SI8310997A - Aktivator plazminogena človeškega tkiva - Google Patents

Abstract

Z uporabo rekombinantnih tehnik je proizveden aktivator plazminogena človeškega tkiva (t-PA) v uporabnih količinah. Ta izum prav tako omogoča proizvodnjo t-PA, ki je brez kontaminantov, ki ga spremljajo v njegovem naravnem celičnem okolju. Prav tako so opisani postopki, nosilci za expresijo in razne celice gostiteljev, ki so uporabni v proizvodnji.

Description

Področje izuma

Izum je s področja genetskega inženirstva.

Tehnični problem

Predloženi izum se nanaša na aktivator plazminogena človeškega tkiva, ki ustreza tistemu v človeškem serumu in/ali tkivih, kot tudi na postopek za njegovo pridobivanje.

Stanje tehnike

Predloženi izum je nastal z delom na osnovi odkritja DNA sekvence in izvedene aminokislinske sekvence aktivatorja človeškega plazminogena. To odkritje je omogočilo proizvodnjo aktivatorja človeškega plazminogena z uporabo rekombinantne DNA tehnologije, kar zopet omogoča proizvodnjo materiala ustrezne kvalitete in kvantitete za iniciiranje in izvajanje testiranja na živalih in kliničnega testiranja, kot nujnih pogojev za odobritev trženja, ki jih ne ovirajo restrikcije, ki so obvezno spremljale postopke izoliranja, ki so jih uporabljali v proizvodnji in ekstrakciji iz obstoječe celične kulture do sedaj. Ta izum je usmerjen na te spremljajoče izvedbe v vseh pogledih.

Publikacije in drugi materiali, ki jih tu uporabljamo za osvetljevanje teoretične osnove izuma in v določenih primerih, za zagotavljanje dodatnih detajlov, ki se nanašajo na uporabo izuma, so vključeni kot reference in zaradi pripravnosti, so v sledečem tekstu numerično NAVEDENI in ustrezno razvrščeni v skupine v priloženi bibliografiji.

A. Aktivator plazminogena človeškega tkiva

Fibrinolitični sistem je v dinamičnem ravnotežju s koagulacijskim sistemom, ob vzdrževanju nedotaknjenega, zaščitenega vaskularnega sloja. Koagulacijski sistem deponira fibrin kot matrico, ki služi za obnavljanje hemostatičnega stanja. Fibrinolitični sistem odstrani fibrinsko mrežo potem ko je doseženo hemostatično stanje. Fibrinolitični sistem se aktivira s proteolitičnim encimom, ki se generira iz prekurzorskega plazminogena proteina plazme. Plazminogen se prevaja v plazmin preko aktivacije z aktivatorjem.

Trenutno sta na razpolago dva aktivatorja, streptokinaza in urokinaza. Oba sta indicirana za zdravljenje akutnih vaskularnih bolezni, kot so miokardni infarkt, kap, plučna embolija, tromboza globokih ven, periferne arterijske inkluzije in druge venske tromboze. Skupaj tvorijo te bolezni glavne nevarnosti za zdravje.

Vzročna etiološka osnova za te bolezni kaže na ali parcialno, ali v nekaterih primerih, na totalno okluzijo krvne žile s krvnim strdkom - trombusom ali tromboembolusom. Tradicionalna antikoagulacijska terapija, kot s heparinom ali kumarinom, ne naredi nič, da bi direktno povečala razgradnjo trombusa ali tromboembolusa. Prej citirani trombolitski sredstvi, streptokinaza in urokinaza, sta imeli praktično in učinkovito uporabo. Vendar pa ima vsako resne omejitve. Nobeno od njiju nima visoke afinitete do fibrina; zaradi tega obe aktivirata cirkulacijo in plazminogen vezan na fibrin, relativno brez razlike. Plazmin, ki se tvori v krožeči krvi, se nevtralizira razmeroma hitro in je izgubljen za koristno atrombolizo. Rezidualni plazmin bo degradiral nekaj proteinskih faktorjev za zamašitev, npr., fibrinogen, faktor V in faktor VIII, pri čemer izziva potencial za krvavitev. Nadalje je streptokinaza močno antigenska in pacienti z visokimi titri protiteles reagirajo neučinkovito na zdravljenje in jih ne moremo podvreči kontinualnemu zdravljenju. Terapija z urokinazo je draga, zaradi njenega zapletenega izoliranja iz človeškega urina ali kulture tkiva in zato, v glavnem, ni sprejeta za klinično prakso. Urokinaza je bila predmet številnih raziskav - glej npr. reference 1-6.

Takoimenovane aktivatorje plazminogena so izolirali iz različnega človeškega tkiva, npr., tkiva maternice, krvi, seruma - glej v glavnem reference 7-11 in iz celične kulture (referenca 94). Prav tako so opisani njihovi preparati - glej reference 12-13. Glej prav tako reference 14-18. Aktivatorji plazminogena, ki so izvedeni iz teh izvorov, so vedno klasificiram v dve glavni skupini: aktivatorji plazminogena urokinaznega tipa (u-PA) in aktivatorji plazminogena po tipu tkiva (t-PA) na osnovi razlik v njihovih imunoloških lastnostih. (Okrajšavi t-PA in u-PA sta taki, kot sta bili predlagani na XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo, Italy, 27 July 1982).

Pred kratkim je bila identificirana linija človeškega melanoma, ki izloča t-PA. Karakterizacija tega aktivatorja plazminogena melanoma je pokazala, da se je ne da razlikovati, niti imunološko niti po aminokislinski sestavi, od aktivatorja plazminogena, kije izoliran iz normalnega človeškega tkiva (referenca 19,88).

Produkt so izolirali v relativno čisti obliki, okarakterizirali in ugotovili, da je visoko aktivno fibrinolitično sredstvo (20).

Nekaj raziskav (npr. reference 95 do 98), v katerih so uporabljali t-PA prečiščen iz celične linije melanoma, je pokazalo njegovo visoko afiniteto za fibrin, v primerjavi z aktivatorji plazminogena urokinaznega tipa. Vendar pa je bilo intenzivno preučevanje človeškega t-PA kot potencialnega trombolitičnega sredstva oteženo zaradi njegove ekstremno nizke koncentracije v krvi, ekstraktih tkiv, perfurzatih žil in celičnih kulturah.

Ugotovili so, da bo uporaba rekombinantne DNA in spremljajočih tehnologij najbolj učinkovit način za zagotavljanje potrebnih velikih količin aktivatorja plazminogena tipa človeškega tkiva visoke kvalitete (prej imenovanega kot aktivator človeškega plazminogena), v bistvu brez drugega človeškega proteina. Takšni materiali bodo verjetno izražali bioaktivnost, ki bo omogočila njihovo klinično uporabo pri zdravljenju različnih kardiovaskularnih stanj in bolezni.

B. Rekombinantna DNA tehnologija

Rekombinantna DNA tehnologija je dosegla stanje določene izpopolnjenosti. Molekularni biologi so sposobni rekombinirati različne DNA sekvence z določeno lahkoto, pri čemer kreirajo nove DNA vrste, ki lahko proizvedejo obilne količine eksogenega proteinskega proizvoda v transformiranih mikrobih in celičnih kulturah. Pri roki so splošna sredstva in postopki za in vitro ligacijo raznih fragmentov DNA s topimi ali lepljivimi konci, tako da se proizvajajo močni nosilci za ekspresijo, ki so koristni v transformiranju določenih organizmov, tako da se usmerja njihova učinkovita sinteza želenega eksogenega proizvoda. Vendar pa ostaja na osnovi posameznega proizvoda, pot do neke mere mukotrpna in znanost še ni napredovala do faze, v kateri bi lahko delali regularna predvidevanja za uspeh. Dejansko delajo tisti, ki dosegajo uspešne rezultate brez utemeljene eksperimentalne osnove, z znatnim tveganjem neoperativnosti.

DNA rekombinacija bistvenih elementov t.j. izvorov replikacije, ene ali več fenotipskih selekcijskih karakteristik, promotorjev ekspresije, vključkov heterolognega gena in preostalega vektorja, se v glavnem izvaja izven celice gostitelja. Dobljeni rekombinantni ekspresijski nosilec, ki se ga da replicirati, ali plazmid, se uvaja v celice s transformiranjem, in z rastjo transformanta dobimo velike količine rekombinantnega nosilca. Kadar je gen vnešen pravilno glede na dele, ki nadzirajo transkripcijo in translacijo kodiranega DNA sporočila, je dobljeni ekspresijski nosilec koristen za dejansko proizvodnjo polipeptidne sekvence, katero vstavljeni del kodira, in to je postopek znan kot ekspresija. Dobljeni proizvod lahko dobimo z rascepljanjem, po potrebi, celice gostitelja, v mikrobnih sistemih in regeneriranjem proizvoda z ustreznim prečiščevanjem iz drugih proteinov.

V praksi lahko uporaba rekombinantne DNA tehnologije izrazi povsem heterologne polipeptide- takoimenovana direktna ekspresija - ali alternativno, izrazi lahko heterologni polipeptid, ki je kondenziran z delom aminokislinske sekvence homolognega polipeptida. V zadnjih primerih včasih želeni bioaktivni proizvod napravijo bio-neaktiven v kondenziranem homolognem/heterolognem polipeptidu, dokler se ne razcepi v zunajcelični okolici. Glej reference (21) in (22).

Na podoben način je dobro razvita znanost o celici in tkivnih kulturah za preučevanje genetike in fiziologije celice. Pri roki so sredstva in postopki za vzdrževanje permanentnih celičnih linij, napravljenih s sukcesivnimi serijskimi transferji iz izolata normalnih celic. Za uporabo v raziskavah vzdržujejo takšne celične linije na trdnem nosilcu v tekoči podlagi, ali pa z rastjo v suspenziji, ki vsebuje nosilne hranljive sestavine. Izgleda, da povzroča proporcioniranje za velike preparate samo mehanske probleme. Za nadaljnjo osnovo usmerjamo pozornost na reference (23) in (24).

Na podoben način je proteinska biokemija koristna, v bistvu nujno dopolnilo, v biotehnologiji. Celice, ki proizvajajo želeni protein, prav tako proizvajajo stotine drugih proteinov, endogenih proizvodov metabolizma celice. Ti kontaminirajoči proteini, kakor tudi druge spojine, se lahko, če jih ne ločimo od želenega proteina, izkažejo kot toksični, če se dajo živali ali človeku ob terapevtskem zdravljenju z želenim proteinom. Zaradi tega omogočajo tehnike proteinske biokemije načrtovanje postopkov za ločevanje, ki so primerni za določeni sistem, ki ga opazujemo in za zagotavljanje homogenega proizvoda, ki je varen za nameravano uporabo. Proteinska biokemija prav tako dokazuje identiteto želenega proizvoda, pri čemer ga okarakterizira in zagotavlja, da ga celice proizvajajo verno, brez alteracij in mutacij. Ta veja znanosti je prav tako vključena v načrtovanje biotestov, preučevanje stabilnosti in druge postopke, ki jih moramo obvezno uporabiti predno izvajamo uspešne klinične raziskave in prodajo na tržišču.

Opis rešitve tehničnega problema s primeri

Predloženi izum temelji na odkritju, da lahko rekombinantno DNA tehnologijo uspešno uporabljamo za proizvodnjo aktivatorja plazminogena človeškega tkiva (tPA), prednostno v direktni obliki, in v zadovoljujočih količinah za iniciiranje in izvedbo testiranja na živalih in kliničnega testiranja, kot predpogojev za sprejem na tržišču. Proizvod, človeški t-PA, je primeren za uporabo v vseh svojih oblikah, v profilaktičnem in terapevtskem zdravljenju ljudi za različna kardiovaskularna stanja ali bolezni. Pri tem je predloženi izum, v enem pomembnem vidiku, usmerjen na postopke za zdravljenje vaskularnih motenj pri človeških pacientih z uporabo t-PA in njegovih primernih farmacevtskih preparatov.

Predloženi izum nadalje obsega v bistvu čist aktivator plazminogena človeškega tkiva. Proizvod, proizveden z genetsko konstruiranimi mikroorganizmi ali sistemi celične kulture zagotavlja možnost za proizvodnjo aktivatorja plazminogena tkiva na mnogo bolj učinkovit način, kot je bilo to možno do sedaj, s čemer omogočimo komercialno izkoriščanje, ki do sedaj ni bilo možno. Nadalje, v odvisnosti od celice gostitelja, lahko aktivator plazminogena človeškega tkiva vsebuje spremljajočo sledečo glikozilacijo v večjem ali manjšem obsegu v primerjavi z naravnim materialom. V vsakem primeru pa bo t-PA brez kontaminantov, ki ga običajno spremljajo v njegovi ne-rekombinantni celični okolici.

Predloženi izum se prav tako nanaša na nosilce za ekspresijo DNA, ki se jih da replicirati, ki proizvajajo sekvence gena, ki kodirajo aktivator plazminogena človeškega tkiva v obliki, ki se lahko izrazi, na soje mikroorganizmov ali celične kulture, ki so z njimi transformirane in na mikrobne ali celične kulture takšnih transformiranih sojev ali kultur, ki lahko proizvedejo aktivator plazminogena človeškega tkiva. V nadaljnjih vidikih se predloženi izum nanaša na različne postopke, ki so uporabni za pripravo omenjenih genskih sekvenc, na nosilce za ekspresijo DNA, na soje mikroorganizmov in celične kulture in na njihove specifične izvedbe. Nadalje se ta izum nanaša na pripravo kultur omenjenih mikroorganizmov za fermentacijo in na celične kulture.

Kratek opis risb

Slika 1 prikazuje 10 % natrijev dodecilsulfat poliakrilamidni gel elektroforeze (SDS PAGE) z 35_s-metioninom označene proteine, ki se jih da oboriti z anti t-PA, ki je izločen iz celic melanoma z ali brez inhibitorja proteaze.

Slika 2 prikazuje elektroforezo imunoprecipitiranih translacijskih proizvodov mRNA frakcij, izvedenih iz celic melanoma.

Slika 3 prikazuje shemo hibridizacije 96 bakterijskih kolonij, ki so transformirane s cDNA z uporabo ³²P markiranega 14-mera kot sonde, ki je napravljen na osnovi sekvence 5 aminokislin človeškega t-PA.

Slika 4 je restrikcijski endonukleazni načrt cDNA človeškega t-PA polne dolžine.

Slike 5a, 5b in 5c prikazujejo sekvenco nukleotidov in izvedeno aminokislinsko sekvenco cDNA t-PA polne dolžine.

Slika 6 je shema konstrukcije ekspresijskega plazmida pdeltaRIPA*.

Slika 7 prikazuje rezultate fibrinskega testa na ploščici na fibrinolitično aktivnost E.coli celic transformiranih s pdeltaRIPA*.

Slika 8 je HPLC sled peptida iz tripsinskega izločka človeškega t-PA.

Slika 9 prikazuje konstrukcijo plazmida, ki kodira za neposredno ekspresijo zrelega

Ί človeškega t-PA v E. coli.

Slika 10 prikazuje rezultate fibrinskega testa na ploščici na fibrinolitsko aktivnost človeškega t-PA proizvedenega s pomočjo E.coli transformirane s pt-PAtrpl2.

