JPH0216981A - ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト血清及び／又はヒト組織中に見い出され
るものに相当するヒトプラスミノーゲン活性化因子をコ
ードしているＤＮＡ配列からなるＤＮＡ単離物、および
該ＤＮＡ配列を発現させ得る複製可能な発現ベクターに
関する。

本発明は、ヒトプラスミノーゲン活性化因子をコードし
ているＤＮＡ配列及びそれから推定される該活性化因子
のアミノ酸配列を知見したことに部分的に起因するもの
である。この知見に基づき、組換ＤＮＡ技術を適用して
ヒトプラスミノーゲン活性化因子を製造することが可能
になり、しかもこの製造方法によると、現存する細胞培
養物に於ける産生及び該細胞培養物からの単離という工
程を含む従来の単離方法に固有のある種の制約を受ける
ことがなく、更に、市場認可に先立って必要とされる動
物実験及び臨床試験に着手し且つこれを遂行するに充分
な質及び量で該活性化因子を製造することが可能になっ
たのである。

本発明は、あらゆる点て、これらの関連する具体例に係
る。

本発明の詳細な説明し且つある場合にはその実施のため
の詳細を補うために使用する文献及びその他の資料は、
本明細書中参照番号を付して引用し、更に便宜のため本
明細書末尾に参考文献として列挙する。

Ａ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子線維素溶解系
は凝固系と動的平衡状態にあり、自然な開放性血管床を
維持する。凝固系は線羅素をマトリックスとして沈着さ
せ、これにより止血状態を回復する。線維素溶解系は、
止血状態が達成された後、線維素網を除去する。この線
維素溶解過程は、血漿タンパク前駆体であるプラスミノ
ーゲンから生ずるタンパク分解酵素、プラスミンによっ
てもたらされる。プラスミノーゲンは活性化剤によって
活性化されてプラスミンに変換される。現在、２種の活
性化剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼが市販さ
れている。この両者の効能は、急性血管病例えば心筋梗
塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞
症及びその他の静脈血栓症の治療とされている。総じて
、これらの病気は重大な健康−にの危険の要因となる。

これらの疾病の基本的原因は、凝血塊（血栓又は血栓塞
栓）による血管の部分的又は重度の場合には全体的閉塞
にある。例えばヘパリン及びクマリンを用いるような従
来の凝固防止療法では、血栓又は血栓塞栓の溶解を直接
には何ら促進しない。

」二連した面栓溶解剤即ちストレプトキナーゼ及びウロ
キナーゼは実際に有効に使用されてきている。

然しなから今日まで、これらの薬剤には夫々厳しい限界
があった。さらに、これらの薬剤は線維素に対する高度
の親和性も有していない。従って、これらの薬剤は、循
環しているプラスミノーゲン及び線維素に結合している
プラスミノーゲンを比較的無差別に活性化する。Ｗｌ環
血液中で形成したプラスミンは、比較的急速に中和され
、有効な血栓溶解能を失う。残留するプラスミンは、数
種の血液凝固因子タンパク例えばフィブリ／−ゲン、第
■因子及び第■因子を分解して出血の可能性をもたらす
。さらに、ストレプトキナーゼは強度に抗原性であり、
高抗体力価ををする患者は治療に対し効果を示さず又継
続して投与することもできない。ウロキナーゼによる治
療法は、該ウロキナーゼの製造工程が人間の尿又は組織
培養物から単離する工程を含むため高価であり、従って
一般に臨床的実用性に劣る。このような状況下で、ウロ
キナーゼは多くの研究の主題であった（例えば文献１乃
至６参照）。

いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は種々のヒト組織
例えば子宮組織、血液、血清（文献７乃至１１参照）並
びに細胞培養物（文献９４参照）から単離されていた。

これらの組成及び／又はこれらを含有する組成物につい
ては文献１２及び１３に記載されている（文献１４乃至
１８参照）。これらの起源を有するプラスミノーゲン活
性化因子は、それらの免疫学的特性の差違に基づいて２
つの主なグループ、即ちウロキナーゼ型プラスミノーゲ
ン活性化因子（ｕ−ＰＡ）及び組織型プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−ＰＡ）に分類される。（略号Ｌ−ＰΔ
及びｕ−ＰＡは、ＸＸＶＩ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ　　ｏｆ
ｔｈｅ　　Ｉ　　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｃｏｍ
ｍ１ｔｔｅｅ　　ｏｎ　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ
　　Ｉ−Ｔｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　Ｂｅｒｇａｍｏ＋
　Ｉ　ｔａｌｙ、　　２７Ｊｕｌｙ１９８２に於いて提
唱されたものである。）近年、ヒトメラノーマ（黒色腫
）セルライン（細胞株）がｔ−ＰＡを分泌することが確
認された。このメラノーマ由来プラスミノーゲン活性化
因子は、免疫学的に及びアミノ酸組成に於いて、正常ヒ
ト組織から単離されたプラスミノーゲン活性化因子と区
別し得ない特性を有することが示されている（文献１９
及び８８参照）。

比較的純粋な形態で単離されたこの物質の特性を検討し
た結果、高い活性を有する線維素溶解因子であることが
知見された（文献２０参照）。

メラノーマセルラインから精製したｔ−ＰＡを使用して
行なわれたいくつかの研究の結果、ｔＰΔがウロキナー
ゼ型プラスミノーゲン活性化因子に比較して線維素に対
してより高い親和力を有することが示された（例えば文
献９５乃至９８参照）。然しながら、ｔ−ＰＡは血液、
組織抽出物、血管潅流液及び細胞培養物中に非常に低濃
度でしか存在しないため、ヒトｔ−ＰＡの血栓溶解剤と
しての可能性を更に深く研究することは困難であった。

ヒト由来の他のタンパクを実質的に含まない高品質のヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子（これは初期には
ヒトプラスミノーゲン活性化因子と呼ばれていた）を必
要充分な量で製造するために最も有効な方法は、組換Ｄ
ＮＡ技術及びそれに関連する技術の適用であろうという
ことは既に考えられていたことである。このような物質
が得られれば、それは恐ら（種々の心血管障害又は心血
管病の治療に対して臨床応用できるような生物活性を示
すであろう。

Ｂ１組換ＤＮＡ技術 組換ＤＮＡ技術は、かなり複雑な応用の段階に達してい
る。分子生物学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に
組換え、形質転換された微生物又は細胞中で大量の外来
タンパク産物を産生じ得る新たなＩ）ＮＡ体を作成し得
る。種々の平滑末端又は粘着末ω１１ａを有するＤＮＡ
断片をｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合し、特定生物を形質転換す
るのに有用な発現ベクターを作成し、かくして所望の外
来性産物の効率的な合成を行なうための一般的手段及び
方法は、既に開発されており自由に使用することかでき
る。然しなから、個々の産物については、その製造工程
はまだ若干複雑であり、常に成功を予測し得る段階にま
では科学は進歩していない。事実、実験的裏付けをせず
に成功結果を予告する者もいるが、このような予言には
実施不能という著しい危険が伴っている。

Ｌ（本釣要素、即ち複製のオリジン、１種又はそれ以上
の表現型選択特性、発現プロモーター、異種遺伝子イン
サート及び残りのベクターのＤＮＡ組換は、一般に宿主
細胞の外部で行なわれる。得られる複製可能な組換発現
ベクターすなわちプラスミドを形質転換により細胞中へ
導入し、得られる形質転換体を増殖させることにより大
量の組換ベクターを得ることができる。コードされてい
るＤＮＡメツセージの転写および翻訳を支配する部分に
対して遺伝子が適切に挿入されていれば、得られた発現
ベクターを使用して挿入遺伝子がコードしているポリペ
プチド配列を実際に産生ずることができ、この過程を発
現と呼ぶ。微生物系で必要に応じて宿主細胞を溶菌し、
且つ適当な方法により他のタンパクから精製して目的産
物を回収することができる。

実際、組換ＤＮＡ技術を用いることにより、全く異種の
ポリペプチドを発現させることができ（いわゆる直接的
発現）、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部
と融合した異種ポリペプチドを発現させることもできる
。後者の場合、目的とする生物活性産物は、しばしば、
細胞外環境に於いて開裂されるまで、融合した同種／異
種ポリペプチド中で生物的に不活性の形態で存在する（
文献２１及び２２参照）。

同様に、遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培
養（セルカルチャー）又は組織培養の技術は充分に確立
されている。単離した正常細胞から継代処理により永久
セルラインを調製しこれを維持する手段及び方法も公知
である。研究に使用するためには、これらのセルライン
を液体培地中の固体支持体上に維持するか、又は栄養物
を含有する懸濁液中で増殖させる。大量生産のためには
機械的問題が残るのみであろう（その他の背景について
は、文献２３及び２４参照）。

又、生物工学においてはタンパク質生化学が有用且つ実
際」二必要な手段である。所望のタンパクを産生ずる細
胞は、多数の他のタンパク、即ち細胞固有の代謝産物を
も産生ずる。これらの夾雑タンパク及びその他の化合物
は、所望タンパクから除去されないと、所望タンパクに
よる治療処置の過程で動物又はヒトに投与した場合有毒
となる危険性がある。タンパク質生化学の技術により、
目的とする特定システムの適する分離方法を使用して目
的用途に対し安全で均質な最終産物を得ることができる
。更に、タンパク質生化学により、所望産物の特性を明
らかにし、細胞が何ら変化せず又は突然変異することな
く所望産物を確実に産生したことを確認することができ
る。この科学分野には、臨床研究及び市場開発に成功す
るために必要とされるバイオアッセイ、安定性試験及び
その他の研究過程も関係している。

本発明は、組換ＤＮＡ技術の使用により、ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を好ましくは直接
的形態で製造し、しかも市場認可を得るための必須要件
である動物実験及び臨床試験を開始し且つ継続するのに
十分な量で有利に製造し得るという知見に基く。製造さ
れたヒトｔ−ｐＡは、ヒトの様々な心血管障害又は心血
管病の予防処置又は治療処置での使用に適している。

本発明により、実質的に純粋なヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子を得ることができる。遺伝子工学的に処理
された微生物又は細胞系により、従来よりも遥かに有効
にヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生じ得、こ
れにより従来は達成し得なかった産業利用の機会が得ら
れる。更に、宿主細胞次第でヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子は天然物質に比較して異なった程度でグリコ
ジル化された状態のものが得られる。いずれにしても、
このように産生されるｔ−ＰＡは、非組換細胞に於いて
は伴なっているのが普通である夾雑物を含まないであろ
う。

本発明は、後に定義するヒト組織ブラスミ／−ゲン活性
化因子をコードしているＤＮＡ配列、該因子を発現し得
る形態でコードしている遺伝子配列を含む複製可能なり
ＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質転換された微生物
菌株又は細胞、並びにヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子を産生じ得る前記の如き形質転換された微生物菌株
又は細胞株の培養及びそれらの培養物に係る。更に別の
角度から見た本発明の目的は、前記の遺伝子配列、ＤＮ
Ａ発現ベクター、微生物菌株及び細胞の製造に有用な種
々の方法及びその具体例を提供することである。更に本
発明は、前記の微生物の発酵培養及び細胞の培養の調製
に係る。

八、定義 本明細書に於いて、「ヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子」又は「ヒ）ｔ−ＰＡ」又はｒｔ−ＰＡＪは、微生
物培養系又は細胞培養系により産生され、プロテアーゼ
部分を含み且つヒト組織に天然に存在する組織プラスミ
ノーゲン活性化因子に対応する生物活性形態のヒト外因
性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意味する。

本発明により産生されるヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子タンパクは、決定されたＤＮＡ遺伝子及び推定ア
ミノ酸の配列決定によって定義されている。各個体毎に
天然のアレル変異体が存在し及び／又は発生することは
理解されよう。これらの変異は、全配列に於ける１個以
上のアミノ酸の相違、又は配列中の１個以上のアミノ酸
の欠失、置換、挿入、転位もしくは付加によって示され
る。更にグリコジル化の位置及び程度は宿主細胞環境の
性質に依存するであろう。

組換ＤＮＡ技術を使用して、例えば、基本となるＤＮＡ
の特定の部位に突然変異を誘発することにより、１個又
は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加又は転位によって
種々変性された種々のヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子誘導体を製造することが可能である。本明細書中で
特に説明するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の一
般的特性である必須のクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）領
域とセリンプロテアーゼ領域とを維持しているが他の部
分は前記の如く変性された誘導体の製造も可能である。

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子中の前記の如きア
レル変異及び変性は、全て本発明の範囲内に包含される
。更に、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の本質的
特徴である活性が実質的に維持されている限り、物理的
及び生物学的に類似した他の近縁のヒト外因性（組織型
）プラスミノーゲン活性化因子も本発明の範囲内に包含
される。

本発明によれば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
は、 （１）第一アミノ酸としてのメチオニンを有する（構造
遺伝子の手前にＡＴＧ開始コドンを挿入して得られる）
か、又は、 （２）メチオニンが細胞内又は細胞外で開裂されている
場合は、正常の第一アミノ酸を有するか、又は、 （３）細胞内又は細胞外環境で特異的開裂可能なシグナ
ルポリペプチド又は従来のシグナルポリペプチド以外の
共役タンパク（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）
を伴なっている（文献２１径照）か、又は、 （４）外来の余分のポリペプチドの開裂が不要な成熟形
態で直接的に発現させることにより製造される。

発現ベクターが組織プラスミノーゲン活性化因子を７グ
ナルペブチドと共に発現すへく設計されており、宿主が
７グナルペブチドを除去又は有効に除去し得ない場合、
特に最後のものが重要である。いずれにしても前記の如
き種々の形態で産生したヒＨ−ＰＡを回収し、種々の血
管障害又は血管病の治療用に適するレベルまで精製する
。

更に、ｔ−ＰＡには、−本鎖タンパクと二本鎖タンパク
との双方の形態がある。二本鎖タンパクは一本鎖化合物
のタンパク分解により誘導される。

理論的には、二本鎖タンパクが産生された線維素と関連
しており、タンパク分解による一本鎖物質から二本鎖物
質への変換はプラスミノーゲンからプラスミンへの転換
部位で生じると想定される。

本発明は、前記の如く、ｉｎ　ｖｉｖｏで転換される一
本鎖タンパクの投４、及び活性を有することがすでに証
明されている二本鎖タンパクの投与の双方を含む。二本
鎖タンパクは、−本鎖物質の産生後に−（しりｊｒｏタ
ンパク分解変換によって製造され得る。所謂クリングル
領域は、セリンプロテアーゼ部分より上流に位置してお
り、本発明の組織プラスミノ−ケン活性化因子を線維素
マトリックスに結合させ、これにより、実際に存在する
血栓に対して組織プラスミノーゲン活性化因子の特異的
活性を発揮せしめるために重要な役割を果たす。本発明
により製造される組織プラスミノーゲン活性化因子は天
然物質に相当する酵素活性部分を含んでいる。ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子なる用語は、このような部
分だけを含むか、又は完全な長さの分子に達するまでの
付加アミノ酸配列と共に含む産生物と定義される。

要約すれば、本発明によるヒ１−ｔ−ＰＡは、以下の如
く機能的に定義し得る。即ち、ヒ＋−ｔ−ｐＡは、プラ
スミノーゲンからプラスミンへの転換を触媒し得、線維
素に結合し、前記の如き免疫学的特性に基いてｔ−ＰＡ
と分類されるものである。

従って、ｔ−ＰＡの機能的誘導体は本発明の範囲内に包
含される。それ故、本願発明の「ヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子をコードしているＤＮＡＪなる用語は、
前記したヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のアレル
変異体および誘導体をコードしているＤＮＡをも包含し
ている。

本発明により産生されるヒ）ｔ−ＰＡの状態を形容すべ
く用いた「実質的に純粋な形態」とは、非組換細胞によ
り産生されたとき即ち「天然」環境で産生されたときヒ
トｔ−ＰＡに通常伴なっているタンパク又は他の物質を
含まないことを意味する。

ｒＤＨＦＲタンパク」とは、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）に関連する活性を有し得、従って、ヒボキサン
チン、グリシン及びチミジンを含まない培地（−ＨＧＴ
培地）に於いて生存し得る細胞によって産生される必要
があるタンパクを意味する。

通常、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｒタンパクを欠く細胞は該培地
では増殖てきないが、ＤＨＦＲタンパクを有する細胞は
該培地で増殖できる。

ｒＭＴＸ感受性細胞」とは、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキ
セート（ＭＴＸ）を含む培地で増殖し得ない細胞を意味
する。従ってｒＭＴＸ感受性細胞」とは、遺伝的に変化
しているか又は他の方法で補足されていない場合、ＭＴ
Ｘ濃度が０．２μ９／畦以上になると周囲及び培地が細
胞のタイプに適した条件であっても増殖できない細胞を
意味する。細菌の如く成る種の細胞は、ＭＴＸに感受性
を示す筈のＤ　ＨＦ　Ｒを含んでいるにも拘わらず、細
胞膜内部へＭＴＸを透過さぜないのでＭＴＸ感受性を示
さない。一般に、Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクとして野生型Ｄ
ＨＦ　Ｒを含む細胞は、ＭＴＸを透過し得るか又は摂取
し得る限り、メトトレキセートに感受性であろう。

［野生ｆｆ４　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　ＲＪとは、使用する特
定生物に通’／ｊ’＋′見出されるようなジヒドロ葉酸
還元酵素（体）を意味する。野生型Ｄ　ＨＰ　Ｒは通常
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで低濃度のメトトレキセートに感受性
である。

ｒＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ
タンパク」なる用語も機能的な定義である。これは、細
胞内部で生成されたときには、０．２μｇ／ｘＱ以上の
ＭＴＸを含む培地でＭＴＸ感受性細胞を増殖せしめるＤ
ＨＰＲタンパクを意味する。このような機能的定義は、
生物のｒＭＴＸに対する結合親和ツノの低いＤＨＦＲタ
ンパク」を産生ずる能力及び産生されたタンパク自体に
依存することは明らかである。然しながら、本明細書中
てこの用、Ｈ＝７ｊを使用する場合には、前記の双方の
メカニズム間の平衡は問題にならない。即ち本発明では
、前記の如きＭＴＸレベルで生存する能力を付与するこ
とが操作の目的であり、産生じたＤ　ＨＦ　Ｒ固有の性
質に加えて多量の発現が前記の如き能力を強化したか否
かは重要でない。前記の定義に適合する適当なりＨＦＲ
タンパクの例としては、１９８３年１月１９日付出願の
米国特許出願筒４５９，１５１号明細書および対応する
ヨーロッパ特許出願公開箱１１７０６０号並びに特開昭
５９−１９２０８９号公報に開示されたものがあり、該
特許出願明細書を本明細書中に引用して包含する。

