JP2564444B2 - ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコードするｄｎａを含有するベクター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヒト血清及び／又はヒト組織中
に見い出されるものに相当するヒトプラスミノーゲン活
性化因子をコードしているＤＮＡ配列からなるＤＮＡ単
離物を発現させ得る複製可能な発現ベクターに関する。

【０００２】本発明は、ヒトプラスミノーゲン活性化因
子をコードしているＤＮＡ配列及びそれから推定される
該活性化因子のアミノ酸配列を知見したことに部分的に
起因するものである。この知見に基づき、組換ＤＮＡ技
術を適用してヒトプラスミノーゲン活性化因子を製造す
ることが可能になり、しかもこの製造方法によると、現
存する細胞培養物に於ける産生及び該細胞培養物からの
単離という工程を含む従来の単離方法に固有のある種の
制約を受けることがなく、更に、市場認可に先立って必
要とされる動物実験及び臨床試験に着手し且つこれを遂
行するに充分な質及び量で該活性化因子を製造すること
が可能になったのである。

【０００３】本発明は、あらゆる点で、これらの関連す
る具体例に係る。本発明の背景を説明し且つある場合に
はその実施のための詳細を補うために使用する文献及び
その他の資料は、本明細書中参照番号を付して引用し、
更に便宜のため本明細書末尾に参考文献として列挙す
る。

【０００４】Ａ．ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子 線維素溶解系は凝固系と動的平衡状態にあり、自然な開
放性血管床を維持する。凝固系は線維素をマトリックス
として沈着させ、これにより止血状態を回復する。線維
素溶解系は、止血状態が達成された後、線維素網を除去
する。この線維素溶解過程は、血漿タンパク前駆体であ
るプラスミノーゲンから生ずるタンパク分解酵素、プラ
スミンによってもたらされる。プラスミノーゲンは活性
化剤によって活性化されてプラスミンに変換される。現
在、２種の活性化剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナ
ーゼが市販されている。この両者の効能は、急性血管病
例えば心筋梗塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、
末梢動脈閉塞症及びその他の静脈血栓症の治療とされて
いる。総じて、これらの病気は重大な健康上の危険の要
因となる。

【０００５】これらの疾病の基本的原因は、凝血塊(血
栓又は血栓塞栓)による血管の部分的又は重度の場合に
は全体的閉塞にある。例えばヘパリン及びクマリンを用
いるような従来の凝固防止療法では、血栓又は血栓塞栓
の溶解を直接には何ら促進しない。上述した血栓溶解剤
即ちストレプトキナーゼ及びウロキナーゼは実際に有効
に使用されてきている。然しながら今日まで、これらの
薬剤には夫々厳しい限界があった。さらに、これらの薬
剤は線維素に対する高度の親和性も有していない。従っ
て、これらの薬剤は、循環しているプラスミノーゲン及
び線維素に結合しているプラスミノーゲンを比較的無差
別に活性化する。循環血液中で形成したプラスミンは、
比較的急速に中和され、有効な血栓溶解能を失う。残留
するプラスミンは、数種の血液凝固因子タンパク例えば
フイブリノーゲン、第Ｖ因子及び第VIII因子を分解して
出血の可能性をもたらす。さらに、ストレプトキナーゼ
は強度に抗原性であり、高抗体力価を有する患者は治療
に対し効果を示さず又継続して投与することもできな
い。ウロキナーゼによる治療法は、該ウロキナーゼの製
造工程が人間の尿又は組織培養物から単離する工程を含
むため高価であり、従って一般に臨床的実用性に劣る。
このような状況下で、ウロキナーゼは多くの研究の主題
であった(例えば文献１乃至６参照)。

【０００６】いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は種
々のヒト組織例えば子宮組織、血液、血清(文献７乃至
１１参照)並びに細胞培養物(文献９４参照)から単離さ
れていた。これらの組成及び／又はこれらを含有する組
成物については文献１２及び１３に記載されている(文
献１４乃至１８参照)。これらの起源を有するプラスミ
ノーゲン活性化因子は、それらの免疫学的特性の差違に
基づいて２つの主なグループ、即ちウロキナーゼ型プラ
スミノーゲン活性化因子(u−ＰＡ)及び組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子(t−ＰＡ)に分類される。(略号t−
ＰＡ及び u−ＰＡは、ＸＸVIII Ｍeeting of the Ｉnte
rnational Ｃommittee on Ｔhrombosis andＨemostasi
s，Ｂergamo，Ｉtaly，２７ Ｊuly １９８２に於いて提
唱されたものである。) 近年、ヒトメラノーマ(黒色
腫)セルライン(細胞株)がt−ＰＡを分泌することが確認
された。このメラノーマ由来プラスミノーゲン活性化因
子は、免疫学的に及びアミノ酸組成に於いて、正常ヒト
組織から単離されたプラスミノーゲン活性化因子と区別
し得ない特性を有することが示されている(文献１９及
び８８参照)。

【０００７】比較的純粋な形態で単離されたこの物質の
特性を検討した結果、高い活性を有する線維素溶解因子
であることが知見された(文献２０参照)。メラノーマセ
ルラインから精製したt−ＰＡを使用して行なわれたい
くつかの研究の結果、t−ＰＡがウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子に比較して線維素に対してより高
い親和力を有することが示された(例えば文献９５乃至
９８参照)。然しながら、t−ＰＡは血液、組織抽出物、
血管潅流液及び細胞培養物中に非常に低濃度でしか存在
しないため、ヒトt−ＰＡの血栓溶解剤としての可能性
を更に深く研究することは困難であった。

【０００８】ヒト由来の他のタンパクを実質的に含まな
い高品質のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子(こ
れは初期にはヒトプラスミノーゲン活性化因子と呼ばれ
ていた)を必要充分な量で製造するために最も有効な方
法は、組換ＤＮＡ技術及びそれに関連する技術の適用で
あろうということは既に考えられていたことである。こ
のような物質が得られれば、それは恐らく種々の心血管
障害又は心血管病の治療に対して臨床応用できるような
生物活性を示すであろう。

【０００９】Ｂ．組換ＤＮＡ技術 組換ＤＮＡ技術は、かなり複雑な応用の段階に達してい
る。分子生物学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に
組換え、形質転換された微生物又は細胞中で大量の外来
タンパク産物を産生し得る新たなＤＮＡ体を作成し得
る。種々の平滑末端又は粘着末端を有するＤＮＡ断片を
in vitro結合し、特定生物を形質転換するのに有用な発
現ベクターを作成し、かくして所望の外来性産物の効率
的な合成を行なうための一般的手段及び方法は、既に開
発されており自由に使用することができる。然しなが
ら、個々の産物については、その製造工程はまだ若干複
雑であり、常に成功を予測し得る段階にまでは科学は進
歩していない。事実、実験的裏付けをせずに成功結果を
予告する者もいるが、このような予言には実施不能とい
う著しい危険が伴っている。

【００１０】基本的要素、即ち複製のオリジン、１種又
はそれ以上の表現型選択特性、発現プロモーター、異種
遺伝子インサート及び残りのベクターのＤＮＡ組換は、
一般に宿主細胞の外部で行なわれる。得られる複製可能
な組換発現ベクターすなわちプラスミドを形質転換によ
り細胞中へ導入し、得られる形質転換体を増殖させるこ
とにより大量の組換ベクターを得ることができる。コー
ドされているＤＮＡメッセージの転写および翻訳を支配
する部分に対して遺伝子が適切に挿入されていれば、得
られた発現ベクターを使用して挿入遺伝子がコードして
いるポリペプチド配列を実際に産生することができ、こ
の過程を発現と呼ぶ。微生物系で必要に応じて宿主細胞
を溶菌し、且つ適当な方法により他のタンパクから精製
して目的産物を回収することができる。

【００１１】実際、組換ＤＮＡ技術を用いることによ
り、全く異種のポリペプチドを発現させることができ
(いわゆる直接的発現)、或いは同種ポリペプチドのアミ
ノ酸配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させ
ることもできる。後者の場合、目的とする生物活性産物
は、しばしば、細胞外環境に於いて開裂されるまで、融
合した同種／異種ポリペプチド中で生物的に不活性の形
態で存在する(文献２１及び２２参照)。

【００１２】同様に、遺伝学及び細胞生理学を研究する
ための細胞培養(セルカルチャー)又は組織培養の技術は
充分に確立されている。単離した正常細胞から継代処理
により永久セルラインを調製しこれを維持する手段及び
方法も公知である。研究に使用するためには、これらの
セルラインを液体培地中の固体支持体上に維持するか、
又は栄養物を含有する懸濁液中で増殖させる。大量生産
のためには機械的問題が残るのみであろう(その他の背
景については、文献２３及び２４参照)。

【００１３】又、生物工学においてはタンパク質生化学
が有用且つ実際上必要な手段である。所望のタンパクを
産生する細胞は、多数の他のタンパク、即ち細胞固有の
代謝産物をも産生する。これらの夾雑タンパク及びその
他の化合物は、所望タンパクから除去されないと、所望
タンパクによる治療処置の過程で動物又はヒトに投与し
た場合有毒となる危険性がある。タンパク質生化学の技
術により、目的とする特定システムの適する分離方法を
使用して目的用途に対し安全で均質な最終産物を得るこ
とができる。更に、タンパク質生化学により、所望産物
の特性を明らかにし、細胞が何ら変化せず又は突然変異
することなく所望産物を確実に産生したことを確認する
ことができる。この科学分野には、臨床研究及び市場開
発に成功するために必要とされるバイオアッセイ、安定
性試験及びその他の研究過程も関係している。

【００１４】本発明は、組換ＤＮＡ技術の使用により、
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t−ＰＡ)を好ま
しくは直接的形態で製造し、しかも市場認可を得るため
の必須要件である動物実験及び臨床試験を開始し且つ継
続するのに十分な量で有利に製造し得るという知見に基
く。製造されたヒトt−ＰＡは、ヒトの様々な心血管障
害又は心血管病の予防処置又は治療処置での使用に適し
ている。本発明により、実質的に純粋なヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子を得ることができる。遺伝子工学
的に処理された微生物又は細胞系により、従来よりも遥
かに有効にヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生
し得、これにより従来は達成し得なかった産業利用の機
会が得られる。更に、宿主細胞次第でヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子は天然物質に比較して異なった程度
でグリコシル化された状態のものが得られる。いずれに
しても、このように産生されるt−ＰＡは、非組換細胞
に於いては伴なっているのが普通である夾雑物を含まな
いであろう。

【００１５】本発明は、後に定義するヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子をコードしているＤＮＡ配列、該因
子を発現し得る形態でコードしている遺伝子配列を含む
複製可能なＤＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質転換
された微生物菌株又は細胞、並びにヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生し得る前記の如き形質転換され
た微生物菌株又は細胞株の培養及びそれらの培養物に係
る。更に別の角度から見た本発明の目的は、前記の遺伝
子配列、ＤＮＡ発現ベクター、微生物菌株及び細胞の製
造に有用な種々の方法及びその具体例を提供することで
ある。更に本発明は、前記の微生物の発酵培養及び細胞
の培養の調製に係る。

【００１６】Ａ．定義 本明細書に於いて、「ヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子」又は「ヒトt−ＰＡ」又は「t−ＰＡ」は、微生物培養
系又は細胞培養系により産生され、プロテアーゼ部分を
含み且つヒト組織に天然に存在する組織プラスミノーゲ
ン活性化因子に対応する生物活性形態のヒト外因性(組
織型)プラスミノーゲン活性化因子を意味する。本発明
により産生されるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
タンパクは、決定されたＤＮＡ遺伝子及び推定アミノ酸
の配列決定によって定義されている。各個体毎に天然の
アレル変異体が存在し及び／又は発生することは理解さ
れよう。これらの変異は、全配列に於ける１個以上のア
ミノ酸の相違、又は配列中の１個以上のアミノ酸の欠
失、置換、挿入、転位もしくは付加によって示される。
更にグリコシル化の位置及び程度は宿主細胞環境の性質
に依存するであろう。

【００１７】組換ＤＮＡ技術を使用して、例えば、基本
となるＤＮＡの特定の部位に突然変異を誘発することに
より、１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加又は
転位によって種々変性された種々のヒト組織プラスミノ
ーゲン活性化因子誘導体を製造することが可能である。
本明細書中で特に説明するヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子の一般的特性である必須のクリングル(kringl
e)領域とセリンプロテアーゼ領域とを維持しているが他
の部分は前記の如く変性された誘導体の製造も可能であ
る。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子中の前記の如
きアレル変異及び変性は、全て本発明の範囲内に包含さ
れる。更に、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の本
質的特徴である活性が実質的に維持されている限り、物
理的及び生物学的に類似した他の近縁のヒト外因性(組
織型)プラスミノーゲン活性化因子も本発明の範囲内に
包含される。

【００１８】本発明によれば、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子は、(１)第一アミノ酸としてのメチオニン
を有する(構造遺伝子の手前にＡＴＧ開始コドンを挿入
して得られる)か、又は、(２)メチオニンが細胞内又は
細胞外で開裂されている場合は、正常の第一アミノ酸を
有するか、又は、(３)細胞内又は細胞外環境で特異的開
裂可能なシグナルポリペプチド又は従来のシグナルポリ
ペプチド以外の共役タンパク(conjugated protein)を伴
なっている(文献２１参照)か、又は、(４)外来の余分の
ポリペプチドの開裂が不要な成熟形態で直接的に発現さ
せることにより製造される。

【００１９】発現ベクターが組織プラスミノーゲン活性
化因子をシグナルペプチドと共に発現すべく設計されて
おり、宿主がシグナルペプチドを除去又は有効に除去し
得ない場合、特に最後のものが重要である。いずれにし
ても前記の如き種々の形態で産生したヒトt−ＰＡを回
収し、種々の血管障害又は血管病の治療用に適するレベ
ルまで精製する。

【００２０】更に、t−ＰＡには、一本鎖タンパクと二
本鎖タンパクとの双方の形態がある。二本鎖タンパクは
一本鎖化合物のタンパク分解により誘導される。理論的
には、二本鎖タンパクが産生された線維素と関連してお
り、タンパク分解による一本鎖物質から二本鎖物質への
変換はプラスミノーゲンからプラスミンへの転換部位で
生じると想定される。本発明は、前記の如く、in vivo
で転換される一本鎖タンパクの投与、及び活性を有する
ことがすでに証明されている二本鎖タンパクの投与の双
方を含む。二本鎖タンパクは、一本鎖物質の産生後にin
vitroタンパク分解変換によって製造され得る。所謂ク
リングル領域は、セリンプロテアーゼ部分より上流に位
置しており、本発明の組織プラスミノーゲン活性化因子
を線維素マトリックスに結合させ、これにより、実際に
存在する血栓に対して組織プラスミノーゲン活性化因子
の特異的活性を発揮せしめるために重要な役割を果た
す。本発明により製造される組織プラスミノーゲン活性
化因子は天然物質に相当する酵素活性部分を含んでい
る。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子なる用語は、
このような部分だけを含むか、又は完全な長さの分子に
達するまでの付加アミノ酸配列と共に含む産生物と定義
される。

【００２１】要約すれば、本発明によるヒトt−ＰＡ
は、以下の如く機能的に定義し得る。即ち、ヒトt−Ｐ
Ａは、プラスミノーゲンからプラスミンへの転換を触媒
し得、線維素に結合し、前記の如き免疫学的特性に基い
てt−ＰＡと分類されるものである。従って、t−ＰＡの
機能的誘導体は本発明の範囲内に包含される。それ故、
本願発明の『ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコ
ードしているＤＮＡ』なる用語は、前記したヒト組織プ
ラスミノーゲン活性化因子の誘導体をコードしているＤ
ＮＡをも包含している。

【００２２】本発明により産生されるヒトt−ＰＡの状
態を形容すべく用いた「実質的に純粋な形態」とは、非組
換細胞により産生されたとき即ち「天然」環境で産生され
たときヒトt−ＰＡに通常伴なっているタンパク又は他
の物質を含まないことを意味する。

【００２３】「ＤＨＦＲタンパク」とは、ジヒドロ葉酸還
元酵素(ＤＨＦＲ)に関連する活性を有し得、従って、ヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない培地
(−ＨＧＴ培地)に於いて生存し得る細胞によって産生さ
れる必要があるタンパクを意味する。通常、ＤＨＦＲタ
ンパクを欠く細胞は該培地では増殖できないが、ＤＨＦ
Ｒタンパクを有する細胞は該培地で増殖できる。

【００２４】「ＭＴＸ感受性細胞」とは、ＤＨＦＲ阻害剤
メトトレキセート(ＭＴＸ)を含む培地で増殖し得ない細
胞を意味する。従って「ＭＴＸ感受性細胞」とは、遺伝的
に変化しているか又は他の方法で補足されていない場
合、ＭＴＸ濃度が０.２μg／ml以上になると周囲及び培
地が細胞のタイプに適した条件であっても増殖できない
細胞を意味する。細菌の如く或る種の細胞は、ＭＴＸに
感受性を示す筈のＤＨＦＲを含んでいるにも拘わらず、
細胞膜内部へＭＴＸを透過させないのでＭＴＸ感受性を
示さない。一般に、ＤＨＦＲタンパクとして野生型ＤＨ
ＦＲを含む細胞は、ＭＴＸを透過し得るか又は摂取し得
る限り、メトトレキセートに感受性であろう。