Slika 11 prikazuje konstrukcijo DHFR (mutantni ali divji tip)/t-PA plazmidov za kodiranje, ki so primerni za transformacijo v celicah tkivnih kultur sesalcev.

Slika 12 je shematski diagram aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, kot smo ga pripravili s postopkom, kije ponazorjen v tukajšnjem poglavju E.l.

Natančen opis

A. Definicije

Kot uporabljamo tukaj, aktivator plazminogena človeškega tkiva ah človeški t-PA ah t-PA označuje človeški zunanji (tkivnega tipa) aktivator plazminogena, proizveden z mikrobnimi ah sistemi celične kulture, v bioaktivnih oblikah, ki obsegajo proteazni del in ki ustrezajo tistim aktivatorjem plazminogena, ki so sicer nativni za človeško tkivo. Protein aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, ki smo ga proizvedli tukaj, smo definirali s pomočjo determiniranega DNA gena in deduktivnega aminokislinskega sekvenciranja. Jasno je, da obstajajo naravne alelične variacije in se pojavljajo od posameznika do posameznika. Te variacije lahko ponazorimo s pomočjo aminokislinskih razlik v skupni sekvenci ah z izpuščanji, substitucijami, vmeščanji, inverzijami ah dodajanji aminokislin(e) v omenjeni sekvenci. Nadalje je lokacija in stopnja glikoziliranja odvisna od narave celične okolice gostitelja.

V uporabi rekombinantne DNA tehnologije obstaja potencial za pripravo različnih derivatov aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, različno modificiranih s pomočjo enojnih ah večkratnih substitucij, izpuščanj, dodajanj ah zamenjav aminokislin, npr. s pomočjo direktne mutageneze mesta v osnovni DNA. Vključena bo priprava derivatov, ki vsebujejo bistveno kringle regijo in regijo serin proteaze, ki sta v glavnem karakteristični za aktivator plazminogena človeškega tkiva, ah so sicer modificirani kot je opisano zgoraj. Vse takšne alelične variacije in modifikacije, ki nastajajo v derivatih aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, so vključene v obseg tega izuma, kakor tudi drugi sorodni aktivatorji človeškega zunanjega (tkivnega tipa) plazminogena, ki so si fizično in biološko podobni, vse dokler ostane bistvena, karakteristična aktivnost aktivatorja plazminogena človeškega tkiva v svoji vrsti nedotaknjena.

Pripravili smo aktivator plazminogena človeškega tkiva 1), ki ima metionin kot prvo aminokislino (ki je prisotna na osnovi vstavitve ATG startnega signalnega kodona pred strukturni gen) ali 2) ki ima, kjer je metionin intra- ali ekstracelično razcepljen, njegovo normalno prvo aminokislino, ali 3) ali skupaj z njegovim signalnim polipeptidom ali s konjugiranim proteinom, ki se razlikuje od konvencionalnega signalnega polipeptida, pri čemer lahko signalni polipeptid ali konjugat specifično razcepimo v intra- ali ekstra-celični okolici (glej referenco 21), ali 4) z direktno ekspresijo v zreli obliki, ne da bi bila potrebna cepitev kakršnegakoli tujega, odvečnega polipeptida. Zadnje je še posebno pomembno takrat, kadar dani gostitelj ne more, ali ne more učinkovito odvajati signalnega peptida, kadar je nosilec za ekspresijo namenjen da izrazi aktivator plazminogena človeškega tkiva skupaj z njegovim signalnim peptidom. V vsakem primeru se tako proizvedeni človeški t-PA, v svojih različnih oblikah, regenerira in prečisti do nivoja, ki je primeren za uporabo v zdravljenju različnih vaskularnih stanj ali bolezni.

Nadalje ima t-PA oblike, ki vključujejo tudi enoverižni protein (1-veriga) in protein z 2-verigama. Zadnji je izveden proteolitsko iz spojin z 2-verigama. Teoretizirajo, daje protein z 2-verigama povezan s proizvedenim fibrinom in da se proteolitska konverzija materiala z 1- v material z 2-verigama vrši na mestu konverzije plazminogena v plazmin. Predloženi izum zagotavlja dajanje proteina z 1-verigo za in vivo konverzijo točno kot je opisano, ali zagotavlja dajanje proteina z 2-verigama, za katerega je bilo prav tako prikazano, da je aktiven. Protein z 2-verigama lahko pripravimo z in vitro proteolitsko konverzijo potem, ko je proizveden material z 1-verigo. Takoimenovana kringle površina, je postavljena navzgor od dela serin proteaze in verjamejo, da igra pomembno funkcijo v vezavi njegovega aktivatorja plazminogena tkiva na fibrinsko matrico; zaradi tega opažamo specifično aktivnost sedanjega aktivatorja plazminogena tkiva proti občutljivim, obstoječim trombusom. Tu se proizvaja aktivator plazminogena tkiva, ki vsebuje encimatsko aktiven del, ki ustreza nativnemu materialu in izraz aktivator plazminogena človeškega tkiva definira proizvode, ki obsegajo takšen del sam ali skupaj z dopolnilnimi aminokislinskimi sekvencami do polne dolžine molekule.

Če povzamemo predloženi izum, ima torej človeški t-PA funkcionalno definicijo; lahko katalizira konverzijo plazminogena v plazmin, se veže na fibrin in na osnovi imunoloških lastnosti ga klasificiramo kot t-PA, kot je prikazano zgoraj.

V bistvu čista oblika kot uporabljamo za opisovanje stanja človeškega t-PA proizvedenega z izumom pomeni, da je brez proteinov ali drugih materialov, ki običajno spremljajo človeški t-PA, kadar je proizveden s pomočjo z ne-rekombinatnih celic t.j. v njegovi nativni okolici.

DHFR protein se nanaša na protein, ki ima lahko aktivnost, ki spremlja dihidrofolat reduktazo (DHFR) in ki mora biti zato proizveden s pomočjo celic, ki so sposobne preživeti na podlagi, ki nima hipoksantina, glicina in tinidina. (-HGT podlaga). V glavnem so celice, ki nimajo DHFR proteina, nesposobne rasti na tej podlagi, celice, ki vsebujejo DHFR protein, pa to delajo uspešno.

Celice občutljive na ΜΤΧ so celice, ki ne morejo rasti na podlagah, ki vsebujejo inhibitor DHFR metotreksat (ΜΤΧ). Torej so celice občutljive na ΜΤΧ celice, ki v kolikor niso genetsko spremenjene ali na kak drug način dopolnjene, ne bodo rasle pod običajnimi pogoji na podlagi, ki je primerna za tip celice, kadar je koncentracija ΜΤΧ 0,2 /xg/ml ali večja. Nekatere celice, kot so bakterije, ne izražajo občutljivosti proti ΜΤΧ, zato ker ne omogočajo, da bi ΜΤΧ vstopil znotraj meje celice, celo tudi če vsebujejo DHFR, ki je sicer občutljiv na to zdravilo. V glavnem bodo celice, ki vsebujejo kot svoj DHFR protein DHFR divjega tipa, občutljive na metotreksat, če niso prepustne ali sposobne za potrošnjo glede na ΜΤΧ.

DHFR divjega tipa se nanaša na dihidrofolat reduktazo, kot se običajno nahaja v določenem zadevnem organizmu. DHFR divjega tipa je v glavnem in vitro občutljiv na nizke koncentracije metotreksata.

DHFR z nizko afiniteto za vezavo na ΜΤΧ ima funkcionalno definicijo. To je DHFR protein, ki bo, kadar se generira v celicah, omogočil rast ΜΤΧ občutljivih celic v podlagi, ki vsebuje 0,2 gg/ml ali več ΜΤΧ. Razume se, da je takšna funkcionalna definicija odvisna od lahkote, s katero organizem proizvaja DHFR protein z nizko afiniteto za vezavo na ΜΤΧ, kot tudi od samega proteina. Vendar pa, kot se uporablja v kontekstu predloženega izuma, ni potrebno, da bi takšno ravnotežje med tema dvema mehanizmoma povzročalo zmedo. Izum funkcionira v zvezi z dajanjem sposobnosti preživetja proti tem nivojem ΜΤΧ in ni posledica tega, ali je sposobnost za to dana s povečano ekspresijo poleg notranje narave proizvedenega DHFR. Primeren DHFR protein, ki sodi v to definicijo, je opisan v U.S.

prijavi serijska št. 459,151, kije bila vložena 19. januarja 1983 in ki je tu vključena kot referenca.

Vektor za ekspresijo vključuje vektorje, ki lahko izražajo DNA sekvence, ki se v njih nahajajo, kadar so takšne sekvence operativno povezane z drugimi sekvencami, ki lahko vplivajo na njihovo izražanje. Implicira se, čeprav to ni vedno posebej navedeno, da se morajo ti vektorji za ekspresijo replicirati v organizmih gostiteljev, ali kot epizomi ali kot integralni del kromosomne DNA. Jasno je, da jih bo pomanjkanje sposobnosti za repliciranje napravilo operativno neučinkovite. Povzeto, vektorju za ekspresijo se daje funkcionalna definicija in katerakoli DNA sekvenca, ki lahko izvede ekspresijo specifičnega DNA koda, ki se nahaja v njej, je vključena v ta termin, kadar ga uporabimo za specifično sekvenco. V glavnem so vektorji za ekspresijo, ki so uporabni v tehnikah rekombinantne DNA, pogosto v obliki plazmidov, ki se nanašajo na krožne pentlje DNA z dvojno verigo, ki v obliki njihovega vektorja niso vezane s kromosomom.

V predloženi prijavi se plazmid in vektor uporabljata izmenično, ker je plazmid najbolj običajno uporabljena oblika vektorja. Vendar pa je namen izuma, da vključi tudi takšne druge oblike vektorjev, ki imajo ekvivalentne funkcije in ki bodo prepoznavni v tehniki, kije opisana kasneje.

Rekombinantne celice gostitelja so celice, ki so bile transformirane z vektorji, ki so skonstruirani z uporabo rekombinantnih DNA tehnik. Kot je definiran tukaj, je t-PA proizveden v dobljenih količinah na osnovi te transformacije, raje kot v takšnih manjših količinah ali, kot je bolj običajno, v takšnih količinah, ki so manjše od tistih, ki se dajo detektirati, kot se lahko proizvedejo s pomočjo netransformiranega gostitelja. t-PA proizveden s pomočjo takšnih celic, lahko imenujemo rekombinantni t-PA.

B. Kulture celic gostiteljev in vektorji

Vektorji in postopki, ki so opisani tukaj, so primerni za uporabo v celicah gostiteljev v širokem intervalu prokariotskih in evkariotskih organizmov.

Seveda so v glavnem želeni prokarioti za kloniranje DNA sekvenc v konstrukciji vektorjev, ki so uporabni v izumu. Npr., še posebno je koristen E. coli K12 soj 294 (ATCC No. 31446). Drugi mikrobni soji, kijih lahko uporabljamo, vključujejo E. coli soje, kot so E. coli B in E. coli Χ17776 (ATCC No. 31537). Ti primeri so seveda namenjeni kot ilustrativni in ne kot omejujoči.

Za ekspresijo pa lahko prav tako uporabljamo prokariote. Uporabljamo lahko prej omenjene soje, kot tudi E. coli W3110 (F, lambda', prototrofni, ATCC No. 27325), takšni bacili kot je Bacillus subtilis, in druge enterobakterije, kot so Salmonella tvphimurium ali Serratia marcesans in razne pseudomonas vrste.

V glavnem se v zvezi s temi gostitelji uporabljajo plazmidni vektorji, ki vsebujejo replikon in kontrolne sekvence, ki so izvedene iz vrst, ki so kompatibilne s celicami gostitelja. Vektor običajno nosi mesto za replikacijo, kot tudi markirne sekvence, ki lahko zagotovijo fenotipsko selekcijo v transformiranih celicah. Npr. E. coli se tipično transformira z uporabo pBR 322, plazmida, ki je izveden iz E. coli vrst (Bolivar, et al. Gene 2: 95 (1977)). pBR322 vsebuje gene za odpornost na ampicilin in tetraciklin in tako zagotavlja prosta sredstva za identifikacijo transformiranih celic. pBR322 plazmid ali drugi mikrobni plazmid mora prav tako vsebovati, ali mora biti modificiran da to vsebuje, promotorje, ki se jih da uporabiti s pomočjo mikrobnega organizma za ekspresijo njegovih lastnih proteinov. Promotorji, ki se najbolj običajno uporabljajo v konstrukciji rekombinantne DNA, vključujejo promotorske sisteme za /3-laktamazo (penicilanazo) in laktozo (Chang et al. Nature, 275: 615 (1978); Itakura, et al, Science, 198: 1056 (1977); (Goeddel, et al Nature 281: 544 (1979)) in promotorski sistem za triptofan (trp) (Goeddel, et al, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EPO Appl. Publ. No. 0036776). Čeprav so ti najbolj običajno uporabljani, pa so bili odkriti in uporabljani drugi mikrobni promotorji, in objavljeni so tudi detajli, ki se nanašajo na njihove nukleotidne sekvence, kar izkušenemu raziskovalcu omogoča, da jih operativno poveže s plazmidnimi vektorji (Siebenlist, et al. Celi 20: 269 (1980)). Pole prokariotov se lahko prav tako uporabljajo tudi evkariotski mikrobi, kot so kulture kvasa. Med evkariotskimi organizmi se najpogosteje uporabljajo Saccharomvces cerevisiae ali navaden pekarski kvas, čeprav je dostopno tudi večje število drugih sojev. Za ekspresijo v Saccharomvces se običajno uporablja plazmid YRp7, npr. (Stinchcomb, et al, Nature, 282: 39 (1979), Kingsman et al, Gene, 7: 141 (1979); Tschemper, et al, Gene, 10: 157 (1980)). Ta plazmid že vsebuje trpi gen, ki zagotavlja selekcijski marker za mutantni soj kvasa, ki nima sposobnosti rasti v triptofanu, npr. ATCC No. 44076 ali PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). Prisotnost trpi poškodbe kot karakteristike genoma celice gostitelja, kvasa tedaj zagotavlja učinkovito okolico za detekcijo transformiranja s pomočjo rasti v odsotnosti triptofana.

Primerne sekvence za promocijo v vektorjih kvasa vključujejo promotorje za

3-fosfoglicerad kinazo (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) ali druge glikolitske sisteme (Hess, et al., J. Adv. Enzvme Reg.. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistrv, 17: 4900 (1978)), kot so enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerad mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza in glukokinaza. Ob konstrukciji primernih ekspresijskih plazmidov se terminalne sekvence, ki spremljajo te gene, prav tako ligirajo v 3’ nosilec za ekspresijo želene sekvence, ki se mora izraziti za zagotovitev poliadeniliranja mRNA in terminacije. Drugi promotorji, ki imajo dodatno sposobnost kontrolirane transkripcije s pomočjo pogoja rasti, so promotorske regije za alkoholdehidrogenazo 2, izocitohrom C, kislo fosfatazo, degradativne encime, ki spremljajo metabolizem dušika, in prej omenjeno gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo in encime, ki so odgovorni za izkoriščanje maltoze in galaktoze (Holland, ibid.). Primeren je katerikoli plazmidni vektor, ki vsebuje promotor, ki je kompatibilen s kvasom, izvor replikacije in terminalne sekvence.