「発現ベクター」とは、内包するＤＮＡ配列が該配列を
発現させ得る別の配列に有効に（発現し得るように）結
合されている場合、該配列を発現させ得るベクターを意
味する。これらの発現ベクターは、本明細書中必ずしも
明確に記述しなくても、宿主生体中で、エビソームとし
て又は染色体ＤＮ八に組込まれた部分として複製可能で
なければならない。複製能が欠如するとベクターは有効
に作用し得ない。

要するに、「発現ベクター」なる用語も機能的定義であ
り、特定の配列に対して用いられると共に、内包する特
定のＤＮＡコードを発現させ得る任意のＤＮＡ配列も、
発現ベクターと指称され得る。

一般には、組換ＤＮＡ技術で使用される発現ベクターは
、しばしば「プラスミド」の形態にある。

「プラスミド」とは、環状二重鎖ＤＮＡループの呼称で
あり、ベクター形態のときには染色体に結合しない。プ
ラスミドの形態のベクターが最もよ（使用されるので、
本明細書中では「プラスミド」及び「ベクター」なる用
語を互換的に使用している。

然しなから、本発明は、勿論、同等の機能を果たすこと
ができ当業界で公知となる別の形態の発現ベクターをも
包含する。

「組換宿主細胞」とは、ｍ換ＤＮＡ技術を用いて構築さ
れたベクターで形質転換された細胞を意味する。前記の
如く、このような形質転換によって多量の１−ＰＡが産
生され得る。対照的に形質転換されていない宿主を用い
るとｔ−ＰＡの産生量は遥かに少なく、普通の場合には
検出不能な量でさえある。前記の如き細胞により産生さ
れたＬＰＡは［組換ｔ−ＰＡＪと指称され得る。

Ｂ、宿主細胞及びベクター 本発明で用いるベクター及び方法は、広範囲に亘る原核
生物及び真核生物の宿主細胞中での使用に適している。

一般に、本発明に有用なベクターを構築するためのＤＮ
Ａ配列のクローン化には原核生物が好ましい。たとえば
、Ｅ、　ｃｏｌｊ　　Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ
、３１４４６）が特に有用である。使用可能な別の微生
物菌株として、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｂ及び［Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｘ］７７６（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）の如き
Ｅ、　ｃｏｌｉ閑株がある。これらは勿論代表例であり
限定的なものではない。

原核生物は、又、発現のためにも使用され得る。

前記の菌株及びＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｗ３１１０（Ｆ−、
λ−。

プｏｌ・）ｏ７．、ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）、並び
に桿菌類たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ
、並びに他の腸内細菌類例えばＳ　ａｌｍｏｎｅｌｌａ
　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳ　ｅｒｒａｔｉａ　
　ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、並びに種々のシュードモナス種
が使用され得る。

一般には、宿主細胞と適合し得る種から誘導されたレプ
リコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、宿主
と関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位と
、形質転換された細胞中での表現型選択を可能にし得る
マーカー配列とを担持している。例えば、Ｅ、　ｃｏｌ
ｉは、典型的には、Ｅ、　ｃｏｌｉ種から誘導されるプ
ラスミドｐＢ　Ｒ３２２を用いて形質転換される（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ、ｅｔ　　ａｌＧｅｎｅ、２：９５（１９７
７））。ｐＢＲ３２２は、アンピンリン及びテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含んでおり、従って形質転換された
細胞の簡単な同定手段となり得る。ｐＢＲ３２２プラス
ミド又は他の微生物プラスミドは、微生物が自身のタン
パクを発現するのに使用し得るプロモーターを含有する
か又は含有する様に変性されていなければならない。組
換ＤＮへの構築に最もよく使用されるフロモーターとし
ては、β−ラクタマーゼ（ペニンリナーゼ）及びラクト
ースブロモーターシステＡ（Ｃｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ
、　、Ｎａｔｕｒｅ、γ７５−：６］５（１９７８）；
１ｔａｋｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ、
　］　９８°１０５６（１９７７）；Ｇｏｅｄｄｅｌ、
　ｅｔ　ａｔ、　、Ｎａｔｕｒｅ２８１）：５４４（１
９７９））、並ひにトリプトファンＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　、　８　：４　０　５　７（　］
　９８０）；欧州特許出願公開第００３６７７６号明細
書）かある。前記のプロモーターが最もよく使用される
が、他の微生物プロモーターも発見され且つ利用されて
おり、それらのヌクレオチド配列に関するのプロモータ
ーをプラスミドベクターに機能的に結合し得る（Ｓ　ｉ
ｅｂｅｎｌｓむ，　　ｅｔ　ａｌ．　　、　Ｃｅｌｌ，
　２　０　：２６９（＋９８０乃。

原核生物以外に、酵母の如き真核微生物の使用も可能で
ある。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ又は音通のパン酵母が最もよく使用される真核
微生物であるが、多くの他の菌株も使用され得る。

Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中での発現のためには、
例えばプラスミドＹＲｐ７（ＳＬｉｎｃｈｃｏｍｂ，ｅ
ｔ　　ａｌ．　　、Ｎａｔｕｒｅ２　８　２　：３　９
　（１　９　７　９１ＫｉｎｇＳｍａｎ，ｅｔ　ａｌ．
、　Ｇｅｎｅ。

７　：　Ｉ　／Ｉ　］　（］１９　７　９）；Ｔｓｃｈ
ｅｍｐｅｒ，ｅｔ　　ａｌ．、Ｇｅｎｅ。

１楽：］５７（１９８０乃か常用される。このプラスミ
ドは（叩１遺伝子を既に含有しており、同遺伝子は、ト
リプトファン中での増殖能力が欠如した酵母突然変異株
〔例えば、ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４
　　１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５・］　］
２］　９　７　７）））の選択マーカーとなる。従って
、酵母宿主細胞ゲノムの特徴として江１の損傷があると
、それはトリプトファンの不在下での増殖によって形質
転換を検出するための効果的な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列として、例え
ば、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ，　ｅｔ　ａｌ．、　Ｊ．　　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｃｍ
．　、２５５：２０７３（１９８０））又は他の解糖系
酵素（Ｈｅｓｓｅｔ　ａｌ．　、　Ｊ，Ａｄｖ．　Ｅｎ
ｚｙｍｅ　　Ｒｅｇ．　、ユニ１４９（１９６８）；Ｈ
ｏ月ａｎｄ，　　ａｔ　ａｌ．　　＋　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ＋　］　７：４９００（１９７８））に対
するプロモーターがある。後者の例に、エノラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、へ牛ソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートインメラーゼ
、ホスホグルフースインメラーゼ及びグルコキナーゼが
ある。適当な発現プラスミドを構築するには、これらの
遺伝子に伴う停止配列を、発現ベクター中で発現したい
配列の３′末端に結合して、ｍＲＮＡのポリアデニル化
及び停止を行なわせる。増殖条件によって転写が制御さ
れるという付加的利点を有する別のプロモーターとして
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ
、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、
前記グリセルアルデヒド３−ボスフェートデヒドロゲナ
ーゼ並びにマルトース及びガラクトースの資化に関係す
る酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ，１掲）に対するプロモーター
領域がある。

酵母適合性のプロモーター、複製のオリジン及び停止配
列を含むいかなるプラスミドベクターも適当に利用でき
る。

微生物以外に、多細胞生物から誘導された細胞も宿主と
して使用し得る。原則として、このような細胞はを椎動
物又は無を椎動物のいずれから得てもよい。然しなから
、を椎動物細胞の方が有利であり、近年では＃１織培養
でのを椎動物細胞の増殖かルーチンプロセスになってい
る（　ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ，　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄＰ　ａｔＬｅｒ
ｓｏｎ．　（　１　９　７　３　））。前記の如き有用
な宿主細胞のセルラインの例として、ＶＥＲＯ細胞株、
チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）セルライン並
びにＷｌ　３８．８ＨＫ、Ｃ０８−７及びＭＤＣＫセル
ラインがある。前記の如き細胞のための発現ベクターは
、通常、（必要に応じて）複製のオリジン、発現すべき
遺伝子の前方に位置するプロモーター、任意のリポソー
ム結合部位、ＲＮＡスプライス（ｓｐｌ　１ｃｅ）部位
、ボリアテニル化部位及び転写終了配列を必要なものと
して含む。

哺乳動物細胞中で使用する場合、発現ベクターの制御機
能は、しばしば、ウィルス性物質によって与えられる。

例えば常用のプロモーターは、ポリオーマウィルス、ア
デノウィルス２から誘導され、更に多くの場合サルウィ
ルス４０　（Ｓ　１ｍ１ａｎＶ　１ｒｕｓイ０，５Ｖ４
０）から誘導される。ＳＶ／ＩＱウィルスの初期（ｅａ
ｒｌｙ）プロモーター及び後期（Ｉａｔｅ）プロモータ
ーが特に有用である。これは、いずれも５Ｖ４Ｑウイル
スの複製のオリジンを併せて含む断片として、ウィルス
から容易に得られるからである（Ｆ　１ｅｒｓ、　ｅｔ
　　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３　：１１３（
１９７８）参照）。断片がウィルスの複製のオリジン中
に位置するＢｇ１１部位に向かって■」１ｎｄｌ１１部
位から伸びる約２５０ｂｐの配列を含む限り、ＳＶ４０
断片の長さの長短は問わない。更に、所望の遺伝子配列
が′通常伴っているプロモーター又は制御配列の使用も
可能であり、このような配列の使用が好ましい場合もし
ばしば見られる。但し、前記の如き制御配列は宿主細胞
系と適合しなければならない。

複製のオリジンは、５Ｖ４Ｑ又は他のウィルス（例えば
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）起源から誘導
され得る外来性オリジンを含むようにベクターを構築し
て得てもよく、又は宿主細胞染色体複製メカニズムによ
って得てもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組込まれ
る場合は、後者が良い場合もしばしばある。

ｔ−ｐ八及びＤ　ＨＦＲタンパクの双方をコードしてい
るＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによってトランス
フェクションを行なう好ましい宿主細胞を選択する際に
は、使用するＤ　ＨＦ　Ｒタンパクのタイプによって宿
主を選択するのが適当である。

野生型ＤＨＦＲＨＦ式クの場合には、Ｄ　Ｊ（Ｆ　Ｒが
欠如した宿主細胞を選択し、これにより、Ｄ　Ｉ−１Ｆ
Ｒコード配列を、ヒボキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを含まない選択培地でのトランスフェクションの成功
を示すマーカーとして使用するのが好ましい。この場合
の適当な宿主細胞きしては、Ｄ　ＨＦ　Ｒ活性が欠如し
たチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインが
ある。該セルラインは、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ
、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　５ｃｉ
（ＵＳＡ）、７ユ：４２１６（１９８０）に記載の方法
で調製され増殖させたものである。該文献を引用して本
明細書中に包含する。

他方、ＭＴＸに対する結合親和力の低いｌ）　Ｉ−Ｉ　
ＦＲタンパクを制御配列として使用する場合には、ＤＨ
ＦＲ耐性細胞を使用する必要がない。突然変異ＤＨＦＲ
はメトトレキセートに鈍感であるから、宿主細胞自体が
メトトレキセート感受性であれば、ＭＴＸ含有培地を選
択の手段として使ＩＴ７Ｌ得る。

ＭＴＸを取込み得る多くの真核細胞はメトトレキセート
感受性であると考えられる。このような有用なセルライ
ンの１例として、ＣＨＯ株、ＣＨＯに１　ΔＴＣＣＮｏ
、ＣＣＬ６１がある。

後述の実施例では川および膜プロモーターシステムを用
いるＥ、　ｃｏｌｉの使用、宿主細胞としてＣＩ−１０
細胞の使用、及びプロモーターとしてのＳＶ４０の′ｆ
Ｕ製のオリジンを含む発現ベクターについて記載する。

然しながら、原核生物又は真核生物宿主細胞の培養物中
で所望のタンパク配列を発現する発現ベクターを構築す
るために類似の技術を使用することは当業界で十分に公
知の事実である。

十分ｍのヒ１−ｔ−ＰＡが細胞培養に於いて産生される
が、第二のコード配列を用いて更に改良することにより
産生レベルを更に向」ニすることが可能である。この第
二のコード配列はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を
含み、このＤ　ＨＦ　Ｒは外部制御パラメーター例えば
メトトレキセート（ｍｅｔｈ。

ｔｒｅｘａｔａ、　Ｍ　ＴＸ　）の作用を受けるので、
従って、ＭＴＩＪａ度の調整によって発現を制御し得る
。

Ｃ叩辺迭 堅固な細胞膜障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用
するときは、トランスフェクションは、Ｇ　ｒａｈａｍ
及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂ、　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５
２：５４６（＋９７８）に記載のリン酸カルシウム沈澱
法で行なわれる。然しなから、ＤＮＡの細胞内導入のた
めには、核注入又はプロトプラスト融合の如き他の方法
も使用し得る。

原核細胞又は堅固な細胞膜障壁を有する細胞を使用する
とき、好ましいトランスフェクションの方法は、Ｆ、　
　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、６９：２１１０（１９
７２）に記載の塩化カルシウムを用いたカル７ウム処理
である。

所望のコード配列及び制御配列を有する適当なベクター
の構築には、標準的に結合方法を使用する。単離された
プラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、末端処理腰所望の
形に再結合して所要プラスミドを形成する。

開裂を行なうためには、適当な緩衝液中で１種（又は複
数種）の制限酵素で処理する。一般には、約１μ９のプ
ラスミド又はＤＮＡ断片に対し約１ユニツトの酵素を含
む緩衝溶液約２０μｇを使用する（特定の制限酵素に対
する適正な緩衝液及び基質量はメーカーによって処方さ
れている）。インキュベーション時間は３７°Ｃで約１
時間である。

インキュベーション後、フェノール及びクロロホルト抽
出でタンパクを除去し、エタノール沈澱により水性画分
から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合、生成物を１０ユニツトのポリメ
ラーゼＩ　（Ｋ　ｌｅｎｏｗ）により１５°Ｃで１５分
間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱する。

開裂した断片のサイズによる分離は、Ｄ、　　Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、３：４０５７（１９８０）に記載
された６％ポリアクリルアミドケルを用いて行なう。こ
の文献を引用して本明細書中に包含する。

結合を行なうためには、正しく整合すべく末端を適当に
処理したほぼ等モル量の所望成分を、０゜５ｔｔ１／の
ＤＮＡに対し約１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで処
理する。（開裂されたベクターを成分として使用する場
合、開裂されたベクターの再結合を阻止するために細菌
のアルカリ性ホスファターゼによる予備処理を行なうと
よい。）構築したプラスミドの正しい配列を確認すべく
行なう解析のためには、結合混合物を用いてＥｃｏｌｉ
　　Ｋ　１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）を
形質転換し、適当な性質例えばアンピシリンまたはテト
ラサイクリン耐性を利用して所望の形質転換株を選択す
る。形質転換株からプラスミドを調製し、制限解析し及
び／又は配列決定する（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ｅｔ　ａｌ
、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：３
０９（１９８１）又はＭａｘａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　
：４９９　（］　９８０））。

Ｄ　ＨＦ　Ｒタンパクをコードしている配列の増幅を行
なうには、Ｄ　ＨＦ　Ｒ活性の競合阻害剤であるメトト
レキセートを濃度約２０−５００．ＯＯＯｎＭで存在さ
せて宿主細胞を増殖させる。有効濃度範囲は、勿論、Ｄ
ＨＦＲ遺伝子の性質、タンパク及び宿主の特性に依存す
る。従って、上記の」二限値及び下限値は確定値ではな
い。ＤＨＦＲを阻害し得る他の葉酸類又は他の化合物を
適正′ａ度で使用することも可能である。然しながらや
はりＭＴＸが便利で入手し易く有効である。

Ｄ、好適具体例の概説 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を以下のように製
造した。

１、組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生ずる
ヒトメラノーマ細胞をコンフルエントな状態（全面成長
）になるまで培養した。

２６　　リボヌクレアーゼ阻害剤の存在下で前記の細胞
培養物から得た細胞ペレットを抽出し細胞質ＲＮＡ全部
を単離した。

３、オリゴ−ｄＴカラムを用い全メツセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）をポリアデニル化形態で単離した。酸性尿
素アガロースゲル電気泳動にかけてｍＲＮＡをサイズ分
画した。

４、組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＲＮＡを含
むゲル画分を以下の方法で同定した。

即ち、各ゲル画分のＲＮＡをイヌのスイ臓ミクロソーム
を補充したウサギ網状赤血球リゼイト系中ｉｎ　　ｖｉ
ｔｒｏで翻訳した。得られた翻訳産物を次にヒト組織プ
ラスミノーゲン活性化因子特異的１ｇＧ抗体で免疫沈降
した。

５　適切なＲＮＡ（２１乃至２４Ｓ）を対応する一重鎖
相補うＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換し、該ｃＤＮＡから二
重鎖ｃＤＮＡを製造した。ポリ−ｄＣを末端につなぎ、
１種以」二の表現型マーカーを含むプラスミドの如きベ
クター内に挿入した。

６、前記の如く調製されたベクターを使用して細菌細胞
を形質転換し、クローン化ｃＤＮＡライブラリーを調製
した。ｔ−ＰＡ中の既知のアミノ酸配列のフトンと相補
的な放射活性標識−合成デオキシオリゴヌクレオチドの
プールを調製しコロニーライブラリーのプローブに用い
た。このようなプールの例として、例えば、（既知（後
記）のアミノ酸配列、トリプトファン−グルタミン酸−
チロンンーンスティンーアスパラギン酸（Ｗ−Ｅ−Ｙ−
Ｃ−Ｄ）をフードする配列と相補的な）８種の１４ヌク
レオチド体（］　４−ｍｅｒ）、５’−ｄＴＣ（Ａ）Ｃ
Ｃ Ａ（Ｇ）ＴＡ（Ｔ）ＴＣＣＣＡ　　３°のプールかある
。

