolytische System entfernt das Fibrinnetzwerk, nachdem
der hämostatische Zustand erreicht ist. Der fibrinolytische Prozess wird durch das proteolytische Enzym Plasmin,
das aus dem Plasmaprotein-Vorläuferprodukt Plasminogen gebildet wird,hervorgerufen. Plasminogen wird durch Aktivierung
mittels eines Aktivators in Plasmin umgewandelt.
Gegenwärtig sind im Handel zwei Aktivatoren erhältlich, nämlieh
Streptokinase und Urokinase. Beide sind zur Behandlung von akuten Gefässerkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall,
Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripherer Arterienverschluss und andere venöse Thrombosen, indiziert. Insgesamt
stellen diese Krankheiten schwerwiegende Gesundheitsrisiken dar.
Die diesen Krankheiten zugrunde liegende ätiologische Basis besteht in einem partiellen oder - in schweren Fällen - totalen
Verschluss eines Blutgefässes durch ein Gerinnsel, d.h.
Thrombus oder Thromboembolus.Bei der herkömmlichen Antikoagulationstherapie,
zum Beispiel mit Heparin und Cumarin, wird nichts getan, um die Auflösung von Thrombi oder Thromboemboli
direkt zu fördern. Die vorstehend erwähnten thrombolytischen Mittel Streptokinase und Urokinase werden in der
Praxis eingesetzt, unterliegen aber beide starken Beschränkungen. Keines der beiden Mittel besitzt eine hohe Affinität
für Fibrin, so dass sie zirkulierendes und fibringebundenes Plasminogen relativ wahllos aktivieren. Das im zirkulierenden
Blut gebildete Plasmin wird relativ rasch neutralisiert und ist für die Thrombolyse verloren. Restliches
Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktorproteine ab, zum Beispiel Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, was ein hämorrhagisches
Potential verursacht. Ferner ist Streptokinase
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stark antigen, und Patienten mit hohen Antikörpertitern reagieren ungenügend auf die Behandlung und können nicht unter
Dauerbehandlung bleiben. Die Urokinasetherapie ist teuer, was auf die Isolierung aus menschlichem Urin oder Gewebekul-
5türen zurückzuführen ist, so dass sie sich in der klinischen
Praxis nicht allgemein durchgesetzt hat. Urokinase ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen gewesen; vgl. zum Beispiel
Literaturstellen 1-6.
Sogenannte Plasminogen-Aktivatoren wurden aus verschiedenen
Humangeweben, zum Beispiel Uterusgewebe, Blut, Serum (vgl. allgemein Literaturstellen 7-11) und Zellkulturen isoliert
(94). Zusammensetzungen davon wurden ebenfalls beschrieben (vgl. Literaturstellen 12, 13 und 14-18). Die aus
15diesen Quellen abgeleiteten Plasminogen-Aktivatoren wurden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Plasminogen-Aktivatoren vom
Urokinasetyp (u-PA) und Plasminogen-Aktivatoren vom Gewebetyp (t-PA), basierend auf Unterschieden in den immunologischen
Eigenschaften. (Die Abkürzungen t-PA und u-PA wurden beim XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis
and Hemostasis, Bergamo, Italien, 27.JuIi 1982, vorgeschlagen.)
Kürzlich wurde eine Humanmelanomlinie identifiziert, die 25t-PA sekretiert. Die Charakterisierung dieses Melanom-Plasminogen-Aktivators
ergab, dass er sich sowohl immunologisch als auch im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung von
aus normalem Humangewebe isoliertem Plasrainogen-Aktivator nicht unterscheiden lässt (Literaturstellen 19, 88).
30
Das Produkt wurde in relativ reiner Form isoliert und charakterisiert.
Es wurde festgestellt, dass es sich um ein hochaktives, fibrinolytisches Mittel handelt (20).
Einige Untersuchungen (vgl. zum Beispiel Literaturstellen 95-98), die aus Melanomzellinien gereinigte t-PA verwendeten,
ergaben für dieses Produkt im Vergleich zu Plasrainogen-Aktivatoren
vom Urokinasetyp eine höhere Affinität für Fibrin.
Eingehendere Untersuchungen von human-t-PA als potentielles, thrombolytisches Mittel wurden jedoch durch dessen äusserst
niedrige Konzentration in Blut, Gewebeextrakten, Gefässperfusionsprodukten und Zellkulturen behindert.
Man nahm an, dass die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen,
grossen Mengen an qualitativ hochwertigem Plasminogen-Aktivator
vom Humangewebetyp (vorher als Hurnan-Plasminogen-Aktivator bezeichnet), der im wesentlichen frei von
anderem Humanprotein ist, darstellt. Diese Materialien sollten vermutlich biologisch aktiv sein, was ihre klinische
Verwendung bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Zustände oder Krankheiten ermöglichen würde.
Zufriedenstellende Mengen an Human-t-PA werden von Zellkulturen gebildet, wobei jedoch weitere Verfeinerungen unter
Anwendung einer sekundären, kodierenden Sequenz dazu dienen, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre,
kodierende Sequenz umfasst Dihydrofolat-reduktase (DHFR), die durch einen extern gesteuerten Parameter, wie Methotrexat,
beeinflusst wird, wodurch die Steuerung der Expression durch Steuerung der Methotrexat (MTX)-Konzentration ermöglicht
wird.
B. Rekombinante DNA-Technik
Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind
in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur
Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben und Zellkulturen fähig sind. Es
stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Ligation von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven
Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungsfähigen Expressionsvehikeln führen, mit denen spezielle
Organismen transformiert werden können, so dass deren Syn-
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-τ-
theseleistung auf das gewünschte, exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch
recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, dass regelmässige Vorhersagen über oie Er-
5fOlgsaussichten gemacht werden können. Versucht man Erfolge
ohne entsprechende, experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.
Die DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d.h. ein
lOStartpunkt der Replikation,.eine oder mehrere phänotypische
Selektionscharakteristiken, ein Expressionspromotor, heterologes Geninsert und restlicher Vektor, findet im allgemeinen
ausserhalb der Wirtszelle statt. Das erhaltene, rekombinante, replizierbare Expressionsvehikel oder Plasmid
löwerden in die Zellen durch Transformation eingeführt und
grosse Mengen des rekombinanten Vehikels durch Wachstum des Transformanten erhalten. Wird das Gen in Bezug auf die Teile,
die die Transkription und Translation der einkodierten DNA-Botschaft steuern, in geeigneter Weise mit Inserts versehen,
so eignet sich das erhaltene Expressionsvehikel zur tatsächlichen
Bildung der Polypeptidsequenz,für die das eingesetzte Gen
kodiert; ein Vorgang der als Expression bezeichnet wird. Das gebildete Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts
25durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.
In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypep-
30tiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expression
eines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen
ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte,bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen,
homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. (21) und
(22).
.9
In ähnlicher Weise ist die Technik von Zeil- oder Gewebekulturen
für genetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten
Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen von isolierten, normalen Zellen hergestellt werden, stehen
zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden derartige Zelllinien auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium
gehalten oder in Suspension mit einem Gehalt an erhaltenden Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrösserung des HerstellungslOmasstabs
zur Herstellung von grossen Präparatemengen scheint nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein. Zur
Vertiefung wird in diesem Zusammenhang auf die Literaturstellen (23) und (24) verwiesen.
Ebenso stellt die Proteinbiochemie ein wertvolles, ja notwendiges Hilfsmittel in der Biotechnologie dar. Zellen, die
das gewünschte Protein bilden, bilden darüber hinaus noch Hunderte von anderen Proteinen, endogenen Produkten des
Zellstoffwechsels. Diese verunreinigenden Proteine sowie andere Verbindungen können, wenn sie nicht vom gewünschten
Protein abgetrennt werden, bei Verabreichung an Tiere oder Menschen im Verlauf einer therapeutischen Behandlung mit
dem gewünschten Protein toxisch wirken. Hier kommen die Methoden der Proteinbiochemie zum Tragen, die die Bereitstellung
von Trennungsverfahren ermöglichen, die für das spezielle, in Betracht kommende System geeignet sind und zur
Bildung eines für den beabsichtigten Verwendungszweck sicheren, homogenen Produkts führen. Die Proteinbiochemie ermöglicht
auch eine Identifizierung und Charakterisierung dieses Produkts und stellt sicher, dass die gebildeten Zellen
das Produkt ohne Veränderungen oder Mutationen gebildet haben. Dieser Zweig der Wissenschaft befasst sich auch mit der
Ausarbeitung von Bioassays, Stabilitätsuntersuchungen und anderen Verfahren, die durchgeführt werden müssen, bevor
erfolgreiche, klinische Untersuchungen oder eine Markteinführung möglich sind.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass die rekombinante
*9
- 1Q-
DNA-Technik geeignet ist zur Herstellung von Huraangewebe-Plasminogen-Aktivator
(t-PA), vorzugsweise in direkter Form und in Mengen, die ausreichen, Tierversuche und klinische Untersuchungen,
die eine Voraussetzung für eine Marktzulassung sind, zu initiieren und durchzuführen. Das gebildete human
t-PA eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des Menschen bei verschiedenen
kardiovaskulären Zuständen oder Krankheiten. Demzufolge stellt die Verwendung von t-PA und von geeigneten pharmazeutischen
Zusammensetzungen davon bei der Behandlung vaskulärer Störungen beim Menschen einen wichtigen Gesichtspunkt
der Erfindung dar.
Gegenstand der Erfindung ist ferner im wesentlichen reiner Humangewebe-Plasminogen-Aktivator. Das durch genetische Manipulation
von Mikroorganismen oder Zellkulturen gebildete Produkt eröffnet die Möglichkeit, Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
effizienter als bisher herzustellen, wodurch die bisher schwer durchführbare, wirtschaftliche Verwertung
ermöglicht wird. Ferner kann der erfindungsgemässe Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
je nach Art der Wirtszelle im Vergleich zu nativem Material in grösserem oder geringerem
Umfang assozierte Glycosylierung enthalten. Auf jeden Fall
ist das t-PA frei von Verunreinigungen , von denen es nor-25malerweise in nicht-rekombinanter, zellulärer Umgebung begleitet
ist.
Gegenstand der Erfindung sind ferner replizierbare DNA-Expressionsvehikel,
die Gensequenzen beherbergen, welche Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in expressionsfähiger Form
kodieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismenstämme oder Zellkulturen, die mit den vorstehenden
Expressionsvehikeln transformiert sind, sowie Mikroben- oder Zellkulturen von derart transformierten Stämmen oder Kultu-
35ren, die zur Bildung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
in der Lage sind. Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung verschiedene Verfahren zur Herstellung der genannten Gensequenzen,
DNA-Expressionsvehikel, Mikroorganismenstämme
und Zellkulturen. Gegenstand der Erfindung ist schliesslich
auch die Herstellung von Fermentationskulturen dieser Mikroorganismen
und Zellkulturen.
Fig. 1 zeigt 10% SDS PAGE von mit anti t-PA IgG fällbaren
S-markierten Proteinen, extrahiert aus Melanomzellen mit
und ohne Proteaseinhibitor.
Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten Translationsprodukte von aus Melanomzellen abgeleiteten
mRNA-Fraktionen.
Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 mit cDNA trans
32 formierten Kolonien unter Verwendung des Pools von P-mar-
lökiertem 14-mer als Tracer, hergestellt auf der Basis einer
5-Aminosäuresequenz von human t-PA.
Fig. 4 zeigt eine Restriktionsendonucleasekarte von human
t-PA cDNA in voller Länge.
20
Fig. 5a, 5b und 5c zeigen die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von human t-PA cDNA in voller Länge.
Fig. 6 zeigt ein Schema des Aufbaus des Expressionsplasmids 25pARIPA°.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur Bestimmung derfibrinolytischen Aktivität der mit pÄRIPA0
transformierten Zellen.
30
Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden eines Trypsinverdauungsprodukts
von human t-PA.
Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression
von reifem human t-PA in E. coli kodierenden Plasmids.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität von human t-PA,
-JM-
das durch mit pt-PAtrp12 transformiertes E. coli gebildet
ist.
Fig. 11 zeigt den Aufbau von DHFR (Mutante oder Wildtyp)/ 5t-PA, das zur Transformation in Säugetiergewebekulturzellen
geeignete Plasmide kodiert.
Fig. 12 ist ein schematisches Diagramm des Humangewebe-Plasminogen-Aktivators,
der gemäss der hier in E.1 erläuterten Methode hergestellt worden ist.
A. Definitionen
Die Ausdrücke "Humangewebe-Plasminogen-Aktivator" oder "human
t-PA" oder "t-PA" betreffen den durch Mikroorganismenoder Zellkultursysteme gebildeten, exogenen (Gewebetyp)
Plasminogen-Aktivator in bioaktiven Formen, der einen Proteaseteil umfasst und den für Humangewebe nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren
entspricht. Das erfindungsgemäss gebildete Humangewebe-Plasminogen-Aktivatorprotein wurde mittels
eines bestimmten DNA-Gens und der abgeleiteten Aminosäuresequenz definiert. Es ist klar, dass natürliche allele
Variationen vorkommen und von Individuum zu Individuum auftreten. Diese Variationen können sich durch eine oder mehrere
unterschiedliche Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen
oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren dieser Sequenz bemerkbar machen. Ferner hängt die Stellung und das
Ausmass der Glycosylierung von der Natur der Wirtszellenumgebung ab.
Bei der Anwendung rekombinanter DNA-Technik besteht die Möglichkeit
zur Herstellung verschiedener Humangewebe-Plasminogen-Aktivatorderivate,
die in verschiedener Weise durch einfache oder mehrfache Substitution, Deletion, Addition oder
Ersatz von Aminosäuren modifiziert sind, beispielweise durch gezielte Mutagenese der zugrunde liegenden DNA. Umfasst wird
auch die Herstellung von Derivaten, bei denen der wesentli-
ehe "kringle?t-Bereich und der Serinprotease-Bereich, die im
allgemeinen für den hier speziell beschriebenen Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
charakteristisch sind, erhalten sind, die aber ansonsten auf die vorstehend beschriebene Weise
modifiziert sind. Sämtliche derartigen allelen Variationen und Modifikationen, die zu Derivaten von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
führen, fallen unter den Gegenstand der Erfindung, desgleichen auch andere verwandte, exogene (Gewebetyp)
Human-Plasminogen-Aktivatoren, die physikalisch und chemisch ähnlich sind, sofern die wesentliche charakteristische
Aktivität von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in ihrer Art unbeeinträchtigt bleibt.