【００２５】「野生型ＤＨＦＲ」とは、使用する特定生物
に通常見出されるようなジヒドロ葉酸還元酵素(体)を意
味する。野生型ＤＨＦＲは通常in vitroで低濃度のメト
トレキセートに感受性である。

【００２６】「ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤＨＦ
Ｒタンパク」なる用語も機能的な定義である。これは、
細胞内部で生成されたときには、０.２μg／ml以上のＭ
ＴＸを含む培地でＭＴＸ感受性細胞を増殖せしめるＤＨ
ＦＲタンパクを意味する。このような機能的定義は、生
物の「ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤＨＦＲタンパ
ク」を産生する能力及び産生されたタンパク自体に依存
することは明らかである。然しながら、本明細書中でこ
の用語を使用する場合には、前記の双方のメカニズム間
の平衡は問題にならない。即ち本発明では、前記の如き
ＭＴＸレベルで生存する能力を付与することが操作の目
的であり、産生したＤＨＦＲ固有の性質に加えて多量の
発現が前記の如き能力を強化したか否かは重要でない。
前記の定義に適合する適当なＤＨＦＲタンパクの例とし
ては、１９８３年１月１９日付出願の米国特許出願第４
５９,１５１号明細書および対応するヨーロッパ特許出
願公開第１１７０６０号並びに特開昭５９−１９２０８
９号公報に開示されたものがあり、該特許出願明細書を
本明細書中に引用して包含する。

【００２７】「発現ベクター」とは、内包するＤＮＡ配列
が該配列を発現させ得る別の配列に有効に(発現し得る
ように)結合されている場合、該配列を発現させ得るベ
クターを意味する。これらの発現ベクターは、本明細書
中必ずしも明確に記述しなくても、宿主生体中で、エピ
ソームとして又は染色体ＤＮＡに組込まれた部分として
複製可能でなければならない。複製能が欠如するとベク
ターは有効に作用し得ない。

【００２８】要するに、「発現ベクター」なる用語も機能
的定義であり、特定の配列に対して用いられると共に、
内包する特定のＤＮＡコードを発現させ得る任意のＤＮ
Ａ配列も、発現ベクターと指称され得る。一般には、組
換ＤＮＡ技術で使用される発現ベクターは、しばしば
「プラスミド」の形態にある。

【００２９】「プラスミド」とは、環状二重鎖ＤＮＡルー
プの呼称であり、ベクター形態のときには染色体に結合
しない。プラスミドの形態のベクターが最もよく使用さ
れるので、本明細書中では「プラスミド」及び「ベクター」
なる用語を互換的に使用している。然しながら、本発明
は、勿論、同等の機能を果たすことができ当業界で公知
となる別の形態の発現ベクターをも包含する。

【００３０】「組換宿主細胞」とは、組換ＤＮＡ技術を用
いて構築されたベクターで形質転換された細胞を意味す
る。前記の如く、このような形質転換によって多量のt
−ＰＡが産生され得る。対照的に形質転換されていない
宿主を用いるとt−ＰＡの産生量は遥かに少なく、普通
の場合には検出不能な量でさえある。前記の如き細胞に
より産生されたt−ＰＡは「組換t−ＰＡ」と指称され得
る。

【００３１】Ｂ．宿主細胞及びベクター 本発明で用いるベクター及び方法は、広範囲に亘る原核
生物及び真核生物の宿主細胞中での使用に適している。
一般に、本発明に有用なベクターを構築するためのＤＮ
Ａ配列のクローン化には原核生物が好ましい。たとえ
ば、Ｅ．coli Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４４
６)が特に有用である。使用可能な別の微生物菌株とし
て、Ｅ．coliＢ及びＥ．coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎ
o.３１５３７)の如きＥ．coli菌株がある。これらは勿
論代表例であり限定的なものではない。

【００３２】原核生物は、又、発現のためにも使用され
得る。前記の菌株及びＥ．coli Ｗ３１１０(Ｆ^- ,λ^-,
プロトトロフ,ＡＴＣＣ Ｎo.２７３２５)、並びに桿菌
類たとえばＢacillus subtilus、並びに他の腸内細菌類
例えばＳalmonella typhimurium又はＳerratia marcese
ns、並びに種々のシュードモナス種が使用され得る。

【００３３】一般には、宿主細胞と適合し得る種から誘
導されたレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベク
ターが、宿主と関連して使用される。ベクターは、通
常、複製部位と、形質転換された細胞中での表現型選択
を可能にし得るマーカー配列とを担持している。例え
ば、Ｅ．coliは、典型的には、Ｅ．coli種から誘導され
るプラスミドpＢＲ３２２を用いて形質転換される(Ｂol
ivar,et al.，Ｇene，２：９５(１９７７))。pＢＲ３２
２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を
含んでおり、従って形質転換された細胞の簡単な同定手
段となり得る。pＢＲ３２２プラスミド又は他の微生物
プラスミドは、微生物が自身のタンパクを発現するのに
使用し得るプロモーターを含有するか又は含有する様に
変性されていなければならない。組換ＤＮＡの構築に最
もよく使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマ
ーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーターシス
テム(Ｃhang,et al.，Ｎature，２７５：６１５(１９７
８)；Ｉtakura,et al.，Ｓcience，１９８：１０５６
(１９７７)；Ｇoeddel,et al.，Ｎature，２８１：５４
４(１９７９))、並びにトリプトファン(trp)プロモータ
ーシステム(Ｇoeddel,etal.，Ｎucleic Ａcids Ｒes.，
８：４０５７(１９８０)；欧州特許出願公開第００３６
７７６号明細書)がある。前記のプロモーターが最もよ
く使用されるが、他の微生物プロモーターも発見され且
つ利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する
詳細も既に公表されているため、当業者はこれらのプロ
モーターをプラスミドベクターに機能的に結合し得る
(Ｓiebenlst,et al.，Ｃell，２０：２６９(１９８
０))。

【００３４】原核生物以外に、酵母の如き真核微生物の
使用も可能である。Ｓaccharomycescerevisiae又は普通
のパン酵母が最もよく使用される真核微生物であるが、
多くの他の菌株も使用され得る。Ｓaccharomyces中での
発現のためには、例えばプラスミドＹＲp７(Ｓtinchcom
b,et al.，Ｎature，２８２：３９(１９７９)；Ｋingsm
an,et al.，Ｇene，７：１４１(１９７９)；Ｔschempe
r,et al.，Ｇene，１０：１５７(１９８０))が常用され
る。このプラスミドはtrp１遺伝子を既に含有してお
り、同遺伝子は、トリプトファン中での増殖能力が欠如
した酵母突然変異株〔例えば、ＡＴＣＣ Ｎo.４４０７
６又はＰＥＰ４−１(Ｊones，Ｇenetics，８５：１２
(１９７７))〕の選択マーカーとなる。従って、酵母宿
主細胞ゲノムの特徴としてtrp１の損傷があると、それ
はトリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を
検出するための効果的な環境を提供する。

【００３５】酵母ベクター中の適当なプロモーター配列
として、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Ｈi
tzeman,et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２５５：２０７３
(１９８０))又は他の解糖系酵素(Ｈess,et al.，Ｊ,Ａd
v.Ｅnzyme Ｒeg.，７：１４９(１９６８)；Ｈolland, e
t al.，Ｂiochemistry，１７：４９００(１９７８))に
対するプロモーターがある。後者の例に、エノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、
ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ
がある。適当な発現プラスミドを構築するには、これら
の遺伝子に伴う停止配列を、発現ベクター中で発現した
い配列の３'末端に結合して、mＲＮＡのポリアデニル化
及び停止を行なわせる。増殖条件によって転写が制御さ
れるという付加的利点を有する別のプロモーターとして
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵
素、前記グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトースの資化に
関係する酵素(Ｈolland,上掲)に対するプロモーター領
域がある。酵母適合性のプロモーター、複製のオリジン
及び停止配列を含むいかなるプラスミドベクターも適当
に利用できる。

【００３６】微生物以外に、多細胞生物から誘導された
細胞も宿主として使用し得る。原則として、このような
細胞は脊椎動物又は無脊椎動物のいずれから得てもよ
い。然しながら、脊椎動物細胞の方が有利であり、近年
では組織培養での脊椎動物細胞の増殖がルーチンプロセ
スになっている(Ｔissue Ｃulture, Ａcademic Ｐres
s，Ｋruse and Ｐatterson,(１９７３))。前記の如き有
用な宿主細胞のセルラインの例として、ＶＥＲＯ細胞
株、チャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)セルライン
並びにＷ１３８,ＢＨＫ,ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫセルラ
インがある。前記の如き細胞のための発現ベクターは、
通常、(必要に応じて)複製のオリジン、発現すべき遺伝
子の前方に位置するプロモーター、任意のリボソーム結
合部位、ＲＮＡスプライス(splice)部位、ポリアデニル
化部位及び転写終了配列を必要なものとして含む。

【００３７】哺乳動物細胞中で使用する場合、発現ベク
ターの制御機能は、しばしば、ウィルス性物質によって
与えられる。例えば常用のプロモーターは、ポリオーマ
ウィルス、アデノウィルス２から誘導され、更に多くの
場合サルウィルス４０(Ｓimian Ｖirus４０,ＳＶ４０)
から誘導される。ＳＶ４０ウィルスの初期(early)プロ
モーター及び後期(late)プロモーターが特に有用であ
る。これは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製のオリジ
ンを併せて含む断片として、ウィルスから容易に得られ
るからである(Ｆiers,et al.，Ｎature，２７３：１１
３(１９７８)参照)。断片がウィルスの複製のオリジン
中に位置するＢglI部位に向かってＨindIII部位から伸
びる約２５０bpの配列を含む限り、ＳＶ４０断片の長さ
の長短は問わない。更に、所望の遺伝子配列が通常伴っ
ているプロモーター又は制御配列の使用も可能であり、
このような配列の使用が好ましい場合もしばしば見られ
る。但し、前記の如き制御配列は宿主細胞系と適合しな
ければならない。

【００３８】複製のオリジンは、ＳＶ４０又は他のウィ
ルス(例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等)起
源から誘導され得る外来性オリジンを含むようにベクタ
ーを構築して得てもよく、又は宿主細胞染色体複製メカ
ニズムによって得てもよい。ベクターが宿主細胞染色体
に組込まれる場合は、後者が良い場合もしばしばある。

【００３９】t−ＰＡ及びＤＨＦＲタンパクの双方をコ
ードしているＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによっ
てトランスフェクションを行なう好ましい宿主細胞を選
択する際には、使用するＤＨＦＲタンパクのタイプによ
って宿主を選択するのが適当である。野生型ＤＨＦＲタ
ンパクの場合には、ＤＨＦＲが欠如した宿主細胞を選択
し、これにより、ＤＨＦＲコード配列を、ヒポキサンチ
ン、グリシン及びチミジンを含まない選択培地でのトラ
ンスフェクションの成功を示すマーカーとして使用する
のが好ましい。この場合の適当な宿主細胞としては、Ｄ
ＨＦＲ活性が欠如したチャイニーズハムスター卵巣(Ｃ
ＨＯ)セルラインがある。該セルラインは、Ｕrlaub及び
Ｃhasin,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ),７７:
４２１６(１９８０)に記載の方法で調製され増殖させた
ものである。該文献を引用して本明細書中に包含する。

【００４０】他方、ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ
ＨＦＲタンパクを制御配列として使用する場合には、Ｄ
ＨＦＲ耐性細胞を使用する必要がない。突然変異ＤＨＦ
Ｒはメトトレキセートに鈍感であるから、宿主細胞自体
がメトトレキセート感受性であれば、ＭＴＸ含有培地を
選択の手段として使用し得る。ＭＴＸを取込み得る多く
の真核細胞はメトトレキセート感受性であると考えられ
る。このような有用なセルラインの１例として、ＣＨＯ
株、ＣＨＯ−Ｋ１ ＡＴＣＣ Ｎo．ＣＣＬ６１があ
る。

【００４１】後述の実施例ではlacおよびtrpプロモータ
ーシステムを用いるＥ．coliの使用、宿主細胞としてＣ
ＨＯ細胞の使用、及びプロモーターとしてのＳＶ４０の
複製のオリジンを含む発現ベクターについて記載する。
然しながら、原核生物又は真核生物宿主細胞の培養物中
で所望のタンパク配列を発現する発現ベクターを構築す
るために類似の技術を使用することは当業界で十分に公
知の事実である。

【００４２】十分量のヒトt−ＰＡが細胞培養に於いて
産生されるが、第二のコード配列を用いて更に改良する
ことにより産生レベルを更に向上することが可能であ
る。この第二のコード配列はジヒドロ葉酸還元酵素(Ｄ
ＨＦＲ)を含み、このＤＨＦＲは外部制御パラメーター
例えばメトトレキセート(metho‐trexate,ＭＴＸ)の作
用を受けるので、従って、ＭＴＸ濃度の調整によって発
現を制御し得る。

【００４３】Ｃ．使用方法 堅固な細胞膜障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用
するときは、トランスフェクションは、Ｇraham及びＶa
nder Ｅb，Ｖirology，５２：５４６(１９７８)に記載
のリン酸カルシウム沈澱法で行なわれる。然しながら、
ＤＮＡの細胞内導入のためには、核注入又はプロトプラ
スト融合の如き他の方法も使用し得る。

【００４４】原核細胞又は堅固な細胞膜障壁を有する細
胞を使用するとき、好ましいトランスフェクションの方
法は、Ｆ.Ｎ.Ｃohen，etal.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.
(ＵＳＡ)，６９：２１１０(１９７２)に記載の塩化カル
シウムを用いたカルシウム処理である。所望のコード配
列及び制御配列を有する適当なベクターの構築には、標
準的に結合方法を使用する。単離されたプラスミド又は
ＤＮＡ断片を開裂し、末端処理し、所望の形に再結合し
て所要プラスミドを形成する。

【００４５】開裂を行なうためには、適当な緩衝液中で
１種(又は複数種)の制限酵素で処理する。一般には、約
１μgのプラスミド又はＤＮＡ断片に対し約１ユニット
の酵素を含む緩衝溶液約２０μlを使用する(特定の制限
酵素に対する適正な緩衝液及び基質量はメーカーによっ
て処方されている)。インキュベーション時間は３７℃
で約１時間である。インキュベーション後、フェノール
及びクロロホルム抽出でタンパクを除去し、エタノール
沈澱により水性画分から核酸を回収する。平滑末端が必
要な場合、生成物を１０ユニットのポリメラーゼI(Ｋle
now)により１５℃で１５分間処理し、フェノール−クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱する。

【００４６】開裂した断片のサイズによる分離は、Ｄ.
Ｇoeddel,et al.，Ｎucleic ＡcidsＲes.，８：４０５
７(１９８０)に記載された６％ポリアクリルアミドゲル
を用いて行なう。この文献を引用して本明細書中に包含
する。結合を行なうためには、正しく整合すべく末端を
適当に処理したほぼ等モル量の所望成分を、０.５μgの
ＤＮＡに対し約１０ユニットのＴ4ＤＮＡリガーゼで処
理する。(開裂されたベクターを成分として使用する場
合、開裂されたベクターの再結合を阻止するために細菌
のアルカリ性ホスファターゼによる予備処理を行なうと
よい。)

【００４７】構築したプラスミドの正しい配列を確認す
べく行なう解析のためには、結合混合物を用いてＥ．co
li Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４４６)を形質
転換し、適当な性質例えばアンピシリンまたはテトラサ
イクリン耐性を利用して所望の形質転換株を選択する。
形質転換株からプラスミドを調製し、制限解析し及び／
又は配列決定する(Ｍessing, et al.，Ｎucleic Ａcids
Ｒes.，９：３０９(１９８１)又はＭaxam, et al.，Ｍ
ethods in Ｅnzymology，６５：４９９(１９８０))。

【００４８】ＤＨＦＲタンパクをコードしている配列の
増幅を行なうには、ＤＨＦＲ活性の競合阻害剤であるメ
トトレキセートを濃度約２０−５００,０００nＭで存在
させて宿主細胞を増殖させる。有効濃度範囲は、勿論、
ＤＨＦＲ遺伝子の性質、タンパク及び宿主の特性に依存
する。従って、上記の上限値及び下限値は確定値ではな
い。ＤＨＦＲを阻害し得る他の葉酸類又は他の化合物を
適正濃度で使用することも可能である。然しながらやは
りＭＴＸが便利で入手し易く有効である。

【００４９】Ｄ．好適具体例の概説 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を以下のように製
造した。 １．組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生する
ヒトメラノーマ細胞をコンフルエントな状態(全面成長)
になるまで培養した。 ２．リボヌクレアーゼ阻害剤の存在下で前記の細胞培養
物から得た細胞ペレットを抽出し細胞質ＲＮＡ全部を単
離した。 ３．オリゴーdＴカラムを用い全メッセンジャーＲＮＡ
(mＲＮＡ)をポリアデニル化形態で単離した。酸性尿素
アガロースゲル電気泳動にかけてmＲＮＡをサイズ分画
した。