Poleg mikroorganizmov, se lahko kot gostitelji uporabljajo prav tako kulture celic, ki so izvedene iz večceličnih organizmov. V principu funkcionira katerakoli takšna celična kultura, ne glede na to ali je od vretenčarjev ali nevretenčarjev. Seveda pa je največje zanimanje za celice vretenčarjev in propagacija celic vretenčarjev v kulturi (tkivni kulturi), je v zadnjih letih postala rutinski postopek /Tissue Culture Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)/. Primeri takšnih uporabnih celičnih linij gostiteljev so VERO in HeLa celice, celične linije jajčnikov kitajskega hrčka (CHO), in W138, BHK, COS-7 in MDCK celične linije. Ekspresijski vektorji za takšne celice običajno vključujejo (po potrebi) izvor replikacije, promotor, ki je lociran pred genom, ki ga je potrebno izraziti, skupaj s katerimikoli mesti potrebnimi za vezavo ribosoma, mesti za rezanje RNA, mestom za poliadeniliranje in transkripcijskimi terminalnimi sekvencami.

Za uporabo v celicah sesalcev, se kontrolne funkcije na vektorjih za ekspresijo pogosto zagotavljajo s pomočjo virusnega materiala. Npr., promotorji, ki se običajno uporabljajo, so izvedeni iz polioma, Adenovirusa 2 in najpogosteje iz Simian Virusa 40 (SV40). Prejšnji in kasnejši promotorji SV40 virusa so še posebej koristni zaradi tega, ker se jih da pridobivati iz virusa kot fragment, ki prav tako vsebuje SV40 virusni izvor replikacije (Fiers, et al, Nature, 273: 113 (1978), vključen tu kot referenca). Prav tako se lahko uporabljajo manjši in večji SV40 fragmenti, pod pogojem, daje vključena sekvenca s približno 250 bp, ki se razteza od Hind III mesta proti Bgl I mestu, ki se nahaja v virusnem izvoru replikacije. Nadalje je prav tako možno, in pogosto želeno, da se uporablja promotorske ali kontrolne sekvence, ki običajno spremljajo želeno sekvenco gena, pod pogojem, da so takšne kontrolne sekvence kompatibilne s celičnimi sistemi gostiteljev.

Izvor replikacije lahko zagotovimo ali s konstrukcijo vektorja tako, da vključimo nek eksogeni izvor, kot je tisti, ki se izvede iz SV40 ali drugega virusnega (npr., Polioma, Adeno, VSV, BPV, itd.) izvora, ali pa ga lahko zagotovimo s pomočjo mehanizma za kromosomno replikacijo celic gostitelja. Če je vektor integriran v kromosom celice gostitelja, je slednji pogosto zadosten.

Ob izboru želenih celic gostiteljev za transfekcijo s pomočjo vektorja v smislu izuma, ki obsega DNA sekvence, ki kodirajo tako t-PA kot DHFR protein, je ustrezno da izberemo gostitelja glede na tip uporabljenega DHFR proteina. Če uporabljamo DHFR protein divjega tipa, je želeno, da izberemo celice gostitelja, ki so deficitne z DHFR, tako da omogočimo uporabo sekvence za kodiranje DHFR, kot markerja za uspešno transfekcijo v selektivni podlagi, ki nima hipoksantina, glicina in timidina. Ustrezna celica gostitelja je v tem primeru celična linija jajčnika kitajskega hrčka (CHO), kije deficitna z DHFR aktivnostjo, kije napravljena in proparigrana, kot je opisano v Utlaub and Chasin, Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 (1980), kije tu vključeno kot referenca. Po drugi strani pa, če DHFR protein z nizko afiniteto za ΜΤΧ uporabljamo kot kontrolno sekvenco, ni potrebno uporabljati DHFR deficitnih celic. Ker je mutantni DHFR rezistenten proti metotreksatu, lahko uporabljamo podlage, ki vsebujejo ΜΤΧ kot sredstvo za selekcijo, pod pogojem, da same celice gostitelja niso občutljive na metotreksat. Izgleda pa, da so mnoge ekvariotske celice, ki so sposobne absorpcije ΜΤΧ, občutljive na metotreksat. Ena takšna celična linija je CHO linija, CHO-K1ATCC št. CCL 61.

Primeri, ki so prikazani nižje, opisujejo uporabo E. coli z uporabo lac i promotorskega sistema in uporabo CHO celic kot celic gostitelja in uporabo ekspresijskih vektorjev, ki vključujejo SV40 izvor replikacije kot promotor. Seveda je znotraj znanja strokovnjakov, da uporabljajo analogne tehnike za konstrukcijo ekspresijskih vektorjev za ekspresijo želene proteinske sekvence v alternativnih prokariotskih ali evkariotskih kulturah celic gostiteljev.

Zadovoljujoče količine človeškega t-PA proizvajamo s pomočjo celičnih kultur, kasnejša čiščenja z uporabo sekundarne sekvence za kodiranje pa jačajo celo tudi višje nivoje proizvodnje. Sekundarna sekvenca za kodiranje obsega dehidrofolat reduktazo (DHFR), na katero vplivamo s pomočjo parametra kontroliranega od zunaj, kot je metotreksat, tako da omogočamo kontrolo ekspresije s pomočjo kontrole koncentracije metotreksata (ΜΤΧ).

C. Uporabljani postopki

Če se kot celice gostitelja uporabljajo celice brez močnih celičnih membranskih barier, se transfekcija izvaja s postopkom obarjanja s kalcijevim sulfatom, kot je opisano v Graham and Van der Eb, Virologv, 52: 546 (1978). Vendar pa se lahko prav tako uporabljajo tudi drugi postopki za uvajanje DNA v celice, kot s pomočjo nuklearne injekcije ali s pomočjo kondenzacije protoplasta.

Če se uporabljajo prokariotske celice ali celice, ki vsebujejo v bistvu celične membranske konstrukcije, je želen postopek za transfekcijo obdelava s kalcijem ob uporabi kalcijevega klorida, kot je opisano v Cohen, F.N. et al Proč. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).

Konstrukcijo primernih vektorjev, ki vsebujejo želene sekvence za kodiranje in kontrolo, izvajamo s standardnimi tehnikami ligacije. Izolirani plazmidi ali DNA fragmente cepimo, krojimo in religiramo v želeno obliko, da oblikujemo potrebne plazmide.

Cepitev izvedemo z obdelavo restrikcijskega encima (ali več encimov) v primernem pufru. V glavnem se uporablja 1 gg plazmida ali DNA fragmenta z okoli 1 enoto encima v okoli 20 gl puferske raztopine. (Ustrezne količine pufra in substrata za določene restrikcijske encime so specificirane s strani proizvajalca). Operativni čas inkubacije je okoli 1 ura na 37 °C. Po inkubaciji protein ločimo z ekstrakcijo s fenolom in kloroformom, in nukleinsko kislino izoliramo iz vodne frakcije z obarjanjem z etanolom.

Če so potrebni topi konci, preparat tretiramo 15 minut na 15° z 10 enotami polimeraze I (Klenow), ekstrahiramo s fenol-kloroformom in oborimo z etanolom.

Ločevanje razcepljenih fragmentov po velikosti izvajamo z uporabo 6 %-nega poliak15 rilamidnega gela, kot je opisano v Goeddel, D., et al, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980), kije tu vključen kot referenca.

Za ligacijo približno ekvimolarih količin želenih komponent, ki so ustrezno skrojene na koncu, da zagotovimo korektno ujemanje, le te obdelamo z okoli 10 enotami T4 DNA ligaze na 0,5 μ-g DNA (kadar kot komponente uporabljamo razcepljene vektorje, je lahko koristno, da preprečimo religacijo razcepljenega vektorja s predhodno obdelavo z bakterijsko alkalno fosfatazo).

Za analizo, za potrditev točne sekvence v skonstruiranih plazmidih, uporabljamo ligacijske zmesi za transformiranje E. coli Ki2 soja 294 (ATCC 31446), in uspešne transformante izberemo na osnovi rezistentnosti na ampicilin ali tetraciklin, kadar je to potrebno. Plazmide iz transformantov pripravimo, analiziramo z restrikcijo in/ali sekvenciranjem s pomočjo postopka po Messing, et al, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) ali iz Maxam, et al, Methods in Enzvmologv, 65:499 (1980).

Amplifikacijo sekvenc za kodiranje DHFR proteina izvedemo z rastjo celičnih kultur gostitelja v prisotnosti približno 20-500,000 nM koncentracije metotreksata, kompetitivnega inhibitorja DHFR aktivnosti. Seveda je učinkovit interval koncentracije zelo odvisen od narave DHFR gena, proteina in lastnosti gostitelja. Jasno je, da se ne da ugotoviti splošno definiranih zgornjih in spodnjih mej. Prav tako se lahko uporabljajo primerne koncentracije drugih analogov folne kisline ali drugih spojin, ki inhibirajo DHFR. Seveda pa je sam ΜΤΧ primeren, lahko dostopen in učinkovit.

D. Splošen opis prednostnih izvedb

Aktivator plazminogena človeškega tkiva dobimo po naslednjem protokolu:

1. Človeške celice melanoma, ki proizvajajo aktivator plazminogena tkiva, gojimo, dokler ne stečejo.

2. Celične granule iz takšnih celičnih kultur ekstrahiramo v prisotnosti inhibitorjev ribonukleaze, tako da izoliramo vso RNA citoplazme.

3. Oligo-dT kolona izolira celotno informacijsko RNA (mRNA) v poliadenilirani obliki. Takšno mRNA frakcioniramo še po velikosti z elektroforezo na kislina-karbamid agaroznem gelu.

4. Gelsko frakcijo, ki vsebuje specifično RNA aktivatorja plazminogena tkiva, identificiramo na naslednji način:

RNA iz vseh frakcij gela prevedemo v in vitro sistemu retikulocitnega lizata kunca, ki je dopolnjen z mikrosomi pankreasa psa. Dobljene proizvode translacije nato imuno-precipitiramo s specifičnim IgG protitelesom aktivatorja plazminogena človeškega tkiva.

5. Ustrezno RNA (21 do 24S) prevedemo v ustrezno komplementarno enoverižno DNA (cDNA), iz katere se proizvaja dvojnoverižna cDNA. Po poli-dC krojenju jo vstavimo v vektor, kot je plazmid, ki nosi en ali več fenotipskih markerjev.

6. Tako pripravljene vektorje uporabljamo za transformiranje bakterijskih celic, tako da zagotovimo knjižnico klonirane DNA. Napravimo skupino radiomarkiranih sintetičnih deoksioligonuleotidov, ki so komplementarni s kodoni za znane aminokislinske sekvence v t-PA, kot je npr. skupina 8 14merov, 5’-dTC(Q)CA(g)TA(^)TCCCA-3’ komplementaren s sekvencami, ki kodirajo znano - glej nižje - aminokislinsko sekvenco : triptofan glutaminska kislina - tirozin - cistein - asparaginska kislina (W-E-Y-C-D) in se uporablja za sondiranje biblioteke kolonij.

7. Iz pozitivnih cDNA klonov izoliramo plazmidno DNA in jo sekvenciramo.

8. Sekvencirano DNA, ki kodira t-PA nato krojimo in vitro za vstavljanje v ustrezni nosilec za ekspresijo, ki ga uporabimo za transformiranje ustrezne celice gostitelja, kateri dovolimo, da raste v kulturi in da proizvede želeni aktivator plazminogena človeškega tkiva.

9. Tako proizveden aktivator plazminogena človeškega tkiva ima približno 251 amino kislin v svojem encimatskem serin proteaznem delu in kringle, ki vsebuje sekvenco navzgor od njega, za katero se trenutno verjame, da je odgovorna za vezavo fibrina. Zreli protein plus njegova signalna presekvenca imata skupaj 562 aminokislin.

Predhodni postopek je sam po sebi uspešen za proizvodnjo čistega t-PA. Postopki v smislu izuma, ki se uporabljajo za dopolnilno sekvenco za kodiranje, ki je občutljiva na metotreksat, omogočajo proizvodnjo v celičnih tkivnih kulturah antigensko aktiv17 nega t-PA proteina v večjih količinah od 0,1 pg na celico na dan. S primerno uporabo pogojev za amplifikacijo lahko dobimo večje količine od 20 pg na celico na dan. V spremenjenih pogojih lahko dosežemo nivoje ekspresije gena, ki vodijo do proizvodnje več kot 9 x 10‘⁶ Plough enot na celico na dan ali, s primerno amplifikacijo, več kot 18 x 10^-4 Plough enot t-PA aktivnosti.

V tem vidiku izuma uporabljamo prednost metotreksata kot zdravila, ki, čeprav je normalno usoden za celice, ki ga lahko uporabljajo, omogoča celicam, da rastejo v prisotnosti kontroliranih nivojev ΜΤΧ z amplifikacijo gena ki kodira sekvenco za kodiranje DHFR (Schimke, Robert T. et al, Science, 202: 1051 (1978); Biedler, J.L. et al, Cancer Res. 32:153 (1972); Chang, S.E., et al, Celi, 7: 391 (1976)).

Za ta vidik izuma je pomemben prikaz, da lahko amplifikacija gena za DHFR izzove amplifikacijo spremljajočih sekvenc, ki kodirajo druge proteine. Izgleda da je to primer, kadar je spremljajoči protein površinski antigen hepatitisa B (HBsAg) (Christman, J Et al, Proč. Natl. Acad. Sci., 79: 1815 (1982): E. coli protein XGPRT (Tingold, Gordon, et al, J. Moleč, and Appl. Gen., 1: 165 (1981)); in endogena sekvenca kombinacije plazmidov DHFR/SV40 (Kaufman, R.F. et al. J. Moleč. Biol., 159: 601 (1982)).

Drugi mehanizmi za zagotavljanje rezistentnosti na metotreksat vključujejo zmanjševanje afinitete za vezavo DHFR proteina, tako da je manj občutljiv na metotreksat (Flintoff, W.F. et al Šomat. Celi Genet., 2: 245 (1976) toda tudi v tem primeru izgleda, da se pojavlja amplifikacija.

Izgleda, da se geni tako za DHFR divjega tipa, kot za DHFR, ki je rezistenten proti ΜΤΧ, na osnovi njihove zmanjšane kapacitete za vezavo, amplificirajo ob prisotnosti ΜΤΧ. Zaradi tega se v principu ta vidik izuma nanaša na uporabo vpliva amplifikacije DHFR sekvence na sekvence za kodiranje spremljajočega proteina, kar omogoča povečane nivoje ekspresije t-PA sekvence v prisotnosti ΜΤΧ, ali na osnovi predhodnega tretiranja transformiranih celic z ΜΤΧ.

E. Primeri

Namen naslednjih primerov je ilustracija, in ne omejevanje izuma. Kot celične kulture gostitelja smo v tukajšnjih primerih uporabili kulture gostitelja E. coli in CHO celično linijo, ki je primerna za sekvenco za kodiranje DHFR tip proteina, ki jo je potrebno uvesti. Seveda pa so za postopek v smislu izuma primerne prav tako tudi druge evkariotske in prokariotske celice.