Es wird Humangewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt, 1)
der Methionin als erste Aminosäure (vorhanden auf Grund der ATG-Startsignalcodoninsertion zu Beginn des Strukturgens)oder
2)der, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär gespalten ist, seine normalerweise erste Aminosäure aufweist oder
3) der zusammen entweder mit seinem Signalpolypeptid oder einem sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidenden,
konjugierten Protein vorliegt, wobei das Signalpolypeptid oder das Konjugat spezifisch in einer intra-oder extrazellulären
Umgebung abspaltbar sind (vgl. Literaturstelle 21), oder 4) der durch direkte Expression in reifer Form
erhältlich ist, ohne dass die Notwendigkeit zur Abspaltung eines nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptids besteht.
Das letztgenannte Produkt ist besonders wichtig, wenn ein bestimmter Wirt nicht oder nicht in ausreichendem
Umfang zur Entfernung eines Signalpeptids in der Lage ist, sofern das Expressionsvehikel so aufgebaut.ist, dass es den
Gewebe-Plasminogen-Aktivator zusammen mit dessen Signalpeptid exprimiert. Auf jeden Fallwird der auf diese Weise gebildete
human t-PA in seinen verschiedenen Formen gewonnen und soweit gereinigt, dass er sich zur Behandlung verschiedener
vaskulärer Zustände oder Krankheiten eignet.
-λ tr
-13-
!Ferner besitzt t-PA Formen,die sowohl das Einzelketten-(I-Kette)-Protein
als auch das 2-Ketten-Protein umfassen. Das letzt genannte Produkt leitet sich proteolytisch von
der 1-Ketten-Verbindung ab. Es wird angenommen, dass das 2-Ketten-Protein
mit dem gebildeten Fibrin assoziiert ist und dass die proteolytische Umwandlung vom 1- in das 2-Ketten-Material
am Ort der Umwandlung vom Plasminogen zu Plasmin erfolgt. Erfindungsgemäss kommt die Verabreichung des 1-Ketten-Proteins
zur vorstehend beschriebenen in vivo-Umwandlung oder die Verabreichung des 2-Ketten-Proteins, das sich
ebenfalls als aktiv erwiesen hat, in Frage. Das 2-Ketten-Protein kann durch in vitro-proteolytische Umwandlung hergestellt
werden, nachdem das 1-Ketten-Material gebildet ist. Ein sogenannter "kringle"-Bereich findet sich oberhalb des
Serinproteasebereichs. Es wird angenommen, dass dieser eine wichtige Funktion bei der Bindung des Gewebe-Plasminogen-Aktivators
an eine Fibrinmatrix spielt. Darauf beruht die beobachtete, spezifische Aktivität des erfindungsgemassen
Gewebe-Plasminogen-Aktivators gegen fühlbare vorhandene Thromben. Der erfindungsgemässe Gewebe-Plasminogen-Aktivator
wird mit einem Gehalt an dem enzymatisch aktiven Bereich gebildet, der dem nativen Material entspricht. Der Ausdruck
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator definiert Produkte, die diesen Bereich allein oder zusammen mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen
bis zur vollen Länge des Moleküls umfassen.
Zusammenfassend lässt sich für die vorliegende Erfindung human t-PA folgendermassen funktionell definieren: Es ist
in der Lage, die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin zu katalysieren, geht eine Bindung mit Fibrin ein und wird auf
Grund der vorstehend dargelegten immunologischen Eigenschaften als t-PA klassifiziert.
Der Ausdruck "in im wesentlichen reiner Form" beschreibt den Zustand von .erfindungsgemäss gebildetem human t-PA, das
frei von Protein oder anderen normalerweise mit human t-PA assoziierten Materialien ist, die bei Bildung durch nichtrekombinante
Zellen, d.h. in der "nativen" Umgebung, ent-
stehen. * 4£,
Der Ausdruck "DHFR-Protein" bezieht sich auf ein Protein,
das die mit Dihydrofolat-reductase (DHFR) assoziierte Aktivität entfaltet und das daher von Zellen gebildet werden
muss, die in einem Medium mit einem Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin (-HGT-Medium) nicht lebensfähig sind.
Im allgemeinen können Zellen mit einem Mangel an DHFR-Protein auf diesem Medium nicht wachsen, während Zellen mit einem
Gehalt an DHFR-Protein dazu in der Lage sind.
Der Ausdruck "gegenüber MTX empfindliche Zellen" betrifft Zellen, die nicht in der Lage sind ,auf Medien, die den DHFR-Inhibitor
Methotrexat (MTX) enthalten, zu wachsen. Bei diesen "gegenüber MTX empfindlichen Zellen" handelt es sich um
solche Zellen, die ohne eine genetische Veränderung oder eine anderweitige Ergänzung nicht in der Lage sind, unter
Bedingungen, die für den Zelltyp in Bezug auf Umgebung und Medium an sich geeignet sind, zu wachsen, wenn die MTX-Konzentration
0,2 yg/ml oder mehr beträgt. Einige Zellen,zum Beispiel
Bakterien, besitzen keine MTX-Empfindlichkeit, was darauf
zurückzuführen ist, dass sie MTX nicht in ihre Zellbegrenzugen gelangen lassen, selbst wenn sie DHFR enthalten, das
ansonsten gegenüber diesem Arzneistoff empfindlich wäre. Im allgemeinen sind Zellen, die als DHFR-Protein Wildtyp-DHFR
enthalten, gegenüber Methotrexat empfindlich, wenn sie in Bezug auf MTX durchlässig oder zu dessen Aufnahme in der
Lage sind.
Der Ausdruck "Wildtyp-DHFR" bezieht sich auf Dihydrofolatreductase,
wie sie üblicherweise in dem speziellen in Frage kommenden Organismus gefunden wird. Wildtyp-DHFR ist im
allgemeinen in vitro empfindlich gegenüber niedrigen Konzentrationen an Methotrexat.
Der Ausdruck "DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität
für MTX" ist funktionell definiert. Es handelt sich um ein DHFR-Protein, das bei Bildung innerhalb von Zellen das Wachs
turn von MTX-empfindlichen Zellen in einem Medium mit einem
Gehalt an 0,2 yg/ml oder mehr MTX ermöglicht. Es ist ersichtlich,
dass eine derartige funktioneile Definition von der Leichtigkeit,mit der der Organismus das "DHFR-Protein mit niedriger
Bindungsaktivität für MTX" bildet sowie vom Protein selbst abhängt. Jedoch sollte im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ein derartiger Ausgleich zwischen diesen beiden Mechanismen keine Schwierigkeiten bereiten. Erfindungsgemäss
wird eine Überlebensfähigkeit bei diesen MTX-Konzentrationen
lOgewährleistet. Es ist belanglos, ob die Fähigkeit hierzu zusätzlich zur vorhandenen Natur des gebildeten DHFR durch
erhöhte Expression beeinflusst wird. Ein geeignetes DHFR-Protein, das dieser Definition entspricht, ist in der US-Anmeldung
459 151 vom 19. Januar 1983 beschrieben.
Der Ausdruck "Expressionsvektor11 umfasst Vektoren, die zur
Expression von hier in Betracht kommenden DNA-Sequenzen in der Lage sind, wobei diese Sequenzen funktionell mit anderen
Sequenzen verknüpft sind, die zur Durchführung von deren Ex-Pression
in der Lage sind. Es wird stillschweigend angenommen, wenn auch nicht immer ausdrücklich erwähnt, dass diese
Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen
DNA replizierbar sein müssen. Ein Mangel an Replikationsfä-
25higkeit würde sie ganz eindeutig unbrauchbar machen. Zusammengefasst
ist der Ausdruck "Expressionsvektor11 funktionell definiert. Jede DNA-Sequenz, die zur Expression eines bestimmten,
hier in Frage kommenden DNA-Codes in der Lage ist, fällt unter diesen Ausdruck, sofern er auf die bestimmte
Sequenz angewandt wird. Im allgemeinen liegen für rekombinante DNA-Techniken geeignete Expressionsvektoren häufig in
Form von "Plasmiden" vor, wobei dieser Ausdruck sich auf kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen bezieht, die in ihrer
Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke "Plasmid"
und "Vektor" wechselweise verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch umfasst die
Erfindung auch solche andere Formen von Expressionsvektoren,
"4"
ldie äquivalente Funktionen erfüllen und die noch aufgefunden
werden.
Der Ausdruck "rekombinante Wirtszellen" betrifft Zellen,die
5mit Vektoren, die durch rekombinante DNA-Techniken aufgebaut sind, transformiert sind. Entsprechend der hier gegebenen
Definition wird t-PA in den auf Grund dieser Transformation erreichten Mengen gebildet und nicht in den geringen Mengen,
die durch den untransformierten Wirt entstehen, die häufig unter der Nachweisgrenze liegen. Durch derartige Zellen
gebildeter t-PA kann auch als "rekombinanter t-PA" bezeichnet werden.
B. Wirtszellkulturen und Vektoren
15
Die hier beschriebenen Vektoren und Methoden eigenen sich zur Anwendung in Wirtszellen innerhalb eines breiten Bereichs
von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen.
Selbstverständlich werden im allgemeinen Prokaryonten zum Klonen von DNA-Sequenzen beim Aufbau der erfindungsgemäss
geeigneten Vektoren bevorzugt. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm 291» (ATCC 31^46) besonders geeignet. Es können
auch andere Mikroorganismenstämme verwendet werden, darun-
25ter die E. coli-Stämme E. coli B und E. coli X1776 (ATCC
31537). Diese Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung und stellen keine Beschränkung dar.
Prokaryonten können ebenfalls zur Expression verwendet werden. Die vorerwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (F", /i~,
prototroph, ATCC 27325), Bazillen, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium
oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies können verwendet werden.
35
Im allgemeinen werden Replikon und Kontrollsequenzen enthaltende Plasmidvektoren, die von mit der Wirtszelle verträglichen
Spezies abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationssteile
sowie markierende Sequenzen, die in der Lage sind ,eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen
zu gewährleisten. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR 322, einem von einer E. coli-Spezies
abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2, (1977), Seite
95) transformiert. pBR 322 enthält
Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erlaubt somit eine leichte Identifizierung von transformierten Zellen.
Das pBR 322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmid muss auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus
zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, oder es muss so modifiziert sein, dass es
diese Promotoren enthält. Diese Promotoren, die sehr häufig beim rekombinanten DNA-Aufbau verwendet werden, umfassen
/tf-Lactamase (Penicilllnase) und Lactose-Promotorsysteme
(Chang et al., Nature, Bd. 275 (1978), S. 615; Itakura et al., Science, Bd. 198 (1977), S. 1056; Goeddel et al.,
Nature, Bd. 281 (1979), S. 5^4) sowie ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem
(Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057; EP-Veröffentlichungsnummer 0 036 776).
Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren wurden auch andere mikrobielle Promotoren aufgefunden und eingesetzt.
Einzelheiten bezüglich der Nukleotidsequenzen dieser Promotoren wurden veröffentlicht ,was es dem Fachmann erlaubt,
sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen (Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (1980), S. 269).
Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben, wie Hefekulturen, verwendet werden. Unter den eukaryontischen
Mikroorganismen wird am häufigsten Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe verwendet, wenngleich auch zahlreiche
andere Stämme verfügbar sind. Für die Expression in Saccharomyces wird im allgemeinen das Plasmid YRp7 (Stinchcomb
et al., Nature, Bd. 282 (1979), S. 39; Kingsman et al.,
lGene, Bd. 7(1979), S. Ill; Tschember et al., Gene, Bd. 10
(1980), S. 157) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm
von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan
öfehlt, zum Beispiel ATCC 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics,
Bd. 85 (1977), S. 12), bereitstellt. Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Charakteristikum für das Hefewirtszellengenora
stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan
lOdar.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2073) oder ande-
15re gly colytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg.,
Bd. 7 (1968), S. 149; Holland et al., Biochemistry, Bd. 17
(1978), S. 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3~phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofructokinase,
Glukose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase,
Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beim Aufbau von
geeigneten Expressionsplasmiden werden die mit diesen Genen assoziierte Terminationssequenzen ebenso in den Expressionsvektor
3' der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz ligiert,
25um für die Polyadenylierung von mRNA und Termination zu sorgen.
Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der
durch die Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkohol-dehydrogenase
2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff Stoffwechsel assoziierte, abbauende Enzyme und die vorer-
wähnten Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme,
die für die Verwertung von Maltose und Lactose verantwortlich sind (Holland a.a.O.). Beliebige Plasmidvektoren mit
einem Gehalt an hefeverträglichen Promotor-Replikationsstartstellen-
und Terminationssequenzen sind geeignet.
Neben Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die
sich von mehrzelligen Organismen ableiten, als Wirte ver-
wendet werden- Im Prinzip sind beliebige, derartige Zellkulturen geeignet, unabhängig davon, ob sie von Wirbeltieren
oder wirbellosen Tieren stammen. Das grösste Interesse besteht jedoch für Wirbeltierzellen. Die Vermehrung von Wir-5beltierzellen
in Kulturen (Gewebekulturen) ist in den letzten Jahren zu einem routinemässigen Verfahren geworden
(Tissue Culture, Academic Press, Herausgeber Kruse und Patterson, 1973). Beispiele für derartige, geeignete Wirtszelllinien
sind VERO- und HeLa-Zellen, Zellinien aus den Ovarien
des Chinesischen Hamsters (CHO) und W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für derartige Zellen
umfassen im allgemeinen (soweit erforderlich) eine Replikationsstartstelle,
einen vor dem zu exprimierenden Gen befindlichen Promotor zusammen mit eventuell erforderlichen
Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleissstellen, eine Polyadenylierungsstelle
und transkriptionale Terminatorsequenzen.