【００５０】４．組織プラスミノーゲン活性化因子特異
的ＲＮＡを含むゲル画分を以下の方法で同定した。即
ち、各ゲル画分のＲＮＡをイヌのスイ臓ミクロソームを
補充したウサギ網状赤血球リゼイト系中in vitroで翻訳
した。得られた翻訳産物を次にヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子特異的ＩgＧ抗体で免疫沈降した。 ５．適切なＲＮＡ(２１乃至２４Ｓ)を対応する一重鎖相
補うＤＮＡ(cＤＮＡ)に転換し、該cＤＮＡから二重鎖c
ＤＮＡを製造した。ポリ−dＣを末端につなぎ、１種以
上の表現型マーカーを含むプラスミドの如きベクター内
に挿入した。

【００５１】６．前記の如く調製されたベクターを使用
して細菌細胞を形質転換し、クローン化cＤＮＡライブ
ラリーを調製した。t−ＰＡ中の既知のアミノ酸配列の
コドンと相補的な放射活性標識−合成デオキシオリゴヌ
クレオチドのプールを調製しコロニーライブラリーのプ
ローブに用いた。このようなプールの例として、例え
ば、(既知(後記)のアミノ酸配列:トリプトファン−グル
タミン酸−チロシン−システィン−アスパラギン酸(Ｗ
−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ)をコードする配列と相補的な)８種の
１４ヌクレオチド体(１４−mer)、

【化１】 のプールがある。

【００５２】７．ポジティブな(プローブに対して陽性
反応を示した) cＤＮＡクローンからプラスミドＤＮＡ
を単離し配列決定した。 ８．次に、t−ＰＡをコードしている配列決定したＤＮ
Ａを適当な発現ベクターに挿入すべくin vitroで末端処
理し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、
宿主細胞を培養により増殖させ、所望のヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子を産生させた。

【００５３】９．前記の如く産生されたヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子は、セリンプロテアーゼ酵素部分
に約２５１個のアミノ酸を有しており、その上流にクリ
ングルを含む配列を有する。現在では該配列が線維素結
合の主因であると理解されている。成熟タンパク及びそ
のシグナルプレ配列とは全部で５６２個のアミノ酸を含
む。

【００５４】前記の方法によって実質的に純粋なt−Ｐ
Ａを産生し得る。メトトレキセート感受性の付加的コー
ド配列を用いる本発明方法によれば、抗原的に活性なt
−ＰＡタンパクを、宿主細胞の培養物中で１日に細胞当
り０.１pgより多い量で産生し得る。適当な増幅条件を
使用すると、２０pg／細胞／日より多い量を得ることも
可能である。換言すれば、９×１０^-6Ｐloughユニット
／細胞／日より多いか、又は適当な増幅によって１８×
１０^-4Ｐloughユニット／細胞／日より多いt−ＰＡ活性
を産生するような遺伝子発現レベルが達成される。

【００５５】この点に於いて、本発明では、薬剤として
メトトレキセートを用いる。メトトレキセートは、これ
を摂取し得る細胞には普通致死性を有するが、制御され
たＭＴＸレベルではＤＨＦＲコード配列をコードしてい
る遺伝子の増幅により細胞が増幅することを可能にする
という性質を有している(Ｓchimke,Ｔ.Ｒobert，et a
l.，Ｓcience，２０２：１０５１(１９７８)；Ｊ.Ｌ.Ｂ
iedler，et al.，Ｃancer Ｒes.，３２：１５３(１９７
２)；Ｓ.Ｅ.Ｃhang，et al.，Ｃell，７:３９１(1９７
６)参照)。

【００５６】本発明のこの点の重要性は、ＤＨＦＲ遺伝
子の増幅が、他のタンパクをコードしている関連配列の
増幅をも生起し得ることにある。関連タンパクが、Ｂ型
肝炎表面抗原(ＨＢsＡg)(Ｊ.Ｃhristman，et al.，Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.，７９：１８１５(１９８２))、
Ｅ．coliタンパクＸＧＰＲＴ (Ｒingold,Ｇordon, eta
l.，Ｊ.Ｍolec．and Ａppl.Ｇen.，１：１６５(１９８
１))、及び結合ＤＨＦＲ／ＳＶ４０プラスミド由来内在
性配列(Ｒ.Ｆ.Ｋaufman，et al.，Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.，
１５９：６０１(１９８２))の場合に、前記の増幅現象
が生じる。

【００５７】メトトレキセート耐性を与える別のメカニ
ズムは、メトトレキセートに対するＤＨＦＲタンパクの
結合親和力を低下させること、従ってメトトレキセート
感受性を低下させることである(Ｗ.Ｆ.Ｆlintoff，et a
l.，Ｓomat.Ｃell Ｇenet.，２：２４５(１９７６))。
しかしこの場合にも増幅は同様に生じるであろう。野性
型ＤＨＦＲ、及び自身の結合親和力の低下によりＭＴＸ
耐性になっているＤＨＦＲに対する遺伝子は、どちらも
ＭＴＸの存在により増幅されるようである。即ち、基本
的に、本発明は、ＭＴＸの存在下で、又は形質転換され
た細胞をＭＴＸで予備処理することにより、t−ＰＡ配
列の発現レベルを向上せしめる制御メカニズムを得るた
めに、ＤＨＦＲ配列の増幅が関連タンパクをコードして
いる配列に与えるインパクトを利用している。

【００５８】Ｅ．実施例 以下の実施例は本発明の代表例として示されたものであ
り限定的な性質を持たない。以下に記載の実施例に於い
ては、Ｅ．coli細胞及び導入されるＤＨＦＲタンパクの
コード配列の型に適したＣＨＯセルラインを宿主細胞と
して使用した。然しながら、他の真核細胞及び原核細胞
も同様に本発明方法に適している。

【００５９】Ｅ．１．Ｅ．coliでのヒトt−ＰＡ遺伝子
の発現 Ｅ．１．Ａ．図の説明 図１は、プロテアーゼインヒビター、アプロチニンの存
在下(レーンb)又は不在下(レーンa)で、ヒトメラノーマ
細胞から３時間のパルスの間にin vivoで分泌され免疫
沈降させた〔³⁵Ｓ〕−メチオニンで標識された(１種以
上の)タンパクを示す１０％ＳＤＳアクリルアミドゲル
のオートラジオグラムである。組織プラスミノーゲン活
性化因子特異的ＩgＧによる免疫沈降後、分子量約６５,
０００、６３,０００及び３５,０００を有する３つのバ
ンドが観察された(レーンa)。然しながら、プロテアー
ゼインヒビターの存在下では、分子量３５,０００の種
は観察されなかった(レーンb)。免疫前血清を使用する
といかなる産生物も免疫沈降しなかった(レーンc)。標
準物質として使用した¹⁴Ｃで標識したタンパクの移動及
び分子量をレーンaの左方に示す。即ち、２００,０００
ミオシン(Ｈ鎖);９２,５００ ホスホリラーゼＢ；６８,
０００牛血清アルブミン；４３,０００オバルブミン(ov
albumin)；２５,７００ α−キモトリプシノーゲン；
１８,４００β−ラクトグロブリン。

【００６０】図２は、酸性尿素アガロースゲルから単離
されたＲＮＡ画分を翻訳した産生の免疫沈降物をゲル電
気泳動にかけた結果を示す。イヌのスイ臓ミクロソーム
の存在下で翻訳後に組織プラスミノーゲン活性化因子特
異的ＩgＧで免疫沈降すると画分Ｎo．７及び８で主バン
ドが観察された。このバンドは分子量約６３,０００ダ
ルトンを有する。画分Ｎo．７及び８に移動するmＲＮＡ
のサイズは約２１乃至２４Ｓである。ＲＮＡ尿素ゲル電
気泳動後に決定され且つ見易いように臭化エチジウムで
染色されたリボソームＲＮＡマーカーの位置が適当なゲ
ルレーンの上方に示されている。

【００６１】図３は、

【化２】 プローブを用いた９６個のコロニーのハイブリダイゼー
ションパターンを示す。９６個の形質転換株の各々をマ
イクロタイタープレート上で増殖させ、レプリカ平板法
で処理し、ニトロセルロース膜上で増殖させた。次にコ
ロニーを溶解し、細菌性ＤＮＡを固定し、フィルターを
³²Ｐ−１４ヌクレオチド体(１４量体)(Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ
−Ｄ)プローブとハイブリダイズした。フィルターを洗
浄してハイブリダイズしなかったプローブを除去し、Ｘ
線フィルムに露光した。このオートラジオグラムは４８
個のフィルター(４６００個の独立コロニー)の各々によ
って得られたパターンを示す。Ｎo．２５のフィルター
上のポジティブな組織プラスミノーゲン活性化因子cＤ
ＮＡを有するクローンの例をＥ１０(矢印)で示す。

【００６２】図４は、全長(full length)ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子cＤＮＡの制限エンドヌクレア
ーゼマップである。制限エンドヌクレアーゼ開裂により
生成した断片の数及びサイズの測定には、６％アクリル
アミドゲル電気泳動を用いた。(図５、図６、図７の)核
酸配列によって部位の位置を確認した。最大のオープン
リーディングフレーム(open reading frame, 停止コ
ドンに至るまでの最長のＤＮＡ配列)のコード領域を長
方形で示し、斜線領域は推定されるシグナルペプチド配
列を示す。点描領域は推定される成熟組織プラスミノー
ゲン活性化因子配列(５２７個のアミノ酸)を示す。mＲ
ＮＡの５'末端は左方、３'末端は右方に示す。

【００６３】図５、図６、および図７は、全長ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子cＤＮＡのヌクレオチド配
列及び推定されるアミノ酸配列を示す。成熟配列に先行
する３５個のアミノ酸(−３５乃至−１)は連続した配列
として示されている。この３５個のアミノ酸配列は、成
熟タンパクのセリン(＋１)に先行する約１２乃至１５個
のアミノ酸の親水性 “プロ" 配列を含み、該プロ配列
の前に “従来の" 疎水性シグナルが存在する(５'末端
から−３５まで伸びる)。分泌されたタンパクに於ける
この種のプレ−プロ構造は、既に、例えばプレプロアル
ブミンに関して記載されている。この理論に基く場合、
分泌された組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は全
て、アミノ末端としてのセリン(＋１)から始まるであろ
う。第２の理論によれば、親水性配列が組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の機能に関与すると考えられており、
この機能は、１０,０００ダルトンのペプチドが天然プ
ラスミノーゲンのアミノ末端部分(アミノ末端残基に因
んで名付けられたＧlu−プラスミノーゲン)から開裂さ
れて、Ｌys−プラスミノーゲンとよばれる新しいアミノ
末端を有するより小さい分子となるときにプラスミノー
ゲンで観察されるのと同様な機能であると考えられる。
Ｌys−プラスミノーゲンは、Ｇlu−プラスミノーゲンよ
りも活性化されてプラスミンになり易く、また線維素に
対する親和力もより大きい。プラスミンはＧlu−プラス
ミノーゲンからＬys−プラスミノーゲンへの転換を触媒
することが判明している。この種のコントロールメカニ
ズムは“ポジティブフィードバック”メカニズムとな
る。最初に形成されたプラスミンは、線維素を分解し同
時に天然プラスミノーゲンよりも活性化し易く基質によ
り堅く結合し易いプラスミノーゲン分子を生成する。そ
の結果、線維素の分解が促進される。組織プラスミノー
ゲン活性化因子の親水性ペプチドは同様なメカニズムに
より、その開裂によって線維素への酵素の結合を修飾し
得る。いずれにしても、３５個のアミノ酸配列は、成熟
タンパクのプレ配列と考えられる。

【００６４】図８は、組織プラスミノーゲン活性化因子
発現プラスミドp△ＲＩＰＡ°の構築を示す概略説明図
である。出発プラスミドpＰＡ２５Ｅ１０を先ずＰstＩ
で消化して３７６bp断片を単離し、次に該断片を図示の
如く消化する。図９は、p△ＲＩＰＡ°によって形質転
換された細胞中で得られた発現産物の線維素溶解能のフ
ィブリンプレートアッセイの結果を示す。

【００６５】図１０は、(本発明の)組織プラスミノーゲ
活性化因子のトリプシン消化によるペプチドのＨＰＬＣ
(高速液体クロマトグラフィー)トレース(２１０nmに於
ける吸収)を示す。矢印は、コロニーライブラリーに用
いるヌクレオチドプローブを設計すべく使用されたペプ
チドに対応するピークを示す。このピークで示されるペ
プチドの完全配列は、Ｌ−Ｔ−Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ−Ｖ
−Ｐ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｌであることが知見さ
れた。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の正しいア
ミノ酸配列を確認すべく、他の主たるピークの配列も同
様にして決定され知見された。アミノ酸を示すペプチド
の文字コードを以下に示す。 Ａsp Ｄ アスパラギン酸 Ｉle Ｉ イソロイシン Ｔhr Ｔ スレオニン Ｌeu Ｌ ロイシン Ｓer Ｓ セリン Ｔyr Ｙ チロシン Ｇlu Ｅ グルタミン酸 Ｐhe Ｆ フェニルアラニン Ｐro Ｐ プロリン Ｈis Ｈ ヒスチジン Ｇly Ｇ グリシン Ｌys Ｋ リジン Ａla Ａ アラニン Ａrg Ｒ アルギニン Ｃys Ｃ システィン Ｔrp Ｗ トリプトファン Ｖal Ｖ バリン Ｇln Ｑ グルタミン Ｍet Ｍ メチオニン Ａsn Ｎ アスパラギン

【００６６】トリプチックペプチド解釈(tryptic pept
ide analysis)用のサンプルは以下の如く調製した。１
mgのt−ＰＡを１００倍容の１％ＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して
透析し、凍結乾燥した。乾燥サンプルに、尿素０.３６
１g、ＥＤＴＡ溶液(Ｎa₂ ＥＤＴＡ５０mg／ml)０.０３m
l、トリス緩衝液(１００ml中に１７.３gのトリス塩基及
び２９.７mlの１Ｎ ＨＣlを含有する)０.３ml及び２−
メルカプトエタノール０.０１mlを添加した。

【００６７】Ｈ₂Ｏを添加して容積を０.７５mlに調整
し、サンプルを１mlの気密性バイアルに入れた。バイア
ルを８Ｍ尿素で上端部に５０μlの空間を残すように充
填し、乾燥Ｎ₂で置換し、密封した。室温で４時間イン
キュベートし、５０μlのヨード酢酸(１Ｎ ＮaＯＨ中
５４０mg／ml)を添加し、暗所で１５分間インキュベー
トした。次いで、１％ＮＨ₄ＨＣＯ₃を含浸しフォイルで
包んだSephadexＰＤ−１０カラムにかけ、タンパクを含
有する画分を集めた。(ジフェニルカルバミルクロリド
(ＤＰＣＣ)処理した)トリプシンをt−ＰＡに対して重量
比１:１００で添加し、３７℃で１６時間インキュベー
トした。次いでサンプルを凍結した。ＳynchronＲＰ−
４カラム逆相クロマトグラフィーを使用してＳpectra
Ｐhysics ＳＰ８０００ＨＰＬＣ系でＨＰＬＣ解析し
た。０.１％トリフルオロ酢酸水溶液中アセトニトリル
密度勾配(０〜７０％)を使用してペプチドを溶出した。
２１０nm及び２８０nmに於ける吸収をモニターした。