E.l Ekspresija človeškega t-PA gena v E. coli

E.l.A Legende slik

Slika 1 je avtoradiogram 10 odstotnega SDS PAGE ki prikazuje imunoprecipitiran(e) z (³⁵S)-metioninom markiran(e) protein(e) izločen(e) iz človeških melanomov celic v teku 3-urnega pulza in vivo, v prisotnosti (linija b) ali odsotnosti (linija a) proteaznega inhibitorja aprotinina. Po imunoprecipitaciji s specifičnim IgG aktivatorjem plazminogena, opazimo tri trakove (linija a), ki imajo molekulske mase približno 65,000, 63,000 in 35,000. V prisotnosti inhibitorja proteaze pa nismo opazili vrste molekulske mase 35,000. Kadar uporabljamo preimunološki serum (linija c) ni imunoprecipitiranih proizvodov. Migracije in molekulske mase ¹⁴C-markiranih proteinskih standardov so prikazane levo od linije a.

Slika 2 opisuje gelsko elektroforezo imunoprecipitiranih translacijskih proizvodov RNA frakcij, izoliranih iz kislina-karbamid agaroznega gela. Glavni trak je opažen v frakcijskih številih 7 in 8 po translaciji v prisotnosti mikrosoma pankreasa psa in nato imunološkega precipitiranja s specifičnim IgG aktivatorjem plazminogena tkiva. Ta trak ima molekulsko maso približno 63,000 daltonov. Velikost mRNA, ki migrira v frakcije 7 in 8 je približno 21 do 24 S. Položaji ribosomnih RNA markerjev, ki so določeni po elektroforezi na RNA karbamidnem gelu in vizualizirani z obarvanjem z etidijevim bromidom, so markirani nad ustreznimi linijami gela.

Slika 3 prikazuje shemo hibridizacije 96 kolonij z ³²P-dTC(_G)CA(£)TA(£)TCCCA (W-E-Y-C-D) sondo. 96 posameznih transformantov gojimo na mikrotitrski plošči, replikante nanesemo na ploščice in gojimo na nitrocelulozni membrani. Kolonije nato razcepimo, bakterijsko DNA filtriramo in filtre hibridiziramo s ³²P-14-mer (W-E-Y-C-D) sondami. Filtre speremo, da ločimo nehibridizirano sondo in izpostavimo filmu z X-žarki. Ta avtoradiogram predstavlja sheme, dobljene z 48 posameznimi filtri (4600 neodvisnih kolonij). En primer pozitivnega cDNA klona aktivatorja plazminogena tkiva na filtru št. 25 je označen kot E10 (puščica).

Slika 4 je restrikcijski endonukleazni načrt cDNA aktivatorja plazminogena človeškega tkiva polne dolžine. Število in velikost fragmentov proizvedenih s cepitvijo z restrikcijsko endonukleazo ocenimo z elektroforezo skozi 6 odstotne akrilamidne gele. Položaje mest potrdimo s sekvenco nukleinske kisline (predstavljena na sliki 5). Regija za kodiranje največjega odprtega okvira za odčitavanje je v škatli, zasenčena regija pa predstavlja domnevno sekvenco signalnega polipeptida, medtem ko točkasta regija predstavlja domnevno sekvenco zrelega aktivatorja plazminogena tkiva (527 aminokislin). 5’ konec mRNA je levo, medtem koje 3’ konec desno.

Slike 5A, 5B in 5C ilustrirajo nukleotidno sekvenco in izvedeno aminokislinsko sekvenco cDNA aktivatorja plazminogena človeškega tkiva polne dolžine. 35 aminokislin (-35 do - 1), ki so pred zrelo sekvenco, so opisane kot neprekinjena sekvenca. Domneva se, da ta 35-aminokislinska sekvenca sestoji iz hidrofilne pro sekvence, ki je predhodna serinu (+1) zrelega proteina, z okoli 12 do 15 aminokislinami, kateri je zopet predhoden konvencionalni hidrofobni signal (ki širi 5’ do -35). Ta tip pre-pro strukture na izločenih proteinih je opisan predhodno, npr. s preproalbuminom. Predpostavljajoč to teorijo, se vse molekule izločenega aktivatorja plazminogena tkiva začenjajo s serinom (+1) kot amino- terminusom. Druga teorija je, da je lahko hidrofilna sekvenca vključena s funkcijo aktivatorja plazminogena tkiva na analogen način, kot je tisti opažen s plazminogenom, kjer lahko peptid z 10,000 daltoni ločimo od amino terminalnega dela nativnega plazminogena (Glu-plazminogen, imenovan po aminoterminalnem ostanku), kar vodi do manjše molekule z novim aminoterminusom, označene Lys-plazminogen. Lys-plazminogen se laže aktivira v plazmin, prav tako pa ima tudi večjo afiniteto do fibrina kot Glu-plazminogen. Pokazano je bilo, da plazmin katalizira konverzijo Glu- v Lys-plazminogen. Ta tip kontrolnega mehanizma vodi do mehanizma pozitivne kontrole povratnega odziva. Prve količine tvorjenega plazmina, poleg degradiranja fibrina, prav tako vodijo do generiranja molekul plazminogena, ki se laže aktivirajo in se prav tako bolj čvrsto vežejo na njihov substrat kot nativni plazminogen. Rezultat je hitrejša degradacija plazmina. Hidrofilni peptid aktivatorja plazminogena tkiva bi lahko bil vključen v podoben mehanizem, pri čemer njegova cepitev vodi do modificirane vezave encima na fibrin. V vsakem primeru smatramo sekvenco s 35 aminokislinami za presekvenco zrelega proteina.

Slika 6 je shematski diagram konstrukcije plazmida pdeltaRIPA⁰ za ekspresijo aktivatorja plazminogena tkiva. Izhodni plazmid pPA25E10 najprej digeriramo s Pstl, da izoliramo fragment s 376 bp (baznimi pari), ki ga nato digeriramo kot je prikazano na sliki.

Slika 7 prikazuje rezultat fibrinskega testa na ploščici na fibrinolitično aktivnost ekspresijskega proizvoda, dobljenega preko pdeltaRIPA⁰ v transformiranih celicah.

Slika 8 je HPLC sled peptidov iz tripsinskega izločka (njihovega aktivatorja plazminogena tkiva) (apsorbanca pri 210 nm). Puščica označuje pik, ki ustreza peptidu, ki smo ga uporabili za konstrukcijo nukleotidne sonde, ki smo jo uporabili z knjižnico kolonij. Ugotovili smo, da ima peptid predstavljen s tem pikom celo sekvenco: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Na podoben način smo sekvencirali tudi druge glavne pike in ugotovili smo, da potrjujejo korektno amino sekvenco aktivatorja plazminogena človeškega tkiva. Peptidni kod z eno črko, ki se nanaša na oznake aminokislin, je kot sledi:

Asp	D	asparaginska kislina	Ile	I	izolevcin
Thr	T	treonin	Leu	L	levcin
Ser	S	serin	Tyr	Y	tirozin
Glu	E	glutaminska kislina	Phe	F	fenilalanin
Pro	P	prolin	His	H	histidin
Gly	G	glicin	Lys	K	lizin
Ala	A	alanin	Arg	R	arginin
Cys	C	cistein	Trp	W	triptofan
Val	V	valin	Gin	Q	glutamin
Met	M	metionin	Asn	N	asparagin

Slika 9 opisuje konstrukcijo plazmida, ki kodira za direktno ekspresijo zrelega aktivatorja plazminogena človeškega tkiva v E. coli. 50 μ-g plazmida pPA17 digeriramo z Sau3AI HincII in Hhal in elektroforiramo na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. Regeneriramo približno 0,5 μ-g 55 bp Sau3AI-HhaI fragmenta. Na podoben način približno 3 p,g 263 bp Hhal-Narl fragmenta prečistimo s 80 /xg klona pPA25E10 najprej z izoliranjem 300 bp Pstl-Narl fragmenta in nato digeriranjem tega fragmenta s Hhal. Vsa digeriranja izvajamo na 37 °C 1 uro in reakcijske produkte razstavimo in elektroeluiramo iz 6 odstotnih poliakrilamidnih gelov. Dva označena deoksioligonukleotida 5’ dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) in 5’ GATCACTTGATAAGACATG (II) sintetiziramo s pomočjo fosfotriesterskega postopka v trdni fazi (51). 100 pmolov oligonukleotida II fosforiliramo v 30 gl reakciji, ki vsebuje 60 mM Tris (pH 8), 10 mM MgCl₂, 15 mM beta-merkaptoetanola in 50 gCi/gama³²P/ATP (Amersham 5,000 Ci mmol·¹), dodamo 12 enot T4 polinukleotid kinaze in reakcijo pustimo, da teče na 37°C 15 min. Nato dodamo 1 gl 10 mM ATP in 12 enot T4 kinaze in reakcijo pustimo teči še 30 minut. Po fenol/CHCl₃ ekstrakciji fosforiliran oligomer II in 5’ hidroksilni oligomer I spojimo z 0,5 μ% eluiranega 55 bp Sau3AI-HhaI fragmenta in 2 μ% 263 bp Hhal-Narl fragmenta in izvedemo obarjanje z etanolom. Te fragmente ligiramo na sobni temperaturi 4 ure v 60 μ\ 20 mM TrisHC1 (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM ditiotreitola, 0,5 mM ATP in 1000 enot T4 DNA ligaze. Zmes 1 uro digeriramo s 48 enotami Nar I, 20 enotami EcoRI in 40 enotami Bgl II (da eliminiramo polimerizacijo preko ligacije kohezivnih Sau3AI terminusov) in elektroforiramo na 6 odstotnem gelu. Produkt s 338 bp (približno 0,1 gg) regeneriramo z elektroeluacijo. Preostale sekvence za kodiranje t-PA (aminokisline

111-528) izoliramo na 1645 bp fragmentu z digeriranjem plazmida pPA25E10 s Narl in Bglll. Plazmid pLeIFAtrplO3 je derivat plazmida pLeIFA25 (52), v katerem je EcoRI mesto oddaljeno od LeIF A gena odstranjeno 53). Tri gg pLeIFAtrpl03 digeriramo z 20 enotami EcoRI in 20 enotami Bglll 90 minut na 37°C, elektroforiramo na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu in z elektroeluacijo regeneriramo velik vektorski fragment (okoli 4200 bp). Za končno konstrukcijo ligiramo 80 ng EcoRI-Bglll pLeIFAtrpl03 s 100 ng 1645 bp Narl-Bglll fragmenta v 20 ng 338 bp EcoRI-Narl fragmenta 10 ur na sobni temperaturi. To ligacijsko zmes uporabimo za transformiranje E. coli K-12 soja 294. Iz 38 od teh transformantov napravimo plazmidno DNA in jo digeriramo z EcoRI. Od teh plazmidov jih je deset vsebovalo želene 600 bp in 472 bp EcoRI fragmente. Analiza DNA sekvence je potrdila, da ni imel niti eden od teh plazmidov (pt-PAtrpl2) želene nukleotidne sekvence na spojih med trp promotorjem, sintetsko DNA in cDNA.

Slika 10 prikazuje rezultat fibrinskega testa na ploščici na fibrinolitično aktivnost ekspresij skega produkta aktivatorja plazminogena tkiva. Nočno kulturo E. coli W3110/pt-PAtrpl v Luria brozgi, ki vsebuje 5 gg ml·¹ tetraciklina razredčimo 1:100 v M9 podlagi, ki vsebuje 0,2 % glukoze, 0,5 % kasamino kislin in 5 gg ml'¹ tetraciklina. Celice gojimo na 37°C do Α_55θ 0,2 in dodamo indolakrilno kislino do končne koncentracije 20 gg/ml. Vzorce zberemo s centrifugiranjem na Α_55θ = 0,5-0,6 (okoli 2xl0⁸ celic ml⁴) in jih takoj zamrznemo. Granule celic suspendiramo v 6M gvanidin hidrokloridu pri 5xl0⁸ celic/ml, jih sonificiramo 10 sekund, inkubiramo na 24°C 30 min in nato dializiramo 4 ure proti 25 mMTris-HCl pH 8,0, 250 mM NaCl, 0,25 mM EDTA in 0,01 odstotnim Tween 80. Po dializi vzorce centrifugiramo pri 13.000 obratih 2 minuti in 10 gl supernatanta analiziramo na aktivnost aktivatorja plazminogena tkiva. Po postopku iz Granelli-Piperno and Reich (87), ploščico inkubiramo 3,5 ure na 37 °C in izmerimo cone cepljenja. Kvantifikacijo dosežemo s primerjavo z razredčinami prečiščene raztopine aktivatorja plazminogena tkiva melanoma.

E.l.B. Izvor mRNA aktivatorja plazminogena tkiva

Uporabili smo celice človeškega melanoma (Bowes). Celice melanoma kultiviramo do vlivnih monoslojev v 100 ml Earles minimalne osnovne podlage, dopolnjene z natrijevim bikarbonatom (0,12 % končna koncentracija), 2 mM glutamina in 10 odstotnem toplotno inaktiviranem serumu fetusa teleta. Da potrdimo, da celice melanoma aktivno proizvajajo aktivator plazminogena človeškega tkiva, celice človeškega melanoma gojimo do vlivanja v mikrotitrski skodeli s 24 vdolbinami. Ali v prisotnosti, ali v odsotnosti 0,33 μΜ inhibitorja proteaze aprotinina, celice speremo enkrat s slano raztopino, ki je napufrana s fosfatnim pufrom in dodamo 0,3 ml serumske podlage, ki je brez metionina. Dodamo 75 gCi(³⁵S)-metionina in celice markiramo na 37°C 3 ure. Ko je 3 urno markiranje končano, podlage ločimo od celic in jih obdelamo s specifičnim IgG aktivatorjem plazminogena človeškega tkiva, ali s pre-imunološkim serumom za imunoprecipitacijo (54). Produkte imunoprecipitacije prikažemo z elektroforezo na 10 odstotnem SDS-akrilamidnem gelu. Košček gela fiksiramo, posušimo in podvržemo fluorografiji.

E.l.C. Izoliranje informacijske RNA in frakcioniranie po velikosti

Celotno RNA iz celičnih kultur melanoma ekstrahiramo v bistvu kot je navedeno v Ward et al. 55). Celice granuliramo s centrifugiranjem in jih nato resuspendiramo v 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5,1,5 mM MgCl₂. Celice razklopimo z dodajanjem NP-40 (končna koncentracija 1 odstotek) in jedra granuliramo s centrifugiranjem. Supernatant vsebuje celotno RNA, ki jo nadalje prečistimo z večkratnimi ekstrakcijami s fenolom in kloroformom. Vodno fazo napravimo 0,2 M glede na NaCl in nato celotno RNA oborimo z dodatkom 2 volumnov etanola. Za prečiščevanje mRNA iz celokupnih preparatov RNA uporabimo oligo-D-Tcelulozno kromatografijo (54). Tipični dobitki iz 10 g gojenih celic melanoma so 5 do 10 mg celotne RNA in 50-20 gg Poli (A) plus mRNA.