Bei Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen an den Expressionsvektoren häufig durch virales Material bereitgestellt-Beispielsweise
leiten sich üblicherweise Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und sehr häufig von Simian Virus
40 (SV 40) ab. Die frühen und späten Promotoren des SV 40-Virus sind besonders geeignet, da sie beide leicht aus dem
Virus als ein Fragment erhalten werden, das auch die SV 40-virale Replikationsstartstelle enthält (Fiers et al., Nature,
Bd. 273 (1978), S. 113). Kleinere oder grössere SV 40-Fragmente
können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt es ist die etwa 250 bp umfassende Sequenz von der Hind III-Stelle
bis zur BgI I-Stelle, die sich in der viralen Replikationsstartstelle
befindet, vorhanden. Ferner ist es auch möglich und häufig erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequenzen
zu verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt diese Kontrollsequenzen
sind mit den Wirtszellsystemen verträglich.
Eine Replikationsstartstelle kann entweder durch Aufbau des Vektors einer exogenen Startstelle, abgeleitet beispielsweise
von SV 40 oder einer anderen viralen Quelle (zum Bei-
spiel Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen), oder durch den chromosomalen Replikationsraechanismus der Wirtszelle
bereitgestellt werden. Ist der Vektor in das Wirtszellenchromosora
integriert, ist dieses Chromosom häufig ausreichend.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle für die Transfektion durch die erfindungsgemassen Vektoren, die sowohl
t-PA als auch DHFR-Protein kodierende DNA- Sequenzen umfassen, ist es angebracht, den Wirt entsprechend dem Typ des
verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wird Wildtyp-DHFR-Protein verwendet, wählt man vorzugsweise eine Wirtszelle
mit einem Mangel an DHFR, was die Verwendung der DHFR kodierenden Sequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion im
selektiven Medium mit Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin ermöglicht. Eine geeignete Wirtszelle in diesem
Fall ist die Zellinie aus den Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) mit einem Mangel an DHFR-Aktivität. Diese Zelllinie
lässt sich gemäss Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sei. (USA), Bd. 77 (1980), S. 4216 >
herstellen und vermehren.
Wird andererseits DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität
für MTX als Kontrollsequenz verwendet, ist es nicht erforderlich, DHFR-resistente Zellen zu verwenden. Da die
mutante DHFR gegen Methotrexat resistent ist, können Medien mit einem Gehalt an MTX als Selektionsmittel verwendet werden,
vorausgesetzt die Wirtszellen sind selbst gegen Methotrexin empfindlich. Die meisten eukaryontischen Zellen, die
zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen gegenüber Methotrexat empfindlich zu sein. Eine geeignete derartige Zelllinie
ist eine CHO-Linie, CH0-K1 ATCC CCL 61.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli mit dem trp-Promotorsystem und CHO-Zellen als Wirtszellen und von Expressionsvektoren, die die SV 40-Replikationsstartstelle
als Promotor enthalten. Der Fachmann kann jedoch auf Grund seines Fachwissens analoge Techniken anwen
lden, um Expressionsvektoren zur Expression der gewünschten Proteinsequenzen in anderen prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirtszellkulturen aufzubauen.
5C. Angewandte Verfahren
Werden Zellen ohne erhebliche Zellwandbarrieren als Wirtszellen verwendet, wird die Transfektion gemäss dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren
nach Graham und Van der Eb, VilOrology, Bd. 52 (1978), S. 546 durchgeführt. Doch können auch
andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen zum Beispiel durch nukleare Injektion oder durch Protoplastenfusion
angewandt werden.
Werden prokaryontische Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwandkonstruktionen
enthalten, verwendet, so besteht die bevorzugte Transfektionsmethode in der Calciumbehandlung unter
Verwendung von Calciumchlorid gemäss F.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), Bd. 69 (1972), S. 2110.
Beim Aufbau von geeigneten Vektoren mit einem Gehalt an diesen Kodierungs- und Kontrollsequenzen werden übliche Ligationstechniken
angewandt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden zur Bildung der gewünschten Form der erforder-25lichen
Plasmide gespalten, geschnitten und religiert.
Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym (oder Enzymen) in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Im
allgemeinen werden etwa 1 \xg Plasmid oder DNA-Fragmente mit
etwa 1 unit Enzym in etwa 20 μΐ Pufferlösung verwendet.
(Entsprechende Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben.) Inkubationszeiten
von etwa 1 Stunde bei 370C sind geeignet. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol
und Chloroform entfernt..Die Nucleinsäure wird aus der wässrigen
Fraktion durch Fällung mit Äthanol gewonnen.
Sind stumpfe Enden erforderlich, wird das Präparat 15 Minu-
ten bei 150C mit 10 units Polymerase I (Klenow) behandelt,
mit Phenol/Choroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Die Auftrennung der gespaltenen Fragmente nach der Grosse
wird unter Verwendung von 6 prozentigem Polyacrylamidgel gemäss D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980),
S. 4057 durchgeführt.
Zur Ligation werden etwa äquimolare Mengen der gewünschten
Komponenten, die am Ende in geeigneter Weise geschnitten sind, um eine korrekte Übereinstimmung zu gewährleisten,
mit etwa 10 units T4 DNA-Ligase pro 0,5 Mg DNA behandelt. (Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet werden,
kann zur Verhinderung der Religation des gespaltenen Vektors eine Vorbehandlung mit bakterieller, alkalischer
Phosphatase durchgeführt werden.)
Für eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den aufgebauten Plasmiden werden die Ligationsgemische zur
Transformation von E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) verwendet.
Erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls auf Grund von Ampicillinresistenz ausgewählt. Von den Transformanten
werden Plasmide hergestellt, durch Restriktion analysiert und /oder nach dem Verfahren von Messing et al.,
Nucleic Acids Res., Bd. 9 O981), S. 309 oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65
(1980), S. 499 sequenziert.
Die Amplifikation von DHFR-Protein kodierenden Sequenzen
wird durchgeführt, indem man Wirtszellkulturen in Gegenwart von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-Ativität
in Konzentrationen von etwa 20-500 000 nanomolar züchtet. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich
stark von der Art des DHFR-Gens, dem Protein und den Eigenschaften des Wirts ab. Im allgemeinen lassen sich klar
definierte obere und untere Grenzen nicht feststellen. Es können auch geeignete Konzentrationen von anderen Folsäureanalogen
oder anderen Verbindungen, die DHFR hemmen, ver-
wendet werden. MTX selbst ist jedoch besonders zweckmässig, leicht zugänglich und wirksam.
D. Allgemeine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
5
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde auf folgende Weise
erhalten:
1. Humanmelanomzellen, die aktiv Gewebe-Plasminogen-Aktivator
bildeten, wurden bis zur Konfluenz gezüchtet.
2. Zellpellets aus diesen Zellkulturen wurden in Gegenwart von Ribonuclease-Inhibitoren gezüchtet, um die gesamte,
zytoplasmatische RNA zu isolieren.
3. Eine oligo-dT-Säule isolierte die gesamte messenger-RNA
(mRNA) in polyadenylierter Form. Diese mRNA wurde der Grössenfraktionierung unter Anwendung der Säure-Harnstoff-Agarosegel-Elektrophorese
unterzogen.
4. Die GeIfraktion mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischer
RNA wurde auf folgende Weise identifiziert: Die RNA der einzelnen Gelfraktionen wurde
in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat- in vitro- System, ergänzt mit Hundepankreas-Mikrisomen, translatiert. Die
erhaltenen Translationsprodukte wurden dann mit Humangewebe -Plasminogen-Aktivator-spezifisehem IgG-Antikörper
immunopräzipitiert.
5. Die geeignete RNA (21 bis 24S) wurde in die entsprechende einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) übergeführt,
aus der doppelsträngige cDNA gebildet wurde. Nach polydC-Schwänzen
wurde es in einen Vektor eingesetzt, beispielsweise in ein Plasmid, das einen oder mehrere phänotypische
Marker trug.
35
6. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer
geklonten cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Pool von radio-
aktiv markierten, synthetischen Desoxyoligonucleotiden,
die komplementär zu den Kodons für bekannte Aminosäuresequenzen
in t-PA waren, zum Beispiel der Pool von 8 14-meren
5'-dtC(£)CA(£)TA(£)TCCCA-3· (komplementär zu den Sequenzen,
die für die bekannte (vgl. unten) Aminosäuresequenz: Tryptophan-Glutaminsäure-Tyrosin-Cystein-Asparaginsäure
(W-E-Y-C-D) kodieren) wurde hergestellt und zur Markierung der Koloniebibliothek verwendet.
7. Aus den positiven cDNA-Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert
und sequenziert.
8. Die sequenzierte DNA wurde dann in vitro zur Insertion xo
in ein geeignetes Expressionsvehikel, das zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle verwendet wurde, geschnitten.
Die Wirtszelle wurde in einer Kultur gezüchtet, wodurch der gewünschte Humangewebe-Plasminogen-Ak-
tivator gebildet wurde.
20
9. Der auf diese Weise gebildete Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
weist in seinem enzymatischen Serinproteaseteil etwa 251 Aminosäuren auf. Ferner besitzt er ober-
halb davon eine einen "kringle" enthaltende Sequenz, von 25
der zur Zeit angenommen wird, dass sie für die Fibrinbindung verantwortlich ist. Das reife Protein zuzüglich
dessen Signalpräsequenz weist insgesamt 562 Aminosäuren auf.
Das vorstehende Verfahren selbst gewährleistet die erfolgreiche Bildung von reinem t-PA. Erfindungsgemässe Verfahren
unter Anwendung einer zusätzlichen kodierenden, gegenüber Methotrexat empfindlichen Sequenz erlauben die Bildung von
antigenaktivem t-PA-Protein in Wirtszellkulturen in Mengen
35
von mehr als 0,1 pg pro Zelle pro Tag. Bei entsprechender Anwendung von amplifizierenden Bedingungen können Mengen
von mehr als 20 pg erhalten werden. Mit anderen Worten, es
lassen sich Genexpressionsgrade erreichen, die zur Bildung von mehr als 9 x 10~ Plo.ugh-Einheiten oder bei entsprechender
Amplifikation von mehr als 18 χ 10 Plough-Einheiten an
t-PA-Aktivität führen.
5
Gemäss dieser Ausführungsform der Erfindung bedient man sich
des Arzneistoffs Methotrexat, der zwar normalerweise für zur Aufnahme dieses Wirkstoffs fähige Zellen tödlich ist,
der in Gegenwart von kontrollierten Konzentrationen an MTX durch Amplifikation des Gens, das für die DHFR-kodierende
Sequenz kodiert, Zellwachstum ermöglicht (R: T. Schimke et al., Science, Bd.202 (1978), S. 1051; J. L. Biedler et al.,
Cancer Res., Bd. 32 (1972), S. 153; S. E. Chang et al., Cell, Bd. 7 (1976), S. 391).
Diesbezüglich ist der Befund von Bedeutung, dass die Araplifikation
des Gens für DHFR die Amplifikation von assoziierten Sequenzen, die für andere Proteine kodieren, verursachen
kann. Dies erscheint der Fall zu sein, wenn es sich beim assoziierten Protein um Hepatitis B-Oberflächenantigen
(HBsAg) (J. Christman et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd.
(1982), S. 1815), E. coli-Protein XGPRT (G. Ringold et al., J. Molec. and Appl. Gen., Bd. 1 (1981), S. 165) und eine
endogene Sequenz aus einer DHFR/SV 40-Plasmidkombination (R: F. Kaufman et al., J. Molec. Biol., Bd. 159 (1982),
S. 601) handelt.
Andere Mechanismen, durch die eine Methotrexat-Resistenz verliehen werden kann, umfassen die Verminderung der Bindungsaffinität
für das DHFR-Protein, so dass es gegenüber Methotrexat weniger empfindlich wird (W. F. Flintoff et al.,
Somat. Cell Genet., Bd. 2 (1976), S. 245), aber in- diesem Fall Amplifikation ebenfalls stattfindet.
Es scheint, dass die Gene für Wildtyp-DHFR und für DHFR,
die gegenüber MTX resistent ist, auf Grund ihrer eigenen verminderten Bindungskapazität durch die Gegenwart von MTX
amplifiziert werden. Somit wird gemäss dieser AusführungSr-'
form der Erfindung die Einwirkung der DHFR-Sequenzamplifikation
auf assoziierte, proteinkodierende Sequenzen angewendet, um einen Kontrollmechanismus bereitzustellen, der
verstärkte Expressionsgrade von t-PA-Sequenzen in Gegenwart von MTX oder aufgrund einer vorherigen Behandlung von transformierten
Zellen mit MTX erlaubt.
E. Beispiele
Die nachstehenden Beispiel erläutern die Erfindung, stellen aber keine Beschränkung dar. In den Beispielen wurden eine
E. coli-Wirtskultur und eine CHO-Zellinie, die sich für den
Typ der einzuführenden DHFR-proteinkodierenden Sequenz eignet als Wirtszellkultur verwendet. Jedoch eignen sich auch
ander eukaryontische und prokaryontische Zellen für das erfindungsgemässe
Verfahren.
E.1 Expression von human t-PA-Gen in E. coli
E.1.A Beschreibung der Figuren
Fig. 1 ist ein Autoradiogramm eines 10 prozentigen SDS-Acrylamidgels,
das das oder die immunopräzipitierte(n) / S7-Methionin-markierte(n) Protein(e), darstellt, die
aus Humanraelanomzellen in vivo während 3 Stunden sekretiert wurden, und zwar in Gegenwart (Reihe b) oder Abwesenheit
(Reihe a) des Proteaseinhibitors Aprotinin. Nach der Irnmunopräzipitation
mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG wurden drei Banden beobachtet (Reihe a), die Molekulargewichte
von etwa 65 000, 63 000 bzw. 35 000 aufwiesen. In Gegenwart des Proteaseinhibitors wurde jedoch die Spezies
mit einem Molekulargewicht von 35 000 nicht festgestellt. Durch die Immunopräzipitation wurden keine Produkte ausgefällt,
wenn Präimmunserum verwendet wurde (Reihe c). Die Wanderungen und die Molekulargewichte von C-markierten
Proteinstandards sind links von Reihe a wiedergegeben.
Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten Translationsprodukte von aus einem Säure-Harnstoff-Agarose-
Igel isolierten RNA-Fraktionen. Eine Hauptbande wurde in den
Fraktionen 7 und 8 nach Translation in Gegenwart von Hundepankreas-Mikrosomen
unter anschliessender Immunopräzipitation mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator- spezifischem IgG beo-5bachtet.
Diese Bande weist ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton auf. Die Grosse der in den Fraktionen 7 und
wandernden mRNA beträgt etwa 21 bis 24 S. Die Positionen der ribosomalen RNA-Marker, die nach Elektrophorese am RNA-Harnstoff-Gel
bestimmt und durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht wurden, sind über den entsprechenden Gelreihen
angegeben.
Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit
dem 32P-dTC(i)CA(i)TA(£)TCCCA (W-E-Y-C-D)-Marker. 96 indi-GGT
vlduelle Transformanten wurden auf einer Mikrotiterplatte gezüchtet, replikaplattiert und auf einer Nitrocellulosemembran
gezüchtet. Die Kolonien wurden sodann lysiert, die bakterielle DNA fixiert und die Filter mit 32P-i4-mer (W-E-Y-C-D)-Markern
hybridisiert. Die Filter wurden zurEntfernung von nicht-hybridisiertem Marker gewaschen und auf Röntgenfilm
aufgelegt. Das Autoradiogramm stellt die Muster von 48 einzelnen Filtern (4600 unabhängige Kolonien) dar. Ein
Beispiel für einen positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
2&cDNA-Klon auf Filter Nummer 25 ist als E10 (Pfeil) gekennzeichnet
.
Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte der vollen
Länge von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA. Die An-
„Q zahl und die Grosse der durch die Spaltung mit Restriktionsendonuclease
gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophorese an 6 prozentigen Acrylamidgelen bestimmt. Die Positionen
der Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenz (in Fig. 5 wiedergegeben) bestätigt. Der kodierende Bereich des gröss-
g5 ten offenen Leserasters ist durch ein Kästchen gekennzeichnet.
Der schraffierte Bereich stellt die mutmassliche Signalpeptidsequenz dar, während der punktierte Bereich die
mutmassliche Sequenz von reifem Gewebe-Plasminogen-Aktivator
1(527 Aminosäuren) wiedergibt. Das 5'-Ende von mRNA befindet
sich auf der linken Seite und das 3'-Ende auf der rechten Seite.
Die Figuren 5A,5B und 5C erläutern die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Huraangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA
in voller Länge. Die der reifen Sequenz vorhergehenden 35 Aminosäuren (-35 bis -1)sind als ununterbrochene
Sequenz dargestellt. Es wird angenommen, dass diese Sequenz mit 35 Aminosäuren aus einer hydrophilen "pro"-Sequenz
mit etwa 12 bis 15 Aminosäuren, die dem Serin (+1) des reifen Proteins vorausgeht, und einem dieser "pro"-Sequenz
vorausgehenden "herkömmlichen" hydrophoben Signal (sich erstreckend von 5' bis -35) besteht. Dieser Typ von
prä-pro-Struktur an sekretierten Proteinen wurde bereits früher beschrieben, zum Beispiel für Präproalbumin. Gemäss
dieser Theorie beginnen sämtliche sekretierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Moleküle
mit dem Serin (+1) als Aminoende. Eine zweite Theorie besteht darin, dass die hydrophile Sequenz
an der Funktion von Gewebe-Plasminogen-Aktivator auf analoge Weise beteiligt sein kann, wie sie ein bei Plasminogen,
bei dem ein Peptid mit 10 000 Dalton vom aminoterminalen Bereich des nativen Plasminogen ( GIu-Plasminogen, benannt
nach dem aminoterminalen Ende) gespalten werden kann, beobachtet wurde, wodurch ein kleineres Molekül mit einem
neuen Aminoende, bezeichnet als Lys-Plasminogen, erhalten wird. Lys-Plasminogen wird leichter zu Plasmin aktiviert
und hat auch eine grössere Affinität für Fibrin als GIu-Plasminogeh.
Es wurde gezeigt, dass Plasmin die Umwandlung von GIu- in Lys-Plasminogen katalysiert. Diese Art von
Kontrollmechanismuns bewirkt einen "positiven feedback"-Mechanismus.
Die ersten Mengen an gebildetem Plasmin bewirken neben dem Abbau von Fibrin auch eine Bildung von Plasminogenmolekülen,
die leichter aktiviert werden,und gehen auch eine festere Bindung mit ihrem Substrat als natives
Plasminogen ein. Es ergibt sich ein rascherer Abbau von Fibrin. Das hydrophile Peptid des Gewebeplasminogen-Aktivators
könnte an einem ähnlichen Mechanismus beteiligt sein, so
dass dessen Spaltung eine modifizierte Bindung des Enzyms an
Fibrin ergibt. In jedem Fall wird die 35-Aminosäuresequenz als Präsequenz für das reife Protein angesehen.
Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm des Aufbaus eines Gewebeplasminogen-Aktivators-Expressionsplasmids pÄRlPA0.
Das Ausgangsplasmid pPA25E1O wurde zunächst mit Pstl verdaut,
um ein 376 bp-Fragment zu isolieren, das sodann gemäss den Angaben dieser Figur verdaut wurde.
10
Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität des über pÄRIPA0
in transformierten Zellen erhaltenen Expressionsprodukts.
Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden aus einem Trypsin-Verdauungsprodukt
von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Absorption bei 210 nm). Der Pfeil identifiziert den Peak, der
dem Peptid entspricht, das zur Bezeichnung des bei der Koloniebibliothek verwendeten Nucleotid-Markers verwendet wurde.
Das diesem Peak entsprechende .Peptid wies folgende vollständige
Sequenz auf: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Die
anderen Hauptpeaks wurden in ähnlicher Weise sequenziert und führten zu einer Bestätigung der korrekten Aminosäuresequenz
von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator. Zur Bezeich-
25nung der Aminosäuren in den Peptiden wurden folgende, einbuchstabige
Symbole verwendet:
Asp |
D |
Asparaginsäure |
He |
I |
Isoleucin |
Thr |
T |
Threonin |
Leu |
L |
Leucin |
30 Ser |
S |
Serin |
Tyr |
y |
Tyrosin |
GIu |
E |
Glutaminsäure |
Phe |
F |
Phenylalanin |
Pro |
P |
Prolin |
His |
H |
Histidin |
GIy |
G |
Glycin |
Lys |
K |
Lysin |
AIa |
A |
Alanin |
Arg |
R |
Arginin |
35 Cys |
C |
Cystein |
Tr ρ |
W |
Tryptophan |
VaI |
V |
Valin |
GIn |
Q |
Glutamin |
Met |
M |
Methionin |
Asn |
N |
Asparagin |
Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression
von reifem Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in E. coli kodierenden
Plasmids. 50 Mg Plasmid pPA17 wurden mit Sau3AI,
HincII und Hhal verdaut und der Elektrophorese an 6 prozentigern Polyacrylaraidel unterworfen. Etwa 0,5 Mg des 55 bp
Sau3AI-HhaI-Fragraents wurden gewonnen. In ähnlicher Weise wurden etwa 3 Mg des 263 bp Hhal-Narl-Fragments aus 80 Mg
des Ions pPA25E10 gereinigt, indem zunächst ein 300 bp Pstl-Narl-Fragment isoliert und dieses Fragment mit Hhal
verdaut wurde. Sämtliche Verdauungsvorgänge wurden 1 Stunde bei 370C durchgeführt. Die Reaktionsprokukte wurden aufgetrennt
und der Elektroelution an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucleotide
5' dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) und 51 GATCACTTGATAAGACATG
15(11) wurden nach der Festphasen-phosphotriester-Methode
(51) synthetisiert. 100 pMol des Oligonucleotids II wurden in einem 30 Ml fassenden Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an
60 millimolar Tris (ph-Wert 8), 10 millimolar MgCl2, 15 millimolar
y^-Mercaptoäthanol und 50 uCi / P7ATP (Amersham
1
5000 Ci mMol"1) phosphoryliert. 12 units T4-Polynucleotidkinase
wurden zugesetzt. Die Umsetzung wurde 15 Minuten bei 370C durchgeführt. 1 μΐ 10 millimolar ATP und 12 units T4-Kinase
wurden sodann zugesetzt und die Umsetztung wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Nach Phenol/CHCl^-Extraktion
25wurden das phosphorylierte Oligomer II und das 5'-Hydroxyloligomer
I mit o,5 Mg des eluierten 55 bp Sau3AI-HhaI-Fragments
und 2 Mg des 263 bp Hhal-Narl-Fragments vereinigt und mit Äthanol gefällt. Diese Fragmente wurden 4 Stunden bei
Raumtemperatur in 60 μΐ 20 millimolar Tris-HCl (ph-Wert 7,5),
10 millimolar MgCl2, 10 millimolar Dithiothreit, 0,5 millimolar
ATP und 1000 units T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit 48 units Narl, 20 units EcoRI und
40 units BgIII (zur Beseitigung der Polymerisation durch
Ligation von kohäsiven Sau3AI-Enden) verdaut und der Elektrophorese
an 6 prozentigem Gel unterworfen. Das 338 bp-Produkt (etwa 0,1 Mg) wurde durch Elektroelution gewonnen.
Der Rest der t-PA-kodierenden Sequenzen (Aminosäuren 111 bis 528) wurden an einem 1645 bp-Fragment durch Verdauen des
Plasmids pPA25E10 mit Narl und BgIII isoliert. Das Plasmid
pLeIFAtrp103 ist ein Derivat des Plasmids pLeIFA25 (52), bei dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF Α-Gen entfernt
worden ist (53). 3 Ug pLeIFAtrp103 wurden mit 20 units EcoRI
und 20 units BgIII 90 Minuten bei 370C verdaut, der Elektrophorese
an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das grosse Vektorfragment ( 4200 bp) wurde durch Elektroelution
gewonnen. Für den endgültigen Aufbau wurden 80 ng EcoRI-BgIII
pLeIFAtrp103 mit 100 ng des 1645 bp-Narl-Bglll-Frag-
lOrnents und 20 ng des 338 bp-EcoRI-Narl-Fragments 10 Stunden
bei Raumtemperatur verknüpft. Dieses Verknüpfungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet.
Plasmid-DNA wurde aus 38 dieser Transformanten hergestellt
mit EcoRI verdaut. 10 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 600 bp- und 472 bp-EcoRI-Fragmente. Die DNA-Sequenzanalyse
bestätigte, dass eines dieser Plasmide (pt-PAtrp12) die gewünschte Nucleotidsequenz an den Verbindungen
zwischen trp-Promotor, synthetischer DNA und cDNA
aufwies.
Fig. 10 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung
der fibrinolytischen Aktivität des erfindungsgemässen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Expressionsprodukts. Eine
über Nacht gezüchtete Kultur von E. coli W3110/pt-PAtrp12 in Luria-Brühe mit einem Gehalt an 5 Mg ml" Tetracyclin
wurde 1:100 in M9-Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und 0,5 yg ml"" Tetracyclin verdünnt. Die Zellen wurden bei 370C bis zu einem
Aj-j-Q -Wert von 0,2 gezüchtet. Indolacrylsäure wurde in einer
Endkonzentration von 20 Mg/ml zugesetzt. Die Proben wurden
8 1 bei einem A550-Wert von 0,5 bis 0,6 (~2 χ 10 Zellen ml )
durch Zentrifugation gewonnen und sofort eingefroren. Die Zellpellets wurden in 6m Guanidin-hydrochlorid in einer
Konzentration von 5 χ 10 Zellen /ml suspendiert, 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt, 30 Minuten bei 240C inkubiert
und sodann 4 Stunden gegen 25 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 250 millimolar NaCl, 0,25 millimolar
EDTA und 0,01 Prozent Tween 80 dialysiert. Nach der
Dialyse wurden die Proben 2 Minuten bei 13 000 g zentrifugiert und 10 μΐ der überstände wurden jeweils auf ihre Aktivität
an Qewebe-Plasrainogen-Aktivator analysiert. Geraäss dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87) wurde die
Platte 3,5 Stunden-bei 370C inkubiert, und die Lysiszonen
wurden gemessen. Ein quantitativer Befund wurde durch Vergleich mit Verdünnungen einer Lösung von gereinigtem MeIanomgewebe-Plasminogen-Aktivator
erhalten.
1OE.1.B Quelle für Gewebe-Plasmlnogen-Aktivator-mRNA
Es wurden Humanmelanomzellen (Bowes) verwendet. Die Melanomzellen wurden bis zur Bildung von konfluenten Monolayers
in 100 ml Earles-Minimal-Essentiell-Medien, die mit Natriumhydrogenearbonat
(0,12 Prozent Endkonzentration), 2 millimolar Glutamin und 10 Prozent wärmeinaktiviertes, fötales
Kälberserura ergänzt waren, gezüchtet-. Zur Bestätigung, dass
die Melanomzellen in Bezug auf die Bildung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
aktiv waren, wurden die Humanmelanomzellen bis zur Konfluenz in einer 24 Vertiefungen aufweisenden
Mikrotiterplatte entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,33 mikromolar Protease-Inhibitor Aprotinin gezüchtet.
Die Zellen wurden einmal mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 0,3 ml serumfreiem, methioninfreiem Medium
25versetzt. 75 yCi / S7-Methionin wurden zugesetzt. Die Zellen
wurden 3 Stunden bei 370C markiert. Nach der dreistündigen
Markierungsdauer wurden die Medien von den Zellen abgetrennt und zur Immunopräzipitation entweder mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem
IgG oder Präimmunserum behandelt (51O. Die immunopräzipitierten Prudukte wurden
der Elektrophorese an einem 10 prozentigen SDS-Acrylamidgel
unterworfen. Das Scheibengel wurde fixiert, getrocknet und der Fluorigraphie unterworfen.