【００６８】図１１、図１２、および図１３は、Ｅ．co
liでの成熟ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の直接
発現をコードするプラスミドの構築を示す。５０μgの
プラスミドpＰＡ１７をＳau ３ＡI及びＨha Iで消化し、
６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。約０.
５μgの５５bp Ｓau３ＡI−ＨhaI断片を回収した。同様
にして、８０μg のクローンpＰＡ２５Ｅ１０から先ず
３００bp ＰstI−ＮarI断片を単離し次にこの断片をＨh
aIで消化することにより約３μgの２６３bp ＨhaI−Ｎa
rI断片を精製した。全ての消化は３７℃にて１時間を要
して行なわれ、反応産物を溶解し、６％ポリアクリルア
ミドゲルから電気溶出した、図示の２種のデオキシオリ
ゴヌクレオチド５'dＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡ
ＡＧＴ(I)と５'dＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡ
ＴＧ(II)とを固相ホスホトリエステル法により合成した
(文献５１参照)。６０mＭのトリス(pＨ８)、1０mＭのＭ
gＣl₂、１５mＭのβ−メルカプトエタノール及び５０μ
Ｃiの〔γ³²Ｐ〕ＡＴＰ(Ａmersham，５,０００Ｃi mmol
^-1)を含む３０μlの反応容量中で１００pmoleのオリゴ
ヌクレオチドIIをリン酸化し、1２ユニットのＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを添加し、３７℃で１５分間反応
させた。次に、１μlの１０mＭＡＴＰ及び１２ユニット
のＴ４キナーゼを添加し更に３０分間反応させた。フェ
ノール／ＣＨＣl₃抽出後、リン酸化オリゴマーII及び5'
−ヒドロキシオリゴマーIを、０.５μgの溶出５５bp Ｓ
au３ＡI−ＨhaI断片及び２μgの２６３bp ＨhaI−Ｎar
I断片と合せてエタノール沈澱した。これらの断片を、
２０mＭのトリス−ＨＣl(pＨ７.５)、１０mＭのＭgＣ
l₂、１０mＭのジチオスレイトール、０.５mＭのＡＴＰ
及び１０００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む６０
μlの反応液中で、室温にて４時間を要して結合した。
混合物を、４８ユニットのＮarI、２０ユニットのＥco
ＲI及び４０ユニットのＢglIIで１時間消化して(粘着性
Ｓau３ＡI末端相互の結合による重合を阻止し)、６％ゲ
ル電気泳動させた。３３８bpの産物(約０.１μg)を電気
溶出によって回収した。プラスミドpＰＡ２５Ｅ１０を
ＮarI及びＢglIIにより消化して、１６４５bp 断片とし
てt−ＰＡコード配列の残部(アミノ酸１１１−５２８)
を単離した。プラスミドpＬeＩＦＡtrp１０３は、ＬeＩ
ＦＡ遺伝子に対して遠位のＥcoＲI部位が除去された(文
献５３)プラスミドpＬeIＦＡ２５の誘導体(文献５２)で
ある。３μgのpＬeＩＦＡtrp１０３を、２０ユニットの
ＥcoＲI及び２０ユニットのＢglIIを用いて３７℃で９
０分間消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
し、大きい(〜４,２００bp)ベクター断片を電気溶出に
よって回収した。最終的な構築のために、８０ngのＥco
ＲI−ＢglII pＬeＩＦＡtrp１０３断片を、１００ngの
１６４５bp ＮarI−ＢglII断片及び２０ngの３３８bp
ＥcoＲI−ＮarI断片と、室温で１０時間かけて結合し
た。この結合混合物を用いてＥ．coli Ｋ−１２株２９
４を形質転換した。３８個の形質転換株からプラスミド
ＤＮＡを調製しＥcoＲIで消化した。このうち１０個の
プラスミドが所望の６００bp及び４７２bpＥcoＲI断片
を含有していた。ＤＮＡ配列解析により確認すると、こ
れらのプラスミドの１つ(pt−ＰＡtrp１２)がtrpプロモ
ーター、合成ＤＮＡ及びcＤＮＡ間の接合部に所望のヌ
クレオチド配列を有していた。

【００６９】図１４は、本発明の組織プラスミノーゲン
活性化因子発現産物の線維素溶解能のフィブリンプレー
トアッセイの結果を示す。５μg／mlのテトラサイクリ
ンを含むルリアブロス(Ｌuria broth)で１晩培養した
Ｅ．coli Ｗ３１１０／pt−ＰＡtrp１２を、０.２％の
グルコース、０.５％のカザミノ酸及び５μg／mlのテト
ラサイクリンを含むＭ９培地中に１:１００に希釈し
た。細胞を３７℃でＡ₅₅₀０.２になるまで増殖させ、イ
ンドールアクリル酸を最終濃度が２０μg／mlになるま
で添加した。Ａ₅₅₀＝０.５−０.６(〜２×1０⁸細胞／m
l)で遠心してサンプルを採取し直ちに凍結した。細胞ペ
レットを６Ｍの塩酸グアニジンに５×１０⁸細胞／mlで
懸濁させ、１０秒間超音波処理し、２４℃で３０分間イ
ンキュベートし、次いで２５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ
８.０)、２５０mＭのＮaＣl、０.２５mＭのＥＤＴＡ及
び０.０１％のＴween８０に対して４時間透析した。透
析後、サンプルを１３,０００×gで２分間遠心し、１０
μlの上清を分析して組織プラスミノーゲン活性化因子
の活性を定量した。Ｇranelli−Ｐiperno及びＲeichの
方法(文献８７)を準用し、プレートを３７℃で３.５時
間インキュベートし溶解ゾーンを測定した。精製メラノ
ーマ組織プラスミノーゲン活性化因子溶液の希釈液と比
較して定量した。

【００７０】Ｅ.１.Ｂ．組織プラスミノーゲン活性化因
子mＲＮＡの起源 ヒトメラノーマ細胞(Ｂowes)を使用した(この細胞は、
例えばＬeuven Ｒesearch and Ｄevelopment vzb，Ｌeu
ven，Ｂelgium(Ｄr．Ｄ.Ｃollen)等から制限なく自由に
入手可能である。文献８８参照)。炭酸水素ナトリウム
(最終濃度０.１２％)、２mＭのグルタミン及び１０％の
熱失活牛胎児血清を補充した1００mlのＥarles Ｍinima
l Ｅssential Ｍedia(米国バージニア州マックレーンの
Ｆlow laboratories社製)中で、メラノーマ細胞をコン
ルエントな状態になるまで単層培養した。メラノーマ細
胞がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生
したことを確認すべく、２４ウェルマイクロタイター皿
でヒトメラノーマ細胞をコンルエントな状態になるまで
培養した。０.３３μＭのプロテアーゼインヒビター、
アプロチニンの存在下又は不在下で、細胞をリン酸緩衝
生理食塩水(ＰＢＳ)で１度洗浄し、血清及びメチオニン
を含まない培地０.３mlを添加した。７５μＣiの
〔³⁵Ｓ〕−メチオニンを添加し細胞を３７℃で３時間か
けて標識した。３時間で標識した後、培地を細胞から除
去し、免疫沈降のために組織プラスミノーゲン活性化因
子特異的ＩgＧ又は免疫前血清で処理した(文献５４)。
免疫沈降産物を１０％ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳
動させ(文献６３)、平板ゲルを固定し、乾燥し、Ｘ線蛍
光測定した(文献６４,図１参照)。

【００７１】Ｅ.１.Ｃ．メッセンジャーＲＮＡの単離及
びサイズ分画 メラノーマ細胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗard et
al．の方法(文献５５)を準用して抽出した。細胞を遠心
によりペレットにし、次に１０mＭのＮaＣl、１０mＭト
リス−ＨＣl(pＨ７.５)及び１.５mＭのＭgＣl₂に再懸濁
させた。ＮＰ−４０(ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０,米国メ
リーランド州ロックヴィルのＢＲＬ(Ｂethesda Ｒesear
ch Ｌaboratories)社製(最終濃度１％)を添加して細胞
を溶解し、遠心して核をペレット化した。全ＲＮＡを含
む上清を多数回のフェノール／クロロホルム抽出により
更に精製した。水相を０.２ＭＮaＣl溶液にし、次に２
倍容のエタノールを添加して全ＲＮＡを沈澱させた。オ
リゴーdＴセルロースクロマトグラフィーを用い、全Ｒ
ＮＡ調製物からmＲＮＡを精製した(文献５４)。典型的
な収量としては、１０gの培養メラノーマ細胞から５乃
至１０mgの全ＲＮＡ及び５０乃至２００μgのポリ(Ａ)
プラスmＲＮＡが得られた。

【００７２】尿素−アガロースゲル電気泳動を用いてポ
リＡ⁺mＲＮＡ(２００μg)(文献５６)の分画を行なっ
た。１.７５％のアガロース、０.０２５Ｍのクエン酸ナ
トリウム(pＨ３.８)及び６Ｍの尿素から成る平板アガロ
ースゲル(文献５７及び５８)を用いた。電気泳動は２５
ミリアンペア、４℃で７時間実施し、次にゲルをカミソ
リの刃で分割した。各スライスを７０℃で融解し、フェ
ノールで２回、クロロホルムで１回抽出した。次に画分
をエタノール沈澱し、引続いてイヌのスイ臓ミクロソー
ム(文献６１)を補充したウサギ網状赤血球ライゼート系
(Ｂethesda Ｒesearch Ｌab．,文献５９及び６０)中i
n vitroで、以下の如く翻訳してアッセイを実施した。２
５mＭのＨＥＰＥＳ(Ｎ,２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ−２−エンタスルホン酸緩衝液)、４８.３mＭの
塩化カリウム、1０mＭのリン酸クレアチン、各５０mＭ
の１９種のアミノ酸、１.１mＭの塩化マグネシウム、１
６．６mＭのＥＤＴＡ、０.１６mＭのジチオスレイトー
ル、８.３mＭのヘミン、１６.６μg．mlのクレアチンキ
ナーゼ、０.３３mＭの塩化カルシウム、０．６６mＭの
ＥＧＴＡ(エチレングリコール−ビス−(β−アミノエチ
ルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラ酢酸緩衝液)及び２
３.３mＭの塩化ナトリウムを含む最終容量３０μlの溶
液中で２５μＣiの〔³⁵Ｓ〕−メチオニン及び５００ng
の各ゲルスライスＲＮＡを用いて翻訳した。

【００７３】３０℃で９０分間インキュベートした。リ
ボソーム(文献６１)を除去すべくＥＤＴＡを用いて粗ミ
クロソームから調製したイヌのスイ臓ミクロソーム膜
を、文献６２に記載の如くヌクレアーゼで処理し、最終
濃度７Ａ₂₆₀ユニット／mlで翻訳混合物中に存在させ
た。翻訳産物又は免疫沈降翻訳産物を、文献６３に記載
の如く、ドデシル硫酸ナトリウム中に１０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけて解析した。未染色の平板
ゲルを固定し、乾燥して蛍光測定した(文献６４)。

【００７４】各ゲル画分から得られた翻訳産物をウサギ
の抗ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＩgＧ
で免疫沈降させた。主な免疫沈降ポリペプチドバンド
は、分子量約６３,０００ダルトンのＲＮＡ画分Ｎo．７
及び８(２１乃至２４Ｓの移動度)の翻訳産物中に見られ
た。免疫沈降の際に免疫前ＩgＧを使用すると前記のバ
ンドが見られなかった。このことは、これらのポリペプ
チドが組織プラスミノーゲン活性化因子特異的であるこ
とを意味する。

【００７５】Ｅ.１.Ｄ．組織プラスミノーゲン活性化因
子配列を含むコロニーライブラリーの調製 ５μgのゲル分画mＲＮＡ(ゲルスライス７のmＲＮＡ)を
使用し、標準法(文献５２,６５及び６６)で２重鎖、cＤ
ＮＡを調製した。cＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲ
ルでサイズ分画し、３５０bpより長いcＤＮＡ(１２５n
g)を電気溶出した。ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ(文献６７)を用いて３０ngのcＤＮ
Ａにデオキシ(Ｃ)残基をつなぎ、同様にＰstI部位にデ
オキシ(Ｇ)残基(文献６７)を末端に結合したプラスミド
pＢＲ３２２(文献６８)３００ngとアニールした。アニ
ールした混合物を次にＥ．coli Ｋ１２株２９４(ＡＴ
ＣＣＮo．３１４４６)に形質転換し、得られたテトラサ
イクリン耐性コロニーを、５μg／mlのテトラサイクリ
ン含有Ｌ−ブロス(文献９３)を入れたマイクロタイター
プレートの個々のウェルに接種した。４６００個の形質
転換株のcＤＮＡライブラリーをニトロセルロースフィ
ルター上で増殖させ、各コロニーのＤＮＡをフィルター
に固定した(文献６９)。８種のデオキシオリゴヌクレオ
チド

【化３】 を、４種の１４ヌクレオチド体の２種のプール中で固相
ホスホトリエステル法(文献５１)によって化学的に合成
した。³²Ｐ−標識プローブを前記８種の１４ヌクレオチ
ド体(文献５２)のプールから調製した。４６００個の形
質転換株を含有するフィルターのセットを、リン酸ナト
リウム(pＨ６.８)５０mＭ、５×ＳＳＣ、超音波処理サ
ケ精子ＤＮＡ１５０μg／ml、５×デンハルト溶液及び
１０％ホルムアミド中で、前記標識プローブ５×１０
⁷c.p.m.とハイブリダイズした。室温に１６時間放置し
た後、フィルターを室温で６×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤ
Ｓ中で良く洗浄し、次いでＸ−線フィルムに露光した。

【００７６】Ｅ.１.Ｅ．ＤＮＡプローブの調製 文献１９及び２０に記載の方法で精製ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子を得た。合成プローブの作製の最適
領域を見い出すべく分子を以下の如く検査した。

【００７７】タンパクをトリプシン消化し易くするため
に還元及びカルボキシメチル化した。組織プラスミノー
ゲン活性化因子２mgのサンプルを先ず０.０１％Ｔween
８０に対して室温で１晩透析した。凍結乾燥したタンパ
クを次に０.５６Ｍのトリス−ＨＣl緩衝液(pＨ８.６)、
８Ｍの尿素及び５mＭのＥＤＴＡを含む液１２mlに溶解
した。０.１mlのβ−メルカプトエタノールを添加して
ジスルフィド結合を還元した。反応は窒素下４５℃で２
時間行なった。１.４Ｍのヨード酢酸の１ＮＮaＯＨ溶液
１.０mlを添加して還元ジスルフィドをアルキル化しカ
ルボキシメチル化誘導体を得た。室温に２０分間放置
後、０.０１％Ｔween８０に対して室温で１８時間透析
して反応を停止し、凍結乾燥した。

【００７８】得られた凍結乾燥カルボキシメチル化タン
パクを３mlの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７．
５)に再度溶解した。トリプシン(ＴＰＣＫ,Ｌ−１−ト
シルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトンで
処理したトリプシン)を(１:５０の割合で)添加し、３７
℃で消化した。３時間,６時間及び１２時間後にサンプ
ル(０.１ml)を取出した。１２時間後にトリプシンを再
度添加した。２４時間後にサンプルを凍結して反応を停
止し、ＨＰＬＣに注入できるまで保存した。ＳＤＳゲル
によりサンプルの消化の程度を測定した。３時間後のサ
ンプルでかすかなバンドが見られる以外、全てのゲルに
変化はなかった。このことは、２４時間で完全な消化が
行なわれ、大きいペプチドが残存しないことを示す。

【００７９】約０.５mlのサンプルを２系列操作型の高
分解能Ａltex Ｃ−８ウルトラスフェア(ultrasphere)
５μカラムに注入した。アセトニトリルの勾配を徐々に
与えた(５分で１乃至５％,１００分で５乃至３５％, ３
０分で３５乃至５０％)。２系列操作のうちの１系列の
操作で溶出液を２つの波長(２１０nm及び２８０nm)でモ
ニターした。２つの波長での吸収比を用いてトリプトフ
ァンを含むペプチドを検出した。

【００８０】多分トリプトファンを含むと思われるペプ
チドピーク、又は他の理由で有用と考えられたペプチド
ピークの配列決定を最初に行った。これにより大部分の
トリプトファンの周辺の配列を決定し得た。約２５個の
最も可能性があると思われるペプチドピークの配列決定
後、一列に並べた全部の配列データをプールして組織プ
ラスミノーゲン活性化因子の一次構造の予備モデルが得
られた。このデータ及びモデルからいくつかの可能なプ
ローブの位置を決定した。

【００８１】Ｅ.１.Ｆ．組織プラスミノーゲン活性化因
子cＤＮＡ配列を含む細菌クローンの同定 ５μg／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ(文献９３)を
入れたマイクロタイタープレートの各ウェルにコロニー
を１個ずつ接種し、７％までＤＭＳＯを添加して−２０
℃に保存した。コロニーライブラリーの２個のコピーを
ニトロセルロースフィルター上で増殖させ、各コロニー
から得たＤＮＡをＧrunstein Ｈogness法(文献６９)で
フィルターに固定した。

【００８２】

【化４】 プローブを、前記の如く合成オリゴマーから調製した
(前記(Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ)１４ヌクレオチド体プー
ル)。５０mＭのリン酸ナトリウム(pＨ６.８)、５×ＳＳ
Ｃ(文献８０)、１５０μg／mlの超音波処理サケ精子Ｄ
ＮＡ、５×デンハルト溶液(文献８５)及び１０％ホルム
アミド中、４,６００個の形質転換株を含むフィルター
を、室温で２時間プレハイブリダイズし、次に同じ溶液
中で５０×１０⁶カウント／分の標識プローブとハイブ
リダイスした。室温で、一晩インキュベートし、フィル
ターを６×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳ中室温で３０分間
３回洗浄し、２×ＳＳＣで１回洗浄し、次にＤupont
Ｌightning Ｐlus増感スクリーンでＫodak ＸＲ−５
Ｘ線フィルムに１６時間露光した。

【００８３】ボジティブなハイブリダイゼーション反応
を示した１２個のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離
した(文献７１)。次に、断片をＭ１３ベクターmp７(文
献７３)中でサブクローン化した後、クローンから得たc
ＤＮＡインサートの配列を、chain termination 法(文
献７２)及びＭaxam Ｇilbert化学法(文献７４)により決
定した。図３は、ポジティブな組織プラスミノーゲン活
性化因子クローンのハイブリダイゼーションパターンを
示すフィルターNo.２５の図である。コロニー２５Ｅ１
０中のcＤＮＡインサートのアミノ酸配列と、精製組織
プラスミノーゲン活性化因子から得られたペプチド配列
(前記)との比較、及びＥ．coli中で産生される発現産物
(詳細は後記)とから、このcＤＮＡインサートが組織プ
ラスミノーゲン活性化因子をコードするＤＮＡであるこ
とが判明した。クローン２５Ｅ１０(プラスミドpＰＡ２
５Ｅ１０)のcＤＮＡインサートは、(図５、図６、およ
び図７に示すようにヌクレオチド２４３から始まる)２
３０４bpの長さを有しており、その最長のオープンリー
ディングフレームは５０８個のアミノ酸からなるタンパ
ク(ＭＷ５６,７５６)をコードしており、７４５bpの３'
非翻訳領域を含む。このcＤＮＡクローンにはＮ−末端
をコードする配列が欠如している。