７　ポンチイブな（プローブに対して陽性反応を示した
）ｃＤＮＡクローンからプラスミドＤＮＡを単離し配列
決定した。

８、次に、ｔ−ＰＡをコードしている配列決定したＤＮ
Ａを適当な発現ベクターに挿入すべくｉｎ　　ｖｉｔｒ
ｏで末端処理し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に形
質転換し、宿主細胞を培養により増殖させ、所望のヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子を産生させた。

９、前記の如く産生きれたヒト組織ブラスミ／−ゲン活
性化因子は、セリンプロテアーゼ酵素部分に約２５１個
のアミノ酸を有しており、その」二流にクリングルを含
む配列を有する。

現在では該配列が線維素結合の主因であると理解されて
いる。成熟タンパク及びそのシグナルプレ配列とは全部
で５６２個のアミノ酸を含む。

前記の方法によって実質的に純粋なｔ−ＰＡを産生じ得
る。メトトレキセート感受性の付加的コード配列を用い
る本発明方法によれば、抗原的に活性なｔ−ＰＡタンパ
クを、宿主細胞の培養物中で１日に細胞当りＯ，Ｉｐｇ
より多い量で産生じ得る。適当な増幅条件を使用すると
、２０　ｐｇ／細胞／日より多い量を得ることも可能で
ある。換言すれば、９　Ｘ　１０−　＠Ｐ　ｔｏｕｇｈ
ユニット／細胞７日より多いか、又は適当な増幅によっ
て１８Ｘ１０−’Ｐ　ｌｏｕｇｈユニット／細胞／日よ
り多いｔ−ＰＡ活性を産生ずるような遺伝子発現レベル
が達成される。

この点に於いて、本発明では、薬剤としてメトトレキセ
ートを用いる。メトトレキセートは、これを摂取し得る
細胞には普通致死性を有するが、制御すれたＭＴＸレベ
ルではＤ　ＨＦ　Ｒコード配列をコードしている遺伝子
の増幅により細胞が増幅することを可能にするという性
質を有している（Ｓ　ｃｈｉｍｋｅ、　Ｔ、　　Ｒｏｂ
ｅｒｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０２
：１０５１（１９７８）；Ｊ、Ｌ、Ｂｉｅｄｌｅｒ、ｅ
Ｌ　　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　　、３２：１５３（１９７
２）：Ｓ、　　ＥＣｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ
１ｌ、　７　：３９　］　（＋９７６）参照）。

本発明のこの点の重要性は、Ｄ）（ＦＲ遺伝子の増幅が
、他のタンパクをコードしている関連配列の増幅をも生
起し得ることにある。関連タンパクが、Ｂ型肝炎表面抗
原（ＨＢｓＡｇ）（Ｊ、Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　、　７９：ｌ　８］　５（１９８２
））、Ｅ、　　ｃｏｌｉタンパクＸＧＰＲＴ（Ｒｉｎｇ
ｏｌｄ、Ｇｏｒｄｏｎ、　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍ
ｏ１ｅｃ、　ａｎｄＡｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　、↓：ｌ　
６５（１９８１））、及び結合ＤＨＦＲ／ＳＶ４０プラ
スミド由来内在性配列（ＲＦ、　　Ｋａｕｒｍａｎ、　
ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｂｉｏｌ。

１５９：６０１（１９８２））の場合に、前記の増幅現
象が生じる。

メトトレキセート耐性を与える別のメカニズムは、メト
トレキセートに対するＤＨＦＲタンパクの結合親和力を
低下させること、従ってメトトレキセート感受性を低下
させることである（Ｗ、　　Ｆ。

ＦＩｉｎｔｏ［Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｓｏｍａｔ、　Ｃ
ｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔ、　＋２：２４５（１９７６））
。しかしこの場合にも増幅は同様に生じるであろう。

野性型ＤＨＰＲ１及び自身の結合親和力の低下によりＭ
ＴＸ耐性になっているＤ　ＨＦ　Ｒに対する遺伝子は、
どちらもＭＴＸの存在により増幅されるようである。即
ち、基本的に、本発明は、ＭＴＸの存在下で、又は形質
転換された細胞をＭＴＸで予備処理することにより、１
．−ＰＡ配列の発現レベルを向上せしめる制御メカニズ
ムを得るために、ＤＨＦＲ配列の増幅が関連タンパクを
コードしている配列に与えるインパクトを利用している
。

Ｅ・宋廊湾 以下の実施例は本発明の代表例として示されたものであ
り限定的な性質を持たない。以下に記載の実施例に於い
ては、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞及び導入されるＤＨＦＲタン
パクのコード配列の型に適したＣＨＯセルラインを宿主
細胞として使用した。然しなから、他の真核細胞及び原
核細胞も同様に本発明方法に適している。

チニンの存在下（レーンｂ）又は不在下（レーンａ）で
、ヒトメラノーマ細胞から３時間のパルスの間に１ｎｖ
ｉｖｏで分泌され免疫沈降させた［３５Ｓ］−メチオニ
ンで標識された（１種以上の）タンパクを示すｌＯ％Ｓ
ＤＳアクリルアミドゲルのオートラジオグラムである。

組織プラスミノーゲン活性化因子特異的１ｇＧによる免
疫沈降後、分子量約６５，０００．６３．　ＯＯＯ及び
３５，０００を有する３つのバンドが観察された（レー
ンａ）。然しなから、プロテアーゼインヒビターの存在
下では、分子量３５．０００の種は観察されなかった（
レーンｂ）。

免疫前面？’ｆｆを使用するといかなる産生物も免疫沈
降しなかった（レーンＣ）。標準物質として使用した１
４Ｃで標識したタンパクの移動及び分子量をレーンａの
左方に示す。即ち、２００．ＯＯＯミオシン（Ｈ鎖）・
９２，５００　ホスホリラーゼＢ；６８゜０００牛血清
アルブミン；　　４．３，０００オバルブミン（ｏｖａ
ｌｂｕｍｉｎ）：　　２５．７００　　α−キモトリブ
ンノーゲン　１８，４００　　β−ラクトグロブリン。

第２図は、酸性尿素アガロースゲルから単離されたＲＮ
Ａ画分を翻訳した産生の免疫沈降物をゲル電気泳動にか
けた結果を示す。イヌのスイ臓ミクロンームの存在下で
翻訳後に組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＩｇＧ
で免疫沈降すると画分Ｎｏ、７及び８で主バンドが観察
された。このバンドは分子量約６３，０００ダルトンを
有する。

画分Ｎ０１７及び８に移動するｍＲＮＡのサイズは約２
１乃至２４Ｓである。ＲＮＡ尿素ゲル電気泳動後に決定
され且つ見易いように臭化エチジウムで染色されたリポ
ソームＲＮＡマーカーの位置が適当なゲルレーンの上方
に示されている。

ＡＣ 第３図は、”ｐ−ｄＴＣ（）ＣＡ（）ＴＡ（Ｔ）Ｇ ＴＣＣＣＡ（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プローブを用い？、
１９６個のコロニーのハイブリダイゼーションパターン
を示す。９６個の形質転換株の各々をマイクロタイター
プレート上で増殖させ、レプリカ平板法で処理し、ニト
ロセルロース膜上で増殖させた。次にコロニーを溶解し
、細菌性ＤＮＡを固定し、フィルターを”Ｐ−１４ヌク
レオチド体（１４量体）（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プロー
ブとハイブリダイズした。フィルターを洗浄してハイブ
リダイズしなかったプローブを除去し、Ｘ線フィルムに
露光した。このオートラジオグラムは４８個のフィルタ
ー（４６００個の独立コロニー）の各々によって得られ
たパターンを示す。Ｎｏ、２５のフィルター上のポジテ
ィブな組織プラスミノーゲン活性化因子ｃＤＮＡを有す
るクローンの例をＥｌｏ（矢印）で示す。

第４図は、全長（ｆｕｌｌ　　ｌｅｎｇｔｈ）ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子ｃＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼマツプである。制限エンドヌクレアーゼ開裂に
より生成した断片の数及びサイズの測定には、６％アク
リルアミドゲル電気泳動を用いた。

（第５図の）核酸配列によって部位の位置を確認した。

Ｑ大のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａ
ｄｉｎｇ　　ｆｒａｍｅ＋　停止コドンに至るまでの最
長のＤＮＡ配列）のコード領域を長方形で示し、斜線領
域は推定されるングナルペプチド配列を示す。

点描領域は推定される成熟組織ブラスミノーゲン活性化
因子配列（５２７個のアミノ酸）を示す。ｍＲＮＡの５
”末端は左方、３゛末端は右方に示す。

第５ａ、５ｂ及びＳｃ図は、全長ヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定さ
れるアミノ酸配列を示す。成熟配列に先行する３５個の
アミノ酸（−３５乃至−１）は連続した配列として示さ
れている。この３５個のアミノ酸配列は、成熟タンパク
のセリン（＋１）に先行する約１２乃至１５個のアミノ
酸の親水性“プロ″配列を含み、該プロ配列の前にパ従
来の″疎水性シグナルが存在する（５°末端から−３５
まで伸びる）。分泌されたタンパクに於けるこの種のプ
レープロ構造は、既に、例えばプレプロアルブミンに関
して記載されている。この理論に基く場合、分泌された
組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は全て、アミン
末端としてのセリン（＋１）から始まるであろう。第２
の理論によれば、親水性配列が組織プラスミノーゲン活
性化因子の機能に関与すると考えられており、この機能
は、１０゜０００ダルトンのペプチドが天然プラスミノ
ーゲンのアミ／末端部分（アミノ末端残基に因んで名付
けられたＧｌｕ−プラスミノーゲン）から開裂されて、
Ｌｙｓ−プラスミノーゲンとよばれる新しいアミ／末端
を有するより小さい分子となるときにプラスミノーゲン
で観察されるのと同様な機能であると考えられる。Ｌｙ
ｓ−プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンよ
りも活性化されてプラスミンになり易く、また線維素に
対する親和力もより大きい。プラスミンはＧｌｕ−プラ
スミノーゲンからＬｙｓ−プラスミノーゲンへの転換を
触媒することが判明している。この種のコントロールメ
カニズムは“′ポジティブフィードバック″メカニズム
となる。最初に形成されたプラスミンは、線維素を分解
し同時に天然プラスミノーゲンよりも活性化し易く基質
により堅く結合し易いプラスミノーゲン分子を生成する
。その結果、線維素の分解が促進される。組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の親水性ペプチドは同様なメカニズ
ムにより、その開裂によって線維素への酵素の結合を修
飾し得る。いずれにしても、３５個のアミノ酸配列は、
成熟タンパクのプレ配列と考えられる。

第６図は、組織プラスミノーゲン活性化因子発現プラス
ミドｐ△ＲＩＰＡ’の構築を示す概略説明図である。出
発プラスミドｐＰＡ２５Ｅ１０を先ずＰｓｔｒで消化し
て３７６ｂｐ断片を０１離し、次に該断片を図示の如く
消化する。

第７図は、ｐ△ＲＩＰＡ’によって形質転換された細胞
中で得られた発現産物の線維素溶解能のフィブリンブレ
ートアッセイの結果を示す。

第８図は、（本発明の）組織ブラスミノーゲ活性化因子
のトリプシン消化によるペプチドのＩ（Ｐ　ＬＣ（高速
液体クロマトグラフィー）トレース（２１０ｎｍに於け
る吸収）を示す。矢印は、コロニーライブラリーに用い
るヌクレオチドプローブを設計すべく使用されたペプチ
ドに対応するピークを示す。このピークで示されるペプ
チドの完全配列は、１、Ｔ−Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ−Ｖ−
Ｐ−３−Ｃ５−Ｔ−Ｃ−（、−Ｌであることが知見され
た。ヒトｍ織プラスミノーゲン活性化因子の正しいアミ
ノ酸配列を確認すべく、他の主たるピークの配列も同様
にして決定され知見された。アミノ酸を示すペプチドの
文字コードを以下に示す。

Δｓｐ　　　Ｄ　　　アスパラギン酸 ｒｌｅ　　　Ｉ　　　イソロイシン Ｔｈｒ　　　Ｔ　　　スレオニン Ｌｅｕ　　　Ｌ　　　ｏイシン Ｓｃｒ　　Ｓ　　　セリン Ｔｙｒ　　　Ｙ　　　チロシン Ｇｌｕ　　　Ｅ　　　　グルタミン酸 Ｐｔ＋ＯＦ　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　Ｐ　　　プロリン Ｈｉｓ　　　ｌ−１ヒスチジン ｃｒｙ　　　Ｇ　　　グリシン Ｌｙｓ　　　Ｋ　　　リジン Δｌａ　　　Ａ　　　アラニン Ａｒｇ　　　Ｒアルギニン Ｃｙｓ　　　Ｃシスティン Ｔｒｐ　　　Ｗ　　　トリプトファン Ｖａｌ　　　Ｖ　　　バリン Ｇｉｎ　　　Ｑ　　　グルタミン Ｍｅｔ　　　Ｍ　　　メチオニン Ａｓｎ　　　Ｎ　　　アスパラギン トリブチノクベブチド解釈（ｔｒｙｐｔｉｃ　　ｐｅｐ
ｔｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓ）用のサンプルは以下の如く
調製した。

Ｉｆｇのｔ−ＰＡを１００倍容の１％Ｎ　Ｈ、ＨＣＯ３
に対して透析し、凍結乾燥した。乾燥サンプルに、尿素
０．３６１ｇ、ＥＤＴＡｍ液（Ｎａ２ＥＤＴＡ５０１１
９／峠）０．０３ｘρ、トリス緩衝液（１００ａ＋＆中
に１７．３９のトリス塩基及び２９．７＊ｌ！のｌＮＨ
Ｃｌを含有する）０．３ｘρ及び２−メルカプトエタノ
ール０．０１１１１（を添加した。

Ｈ，Ｏを添加して容積を０．７５ＲＱ１．：調整し、サ
ンプルを１肩Ｑの気密性バイアルに入れた。バイアルを
８Ｍ尿素で上端部に５０μＣの空間を残すように充填し
、乾燥Ｎ２で置換し、密封した。室温で４時間インキュ
ベートし、５０μＱのヨード酢酸（ＩＮ　　Ｎａ１ｌ（
中５４０ｍｇ／ｐのを添加し、暗所で１５分間インキュ
ベートした。次いで、ｊ％ＮＨ，ＨＣＯ３を含浸しフォ
イルで包んだ５ｅｐｈａｄｅｘＰＤ−１０カラトにかけ
、タンパクを含有する画分を集めた。（ジフェニルカル
バミルクロリド（Ｄｌ）　ＣＣ）処理した）トリプシン
をｔ−ＰＡに対して重量比１：］ＯＯで添加し、３７°
Ｃで］６時間インキュベートした。次いでサンプルを凍
結した。

Ｓ　ｙｎｃｈｒｏｎＲＰ　　４カラム逆相クロマトグラ
フイーを使用して５ｐｅｃｔｒａ　　Ｐｈｙｓｉｃｓ　
　５Ｐ８０００１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ系でＨＰＬｃ解析し
た。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中アセトニトリル
密度勾配（０〜７０％）を使用してペプチドを溶出した
。２１０ｎｍ及び２８０ｎｍに於ける吸収をモニターし
た。

第９図は、及、ｃｏｌｉでの成熟ヒト＃Ｉ織プラスミノ
ーゲン活性化因子の直接発現をコードするプラスミドの
構築を示す。５０μ９のプラスミドｐＰＡＩ７をジ製３
ＡＩ及びＨｈａｌで消化し、６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた。約０５μ２の５５ｂｐ　５ａｕ３
Ａ　Ｉ−Ｈｈａｌ断片を回収した。同様にして、８０μ
ｇのクローンｐＰＡ２５ＥＩＯから先ず３００ｂｐ　Ｐ
ｓｔｌ−Ｎａｒｌ断片を単離し次にこの断片をＨｈａｌ
で消化することにより約３μｙの２６３ｂｐ焦すＩ−斗
ａＢ断片を精製した。全ての消化は３７°Ｃにて１時間
を要して行なわれ、反応産物を溶解し、６％ポリアクリ
ルアミドゲルから電気溶出した、図示の２種のデオキシ
オリゴヌクレオチド５’ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡ
ＴＣＡＡＧＴ（１）と５’ｄＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡ
ＡＧＡＣＡＴＧ（ＩＩ）とを固相ホスホトリエステル法
により合成した（文献５１参照）。６０ｍＭのトリス（
ｐＨ８）、ｌｏｍＭのＭｇＣ１ｚ、１５ｍＭのβ−メル
カプトエタノール及び５０μＣｉの〔γ”ＰＩＡＴＰ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ、　　５，０００Ｃ４ｍｍｏｌ−りを
含む３０μρの反応容量中で１００　ｐｍｏｌｅのオリ
ゴヌクレオチド■をリン酸化し、１２ユニツトのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを添加し、３７°Ｃで１５分間
反応させた。次に、１μρのＩＯｍＭＡＴＰ及び１２ユ
ニツトのＴ４キナーゼを添加し更に３００分間反応せた
。フェノール／ＣＨＣＩ。

抽出後、リン酸化オリゴマー■及び５′−ヒドロキシオ
リゴマーＩを、０．５ｔｔ＆の溶出５５ｈｐＳａｕ３Ａ
Ｉ　　ＨｈａＪ断片及び２μ９の２６３ｂｐ　　Ｈｈａ
ｌ−Ｎａｒ■断片と合せてエタノール沈澱した。これら
の断片を、２０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７゜５）、
ｌｏｍＭのＭｇＣｌ２、ｌ０ｍＭのジチオスレイトール
、０．５ｍＭのＡＴＰ及び１．　ＯＯＯユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼを含む６０μρの反応液中で、室温にて
４時間を要して結合した。混合物を、４８ユニツトのＮ
ａｒｌ、２０ユニツトのＥｃｏＲｌ及び４０ユニｙトの
ＢｇｌｌＩで１時間消化して（粘着性５ａｕ３ΔＩ末端
相互の結合による重合を阻止し）、６％ゲル電気泳動さ
せた。３３８ｂＰの産物（約０１μｇ）を電気溶出によ
って回収した。プラスミドｐＰΔ２５ＥＩＯをＮ肛■及
び乱〔■により消化して、１６４５ｂｐ断片としてｔ−
ＰＡコード配列の残部（アミノ酸＋１ｌ−５２８）を単
離した。