Frakcioniranje PoliA⁺ (200 /tg) (56) izvedemo z elektroforezo skozi karbamidagarozne gele. Košček agaroznega gela (57, 58) je bil sestavljen iz 1,75 % agaroze, 0,025 M natrijevega citrata, pH 3,8 in 6 M karbamida. Elektroforezo izvajamo 7 minut na 25 miliamp in 4 °C. Gel nato frakcioniramo z rezilom britvice. Posamezne rezine raztopimo na 70 °C in ekstrahiramo 2-krat s fenolom in enkrat s kloroformom. Frakcije oborimo z etanolom in nato testiramo s pomočjo in vitro translacije v retikulocitnem lizatnem sistemu kuncev Bethesda Research Lab. (59, 60), ki je dopolnjen s mikrosomi pankreasa psa na naslednji način: translacije izvedemo z uporabo 25 /tCi (³⁵S) metionina in 500 nanogrami vsake rezine gela RNA v končnem volumnu 30 /tl, ki vsebuje 25 mM HEPES, 48,3 mM kalijevega klorida, 10 mM kreatin fosfata, po 50 mM vsake od 19 aminokislin, 1,1 mM magnezijevega klorida,

16,6 mM EDTA, 0,16 mM ditiotreitola, 8,3 mM hemina, 16,6 /tg/ml kreatin kinaze, 0,33 mM kalcijevega klorida, 0,66 mM EGTA, 23,3 mM natrijevega klorida.

Inkubacije izvajamo na 30 °C 90 minut. Mikrosomne membrane pankreasa psa pripravimo iz grobih mikrosomov z uporabo EDTA za odstranitev ribosomov (61) in jih obdelamo z nukleazo, kot je opisano (62) in v translacijski zmesi so bile prisotne v končni koncentraciji 7 Α^θ enot/ml. Translacijske produkte ali imunoprecipitirane translacijske produkte analiziramo z elektroforezo na 10 odstotnih poliakrilamidnih gelih v natrijevem-dodecilsulfatu, kot je opisano prej (63). Neobarvane koščke gela fiksiramo, posušimo in podvržemo fluorografiji (64).

Dobljene translacijske produkte iz vsake frakcije gela imunoprecipitiramo s specifičnimi IgG aktivatorji plazminogena kunčjega anti-človeškega tkiva. Opazimo en glavni imunoprecipitiran polipeptidni pas v translaciji RNA frakcij številk 7 in 8 (migracija od 21 do 24 S), ki ima molekulsko maso približno 63,000 daltonov. Tega pasu nismo opazili, kadar smo za imunoprecipitacijo uporabili preimunološki IgG, kar kaže na to, da so ti polipeptidi specifični za aktivator plazminogena tkiva.

E.l.D. Priprava knjižnice kolonij, ki vsebujejo frekvence aktivatoria plazminogena tkiva /tg mRNA frakcionirane na gelu (rezina gela mRNA 7) uporabimo za pripravo dvojnoverižne cDNA s pomočjo standardnih postopkov (52, 65, 66). cDNA frakcioniramo po velikosti na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. cDNA večjo od 350 baznih parov po dolžini (125 ng) elektroeluiramo. 30 ng cDNA razširimo z deoksi (C) ostanki z uporabo terminalne deoksinukleotidil transferaze (67) in kalimo s 300 ng plazmidne pBR322 (68), ki je bila na podoben način skrojena z deoksi(G) ostanki na Pstl mestu (67). Kaljeno zmes nato transformiramo v E. coli K12 soju 294 (ATCC št. 31446). Dobimo približno 4600 transformantov.

E.l.E Priprava DNA sonde

Prečiščen aktivator plazminogena človeškega tkiva dobimo po postopku iz opisanih referenc (19,20).

Molekulo skeniramo z namenom locirati regije, ki so najprimernejše za pripravo sintetičnih sond, kot sledi:

Za pripravo proteinov, ki se jih da digerirati s tripsinom, smo izvedli redukcijo in karboksimetiliranje. Vzorec 2 mg aktivatorja plazminogena tkiva smo najprej dializirali proti 0,01 odstotnem Tween 80 preko noči pri sobni temperaturi. Liofilizirani protein smo nato raztopili v 12 ml 0,56 M Tris-HCl pufra (pH 8,6), 8 molarnem glede na karbamid in 5 mM EDTA. Disulfidne vezi smo reducirali z dodatkom 0,1 ml /3-merkapto etanola. To reakcijo smo izvedli pod dušikom v teku 2 ur na 45 °C. Reducirane disulfide smo alkilirali v karboksimetil derivat z dodatkom 1,0 ml 1,4 M jodoocetne kisline v 1 N NaOH. Po 20 minutah na sobni temperaturi smo reakcijo ustavili z dializo proti 0,01 odstotnem Tween 80 v teku 80 ur na sobni temperaturi in izvedli liofilizacijo.

Dobljeni liofilizirani karboksimetilirani protein smo ponovno raztopili v 3 ml 0,1 M natrijevega fosfatnega pufra (pH 7,5). Dodali smo tripsin (TP CK) (razmerje 1 proti 50) in digerirali na 37 °C. Po 3 urah, 6 urah in 12 urah smo odvzeli alikvote (0,1 ml). Drugi dodatek tripsina smo izvedli po 12 urah. Po 24 urah smo reakcijo ustavili z zamrzovanjem vzorca, vse dokler se ga je še dalo injicirati na HPLC. Napredek digeriranja smo določili s pomočjo SDS gela na alikvotih. Vsi geli so bili prazni, razen slabega traku na alikvotu po 3 urah. To je nakazalo, da je digeriranje v 24 urah kompletno in da ni ostalo nobenih velikih peptidov.

Vzorec (približno 0,5 ml) smo injicirali v Altex C-8 ultrasphere 5 μ kolono z visoko ločljivostjo v dveh delih. Uporabili smo postopni gradient acetonitrila (1 odstoten do 5 odstoten 5 minut, 5 odstoten do 35 odstoten 100 minut, 35-50 odstoten 30 minut). V enem od dveh preparativnih eksperimentov smo eluent spremljali na dveh valovnih dolžinah (210 nm in 280 nm). Razmerje absorpcij na dveh valovnih dolžinah smo uporabili za indiciranje peptidov, ki vsebujejo triptofan.

Najprej smo sekvencirali peptidne pike za katere je bilo najbolj verjetno, da vsebujejo triptofan, ali tiste, za katere smo verjeli, da so uporabni iz drugih razlogov. To je omogočilo določevanje sekvence okoli največjega števila triptofanov. Po sekvenciranju okoli 25 najboljših možnih peptidnih pikov, smo zbrali vse podatke o sekvenci, ki se jih da poravnati, tako da smo dobili preliminarni model primarne strukture aktivatorja plazminogena tkiva. Na osnovi teh podatkov in modelov smo locirali nekoliko možnih sond.

E. 1 .F. Identifikacija bakterijskih klonov, ki vsebujejo cDNA sekvence aktivatorja plazminogena tkiva

Kolonije smo posamezno inokulirali v jamice mikrotiterskih ploščic, ki vsebujejo LB (93) + 5 μ-g/ml tetraciklina in jih po dodatku DMSO do 7 odstotkov shranili na -20 °C. Dve kopiji knjižnice kolonij smo gojili na nitroceluloznih filtrih in DNA iz vsake kolonije smo fiksirali na filter s pomočjo Grunstein Hogness postopka (69).

³²P-markirano - TC(^)CA(q)TA(^)TCCCA sondo smo pripravili (iz sintetičnega oligomera) (W-E-Y-C-D) iz 14-mer skupin, kot je opisano zgoraj. Filtre, ki vsebujejo 4600 transformantov, smo prehibridizirali 2 uri na sobni temperaturi v 50 mm natrijevega fosfata pH 6,8,5xSSC (80), 150 jttg/m DNA sonificirane sperme lososa, 5x Denhardt-ove raztopine (85), 10 odstotkov formamida in nato smo jih hibridizirali z 50x 10⁶ štetji v minuti markirane sonde v isti raztopini. Po nočni inkubaciji na sobni temperaturi, smo filtre na sobni temperaturi sprali 3-krat v 6x SSC, 0,1 odstotnem SDS v teku 30 minut, enkrat z 2x SDS in jih nato izpostavili na Kodak XR-5 filmu za X-žarke Dupont Lightening Plus ojačevalnim sitom v teku 16 ur.

Plazmidno DNA izoliramo s hitrim postopkom (71) iz vseh kolonij, ki kažejo pozitivno reakcijo hibridizacije. cDNA vključke iz teh klonov nato sekvenciramo po subkloniranju fragmentov v M13 vektor mp 7 (73) in s pomočjo Maxam Gilbert kemijskega postopka (74). Slika 3 prikazuje filter št. 25, ki prikazuje shemo hibridizacije pozitivnega klona aktivatorja plazminogena tkiva. Prikazano je, da cDNA vključek v klonu 25E10 DNA, ki kodira aktivator plazminogena tkiva, in sicer s primerjavo njegove aminokislinske sekvence s peptidno sekvenco (glej zgoraj), ki je dobljena iz prečiščenega aktivatorja plazminogena tkiva in s pomočjo njegovega proizvoda ekspresije, proizvedenega v E. coli, kot je opisano natančneje spodaj. cDNA del klona 25E10 (plazmid pPA25E10) je imel 2304 baznih parov po dolžini z najdaljšim odprtim okvirom za odčitavanje, ki kodira protein s 508 aminokislinami (mol. masa. 56,756) in ki vsebuje 772 bp 3’ netranslantirano regijo. Ta cDNA klon ni imel N-terminalne sekvence za kodiranje.

E.l.G. Direktna ekspresija klona aktivatoria plazminogena človeškega tkiva v

E. coli

Z ozirom na sliko 6, smo digerirali 50 /xg pPA25E10 (zgoraj) s Pati in 376 bp fragment smo izolirali z elektroforezo na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. Približno 3 μ% tega fragmenta smo izolirali iz gela z elektroeluacijo, jih digerirali s 30 enotami Dde I 1 uro pri 37°C, ekstrahirali s fenolom in kloroformom in izvedli obarjanje z etanolom. Dobljene Dde I lepljive konce smo podaljšali do topih koncev z dodatkom 5 enot DNA polimeraze I (Klenow fragment) in 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP v reakcijsko zmes in z inkubacijo na 4°C 8 ur. Po ekstrakciji s fenolom in kloroformom smo DNA digerirali s 15 enotami Narl 2 uri in reakcijsko zmes elektroforirali na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. Regenerirali smo približno 0,5 μ-g želenega Narl fragmenta s 125 bp s topim koncem. Ta fragment kodira aminokisline št. 69 do 110 zrelega proteina aktivatorja plazminogena tkiva celotne dolžine.

Za izolacijo 1645 bp Nar I - Bgl II fragmenta digeriramo 30 μξ pPA25E10 s 30 enotami Nar I in 35 enotami Bgl II 2 uri na 37°C in reakcijsko zmes podvržemo elektroforezi na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. Regeneriramo približno 6 /xg želenega 1645 bp Nar Ι-Bgl II fragmenta.

Plazmid pdeltaRlSRC je derivat plazmida pSRCexl6 (79), v katerem so Eco Rl mesta, ki so blizu trp promotorja in oddaljena od SRS gena, odstranjena s popravkom s DNA polimeraze I (28) in samo-komplementarni oligodeoksinukleotid AATTATGAATTCAT (sintetiziran s pomočjo fosfotriestrskega postopka (75)) je vstavljen v preostalo Eco RI mesto neposredno ob Xbal mesto. 20 /ig pdeltaRlSRC digeriramo do kompletiranja z Eco RI, ekstrahiramo s fenolom in kloroformom in izvedemo obarjanje z etanolom. Plazmid nato digeriramo s 100 enotami nukleaze Sl pri 16 °C 13 minut v 25 mM natrijevem acetatu (pH 6,4), 1 mM ZnCl₂ in 0,3 M NaCl, tako da kreiramo top konec s sekvenco ATG. Po ekstrakciji s fenolom in kloroformom in obarjanjem z etanolom, DNA digeriramo s Bam HI, podvržemo elektroforezi na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu, in z elektroeluacijo regeneriramo velik vektorski fragment (4,300 bp).

Plazmid za ekspresijo sklopimo s skupno ligacijo 0,2 gg vektorja, 0,06 gg Narl fragmenta s 125 bp s topim koncem in 0,6 μξ Narl-Bglll fragmenta s 1645 bp z 10 enotami T4 DNA ligaze 7 ur na sobni temperaturi in ga uporabimo za transformiranje E. coli soja 294 (ATCC št. 31446) na rezistentnost proti ampicilinu. Plazmidno DNA napravimo iz 26 kolonij in jo digeriramo z Xbal in Eco RI. 12 teh plazmidov je vsebovalo željena 415 bp Xbal-Eco RI in 462 bp Eco Rl-fragmenta. Analiza DNA sekvence je potrdila, da je nekaj izmed teh plazmidov imelo ATG inicirajoči kodon pravilno postavljen na začetku aminokisline št. 69 (serin). Enega izmed teh plazmidov pdeltaRIPA⁰ smo testirali in proizvedel je željeni aktivator plazminogena tkiva (slika 7).

E.l.H. cDNA aktivatorja plazminogena tkiva polne dolžine

a. ) Priprava knjižnice kolonij, ki vsebuje N-terminalne sekvence aktivatorja plazminogena tkiva

0,4 gg sintetičnega oligonukleotida 5’ TTCTGAGCACAGGGCG 3’ smo uporabili za primiranje 7,5 gg gelske frakcije mRNA 8 (zgoraj) za pripravo dvojnoverižne cDNA s standardnimi postopki (65, 66). cDNA frakcioniramo po velikosti na 6 odstotnem poliakrilamidnem gelu. Frakcijo večje velikosti od 300 baznih parov (36 ng) elektroeluiramo. 5 ng razširimo z deoksi (C) ostanki z uporabo terminalne deoksinukleotidil transferaze (67) in kalimo s 50 ng plazmida pBR322 (68), kije bil skrojen na podoben način z deoksi (G) ostanki na Pst I mestu (67). Kaljeno zmes nato transformiramo v E. coli K12 soju 294. Dobimo približno 1500 transformantov.

b. ) Južna hibridizacija človeške genomne DNA

Ker reakcijo cDNA primiranja izvedemo z uporabo sintetičnega fragmenta, ki je hibridiziral 13 baznih parov iz N-terminalnega klona pPA25E10, ni bilo na razpolago primernega restrikcijskega fragmenta v tej regiji s 29 baznimi pari (ki vključuje 16merno sekvenco) za testiranje cDNA klonov. Zato je nujno, da izoliramo genomni klon aktivatorja plazminogena človeškega tkiva z namenom, da identificiramo cDNA klone razširjene s primerjem, ki vsebuje N-terminalne sekvence, ki kodirajo aktivator plazminogena tkiva.