【００８４】Ｅ.１.Ｇ.Ｅ．coliでのヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子クローンの直接発現 図８に示す如く、５０μgのpＰＡ２５Ｅ１０(前記)をＰ
stIで消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
３７６bpの断片を単離した。この断片約３μgを電気溶
出でゲルから単離し、３０ユニットのＤdeIを用いて３
７℃で１時間消化し、フェノールクロロホルムで抽出
し、エタノール沈澱させた。これによりＤdeI粘着末端
が得られる。反応混合物に５ユニットのＤＮＡポリメラ
ーゼI(Ｋlenow断片)並びに各０.１mＭのdＡＴＰ,dＣＴ
Ｐ,dＧＴＰ及びdＴＴＰを添加し、４℃で８時間インキ
ュベートして、前記のＤdeI粘着末端を伸ばして平滑末
端とした。フェノール−クロロホルム抽出後、ＤＮＡを
１５ユニットのＮarIで２時間消化し、反応混合物を６
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。約０.５
μgの所望の１２５bp平滑末端−ＮarI断片を回収した。
この断片は、成熟全長組織プラスミノーゲン活性化因子
タンパクのアミノ酸のうちNo.６９からNo.１１０までの
アミノ酸をコードしている。

【００８５】１６４５bp ＮarI−ＢglII断片を単離する
ために、３０μgのpＰＡ２５Ｅ１０を３０ユニットのＮ
arI及び３５ユニットのＢglIIにより３７℃で２時間消
化し、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。約６μgの所望の１６４５bp ＮarI−ＢglI
I断片を回収した。

【００８６】プラスミドp△ＲＩexsrcはプラスミドpＳ
ＲＣex１６(文献７９)の誘導体であり、前者に於いて
は、trpプロモーターに近位でＳＲＣ遺伝子に遠位のＥc
oＲＩ部位がＤＮＡポリメラーゼI(文献２８)で修復する
ことにより除去されており、ホスホトリエステル法(文
献７５)で合成された自己相補的オリゴデオキシヌクレ
オチド ＡＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴがＸbaI部位の
直ぐ隣りの残存ＥcoＲI部位に挿入されている。２０μg
のp△ＲＩexsrcをＥcoＲIで完全に消化し、フェノール
−クロロホルムを抽出し、エタノール沈澱した。次に、
２５mＭの酢酸ナトリウム(pＨ４.６)、１mＭのＺnＣl₂
及び０.３ＭのＮaＣlの中でプラスミドを１００ユニッ
トのヌクレアーゼＳ１で１６℃、３０分間消化し、配列
ＡＴＧをもつ平滑末端を形成した。フェノール−クロロ
ホルム抽出及びエタノール沈澱後、ＤＮＡをＢamＨIで
消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、
大きい(４,３００bp)ベクター断片を電気溶出で回収し
た。

【００８７】０.２μgのベクター、０.０６μgの１２５
bp平滑末端−ＮarI断片及び０.６μgの１６４５bpＮarI
−ＢglII断片とを、１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
で、室温で７時間を要して互いに結合して発現プラスミ
ドを構築し、Ｅ．coli２９４株(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４
４６)をアンピシリン耐性に形質転換すべく使用した。
プラスミドＤＮＡを２６個のコロニーから調製しＸbaI
及びＥcoＲIで消化した。そのうち１２個のプラスミド
が所望の４１５bpＸbaI−ＥcoＲI断片及び４７２bpＥco
ＲI−断片を含んでいた。ＤＮＡの配列決定により、こ
れらのプラスミドのいくつかが、出発点であるアミノ酸
No.６９(セリン)に対して正しく配置されたＡＴＧ開始
コドンを有することが確認された。これらのプラスミド
の１つ、p△ＲＩＰＡ°を試験したところ、所望の組織
プラスミノーゲン活性化因子を産生していた(図９)。

【００８８】Ｅ.１.Ｈ．全長組織プラスミノーゲン活性
化因子cＤＮＡ a)Ｎ−末端組織プラスミノーゲン活性化因子配列を含む
コロニーライブラリーの調製 ０.４μgの合成オリゴヌクレオチド ５'ＴＴＣＴＧＡＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣＧ３'(これはt−ＰＡmＲＮＡのヌクレ
オチド２５６−２７１に相補的である)を合成し(文献５
１)、これをプライマーとして使用し、標準法(文献６５
及び６６)により、７.５μgのゲル画分No.８のmＲＮＡ
(前記)から、二重鎖cＤＮＡを調製した。cＤＮＡを６％
ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画した。３００bpよ
り大きいサイズ画分(３６ng)を電気溶出した。ターミナ
ルデオキシシチジルトランスフェラーゼ(文献６７)を用
いて５ngのcＤＮＡにデオキシ(Ｃ)残基をつなぎ、同様
にＰstI部位(文献６７)にデオキシ(Ｇ)残基をつないだ
５０ngのプラスミドpＢＲ３２２(文献６８)とアニール
した。次にアニールした混合物をＥ．coliＫ１２株２９
４に形質転換した。約１,５００個の形質転換株が得ら
れた。

【００８９】b)ヒトゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイ
ゼーション cＤＮＡのプライミング反応が、クローンpＰＡ２５Ｅ１
０のＮ−末端から１３bpとハイブリダイズした合成断片
を用いて行なわれたので、(１６ヌクレオチド体配列を
含む)この２９bp領域には、cＤＮＡクローンをスクリー
ニングするための適当な制限断片は得られなかった。従
って、Ｎ−末端組織プラスミノーゲン活性化因子をコー
ドしている配列を含みプライマーで伸延したcＤＮＡク
ローンを同定するためには、ヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子ゲノムのクローン(文献７６)を単離すること
が必要であった。

【００９０】このプロセスの第１段階では、唯一の相同
組織プラスミノーゲン活性化因子の遺伝子がヒトゲノム
ＤＮＡ中に存在することを確認した。このためにサザン
ハイブリダイゼーションを実施した。この方法に於いて
は、５μgの高分子量ヒトリンパ球ＤＮＡ(文献８０の如
く調製)を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全に消化
し、１.０％アガロースゲル電気泳動(文献８１)にか
け、ニトロセルロースフィルターにブロットした(文献
７７)。

【００９１】pＰＡ２５Ｅ１０のcＤＮＡインサート(２
３２bpＲsaI−ＰstI断片)の５'末端から³²Ｐ−標識ＤＮ
Ａプローブを調製し(文献７６)、前記ニトロセルロース
フィルターとハイブリダイズした(文献８２)。３５×１
０⁶カウント／分のプローブを４０時間ハイブリダイズ
し、次に洗浄した(文献８２参照)。２種のエンドヌクレ
アーゼ消化パターンから唯一のハイブリダイズＤＮＡ断
片：ＢglII(５.７Ｋbp)及びＰvuII(４.２Ｋbp)が得られ
た。２種のハイブリダイズＤＮＡ断片がＨincII(５.１
Ｋbp及び４.３Ｋbp)で観察された。両者を総合したデー
タによれば、ヒトゲノム中に唯一の組織プラスミノーゲ
ン活性化因子が存在すること、及び該遺伝子が少なくと
も１個の介在遺伝子を有することが判明した。

【００９２】c)組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子
用ヒトλファージライブラリーのスクリーニング 組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子を担うλファー
ジ組換体を同定するために、組織プラスミノーゲン活性
化pＰＡ２５Ｅ１０のcＤＮＡから調製された放射性プロ
ーブとのヌクレオチド相同性を検出する方法を用いた。
１０万個の組織λファージを１０,０００pfu／１５cmプ
レートの密度でＤＰ５０Ｓup Ｆを宿主としてプレート
アウトし、Ｂenton及びＤavisの方法(文献７８)によ
り、各プレート毎にニトロセルロースフィルターレプリ
カを調製した。標準法(文献８３)を使用し、プラスミド
pＰＡ２５Ｅ１０の２３２bpＲsaI−ＰstI断片を用い
て、³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを調製した。５０mＭの
リン酸ナトリウム(pＨ６.５)、５×ＳＳＣ(文献７７)、
０.０５mg／mlの超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５×デン
ハルト溶液(文献８４)及び５０％ホルムアミド中で、各
ニトロセルロースフィルターを４２℃で２時間プレハイ
ブリダイズし、次に、１０％デキストラン硫酸ナトリウ
ム(文献８５)を含む同じ溶液中で、５０×１０⁶カウン
ト／分の標識プローブとハイブリダイズした。４２℃で
１晩インキュベートし、フィルターを０.２×ＳＳＣ及
び０.１％ＳＤＳ中５０℃、３０分間で４回洗浄し、２
×ＳＳＣで室温で１回洗浄し、次にＤupont Ｃronex増
感スクリーンでＸＲ−５ Ｘ−線フィルムに１晩露光し
た。全部で１９個のクローンがプローブとハイブリダイ
ズした。６個の組換体から文献８６に記載の方法でファ
ージＤＮＡを調製した。コロニースクリーニング用のＰ
vuII断片を調製するために、これらのポジティブなハイ
ブリダイゼーションを示す組換体の中からλクローンＣ
を選択した。３０μgのＤＮＡをＰvuIIを用いて３７℃
で１時間消化し、１.０％アガロースゲル電気泳動にか
けた。組織プラスミノーゲン活性化因子をコードする配
列を含有することが既に判明した、４.２Ｋbpの断片を
電気溶出して精製した。後述の如きコロニーハイブリダ
イゼーションを行なうために標準法(文献８３)を用いて
³²Ｐ−標識プローブを調製した。

【００９３】d)５'−組織プラスミノーゲン活性化因子
配列のためのコロニーライブラリーのスクリーニング コロニーをプレートからニトロセルロースフィルターに
移して増殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧrunste
in−Ｈogness法(文献６９)でフィルターに固定した。単
離した組織プラスミノーゲン活性化因子λゲノムのクロ
ーンから４.２ＫbpＰvuII断片の仔牛胸線(文献８３)プ
ライミングによって³²Ｐ−標識プローブを製造した。
１,５００個の形質転換株を含むフィルターを１１２×
１０⁶cpmの³²Ｐ−ゲノムＰvuII断片とハイブリダイズし
た。

【００９４】Ｆritsch et al．により記載された条件
(文献８２)を用いてハイブリダイゼーションを１６時間
継続した。フィルターをよく洗い次にＤupontＬightnin
g−Ｐlus 増感スクリーンと共にＫodakＸＲ−５ Ｘ−
線フィルムに１６乃至４８時間露光した。１８個のコロ
ニーが明らかにゲノムプローブとハイブリダイズした。
プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーの各々から単離
し、ニトロセルロースフィルターに固定し、最初のプラ
イミング反応に使用した³²Ｐ−標識合成オリゴヌクレオ
チド(１６ヌクレオチド体)とハイブリダイズした。１８
個のクローンのうちの７個がキナーゼによって活性化し
た１６ヌクレオチド体とハイブリダイズした。m１３ベ
クターmp７(文献７３)中での断片のサブクローン化後に
配列を解析すると、１種類のクローン(pＰＡ１７)が組
織プラスミノーゲン活性化因子の正しい５'末端領域、
シグナルリーダー配列及び８４bp５'非翻訳領域を含む
ことが判明した。

【００９５】pＰＡ１７のcＤＮＡインサートの長さは２
７１bpである。これはその合成にプライマーとして使用
したヘキサデカヌクレオチド配列を含んでおり、これに
よりそのＤＮＡ配列をpＰＡ２５Ｅ１０の配列と合わせ
て整列することが可能になった。これら２種のcＤＮＡ
クローンpＰＡ２５Ｅ１０及びpＰＡ１７から、t−ＰＡ
のヌクレオチド配列及びそれに対応するアミノ酸配列を
決定した(図５、図６、および図７)。２種のクローンp
ＰＡ２５Ｅ１０及びpＰＡ１７から、図５、図６、およ
び図７の完全ヌクレオチド配列及び全長組織プラスミノ
ーゲン活性化因子クローンの制限パターン(図４)を決定
した。

【００９６】完全な２５３０bp cＤＮＡ配列は単一のオ
ープンリーディングフレームを含んでおり、これはヌク
レオチド８５〜８７のＡＴＧコドンで始まっている。こ
のＡＴＧの下流に５６２個のコドンがあり、その後ヌク
レオチド１７７１〜１７７３にＴＧＡ停止トリプレット
がある。このＡＴＧは、最初に遭遇するものであり、か
つ、このＡＴＧの上流ヌクレオチド４〜６の位置には相
内に停止コドンがあるので、これが恐らく翻訳開始部位
として働いている。アミノ酸 No.１と印したセリンは、
精製メラノーマ細胞t−ＰＡのＮＨ₂−末端の配列決定に
基づいている。このセリンの前に３５個のアミノ酸があ
り、このうちＮＨ₂−末端の２０〜２３個は、t−ＰＡの
分泌に関与する疎水性シグナルペプチドを構成している
と思われる。残りの１２〜１５個の親水性アミノ酸は成
熟t−ＰＡの第一アミノ酸の直前にあり、血清アルブミ
ンに見られるものに類似する“プロ"配列を構成してい
る。３'−非翻訳領域は７５９個のヌクレオチドから成
り、ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ(位置２４９６〜
２５０１)を含んである。このヘキサヌクレオチドは、
多くの真核生物mＲＮＡのポリアデニル化部位の上流に
ある。

【００９７】天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の
分子は、３５個のシステイン残基を有しており、従って
１７個のジスルフィド結合により安定化される可能性を
有する。図１６に示した概略図は、他のセリンプロテア
ーゼとの相同性に基づいて構成される。４個の可能なＮ
−グリコシル化部位があり、このうち３個はクリングル
領域の asn₁₁₇, asn₁₈₄, asn₂₁₈に存在しており、他の
可能な部位はＬ鎖領域のasn₄₄₈に存在している。構造上
のオリゴ糖リガンドの違いが種々の分子形態(分子量６
５,０００及び６３,０００の種)の原因である。

【００９８】アミノ酸分析用のt−ＰＡサンプルは、０.
１％ＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して充分に透析し減圧乾燥して調
製した。残基を６Ｎ ＨＣlに懸濁し、バイアルを真空
密封した。加水分解は１１０℃で２４時間実施した。次
いで、得られた加水分解物をＢeckman Ｓystem ６３０
０アミノ酸分析器で解析した。

【００９９】分子量は、ゲル分析により以下の如く決定
した。Ｌaemmliの方法(文献６３)を使用してＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ゲルは、１０
％アクリルアミド及び０.２７％メチレンビスアクリル
アミドから成っていた。サンプルの還元が必要なときに
は、メルカプトエタノールの代わりにジチオスレイトー
ルを用いて還元し、Ｂio−Ｒad低分子量ＳＤＳ標準混合
物を標準として使用した。Ｍorrissey,Ａnal．Ｂioche
m．１１７, ３０７(１９８１)の方法に従って銀染色を
行なった。

【０１００】種々の分子量を有するt−ＰＡを、溶出液
としてアルギニンを用いてリジン−セファロース上で分
離した。単離したタンパクは、検出可能な量のＳＤＳゲ
ル電気泳動による交差汚染(cross contamination)を含
まなかった。各タイプのタンパクを、先ず還元し、カル
ボキシメチル化し、前記の如くトリプシン消化した。こ
の消化生成物を、Ｃon−Ａ−アガロース(Ｓigma社製)に
かけ、０.２Ｍのα−メチルマンノシドで溶出した。Ｃo
n−Ａ樹脂に結合し、α−メチルマンノシドで溶出する
ペプチドを、前記ＨＰＬＣを用いて解析した。高分子量
のt−ＰＡは３種の主要なペプチドを含んでおり、低分
子量のt−ＰＡは２種のＣon−Ａに結合するペプチドを
含んでいた。これらのペプチドをタンパク質配列分析に
より同定した。その結果、１)両者のタイプのt−ＰＡに
おいて残基１１７及び４４８がグリコシル化されてお
り、対応するトリプチップペプチドがＣon−Ａと結合し
ていること、２)高分子量のタイプのt−ＰＡでは残基１
８４がグリコシル化され、Ｃon−Ａに結合しているが、
低分子量のタイプのt−ＰＡは、グリコシル化残基１８
４を含有しているＣon−Ａに結合するペプチドを含んで
いないこと、及び、３)残基２１８のアスパラギンがグ
リコシル化されていないようであることが判明した。