プラスミドｐＬｅＩ　Ｆ　Ａｔｒｐｌ　Ｏ３は、Ｉ、ｅ
ｌＦＡ遺伝子に対して遠位のＥｃｏＲ１部位が除去され
たく文献５３）プラスミドｐＬｅｆＦＡ２５の誘導体く
文献５２）である。３ｔｔｙのｐＬｅｌ　ＦＡｔｒｐ］
　０３を、２０ユニツトのＥｃｏＲＩ及び２０ユニツト
の隻１■を用いて３７℃で９０分間消化し、６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動し、大きい（〜４，２０Ｏｂ
ｐ）ベクター断片を電気溶出によって回収した。

最終的な構築のために、８０ｎｇのＥｃｏＲｌ−Ｂ担Ｕ
　　ｐＬｅｌ　Ｆ　Ａｔｒｐｌ　０３断片を、１１００
ｎの１６４５ｂｐ　Ｎａｒｌ−ＢｇｌＵ断片及び２０ｎ
９の３３３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｎａｒｌ断片と、室温で
１０時間かけて結合した。この結合混合物を用いてＥ、
ｃ。

１ｉＫ−１２株２９４を形質転換した。３８個の形質転
換株からプラスミドＤＮＡを調製しＥｃｏＲＩで消化し
た。このうち１０個のプラスミドが所望の６００ｂｐ及
び４７２ｂｐＥｃｏＲｌ断片を含有していた。ＤＮＡ配
列解析により確認すると、これらのプラスミドの１つ（
ｐｔ−ＰＡｔｒｐｌ　２）が匂±プロモーター、合成り
ＮＡ及びｃＤＮＡ間の接合部に所望のヌクレオチド配列
を有していた。

第１０図は、本発明の組織プラスミノーゲン活性化因子
発現産物の線維素溶解能のフィブリンフレートアッセイ
の結果を示す。５μｇ／ｘ（ｌのテトラサイクリンを含
むルリアブロス（Ｉ、ｕｒｉａ　　ｂｒｏｔｈ）で１晩
培養したＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｗ３１１０／ｐｔ−ＰＡ卿
１２を、０．２％のグルコース、０．５％のカザミノ酸
及び５μ９／　１ｘＱのテトラサイクリンを含むＭ９培
地中に１：１００に希釈した。細胞を３７°ＣでＡ’ｔ
５ｏ　　Ｏ，２になるまで増殖させ、インドールアクリ
ル酸を最終濃度が２０μｇ／ｍ（ｌになるまで添加した
。Ａｓ５ｏ＝０．５−０．６（〜２ｘ＋Ｏ１′細胞／肩
ので遠心してサンプルを採取し直ちに凍結した。細胞ペ
レットを６Ｍの塩酸グアニジンに５Ｘ］０８細胞／ｘ（
ｌで懸濁させ、１０秒間超音波処理し、２４°Ｃで３０
分間インキュベートシ、次いで２５１１１Ｍのトリス−
ＨＣ］（ｐＨ８，０）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２
５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ８０に対
して４時間透析した。透析後、サンプルを１３，０ＯＯ
Ｘｙで２分間遠心し、１０μａの上清を分析して組織プ
ラスミノーゲン活性化因子の活性を定量した。Ｇｒａｎ
ｅｌｌｉ　−Ｐ　１ｐｃｒｎ。

及びＲｅｉｃｈの方法（文献８７）を準用し、プレート
を３７°Ｃで３．５時間インキュベートし溶解ゾーンを
測定した。精製メラノーマ４Ｊ’ｌ織プラスミノーゲン
活性化囚子溶液の希釈液と比較して定量した。

Ｅ、］。Ｂ　組織プラスミノーゲン活性化因子ｍＲＮＡ
の起源 ヒトメラノーマ細胞（Ｂ　ｏｗｅｓ）を使用した（この
細胞は、例えばＬ　ｅｕｖｅｎ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　
　ａｎｄ　　Ｄ　ｅｖａｌｏｐｍｅｎｔ　　ｖｚｂ、　
　Ｌｅｕｖｅｎ、　　Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｄｒ、　　ＤＣ
ｏｌｌｅｎ）等から制限なく自由に入手可能である。

文献８８参照）。炭酸水素ナトリウム（最終濃度０１２
％）、２ｍＭのグルタミン及び１０％の熱失活牛胎児血
清を補充した１００ｘＣのＥａｒｌｅｓ　Ｍｉｎｉｍａ
ｌＥ　５ｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍｅｄｉａ（米国バージニ
ア州マツクレーンのＦ　ｌｏｗ　　１ａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）中で、メラノーマ細胞をコンルエントな状
態になるまで単層培養した。メラノーマ細胞がヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生じたことを確
認すべく、２４ウ工ルマイクロタイター皿でヒトメラノ
ーマ細胞をコンルエントな状態になるまで培養した。

０．３３μＭのプロテアーゼインヒビター、アプロチニ
ンの存在下又は不在下で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）で１度洗浄し、血清及びメチオニンを含まな
い培地０．３ｘＣを添加した。７５μＣｉの［”Ｓ）−
メチオニンを添加し細胞を３７°Ｃで３時間かけて標識
した。３時間で標識した後、培地を細胞から除去し、免
疫沈降のために組織プラスミノーゲン活性化因子特異的
１ｇＧ又は免疫前血清で処理した（文献５４）。免疫沈
降産物を１０％ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動させ
（文献６３）、平板ゲルを固定し、乾燥し、Ｘ線蛍光測
定した（文献６４．第１図参照）。

Ｅ、　］、ＣメツセンジャーＲＮＡの単離及びす堕〆分
世 メラノーマ細胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗａｒｄ　
　ｅｔ　ａｌ、の方法（文献５５）を準用して抽出した
。細胞を遠心によりペレットにし、次に１０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭ）リス−ＨＣ！（ｐＨ７，５）及び］、
５５ｍのＭｇＣｌ、に再懸濁させた。ＮＰ４０（ＮＯＮ
ＴＤＥＴ　　Ｐｉｅ、米国メリーランド州ロツクウ゛イ
ルのＢ　ＲＬ　（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製（最終濃度１％）
を添加して細胞を溶解し、遠心して核をペレット化した
。全ＲＮＡを含む上清を多数回のフェノール／クロロポ
ルム抽出により更に精製した。水相を０．２ＭＮａＣ１
溶液にし、次に２倍容のエタノールを添加して全ＲＮＡ
を沈澱させた。オリコーｄＴセルロースクロマトグラフ
ィーを用い、全ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを精製した（
文献５４）。典型的な収量としては、１０ｇの培養メラ
ノーマ細胞から５乃至１０ＪＩｇの全ＲＮＡ及び５０乃
至２００μこのポリ（Ａ）プラスｍＲＮＡが得られた。

尿素−アガロースゲル電気泳動を用いてポリＡ＋ｍＲＮ
Ａ（２００μｙ）（文献５６）の分画を行なった。

１．７５％のアガロース、０．０２５Ｍのクエン酸ナト
リウム（ｐＨ３，８）及び６Ｍの尿素から成る平板アガ
ロースゲル（文献５７及び５８）を用いた。

電気泳動は２５ミリアンペア、４°Ｃで７時間実施し、
次にゲルをカミソリの刃で分割した。各スライスを７０
’Ｃで融解し、フェノールで２回、クロロホルムで１回
抽出した。次に両分をエタノール沈澱し、引続いてイヌ
のスイ臓ミクロソーム（文献６１）を補充したウサギ網
状赤血球ライゼート系（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ　　Ｌ　ａｂ、　、文献５９及び６０）中ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏで、以下の如く翻訳してアッセイを実施
した。２５ｍＭのＪ（ＥＰＥＳ（Ｎ、２−とドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ−２−エンタスルホン酸緩衝１ｌ１
２）、４８．３ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸
クレアチン、各５０ｍＭの１９種のアミノ酸、１．１ｍ
Ｍの塩化マグネシウム、１６．６ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１６ｍＭのジチオスレイトール、８．３ｍＭのヘミン、
］　６．６　ｔｔｑ、　ｘＱのタレアチン＋ナーゼ、０
．３３ｍＭの塩化カルシウム、０６６ｍＭのＥＧＴＡ（
エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル
）−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトう酢酸緩衝液）及び２３．３
ｍＭの塩化ナトリウムを含む最終容量３０μＱの溶液中
で２５μＣｉの［：”Ｓ）−メチオニン及び５００ｎｇ
の各ゲルスライスＲＮ　Ａを用いて翻訳した。

３０’Ｃで９０分間インキュベートした。リポソーム（
文献６１）を除去すべくＥＤＴＡを用いて粗ミクロソー
ムから調製したイヌのスイ臓ミクロソーｌ、膜を、文献
６２に記載の如くヌクレアーゼで処理し、最終濃度７　
Ａ　２１１Ｑユニット／ｍＱで翻訳混合物中に存在させ
た。翻訳産物又は免疫沈降翻訳産物を、文献６３に記載
の如く、ドデンル硫酸ナトリウム中に１０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけて解析した。未染色の平板
ゲルを固定し、乾燥して蛍光測定した（文献６４）。

各ゲル画分から得られた翻訳産物をウサギの抗ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子特異的１ｇＧで免疫沈降さ
せた。主な免疫沈降ポリペプチドバンドは、分子量約６
３，０００グルトンのＲＮＡ画分Ｎｏ、７及び８（２１
乃至２４Ｓの移動度）の翻訳産物中に見られた。免疫沈
降の際に免疫前ＩｇＧを使用すると前記のバンドが見ら
れなかった。このことは、これらのポリペプチドが組織
プラスミノーゲン活性化因子特異的であることを意味す
る。

５μｇ（Ｄ’ｆ　ル分画ｍＲＮ　Ａ　（ゲルスライス７
（７）ｍＲＮＡ）を使用し、標準法（文献５２．６５及
び６Ｇ）で２重鎖、ｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを６
％ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、３５０　ｂ
ｐより長いｃＤＮＡ（１２５ｎｌ＋）を電気溶出した。

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーセ
（文献６７）を用いて３０ｎｇのｃＤＮＡにデオキソ（
Ｃ）残基をつなぎ、同様にＰｓｔ１部位にデオキソ（Ｇ
）残姑（文献６７）を末端に結合したプラスミドｐＢＲ
３２２（文献６８）３００ｎ９とアニールした。アニー
ルした混合物を次にＥ、ｃｏｌｉＫＩ２株２９４（ＡＴ
ＣＣＮｏ、３１４４６）に形質転換し、得られたテｉ・
ラサイクリン耐性コロニーを、５μｇ／ｚσのテトラサ
イクリン含有し一ブロス（文献９３）を入れたマイクロ
タイタープレートの個々のウェルに接種した。４６００
個の形質転換株のｃＤＮＡライブラリーをニトロセルロ
ースフィルター上で増殖させ、各コロニーのＤＮＡをフ
ィルターに固定した（文献６９）。８種のデオキンオリ
ゴヌクレオチドｄＴＣ（Ｑ）ＣＡ（Ｑ）ＴＡ（♀）ＴＣ
ＣＣＡを、４種の１４ヌクレオチド体の２種のプール中
で固相ホスホトリエステル法（文献５１）によって化学
的に合成した。３２ｐ−標識プローブを前記８種の１４
ヌクレオチド体（文献５２）のブ−ルから調製した。４
６００個の形質転換株を含有するフィルターのセクトを
、リン酸すｌ・リウム（ｐＨ６，８）５０ｍＭ、５ｘＳ
ＳＣ１超音波処理サケ精子ＤＮＡ］５０１ｚｇ／屑Ｑ、
５×デンハルト溶液及び１０％ホルムアミド中で、前記
標識プローブ５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃ、ｐ、ｍ、とハイブリ
ダイズした。室温に１６時間放置した後、フィルターを
室温で６×ＳＳＣ及び０１％ＳＤＳ中て良く洗浄し、次
いでＸ−線フィルムに露光した。

Ｅ、１．Ｅ、ＤＮＡプローブの調製 文献１９及び２０に記載の方法で精製ヒト組織ブラスミ
／−ゲン活性化因子を得た。

合成プローブの作製の最適領域を見い出すべく分子を以
下の如く検査した。

タンパクをトリプシン消化し易くするために還元及びカ
ルホキンメチル化した。組織プラスミノーゲン活性化因
子２Ｈのサンプルを先ず０．Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ８０に対
して室温で１晩透析した。凍結乾燥したタンパクを次に
０．５６Ｍのトリス−■］Ｃ１緩衝液（ｐＨ８，６）、
８Ｍの尿素及び５ｍＭのＥＤ　′ＦＡを含む液１２好に
溶解した。０．］ｉρのβメルカプトエタノールを添加
してジスルフィド結合を還元した。反応は窒素下４５°
Ｃで２時間行なった。１．４Ｍのヨード酢酸のＩＮ　　
ＮａＯＨ溶を夜］、Ｏｘ＆を添加して還元ジスルフィド
をアルキル化しカルボキシメチル化誘導体を得た。室温
に２０分間放置後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０に対して
室温で１８時間透析して反応を停止し、凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥カルボキシメチル化タンパクを３順の
Ｏ，１Ｍリン酸すトリウム緩衝液（ｐＨ７５）に再度溶
解した。トリプシン（ＴＰＣＫ、Ｌｌ−トシルアミド−
２−フェニルエチルクロロメチルケトンで処理したトリ
プシン）を（］：５０の割合で）添加し、３７°Ｃで消
化した。３時間、６時間及び１２時間後にサンプル（０
，１１Ｒρ）を取出した。

１２時間後にトリプシンを再度添加した。２４時間後に
サンプルを凍結して反応を停止し、ＨＰＬＣに注入でき
るまで保存した。ＳＤＳゲルによりサンプルの消化の程
度を測定した。３時間後のすンブルでかすかなバンドが
見られる以外、全てのゲルに変化はなかった。このこと
は、２４時間で完全な消化が行なわれ、大きいペプチド
が残存しないことを示す。

約０．５ｘ１２のサンプルを２系列操作型の高分ｌ！ゲ
能ＡｌｔｅｘＣ−８ウルトラスフェア（ｕｌｔｒａｓｐ
ｈｅｒｅ）５μカラムに注入した。アセトニトリルの勾
配を徐々に与えた（５分で１乃至５％、１００分で５乃
至３５％、３０分で３５乃至５０％）。２系列操作のう
ちの１系列の操作で溶出液を２つの波長（２］Ｏｒ＋ｍ
及び２８０　ｎｍ）でモニターした。２つの波長での吸
収比を用いてトリプトファンを含むペプチドを検出した
。

多分トリプトファンを含むと思われるペプチドピーク、
又は他の理由で有用と考えられたペプチドピークの配列
決定を最初に行った。これにより大部分のトリプトファ
ンの周辺の配列を決定し得た。約２５個の最も可能性が
あると思われるペプチドピークの配列決定後、−列に並
べた全部の配列データをプールして組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の一次構造の予備モデルが得られた。この
データ及びモデルからいくつかの可能なプローブの位置
を決定した。

顎 ５μ！／／Ｒρのテトラサイタリンを含むＬＢ（文献９
３）を入れたマイクロタイタープレートの各ウェルにコ
ロニーを１個ずつ接種上７％までＤＭＳＯを添加して一
２０℃に保存した。コロニーライブラリーの２個のコピ
ーをニトロセルロースフィルター上で増殖させ、各コロ
ニーから得たＤＮＡをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ　　Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ法（文献６９）でフィルターに固定した。

ＡＣ ３２ｐ〜標識−ＴＣ（。）ＣＡ（。）ＴＡ　（Ｔ）ＴＣ
ＣＣＡプローブを、前記の如く合成オリゴマー　カラ調
製Ｌ　タ（前記（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）］　４ヌクレオ
チド体プール）。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐｌ−
１６，８）、５ｘＳＳＣ（文献８０）、１５０μ２／１
１ρの超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５ｘデンハルＩｌ液
（文＃８５）及び１０％ホルムアミド中、４，６００個
の形質転換株を含むフィルターを、室温で２時間プレハ
イブリダイズし、次に同じ溶液中で５０×ｌＯ６力ウン
ト／分の標識プローブとハイブリダイスした。室温で、
−晩インキユベートし、フィルターを５ｘＳＳＣ及び０
．１％ＳＤＳ中室温で中室性間３回洗浄し、２ＸＳＳＣ
で１回洗浄し、次にＤ　ｕｐｏｎｔ　　Ｌ　ｉｇｈｔｎ
ｉｎｇ　　Ｐ　Ｉｕｓ増感スクリーンでＫｏｄａｋ　　
ＸＲ−５Ｘ線フィルムに１６時間露光した。

ポジティブなハイブリダイゼーション反応を示した１２
個のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した（文献７
１）。次に、断片をＭ１３ベクターｍｐ　７　（文献７
３　）中でサブクローン化した後、クローンから得たｃ
ＤＮＡインサートの配列を、ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａ
ｔ　ｉｏｎ法（文献７２）及びＭａｘａｍ　Ｇ１１ｂｅ
ｒｔ化学法（文献７４）により決定した。第３図は、ポ
ジティブな組織プラスミノーゲン活性化因子クローンの
ハイブリダイゼーションパターンを示すフィルターＮｏ
、　２５の図である。コロニー２５Ｅ１０中のｃＤＮＡ
インサートのアミノ酸配列と、精製組織ブラスミ／−ゲ
ン活性化因子から得られたペプチド配列（前記）との比
較、及びＥ、　ｃｏｌｉ中で産生される発現産物（詳細
は後記）とから、このｃＤＮΔインサートが組織プラス
ミノーゲン活性化因子をコードするＤＮＡであることが
判明した。クローン２５Ｅ１０（プラスミドｐＰＡ２５
Ｅ］ｏ）のｃＤＮＡインサートは、（第５図に示すよう
にヌクレオチド２４３から始まる）２３０４ｂｐの長さ
を有しており、その最長のオーブンリーディングフレー
ムは５０８個のアミノ酸からなるタンパク（ＭＷ５６．
７５６）をコードしており、７４５ｂｐの３”非翻訳領
域を含む。このｃＤＮＡクローンにはＮ−末端をコード
する配列が欠如している。