Prva faza v tem postopku je vključevala ugotavljanje dejstva, da je prisoten samo en gen aktivatorja plazminogena homolognega tkiva v človeški genomni DNA. V tem postopku (77) smo 5 gg človeške limfocitne DNA z veliko molekulsko maso (pripravljene kot 80) digerirali do kompletiranja z različnimi restrikcijskimi endonukleazami, podvrgli elektroforezi na 1,0 odstotnih agaroznih gelih (81) in položili na nitrocelulozni filter (77). ³²P-markiran DNA vzorec smo napravili (76) iz 5’ konca cDNA vključka pPA25E10 (230 bp Hpall-Rsal fragment) in hibridizirali (82) z nitroceluloznim filtrom. 35xl0⁶ šteti na minuto sonde smo hibridizirali v teku 40 ur in nato izprali, kot je opisano (82). Dve shemi digeriranja z endonukleazo zagotavljajo samo en hibridizirajoč DNA fragment: Bgl II (5,7 Kbp) in Pvu II (4,2 Kbp). Dva hibridizirajoča DNA fragmenta smo opazili s Hinc II (5,1 Kbp in 4,3 Kbp). Zbrani vsi ti podatki sugerirajo na prisotnost samo enega gena za aktivator plazminogena tkiva v človeškem genomu in da ta gen vsebuje vsaj eno interventno sekvenco.

c.) Testiranje knjižnice človeškega lambda faga na gene za aktivator plazminogena tkiva

Strategijo, ki smo jo uporabili za identifikacijo rekombinantov lambda faga, ki nosijo gene aktivatorja plazminogena tkiva, je sestavljala detekcija nukleotidne homologije z radioaktivno sondo, ki je napravljena z cDNA pPA25E10 aktivatorja plazminogena tkiva. En milijon rekombinantnega lambda faga položimo na ploščico na DP 50 Sup F z gostoto 10,000 pfu/15 cm ploščice s postopkom iz Benton and Davis (78). ³²P-markirano DNA sondo smo pripravili s standardnimi postopki (83) iz 230 bp Hpall-Rsal fragmenta lociranega na 34 baznih parih iz 5’ konca plazmida pPA25E10. Vsak nitrocelulozni filter smo prehibridizirali na 42°C 2 uri v 50 mM natrijevega fosfata (pH 6,5), 5xSSC (77), 0,05 mg/ml DNA sonificirane sperme losusa, 5x Denhardt-ove raztopine (84), 50 odstotnem formamidu in nato hibridizirali s 50xl0⁶ štetji na minuto markirane sonde v isti raztopini, ki vsebuje 10 odstotkov natrijevega dekstran sulfata (85). Po nočni inkubaciji na 42 °C filtre speremo 4 krat na 50°C v 0,2xSSC, 0,1 odstotnem SDS v teku 30 minut, enkrat v 2xSSC pri sobni temperaturi in nato izpostavimo Kodak XR-5 filmu za X-žarke z Dupont Cronex ojačevalnimi siti preko noči. Dobimo celokupno 19 klonov, ki so hibridizirani s sondo. DNA faga je narejena iz 6 rekombinantov kot je opisano predhodno (86). Lambda klon C smo izbrali za pripravo PvuII fragmenta za testiranje kolonij. 30 ^g DNA digeriramo s Pvu II1 uro na 37°C in podvržemo elektroforezi na 1,0 odstotnih agaroznih gelih. Fragment s 4,2 kilobaznimi pari, za katerega je bilo predhodno dokazano, da vsebuje sekvence aktivatorja plazminogena tkiva, elektroeluiramo in prečistimo. ³²P markirano sondo pripravimo s standardnimi postopki (83) za hibridizacijo kolonij, kot je opisano nižje.

d.) Testiranje knjižnice kolonij na 5’ sekvence aktivatorja plazminogena tkiva

Kolonije smo prenesli s ploščic in jih gojili na nitroceluloznih filtrih in DNA iz vsake kolonije smo fiksirali na filter s pomočjo Grunstein-Hogness postopka (69). ³²Pmarkirano sondo smo napravili s primiranjem (83) Pvu II fragmenta s 42 kilobaznimi pari iz kravjega timusa iz izoliranega lambda genomnega klona aktivatorja plazminogena tkiva. Filtre, ki vsebujejo 1500 transformantov, smo hibridizirali s 112xl0⁶ cpm ³²P-genomnega Pvu II fragmenta.

Hibridizacijo smo izvajali 16 ur ob uporabi pogojev, ki so opisani v Fritsch et al (82). Filtre smo dobro sprali in nato izpostavili Kodak XR-5 filmu za X-žarke z Dupont Lightnig Plus ojačevalnimi siti 16-48 ur. 18 kolonij je jasno hibridizirano s genomno sondo. Plazmidno DNA smo izolirali iz vsake izmed teh kolonij in jo vezali na nitrocelulozne filtre in hibridizirali s ³²P-markiranim sintetičnim oligonukleotidom (16-mer) uporabljenim za originalno reakcijo primiranja. Izmed 18 klonov jih 7 hibridiziramo s kinaznim 16-merom. Po analizi sekvence, po subkloniranju fragmenta v ml3 vektor mp⁷ (73) se je pokazalo, da en klon (pPA17) vsebuje korektno 5’ N-terminalno regijo aktivatorja plazminogena tkiva, signalno vodilno sekvenco in 84 bp 5’ netranslantirano regijo. Iz dveh klonov pPA25E10 in pPA17 smo določili kompletno nukleotidno sekvenco s slike 5 in restrikcijsko shemo (slika 4) klona aktivatorja plazminogena tkiva polne dolžine.

Nativna molekula aktivatorja plazminogena tkiva ima potencial, da se stabilizira s 17 disulfidnimi mostovi na bazi homologije z drugimi serin proteazami. Obstajajo 4 potencialna mesta za N-glikoziliranje, tri so locirana v kringle regijah na asn₁₁₇, asn_lg4, asn_21g in eno potencialno mesto je v regiji lahkega niza, na asn_44g. Variacije v strukturi oligosaharidnih ligandov so lahko odgovorne za različne molekulske oblike (vrste molekulskih mas 65,000 in 63,000).

E. 1.L Direktna ekspresija cDNA klona aktivatorja plazminogena tkiva polne dolžine v E. coli

Rekonstrukcija celokupne sekvence za kodiranje je bila možna z uporabo skupnega Hhal restrikcijskega endonukleaznega mesta, ki si ga delita oba parcialna klona pPA17 in pPA25E10. 55 bp Sau3AI-HhaI restrikcijski fragment, ki ustreza aminokislinam 5-23 smo izolirali iz plazmida pPA17. Sau3AI restrikcijsko mesto smo locirali na kodonu štiri predpostavljene zrele sekvence za kodiranje in uporabili za ločevanje regije za kodiranje signalnega peptida. Prav tako smo izolirali 263 bp Hhal-Narl fragment (ki kodira za aminokisline 24-110) iz plazmida pPA25E10. Skonstruirali smo sintetične deoksinukleotide, ki obnavljajo kodone za aminokisline 1-4, inkorporirajo ATG translacijski inicirajoči kodon in kreirajo EcoRI kohezivni terminus. Te tri fragmente nato skupaj ligiramo tako, da tvorimo 338 bp fragment, ki kodira aminokisline 1-110. Ta fragment in 1645 bp Narl-Bglll fragment iz pPA25E10 nato ligiramo med EcoRI in Bglll mesti plazmida pLeIFAtrplO3 (53), tako da dobimo plazmid za ekspresijo pt-PAtrpl2. Klonirani t-PA gen se prepiše pod kontrolo 300 bp fragmenta E. coli trp operona, ki vsebuje trp promotor operator in Shine-Dalgarno sekvenco trp vodilnega peptida, toda nima inicirajočega kodona ATG vodilnega peptida (52).

Gojili smo E. coli K12 soj W3110 (ATCC št. 27325), ki vsebuje pt-PAtrpl2 in pripravili smo ekstrakte za testiranje fibrinolitične aktivnosti. Eden od uporabljanih postopkov za merjenje aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva je fibrinski test na ploščici (87). Ta meri količino tvoijenega plazmina z merjenjem obsega plazminske digestije fibrina na agarozni ploščici, ki vsebuje plazminogen in fibrin. Plazmin proizvaja jasno cono cepitve v fibrinski ploščici in površino te cone lahko koleriramo s količino aktivatorja plazminogena tkiva v vzorcu. Ko ekstrakte pt-PAtrpl2 klona testiramo na aktivnost aktivatorja plazminogena tkiva z uporabo fibrinskega testa na ploščici, je cona cepitve očitna. Ta fibrinolitična aktivnost je inhibrirana z anti t-PA IgG ne pa tudi s preimunološkim IgG ali z anti-urokinazno IgG in iz ekstrakta, ki je pripravljen iz celic, ki vsebujejo kot kontrolo levkocitni interferonski plazmid pLeIFAtrpl03 se aktivnost ne vidi. Z uporabo standardne krivulje prečiščenega t-PA je mogoče oceniti, da dobimo približno 20 enot ekstrahirane aktivnosti na 10⁹ celic (za prečiščeni t-PA, 90,000 Plough enot = 1 mg) (slika 10).

E.l.J. Analiza sekvence

Analiza sekvence je osnovana na Edman degradaciji (83b). Vzorec smo uvedli v Beckmanovo čašo 890B ali 890C sekvenciatorja z vrtečo se čašo. Kot nosilec v čaši uporabimo Polybrene™ (NjNjN^NMetrametil-N-trimetilenheksametilen diamonijev diacetat) (63C). Sekvenciator je modificiran s hladno pastjo in nekaterimi spremembami v programu, tako da se zmanjšajo osnovni piki (piki ozadja). Reagenti so bili 0,1 molaren Quadrol pufer, fenilizotiocianat in heptafluoromaslena kislina kvalitete za Beckman-ovo sekvenco.

Zbrane Edman-ove cikluse ročno prevedemo v 2-anilino-5-tiazolinonske derivate.

1- klorobutan smo posušili pod dušikom. Nato dodamo 1,0 N HCl v vodi na

2- anilino-5-tiazolinon in segrevamo 10 minut na 70 °C, da ga prevedemo v 3-fenil-2tiohidantoin (PTH derivat). PTH-aminokislinski ostanek nato raztopimo v 50 odstotnem acetonitrilu v vodi in injiciramo v visokotlačni tekočinski kromatograf z reverzno fazo. Vsako PTH-aminokislino nato identificiramo s primerjavo retencijskih časov standardne zmesi PTH-aminokislin, ki jo uvedemo v fiolo za konverzijo in obdelamo na isti način, kot ciklus iz sekvenciatorja.

E.l.K. Testi za detekcijo ekspresije aktivatoria plazminogena tkiva

1. Direkten test tvorbe plazmina

a. Teorija

Občutljivo analizo aktivatorja plazminogena tkiva lahko izvedemo z zasledovanjem konverzije plazminogena v plazmin, katalizirane z aktivatorjem plazminogena tkiva. Plazmin je encim, za katerega obstajajo kromogeni substratni testi. Ti testi temeljijo na proteolitski cepitvi tripeptidov od kromoforne skupine. Hitrost cepitve je v neposredni povezavi tako s specifičnostjo, kot s koncentracijo proteaze, ki jo testiramo. Osnova testa je določitev količine tvorjenega plazmina po inkubaciji raztopine, ki vsebuje aktivator plazminogena tkiva, z raztopino plazminogena. Večja ko je količina aktivatorja, večja je tudi količina tvorjenega plazmina. Plazmin merimo s spremljanjem njegove cepitve s kromogenega substrata S2251 (kupljen pri Kabi Group, Inc., Greenwich, CT).

b. Postopek

Alikvot vzorca zmešamo z 0,10 ml 0,7 mg/ml plazminogena (v 0,05M Tris.HCl, pH 7,4, ki vsebuje 0,012 M NaCl) in volumen naravnamo na 0,15 ml. Zmes inkubiramo 10 minut na 37°C, dodamo 0,35 ml S2251 (1,0 mM raztopina v zgornjem pufru) in reakcijo nadaljujemo 30 minut na 37 °C. Dodamo ledocetno kislino (25 μΥ), da se reakcija konča. Vzorce centrifugiramo in merimo absorbanco pri 405 nm. Kvantificirane količine aktivnosti dobimo s primerjavo s standardno raztopino urokinaze. Pogoje testa detekcijo aktivatorja plazminogena tkiva polne dolžine modificiramo z dodatkom fibrinogena (0,2 mg) v raztopino. Fibrinogen vodi do stimulacije opazovane aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva in zato nastaja nekoliko povečan nivo aktivnosti. Aktivnost beležimo v Plough enotah, pri čemer je 90,000 Plough enot enako aktivnosti, ki jo izraža 1 mg prečiščenega aktivatorja plazminogena tkiva.

2. Indirektno testiranje tvorbe plazmina

a. Teorija

Razvit je bil občutljiv test aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva (87). Test temelji na določitvi tvorbe plazmina z merjenjem obsega plazminske digestije fibrina na agarski ploščici, ki vsebuje fibrin in plazminogen. Plazmin proizvaja jasno cono cepitve v fibrinski ploščici. Površino cone cepitve lahko koleriramo s količino aktivatorja plazminogena tkiva v vzorcu.

b. Postopek

Po postopku iz Granelli-Piperno in Reich (87), ploščice inkubiramo 3,5 ure na 37 °C in merimo cone cepitve. Kvantifikacijo dosežemo s primerjavo s standardno raztopino urokinaze.

E.l.L. Detekcija aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva

1. Bakterijska rast in priprava vzorca

Kolonijo E. coli, ki vsebuje plazmid (pdeltaRIPA⁰) inokuliramo v epruveto za testiranje, ki vsebuje 5 ml LB podlage za rast, ki vsebuje 20 jug/ml ampicilina. Celice kultiviramo preko noči na 37 °C. Alikvot te kulture razredčimo 1:100 v 300 ml M9 podlage, ki vsebujejo 20p,g/ml ampicilina. Celice gojimo v stresalni posodi na 37 °C 4 ure, kar ima za posledico absorbanco pri 550 nm 0,419. Dodamo triptofanski analog indolakrilne kisline do koncentracije 30 jug/ml. Celice inkubiramo 90 minut, kar ima za posledico absorbanco pri 550 nm 0,628. Celice požanjemo s centrifugiranjem in ponovno suspendirano v 0,8 ml 0,001 M Tris, pH 8,0, ki vsebuje 0,01 M EDTA. Dobljeno suspenzijo hitro mešamo na sobni temperaturi 18 ur. Vzorec centrifugiramo in supernatant testiramo na aktivnost aktivatorja plazminogena tkiva.

Za ekspresijo pt-PAtrpl2 glej natančen opis v legendi za sliko 10.

2. Detekcija aktivnosti

Tabeli 1 in 2 prikazujeta rezultate aktivacije plazminogena s pomočjo ustreznih ekstraktov E. coli, v teku izvedbe testa. Generira se aktivnost, kije odvisna od prisotnosti plazminogena (tabela 1). Na to aktivnost ne vpliva preimunološki serum kuncev, znatno pa jo inhibira antiserum, ki je pripravljen proti prečiščenim celicam melanoma, ki proizvajajo aktivator plazminogena tkiva (88), tabeli 1 in 2. To kaže, da E. coli ekstrakti proizvajajo aktivnost za aktiviranje plazminogena, ki jo inhibirajo protitelesa proti aktivatorju plazminogena tkiva.