E.1.C.Isolierung und Grössenfraktionlerung von MessengermRNA
Die gesamte RNA aus Melanomzellkulturen wurde im wesentli-
chen nach dem Verfahren von Ward et al. (55) extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann
in 10 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert
7,5, 1,5 millimolar MgCl2 resuspendiert. Die Zellen wurden
durch Zugabe von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der die
gesamte RNA enthaltende Überstand wurde durch mehrfache Phenol- und Chloroform-Extraktionen weiter gereinigt.Die
wässrige Phase wurde auf eine NaCl-Konzentration von 0,2 m
lOgebracht. Anschliessend wurde die gesamte RNA durch Zugabe
von 2.Volumina Äthanol ausgefällt. Zur Reinigung von mRNA
aus den Gesamt-RNA-Präparaten wurde die oligo-dT-Cellulosechromatographie
angewandt (51). Typische Ausbeuten aus 10 g gezüchteten Melanomzellen betrugen 5 bis 10 mg Gesamt-RNA
und 50 bis 200 Mg Poly(A)+-mRNA.
Die Fraktionierung von PolyA+-mRNA (200 pg) (56) wurde durch
Elektrophorese an Harnstoff-Agarosegelen durchgeführt. Das
Scheibenagarosegel (57, 58) bestand aus 1,75 Prozent Agarose,0,025
m Natriumeitrat, pH-Wert 3,8 und 6 m Harnstoff. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 mA und 40C durchgeführt. Das Gel wurde sodann mit einer Rasierklinge fraktioniert.
Die einzelnen Scheiben wurden bei 700C geschmolzen und zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extra-
25hiert. Die Fraktionen wurden sodann mit Äthanol gefällt und
anschliessend durch in vitro-Translation in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System,
Bethesda Research Lab. (59, 60), ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen folgendermassen getestet:
Translationen wurden unter Verwendung von 25 pCi an / J S/-Methionin und 500 ng der einzelen Gelscheiben-RNA
in einem Endvolumen von 30 μΐ mit einem Gehalt an 25 millimolar
HEPES, 48,3 millimolar KCl, 10 millimolar Kreatinphosphat, Aminosäuren jeweils 50 millimolar, 1,1 millimolar Magnesiumchlorid,
16,6 millimolar EDTA, 0,16 millimolar Dithiothreit, 8,3 millimolar
Hämin, 16,6 pg/ml Kreatin-kinase, 0,33 millimolar Calciumchlorid, 0,66 millimolar EGTA, 23,3 millimolar Natriumchlorid
durchgeführt.
Die Inkubationen wurden 90 Minuten bei 3O0C durchgeführt.
Hundepankreas-Mikrosomenmembranen, die aus rohen Mikrosomen
unter Verwendung von EDTA zur Entfernung der Ribosomen
hergestellt waren (61), wurden gemäss (62) mit Nuclease behandelt.
Sie lagen im Translationsgemisch in einer Endkonzen tration von 7Apg0 units/ml vor. Die Translationsprodukte
oder immunopräzipitierten Translationsprodukte wurden durch Elektrophorese an 10 prozentigen Polacrylamidgelen gema'ss den
nachstehenden Angaben inNatriumdodecylsulfat analysiert (63). Die ungefärbten Plattengele wurden fixiert, getrocknet und
der Fluorigraphie unterworfen
Die erhaltenen Translationsprodukte aus den einzelnen Gelfraktionen
wurden mit Kaninchen-anti-Humangewebe-Plasmino-
15gen-Aktivator-spezifischem IgG immunopräzipitiert. Eine
immunopräzipitierte Polypeptidhauptbande wurde bei der Translation der RNA-Fraktionsnummern 7 und 8 (Wanderung von
21 bis 24 S) mit einem Molekulargewicht von etwa 63 000 DaI-ton beobachtet. Diese Bande wurde nicht beobachtet, wenn
Präimmun-IgG zur Immunopräzipitation verwendet wurde, was darauf schliessen liess, dass diese Polypeptide für Gewebe-Plasminogen-Aktivator
spezifisch waren.
E.1.D Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt
an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
5 Mg gelfraktionierte mRNA (Gelscheibe 7 mRNA) wurden zur
Herstellung von doppelsträngiger cDNA nach üblichen Verfahren (52,65,66) verwendet. Die cDNA wurde an 6 prozentigem
Polyacrylamidgel der Grössenfraktionierung unterworfen. cDNA
mit mehr als 350 bp Länge (125 ng) wurde der Elektroelution unterzogen. 30 ng cDNA wurden mit desoxy(C)-Resten unter
Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-transferase
(67) erweitert und mit 300 ng Plasmid-pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten an der Pst I-Stelle geschnitten
war (67) ,verschweisst. Das verschweisste Geraisch
wurde sodann in E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) transformiert.
Es wurden etwa 4600 Transformanten erhalten.
E.1.E Herstellung eines DNA-Markers
Gereinigter Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde gemäss
dem Verfahren der Literaturstellen 19 und 20 erhalten. 5
Das Molekül wurde zur Feststellung der Bereiche, die sich am besten zur Herstellung von synthetischen Markern eigneten,
auf folgende Weise zerlegt:
Um die Proteine gegenüber einer Verdauung durch Trypsin empfindlich zu machen, wurden sie reduziert und carboxymethyliert.
Eine 2 pg-Probe an Gewebe-Plasminogen-Aktivator wurde zunächst über Nacht bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prosent
Tween 80 dialysiert. Das lyophilisierte Protein wurde sodann in 12 ml 0,56 m Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,6) mit
einem Gehalt an 8 m Harnstoff und 5 millimolar EDTA gelöst. Die Disulfidbindungen wurden durch Zugabe von 0,1 ml ß-Mercaptoäthanol
reduziert. Diese Reaktion wurde 2 Stunden bei 450C unter Stickstoff durchgeführt. Die reduzierten Disulfide
wurden sodann durch Zugabe von 1,0 ml 1,*» m Jodessigsäure
in 1 m NaOH zum Carboxymethylderivat alkyliert. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Umsetzung durch 18-stündige
Dialyse bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent Tween 80 gestoppt. Sodann dann wurde lyophilisiert.
Das erhaltene, ,lyophilisierte, carboxymethylierte Protein
wurde in 3 ml 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) gelöst. Trypsin (TPCK) wurde ineinem Verhältnis von 1:50 zugesetzt.
Die Verdauung wurde bei 370C durchgeführt. Nach 3, 6 bzw. 12 Stunden wurden jeweils Aliquotanteile (0,1 ml)
entnommen. Eine zweite Trypsinzugabe erfolgte nach 12 Stunden.
Nach 24 Stunden wurde die Umsetzung durch Einfrieren gestoppt.
Sie wurde bis zur Injektion in die HPLC-Vorrichtung in gefrorenem Zustand gehalten. Der Verdauungsblauf wurde
durch SDS-GeIe der Aliquotanteile ermittelt. Sämtliche Gele waren leer mit Ausnahme einer schwachen Bande am 3-Stunden-Aliquotanteil.
Dies zeigt, dass das 24 Stunden-Verdauungsprodukt vollständig war und keine grossen Peptide enthielt.
Eine Probe (etwa 0,5 ml) wurde in eine hochauflösende Altex
C-8-Ultrasphere 5 μ-Säule mit zwei Durchläufen injiziert.
Ein Acetonitrilgradient (1 bis 5 Prozent in 5 Minuten, 5 bis 35 Prozent in 100 Minuten, 35 bis 50 Prozent in 30 Minuten)
5wurde angewandt. In einer der beiden präparativen Durchläufe wurde das eluierte Produkt bei zwei Wellenlängen ( 210 und
280 nm) überprüft. Das Verhältnis der Absorptionen bei den beiden Wellenlängen wurde als Mass für den Tryptophangehalt
der Peptide herangezogen.
Die Peptidpeaks, bei denen ein Tryptophangehalt am wahrscheinlichsten
war, oder solche Peaks, die aus anderen Gründen als geeignet erschienen wurden ,zuerst sequenziert. Dies
ermöglichte die Bestimmung der Sequenz um die meisten der Tryptophanreste. Nach Sequenzieren von etwa 25 der bestgeeigneten
Peptidpeaks wurden sämtliche zusammenpassenden Sequenzdaten zu einem vorläufigen Modell der Primärstruktur
von Gewebe-Plasminogen-Aktivator vereinigt. Aus diesen Daten und dem Modell konnten mehrere mögliche Tracer festgestellt
werden.
E.1.F Identifikation von Bakterienklonen mit einem Gehalt
an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA-Sequenzen
25Die Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten
mit einem Gehalt an LB (93) + 5 ug/ml Tetracyclin
gebracht und nach Zugabe von DMSO auf eine Konzentration von 7 Prozent bei -2O0C gelagert. Zwei Kopien der Koloniebibliothek
wurden auf Nitrocellulosefiltern gezüchtet. Die DNA einer jeden Kolonie wurde gemäss dem Grunstein-Hogness-Verfahren
(69) am Filter fixiert.
Der 32P-raarkierte TC(^)CA(^)TA(S)TCCCA-Tracer wurde gemäss
den vorstehenden Ausführungen aus dem synthetischen Oligo-35meren
(W-E-Y-C-D) 14-mer-Pool hergestellt. Filter mit einem
Gehalt an 4600 Transformanten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 50 millimolar Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8
5x SSC (80), 150 yg/ml mit Ultraschall behandeltes Lachs-
sperma-DNA, 5x Denhardt-Lösung (85), 10 Prozent Formamid
prähybridisiert und anschliessend mit 5Ox 10 cpm des markierten Tracers in der gleichen Lösung hybridisiert. Nach
Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 30 Minuten in 6x SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal in 2x SSC gewaschen und sodann
16 Stunden auf Kodak XR-5-RÖntgenfilm unter Verwendung von
Dupont Lightning Plus-Verstärkungsfiltern gelegt.
Plasmid-DNA wurde aus sämtlichen Kolonien nach einem
Schnellverfahren (71) isoliert, wobei sich eine positive Hybridisierungsreaktion ergab. Die cDNA-Inserts aus diesen
Klonen wurden sodann nach Subklonierung von Fragmenten in den M13-Vektor mp 7 (73). und nach dem chemischen Verfahren
gemäss Maxara Gilbert (74) sequenziert. Fig. 3 zeigt, dass
Filter Nummer 25 das Hybridisierungsmuster eines positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klons aufweist. Das cDNA-Insert
im Klon 25E10 erwies sich als DNA-kodierend für Gewebe-Plasminogen-Aktivator,
was durch einen Vergleich von dessen Aminosäuresequenzen der Peptidsequenz (vgl. oben) von ge-
20r"einigtem Gewebe-Plasminogen-Aktivator und durch dessen in
E. coli gemäss den vorstehenden, näheren Angaben gebildeten Expressionsprodukt gezeigt wurde. Der Klon 25E10 war 2304
Basenpaare lang, wobei der längste, offene Ableseraster ein Protein von 508 Aminosäuren (Molekulargewicht 56 756) kodier-
25te und einen 772 bp-3'-nicht-translatierten Bereich enthielt. Diesem cDNA-Klon fehlten die N-terminalen, kodierenden Sequenzen.
E. 1n. G Direkte Expression von Humangewebe-Plasminogen- Aktivator-Klon in E. coli
Bezugnehmend auf Fig. 6 wurden 50 \xg pPA25E10 (vgl. oben)
mit Pstl verdaut. Das 376 bp-Fragment wurde durch Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etwa
3 Mg dieses Fragments wurden durch Elektroelution aus dem
Gel isoliert, mit 30 units Dde I 1 Stunde bei 370C verdaut,
mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Die erhaltenen Dde I-kohäsiven Enden wurden durch
Zusatz von 5 units DNA-Polyraerase I (Klenow-Fragment) und
jeweils 0,1 millimolar dATP, dCTP, dGTP, dTTP zum Reaktionsgemisch und 8-stündige Inkubation bei 40C zu stumpfen Enden
erweitert.Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform wurde
die DNA 2 Stunden mit 15 units Nar I verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacryiamidgel
unterworfen. Etwa 0,5 Mg des gewünschten 125 bpstumpfendigen
Nar I-Fragments wurden gewonnen. Dieses Fragment kodiert für die Aminosäuren Nummer 69 bis 110 von reifern
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Protein voller Länge.
Zur Isolation des 1645 bp-Nar I - BgI II-Fragments wurden
30 \ig pPa25E10 mit 30 units Nar I und 35 units BgI II
2 Stunden bei 370C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der
Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Etwa 6 \xg des gewünschten 1645 bp-Nar I - BgI II-Fragments
wurden gewonnen.
Das Plasmid PARISRC ist ein Derivat des Plasmids
2OpSRCexi6 (79), bei dem die Eco RI-Stellen proximal zum trp-Promotor
und distal zum SRC-Gen durch Reparatur mit DNA-Polymerase I (28) entfernt waren. Das selbst-komplementäre
Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (hergestellt nach dem Phosphortriester-Verfahren (75)) wurde in die verbleibende
Eco RI-Stelle unmittelbar neben der Xba I-Stelle eingesetzt.
20 \xg pARISRC wurden vollständig mit Eco RI verdaut,
mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das Plasmid wurde sodann mit 100 units Nuclease
SI 30 Minuten bei 160C in 25 millimolar Natriumacetat (pH-Wert
4,6) mit einem Gehalt an 1 millimolar ZnCl2 und 0,3 ra
NaCl verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz ATG zu schaffen. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform und nach
Äthanolfällung wurde die DNA mit Bam HI verdaut, der Elektrophorese
an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfenf
und das grosse Vektorfragment (4300 bp) wurde durch Elektroelution gewonnen.
Das Expressionsplasmid wurde durch 7-stündige Ligation bei Raumtemperatur von 0,2 yig Vektor, 0,06 \ig des 125 bp-sturapfendigen
Nar I-Fragments und 0,6 \xg des 161IS bp-Nar I BgI
II-Fragments mit 10 units T^-DNA-Ligase aufgebaut. Die-
ses wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 (ATCC
31446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Plasmid-DNA wurde aus 26 der Kolonien hergestellt und mit
Xba I und Eco RI verdaut. 12 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 415 bp Xba I-Eco RI- und 472 bp-Eco RI-Fragmente.
Die Analyse der DNA-Sequenz ergab, dass einige dieser Plasmide ein ATG-Initiationscodon aufwiesen, das korrekt
am Start der Aminosäure Nummer 69 (Serin) plaziert war. Eines dieser Plasmide, p-RIPA0, wurde untersucht. Es ergab
den gewünschten Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Fig. 7).