【０１０１】Ｅ.１.I．Ｅ．coli中での全長組織プラス
ミノーゲン活性化因子cＤＮＡクローンの直接発現 部分クローンpＰＡ１７とpＰＡ２５Ｅ１０との双方に共
通のＨhaI制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることに
より、完全コード配列の再構築が可能であった。アミノ
酸５−２３に対応する５５bp Ｓau３ＡI−ＨhaI制限断
片をプラスミドpＰＡ１７から単離した。Ｓau３ＡI制限
部位は推定成熟コード配列のコドン４に位置しており、
シグナルペプチドをコードする領域を除去すべく使用し
た。同様に(アミノ酸２４−１１０をコードする)２６３
bpＨhaI−ＮarI断片をプラスミドpＰＡ２５Ｅ１０から
単離した。アミノ酸１−４のコドンを再生しＡＴＧ翻訳
開始コドンを組込んでＥcoＲI粘着末端を形成する２種
の合成デオキシオリゴヌクレオチドを設計した。次に、
これら３種の断片を互いに結合し、アミノ酸１−１１０
をコードする３３８ bp断片を形成した。次に該断片及
びpＰＡ２５Ｅ１０から得た１６４５bpＮarI−ＢglII断
片を、プラスミドpＬe ＩＦＡ trp１０３(文献５３)の
ＥcoＲI部位及びＢglII部位の間に結合し、発現プラス
ミドpt−ＰＡtrp１２を調製した。trpプロモーター、オ
ペレーター及びtrpリーダーペプチドのシャイン−ダル
ガルノ配列を含むがリーダーペプチドＡＴＧ開始コドン
(文献５２)を含まないＥ．coli trpオペロンの３００b
p断片の制御下でクローン化t−ＰＡ遺伝子を転写した。

【０１０２】プラスミドpt−ＰＡtrp１２を含むＥ．col
i Ｋ１２株 Ｗ３１１０(ＡＴＣＣＮo.２７３２５)を
増殖し、線維素溶解能アッセイのための抽出物を調製し
た。組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を測定する
１つの方法としてフィブリンプレートアッセイ(文献８
７)がある。この方法では、プラスミノーゲン及び線維
素を含むアガロースプレート中でのプラスミンによる線
維素の消化の程度を測定することによってプラスミン生
成量を測定する。プラスミンはフィブリンプラスミン中
に透明な溶解ゾーンを形成し、このゾーンの面積をサン
プル中の組織プラスミノーゲン活性化因子の量と相関さ
せ得る。フィブリンプレートアッセイを使用して、pt−
ＰＡtrp１２クローンから得た抽出物の組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の活性を試験すると、透明溶解ゾーン
が明らかである。この線維素溶解能は抗t−ＰＡＩgＧに
よって阻害されるが、免疫前ＩgＧ又は抗ウロキナーゼ
ＩgＧによっては阻害されない。対照として白血球イン
ターフェロンプラスミドpＬeＩＦＡ trp１０３を含む細
胞から得られた抽出物について試験したところ、活性は
全く検出されなかった。精製 t−ＰＡについて得られた
標準曲線によれば、１０⁹個の細胞当たり約２０ユニッ
トの抽出活性が得られると推定し得る(精製t−ＰＡで
は、９０,０００Ｐlough)ユニット＝１mg)(図１４)。

【０１０３】Ｅ.１.Ｊ．配列解析 配列解析はＥdman分解(文献８３b)に基づいて行なっ
た。サンプルをＢeckman８９０Ｂ又は８９０Ｃスピンカ
ップシーケンサー(spinning cup sequencer)のカツプ
に導入した。カツプ内の担体として、ポリブレンＴＭ
(ポリ−Ｎ,Ｎ,Ｎ¹,Ｎ¹−テトラメチル−Ｎ−トリメチレ
ンヘキサメチレン ジアンモニウム ジアセテート)(文
献６３c)を使用した。シーケンサーを寒冷トラップ及び
いくつかのプログラム変化によって変更し、バックグラ
ウンドピークを低減させた。試薬としては、Ｂeckman's
シーケンスグレード０.１Ｍ Ｑuadrol緩衝液、フェニ
ルイソチオシアネート及びヘプタフルオロ酪酸を用い
た。

【０１０４】収集したＥdmanサイクルをマニュアルに従
って２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体に転換し
た。１−クロロブタンを窒素下で乾燥した。次いで、
１.０ＮのＨＣl水溶液を２−アニリノ−５−チアゾリノ
ンに添加し、７０℃で１０分間加熱して３フェニル−２
−チオヒダントイン(ＰＴＨ誘導体)に転換した。次に、
ＰＴＨ−アミノ酸残基を５０％アセトニトリル及び水に
溶解し、逆相高圧液体クロマトグラフに注入した。次
に、転換バイアル内に導入されシーケンサーからのサイ
クルと同様にして処理されたＰＴＨ−アミノ酸の標準混
合物の保持時間との比較によって各ＰＴＨ−アミノ酸を
同定した。

【０１０５】Ｅ.１.Ｋ．組織プラスミノーゲン活性化因
子の発現検出アッセイ １．プラスミン形成の直接アッセイ a．理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の感度のよいアッセイ
は、組織プラスミノーゲン活性化因子が触媒するプラス
ミノーゲンからプラスミンへの転換をモニターして行な
うことができる。プラスミンは色素原基質アッセイが可
能な酵素である。これらのアッセイは、発色団のトリペ
プチドのタンパク分解的開裂に基づく。開裂速度は、被
検プロテアーゼの特異性及び濃度の双方に直接関連す
る。組織プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液をプラ
スミノーゲン溶液とインキュベートした後に形成される
プラスミンの量の測定がアッセイのベースとなる。活性
化因子の量が多い程、形成されるプラスミンの量も多
い。(Ｋabi Ｇroup, Ｉnc.,Ｇreenwich, ＣＴから購
入した)色素原基質Ｓ２２５１の開裂をモニターするこ
とによりプラスミンを測定する。

【０１０６】b．手順 サンプルを(０.０１２ＭのＮaＣlを含む０.０５Ｍのト
リス−ＨＣl, pＨ７.４中の)０.７mg／mlのプラスミノ
ーゲン０.１０mlと混合し容量を０.１５mlに調整する。
混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、０.３５m
lのＳ２２５１(上記緩衝液中の１.０mＭ溶液)を添加
し、３７℃で反応を３０分間継続する。氷酢酸(２５μ
l)を添加して反応を停止させる。サンプルを遠心し４０
５nmでの吸収を測定する。標準ウロキナーゼ溶液との比
較により活性量が定量できる。溶液にフィブリノーゲン
(０.２mg)を添加し、これにより全長組織プラスミノー
ゲン活性化因子を検出すべくアッセイ条件を変更した。
フィブリノーゲンは検出される組織プラスミノーゲン活
性化因子の活性を刺激し、従って活性レベルをやや上昇
させる。活性をＰloughユニットで記録した。９０,００
０Ｐloughユニットは、精製組織プラスミノーゲン活性
化因子１mgが示す活性に等しい。

【０１０７】２．プラスミン形成の間接アッセイ a．理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の活性の感度の良いア
ッセイが開発された(文献８７)。このアッセイは、線維
素及びプラスミノーゲンを含む寒天プレート中でのプラ
スミンによる線維素消化の程度を測定することによって
プラスミン形成を決定することに基づく。プラスミンは
フィブリンプレート中に透明な溶解ゾーンを形成する。
この溶解ゾーンの面積をサンプル中の組織プラスミノー
ゲン活性化因子の量と相関させ得る。 b．手順 Ｇranelli−Ｐiperno及びＲeichの方法(文献８７)に準
じて、プレートを３７℃で３.５時間インキュベートし
て溶解ゾーンを測定した。標準ウロキナーゼ溶液との比
較によって定量をおこなった。

【０１０８】Ｅ.１.Ｌ．組織プラスミノーゲン活性化因
子の活性の検出 １．細菌増殖及びサンプル調製 ２０μg／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ増殖培地
を入れた試験管にプラスミド p△ＲＩＰＡ°を含むＥ．coliコロニーを接種した。細
胞を３７℃で１晩増殖させた。この培養物のサンプル
を、２０μg／mlのアンピシリンを含む３００mlのＭ９
培地に１:１００で希釈した。細胞を３７℃の振盪フラ
スコ中で４時間増殖したところ、５５０nmの吸光度が
０.４１９になった。トリプトファンに類似のインドー
ルアクリル酸を濃度３０μg／mlまで添加した。細胞を
９０分間インキュベートしたところ、５５０nmの吸光度
が０.６２８になった。遠心により細胞を回収し、０.０
１ＭのＥＤＴＡを含む０.８mlの０.０１Ｍトリス(pＨ
８.０)に再懸濁させた。得られた懸濁液を室温で１８時
間急激に撹拌した。サンプルを遠心し、上清を用いて組
織プラスミノーゲン活性化因子の活性をアッセイした。
pt−ＰＡtrp１２の発現に関しては、Ｅ.１.Ａ．図１４
の説明に於ける詳細な記載を参照されたい。

【０１０９】２．活性検出 表１および表２は、アッセイに用いたＥ．coli抽出物の
各々が示したプラスミノーゲンの活性化の結果を示す。
活性はプラスミノーゲンの存在に依存して発生する(表
１参照)。この活性は、ウサギの免疫前血清の影響を受
けないが、精製メラノーマ細胞から誘導された組織プラ
スミノーゲン活性化因子(文献８８)に対する抗血清によ
り顕著に阻害される(表１及び表２参照)。これは、Ｅ．
coli抽出物がプラスミノーゲンを活性化する活性を生成
し、この活性が組織プラスミノーゲン活性化因子に対す
る抗体によって阻害されることを示す。

【０１１０】図９は線維素溶解能に関するフィブリンプ
レートアッセイの結果を示す。中央の縦列の下から上に
向かって濃度０.２４、０.１４、０.１０、０.０５及び
０.０２Ｐloughユニットで標準量のウロキナーゼを添加
した。右側の縦列は、各ウェルに同量の酵素を添加した
天然組織プラスミノーゲン活性化因子のサンプルであ
り、同縦列の下から上に向かって組織プラスミノーゲン
活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子＋免疫前
血清、組織プラスミノーゲン活性化因子＋組織プラスミ
ノーゲン活性化因子抗体が各ウェルに収容されている。
左側の縦列の各ウェルは８μlの組換組織プラスミノー
ゲン活性化因子Ｅ．coli抽出物を収容しており、下から
上へ向かって、第１ウェルは抽出物のみ、第２ウェルは
免疫前血清が添加された抽出物及び第３ウェルは組織プ
ラスミノーゲン活性化因子抗体が添加された抽出物をそ
れぞれ含む。免疫前血清が天然及び組換組織プラスミノ
ーゲン活性化因子に影響を与えないこと、並びに組織プ
ラスミノーゲン活性化因子抗体が天然抽出物及びＥ．co
li抽出物の双方の活性を阻害することが明らかである。
ウロキナーゼ標準に基づいて、抽出物は２.５Ｐloughユ
ニット／mlよりやや少ない活性を含有している。この値
は表１の１.３Ｐloughユニット／mlより有利である。

【０１１１】以下の表１及び表２は前記のＥ.１．Ｋ.
１．bに記載の如く実施されたアッセイの結果を示す。

【表１】 p△ＲＩＰＡ°を含むＥ．coli培養抽出物によるプラスミノーゲン活性化 パーセント 計算値 サ ン プ ル Ａ₄₀₅ 活性¹ loughユニットm 抽出物(プラスミノーゲン非含有) 0.043 ( 0) 抽出物 0.451 (100) 1.3 抽出物＋免疫前血清 0.477 106 1.4抽出物＋抗t−ＰＡ抗体 0.079 9 注)１．得られた値からブランク(０.０４３)を減算し抽
出物で得られた値で除算したパーセント活性。

【０１１２】

【表２】 pt−ＰＡtrp１２のＥ．coli培養抽出物によるプラスミノーゲン活性化 サ ン プ ル Ａ₄₀₅ パーセント活性 抽出物 0.657 (100) 抽出物＋免疫前血清 0.665 101 抽出物＋抗t−ＰＡ抗体 0.059 9

【０１１３】図１４は、組織プラスミノーゲン活性化因
子発現プラスミドを含むＥ．coliの１０Ｌ発酵培養物か
らの抽出物を用いて実施したフィブリンプレートアッセ
イの結果を示す。組織プラスミノーゲン活性化因子を含
む抽出物の線維素溶解能が図１４のウェルaで示される
この線維素溶解能は抗t−ＰＡ ＩgＧ(ウェルc)により
阻害されるが、免疫前ＩgＧ(ウェルb)又は抗ウロキナー
ゼＩgＧ(ウェルd)では阻害されない。また、対照として
の白血球インターフェロンプラスミドpＬe ＩＦＡtrp１
０３(ウェルh)を含む細胞で調製された抽出物では活性
が全く検出されない。ウェルe、ウェルf及びウェルgは
それぞれ０.２、０.１及び０.０２ユニットの精製され
たメラノーマt−ＰＡを含む。

【０１１４】Ｅ.２ ＭＴＸに対する結合親和力の低い
ＤＨＦＲタンパクを使用するt−ＰＡの産生 Ｅ.２.Ａ．ベクターの構築 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t−ＰＡ)をコー
ドする配列をＭＴＸに対する結合親和力の低い突然変異
ＤＨＦＲを含む発現プラスミドに以下の手順で挿入する
(図１５)(ヨーロッパ特許出願公開第１１７,０６０号お
よび対応する特開昭５９−１９２０８９号公報参照)。

【０１１５】オーバーラップするt−ＰＡプラスミド、p
ＰＡ２５Ｅ１０、pＰＡ１７及びpt−ＰＡtrp１２(前記)
から３種の断片を以下の如く調製した。プラスミドpＰ
Ａ１７をＤdeIで消化し、Ｋlenow ＤＮＡ ポリメラー
ゼIを用いて充填し、ＰstIで再度切断した。その結果生
成された５'末端t−ＰＡ配列を含む約２００bpの断片を
単離した。第２のt−ＰＡ断片を得るために、pt−ＰＡt
rp１２をＰstI及びＮarIで消化し、約３１０bpの断片を
単離した。第３のt−ＰＡ断片を得るために、pＰＡ２５
Ｅ１０をＮarI及びＢglIIで消化し、約１６４５bpの断
片を単離した。最後の断片はt−ＰＡをコードする領域
の殆どを含んでおり更にいくらかの３'非翻訳配列を含
んでいる。

【０１１６】ＨＢＶ表面抗原を発現するプラスミドpＥ
３４２(pＨＢs３４８−Ｅとも指称される)は、１９８３
年３月９日付で公開されたＬevinson et al．のヨー
ロッパ特許出願公開第００７３６５６号および対応する
特開昭５８−５６６８５号公報に記載されている。該出
願を引用して本明細書中に包含する。要約すれば、サル
ウィルスＳＶ４０のオリジンを単離するために、ＳＶ４
０ ＤＮＡをＨindIIIで消化してコンバーター(ＡＧＣ
ＴＧＡＡＴＴＣ)を添加してＨindIII末端に変換した。
このＤＮＡをＰvuIIで切断しＲＩリンカーを添加した。
ＥcoＲIで消化後、オリジンを含む３４８bp断片をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及び電気溶出で単離し、p
ＢＲ３２２中でクローン化した。ＨＢＶ(Ａnimal Ｖir
us Ｇenetics, (Ｃh.５)Ａcad．Ｐress, Ｎ．Ｙ．(１
９８０))のＥcoＲI及びＢglIIによる消化で得られた１
９８６bp断片(これはＨＢs Ａgをコードする遺伝子を含
んでいる)を、ＥcoＲI部位及びＳamＨI部位でプラスミ
ドpＭＬ(Ｌuskyet al., Ｎature, ２９３:７９(１９８
１))にクローン化して発現プラスミドpＨＢs３４８−Ｅ
を構築した。(pＭＬは、サル細胞中でのプラスミド複製
を阻害する配列が除去された欠失を有するpＢＲ３２２
の誘導体である)。得られたプラスミド(pＲＩ−Ｂgl)を
次にＥcoＲIで直線化し、ＳＶ４０のオリジン領域を示
す３４８bp断片をpＲＩ−ＢglのＥcoＲI部位に導入し
た。オリジン断片はいずれの配向でも挿入され得る。こ
の断片は複製のオリジン以外に初期及び後期のＳＶ４０
のプロモーターをコードしているので、オリジンの配向
次第でどちらかのプロモーターが作用し該プロモーター
の制御下でＨＢＶ遺伝子が発現し得た。(pＨＢＳ３４８
−Ｅは初期プロモーターの制御下で発現したＨＢsを示
す)。pＥ３４２を修飾するために、pＥ３４２をＥcoＲI
で部分消化し、Ｋlenow ＤＮＡポリメラーゼIを用いて
開裂部位を充填し、プラスミドを再結合し、これによ
り、pＥ３４２中のＳＶ４０オリジンに先行するＥcoＲI
部位を除去する。得られたプラスミド即ち pＥ３４２△
Ｒ１をＥcoＲIで消化し、Ｋlenow ＤＮＡポリメラーゼ
Iを用いて充填し、ＢamＨIで再度切断する。アクリルア
ミドゲル電気泳動後、約３５００bp断片を電気溶出し、
フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ
る。