Slika 7 prikazuje rezultat fibrinskega testa na ploščici na fibrinolitsko aktivnost. Standardno količino urokinaze smo dodali v centralno vrsto v koncentracijah, od leve proti desni, 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 in 0,02 Ploug enot. Spodnja vrsta so vzorci naravnega aktivatorja plazminogena tkiva, z isto količino encima v vsaki vdolbini. Vdolbine vsebujejo od leve proti desni, aktivator plazminogena tkiva, aktivator antiplazminogena plus pre-imunološki serum in aktivator plazminogena tkiva plus protitelesa aktivatorja plazminogena tkiva. Vse vdolbine v zgornji vrsti vsebujejo 8 μΐ E. coli ekstrakta aktivatorja plazminogena tkiva. Prva vdolbina je samo ekstrakt, druga vdolbina ima dodan preimunološki serum, tretja vdolbina pa ima dodana protitelesa aktivatorja plazminogena tkiva. Jasno je, da pre-imunološki serum ne vpliva na naravni ali rekombinantni aktivator plazminogena tkiva in da protitelesa aktivatorja plazminogena tkiva inhibirajo aktivnost tako naravnega produkta, kot ekstrakta E. coli. Na osnovi urokinaznih standardov vsebujejo ekstrakti le nekaj manj kot 2,5 Plough enot na ml. To lahko ugodno primerjamo z vrednostjo, ki jo dobimo v tabeli 1, in sicer 1,3 Plough enot na ml. Tabeli 1 in 2 prikazujeta rezultate testov izvedenih, kot je opisano zgoraj v E.l.K.l.b.;

TABELA 1: Aktivacija plazminogena s pomočjo E. coli ekstrakta kultur, ki vsebujejo pdelta RIPA

Vzorec	A—
Ekstrakt (brez plazminogena)	0,043
Ekstrakt	0,451
Ekstrakt plus preimunološki serum	0,477
Ekstrakt plus anti t-PA protitelesa	0,079

Odstotek Izračunane aktivnosti- Plough enote/ml (θ) (100) 1,3

106

Odstotek aktivnosti smo izračunali z odštevanjem kontrole (0,043) od vrednosti, ki smo jih dobili in deljenjem z dobljeno vrednostjo iz ekstrakta

Tabela 2: Aktivacija plazminogena s pomočjo E. coli ekstrakta kultur

pt-PAtrpl2
Vzorec	—405	Odstotek aktivnosti
Ekstrakt	0,657	(100)
Ekstrakt plus preimunološki serum	0,665	101
Ekstrakt plus anti t-PA protitelesa	0,059	9

Slika 10 predstavlja rezultate fibrinskega testa na ploščici izvedenega z ekstrakti iz 10 1 fermentacijskih kultur E. coli, ki vsebujejo plazmid za ekspresijo aktivatorja plazminogena tkiva. Fibrinolitična aktivnost ekstrakta, ki vsebuje aktivator plazminogena tkiva, je predstavljena na sliki 10 s pomočjo vdolbine A. To fibrinolitično aktivnost inhibira anti t-PAIgG (vdolbina C) toda ne preimunološki IgG (vdolbina B) ali urokinazni IgG (vdolbina D), in ni videti aktivnosti iz ekstrakta, ki je pripravljen iz celic, ki vsebujejo kot kontrolo levkocitni interferonski plazmid pLeIPAtrpl03 (vdolbina H).

E.2 Proizvodnja tPA z uporabo DHFR proteina z nizko vezivno afiniteto za ΜΤΧ

E.2.A. Konstrukcija vektorja

Sekvenco, ki kodira aktivator plazminogena tkiva (t-PA) vstavimo v ekspresijski plazmid, ki vsebuje mutantni DHFR z nizko afiniteto za vezavo na ΜΤΧ, kije opisan v U.S. prijavi serijski št. 459,151, vloženi 19. januarja 1983, kije istočasno v postopku in ki ustreza evropski patentni prijavi št. 117.060, vstavljene tu kot reference, z naslednjim postopkom (glej sliko 11).

Tri plazmide iz prekrivajočih se t-PA plazmidov, pPA25E10 in pPA17 in pt-PAtrpl2 (zgoraj) pripravimo kot sledi: plazmid pPA17 digeriramo z Dde I, dopolnimo z uporabo Klenow DNA polimeraze 1, in podstrižemo s Pst I. Tako generiramo in izoliramo ustrezni 200 bp fragment, ki vsebuje 5’ terminalno t-PA sekvenco. Drugi t-PA fragment dobimo s cepitvijo pt-PAtrpl2 z Pst I in Nar I in izolacijo fragmenta s približno 310 bp. Tretji t-PA fragment dobimo z digeriranjem pPA25E10 z Narl in Bgl II in izolacijo fragmenta s približno 1645 bp, ki vsebuje, poleg velikega dela regije, ki kodira za t-PA, nekaj 3’ ne-translatiranih sekvenc.

Plazmid pE342, ki izraža HBV površinski antigen (ki se prav tako imenuje pHBs348-E) je opisan v Levinson et al, patentna prijava št. 326,980, ki je bila vložena

3. decembra, 1981 in ki ustreza evropski patentni prijavi št. 73.656, kije tu vključena kot referenca. (Na kratko, izoliramo vir Simian virusa SV40 z digeriranjem SV40 DNA z Hind III in konverzijo Hind III koncev v EcoRI konce z dodajanjem konverterjev AGCTGAATTC). To DNA razrežemo s PvuII in dodamo RI vezivna sredstva. Po digeriranju z EcoRI izoliramo z elektroforezo na poliakrilamidnem gelu in elektroeluacijo fragment s 348 baznimi pari, ki objema izvor in kloniramo v pBR322. Skonstruiramo plazmid za ekspresijo pHBs348-E s kloniranjem fragmenta z 1986 baznimi pari, ki nastane iz EcoRI in Bgl II z digeriranjem HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, Ν.Υ. (1980) (ki objema gen, ki kodira za HBsAg) v plazmidu pML (Lusky et al.. Nature, 293: 79 (1981) na EcoRI in BamHI mestih. (pML je derivat pBR322, ki ima manjkajoče eliminacijske sekvence, ki inhibirajo replikacijo plazmidov v celicah opic). Dobljeni plazmid (pRI-Bgl) nato lineariziramo z EcoRI in fragment s 348 baznimi pari, ki predstavlja regijo SV40 izvora uvedemo v EcoRI mesto pRI-Bgl. Fragment izvora lahko vstavimo v kakršnikoli orientaciji. Ker ta fragment kodira poleg izvora replikacije tako zgodnje, kot tudi kasnejše SV40 promotorje, se lahko HBV geni izražajo pod kontrolo kateregakoli promotorja, v odvisnosti od te orientacije (pHBS348-E predstavlja HBs izražen pod kontrolo zgodnjega promotorja). pE342 modificiramo s parcialnim digeriranjem z EcoRI, z zapolnitvijo na razcepljenjem mestu z uporabo Klenow DNA polimeraze in skupno ligacijo plazmidov, tako da odstranimo EcoRI mesto, ki je predhodno SV40 izvoru v pE342. Dobljeni plazmid, označen pE342deltaRl, digeriramo z EcoRI, dopolnimo z uporabo Klenow DNA polimeraze I in podstrižemo z BamHI. Po elektroforezi na akrilamidnem gelu, elektroeluiramo fragment s približno 3500 bp, ga ekstrahiramo s fenol-kloroformom in oborimo z etanolom kot zgoraj.

Tako pripravljen p342E 3500 bp vektor in zgoraj opisane t-PA fragmente, ki obsegajo 2160 bp, ligiramo skupaj z uporabo standardnih tehnik. Izoliramo plazmid, ki vsebuje tri t-PA fragmente za kodiranje v pravilni orientaciji, ga okarakteriziramo in označen je kot pE342-t-PA. Ta plazmid digeriramo z Sac II in obdelamo z bak37 terijsko alkalno fosfatazo (BRL). Da zagotovimo DHFR sekvenco (skupaj s kontrolnimi sekvencami za njegovo ekspresijo), generiramo fragment s približno 1700 bp s pomočjo Sac II digeriranja pEHER. (pEHER je plazmid, ki izraža mutantni DHFR opisan v U.S. serijska št. 459,151 (zgoraj). Ta fragment ligiramo v pE342-t-PA plazmid zaradi kreiranja pETPAER400 plazmida, ki je analogen pEHER, razen da je regija za kodiranje HBsAg zamenjana s cDNA sekvencami iz t-PA.

E.2.B. Ekspresija in amplifikaciia t-PA sekvence pETPAER400 (pETPER) transfektiramo tako v dhfr' CHO-DUX Bil celice, kot v DHFR⁺ CHO-K1 (ATCC CCL61) celice s postopkom iz Graham in Van der Eb (zgoraj). Transformirane dhfr’ celice izberemo z rastjo v podlagi, ki je deficitarna z glicinom, hipoksantinom in timidinom. Transformirane DHFR⁺ celice izberemo na osnovi rasti v > 100 nM ΜΤΧ. Kolonije, ki rastejo na ustrezno izbrani podlagi, izoliramo z uporabo prstanov za kloniranje in jih propagiramo na isti način, v isti podlagi do nekaj generacij.

Za amplifikacijo celice iz kolonij razdelimo v podlage, ki vsebujejo 5xl0⁴, 10⁵, 2,5xl0⁵, 5xl0⁵ in ΙΟ⁶ nM ΜΤΧ in jih pustimo, da nekolikokrat preidejo. Celice nanesemo v zelo nizkih (10²-10³ celic/ploščico) gostoti celic v 10 cm skodelice in dobljene kolonije izoliramo.

E.2.C. Postopki testiranja

Ekspresijo t-PA v transfektiranih amplificiranih kolonijah lahko primerno ocenimo s postopki, ki so podobni tistim, ki so prikazani v E.l.K.l.b (zgoraj).

Koamplifikacijo DHFR in t-PA sekvenc testiramo z izolacijo DNA iz vlivnih slojev (mono) amplificiranih kolonij, kot sledi: konfluentne monosloje v 150 mm ploščicah speremo s 50 ml sterilnega PBS in razcepimo z dodatkom 5 ml 0,1 odstotnega SDS, 0,4 M CaCl₂, 0,1 M EDTA, pH 8. Po 5-10 minutah zmes ločimo, ekstrahiramo s fenolom, ekstrahiramo s kloroformom in oborimo z etanolom. DNA resuspendiramo v 1 ml (po 150 mm ploščici) 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA (TE), dodamo RNazo do 0,1 mg/ml in raztopino inkubiramo 30 minut na 37°C. Nato dodamo SDS do 0,1 odstotka in dodamo pronazo (Sigma) do 0,5 mg/ml. Po 3-16 urah inkubacije na 37°C raztopino ponovno ekstrahiramo s fenolom, ekstrahiramo s kloroformom in oborimo z etanolom. DNA granulo resuspendiramo v 0,5 ml vode in digeriramo z restrikcijskimi encimi. Približno 5-10 /xg digerirane DNA podvržemo elektroforezi v agaroznem gelu/1 odstotek agaroze v Tris-acetatnem pufru (40 mM Tris, 1 mM EDTA, dopolnjen do pH 8,2 z ocetno kislino); (Crouse, et al, J. Biol. Chem., 257: 7887 (1982)). Ko bromfenol modra barva do 2/3 migrira po gelu, gel ločimo in obarvamo z etidijevim bromidom. Po vizualizaciji DNA z ultravijolično svetlobo, DNA prenesemo iz gela na nitrocelulozne filtre po postopku iz Southern (J. Mol. Biol. 98: 503. (1975)). Filtre nato hibridiziramo s translatirano sondo, pripravljeno iz 1700 bp Sac II fragmenta pEHER (pripravljen in hibridiziran, kot je opisano zgoraj), ali iz Bgl II fragmenta pETPER s približno 1970 bp.

E.3. Proizvodnja t-PA skupaj s DHFR proteinom divjega tipa

E.3.A. Konstrukcija vektorja

Na način, analogen tistemu, ki smo ga uporabili pri konstrukciji pETPER, skonstruiramo plazmid pETPFR, ki vsebuje DNA sekvenco, ki kodira za DHFR divjega tipa. Konstrukcija je potekla kot v primeru E.2.A., razen da smo namesto plazmida pEHER, kot raztopino sekvence gena za DHFR protein, uporabili plazmid pE342.HBV.E400. D22 je opisan v prijavi, ki je istočasno v postopku, Genentech Docket št. 100/92. V US ser. št. 459.152 dopolnjena 19. januarja 1983, ki ustreza evropski patentni prijavi št. 117.058, ki je tu vključena kot referenca. Plazmid pE342.HBV.E400.D22 je isti kot pEHER, razen za razliko v enem baznem paru med DHVR divjega tipa in mutantom. Tako dobljen plazmid pETPFR je v vskem pogledu analogen s pETPER, razen da je DNA sekvenca, ki kodira za DHFR divjega tipa, zamenjana s sekvenco za mutant.

E.3.B. Ekspresija t-PA sekvence pETPFR smo uporabimo za transfekcijo CHO celic deficitarnih z DHFR (Urlaub in Chasin (zgoraj)) z uporabo postopka obarjanja s kalcijevim fosfatom iz Graham in Van der Eb. Enaindvajset kolonij, ki so rastle na selektivni podlagi (-HGT) ocenimo z detekcijo tvorbe plazmina, kot smo ocenili s pomočjo digeriranja fibrina na agarski plošči, ki vsebuje fibrin in plazminogen, opisano v Granelli-Piperno, et al. J. Exp. Med., 148: 223 (1978).

Štiri najmočnejše pozitivne klone ocenimo kvantitativno na tvorbo plazmina na osnovi po celici, v skladu postopkom, ki je opisan v E.l.K.l.b.

Po takšnem kvantitativnem določevanju smo ugotovili, da štirje testirani kloni izražajo isto ali primerljivo t-PA izločanje v podlago, določeno kot enota/celica/dan. Subklone smo pripravili s transferjem inokulata iz dveh klonov v posebne ploščice, ki vsebujejo -HGT podlago. Dva dobljena subklona, 18B in 1 smo uporabili za nadaljnjo analizo.

E.3.C Amplifikaciia in nivoji proizvodnje t-PA

Gornje subklone prevlečemo z 2xl0⁵ celicami na 100 mm plošče v 50 nM ΜΤΧ, tako da promoviramo amplifikacijo. Tiste celice, ki preživijo, ko jih testiramo, kot je opisano zgoraj, dajemo v vseh primerih okoli 10-krat večjo neamplificirano količino aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva. Dva od teh klonov smo izbrali za nadaljnje preučevanje in imenovana sta 1-15 in 18B-9.