E.1.H Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA von voller Länge
a·) Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an
N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
0,4 yg des synthetischen Oligonucleotids
5f-TTCTGAGCACAGGGCG-S' wurden zum "Primen" von 7,5 Mg
Gelfraktion Nummer 8 mRNA (vgl. oben) verwendet, um nach üblichen Verfahren (65, 66) doppelsträngige cDNA
herzustellen. Die cDNA wurde der Grössenfraktionierung an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Eine
Fraktion von mehr als 300 bp (36 ng) wurde der Elektroelution unterworfen. 5 ng cDNA wurden mit desoxy(C)-Resten
unter Verwendung von terminaler Desoxycytidyltransferase (67) erweitert und mit 50 ng des Plasmids
pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten an der Pst I-Stelle geschnitten war (67), verschweisst.
Das verschweisste Gemisch wurde sodann in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Es wurden etwa 1500 Transformanten
erhalten.
Ib.) Southern-Hybrisierung von Humangenom-DNA
Da die cDNA-Primer-Reaktion unter Verwendung eines synthetischen
Fragments, das 13 bp vom N-Ende des Klons pPA25E10 hybridisierte, durchgeführt worden war, stand
in diesem 29 bp-Bereich (der die 16-mer Sequenz umfasst) kein geeignetes Restriktionsfragment zum Screening der
cDNA-Klone zur Verfügung. Daher war es erforderlich,ein
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Genom-Klon zu isolieren,
um alle Primer-erweiterten cDNA-Klone mit einem Gehalt an N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivatorkodierenden
Sequenzen zu identifizieren.
Bei der ersten Stufe dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass in Humangenom-DNA nur ein einziges, homologes Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen
vorhanden ist. Um dies festzustellen, wurde eine Southern-Hybridisierung durchgeführt.
Bei diesem Verfahren (77) wurden 5 Mg hochmolekulare Humanlymphocyten-DNA (hergestellt gemäss 80)
vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut, der Elektrophorese an 1,0 prozentigen Agarosegelen
unterworfen (81) und auf ein Nitrocellulosefilter geblottet (77). Ein ^2P-markierter DNA-Tracer wurde aus
dem 5f-Ende des cDNA-Iserts des cDNA-Klons pPA25E1O
( ein 230 bp-Hpa II -RSA I-Fragment) hergestellt (76) und mit dem Nitrocellulosefilter hybridisiert (82).
35 χ 10 cpm des Tracers wurden 40 Stunden hybridisiert
und sodann gemäss (82) gewaschen. Zwei Endonuclease-Verdauungsmuster
zeigen nur ein einziges, hybridisierendes DNA-Fragment: BgI II (5,7 Kbp) und Pvu II (4,2 kbp)
Zwei hybridisierende DNA-Fragmente wurden mit Hinc II (5,1 Kbp und 4,3 Kbp) beobachtet. Zusammen lassen diese
Daten den Schluss zu, dass im Humangenom nur ein einziges Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist und
dass dieses Gen mindestens eine Zwischensequenz (intervening sequence) enthält.
c·) Screening der Human- X -Phagenbibliothek auf Plasminogen-Aktivator-Gene
Die zur Identifizierung der ^-Phagenrekombinanten,die die
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gene tragen, angewandte Strategie bestand
im Nachweis der Nucleotidhomologie mit einem aus dem Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klon
pPA25E10 hergestellten, radioaktiven Tracers«1 Million rekombinante Λ-Phagen
wurden in einer Dichte von 10 000 pfu/15 cm Platte auf DP 50 Sup F ausgestrichen. Nitrocellulosefilter-Replikaplattierungen
wurden von jeder Platte gemäss dem Verfahren von Benton und Davis (78) hergestellt. Eine
•3p
P-markierte DNA-Probe wurde nach üblichen Verfahren
(83) aus einem 230 bp-Hpa II - Rsa I-Fragment, das sich
■ in einer Entfernung von 34 bp vom 5'-Ende des Klons
p25E10 befand, hergestellt. Jeder Nitrocellulosefilter wurde bei 420C zwei Stunden in 50 millimolar Natriumphosphat
(pH-Wert 6,5), 5x SSC (77), 0,05 mg/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA, 5x Denhardt-Lösung
(84), 50 Prozent Formamid prähybridisiert und sodann mit 50 χ 10 cpm der markierten Probe in der gleichen
Lösung mit einem Gehalt an 10 Prozent Natriumdextransulfat hybridisiert (85). Nach Inkubation über Nacht
bei 420C wurden die Filter viermal bei 5O0C 30 Minuten
in 0,2x SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal bei Raumtemperatur in 2x SSC gewaschen und sodann über Nacht auf Kodak
XR-5-Röntgenfilme unter Verwendung von Dupont-Cronex-Verstärkungsfiltern
aufgelegt. Insgesamt wurden 19 mit dem Tracer hybridisierte Klone erhalten. Phagen-DNA
wurde gemäss den vorstehenden Angaben (86) aus 6 Rekombinanten hergestellt. Der /L-Klon C wurde zur Herstellung
eines Pvu II-Fragments zum Kolonienscreening verwendet. 30 Mg DNA wurden 1 Stunde bei 370C mit Pvu II
verdaut und der Elektrophorese an 1,0 prozentigem Agarosegel unterworfen. Ein 4,2 Kbp-Fragment, in dem vorher
der Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen nachgewiesen worden war, wurde der Elektroelution
op
unterworfen und gereinigt. Ein J P-markierter Tracer
wurde nach üblichen Verfahren (83) für Kolonienhybridisierungen geraäss den vorstehenden Angaben hergestellt.
d·) Screening der Kcloniebibliothek für 5 ' -Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
Die Kolonien wurden von Platten übertragen und auf Witrocellulosefiltern
gezüchtet. Die DNA der einzelnen Kolonien wurden am Filter gemäss dem Verfahren von Grunstein-Hogness
(69) fixiert. Ein P-markierter Tracer wurde durch Kalbsthymus-Primen (83) eines 4,2 kbp-Pvu II-Fragments
aus einem isolierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-A-Genomklon
hergestellt. Filter mit einem Gehalt an 1500 Transformanten wurden mit 112 χ 10 cpm des ^ P-Genom-Pvu
II-Fragments hybridisiert.
Die Hybridisierung wurde 16 Stunden unter den Bedingunger gemäss Fritsch et al. (82) durchgeführt. Die Filter
wurden gründlich gewaschen und sodann 16 bis 48 Stunden
auf Kodak XR-5-RöntgenfUrne unter Verwendung von Dupont-Lightning-Plus-Verstärkungsfiltern
aufgelegt. 18 Kolonien hybridisierten klar mit der Genomprobe. Plasmid-DNA
wurde aus jeder dieser Kolonien isoliert, an Nitrocellulosefilter gebunden und mit den für die ursprüngliche
op
Primer-Reaktion verwendeten P-markierten, synthetischen
Oligonucleotid (16-mer) hybridisiert. Von den 18 Klonen hybridisierten 7 mit dem der Kinasebehandlung unterworfenen
16-mer. Bei der Sequenzanalyse nach Subklonierung der Fragmente in den m13-Vektor mp (73) ergab sich für
einen Klon (pPA17), dass er den korrekten 5'-N-terminalen
Bereich von Gewebe-Plasminogen-Aktivator, eine Signalleitsequenz
(signal leader sequence) und einen 8H bp-5'-nicht-translatierten bereich enthielt. Aus den
beiden Klonen pPA25E10 und pPA17 wurde die vollständige Nucleotidsequenz gemäss Fig. 5 und das Restriktionsmuster
(Fig. H) von Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klon von
voller Länge bestimmt.
Beim nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Molekül besteht
die Möglichkeit zur Stabilisierung durch 17 Disulfidbrücken, basierend auf der Homologie mit anderen
Serinproteasen. Es gibt vier potentielle N-Glykosylierungsstellen,
drei in den "kringle"-Bereichen bei asn117,
asn^j., asn21ß und eine potentielle Stelle im gleichen
Kettenbereich bei asn^g. Variationen in der Struktur
der Oligos.accharid-Liganden können für die unterschiedlichen molekularen Formen (mit Molgewichten von 65
bzw. 63 000) verantwortlich sein.
E.1.1 Direkte Expression von Gewebe-Plasminogen-AktivatorcDNA-Klon voller Länge in E. coli
Eine Rekonstruktion der gesamten kodierenden Sequenz war unter Verwendung der gemeinsamen Hha I-Restriktionsendonuclease-Stelle,
die beide partiellen Klone pPA17 und pPA25E10 gemeinsam besitzten, möglich. Ein 55 bp-Sau3AI-Hhal-Restriktionsfragment,
das den Aminosäuren 5-23 ent-
20sprach, wurde aus dem Plasmid pPA17 isoliert. Die Sau3AI-Restriktionsstelle
befand sich am Kodon 4 der angenommenen reifen, kodierenden Sequenz und wurde zur Entfernung des das.
Signalpeptid kodierenden Bereichs verwendet. Ein 263 bp-Hhal
- Narl-Fragment (kodierend für die Aminosäuren 24-1 TO)
25wurde ebenfalls aus dem Plasmid pPA25E10 isoliert. Zwei synthetische Desoxyoligonucleotide wurden hergestellt, die
dieKodons für die Aminosäuren 1-4 wiederherstellen, ein ATG-translationales Initiationskodon einverleiben und ein Eco
RI-kohäsives Ende schaffen. Diese drei Fragmente wurden so-
30dann unter Bildung eines für die Aminosäuren 1-110 kodierenden
338 bp-Fragments miteinander verknüpft. Dieses Fragment und ein 1645 bp-Nar I - BgI II-Fragment aus pPA25E10 wurden
sodann zwischen den Eco RI- und BgI II-Stellen des Plasmids pLelFAtrp 103 (53) unter Bildung des Expressionsplasmids
35pt-PAtrp12 verknüpft. Das geklonte t-PA-Gen wurde unter der
Kontrolle eines 300 bp-Fragments von E. coli-trp-Operon, das den trp-Promotor, Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenz
des trp-Leitpeptids enthält, aber das Leitpeptid
ATG-Initiationskodon nicht enthält, transkribiert (52).
E. coli K12 Stamm W3110 (ATCC 27325) mit einem Gehalt am
Plasmid pt-PAtrp12 wurde gezüchtet. Extrakte wurden zur Be-Stimmung der fibrinolytischen Aktivität hergestellt. Eine
Methode zur Messung der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität war der Fibrinplattentest (87). Dabei wird/ die Menge
an gebildetem Plasmin gemessen, indem man das Ausmass der
Piasminverdauung von Fibrin in einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an Plasminogen und Fibrin bestimmt. Plasmin ruft eine
klare Lysiszone in der Fibrinplatte hervor. Aus der Fläche dieser Zone kann die Menge an in der Probe vorhandenem Gewebe-PLasminogen-Aktivator
ermittelt werden. Werden Extrakte von pt-PAtrp12-Klonen auf die Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität
unter Anwendung des Fibrinplattentests getestet, so ergibt sich eine klare Lysiszone. Diese fibrinolytische
Aktivität wird durch anti t-PA- IgG1 aber nicht durch Präimmun-IgG oder anti- Urokinase-IgG gehemmt. Keine
Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen hergestellt ist, die zur Kontrolle das Leukocyteninterferonplasmid
pLeIFAtrp103 enthalten. Unter Anwendung einer Eichkurve von gereinigtem t-PA lässt sich berechnen, dass etwa
20 units an extrahierter Aktivität pro 10 Zellen erhalten
wurden (für gereinigtes t-PA: 90 000 Plough-units = 1 mg) (Fig. 10).
E.1.J Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse beruhte auf dem Edman-Abbau (83b). Die
Probe wurde in das Probengefäss des Beckman 890B oder 89OC-Sequenziergerät
mit drehendem Probengefäss gegeben. PoIy-
R 11
brene (PoIy-N,N,N ,N -tetramethyl-N-trimethylenhexamethylendiammonium-diacetat)
wurde als Träger im Gefäss verwendet. (63c). Das Sequenziergerät war mit einer Kühlfalle und mit
einigen Programmveränderungen zur Verringerung von Hintergrundpeaks modifiziert. Als Reagentien wurden die Beckman-Reagentien
für Sequenzierzwecke 0,1 m Quadrol-Puffer, Phenylisothiocyanat
und Heptafluorbuttersäure verwendet.
Die gesammelten Edman-Zyklen wurden manuell zu 2-Anilino-5-thiazolinonderivaten
umgesetzt. Das 1 Chlorbutan wurde unter Stickstoff getrocknet. Sodann wurde 1,0 η HCl in Wasser
zum 2-Anilino-5-thiazolinon gegeben und 10 Minuten auf
5700C erwärmt, um eine Umwandlung in das 3-Phenyl-2-thiohydantoin
(PTH-Derivat) durchzuführen. Der PTH-Aminosäurerest wurde sodann in 50 prozentigem Acetonitril in Wasser
gelöst und in eine Hochdruck-Flüssigchromatographievorrichtung mit Phasenumkehr injiziert. Die einzelnen PTH-Aminosäuren
wurden durch Vergleich der Retentionszeiten eines Standardgeraisches von PTH-Aminosäuren, die in die Konversionsflasche
eingeführt und wie ein Zyklus des Sequenziergeräts behandelt wurden, identifiziert.
E.1.K Tests zum Nachweis der Expression von Gewebe-Plasminogen-Aktivator
1. Direkter Test der Plasminbildung
a. Theorie
Ein empfindlicher Test für Gewebe-Plasminogen-Aktivator lässt sich durchführen,indem man die durch den Gewebe-Plasminogen-Aktivator
katalysierte Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin ermittelt. Plasmin ist ein Enzym, für das chromogene
Substratests zur Verfügung stehen. Diese Tests beruhen auf der proteolytischen Spaltung eines Tripeptids von
einer chromophoren Gruppe. Die Spaltungsgeschwindigkeit ist direkt proportional zur Spezifität und zur Konzentration der
zu untersuchenden Protease. Die Grundlage für diesen Test ist die Bestimmung der Menge an Plasmin, die nach Inkubation
der den Gewebe-Plasminogen-Aktivator enthaltenden Lösung
mit einer Plasminogenlösung entsteht. Je grosser die Aktivatormenge
ist, desto grosser ist die Menge an gebildetem Plasmin. Plasmin wird auf Grund der Spaltung des chromogenen
Substrats S2251 (Kabi Group, Inc., Greenwich, CT) gemessen. 35
b. Verfahren
Ein Aliquotanteil der Probe wird mit 0,10 ml 0,7 mg/ml Plasminogen
(in 0,05 m Tris-HCl, pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt
lan 0,012 m NaCl) vermischt. Das Volumen wird auf 0,15 ml eingestellt.