第６図に示す如く、５０μ２のｐＰＡ２５Ｅ］。

（前記）をＰｓｔｌで消化し、６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で３７６ｂｐの断片を単離した。この断片
約３μ２を電気溶出でゲルから単離し、３Ｏユニツトの
Ｄｄｅｌを用いて３７℃で１時間消化し、フェノールク
ロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた。これによ
りＤｄｅＩｔｌ！ｉｆ）末端が得られる。反応混合物に
５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋ　ｌｅｎｏｗ
断片）並びに各０．１ｍＭのｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを添加し、４℃で８時
間インキュベートして、前記のＤｄｅｌ粘着末端を伸ば
して平滑末端とした。フェノール−クロロホルム抽出後
、ＤＮＡを１５ユニツトのＮａｒｌで２時間消化し、反
応混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。約０．５μ９の所望の１２５ｂｐ平滑末端−Ｎａｒ
ｌ断片を回収した。この断片は、成熟全長組織プラスミ
ノーゲン活性化因子タンパクのアミノ酸のうちＮｏ、　
６９からＮｏ、　Ｉ　］０までのアミノ酸をコードして
いる。

１６４５ｂｐ　Ｎａｒｌ　−Ｂｇｌｌｌ断片を単離する
ために、３０μ９のｐＰＡ２５Ｅｌｏを３０ユニツトの
ＮａｒＩ及び３５ユニツトのＢｇｌｌｌにより３７°Ｃ
で２時間消化し、反応混合物を６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。約６μ９の所望の１６４５ｂｐ
　Ｎａｒｌ−旦ｇｌＩＩ断片を回収した。

プラスミドｐ△ＲＩ　ｅｘｓｒｃはプラスミドｐＳＲＣ
ｅ×１６（文献７９）の誘導体であり、前者に於いては
、■プロモーターに近位でＳＲＣ遺伝子に遠位のＥｃｏ
Ｒ１部位がＤＮＡポリメラーゼ＋　（文Ｍ２８）で修復
することにより除去されており、ホスホトリエステル法
（文献７５）で合成された自己相補的オリゴデオキンヌ
クレオチド　ＡＡＴＴＡＴＧΔＡＴＴＣＡＴがＸｂａ１
部位の直ぐ隣りの残存ＥｃｏＲ１部位に挿入されている
。２０μ２のｐ△ＲＩ　ｃｘｓｒｃをＥｃｏＲＩで完全
に消化し、フェノール−クロロポルムを抽出し、エタノ
ール沈澱した。

次に、２５１１１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、
１ｍＭのＺｎＣＩｚ及び０．３ＭのＮａＣ］の中でプラ
スミドを１００ユニツトのヌクレアーゼＳ１で１６℃、
３０分間消化し、配列ＡＴＧをもつ平滑末端を形成した
。フェノール−クロロボルム抽出及びエタノール沈澱後
、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、大きい（４，３００ｂｐ）ベク
ター断片を電気溶出で回収しａ）Ｎ〜末端組織プラスミ
ノーゲン活性化因子配列０．２μ？のベクター、０．０
６μ９の１２５ｂｐ平滑末端−ＮａｒＩ断片及び０．６
　μｇの１６４５ｂｐＮ鼾Ｉ−旦０■断片とを、１０ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼで、室温で７時間を要して
互いに結合して発現プラスミドを構築し、Ｅ、ｃｏｌｉ
２９７１株（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）をアンピシリ
ン耐性に形質転換すべく使用した。プラスミドＤＮＡを
２６個のコロニーから調製しＸｂａｌ及びＥｃｏＲｌで
消化した。そのうち１２個のプラスミドが所望の４　］
　５ｂｐＸｂａｌ　−ＥｃｏＲＴ断片及び４７２ｂｐＥ
ｃｏＲＩ−断片を含んでいた。ＤＮＡの配列決定により
、これらのプラスミドのいくつかが、出発点。

であるアミノ酸Ｎｏ、　６９　（セリン）に対して正し
く配置されたＡＴＧ開始コドンを有することが確認され
た。これらのプラスミドの１つ、ｐ△ＲＩＰＡ０を試験
したところ、所望の組織プラスミノーゲン活性化因子を
産生じていたく第７図）。

０．４ｔｔｇの合成オリゴヌクレオチド５’ＴＴＣＴＧ
ＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧ３’（これはｔ−ＰＡｍＲＮＡ
のヌクレオチド２５６−２７１に相捕的である）を合成
しく文献５１）、これをブライマーとして使用し、標準
法（文献６５及び６６）により、１．５ｔｔｇのゲル画
分Ｎｏ、　８のｍＲＮ　Ａ　（前記）から、二重鎖ｃＤ
ＮＡを調製した。ｃＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲ
ルでサイズ分画した。３００ｂｐより大きいサイズ画分
（３６ｎｇ＞を電気溶出した。ターミナルデオキシシチ
ジルトランスフェラーゼ（文献６７）を用いて５ｎｇの
ｃＤＮＡにデオキシ（Ｃ）残基をつなぎ、同様にＰｓｔ
１部位（文献６７）にデオキシ（Ｇ）残基をつないだ５
０ｎｇのプラスミドｐＢＲ３２２（文献６８）とアニー
ルした。次にアニールした混合物をＥ、　ｃｏｌｉ　　
Ｋ１２株２９４に形質転換した。約１，５００個の形質
転換株が得られた。

ｂ）ヒトゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーショｃ
ＤＮＡのブライミング反応が、クローンｐＰＡ２５Ｅ１
０のＮ−末端から１３ｂｐとノｈイブリダイズした合成
断片を用いて行なわれたので、（１６ヌクレオチド体配
列を含む）この２９ｂｐ領域には、ｃＤＮＡクローンを
スクリーニングするための適当な制限断片は得られなか
った。従って、Ｎ−末端組織プラスミノーゲン活性化因
子をコードしている配列を含みブライマーで伸延したｃ
ＤＮＡクローンを同定するためには、ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子ゲノムのクローン（文献７６）を単
離することが必要であった。

このプロセスの第１段階では、唯一の相同組織プラスミ
ノーゲン活性化因子の遺伝子がヒトゲノムＤＮＡ中に存
在することを確認した。このためにサザンハイブリダイ
ゼーシコンを実施した。この方法に於いては、５μ２の
高分子■ヒトリンパ球ＤＮＡ（文献８０の如く調製）を
種々の制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、１．０
％アガロースゲル電気泳動（文献８１）にかけ、ニトロ
セルロースフィルターにプロットした（文献７７）。

ｐＰΔ２５ＥＩＯのｃＤＮＡインサート（２３２ｂｐＲ
ｓａ　［−Ｐｓｔ　ｒ断片）の５”末端から３１ｐ−標
識ＤＮＡプローブを調製しく文献７６）、前記ニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイズした（文献８２）
。３５Ｘ１０°力ウント／分のプローブを４０時間ハイ
ブリダイズし、次に洗浄した（文献８２参照）。２種の
エンドヌクレアーゼ消化パターンから唯一のハイブリダ
イズＤＮＡ断片：見ｇｌｌｌ（５，７Ｋｂｐ）及び尺些
Ｕ（４，２Ｋｂｐ）が得られた。２種のハイブリダイズ
ＤＮＡ断片がＨｉｎｃｎ（５，ＩＫｂｐ及び４．３Ｋｂ
ｐ）で観察された。両者を総合したデータによれば、ヒ
トゲノム中に唯一の組織プラスミノーゲン活性化因子が
存在すること、及び該遺伝子が少なくとも１個の介在遺
伝子を有することが判明した。

組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子を担うλフアー
ジ組換体を同定するために、組織プラスミノーゲン活性
化ｐＰＡ２５Ｅ］ｏのｃＤＮＡから調製された放射性プ
ローブとのヌクレオチド相同性を検出する方法を用いた
。１０万個の組織λファージをＩ　Ｏ，ＯＯ０ｐｆｕ／
　１５ｃｍプレートの密度てＤ　Ｐ　５０　Ｓ　ｕｐ　
　Ｆを宿主としてプレートアウトし、Ｂ　ｅｎｔｏｎ及
びＤ　ａｖｉｓの方法（文献７８）により、各プレート
毎にニトロセルロースフィルターレプリカを調製した。

標準法（文献８３）を使用し、ブラスミ　ドｐＰＡ２５
Ｅ］０の２３２ｂｐＲｓａ　Ｉ　−ＰｓｔＩ断片を用い
て、３２ｐ−標識ＤＮＡプローブを調製した。５０ｍＭ
のリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）、５ｘＳＳＣ（文献
７７）、０．０５ｍｇ／ｉｆ！の超音波処理サケ精子Ｄ
ＮＡ、５×デンハルト溶液（文献８４）及び５０％ホル
ムアミド中で、各ニトロセルロースフィルターを４２°
Ｃで２時間プレハイブリダイズし、次に、１０％デキス
トラン硫酸ナトリウム（文献８５）を含む同じ溶液中で
、５０×ＩＯＩ′力ウント／分の標識プローブとハイブ
リダイズした。４２°Ｃで１晩インキュベ−トシ、フィ
ルターを０．２ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中５０°Ｃ
１３０分間で４回洗浄し、２ＸＳＳＣで室温で１同洗浄
し、次にＤ　ｕｐｏｎｔ　　Ｃｒｏｎｅχ増感スクリー
ンでＸＲ−５Ｘ−線フィルムに１晩露光した。

全部で１９個のクローンがプローブとハイブリダイズし
た。６個の組換体から文献８６に記載の方法でファージ
ＤＮＡを調製した。コロニースクリニング用のＰｖｕｆ
ｆ断片をｇＦＪするために、これらのポジティブなハイ
ブリダイゼーションを示すπ１１換体の中からλクロー
ンＣを選択した。３０μ２のＤＮＡをＰｖｕＨを用いて
３７℃で１時間消化し、１．０％アガロースゲル電気泳
動にかけた。

組織プラスミノーゲン活性化因子をコードする配列を３
１丁することが既に判明した、４．２Ｋｂｐの断片を電
気溶出して精製した。後述の如きコロニーハイブリダイ
ゼー／ヨンを行なうために標準法（文献８３）を用いて
３２Ｐ−標識プローブを調製した。

コロニーヲプレートカらニトロセルロースフィルターに
移して増殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　ｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ　−Ｈｏｇｎｅｓｓ法（文献６９）でフィ
ルターに固定した。単離した組織プラスミノーゲン活性
化因子λヶノムのクローンから４．２ＫｂｐＰｖｕｌｌ
断片の仔牛胸線（文献８３）プライミングによって３２
ｐ−標識クローンを製造した。Ｊ、５００個の形質転換
株を含むフィルターを１１２×１０°ｃｐｍのＬｔｐ−
ゲノムＰｖｕｌｌ断片とハイブリダイズした。

Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、により記載された条件
（文献８２）を用いてハイブリダイゼーションを１６時
間継続した。フィルターをよく洗い次にＤ　ｕｐｏｎｔ
Ｌ　ｉｇｈｔｎｉｎｇ　−Ｐ　ｌｕｓ　ＦｆＪ＠スクリ
ーンと共にＫｏｄａｋＸＲ−５Ｘ〜線フィルムに１６乃
至４８時間露光した。１８個のコロニーが明らかにゲノ
ムプローブとハイブリダイズした。プラスミドＤＮＡを
これらのコロニーの各々から単離し、ニトロセルロース
フィルターに固定し、最初のプライミング反応に使用し
た３２ｐ−標識合成オリゴヌクレオチド（１６ヌクレオ
チド体）とハイブリダイズした。

１８個のクローンのうちの７個がキナーゼによって活性
化した１６ヌクレオチド体とハイブリダイズした。ｍ１
３ベクタ−ｍｐ７（文献７３）中での断片のサブクロー
ン化後に配列を解析すると、１種類のクローン（ｐＰＡ
１７）が組織プラスミノーゲン活性化因子の正しい５′
末端領域、シグナルリーダー配列及び８４ｂｐ５’非翻
訳領域を含むことが判明した。

ｐＰＡ！７のｃＤＮＡインサートの長さは２７１ｂｐで
ある。これはその合成にブライマーとして使用したヘキ
サデカヌクレオチド配列を含んでおり、これによりその
ＤＮＡ配列をｐＰＡ２５Ｅ１０の配列と合わせて整列す
ることが可能になった。これら２種のｃＤＮＡクローン
ｐＰＡ２５ＥＩｏ及びｐＰＡ１７から、ｔ−ＰＡのヌク
レオチド配列及びそれに対応するアミノ酸配列を決定し
た（第５図）。

２種のクローンｐＰＡ２５ＥＩｏ及びｐＰＡＩ７から、
第５図の完全ヌクレオチド配列及び全長組織プラスミノ
ーゲン活性化因子クローンの制限パターン（第４図）を
決定した。

完全な２５３０ｂｐｃＤＮΔ配列は単一のオープンリー
ディングフレームを含んでおり、これはヌクレオチド８
５〜８７のＡＴＧコドンで始まっている。このＡＴＧの
下流に５６２個のコドンかあり、その後ヌクレオチド１
７７１〜１７７３に′ＦＧＡ停止トリブレットがある。

このＡＴＧは、最初に遭遇するものであり、かつ、この
Ａ　Ｔ　Ｇの上流ヌクレオチド４〜６の位置には相内に
停止コドンがあるので、これが恐ら（翻訳開始部位とし
て働いている。アミノ酸Ｎｏ、　］と印したセリンは、
精製メラノーマ細胞ｔ−ＰＡのＮＯ３−末端の配列決定
に基づいている。このセリンの前に３５個のアミノ酸が
あり、このうちＮ　Ｈ、−末端の２０〜２３個は、Ｌ−
ＰＡの分泌に関与する神木性シグナルペプチドを構成し
ていると思われる。残りの１２〜１５個の親水性アミノ
酸は成熟ｔ−ＰＡの第一アミノ酸の直前にあり、血清ア
ルブミンに見られるものに類似する゛プロ゛配列を構成
している。

３”−非翻訳領域は７５９個のヌクレオチドから成り、
ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ（位置２／１９６〜２
５０　］）を含んである。このヘキサヌクレオチドは、
多くの真核生物ｍＲＮＡのポリアデニル化部位の上流に
ある。

天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は、３５
個のンステイン残基を有しており、従って１７個のジス
ルフィド結合により安定化される可能性を有する。第１
２図に示した概略図は、他のセリンプロテアーゼとの相
同性に基づいて構成される。４個の可能なＮ−グリコジ
ル化部位があり、このうち３個はクリングル領域のａＳ
ｎｚ？＋ａｓｎｌ。４．　ａｓｎ、＋ｓに存在しており
、他の可能な部位はＬ鎖領域のａｓｎ４＋Ｉｌに存在し
ている。構造上のオリゴ糖リガンドの違いが種々の分子
形態（分子Ｍ６５．０００及び６３，０００の種）の原
因である。

アミノ酸分析用のｔ−ＰＡサンプルは、０．１％ＮＨ，
，ＨＣＯ，に対して充分に透析し減圧乾燥して調製した
。残基を５ＮＨＣ１に懸濁し、バイアルを真空密封した
。加水分解は１１０℃で２４時間実施した。次いで、得
られた加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ　　ＳｙＳｔｅｍ　
６３００アミノ酸分析器で解析した。

分子Ｉは、ゲル分析により以下の如く決定した。

Ｌａｅｍｍｌｉの方法（文献６３）を使用してＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ゲルは、１
０％アクリルアミド及び０．２７％メチレンビスアクリ
ルアミドから成っていた。サンプルの還元が必要なとき
には、メルカプトエタノールの代わりにジチオスレイト
ールを用いて還元し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ低分子量ＳＤＳ標
準混合物を標準として使用した。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、
　　Ａ　ｎａｌ、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　１１７．
３０７（１９８１）の方法に従って銀染色を行なった。

種々の分子量を有するｔ−ＰＡを、溶出液としてアルギ
ニンを用いてリジン−セファロース上で分離した。単離
したタンパクは、検出可能な■のＳＤＳゲル電気泳動に
よる交差汚染（ｃｒｏｓｓｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ
）を含まなかった。各タイプのタンパクを、先ず還元し
、カルボキシメチル化し、前記の如くトリプシン消化し
た。この消化生成物を、Ｃｏｎ−Ａ−アガロース（Ｓｉ
ｇｍａ社製）にかけ、０２Ｍのα−メチルマンノシドで
溶出した。Ｃ０ｎ−Ａ樹脂に結合し、α−メチルマンノ
シドでＦＪ出するペプチドを、前記ＨＰ　Ｌ　Ｃを用い
て解析した。

高分子量のｔ−ＰＡは３種の主要なペプチドを含んでお
り、低分子量のｔ−ＰＡは２種のＣｏｎ−Ａに結合する
ペプチドを含んでいた。これらのペプチドをタンパク質
配列分析により同定した。その結果、１）両者のタイプ
のｔ−ＰＡにおいて残基１１７及び／Ｉ４８がグリフシ
ル化されており、対応するトリブチツブペプチドがＣｏ
ｎ−Ａと結合していること、２）高分子量のタイプのｔ
−ＰＡでは残基１８４がグリフシル化され、Ｃｏｎ−Ａ
に結合しているが、低分子量のタイプのｔ−ＰＡは、グ
リコジル化残基１８４を含有しているＣｏｎ−Ａに結合
するペプチドを含んでいないこと、及び、３）残基２１
８のアスパラギンがグリコジル化されていないようであ
ることが判明した。