【０１１７】前記の如く調製されたpＥ３４２ ３５０
０bpベクター及び約２１６０bpの前記t−ＰＡ断片を標
準法により互いに結合した。t−ＰＡをコードする３種
の断片を適正方向で含むプラスミドを単離し、特性決定
し、pＥ３４２−t−ＰＡと命名した。このプラスミドを
ＳacIIで消化し細菌性アルカリ性ホスファターゼ(ＢＲ
Ｌ社製)で処理した。ＤＨＦＲ配列を(該配列の発現用制
御配列と共に)与えるために、pＥＨＥＲのＳacII消化に
よって約１７００bpの断片を生成した。(pＨＥＲは前記
米国特許出願第４５９,１５１号明細書および対応する
特許出願公開第１１７０６０号並びに特開昭５９−１９
２０８９号公報に記載の突然変異ＤＨＦＲを発現するプ
ラスミドである)。即ち、pＥＨＥＲは図１７に示す如く
調製されたプラスミドであり、pＥ３４２は１９８３年
３月９日付で公開されたＬevinson等のヨーロッパ特許
出願公開第００７３６５６号および対応する特開昭５８
−５６６８５号公報に記載されており、pＨＢＶ−Ｔ−
１Ａ及びpＳＶＲはＬiu等のＤＮＡ、１:２１３(１９８
２)に記載されており、pＦＲ４００は以下の如く調製さ
れる。

【０１１８】ＳＶ４０複製オリジンを含む５４０bpのＨ
indII−ＨindIII断片(Ｌiu等、ＤＮＡ １: ２１３(１９
８２))をＥcoＲI部位とＨindIII部位との間でプラスミ
ドpＭＬ(Ｍ.Ｌusky及びＭ.Ｂotchan.，Ｎature，２９
３：７９(１９８１))に結合した。ＨindIIIで消化する
前に４dＮＴＰの存在下でＫlenow ＤＮＡポリメラーゼI
を添加して該プラスミドのＥcoＲI部位とＳＶ４０のＨi
ndII部位とを平滑末端化した。得られたプラスミドpＥ
ＳＶをＨindIII及びＢamＨIにより消化し、２９００bp
のベクター断片を単離した。該断片に対し、ＥcoＲI部
位にポリリンカー(多数制限部位を含むＤＮＡ断片)を含
むように修飾されたＨＢＶからの２０２５bpのＨindIII
−ＢglII断片を結合した。ＨＢＶ断片は表面抗原遺伝子
を含んでおり、前出のＬiu等, ＤＮＡ１:２１３, １９
８２に記載の如くクローン化したＨＢＶＤＮＡのＥcoＲ
I−ＢglII消化によって得られる。二重鎖リンカー ＤＮ
Ａ断片(５'dＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡ
ＴＴＣ３'・・・)をＨindIII及びＥcoＲIによって消化し、
ＨＢＶ断片に付加し、ＥcoＲI−ＢglII断片をＨindIII
−ＢglII断片に転換した。リンカーとＨＢＶ断片とベク
ターとから成る三部分を同時に結合することも可能であ
るが、先ずＨindIII−ＥcoＲIリンカーをクローン化し
たＨＢＶ ＤＮＡに付加し、次に制限酵素を用いるプラ
スミドの同時消化によってＨindIII−ＢglII断片を切除
する方法がより有利であるためこの方法を使用した。得
られたプラスミドpＣＶＥＳＶＨＢＶは、pＢＲ３２２由
来のpＭＬからの細菌性複製オリジンと同じくpＭＬから
のアンピシリン耐性マーカーと、消化ＨＢＶ断片の転写
を初期プロモータが指示するように配向されたＳＶ４０
断片とＨＢＶからの表面抗原遺伝子とを含む。ＨＢＶ断
片はまた哺乳類細胞の細胞質に通常形成される如きポリ
アデニル化 mＲＮＡを産生するためのポリアデニル化シ
グナルを与える。ＨＢsＡgコード領域は、ＥcoＲIによ
る消化と前記の如きＫlenow ＤＮＡポリメラーゼによ
る末端充填とＢamＨIによる部分消化とによって除去さ
れる。ＤＨＦＲをコードするcＤＮＡからのＦnu４ＨＩ
−ＢglII断片が該領域に挿入される。得られたプラスミ
ドは図１８に示されている。pＦＤ１１は野性型ＤＨＦ
Ｒ cＤＮＡプラスミドpＤＨＦＲ−１１(Ｎunberg等,
Ｃell １９:３５５(１９８０))のＦnu４ＨI−ＢglII断
片を用いて構築されたものであり、pＦＲ４００はpＦＲ
４００．１２からの同様の断片を用いて構築されたもの
である。

【０１１９】pＲ４００．１２は、メトトレキセート耐
性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含む組換プラスミ
ドであり、突然変異３Ｔ ６Ｒ４００細胞(Ｄ．Ａ．Ｈa
ber及びＲ．Ｔ．Ｓchimke, Ｃell．２６:３５５(１９８
１))から mＲＮＡを単離し、単離 mＲＮＡから cＤＮＡ
ライブラリーを調製し、ＰstI開裂 pＢＲ３２２にcＤＮ
Ａを結合し、Ｅ．coli株２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)
を形質転換し、ネズミのＤＨＦＲ cＤＮＡ(Ｊ.Ｈ.Ｎun
berg等, 前出)からの cＤＮＡインサートのＰstI−Ｂgl
II消化物を用いて形質転換体をプローブし、適正な突然
変異ＤＨＦＲコード配列を有するプラスミドを含むコロ
ニーを選択することによって調製される。この断片をp
Ｅ３４２−t−ＰＡプラスミドに結合し、pＥＴＰＡＥＲ
４００を作製した。該プラスミドはpＥＨＥＲに類似し
ているがＨＢsＡgをコードする領域が t−ＰＡからのc
ＤＮＡ配列で置換されている。

【０１２０】Ｅ.２．Ｂ t−ＰＡ配列の発現及び増幅 Ｇraham及びＶan der Ｅb の方法(前記)でpＥＴＰＡＥ
Ｒ４００(pＥＴＰＥＲ)をdhfr^-ＣＨＯ−ＤＵＸ Ｂ１１
細胞及びＤＨＦＲ ＣＨＯ−Ｋ１(ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１)
細胞にトランスフェクトした。グリシン、ヒポキサンチ
ン及びチミジンを含まない培地で増殖し形質転換された
dhfr細胞を選択した。１００nＭ以上のＭＴＸ中で増殖
して形質転換されたＤＨＦＲ細胞を選択した。適当な選
択培地上に発生したコロニーを、クローン化したリング
で単離し同じ培地中で数世代まで増殖した。

【０１２１】増殖のために、コロニーから細胞を分割し
て５×１０⁴,１０⁵, ２.５×１０⁵, ５×１０⁵及び１０
⁶nＭのＭＴＸを含む培地に入れ、この操作を数回繰返し
た。極めて低い細胞密度(１０²−1０³細胞／プレート)
で細胞を１０cmの皿にプレートし、得られたコロニーを
単離した。

【０１２２】Ｅ.２．Ｃ アッセイ方法 トランスフェクトされ増幅されたコロニー中のt−ＰＡ
の発現は、Ｅ.１．Ｋ.１．bで説明した方法(前記)と同
様の方法で簡便に検定され得る。ＤＨＦＲ及びt−ＰＡ
配列の同時増幅は、増幅されたコロニーのコンフルエン
トな単層から下記の如くＤＮＡを単離してアッセイす
る。１５０mmプレートのコンフルエントな単層を５０ml
の無菌ＰＢＳで洗浄し、５mlの０.１％ＳＤＳ、０.４Ｍ
ＣaＣl₂及び０.１Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ８)を添加して溶解
する。５乃至１０分後、混合物を取出し、フェノール抽
出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させる。
０.１mg／mlまでＲＮaseを添加した１０mＭトリス−Ｈ
Ｃl ( pＨ８)及び１mＭ ＥＤＴＡ(ＴＥ)からなる液１m
l (１５０mmプレート当たり)にＤＮＡを再懸濁させ、溶
液を３７℃で３０分間インキュベートする。次にＳＤＳ
を０.１％まで添加し、プロナーゼ(シグマ社製)を０.５
mg／mlまで添加する。３７℃で３乃至１６時間インキュ
ベートした後、溶液を再度フェノール抽出、クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱させる。ＤＮＡペレットを
０.５mlの水に再懸濁させ、制限酵素で消化する。約５
乃至１０μgの消化ＤＮＡをアガロースゲル [１％のア
ガロースを含むトリス−酢酸緩衝液 (４０mＭトリス、
１mＭ ＥＤＴＡ、酢酸でpＨ８.２に調整)]の電気泳動
にかける(Ｃrouse et al., Ｊ．Ｂiol．Ｃhem., ２５
７:７８８７(１９８２))。ブロモフェノールブルー染料
がゲルの厚み２／３まで移行した後、ゲルを取出し臭化
エチジウムで染色する。紫外線でＤＮＡを見えるように
し、サザン法(Ｊ．Ｍol．Ｂiol., ９８: ５０３(１９７
５))によりＤＮＡをゲルからニトロセルロースフィルタ
ーに移行させる。次にフィルターを、(前記の如く調製
されハイブリダイズされた)pＥＨＥＲの１７００bpＳac
II断片から製造されたニック翻訳プローブとハイブリダ
イズさせる。

【０１２３】Ｅ.３ 野性型ＤＨＦＲタンパクを使用す
るt−ＰＡの産生 Ｅ.３．Ａ ベクターの構築 pＥＴＰＥＲの構築に使用した方法と同様の方法で、野
性型ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド
pＥＴＰＦＲを構築した。実施例Ｅ.２．Ａに記載の如く
構築するが、ＤＨＦＲタンパク遺伝子配列の起源として
プラスミドpＥＨＥＲの代わりに、プラスミドpＥ３４
２．ＨＢＶ．Ｅ４００, Ｄ２２(米国特許出願番号４５
９,１５２号(１９８３年１月１９日出願)および対応す
るヨーロッパ特許出願第１１７,０５８号および対応す
る特開昭５９−１７３０９６号公報参照)を使用した。
野性型ＤＨＦＲと突然変異株ＤＨＦＲとの間の１個の塩
基対の相違以外はプラスミドpＥ３４２．ＨＢＶ．Ｅ４
００．Ｄ２２はpＥＨＥＲと同様である。該プラスミド
はpＦＤ１１をpＦＲ４００に置きかえてpＥＨＥＲと同
様にして構築される(図１７及び図１８参照)。又は、図
１９の pＥ３４２．Ｄ２２は pＤＨＦＲ−１１(Ｎunber
g,前出)から由来しており、(pＥ３４２の初期プロモー
タの上流のＥcoＲI部位の欠失により得られた)pＥ３４
２△Ｒ１は図２０に記載されている。従って、得られる
プラスミドpＥＴＰＦＲは全ての点でpＥＴＰＥＲと類似
しているが、突然変異ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列
の代わりに、野性型ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列が
含まれている。

【０１２４】Ｅ.３．Ｂ t−ＰＡ配列の発現 Ｇraham およびＶan der Ｅbのリン酸カルシウム沈
澱法によりpＥＴＰＦＲを使用してＤＨＦＲが欠如した
ＣＨＯ細胞(Ｕrlaub及びＣhasin(前記))をトランスフェ
クトした。選択用培地(−ＨＧＴ)で発生した２１個のコ
ロニーをアッセイするために、Ｇranelli−Ｐiperno, e
t al.,Ｊ．Ｅxp．Ｍed., １４８:２２３(１９７８)に
記載の如く、線維素及びプラスミノーゲンを含む寒天プ
レート中の線維素の消化によって測定されるプラスミン
形成を検出した。

【０１２５】次にＥ.１．Ｋ.１．b．に記載の方法によ
り、最もポジティブなクローンのうち４個の細胞当たり
のプラスミン形成を定量的に検定した。前記の如き定量
的測定により、４個の被検クローンが、ユニット／細胞
／日で示すと、等しいか又は同等の培地内 t−ＰＡ分泌
を示すことが知見された。２個のクローンからの接種物
を−ＨＧＴ培地を含む別のプレートに移してサブクロー
ンを調製した。得られたサブクローンのうちの２種、１
８Ｂ及び１を使用してさらに解析を進めた。

【０１２６】Ｅ.３．Ｃ 増幅及びt−ＰＡ産生レベル 増幅を促進すべく前記サブクローンを５０nＭのＭＴＸ
中で１００mmプレート当たり２×１０⁵の細胞を含むよ
うにプレートした。生存した細胞を前記の如くアッセイ
すると、全ての場合に、未増幅の組織プラスミノーゲン
活性化因子の活性の約１０倍の活性が検出された。これ
らのクローンの２個を選択して１−１５及び１８Ｂ−９
と命名し更に研究を進めた。サブクローン１−１５を更
に増幅するために、５００nＭのＭＴＸを含む１００mm
プレートに２×１０⁵個の細胞を接種した。このように
して増幅された細胞のアッセイによれば、t−ＰＡ産生
量は更に増加していた(約３倍)。

【０１２７】Ｅ.１．Ｋの方法で定量的に検定するとレ
ベルは７×１０^-4ユニット／細胞／日であった。次に、
これらの増幅細胞の一部分を１０,０００nＭのＭＴＸの
存在下に移して維持した。サブクローン１−１５及び１
８Ｂ−９を表３に示した条件で約１乃至２カ月維持した
後に再度検査した。

【０１２８】

【表３】 セルライン 増 殖 条 件 ng t-PA/細胞/日 1-15₅₀₀ 500nＭ ＭＴＸ 28.5×10^-3 1-15₅₀₀ 500nＭ ＭＴＸ 26.0×10^-3 1-15₅₀₀ (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 8.3×10^-3 1-15₅₀₀ (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 18.0×10^-3 1-15₁₀,₀₀₀ 10μＭ ＭＴＸ 29.3×10^-3 1-15₁₀,₀₀₀ 10μＭ ＭＴＸ 49.0×10^-3 18Ｂ-9 50nＭ ＭＴＸ 14.3×10^-3 18Ｂ-9 50nＭ ＭＴＸ 14.4×10^-3 18Ｂ-9 (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 14.3×10^-3 18Ｂ-9 (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 14.4×10^-3 1 (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 1.0×10^-3 1 (-ＨＧＴ培地,ＭＴＸなし) 0.7×10^-3 注）培地中のt−ＰＡを以下の如くラジオイムノアッセ
イで定量的にアッセイした。精製t−ＰＡ及びメラノー
マ細胞から誘導された精製ヨード化トレーサ−t−ＰＡ
を、燐酸緩衝生理食塩水(pＨ7.3)、０.５％牛血清アル
ブミン、０.０１％Ｔween８０及び０.０２％ＮaＮ₃を含
む緩衝液中で濃度１２.５乃至４００ng／mlまで順次希
釈した。適当な希釈度の被検定培地サンプルを放射活性
標識トレーサータンパクに添加した。１:１０,０００希
釈のウサギ抗t−ＰＡ抗血清のＩgＧ画分の存在下で抗原
を室温で１晩インキュベートした。ヤギ抗ウサギＩgＧ
イムノビーズ(ＢioＲad社製)に室温で２時間吸収させて
抗体−抗原コンプレックスを沈澱させた。希生理食塩水
を添加してビーズを洗浄し、次に４℃、２０００× g
で１０分間遠心した。上清を捨て、沈澱物中の放射活性
をモニターした。参照標準との比較によって濃度を決定
した。セルラインは以下の如くである。セルライン
“１”は、４個のオリジナルセットから選択された未増
幅クローンである。“１−１５₅₀₀”は最初に５０nＭの
ＭＴＸ中で増幅されて１−１５を生じ次に５００nＭの
ＭＴＸに移されて更に増幅されたセルライン“１”の増
幅サブクローンである。１−１５₁₀,₀₀₀は１０,０００n
ＭのＭＴＸの存在下で更に増幅された１−１５₅₀₀のサ
ブクローンである。セルライン１８Ｂ−９は４個のオリ
ジナルクローンの１個から選択され５０nＭのＭＴＸで
増幅されたサブクローンである。全ての増幅細胞は、未
増幅細胞が示したよりも増加したt−ＰＡ産生レベルを
示す。未増幅培養物でも０.５pg／細胞／日より高いt−
ＰＡ産生量を示すが、増幅の結果として５０pg／細胞／
日に近いレベルが得られる。

【０１２９】Ｆ．薬剤組成物 本発明の化合物は、本発明のヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子産物が薬剤上許容され得るキャリアビヒクル
に混合されて成る薬剤的に有用な組成物を調製すべく公
知方法で処方され得る。他のヒトタンパク例えばヒト血
清アルブミンを包含する適当なビヒクル及びその処方
は、例えばＥ．Ｗ．ＭartinによるＲemington's Ｐhar
maceutical Ｓciencesに記載されている。該文献を引
用して本明細書中に包含する。前記の如き組成物は、宿
主への有効投与に適した薬剤上許容され得る組成物を調
製するための適当量のビヒクルと共に有効量の本発明タ
ンパクを含有するであろう。