Das Gemisch wird 10 Minuten bei 370C inkubiert und mit 0,35 ml S2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten
Puffer) versetzt. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 370C
fortgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion werden 25 μΐ Eisessig
zugesetzt. Die Proben werden zentrifugiert. Die Absorbtion bei 405 nm wird gemessen. Die quantitative Bestimmung
der Aktivität erfolgt mittels eines Vergleichs mit einer Urokinase-Eichlösung. Die Testbedingungen zum Nachweis
des Gewebe-Plasminogen-Aktivators der vollen Länge werden durch Zugabe von 0,2 mg Fibrinogen zur Lösung modifiziert.
Fibrinogen bewirkt eine Stimulierung der Aktivität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators,
wodurch sich eine etwas erhöhte Aktivität ergibt. Die Aktivität wird in Plough-units festgehalten,
wobei 90 000 Plough-units der Aktivität von Γ mg gereinigtem Gewebe-Plasminogen-Aktivator entsprechen.
2. Indirekter Test der Plasminbildung
a. Theorie
Es wurde ein empfindlicher Test auf die Aktivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator
entwickelt (87). Der Test beruht auf der Bestimmung der Plasminbildung durch Messung des Grads der Verdauung
von Fibrin durch Plasmin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen. Plasmin bildet eine klare
2^ Lysiszone in der Fibrinplatte. Die Fläche dieser Lysiszone
korreliert mit der Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator in der Probe.
b.Verfahren
Gemäss dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87)
werden die Platten 3,5 Stunden bei 370C inkubiert. Die Lysiszonen
werden gemessen. Eine quantitative Bestimmung ergibt sich durch Vergleich mit einer Urokinase-Eichlösung.
E.1.L Nachweis der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität
1. Bakterielles Wachstum und Probenvorbereitung Eine Kolonie von E. coli mit einem Gehalt an dem Plasmid
) wurde in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an 5 ml LB-Wachstumsmedium mit einem Gehalt an 20 ug/ml Ampicillin
überimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 370C gezüchtet.
Eine Aliquotmenge dieser Kultur wurde 1:100 in 300 ml M-9-Medium mit einem Gehalt an 20 ug/ml Ampicillin
verdünnt. Die Zellen wurden 4 Stunden bei 370C in einem
Schüttelkolben gezüchtet, wobei sich eine Absorbtion bei 550 nm von 0,419 ergab. Die tryptophananaloge Indolacrylsäure
wurde in einer Konzentration von 30 Mg/ml zugesetzt.
Die Zellen wurden 90 Minuten inkubiert, wobei sich eine Absorption
bei 550 nm von 0,628 ergab. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 0,8 ml 0,01 m Tris vom pH-Wert
8,0 mit einem Gehalt an 0,01 m EDTA resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur
rasch gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert. Der überstand wurde auf die Aktivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator getestet.
Bezüglich der Expression von pt-PAtrp12 wird auf die ausführliche Erläuterung zu Fig. 10 verwiesen.
2. Aktivitätsnachweis
Die Tabellen I und II zeigen die Ergebnisse der Aktivierung von Plasminogen durch entsprechende E. coli-Extrakte. Es
bildet sich eine Aktivität, die von der Anwesenheit von Plasminogen abhängig ist (Tabelle I). Diese Aktivität wird nicht
durch Präimmunserum von Kaninchen beeinflusst, wird aber durch Antiserum, das gegen aus gereinigten Melanomzellen
abgeleiteten Gewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt wurde
(88) ,deutlich gehemmt (Tabellen I und II). Dies zeigt, dass
E. coli-Extrakte eine Plasminogen aktivierende Aktivität erzeugen, die durch Antikörper gegen den Gewebe-Plasminogen-Aktivator
gehemmt wird.
Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests auf fibrinolytische
Aktivität. Eine Standardmenge an Urokinase wurde in die Mittelreihe in Konzentrationen (von links nach
rechts) von 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 und 0,02 Plough-units ge-
geben. Die untereReihe enthält Proben von natürlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator
mit der gleichen Enzymmenge in jeder Vertiefung. Die Vertiefungen enthalten (von links nach
rechts) Gewebe-Plasminogen-Aktivator, anti-Plasminogen-Akt-5vator
plus Präimmunserum und Gewebe-Plasminogen-Aktivator plus Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper. Die Vertiefungen
in der oberen Reihe enthalten jeweils 8 μΐ der rekombinanten
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-E. coli-Extrakte. Die
erste Vertiefung enthält das Extrakt allein, in der zweiten Vertiefung ist Präimmunserura zugesetzt und in der dritten
Vertiefung sind Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper zugesetzt.
Es ist offensichtlich, dass das Präimmunserum natürlichen oder rekorabinanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator
nicht beeinflusst und dass Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper die Aktivität von natürlichen und von E. coli-Extrakten
hemmen. Bezogen auf die Urokinase-Standards enthalten die Extrakte geringfügig weniger als 2,5 Ploughunits
pro ml. Dies braucht den Vergleich mit dem in Tabelle I erhaltenen Wert von 1,3 Plough-units pro ml nicht scheuen,
In den Tabellen I und II sind die Ergebnisse der in E.1.K.
1.b. durchgeführten Tests zusammengestellt.
Tabelle I
Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakte von Kulturen
mit einem Gehalt an p^RIPA
ünc prozentuale berechnete
Probe A
°
Aktivität Plough-Units/ml
Extrakt (ohne 0,043 (0)
Plasminogen)
Extrakt 0,451 (100) 1,3.
Extrakt plus Prä- 0,477 106
immunserura
Extrakt plus anti 0,079 9 —
t-PA-Antikörper
Prozentuale Aktivität, berechnet durch Subtraktion des Leerwerts
(0,043) von den erhaltenen Werten und Division durch den vom Extrakt
erhaltenen Wert.
Tabelle II
Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakte von Kulturen
von pt-PAtrp12
Probe A)1 Q1- prozentuale Aktivität
Extrakt 0,657 (100)
Extrakt plus Präimmun- 0,665 101
serum
Extrakt plus anti 0,059 9
t-PA-Antikörper
Fig. 10 gibt die Ergebnisse eines Fibrinplattentests wieder,
der mit Extrakten aus 10 Liter Fermentationskulturen von E. coli mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator
exprimierendem Plasmid durchgeführt wurde. Die fibrinolytische
Aktivität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators mit einem Gehalt an dem Extrakt ist in Fig. 10 durch die Vertiefung A
wiedergegeben. Diese fibrinolytische Aktivität wird durch
anti-t-PA-IgG (Vertiefung C), aber nicht durch Präimmun-IgG
(Vertiefung B) oder durch anti-Urokinase-IgG (Vertiefung D) gehemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der
aus Zellen hergestellt ist, die als Kontrolle das Leukocyteninterferonplasmid pLeIFAtrp103 enthalten (Vertiefung H).
E.2 Herstellung von t-PA unter Verwendung von DHFR-Protein
mit geringer Bindungsaffinität für MTX
E.2.A Vektoraufbau
Die Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) kodierende Sequenz
wird in ein Expressionsplasmid mit einem Gehalt an 35mutanter DHFR mit geringer Bindungsaktivität für MTX (beschrieben
in der US-Anmeldung 459 151 vom 19. Januar 1983) gemäss folgendem Verfahren (vgl. Fig. 11) eingesetzt:
-"ft-SA-
Drei Fragmente von überlappenden t-PA-Plasmiden, nämlich
pPA25E10, pPA17 und p^RIPA0 (vgl. oben) wurden folgendermassen
hergestellt: Plasmid pPA17 wurde mit Dde I verdaut. unter Verwendung von Klenow DNA-Polymerase I gefüllt und mit
5PstI geschnitten. Das auf diese Weise gebildete Fragment mit
etwa 200 bp mit einem Gehalt an der 5'-terminalen t-PA-Sequenz
wurde isoliert. Das zweite t-PA-Fragment wurde durcn Verdauen von p^RIPA0 mit Pstl und Narl und Isolieren des
Fragments mit etwa 310 bp erhalten. Das dritte t-PA-Fragment wurde
durch Verdauen von pPA25E10 mit Narl und BgIII und Isolieren
des etwa 1645 bp aufweisenden Fragments, das zusätzlich zu einem Grossteil des t-PA-kodierenden Bereichs einige 3'-nicht-translatierte
Sequenzen enthält, erhalten.
Das Plasmid pE342, das HBV-Oberflächenantigen exprimiert
(auch bezeichnet als pHBs348-E)) ist in der US-Patentanmeldung 326 980 vom 03- Dezember 1981 beschrieben. Kurz zusammengefasst,
wurde die Startstelle des Simian-Virus SV 40 durch Verdauen von SV 40-DNA mit Hindlll und Umwandeln der
Hindlll-Enden zu Eco RI-Enden durch Zugabe eines Konverters
(AGCTGAATTC) isoliert. Diese DNA wurde mit PvuII geschnitten und mit RI-Linkern versetzt. Durch anschliessende Verdauung
mit Eco RI wurde das 348 bp-Fragment, das die Startstelle umspannt, durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel und Elektroelution
isoliert und in pBR322 geklont. Das Expressionsplasmid pHBs348-E wurde durch Klonen des 1986 bp-Fragments,
das durch Eco RI-und Bglll-Verdauung von HBV (Animal Virus Genetics,(Ch.5) Acad. Press, N.Y., 1980) (das das HBsAg
kodierende Gen umspannt) erhalten worden ist, in das Plas-
30mid pML (Lusky et al., Nature, Bd. 293 (1981), S. 79) an den Eco RI- und BamHI-Stellen aufgebaut. (pML ist ein Derivat
von pBR322, das eine Deletion unter Weglassen von Sequenzen, die eine Hemmung der Plasmidreplikation in Affenzellen
bewirken, aufweist). Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl)
wurde dann mit Eco RI linearisiert, und das 348 bp-Fragment, das den SV 40-Startbereich repräsentiert, wurde in die Eco
RI-Stelle von pRI-Bgl eingeführt. Das Startstellenfragment kann in beliebiger Orientierung eingesetzt werden. Da dieses
Fragment sowohl die frühen als auch die späten SV 40-Promotoren
zusätzlich zur Replikationsstartstelle kodiert, konnten HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach
dieser Orientierung (pHBS348-E repräsentiert HBs, das unter der Kontrolle des frühen Promotors exprimiert ist) exprimiert
werden. pE3^2 ist durch teilweise Verdauung mit Eco
RI, Füllen der Spaltungsstelle unter Verwedung von Klenow-DNA-Polymerase
I und Rückligation des Plasmids modifiziert, wordurch die Eco RI-Stelle, die der SV 40-Ursprungsstelle
in pE342 vorausgeht,entfernt wird. Das erhaltene Plasmid,
als pE3^2^RI bezeichnet, wird mit. Eco RI verdaut, unter Verwendung
von Klenow-DNA-Polymerase I gefüllt und mit Bam HI
geschnitten. Nach Elektrophorese an Acrylamidgel wird das Fragment mit etwa 3500 bp auf die vorstehend erläuterte Weise
der Elektroelution unterworfen, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Der auf diese Weise hergestellte p342E-3500 bp-Vektor und
die vorstehend beschriebenen t-PA-Fragmente mit etwa 2160 bp werden unter Anwendung von üblichen Techniken miteinander
ligiert. Ein Plasmid mit einem Gehalt an den drei t-PA kodierenden Fragmenten in richtiger Orientierung wurde isoliert,
charakterisiert und als pE342-t-PA bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit Sac II verdaut und mit bakterieller alkalischer
Phosphatase (BRL) behandelt. Zur Erzeugung der DHFR-Sequenz (zusammen mit Kontrollsequenzen für dessen Expression)
wurde ein Fragment mit etwa 1700 bp durch SacII-Verdauung
von pEHER erzeugt. (pEHER ist ein Plasraid, das mutante DHFR exprimiert; vgl. US-Patentanmeldung 459 151
a.a.O.). Dieses Fragment wurde in das pE342-t-PA-Plasmid unter Bildung von pEdPAER400, einem Plasmid, das analog zu
pEHER ist, mit der Ausnahme, dass der HBsAg kodierende Bereich durch die cDNA-Sequenzen aus t-PA ersetzt ist, ligiert.
E.2.B Expression und Amplifikation der t-PA-Sequenz
pETPAERiOO (pETPER) wurde gemäss dem Verfahren von Graham
und Van der Eb (vgl. oben) sowohl in dhfr"" CHO-DUX BH-Zel-
len als auch in DHFR+ CH0-K1 (ATCC CCL61) transfiziert.
Transformierte dhfr~-Zellen wurden durch Züchtung in einem Medium mit einem Mangel an Glycin, Hypoxanthin und Thymidin
ausgewählt. Transformierte DHFR+-Zellen wurden durch Züch-
5tung in —100 nanomolar MTX ausgewählt. Kolonien, die im entsprechenden
Selektionmedium entstanden, wurden unter Verwendung von Klonierungsringen isoliert und im gleichen Medium
auf mehrere Generationen vermehrt.
Zur Amplifikation wurden die Zellen aus den Kolonien in Medien
mit einem Gehalt an 5 χ 10 , 105, 2,5 χ 10 , 5 χ 10
und 10 nanomolar MTX aufgeteilt und mehrmals passagiert.
2 "i Die Zellen wurden in sehr niedrigen Zelldichten (10 -10
Zellen/Platte) in 10 cm-Schalen ausgestrichen. Die erhalte-15nen
Kolonien wurden isoliert.