接発現 部分クローンｐＰＡ１７とｐＰＡ２５Ｅ］ｏとの双方に
共通のＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用いるこ
とにより、完全コード配列の再構築が可能であった。ア
ミノ酸５−２３にＺ−１応する５５ｂｐ　５ａｕ３Ａ　
Ｉ−Ｉ（ｈａＩ制限断片をプラスミドｐＰＡ１７から中
離した。５ａｕ３Ａｌ制限部位は推定成熟コード配列の
コドン４に位置しており、ングナルペブチドをコードす
る領域を除去すべく使用した。同様に（アミノ酸２４−
１１０をコードする）２６３ｂｐＨｈａｌ−Ｎａｒｌ断
片をプラスミドｐＰＡ２５Ｅ１０から単離した。アミノ
酸１４のコドンを再生しＡＴＧ翻訳開始コドンを組込ん
でＥｃｏＲＩ粘着末端を形成する２種の合成チオキンオ
リゴヌクレオチドを設計した。次に、これら３種の断片
を互いに結合し、アミノ酸１−１１０をコードする３３
８ｂｐ断片を形成した。次に該断片及びｐＰＡ２５Ｅ１
０から得た＋６４５１］Ｉ）ＮａｒＩ−ＢｇｌＩＩ断片
を、プラスミドｐＬｅｌＦへ卿１０３（文献５３）の見
曽Ｒ１部位及び馬〔■部位の間に結合し、発現プラスミ
ドｐｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒｐｌ２を調製した。卿プロモー
ター、オペレーター及びｔｒｐリーダーペプチドのシャ
イン−ダルガルノ配列を含むかリーダーペプチドＡＴＧ
開始コドン（文山Ｊ、５２）を含まない汎、　　ｃｏｌ
ｉ　　□ｔｒｐオペロンノ３００　ｂｐ断片の制御下で
クローン化ｔ−ＰＡ遺伝子を転写した。

プラスミドｐｔ−ＰＡＬｒｐ１２を含むＥ、　ｃｏｌｉ
Ｋ１２株　Ｗ３１］０（ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）を
増殖し、線維素溶解能アッセイのための抽出物を：ＡＩ
！２した。組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を測
定する１つの方法としてフィブリンプレートアッセイ（
文献８７）がある。この方法では、プラスミノーゲン及
び線維素を含むアガロースプレート中でのプラスミンに
よる線維素の消化の程度を測定することによってプラス
ミン生成量を測定する。プラスミンはフィブリンプラス
ミン中に透明な溶解ゾーンを形成し、このゾーンの面積
をサンプル中の組織プラスミノーゲン活性化因子の徂と
相関させ得る。フィブリンプレートアッセイを使用して
、ｐｔ−ｐΔ■１２クローンから得た抽出物の組織ブラ
スミ／−ゲン活性化因子の活性を試験すると、透明溶解
ゾーンが明らかである。

この線維素溶解能は抗ｔ−ＰＡＩｇＧによって阻害され
るが、免疫前１ｇＧ又は抗つロキナーセＩｇＧによって
は阻害されない。対照として白血球インターフェ０ンブ
ラスミドｐＬｅ　Ｉ　ＦＡ　ｔｒｐｌ　０３を含む細胞
から得られた抽出物について試験したところ、活性は全
く検出されなかった。精製ｔＰＡについて得られた標準
曲線によれば、１０６個の細胞光たり約２０ユニツトの
抽出活性が得られると推定し得る（精製ｔ−ＰＡでは、
９０．００Ｑ　Ｐ　ｌｏｕｇｈ）ユニット−１ｍｇ）（
第１０図）。

Ｅ、１ｊ、配列解析 配列解析はＥ　ｄｍａｎ分解（文献８３ｂ）にノ、（つ
いて行なった。サンプルをＢ　ｅｃｋｍａｎ　８９０　
Ｂ又は８９０Ｃスピンカップ／−ケンサ−（ｓｐｉｎｎ
ｉｎｇ　　ｃｕｐｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）のカップに導入
した。カップ内の押体として１．ｆリブレンＴＭ（ポリ
ーＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’テトラ、メチル−Ｎ−トリメチレ
ンへキサメチレンジアンモニウム　ジアセテート）（文
献６３ｃ）を使用した。ンーケンサーを寒冷トラップ及
びいくつかのプログラム変化によって変更し、バックグ
ラウンドピークを低減させた。試薬としては、Ｂｅｃｋ
ｍａｎ　ｓ　シーケンスグレードＱ、ＩＭ　Ｑｕａｄｒ
ｏｌ緩衝液、フェニルイソチオソアネート及びヘプタフ
ルオロ醋酸を用いた。

収集したＥ　ｄｍａｎサイクルをマニュアルに従って２
−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体に転換した。Ｉ−
り四ロブタンを窒素下で乾燥した。次いで、１．ＯＮ（
］（ＣＩ水溶液を２−アニリノ−５−チアゾリノンに添
加し、７０℃で１０分間加熱して３フェニル−２−チオ
ヒダントイン（ＰＴＨ誘導体）に転換した。次に、ＰＴ
Ｈ−アミノ酸残基を５０％アセトニトリル及び水に溶解
し、逆′相高圧液体りロマトグラフに注入した。次に、
転換バイアル内に導入されシーケンサ−からのサイクル
と同様にして処理されたＰＴＨ−アミノ酸の標準混合物
の保持時間との比較によって各Ｐ　Ｔ　Ｈ−アミノ酸を
同定した。

Ｅ、］、に、相繊織ラスミノーゲン活性化因子の発現検
出アッセイ ａ、理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の感度のよいアッセイ
は、組織プラスミノ−ケン活性化因子が触媒するプラス
ミノ−ケンからプラスミンへの転換をモニターして行な
うことができる。プラスミンは色素原基質アッセイが可
能な酵素である。これらのアッセイは、発色団のトリペ
プチドのタンパク分解的開裂に基づく。開裂速度は、被
検プロテアーゼの特異性及び濃度の双方に直接関連する
。

組織プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液をプラスミ
ノーゲン溶液とインキュベートした後に形成されるプラ
スミンの里の測定がアッセイのベースとなる。活性化因
子の量が多い程、形成されるプラスミンの量も多い。（
Ｋａｂｉ　　Ｇｒｏｕｐ、　　Ｉ　ｎｃ、。

Ｇ　ｒｅｅｎｗｉｃｈ、　ＣＴから購入した）色素原基
質５２２５１の開裂をモニターすることによりプラスミ
ンを測定する。

ｂ、平置 ５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４中の）０．７１１ｙ
／ｍρのプラスミノーゲンＯ，ｌ　ＯＪＩρと混合し容
量を０１５＋ｖｉ！に調整する。混合物を３７℃で１０
分ＩＦｆｌインキ、ヘ−１−Ｌ、０．３５ｘｆ！の５２
２５１（上記緩衝液中の１．ｏｍＭ溶ｅ）を添加し、３
７°Ｃで反応を３０分間継続する。氷酢酸（２５μのを
添加して反応を停止させる。サンプルを遠心し４０５ｎ
ｍでの吸収を測定する。標準ウロキナーゼ溶液との比較
により活性ｆｆｉが定量できる。溶液にフィブリノーゲ
ン（０，２ｚｙ）を添加し、これにより全長組織プラス
ミノーゲン活性化因子を検出すべくアッセイ条件を変更
した。フィブリノーゲンは検出される組織プラスミノー
ゲン活性化因子の活性を刺激し、従って活性レベルをや
や上胃させる。活性をＰｌＯｕｇｈユニットで記録した
。　９０，０００Ｐ　Ｉｏｕｇｈユニットは、精製組織
プラスミノーゲン活性化因子１１１ｇか示す活性に等し
い。

２　プラスミン形成の間接アッセイ ａ、　ｆ’ｊｊ羊 組織プラスミノーゲン活性化因子の活性の感度の良いア
ッセイが開発された（文献８７）。このアッセイは、線
維素及びプラスミノーゲンを含む寒天プレート中でのプ
ラスミンによる線維素消化の程度を測定することによっ
てプラスミン形成を決定することに基づく。プラスミン
はフィブリンプレート中に透明な溶解ゾーンを形成する
。この溶解ゾーンの面積をサンプル中の組織プラスミノ
ーゲン活性化因子のｍと相関させ得る。

ｂ、土願 Ｇｒａｎｅｌｌｉ　−Ｐ　１ｐｅｒｎｏ及びＲｅｉｃｈ
の方？ｉ：（文献８７）に準じて、プレートを３７°Ｃ
で３５時間インキュベートして溶解ゾーンを測定した。

標準ウロキナーゼ溶液との比較によって定■をおこなっ
た。

Ｅ、１．Ｌ、組織プラスミ／−ケン活性化因子の活性の
検出 ■、細菌増殖及びサンプル調製 ２０μ９／Ｍ（ｌのアンピシリンを含む５酎のＬＢ増殖
培地を入れた試験管にプラスミド ｐ△ＲＩＰＡ’を含むＥ、　ｃｏｌｉフロニーを接種し
た。細胞を３７°Ｃで１晩増殖させた。この培養物のサ
ンプルを、２０μｇ／βｇのアンピシリンを含むａｏｏ
ｚρのＭ９培地にＩ：１００で希釈した。

細胞を３７°Ｃの振盪フラスコ中で４時間増殖したとこ
ろ、５５０ｎｍの吸光度が０．４１９になった。

トリプトファンに類似のインドールアクリル酸を濃度３
ＣＪｔｔｇ／ｒｎＱまで添加した。細胞を９０分間イン
キュベートシたところ、５５０ｎｍの吸光度が０．６２
８になった。遠心により細胞を回収し、０．０１ＭのＩ
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む０．８ＪＩρのＯ，０１Ｍトリス
（ｐｌ−Ｔ　８　、０　）に再懸濁させた。得られた懸
濁液を室温で１８時間急激に撹拌した。サンプルを遠心
し、上清を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子の活
性をアッセイした。

１）ｔ−１）Ａ駐１２の発現に関しては、Ｅ、１．Ａ第
１０図の説明に於ける詳細な記載を参照されたい。

２、尚快倹坦 表１および表２は、アッセイに用いたＥ、　ｃｏｌ＋抽
出物の各々が示したプラスミノーゲンの活性化の結果を
示す。活性はプラスミノ−ケンの７′ｊ在に依存して発
生する（表１参照）。この活性は、ウサギの免疫前血清
の影響を受けないが、精製メラノーマ細胞から誘導され
た組織プラスミノ−ケン活性化因子（文献８８）に対す
る抗血清により顕著に阻害される（表１及び表２祭照）
。　これは、Ｅｃｏｌｉ抽出物がプラスミノーゲンを活
性化する活性を生成し、この活性か組織プラスミノ−ケ
ン活性化因子に対する抗体によって阻害されることを示
す。

第７図は線維素溶解能に関するフィブリンブレートアッ
セイの結果を示す。中央の縦列の下から上に向かって濃
度０．２４．０．１４．０１０１０．０５及び０．０２
　Ｐ　ｆｏｕｇｈｔニットで標準量のウロキナーゼを添
加した。右側の縦列は、各ウェルに同量の酵素を添加し
た天然組織プラスミノーゲン活性化因子のサンプルであ
り、同縦列の下から上に向かって組織プラスミノーゲン
活性化因子、組織プラスミノ−ケン活性化因子＋免疫前
血清、組織プラスミノーゲン活性化因子＋組織プラスミ
ノ−ケン活性化因子抗体か各ウェルに収容されている。

左側の縦列の各ウェルは８μρの組換組織プラスミノー
ゲン活性化因子Ｅ、　ｃｏｌｉ抽出物を収容しており、
下から一トヘ向かって、第１ウエルは抽出物のみ、第２
ウエルは免疫前血清が添加された抽出物及び第３ウエル
は組織プラスミ／−ケン活性化因子抗体が添加された抽
出物をそれぞれ含む。免疫前血清が天然及び組換組織プ
ラスミノーゲン活性化因子に影響を与えないこと、並び
に組織プラスミノーゲン活性化因子抗体が天然抽出物及
びＥ、　ｃｏｌｉ抽出物の双方の活性を阻害することが
明らかである。ウロキナーゼ標準に基づいて、抽出物は
２．５　Ｐ　ｌｏｕｇｈユニット／ｘρよりやや少ない
活性を含有している。この値は表１の１．３Ｐ　ｌｏｕ
ｇｈユニット／ＩＲＱより有利である。

以下の表１及び表２は前記のＥ、］、　　Ｋ、１．　ｂ
に記載の如〈実施されたアッセイの結果を示す。

表２　　ｐＬ−ＰΔｔｒｐ１２のＥ、　ｃｏｌｉ培養抽
出物によるプラスミノーゲン活性化 第１０図は、組織プラスミノーゲン活性化因子発現プラ
スミドを含むＥ、　ｃｏｌｉの１ＯＬ発酵培養物からの
抽出物を用いて実施したフィブリンブレートアッセイの
結果を示す。組織プラスミノーゲン活性化因子を含む抽
出物の線維素溶解能が第１０図のウェルａで示されるこ
の線維素溶解能は抗［−ＰΔ　ＩｇＧ（ウェルＣ）によ
り阻害されるが、免疫前ＩｇＧ（ウェルｂ）又は抗ウロ
キナーゼＩｇＧ（ウェルｄ）では阻害されない。また、
対照としての白血球インターフェロンプラスミドｐＬｅ
　Ｉ　Ｆ　Ａｔｒｐ１０３（ウェルｈ）を含む細胞で調
製された抽出物では活性が全く検出されない。つ５．ル
ｅ、つｚＪしｒ及びウェルｇはそれぞれ０．２．０．１
及び０．０２ユニットの精製されたメラノーマｔ−ＰＡ
を含む。

Ｅ、２．Ａ、　ベクターの構築 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）をコ
ードする配列をＭＴＸに対する結合親和力の低い突然変
異ＤＨＦＲを含む発現プラスミドに以下の手順で挿入す
る（第１１図）（ヨーロッパ特許出願公開第１１７，０
６０号および対応する特開昭５９−１９２０８９号公報
参照）。

オーバーラツプするｔ−ＰＡプラスミド、ｐＰＡ２５Ｅ
ＩＯ１ｐＰＡＩ７及びｐｉ−ＰＡｔｒｐｌ　２（前記）
から３種の断片を以下の如く調製した。プラスミドｐＰ
Ａ１７をＤｄｅｌでｌ消化し、Ｋｌｅｎｏｗ　　ＤＮＡ
　　ポリメラーゼＩを用いて充填し、Ｐｓｔｌで再度切
断した。その結果生成された５゛末端ｔ−ｐＡ配列を含
む約２００ｂｐの断片を単離した。第２のｔ−ＰＡ断片
を得るために、ｐｉ−ＰＡｔｒｐｌ２をＰｓＬＩ及びＮ
ａｒＪで消化し、約３１０ｂｐの断片を単離した。第３
のｔ−ＰＡ断片を得るために、ｐＰＡ２５Ｅ］０をＮａ
ｒｌ及びＢｇｌＩＩで消化し、約１６／ｌ５ｂｐの断片
を単離した。最後の断片は１−ＰＡをコードする領域の
殆どを含んでおり更にいくらかの３′非翻訳配列を含ん
でいる。

ＨＩ３　Ｖ表面抗原を発現するプラスミドｐＥ　３４２
（ｐｉ−ＴＢｓ３４８−Ｅとも指称される）は、１９８
３年３月９日付で公開されたＬ　ｅｖｉｎｓｏｎ　　ｅ
ｔ　　ａｌのヨーロッパ特許出師公開第００７３６５６
号および対応する特開昭５８−５６６８５号公報に記載
されている。該出願を引用して本明細書中に包含する。

要約すれば、サルウィルス５Ｖ４Ｑのオ！Ｊ　’；　ン
ヲ’１ｉｌｌ　ｔ　ルタめに、５Ｖ４Ｑ　　ＤＮＡをＨ
ｉｎｄｌｌで消化してコンバーター（Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｇ
　Ａ　Ａ　ＴＴＣ）を添加してＨｉｎｄｌｌｌ末端に変
換した。このＤＮＡをＰｖｕＩＩで切断しＲ１リンカ−
を添加した。

ＥｃｏＲＩで消化後、オリジンを含む３４．８　ｂｐ断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電気溶出で単
離し、ｐｉ３　Ｒ３２２巾でクローン化した。

トＩＢＶ（Ａｎｉｍａｌ　　　Ｖｉｒｕｓ　　　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、　　（ｃｈ、　５）Ａｃａｄ、　　Ｐｒｅ
ｓｓ、　　Ｎ、　　Ｙ、　（１９８０乃のＥｃｏＲＩ及
びＢｇｌＴＩによる消化で得られた１９８６ｂｐ断片（
これはＨＢｓＡｇをコードする遺伝子を含んでいる）を
、ＥｃｏＲ１部位及び５ａｉｌ（１部位でプラスミ　ド
ｐＭＬ（Ｌｕｓｋｙ　　　ｅｔ　　　ａｌ、、　　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　２９　３７９（１９８１））にクローン
化して発現プラスミドｐＨＢｓ３４８−Ｅを構築した。

（ｐＭＬは、サル細胞中でのプラスミド複製を阻害する
配列が除去された欠失を有するｐＢＲ３２２の誘導体で
ある）。

得られたプラスミド（ｐＲＩ　−Ｂｇｌ）を次にＦ、ｃ
ｏＲ■で直線化し、５Ｖ４Ｑのオリジン領域を示ス３４
８ｂｐ断片をｐＲｆ−旦Ｕの旦ｃａＲＴ部位に導入した
。オリジン断片はいずれの配向でも挿入され得る。この
断片は複製のオリジン以外に初期及び後期のＳＶ４０の
プロモーターをコードしているので、オリジンの配向次
第でどちらかのプロモーターが作用し該プロモーターの
制御下でＨＢ　Ｖ遺伝子が発現し得た。（ｐＨＢＳ３／
Ｉ８　　Ｅは初期プロモーターの制御下で発現したＨＢ
ｓを示す）。

ｐＥ３／１２を修飾するために、ｐＥ３４２をＥｃｏＲ
ｌで部分消化し、Ｋ　ｌｅｎｏｗ　　Ｄ　ＮΔポリメラ
ーゼＩを用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再結合
し、これにより、ｐＥ３４２中の５Ｖ４Ｑオリジンに先
行する旦ｃｏＲ１部位を除去する。得られたプラスミド
即ちｐＥ３４２△Ｒ１をＥｃｏＲｒで消化し、ＫＩ８１
１０Ｗ　　ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて充填し、Ｂａ
ｍＨＩで再度切断する。アクリルアミドゲル電気泳動後
、約３５００ｂｐ断片を電気溶出し、フェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱させる。

前記の如く調製されたｐＥ３４２　３５００ｂｐベクタ
ー及び約２１６０ｂｐの前記ｔ−ＰＡ断片を標準法によ
り互いに結合した。ｔ−ＰＡをコードする３種の断片を
適正方向で含むプラスミドを単離上特性決定し、ｐＥ３
４２−ｔ−ＰＡと命名した。このプラスミドを５ａｃＴ
Ｉで消化し細菌性アルカリ性ホスファターゼ（ＢＲＬ社
製）で処理した。

Ｄ　ＨＦ　Ｒ配列を（該配列の発現用制御配列と共に）
与えるために、ｐＥ　ＨＥ　Ｒの５ａｃｌｌ消化によっ
て約１７００ｂｐの断片を生成した。（ｐＨＥ　Ｒは前
記米国特許出願第４５９，１５＋号明細書および対応す
る特許出願公開第１　］　７７０６０号びに特開昭５９
−１９２０８９号公報に記載の突然変異ＤＨＦＲを発現
するプラスミドである）。即ち、ｐＥＨＥＲは第１３図
に示す如く調Φｌされたプラスミドであり、ｐＥ３４２
は１９８３年３月９日付で公開されたＬｅｖｉｎｓｏｎ
等のヨーロッパ特許出願公開第００７３６５６号および
対応する特開昭５８５６６８５号公報に記載されており
、ｐＨＢＶＴ−ＩＡ及びｐＳＶＲはＬｉｕ等のＤＮＡ、
］：２１３（１９８２）に記載されており、ｐＦＲ４０
０は以下の如く調製される。

ＳＶ４０ｍ製オリジンを含む５４０ｂｐのＨｉｎｄｌｌ
−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片（Ｌｉｕ等、ＤＮＡ　　］：　２
１３（１９８２乃をＥｃｏＲ１部位とＨｉｎｄＩ１１部
位との間でプラスミドｐＭ　Ｌ　（Ｍ、　　Ｌ　ｕｓｋ
ｙ　　及びＭ、　　ＢｏｔｃｈａｎＮａｔｕｒｅ　　２
９３°７９（１９８１））に結合した。

ＨｉｎｄＩＩＩで消化する前に４ｄＮＴＰの存在下でＫ
　Ｉｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩを添加して該
プラスミドのＥｃｏＲ１部位とＳＶ４０のＩ（ｉｎｄｒ
１部位とを平滑末端化した。得られたプラスミドｐＥＳ
ＶをＩｌｉｎｄｍ及びＢａｍＨＩにより消化し、２９０
０ｂｐのベクター断片を単離した。該断片に対し、Ｅｃ
ｏＲ１部位にポリリンカー（多数制限部位を含むＤＮＡ
断片）を含むように修飾されたＨ　Ｂ　Ｖからの２０２
５ｂｐの且１ｎｌＴ−旦ｇｌＵ断片を結合した。ＨＢＶ
断片は表面抗原遺伝子を含んでおり、前出のＬｉｕ等、
ＤＮＡ　　］：２１３，１９８２に記載の如くクローン
化したＩ（ＢＶ　　ＤＮＡのＥｃｏＲｌ−ＢｇｌｌＴ消
化によって得られる。二重鎖リンカＤＮＡ断片（５“ｄ
ＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣ３’・
−）をＨｉｎｄｕ及びＥｃ。

Ｒ１によって消化し、ＨＢ　Ｖ断片に付加し、Ｅｃ。

Ｒ１−旦耐■断片を几ハｄＩＩＩ−旦魁■断片に転換し
た。リンカ−とｆ（Ｂ　Ｖ断片とベクターとから成る三
部分を同時に結合することも可能であるが、先ずＩＩ　
１ｎｄｌ　−Ｅ　ｃｏＲＩリンカ−をクローン化したＨ
　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａに付加し、次に制限酵素を用い
るプラスミドの同時消化によってＨｉｎｄｌｌｌ−旦料
■断片を切除する方法がより有利であるためこの方法を
使用した。得られたプラスミドｐｃ　Ｙ　Ｅ　５ＶＨＢ
Ｖは、ｐＢＲ３２２由来のｐＭＬからの細菌性複製オリ
ジンと同じ＜ｐＭＬからのアンビンリン耐性マーカーと
、消化ＨＢ　Ｖ断片の転写を初期プロモータが指示する
ように配向された５Ｖ４Ｑ断片とＨＢ　Ｖからの表面抗
原遺伝子とを含む。１−ＴＢＶ断片はまた哺乳類細胞の
細胞質に通常形成される如きポリアデニル化ｍＲＮＡを
産生ずるためのポリアデニル化ングナルを与える。ＨＢ
ｓＡｇフード領域は、ＥｃｏＲｒによる消化と前記の如
きＫｌｅｎｏｗ　　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼによる末端
充填とＢａｍＨＩによる部分消化とによって除去される
。ＤＨＦＲをコードするｃＤＮＡからのＦｎｕ４ＨＩ乱
１■断片が該領域に押入される。得られたプラスミドは
第１４図に示されている。ｐＦＤ］１は野性型ＤＨＦＲ
ｃＤＮＡプラスミドｐＤＨＦＲ１１（Ｎｕｎｂｅｒｇ等
、Ｃｅ１ｌ　　１９：３５５（１９８０））の旦ｎｕ４
　ＨＩ　−Ｂｇｌ　Ｈ断片を用いて構築されたものであ
り、ｐＦＲ４００はｐＦＲ４００，１２からの同様の断
片を用いて構築されたものである。

ｐＲ４００，１２は、メトトレキセート耐性Ｄ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　ＲをコードするＤＮＡ配列を含む組換プラスミド
であり、突然変異３Ｔ　　６Ｒ４００細胞（Ｄ、Ａ、）
ｌａｂｅｒ及びＲ，Ｔ、　　Ｓｃｈｉｍｋｅ、　　Ｃｅ
１ｌ。

２６：３５５（１９８１））からｍＲＮＡを単離し、単
１ｍｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、Ｐｓ
ｔｒ開裂ｐＢ　Ｒ３２２にｃＤＮＡを結合し、Ｅ。

薊株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、ネズ
ミのＤＨＦＲｃＤＮＡ（Ｊ、Ｈ，Ｎｕｎｂｅｒｇ等、前
出）からのｃＤＮＡインサートのＰｓｔｒ　−Ｂｇｌｌ
ｌ消化物を用いて形質転換体をプローブし、適正な突然
変異Ｄ　ＨＦ　Ｒコード配列を有するプラスミドを含む
コロニーを選択することによって調製される。この断片
をｐＥ３４２−ｔ−ＰＡプラスミドに結合し、ｐＥＴＰ
ＡＥＲ４００を作製した。

該プラスミドはｐＥＩ−ＩＥＲに類似しているがＨＢｓ
八ｇへコードする領域がｔ−ＰＡからのｃＤＮＡ配列で
置換されている。

Ｅ、２．Ｂ　　ｔ−ＰＡ配列の発現及び増幅Ｇ　ｒａｂ
ａｍ及びＶａｎｄｅｒ　　Ｅｂの方法（前記）でｐＥＴ
ＰＡＥＲ４００（ｐＥＴＰＥＲ）をｄｈｆｒＣｌｌ０−
ＤＵＸ　　Ｂｌｌ細胞及びＤＨＰＲ”　　ＣＨＯ−Ｋ　
１（ＡＴＣＣＣＣｌ２１）細胞にトランスフェクトした
。グリシン、ヒボキサンチン及びチミジンを含まない培
地で増殖し形質転換されたｄｈｒｒ−細胞を選択した。

１１００ｎ以上のＭ　Ｔ　Ｘ　Ｌｌｌで増殖して形質転
換されたＤ　ＨＦ　Ｒ＋細胞を選択した。適当な選択培
地上に発生したコロニーを、クローン化したリングで単
離し同じ培地中で数世代まで増殖した。

増殖のために、コロニーから細胞を分割して５Ｘ１０’
、１０５．２．５ＸＩＯ５，５ＸＩＯ５及び１１０６ｎ
のＭＴＸを含む培地に入れ、この操作を数回繰返した。

極めて低い細胞密度（１０”−１０’細胞／プレート）
で細胞をｌ０ｃｍの皿にプレートし、得られたコロニー
を単離した。

Ｅ、２．　Ｃアッセイ方法 トランスフェクトされ増幅されたコロニー中のｔ−Ｐへ
の発現は、Ｅ、　１．　　Ｋ、　１．　ｂで説明した方
法（前記）と同様の方法で簡便に検定され得る。

Ｄ　ＨＦ　Ｒ及びｔ−ＰＡ配列の同時増幅は、増幅され
たコロニーのコンフルエントな単層から下記の如（１）
ＮＡを単離してアッセイする。１５０ｍｍプレートのコ
ンフルエントな単層を５０Ｊ！ρの無菌１）　Ｂ　Ｓて
洗浄し、５１ρの０１％ＳＤＳ、０　４ＭＣＦ１ＣＬ　
　及び０．］Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を添加して溶解
する。５乃至１０分後、混合物を取出し、フェノール抽
出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱さぜる。Ｏ
、］　ｏ／　ｘＱ、までＲＮａｓｅを添加したｌｏｍＭ
）リス−Ｊ（Ｃ１（ｐＨ８）及び］ｍＭＩＥＤＴＡ（Ｔ
”Ｅ）からなる液１１１Ｑ（１５０ｍｍプレート当たり
）にＤＮＡを再）靜濁させ、溶液を３７°Ｃで３０分間
インキュベートする。次にＳＤＳを０゜１％まで添加し
、プロナーゼ（ソグマ社製）を０゜５ｕ／ｘρまで添加
する。３７°Ｃで３乃至１６時間イン＋ユベートした後
、溶液を再度フェノール抽出、クロロポルム抽出し、エ
タノール沈澱させる。

ＤＮＡペレットを０．５ｘρの水に再１１させ、制限酵
素で消化する。約５乃至１０μこの消化ＤＮＡをアガロ
ースゲル［１％のアガロースを含むトＪスー酢酸緩衝液
（４０ｍＭ）−リス、ＩｍＭＥＤＴＡ、酢酸でｐＨ８，
２に調整）］の電気泳動にかける（Ｃｒｏｕｓｅ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、
　　２５７：７８８７（１９８２））。ブロモフェノー
ルブルー染料がゲルの厚み２／３まで移行した後、ゲル
を取出し臭化エチジウムで染色する。紫外線でＤＮＡを
見えるようにし、サザン法（Ｊ、　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏ
ｌ、、９８：　５０３（１９７５））によりＤＮＡをゲ
ルカラニトロセルロースフィルターに移？−７サｔ！　
ル。

次にフィルターを、（前記の如く調製されハイブリダイ
ズされた）ｐＥＨＥＲの］　７００ｂｐＳａｃｌｌ断片
から製造されたニック翻訳プローブとハイブリダイズさ
せる。

Ｅ、３　　野性型ＤＨＦＲタンパクを使用するｔ−ｐＡ
の産生 Ｅ、３．Ａ　　ベクターの構築 ｐＥＴＰＥＲの構築に使用した方法と同様の方法で、野
性型ＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド
ｐＥＴＰＦＲを構築した。実施例Ｅ、２．　Ａに記載の
如く構築するが、Ｄ　Ｉ−（Ｆ　Ｒタンパク遺伝子配列
の起源としてプラスミドｐＥ＋−＋ＥＲの代わりに、プ
ラスミドｐＥ３４２．ＨＢＶＥ４００．Ｄ２２（米国特
許出願番号４５９，１５２号（１９８３年１月１９日出
願）および対応するヨーロッパ特許出願第１１７，０５
８号および対応する特開昭５９−１７３０９６号公報参
照）を使用した。野性型ＤＨＦＲと突然変異株ＤＨＦＲ
との間の１個の塩基対の相違以外はプラスミドｐＥ３／
１２．ＩＩＢＶ、Ｅ４００．Ｄ２２１：１ｐＥＨＥＲと
同様である。該プラスミドはｐＦＤ］ＩをｐＦＲ４００
に置きかえてｐＥＨＥＲと同様にして構築される（第１
３図及び第１４図参照）。又は、第１５図のｐＥ３１２
．Ｄ２２はｐＤＨＦＲ−１］（Ｎ　ｕｎｂｅｒｇ、前出
）から由来しており、（ｐＥ３４２の初期プロモータの
上流のＥｃｏＲＩ部位の欠失により得られた）ｐＥ３４
２△Ｒ１は第１６図に記載されている。従って、得られ
るプラスミドｐＥＴＰ　Ｆ　Ｒは全ての点でｐＥＴＰＥ
Ｒと類似しているが、突然変異ＤＨＦＲをコードするＤ
ＮＡ配列の代わりに、野性型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒをフー
ドするＤＮＡ配列がａまれている。

Ｅ、３．　　Ｂ　　ｔ−ＰＡ配列の発現Ｇ　ｒａｈａｍ
　　およびＶａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｂのリン酸カルシウ
ム沈澱法によりｐＥＴＰＦＲを使用してＤ　ＨＰＲが欠
如したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（前
記））をトランスフェクトした。選択用培地（ＨＧＴ）
で発生した２１個のコロニーをアッセイするために、Ｇ
ｒａｎｅｌｌｉ　−Ｐ　１ｐｅｒｎｏ、　ａｔ　　ａｌ
、、　Ｊ　。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、Ｉ　４８：２２３（１９７８）に記
載の如く、線維素及びプラスミノーゲンを含む寒天プレ
ート中の線維素の消化によって測定されるプラスミン形
成を検出した。

次にＥ、　１．　　Ｋ、　１．　ｂ　　に記載の方法に
より、最もポジティブなりローンのうち４個の細胞力た
りのプラスミン形成を定量的に検定した。

前記の如き定ｍ的測定により、４個の被検クローンが、
ユニット／細胞７日で示すと、等しいか又は同等の培地
内ｔ−ｐΔ分泌を示すことが知見された。２個のクロー
ンからの接種物を−ＨＧ　Ｔ培地を含む別のプレートに
移してサブクローンを調製した。得られたサブクローン
のうちの２種、１８Ｂ及び１を使用してさらに解析を進
めた。

Ｅ、３．　Ｃ増幅及びｔ−ＰＡ産生レベル増幅を促進す
べく前記サブクローンを５０ＢＭのＭＴＸ中で１００ｍ
ｍプレート当たり２Ｘ１０’の細胞を含むようにプレー
トした。生存した細胞を前記の如くアッセイすると、全
ての場合に、未増幅の組織プラスミノーゲン活性化因子
の活性の約１０倍の活性が検出された。これらのクロー
ンの２個を選択して１−１５及び１８Ｂ−９と命名し更
に研究を進めた。

サブクローンｌ−１５を更に増幅するために、５００１
１ＭのＭＴＸを含むＩ００＋ｎ＋ｎプレートに２×１０
６個の細胞を接種した。このようにして増幅された細胞
のアッセイによれば、ｔ−ＰＡ産生量は更に増加してい
た（約３倍）。

Ｅ、１．にの方法で定量的に検定するとレベルは７ＸＩ
Ｏ−’ユニット／細胞／日であった。次に、これらの増
幅細胞の一部分を１０，０００ｎＭのＭＴＸの存在下に
移して維持した。サブクローン１−１５及び１８Ｂ−９
を表３に示した条件で約１乃至２力月組、持した後に再
度検査した。

表３ 表３　注水 培地中のｔ−ＰＡを以下の如くラジオイムノア・。

セイで定量的にアッセイした。精製ｔ−ＰＡ及びメラノ
ーマ細胞から誘導された精製ヨード化トレーサーｔ−Ｐ
Ａを、燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，３）、０．５％牛
血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０
２％ＮａＮ、を含む緩衝液中で濃度１２５乃至４００ｎ
ｇ／ｘ（ｌまで順次希釈した。適当な希釈度の被検定培
地サンプルを放射活性標識トレーサータンパクに添加し
た。■、１０，０００希釈のウサギ抗ｔ−ＰＡ抗血清の
ＩｇＧ画分の存在下で抗原を室温で１晩インキユベート
した。ヤキ抗つサギＩｇＧイムノビーズ（ＢｉｏＲａｄ
社製）に室温で２時間吸収させて抗体−抗原コンプレ・
ソクスを沈澱させた。希生理食塩水を添加してビーズを
洗浄し、次に４°Ｃ１２０００ｘ　ｙで１０分間遠心し
た。

上清を捨て、沈澱物中の放射活性をモニターした。

参照標準との比較によって濃度を決定した。

セルラインは以下の如くである。セルライン’１”は、
４個のオリジナルセットから選択された未増幅クローン
である。Ｉ−１５５ｏｏ”は最初に５０ｎＭのＭＴＸ中
で増幅されて１−１５を生じ次に５００ｎＭのＭＴＸに
移されて更に増幅されたセルライン゛ピの増幅サブクロ
ーンである。１１５１Ｇ＋　００１１は１０．ＯＯＯｎ
ＭのＭＴＸの存在下で更に増幅された］−１５５，、の
サブクローンである。セルライン１８Ｂ−９は４個のオ
リジナルクローンの１個から）ＳＪ択され５０ｎＭのＭ
ＴＸで増幅されたサブクローンである。

全ての増幅細胞は、未増幅細胞が示したよりも増加した
ｔ−ＰＡ産生レベルを示す。未増幅培養物でもＣ６５ｐ
ｇ／細胞／日より高いｔ、−ＰＡ産生量を示すか、増幅
の結果として５０ｐｇ／細胞／日に近いレベルが得られ
る。

Ｆ、剰屓机戊物 本発明の化合物は、本発明のヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子産物が薬剤上許容され得るキャリアビヒクル
に混合されて成る薬剤的に有用な組成物を調製すべく公
知方法で処方され得る。他のヒトタンパク例えばヒト血
清アルブミンを包含する適当なビヒクル及びその処方は
、例えばＥ、Ｗ。

ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ　ｓ　　Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳ　ｃｉｅｎｃｅｓに記載され
ている。該文献を引用して本明細書中に包含する。前記
の如き組成物は、宿主への有効投与に適した薬剤上許容
され得る組成物を調製するための適当量のビヒクルと共
に有効量の本発明タンパクを含有するであろう。

例えば、本発明のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
は、心血管病又は心血管障害に苦しむ患者に非経口的に
投与され得る。用量及び投与速度は現在臨床に用いられ
ている他の心血管血栓溶解剤と同様でよい。例えば、肺
塞栓症の患者には、初回に約４４０１　Ｕ／ｋｇを靜注
し、以後約４４０ＩＩＪ／ｋｇ／時ずつ１２時間静注す
る。