【０１３０】例えば、本発明のヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子は、心血管病又は心血管障害に苦しむ患者
に非経口的に投与され得る。用量及び投与速度は現在臨
床に用いられている他の心血管血栓溶解剤と同様でよ
い。例えば、肺塞栓症の患者には、初回に約４４０ＩＵ
／kgを静注し、以後約４４０ＩＵ／kg／時ずつ１２時間
静注する。

【０１３１】本発明の実質的に均質なヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子を、非経口的に投与するための適当
な剤形の一例としては、２５０００ＩＵの組織プラスミ
ノーゲン活性化因子活性、２５mgのマンニトール及び４
５mgのＮaＣlを含むバイアルを５mlの注射無菌水で復元
し、静脈内投与のために適正量の０.９％食塩注射剤又
は５％デキストロース注射剤と混合すればよい。

【０１３２】Ｇ．組換ヒトt−ＰＡの詳細な説明 本明細書中では、実施例に於いて調製されたヒトt−Ｐ
Ａの特定具体例の構造を遺伝子をコードする配列の解明
及びタンパク質生化学技術の双方により、ある程度詳細
に説明した。一般に理解されているタンパク構造を図１
６に示す。Ｃollen 及び彼の共同研究者(文献８８)によ
って、二本鎖ヒトt−ＰＡは一本鎖分子がタンパク分解
的開裂により、ジスルフィド結合で接続された２個のポ
リペプチドになる結果形成されることはすでに明らかに
されていた。本発明によって、Ｈ鎖(分子量３０８８２)
がＮＨ₂−末端部から誘導され、Ｌ鎖(分子量２８１２
６)がＣＯＯＨ−末端領域からなるという結論が得られ
る。二本鎖分子のＮ−末端配列決定によれば、二本鎖形
態は１個のアルギニル−イソロイシン結合(図１６の矢
印)の開裂により生成されると思われる。

【０１３３】ヒトt−ＰＡ(図１６)のＨ鎖領域の１部分
の一次構造は、プラスミノーゲン(文献８９)及びプロト
ロンビン(文献４０及び４１)のクリングル領域に対して
高度の配列相同性を示す。クリングル領域とは、プロト
ロンビンのプロ断片中で最初に発見された特徴的トリプ
ルジスルフィド構造を意味しており、これに関してはＭ
agnusson et al．(文献９１及び９２)が初めて詳細に
記載した。t−ＰＡの一次配列から２個の所謂クリング
ル領域が明らかになる。これらの領域は、各々が８２個
のアミノ酸を含んでおり、プラスミノーゲンの５個のク
リングル領域と高度の相同性を有する。残りのＮ−末端
の９１個のアミノ酸は従来のクリングル領域との相同性
を殆ど有していない。然しながら、１１個の付加的シス
ティン残基が検出されるので、この領域も多数のジスル
フィド結合を含む構造を有し得ると推測し得る。

【０１３４】ヒトt−ＰＡのＬ鎖の触媒部位、所謂セリ
ンプロテアーゼ領域は、他のセリン酵素同様に、ヒスチ
ジン₃₂₂, アスパラギン酸₃₇₁及びセリン₄₇₈残基から形
成されている可能性が大きい。更に、これらの残基を包
囲するアミノ酸配列は、トリプシン、プロトロンビン及
びプラスミノーゲンの如き他のセリンプロテアーゼの対
応する部分に極めて良く相同している。本発明を好まし
い特定具体例に関して説明してきたが、本発明は前記具
体例だけに限定されるべきでないことが理解されよう。

【０１３５】参考文献 １．米国特許 No.３３５５３６１． ２．米国特許 No.３９２６７２７． ３．米国特許 No.４０２９７６７． ４．米国特許 No.４２５８０３０． ５．米国特許 No.４２７１１５０． ６．欧州特許出願公開 No.００３７６８７． ７．Ｒijken．Ｄ．Ｃ., “Ｐlasminogen Ａctivator fr
om Ｈuman Ｔissue”，Ｋrips Ｒepro Ｍeppel, １９８
０． ８．米国特許 No.３５５５０００． ９．米国特許 No.３９９８９４７． 10．米国特許 No.４２４５０５１．

【０１３６】11．欧州特許出願公開 No.００２３８６
０． 12．米国特許 No.４０８３９６１． 13．米国特許 No.４１７７２６２． 14．米国特許 No.３０８２６１２． 15．Ｗallen,Ｐ., Ｐroc.Ｓerono Ｓymp.，９．９１(１
９７７)． 16．Ｔhorsen,Ｓ., et al.，Ｔhrombos.Ｄiathes.haemo
rrh.，２８, ６５(１９７２)． 17．Ｃollen,Ｔhrombos．Ｈaemostas., ４３，７７(１
９８０)． 18．Ｗiman et al.,Ｎature，２７２,５４９(１９７
８)． 19．欧州特許出願公開 No.００４１７６６． 20．Ｗeimar,Ｗ., et al．Ｔhe Ｌancet，Ｖol．II, Ｎ
o.８２５４, p.１０１８(１９８１)．

【０１３７】21．英国特許出願公開 No.２００７６７６
Ａ． 22．Ｗetzel，Ａmerican Ｓcientist，６８,６６４(１
９８０)． 23．Ｍicrobiology，２d Ｅd.，Ｈarper and Ｒow Ｐub
lications.Ｉnc.，Ｈagerstown，Ｍaryland(１９７
３)，esp.pp.１１２２ et seq． 24．Ｓcientfic Ａmerican．２４５,１０６(１９８
１)． 25．英国特許出願公開 No.２０５５３８２Ａ． 26．西独特許出願公開 ２６４４４３２． 27．Ｃhang et al.，Ｎature，２７５，６１７(１９７
８). 28．Ｉtakura et al.，Ｓcience，１９８，１０５６(１
９７７)． 29．Ｇoeddel et al.，Ｎucleic Ａcids Ｒesearch，
８，４０５７(１９８０)． 30．欧州特許出願公開 No.００３６７７６．

【０１３８】31．Ｓiebenlist et al.，Ｃell２０，２
６９(１９８０). 32．Ｓtinchcomb et al.，Ｎature，２８２，３９(１９
７９)． 33．Ｋingsman et al.，Ｇene．７．１４１(１９７
９)． 34．Ｔschumper et al.，Ｇene，１０．１５７(１９８
０). 35．Ｍortimer et al.，Ｍicrobiological Ｒeviews，
４４，５１９(１９８０)． 36．Ｍiozzari et al.，Ｊournal of Ｂacteriology，
１３４，４８(１９７８). 37．Ｊones.Ｇenetics．８５，２３(１９７７). 38．Ｈitzeman，et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２５５，１
２０７３(１９８０). 39．Ｈess et al.，Ｊ.Ａdv.Ｅnzyme Ｒequl.，７，１
４９(１９６８)． 40．Ｈolland et al.，Ｂiochemistry，１７，４９００
(１９７８)．

【０１３９】41．Ｂostian et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.，(ＵＳＡ)，７７．４５０４(１９８０)． 42．Ｔhe Ｍolecular Ｂiology of Ｙeast(Ａug １１−
１８.１９８１)，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborator
y，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork． 43．Ｃhambon，Ａnn.Ｒev.Ｂiochemistry．４４，６１
３(１９７５)． 44．Ｔissue Ｃulture，Ａcademic Ｐress，Ｋruse and
Ｐatterson eds.,(１９７３). 45．Ｇluzman，Ｃell，２３，１７５(１９８１). 46．Ｂolivar et al.，Ｇene，２．９５(１９７７)． 47．Ｌusky et al.，Ｎature，２９３，７９(１９８
１). 48．Ｇluzman，et al., Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp.
Ｑuant.Ｂiol.，４４，２９３(１９８０)． 49．Ｆiers et al.，Ｎature，２７３，１１３(１９７
８). 50．Ｒeddy et al.，Ｓcience．２００，４９４(１９７
８)．

【０１４０】51．Ｃrea et al.，Ｎucleic Ａcids Ｒes
earch．８，２３３１(１９８０)． 52．Ｇoeddel et al.，Ｎature，２８７，４１１(１９
８０)． 53．Ｇray et al.，Ｎature，２９５，５０３(１９８
２)． 54．Ｏppermann et al.，Ｖirology，１０８，４７(１
９８１)． 55．Ｗard et al.，Ｊ.Ｖirol.，９，６１(１９７２)． 56．Ａviv et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,(ＵＳ
Ａ)，６９，１４０８(１９７２). 57．Ｌehrach et al.，Ｂiochemistry．１６，４７４３
(１９７７)． 58．Ｌynch et al.，Ｖirology，９８．２５１(１９７
９). 59．Ｌodish，Ａm.Ｒev．of Ｂiochem.，４５，４０(１
９７６)． 60．Ｐelham et al.，Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.，４３，２４
７(１９７６)．

【０１４１】61．Ｂlobel．et al.，Ｊ.Ｃell Ｂiolog
y，６７，８５２(１９７５)． 62．Ｓhields et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhemistry，２５３，
３７５３(１９７８). 63．Ｌaemmli，Ｎature，２２７，６８０(１９７０)． 64．Ｂonner et al.，Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.，４６，８３
(１９７４)． 65．Ｇoeddel et al.，Ｎature，２８１，５４４(１９
７９)． 66．Ｗickens et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２５３，２４
８３(１９７８)． 67．Ｃhang et al.，Ｎature，２７５，６１７(１９７
８). 68．Ｂolivar et al.，Ｇene，２，９５(１９７７)． 69．Ｇrustein et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳ
Ａ，７２，３９６１(１９７５). 70．Ｈanahan et al.，Ｇene，１０，６３(１９８０)．

【０１４２】71．Ｂirnboim et al.，Ｎucleic Ａcids
Ｒes.,７，１５１３(１９７９). 72．Ｓmith，Ｍethods Ｅnzymol.，６５，４９９(１９
８０)． 73．Ｍessing et al.，Ｎucleic Ａcids Ｒes.，９．３
０９(１９８１)． 74．Ｍaxam et al.，Ｍethods in Ｅnzymol.，６５．４
９９(１９８０)． 75．Ｃrea et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.，７５，
５７６５(１９７８)． 76．Ｌawn et al.，Ｃell，１５，１１５７(１９７
８)． 77．Ｓouthern，Ｊ.Ｍol.Ｂiol.，９８，５０３(１９７
５)． 78．Ｂenton et al.，Ｓcience，１９６，１８０(１９
７７)． 79．Ｍc Ｇrath and Ｌevinson，Ｎature，２９５，４
２３(１９８２)． 80．Ｂlin et al.，Ｎucleic Ａcids Ｒes.，３，２３
０３(１９７６)．

【０１４３】81．Ｌawn et al.，Ｓcience，２１２，１
１５９(１９８１)． 82．Ｆritsch et al.，Ｃell，１９，９５９(１９８
０)． 83．Ｔaylor et al.，Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta，４４
２，３２４(１９７６)． 83b．Ｅdman et al.，Ｅuropean Ｊ.Ｂiochem.，１，８
０(１９６７)． 84．Ｄenhardt，Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.,Ｃomm.，２
３，６４１(１９６６)． 85．Ｗahl et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,(ＵＳ
Ａ)，７６，３６８３(１９７９)． 86．Ｄavis et al.，Ａdvanced Ｂacterial Ｇenetic
s，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，Ｎew Ｙork
(１９８０)． 87．Ｇranelli−Ｐiperno et al.，Ｊ.Ｅxp.Ｍed.，１
４８，２２３． 88．Ｒijken et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２５６，７０
３５(１９８１)． 89．Ｓottrup−Ｊensen et al.，Ｐrogress in Ｃhemic
al Ｆibrinolysis andＴhrombolysis，Ｖol.３，Ｒaven
Ｐress，Ｎ.Ｙ．p.１９１(１９７８)． 90．Ｓothrup−Ｊensen et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓ
ci.，(ＵＳＡ)，７２，２５７７(１９７５)．

【０１４４】91．Ｍagnussen et al.，Ｐroteolysis an
d Ｐhysiological Ｒegulation，Ｒibbons et al.，Ｅd
s.,Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，p.２０３(１９７
６). 92．Ｍagnussen et al.，Ｐroteases and Ｂiological
Ｃontrol，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，Ｎ.
Ｙ.，p.１２３(１９７５)． 93．Ｍiller，Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetic
s，p.４３１−３，ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌab.，Ｃold
Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork(１９７２)． 94．Ｒeich，Ｅ.，Ｐroteases and Ｂiological Ｃontr
ol．(Ｉbid)p.３３３−３４１． 95．Ｍatsuo,Ｏ.，et al.，Ｔhrom.Ｈaemostasis，４
５，２２５(１９８１). 96．Ｋoringer,Ｃ.，et al.，Ｔhrom.Ｈaemostasis，４
６，５６１，６６２(１９８１)． 97．Ｈoylaerts，Ｍ.，et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,２５
７，２９１２(１９８２)． 98．Ｋoringer,Ｃ.，et al.，Ｔhromb.Ｈaemostasis，
４６，６８５(１９８１)．

【図面の簡単な説明】

【図１】 プロテアーゼインヒビターの存在下及び不在
下での、メラノーマ細胞から分泌された抗t−ＰＡ Ｉg
Ｇにより沈降し得る³⁵Ｓ−メチオニン標識タンパクの１
０％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(ＳＤＳ ＰＡＧＥ)の結果を示す写真の模写図
である。

【図２】 メラノーマ細胞から誘導されたmＲＮＡ画分
の免疫沈降した翻訳産物の電気泳動の結果を示す写真の
模写図である。

【図３】 ヒトt−ＰＡの５個のアミノ酸配列に基づい
て調製した³²Ｐ−標識１４ヌクレオチド体のプールをプ
ローブとして用いたときの、cＤＮＡで形質転換された
９６個の細菌コロニーのハイブリダイゼーションパター
ンを示す写真の模写図である。

【図４】 全長ヒトt−ＰＡ cＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼマップである。

【図５】 全長ヒトt−ＰＡ cＤＮＡのヌクレオチド配
列及びそれから推定されたアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図６】 全長ヒトt−ＰＡ cＤＮＡのヌクレオチド配
列及びそれから推定されたアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図７】 全長ヒトt−ＰＡ cＤＮＡのヌクレオチド配
列及びそれから推定されたアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図８】 発現プラスミドp△ＲＩＰＡ°の構築工程図
である。

【図９】 p△ＲＩＰＡ°で形質転換された大腸菌細胞
の線維素溶解能のフィブリンプレートアッセイの結果を
示す写真の模写図である。

【図１０】 ヒトt−ＰＡのトリプシン消化によって得
られたペプチドのＨＰＬＣの結果を示すトレース図であ
る。

【図１１】 Ｅ．coli中での成熟ヒトt−ＰＡの直接発
現をコードするプラスミドの構築工程図である。

【図１２】 Ｅ．coli中での成熟ヒトt−ＰＡの直接発
現をコードするプラスミドの構築工程図である。

【図１３】 Ｅ．coli中での成熟ヒトt−ＰＡの直接発
現をコードするプラスミドの構築工程図である。

【図１４】 pt−ＰＡtrp１２で形質転換されたＥ．col
iにより産生されるヒトt−ＰＡの線維素溶解能に対する
フィブリンプレートアッセイの結果を示す写真の模写図
である。

【図１５】 ＤＨＦＲ(突然変異体又は野性型)／t−Ｐ
Ａをコードしている哺乳類組織培養細胞を形質転換する
のに適したプラスミドの構築工程図である。

【図１６】 本明細書中のＥ.１．に例示した方法で調
製されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の概略図
である。

【図１７】 pＥＨＥＲの構築工程図である。

【図１８】 pＦＲ４００及びpＦＤ１１の調製説明図で
ある。

【図１９】 pＥ３４２．ＨＢＶ．Ｅ４００．Ｄ２２の
構築工程図である。

【図２０】 pＥ３４２．Ｄ２２の構築工程図である。

フロントページの続き (72)発明者 ダイアン・ペニカ アメリカ合衆国、カリフォルニア・ 94404・フォスター・シティー、ジュノ ー・レイン・815・１／２ (72)発明者 ゴードン・アレン・ヴイハー アメリカ合衆国、カリフォルニア・ 94070、サン・カーロス、メイプル・ウ エイ・14 (56)参考文献 ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩ ＮＧ −ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ−，ＶＯＬ．３，Ｐ. １−32（1981）ＰＬＥＮＵＭ ＰＲＥＳ Ｓ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＭＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，Ｖ ＯＬ．９，Ｐ．3647−3656（1981) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．77，Ｐ．7024− 7028（ＤＥＣＥＭＢＥＲ 1980) ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．209，Ｐ. 1396−1400（19 ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ 1980)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列１〜５２７を有するヒ
   ト組織プラスミノーゲン活性化因子、または下記アミノ
   酸配列にアミノ酸残基の削除、付加、または置換を施す
   ことによって得られるアミノ酸配列を有し、ヒト組織プ
   ラスミノーゲン活性化因子の特性を有するヒト組織プラ
   スミノーゲン活性化因子誘導体、をコードしているＤＮ
   Ａを発現させ得る組換え発現ベクター： 【化５】 【化６】 【化７】
2. 【請求項２】 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子誘
   導体が下記アミノ酸配列を有するものである請求項１の
   組換え発現ベクター： 【化８】 【化９】 【化１０】