E.2.C Testmethoden
Die Expression von t-PA in den transfizierten, amplifizierten
Kolonien kann zweckmässigerweise nach ähnlichen Verfahren bestimmt werden, wie sie vorstehend unter D.I.K.I.b angegeben
sind.
Die Koamplifikation von DHFR- und t-PA-Sequenzen wird durch Isolierung von DNA aus konfluenten Monolayers von amplifizierten
Kolonien folgendermassen bestimmt: Konfluente Monolayers in 150 mm Platten .werden mit 50 ml steriler PBS gewaschen
und durch Zugabe von 5 ml 0,1 Prozent SDS, 0,4 m CaCl2, 0,1 m EDTA, pH-Wert 8 lysiert. Nach 5 bis 10 Minuten
wird das Gemisch entfernt, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Die DNA wird in 1 ml (pro
150 mm-Platte) 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,1 millimolar
EDTA (TE) resuspendiert. 0,1 mg/ml RNase werden zugesetzt und die Lösung wird 30 Minuten bei 370C inkubiert. Sodann
wird 0,1 Prozent SDS und 0,5 mg/ml Pronase (Sigma) zugegeben. Nach 3- bis 16-stündiger Inkubation bei 370C wird
die Lösung wieder mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 0,5 ml Wasser
resuspendiert und mit Restriktionsenzymen verdaut. Etwa 5 bis 10 ug der verdauten DNA werden der Elektrophorese in
einem Agarosegel (1 Prozent Agarose in Tris-Acetat-Puffer
(40 millimolar Tris, 1 millimolar EDTA, mit Essigsäure auf 5den pH-Wert 8,2 eingestellt)) unterworfen; vgl. Crouse et
al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 788?. Nachdem Bromphenolblau-Farbstoff
im Gel 2/3 der Strecke nach unten gewandert ist, wird das Gel entfernt und mit Ethidiumbromid
gefärbt. Nach Sichtbarmachen der DNA mit UV-Licht wird die DNA gemäss dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol., Bd.
(1975), S. 503, auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter werden sodann mit einem der Nick-Translation unterworfenen
Tracer, der aus dem 1700 bp-SacII-Fragment von pEHER (hergestellt und hybridisiert auf die vorstehend be-
15schriebene Weise) oder aus dem etwa 1970 bp umfassenden
Bglll-Fragment von pETPER hergestellt worden ist, unterzogen.
E.3 Herstellung von t-PA in Konjunktion mit Wildtyp-DHFR-Protein
E.3-A Vektoraufbau
Auf analoge Weise wie beim Aufbau von pETPER wird ein Plas-25mid
mit einem Gehalt an der DNA-Sequenz, die Wildtyp-DHFR kodiert, nämlich pETPFR, aufgebaut. Der Aufbau erfolgt gemäss
Beispiel C.1.A mit der Ausnahme, dass an Stelle des Plasmids pEHER als Quelle für die DHFR-Protein-Gensequenz
das Plasmid pE342.HBV;E400.D22 (vgl. Genentech-Anmeldung
mit dem internen Aktenzeichen 100/92) verwendet wurde. Das Plasmid pE342.HBV.E400.D22 ist das gleiche wie pEHER, mit
Ausnahme eines Unterschieds bezüglich eines einzigen Basenpaars zwischen Wildtyp- und Mutanten-DHFR. Somit ist das
erhaltene Plasmid pETPFR in jeder Weise zu pETPER analog, mit der Ausnahme, dass die für Wildtyp-DHFR kodierende DNA-Sequenz
durch die Sequenz der Mutante ersetzt ist.
Ε.3·Β Expression der t-PA-Sequenz
pETPFR wurde zur Transfektion von CHO-Zellen mit DHFR-Mangel
(Urlaub und Chasin, a.a.O.) unter Verwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahrens
gemäss Graham und Van der Eb verwendet. 21 Kolonien, die auf dem selektiven Medium (-HGT'
entstanden, wurden durch Nachweis der Plasminbildung bestimmt. Dieser Nachweis erfolgte auf Grund der Verdauung von
Fibrin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen gemäss Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med.,
Bd. 1ii8 (1978), S. 223.
Vier der besten positiven Klone wurden dann quantitativ auf Plasminbildung pro Zelle gemäss dem in D.2.C erläuterten
Verfahren getestet.
Auf Grund dieser quantitativen Bestimmung wurde festgestellt, dass die vier untersuchten Klone bei der Bestimmung von
units/Zelle/Tag die gleiche oder eine vergleichbare Sekretion von t-PA in das Medium aufwiesen. Subklone wurden hergestellt,
indem Inocula aus zwei der Klone in getrennte Platten mit einem Gehalt an -HGT-Medium übertragen wurden.
Zwei der erhaltenen Subklone, 18B und 1, wurden für die weitere Analyse herangezogen.
E.3.C Amplifikation und Grad der t-PA-Bildung
Die vorerwähnten Subklone wurden in einer Menge von 2 χ 10"
Zellen pro 100 mm-Platten in 50 nanomolar MTX ausgestrichen, um die Amplifikation zu fördern. Die überlebenden Zellen
ergaben bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung in sämtlichen Fällen im Vergleich zur unverstärkten Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität
die 10-fache Aktivität. Zwei dieser Klone wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt
und als 1-15 und 18B-9 bezeichnet.
Der Subklon 1-15 wurde weiter durch überimpfen von 2 χ 10
Zellen in 100 mm-Platten mit einem Gehalt an 500 nanomolar
MTX verstärkt. Die Bestimmung der auf diese Weise amplifizierten Zellen ergab einen weiteren Anstieg (etwa um das
3-fache) in Bezug auf die t-PA-Bildung. Bei quantitativer Bestimmung gemäss dem Verfahren von C.1.C ergaben sich Menagen
im Bereich von 7 x 10 units/Zelle/Tag. Ein Teil dieser
amplifizierten Zellen wurde sodann übertragen und in Gegenwart
von 10 000 nanomolar MTX erhalten. Subklone von 1-15 undi8B-9 wurden, nachdem sie etwa 1 bis 2 Monate unter den
in Tabelle 11 angegebenen Bedingungen gehalten worden waren,
weiter getestet.
Tabelle 11
Zellinie Wachstumsbedingungen
15 1~15500 50° nanomolar MTX
1-15500 500 nanomolar MTX
1-15500 (-HGT-Medium, kein MTX)
1-15500 (-HGT-Medium, kein MTX)
20 1-1510 Q00 10 mikromolar MTX
ng t-PA/Zelle/Tag* |
X
X
|
10"3
10"3 |
28,5
26,0 |
X
X
|
ΙΟ"3
10"3 |
8,3
18,0 |
X
X
|
1O-3
ΙΟ"3 |
29,3
49,0 |
X
X
|
ΙΟ"3
10"3 |
14,3
14,4 |
X
X
|
10"3
ΙΟ"3 |
14,3
14,4 |
X
|
ΙΟ"3 |
1,0 |
1 ""1^ 10 000 10 mikromolar MTX
18B-9 50 nanomolar MTX
18B-9 50 nanomolar MTX
oc 18B-9 (-HGT-Medium, kein MTX)
18B-9 (-HGT-Medium, kein MTX)
1 (-HGT-Medium, kein MTX)
1 (-HGT-Medium, kein MTX)
° t -PA im Kulturmedium wurde quantitativ durch einen Radioimmunoassay
folgendermassen bestimmt: Gereinigter t-PA und gereinigter, jodierter Tracer-t-PA, die aus Melanomzellen
abgeleitet waren, wurden Serienverdünnungen auf Konzentrationen von 12,5 bis 400 ng/ml in einem Puffer mit einem Gehalt
an phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,3, 0,5 Prozent Rinderserumalbumin, 0,01 Prozent Tween 80 und
0,02 Prozent NaN3 unterzogen. Entsprechende Verdünnungen der zu untersuchenden Mediumproben wurden zu radioaktiv
markierten Tracerproteinen gegeben. Man liess die Antigene über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart einer 1:10 000-Verdürmung
der IgG-Fraktion von Kaninchen-anti-t-PA-Anti-
serum inkubieren. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde durch
zweistündige Absorption bei Raumtemperatur an Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Immunokügelchen
(Immunobeads,BioRad) präzipitiert. Die Kügelchen wurden durch Zugabe von Kochsalzlösung-Verdünnungsmittel
geklärt und sodann 10 Minuten bei 2000 g bei 40C zentrifugiert. Die überstände wurden verworfen. Die
Radioaktivität der Niederschläge wurde ermittelt. Die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Eichstandards festgelegt.
Es handelte sich um folgende Zellinien: Zellinie "1" ist ein nicht-amplifizierter Klon aus dem ursprünglichen Satz
von vier Klonen. "1-'|5(-00" ist ein amplifizierter Subklon
der Zellinie "1", die zunächst in 50 nanomolar MTX unter Bildung von 1-15 amplifiziert und sodann zur weiteren Amplifikation
in 500 nanomolar MTX übertragen worden ist.
1 — 15-jQ QQQ ist ein Subklon von 1-15cOO,der weiter in Gegenwart
von 10 000 nanomolar MTX amplifiziert worden ist. Die Zellinie 18B-9 ist ein Subklon von einem der ursprünglichen
vier nachgewiesenen Klone, der mit 50 nanomolar MTX amplifiziert worden ist.
20
Sämtliche araplifizierten Zellen zeigen eine erhöhte t-PA-Bildung
im Vergleich zur nicht-amplifizierten Zellkultur. Auch die nicht-amplifizierte Kultur bildet t-PA-Mengen von
mehr als 0,5 pg/Zelle/Tag. Durch Amplifikation nähert man
25sich der Menge von 50 pg/Zelle/Tag.
F. Arzneimittel
Die Verbindungen der Erfindung können nach an sich bekannten
ow Verfahren zu Arzneimitteln formuliert werden, wobei das erfind
ungsgemässe Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Produkt
mit einem pharmakologisch verträglichen Träger vermischt wird. Entsprechende Träger und deren Herstellung, unter Einschluss
von anderen Humanproteinen, wie Humanserumalbumin,
sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences,
E. W. Martin, erläutert. Diese Arzneimittel enthalten eine wirksame Menge des erfindungsgemässen Proteins zusammen mit
einer entsprechenden Trägerstoffmenge, so dass pharmakolo-
gisch verträgliche Arzneimittel, die sich zur wirksamen Verabreichung
an einen Wirt eignen, gebildet werden.
Beispielsweise kann der erfindungsgemässe Humangewebe-Plas-5minogen-Aktivator
parenteral an Patienten, die an kardiovaskulären Krankheiten oder Zuständen leiden, verabreicht
werden. Die Dosierung bei Patienten mit Pulmonarembolie kann entsprechend der gegenwärtigen Praxis bei klinischen Untersuchungen
von anderen kardiovaskulären, thrombolytischen Mitteln erfolgen, zum Beispiel durch eine intravenöse Anfangsdosis
von etwa 440 IU/kg Körpergewicht, gefolgt von einer 12-stündigen, kontinuierlichen, intravenösen Infusion
von etwa 440 IU/kg/Stunde.
Ein Beispiel für eine entsprechende Dosierungsform für im wesentlichen homogenen Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
zur parenteralen Verabreichung sind Fläschchen mit einem Gehalt an 25 000 IU Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktiyität,
25 mg Mannit und 45 mg NaCl, die für die intravenöse Verabreichung
mit 5 ml sterilem Wasser für Injektionszwecke rekonstituiert
und mit einem entsprechendem Volumen an 0,9 prozentiger Natriumchloridlösung oder 5 prozentiger Dextroselösung
für Injektionszwecke vermischt werden können.
G. Ausführliche Beschreibung von rekombinanter human t-PA
Die Struktur des gemäss den Beispielen hergestellten human
t-PA wurde näher untersucht, und zwar sowohl durch Aufklärung der Genkodierungssequenz und durch biochemische Proteinuntersuchungstechniken.
Gegenwärtig nimmt man die in Fig. 12 dargestellte Proteinstruktur an.
ν Durch Collen et al. (88) wurde auch nachgewiesen, dass zweikettiger
human t-PA durch proteolytische Spaltung des einkettigen Moleküls in zwei durch Disulfidbindung verbundene
Polypeptide erfolgt. Die gegenwärtigen Befunde erlauben den Schluss, dass die schwere Kette (Molekulargewicht 30 882)
sich vom NHp-terminalen Teil ableitet und die leichte Kette
(Molekulargewicht 28 126) den COOH-terminalen Bereich umfasst.
Die N-terminale Sequenzierung des zweikettigen Moleküls legt den Schluss nahe, dass die zweikettige Form durch
Spaltung einer einzigen Arginyl-Isoleucin-Bindung entsteht (Fig. 12, Pfeil).
Die primäre Struktur eines Teils des Bereichs der schweren Kette von human t-PA (Fig. 12) zeigt ein hohes Ausmass an
Sequenzhomologie mit den "kringle"-Bereichen von Plasmino-
lOgen (89) und Prothrombin (40, 41). Der "kringle"-Bereich
bezieht sich auf eine charakteristische, dreifache Disulfidstruktur im "pro"-Fragment von Prothrombin, was zunächst von
Magnusson et al. (91, 92) näher beschrieben wurde. In der Primärsequenz von t-PA sind zwei sogenannte "kringle"-Bereiehe
von jeweils 82 Aminosäuren erkennbar, die ein hohes Ausmass an Homologie mit den 5 "kringle"-Bereichen von Plasminogen
zeigen. Die restlichen N-terminalen 91 Aminosäuren zeigen wenig Homologie mit dem üblichen "kringle"-Bereich.
Es lässt sich jedoch vermuten, dass dieser Bereich ebenfalls eine Struktur mit einem Gehalt an mehrfachen Disulfidbindungen
annehmen kann, da dort 11 weitere Cysteinreste vorhanden sind.
Das katalytische Zentrum der leichten Kette von human t-PA, der sogenannte Serinproteasebereich ist wie bei anderen Serinenzymen
vermutlich aus den Resten Histidin.,--, Asparaginsäure^.·
und Serin^g gebildet. Ferner zeigen die diese
Reste umgebenden Aminosäuresequenzen eine strake Homologie zu entsprechenden Teilen anderer Serinproteasen, wie Trypsin,
Prothrombin und Plasminogen.
IbZS /
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