Subklon 1-15 smo nadalje amplificirali s vsaditvijo 2xl0⁵ celic v 100 mm ploščice, ki vsebujejo 500 nM ΜΤΧ. Testiranje tako amplificiranih celic je dalo nadaljnje povečanje (okoli 3-kratno) v proizvodnji t-PA; ko smo jih ocenili kvantitativno po postopku C.l.C, so bili nivoji v intervalu 7xl0'⁴ enot/celico/dan. Del teh amplificiranih celic smo nato prenesli in vzdrževali v prisotnosti 10,000 nM ΜΤΧ. Subklone 1-15 in 18-B-9 smo nadalje testirali potem, ko smo jih vzdrževali približno 1-2 meseca pod pogoji, ki so specificirani v tabeli T.

TABELA 1’	ne t-PA/celico/dan
Celična linija	Poeoii rasti
1-1^500	500nMMTX	28,5 χ ΙΟ’3
Ι'-^οο	500nMMTX	26,0xl0'3
1'155Oo	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	8,3 χ ΙΟ’3
	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	18,0 χ 10'3
1-15 10,000	ΙΟμ,ΜΜΤΧ	29,3 χ ΙΟ’3
1-15 10,000	ΙΟμΜΜΤΧ	49,0 χ 10'3
18B-9	50nMMTX	14,3 χ ΙΟ 3
18B-9	50 nM ΜΤΧ	14,4 χ 10'3
18B-9	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	14,3 χ 10'3
18B-9	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	14,4 xl0'3
1	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	1,0 xl0'3
1	(-HGT podloga, nima ΜΤΧ)	0,7 χ 10'3

* t-PA v gojitveni podlagi smo ocenili kvantitativno v radioimunološkem testu kot sledi: prečiščeni t-PA in prečiščeni jodirani tracer t-PA, izveden iz celic melanoma, smo serijsko razredčili, tako da je vključeval koncentracije 12,5 do 400 ng/ml v pufru, ki vsebuje fosfatno napufrano raztopino soli, pH 7,3, 0,5 odstotka albumina volovskega seruma, 0,01 odstotka Tween 80 in 0,02 odstotka NaN_y Na radioaktivno markirane tracer proteine dodamo ustrezne razredčine vzorcev podlage, ki jih je potrebno testirati. Antigene pustimo, da se inkubirajo preko noči na sobni temperaturi v prisotnosti 1:10,000 razredčitve IgG frakcije anti-t-PA kunčjega antiseruma.

Kompleks protitelo-antigen obarjamo z absorpcijo na IgG imunozrnih koze antikunca (BioRad) 2 uri na sobni temperaturi. Zrna zbistrimo z dodatkom slanega razredčila in nato centrifugiramo 10 minut pri 2000 x g na 4 °C. Supernatante zavržemo in registriramo radioaktivnost v oborini. Koncentracije določimo s primerjavo z referenčnim standardom.

Celične linije so kot sledi: celična linija 1 je neamplificirani klon iz orginalnega seta štirih. 1-15_5θ0 je amplificirani subklon celične linije 1, kije amplificiran na začetku v 50 nM ΜΤΧ, tako da dobimo 1-15 in je nato prenešen za nadaljnjo amplifikacijo v 500 nM ΜΤΧ. 1-15_10θ0θ je subklon 1-15_5θθ, ki je nadalje amplificiran v prisotnosti 10,000 nM ΜΤΧ. Celična linija 18B-9 je subklon enega od štirih detektiranih na začetku, ki so bili amplificirani na 50 nM ΜΤΧ.

Vse amplificirane celice so pokazale povečane nivoje proizvodnje t-PA nad tistimi, ki jih izraža neamplificirana celična kultura. Celo tudi neamplificirana kultura proizvaja količine t-PA večje od 0,5 pg/celico/dan; amplifikacija vodi do nivojev, ki se približujejo 50 pg/celico/dan.

F. Farmacevtski preparati

Spojine predloženega izuma lahko formuliramo po znanih postopkih za pripravo farmacevtsko uporabnih preparatov, pri čemer predmetni proizvod - aktivator plazminogena človeškega tkiva kombiniramo v zmes s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem. Primerni nosilci in njihovo formuliranje, vključujoč tudi druge človeške proteine, npr. albumin človeškega seruma, so opisani, npr. v Remington’s Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, ki je tu naveden kot referenca. Takšni preparati bodo vsebovali učinkovito količino predmetnega proteina, skupaj s primerno količino nosilca, z namenom priprave farmacevtsko sprejemljivih preparatov, ki so primerni za učinkovito dajanje gostitelju.

Na primer, predmetni aktivator plazminogena človeškega tkiva lahko dajemo parenteralno pacientom, ki imajo kardiovaskularne bolezni ali stanja. Doziranje in hitrost doziranja sta lahko paralelna tistim, ki se trenutno uporabljajo v kliničnih raziskavah drugih kardiovaskularnih, trombolitičnih sredstev, npr. okoli 440 IU/kg telesne teže, kot intravenozna primarna doza, ki jo spremlja kontinualna intravenozna infuzija z okoli 440 IU/kg/ura tekom 12 ur, pri pacientih, ki imajo pljučno embolijo.

Kot en primer ustrezne dozirne oblike za v bistvu homogen aktivator plazminogena človeškega tkiva v parenteralni obliki, ki je tu uporabna, je viola, ki vsebuje 25000IU aktivnosti aktivatorja plazminogena tkiva, 25 mg manitola in 45 mg NaCl, ki jo lahko rekonstituiramo s 5 ml sterilne vode za injekcije in zmešamo s primernim volumnom 0,9 odstotnega natrijevega klorida za injekcije ali s 5 odstotno raztopino dekstroze za intravenozno dajanja.

G. Natančen opis rekombinantnega človeškega t-PA

Strukturo določene izvedbe človeškega t-PA, pripravljenega v tukajšnjih primerih, smo preučevali v določenih detajlih, tako v smislu pojasnjevanja sekvence gena za kodiranje, kot v smislu tehnik proteinske biokemije. Trenutno razumevanje strukture proteina je ponazorjeno na sliki 12.

Collen in sodelavci (88) so prav tako že prej demonstrirali, da se človeški dvojnoverižni t-PA tvori s proteolitskim cepljenjem enoverižnih molekul dva polipeptida, ki sta spojena z disulfidno vezjo. Tukajšnje delo omogoča zaključek, da je težka veriga (30882 molekulska masa) izvedena iz NH₂ terminalnega dela, lahka veriga (28126 molekulska masa) pa obsega COOH, terminalno regijo. N-terminalno sekvenciranje dvoverižne molekule sugerira, da se dvojnoverižna oblika generira s cepitvijo enojne arginil-izolevcin vezi (slika 12; narisana puščica).

Primarna struktura dela regije težke verige človeškega t-PA (slika 12) odkriva visoko stopnjo homologije sekvence s kringle regijami plazminogena (89) in prototrombina (40, 41 kringle regija se nanaša na karakteristično trojno disulfidno strukturo, ki je bila na začetku odkrita v pro-fragmentu protrombina, katerega je prvi natančno opisal Magnuson et al (91, 92). Iz primarne sekvence t-PA sta vidni takoimenovani kringle regiji s po 82 aminokislinami, ki imajo visoko stopnjo homologije s 5 kringle regijami plazminogena. Preostalih 91 N-terminalnih aminokislin ima malo homologije s konvencionalno kringle regijo. Vendar pa lahko predvidevamo, da ima lahko ta regija strukturo, ki vsebuje večkratne disulfidne vezi, saj se tu nahaja 11 dodatnih cisteinskih ostankov.

Katalitsko mesto lahke verige človeškega t-PA, takoimenovana regija serin proteaze se, kakor v drugih serinskih encimih, najverjetneje tvori s pomočjo ostankov histidina₃₂₂, asparaginske kisline₃₇₁ in serina_47g. Nadalje so aminokislinske sekvence, ki obkrožajo te ostanke, zelo homologne z ustreznimi deli drugih serin proteaz, kot so tripsin, protrombin in plazminogen.

Ne da bi zanemarili dejstvo, da so navedene določene želene izvedbe, je jasno, da predloženi izum z njimi ni omejen, ampak je omejen le z zakonskim obsegom predloženih zahtevkov.

Bibliografija

1. United States Patent No. 3355361.

2. United States Patent No. 3926727.

3. United States Patent No. 4029767.

4. United States Patent No. 4258030.

5. United States Patent No. 4271150.

6. European Patent Application Publn. No. 0037687.

7. Rijken, D.C., Plasminogen Activator from Human Tissue, Krips Repro Meppel, 1980.

8. United States Patent No. 3555000.

9. United States Patent No. 3998947.

10. United States Patent No. 4245051.

11. European Patent Application Publn. No. 0023860.

12. United States Patent No. 4083961.

13. United States Patent No. 4177262.

14. United States Patent No. 3082612.

15. Wallen, P., Proč. Serono $ymp. 9, 91 (1977).

16. Thorsen, S., et al., Thrombos. Oiathes. haemorrh. 28, 65 (1972)

17. Col len, Thrombos. Haemostas. 43, 77 (1980).

18. Wiman et al., Nature 272, 549 (1978).

19. European Patent Application Publn. No. 0041766.

20. Vleimar, W., et aL, The Lancet Vol. II, No. 8254, p. 1018 (1981)

21. British Patent Application Publn. No. 2007676A.

22. Metzel, American Scientist 68, 664 (1980).

23. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., <

Hagerstown, Maryland (1973), esp. pp. 1122 et seg.

24. Scientific American 245, 106 (1981).

25. British Patent Application Publn. No. 2055382A.

26. German Offenlegungsschrift 2644432.

27. Chang et al.., Nature 275, 617 (1978).

28. Itakura et ak, Science 198, 1056 (1977).

29. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

30. European Patent Application Publn. No. 0036776.

31. Siebenlist et al.., Celi 20, 269 (1980).

32. Stinchcomb et al.., Nature 282, 39 (1979).

33. Kingsman et al., Gene 7. 141 (1979).

34. Tschumper et_ ak, Gene 10, 157 (1980).

35. Mortimer et al., Microbio!ogica) Reviews 44, 519 (198 ).

36. Miozzari et al_., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

37. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

38. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

39. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).

K

40. Holland et_ al_., Biochemistry 17, 4900 (1978).

41. Bostian et al_., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

42. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

43. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

44. Tissue Cul ture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, (1973).

45. Gluzman, Celi 23, 175 (1981).

46. Boli var et al., Gene 2, 95 (1977).

47. Lusky et £1_., Nature 293, 79 (1981).

48. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

49. Fiers et al_., Nature 273, 113 (1978).

50. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

51. Crea et_ ab, Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980).

52. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980).

53. Gray et ab, Nature 295, 503 (1982).

54. Oppermann et al., Virology 108, 47 (1981).

55. Ward et ab, J. Virob 9, 61 (1972).

56. Aviv et ab, Proč. Natb Acad. Sci. (USA) 69, 1408 (1972)

57. Lehrach et ab, Biochetnistry 16» 4743 (1977).

58. Lynch et ab, Virology 98, 251 (1979).

59. Lodish, Am. Rev, of Biochem. 45, 40 (1976).

60. Pelhani et ab, Eur. J. Biochem. 43, 247 (1976).

61. BI obel, etat, J. Celi Bio1ogy 67, 852 (1975).

62. Shields et ab, J. Bi ob Chemistry 253, 3753 (1978).

63. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

64. Bonner et ab, Eur. J. Biochem. 46, 83 (1974).

65. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

66. Uickens et ab, J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

67. Chang et ab, Nature 275, 617 (1978).

68. Bolivar et ab, Gene 2, 95 (1977).

0332L

69. Grunstein et al., Proč. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975)

70. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980).

71. Birnboim et. al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

72. Smith, Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

73. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

74. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 499 (1980).

K

75. Crea et al., Proč. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978).

76. Lawn et ak, Celi 15, 1157 (1978).

77. Southern, 3. Mol. Biol. 98, 503 (1975).

78. Benton etak, Science 196, 180 (1977).

79. McGrath and Levinson, Nature 295, 423 (1982).

80. BI in et al_., Nucleic Acid Res. 3^, 2303 (1976).

81. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

82. Fritsch et ak, Celi 19, 959 (1980).

83. Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

83b. Edman et. al., Eurooean 3. Biochem. 1, 80 (1967).

84. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641 (1966).

85. Wahl et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USAl 76, 3683 (1979).

86. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980).

87. Granelli-Piperno et_al_., 3. Exp. Med. 148, 223.

88. Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981).

89. Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Raven Press, Ν.Υ. p. 191 (1978)

90. Sothrup-Jensen et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 72, 2577 (1975).

91. Magnussen et al., Proteolysis and Physiologica1 Regulation, Ribbons et al., Eds., Academic Press, New York, p. 203 (1976).

92. Magnussen et al., Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor Laboratory, Ν.Υ., p. 123 (1975).

93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

94. Reich, E., Proteases and Biological Control, (Ibid) p. 333-341.

95. Matsuo, 0., et al., Throm. Haemostasis 45 225 (1981).

96. Koringer, C., et al., Throm. Haemostasis 46 561, 662 (1981).

97. Hoylaerts, Ή., et al., J. Biol. Chem. 257 2912 (1982).

98. Koringer, C., et al., Thromb. Haemostasis 46 685 (1981).

Claims (9)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. DNA izolat, označen s tem, da sestoji iz DNA sekvence, ki kodira aktivator plazminogena človeškega tkiva.
2. 2. DNA izolat po zahtevku 1, označen s tem, da ima aktivator plazminogena človeškega tkiva aminokislinsko sekvenco 1-527 podano na slikah 5a, 5b in 5c.
3. 3. Rekombinantni ekspresijski vektor, ki vsebuje DNA sekvenco, ki kodira aktivator plazminogena človeškega tkiva, označen s tem, da je vektor sposoben izraziti aktivator plazminogena človeškega tkiva, v transformirani mikroorganizem ali celično kulturo.
4. 4. Rekombinantni ekspresijski vektor po zahtevku 3, označen s tem, da ima aktivator plazminogena človeškega tkiva aminokislinsko sekvenco 1-527 podano na slikah 5a, 5b in 5c.
5. 5. Mikroorganizem, transformiran z vektorjem iz zahtevka 3, označen s tem, da je sposoben izraziti aktivator plazminogena človeškega tkiva, takšen kot je E. coli.
6. 6. Celična kultura sposobna izraziti aktivator plazminogena človeškega tkiva, označena s tem, da je dobljena s transformacijo celične linije sesalcev, takšne kot je celična linija jajčnikov kitajskega hrčka z vektorjem po zahtevku 3.
7. 7. Postopek, označen s tem, da obsega ekspresijo DNA sekvence po zahtevku 1 v rekombinantni celici gostitelja, takšni kot je mikroorganizem E. coli ali celična linija jajčnika kitajskega hrčka.
8. 8. Postopek za pridobivanje rekombinantnega aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, označen s tem, da obsega:

   a) rast rekombinantnih celic transformiranih z ekspresijskim vektorjem, vektorjem po zahtevku 3, in

   b) istočasno ekspresijo omenjene DNA po zahtevku 1.
9. 9. Postopek za pridobivanje rekombinantnega aktivatorja plazminogena človeškega tkiva, označen s tem, da obsega:

   a) transformiranje celice gostitelja po zahtevku 7 z replikatorskim vektorjem, ki vsebuje DNA sekvenco po zahtevku 1, in

   b) ekspresijo omenjene DNA v omenjeno celico gostitelja.