本発明の実質的に均質なヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子を、非経口的に投与するための適当な剤形の一例
としては、２５０００１Ｕの！織プラスミノーゲン活性
化因子活性、２５１１ｇのマンニトール及び４５１１ｇ
のＮａＣ１を含むバイアルを５峠の注射無菌水で復元し
、静脈内投与のために適正量の０．９％食塩注射剤又は
５％デキストロース注ｑ＝を剤と混合すればよい。

Ｇ、組換ヒトｔ−ｐＡの詳細な説明 本明細書中では、実施例に於いて調製されたヒ１−Ｌ−
ＰＡの特定具体例の構造を遺伝子をコードする配列の肝
明及びタンパク質生化学技術の双方により、ある程度詳
細に説明した。一般に理解されているタンパク構造を第
１２図に示す。

Ｃｏｌ　ｔｅｎ及び彼の共同研究者（文献８８）によっ
て、二本鎖ヒ１−ｔ−ＰＡは一本鎖分子がタンパク分解
的開裂により、ジスルフィド結合で接続された２個のポ
リペプチドになる結果形成されることはすでに明らかに
されていた。本発明によって、１１鎖（分子量３０８８
２）がＮＨ，−末端部から誘導され、■、鎖（分子量２
８１２６）がＣ０ＯＨ４ｍ端領域からなるという結論が
得られる。二本鎖分子のＮ−末端配列決定によれば、二
本鎖形態は１個のアルギニル−イソロイシン結合（第１
２図の矢印）の開裂により生成されると思われる。

ヒト【〜ＰＡ（第１２図）のＨ鎖領域の１部分の−次構
造は、プラスミノーゲン（文献８９）及びプロトロンビ
ン（文献４０及び４１）のクリングル領域に対して高度
の配列相同性を示す。クリングル領域とは、プロトロン
ビンのプロ断片中で最初に発見された特徴的トリプルジ
スルフィド構造を意味しており、これに関してはＭａｇ
ｎｕｓｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ（文献９Ｉ及び９２）が
初めて詳細に記載した。Ｌ〜ＰＡの一次配列から２個の
所謂クリングル領域が明らかになる。これらの領域は、
各々が８２個のアミノ酸を含んでおり、プラスミノーゲ
ンの５個のクリングル領域と高度の相同性を有する。残
りのＮ−末端の９１個のアミノ酸は従来のクリングル領
域との相同性を殆ど有していない。然しなから、１１個
の付加的／スティン残基が検出されるので、この領域も
多数のジスルフィド結合を含む構造を有し得ると推測し
得る。

ヒ）ｔ−ＰＡのし鎖の触媒部位、所謂セリンプロテアー
ゼ領域は、他のセリン酵素同様に、ヒスチジン。７３．
アスパラギン酸。７□及びセリン。、、８残基から形成
されている可能性が大きい。更に、これらの残基を包囲
するアミノ酸配列は、トリプシン、プロトロンビン及び
プラスミノーゲンの如き他のセリンプロテアーゼの対応
する部分に極めて良く相同している。

本発明を好ましい特定具体例に関して説明してきたが、
本発明は前記具体例だけに限定されるべきでないことが
理解されよう。

菟灸客勲 １、米国特許Ｎｏ、　３３５５３６１ ２、米国特許Ｎｏ、　３９２６７２７　。

３、米国特許Ｎｏ、　４０２９７６７ ４、米国特許Ｎｏ、　４２５８０３０ ５、米国時ＩＦ　Ｎｏ、４２７１１５０゜６、欧州特許
出願公開Ｎｏ、　００３７６８７７、　　　Ｒｉｊｋｅ
ｎ、　　　Ｄ、　　　Ｃ，、”Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ
　　　Ａｃｔｉ　−ｖａｔｏｒ　　ｆｒｏｍ　　Ｈｕｍ
ａｎ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　、　　Ｋｒ１ｐｓＲｅｐｒｏ
　　Ｍｅｐｐｅｌ、　　１９８０　。

８、米国特許Ｎｏ、　３５５５０００　。

９、米国特許Ｎｏ、　３９９８９４７ 米国特許Ｎｏ、　４２４５０５１ 欧州特許出願公開Ｎｏ、　ＯＯ２３８６０米国特許Ｎｏ
、　４０８３９６１　。

米国特許Ｎｏ、４１７７２６２゜ 米国特許Ｎｏ、３０８２６１２゜ Ｗａｌｌｅｎ、　　Ｐ、、　　Ｐｒｏｃ、　　５ｅｒｏ
ｎｏ　　Ｓｙｍｐ、、　９１６、　Ｔｈｏｒｓｅｎ、Ｓ
、＋　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　　Ｄｉａｔ
ｈｅｓｈａｅｍｏｒｒｈ。、２８．６５（１９７２）１
７、　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｈａｅｍｏ
ｓｔａｓ、、　　４３＋７７（＋９８０）。

１８、　Ｗｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ＋　
　２７２＋　５４９（１９７８）、 １９、欧州特許出願公開Ｎｏ、００４１７６６゜２０、
　Ｗｅｉｍａｒ　　Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｅ　　
Ｌａｎｃｅｔ、　Ｖｏｌ、ＨＮｏ、８２５４．ｐ、１０
１８（１９８１）２１　　英国特許出願公開Ｎｏ、２０
０７６７６Ａ。

２２、　Ｗｅｔｚｅｌ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅ
ｎｔｉｓｔ、　　６８，６６２３、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇＹ、　　２ｄ　　Ｅｄ、、　Ｈａｒｐｅｒ　　ａ
ｎｄＲｏｗ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　　Ｉｎｃ、
、　　ＨａｇｅｒｓｔｏｗｎＭａｒｙｌａｎｄ（１９７
３）、　ｅｓｐ、　ｐｐ、　　１１２２ｅＬ　　５ｅｑ ２４、５ｃｉｅｎｔｆｉｃ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２
４５．　１０６（１９８］）。

２５、英国特許出願公開Ｎｏ、２０５５３８２Ａ。

２６、西独特許出願公開２６４４４３２゜２７、　Ｃｈ
ａｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ＋　　２
７５．　６１７２８、Ｉｔａｋｕｒａ　　ｅｔ　　ａｌ
、、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　Ｉ　９８＋　　］２９、
　　Ｇｏｅｄｄｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　８．　４
０５７（１９８０）。

３０、欧州特許出願公開Ｎｏ、　ＯＯ３６７７６３１、
５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ
　２０．　２６９（１９８０）。

３２、　　Ｓ　Ｌｉｎｃｈｃｏｍｂ　　ｅｔ　　ａｌ、
、　　Ｎａｔｕｒｅ、λ」４−１３９（１９７９）。

３３、　　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｇ
ｅｎｅ、　　７．　１４１（１９７９）。

３４、　　Ｔｇｃｈｕｍｐｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
　ＧＣｎｅ、　　１０．　１５７３５、　　Ｍｏｒｔｉ
ｍｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、　　４４．　５１９（１９
８０）３６、　　Ｍｉｏｚｚａｒｉ　　ｅｔ　　ａｌ、
、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｉ’、上３４．４８（１９７８）３７、　　Ｊｏｎｅ
ｓ、　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５．　２３（］　９７７
）３８、Ｈｊｔｚｅｍａｎ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈａｍλ旦上、１２０７３（
１９８０） ３９、　　Ｈｅ５ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ａｄ
ｖ、　　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｒｅｑｕｌ、。

ヱ、１４９（１９６８）。

４０、　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　］　７４９００（１９７
８）。

４１、　　Ｂｏｓｔｉａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）、ヱ７．４５０４（１９８０）。

４２、　　Ｔｈｅ　　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　　　ｏｆ　　　Ｙｅａｓむ（Ａｕｇ　　１
１　　１８．　１９８１）、Ｃｏ１ｄＳ　ｐｒｉｎｇ　
　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、　　Ｎｅｗ　　Ｙ
ｏｒｋ。

４３、　　Ｃｈａｍｂｏｎ、　　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、
　　Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ、４４＋４４、　　Ｔｉ
５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
　ＰｒｅｓｓＫｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ
　ｅｄｓ、、　　（］　９７３）４５、　　　Ｇｌｕｚ
ｍａｎ、　　　Ｃｅ１ｌ、　　　２　３．　１　７　５
（１９８１）４６、　　Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　Ｇｅｎｅ＋　λ、９５（１９７７）。

４７、　　Ｌｕ５ｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　　２９３．　７９（１４８、　　Ｇｌｕｚｍ
ａｎ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒＩｎｇ
　　Ｉ−ｌ−１ａｒｂｏｒＳｙ、　ＱｕａｎＬ、　Ｂｉ
ｏｌ、、　４４．２９３（１９４９、Ｆｉｅｒｓ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２７３＋　　１
１３５０、　　Ｒｅｄｄｙ　　ｅｔ　ａｔ、、　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　　２００＋　　４９４５１、　　Ｃｒｃ
ａ　　ＣＬａ１．　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ、　　８．　２３３１（１９８０）５２
、　　Ｇｏｃｄｄｅｌ　ｅＬ　ａｌ４．　　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２８７．　４　］　１５３、　　Ｇｒａｙ　　
ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９５．　５
０３５４、　０ｐｐｅｒｍａｎｎ　　ｅｔ　　ａｌ、＋
　　ＶｉｒｏｌｏｇＬ　　１０８＋４７（１９８１）。

５５、　　Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　
Ｖｊｒｏｌ、、　　９＋　　６１（］５６、Ａｖｉｖ　
　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、（ＵＳＡ）、６９．１４０８（１９７２）５
７、　　Ｌｅｈｒａｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｂｊ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１６＋５８、　　Ｌｙｎｃ
ｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋　　９
８．　２５１（１９７９）。

５９、　　Ｌｏｄｉｓｈ、　　Ａｍ、　　Ｒｅｖ、　ｏ
ｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　４５＋４０（１９７６）
。

６０、　　Ｐｅｌｈａｍ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｅｕ
ｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

土３．２４７（１９７６）、 ６１、　　Ｂｌｏｂｅｌ、　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ
、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ旦７，８５２（１９
７５） ６２、　５ｈｉｅｌｄｓ　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　
　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙλ旦３．３７５３
（１９７８）。

６３、　　Ｌａｅｍｍｌｉ、　　ＮａＬｕｒｅ、　　２
２７．　６８０（］　９７６４、　Ｂｏｎｎｅｒ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
。

■、８３（１９７４）。

６５、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２８１＋　５４４（１９７９）。

６６、　Ｗｒｃｋｅｒ＋ｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋λ五多、２４８３（１９
７８） ６７、　Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、
　２７５ｒ　６１７（１９７８）。

６８、Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｇｅｎ
ｅ、　２．９５（＋９７７）。

６９、　Ｇｒｕｓｔｅｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、、ＵＳＡ、７
２．３９６１（１９７５）７０、　Ｈａｎａｈａｎ　　
ｅｔ　　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　１０＋　６３（１９
８０）。

７１、　　Ｂｊｒｎｂｏｉｍ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、＋　７．　　］　
５１３（１９７９）。

７２、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ
＋、＋　６５＋　４９９（１９８０）。

７３、　Ｍｅｓｓｊｎｇ　ｅｔ　　ａｌ、、　ＮｕｃＩ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ９．３０９（１９８］） ７４　　Ｍａｘａｍ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｒ＋ｚｙｍｏｌ旦５．４９９（１９
８０） ７５、　Ｃｒｅａ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

７５．５７６５（１９７８） ７６、　Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ６．　Ｃｅ１ｌ、　１５
．１１５７（１７７、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３（＋９７５） ７８、　Ｂｅｎｔｏｎ　　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　ｌ　９６＋　１８０（＋９７７） ７９、　Ｍｅ　　Ｇｒａｔｈ　　ａｎｄ　　Ｌｅｖｉｎ
ｓｏｎ、　　Ｎａｔｕｒｅ。

υ５，４２３（１９８２） ８０、　　Ｂ１１ｎｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ。

３．２３０３（１９７６）。

８１、　Ｌａｗｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２１２＋　　１　］　５９（１９８１）。

８２、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、
　１９．９５９８３、　　Ｔａｙｌｏｒ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、＋　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

８３ｂ、　Ｅ　＋Ｊｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　　
Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　＋
↓、８０（＋９６７）。

８４、　　Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ
、　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　　２３，６４１（］　９６６）８５、　Ｗ
ａｈｌ　ａｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、５ｃｉ（ＵＳＡ）、工６．３６８３（１９７９
）。

８６、　　Ｄ　ａｖｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　　Δ
ｄｖａｎｃｅｄ　　Ｂ　ａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎＣｔｉ
ｃｓ　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（］　
９８０）８７、　Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ　
　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１４８．２２３ ８８、　　Ｒｉｊｋｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、
　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、。

２５６．７０３５（１９８１）。

８９、　　Ｓ　ｏＬＬｒｕｐ　−Ｊ　ｅｎｓｅｎ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、　、　　Ｐ　ｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　　Ｆ　ｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉＳａｎｄＴ
ｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、　　Ｖｏｌ、　　３．　　Ｒ
ａｖｅｎ　　ＰｒｅｓｓＮ、Ｙ、ｐ、］９１（１９７８
） ９０、　５ｏｔｈｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　　ｅｔ　ａｌ
、、　　Ｐｒｏｃ、　　ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、、
（ＵＳＡ）、７２．２５７７（１９７５）。

９１、　　Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　　ａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　　Ｒｉｂｂｏ
ｎｓｅｔ　　ａｌ、、　　Ｅｄｓ、、　　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ＮｅｗＹｏｒｋ、　　ｐ、　
２０３（１９７６）。

９２、　　Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ　、亡、ｐ
、１２３９３、　　Ｍｉｌｌｅｒ、　　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ、　ｐ、４３１−３＋　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ、、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＮｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９
７２）。

９４、　　Ｒｅ１ｃｈ、　　Ｅ、、　　Ｐｒｏｔｅａｓ
ｅｓ　　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ
、　　（Ｉｂｉｄ）　　ｐ、３３３−３４１゜９５、　
　Ｍａｔｓｕｏ、　　○、、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　
Ｔｈｒｏｍ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４５．　２２５（１９８
１）。

９６、　　Ｋｏｒｉｎｇｅｒ、　　Ｃ，、ｅｔ　　ａｌ
、、　　Ｔｈｒｏｍ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４６．　５６１．　６６
２（１９８１）。

９７、　　Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ、　　Ｍ、、　　ｅｔ　
ａｌ、、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２５７．２９１２（１９８２）。

９８、　　Ｋｏｒｉｎｇｅｒ、　　Ｃ，、ｅｔ　　ａｌ
、、　　ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４
６　６８５（１９８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテアーゼインヒビターの存在下及び不在
下での、メラノーマ細胞から分泌された抗ｔ−ＰＡ　　
ＩｇＧにより沈降し得る″′Ｓ−メチオニン標識タンパ
クの１０％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）の結果を示す写真の
模写図である。 第２図は、メラノーマ細胞から誘導されたｍＲＮＡ画分
の免疫沈降した翻訳産物の電気泳動の結果を示す写真の
模写図である。 第３図は、ヒトＬ−ＰＡの５個のアミノ酸配列に基づい
て調製した５ｘＰ−標識１４ヌクレオチド体のプールを
プローブとして用いたときの、ｃＤＮＡで形質転換され
た９６個の細菌コロニーのハイブリダイゼーションパタ
ーンを示す写真の模写図である。 第４図は、全長ヒ）ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの制限エンドヌ
クレアーゼマツプである。 第５図は、全長ヒ）Ｌ−ＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド配
列及びそれから推定されたアミノ酸配列を示す模式図で
ある。 第６図は、発現プラスミドｐ△ＲＩＰＡ’の構築工程図
である。 第７図は、ｐ△ＲＴＰＡ０て形質転換された大腸菌細胞
の線維素溶解能のフィブリンプレートアッセイの結果を
示す写真の模写図である。 第８図は、ヒトｔ−ＰＡのトリプシン消化によって得ら
れたペプチドのＨＰＬＣの結果を示すトレース図である
。 第９図は、Ｅ、　ｃｏｌｉ中での成熟ヒトｔ−ＰＡの直
接発現をコードするプラスミドの構築工程図である。 第１０図は、ｐｔ−ＰＡｔｒｐ１２て形質転換されたＥ
、　ｃｏｌｉにより産生されるヒトｔ−ＰＡの線維素溶
解能に対するフィブリンブレートアッセイの結果を示す
写真の模写図である。 第１１図は、Ｄ　ＨＴ？　Ｒ（突然変異体又は野性型）
／ｊ−ＰＡをコードしている哺乳類組織培養細胞を形質
転換するのに適したプラスミドの構築工程図である。 第１２図は、本明細書中のＥ、１．に例示した方法で調
製されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の概略図
である。 第１３図は、ｐＥＨＥＲの構築工程図である。 第１４図は、ｐＦＲ４００及びｐＦＤｌｌの調製説明図
である。 第１５図は、ｐＥ３４２．ＨＢＶ、Ｅ４００゜Ｉ〕２２
の構築工程図である。 第１６図は、ｐＥ３４２．Ｄ２２の構築工程図である。 特許出願人　ジェネンテック・インコーボレイテノド

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）第５図に記載のアミノ酸配列１〜５２７を有する
   ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子またはヒト組織プ
   ラスミノーゲン活性化因子の特性を有するそのアレル変
   異体または誘導体をコードしているＤＮＡ。
2. （２）形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞に
   於いて、第５図に記載のアミノ酸配列１〜５２７を有す
   るヒト組織プラスミノーゲン活性化因子またはヒト組織
   プラスミノーゲン活性化因子の特性を有するそのアレル
   変異体または誘導体をコードしているＤＮＡを発現させ
   得る組換え発現ベクター。
3. （３）プラスミドｐ△ＲＩＰＡ°又はｐｔ−ＰＡｔｒｐ
   １２である特許請求の範囲第（２）項に記載のベクター
   。
4. （４）プラスミドｐＥＴＰＥＲ又はｐＥＴＰＦＲである
   特許請求の範囲第（２）項に記載のベクター。